KR20070121669A

KR20070121669A - 뼈 상태 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20070121669A
Application number: KR1020077020929A
Authority: KR
Inventors: 치아 수; 캉 팅; 슈니치 구로다; 벤 우
Original assignee: 더 리젠트스 오브 더 유니이버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 2005-02-16
Filing date: 2006-02-16
Publication date: 2007-12-27
Also published as: US7833968B2; EP1851237A2; CA2597605A1; US9511115B2; JP2008530227A; WO2006089023A2; US20170165323A1; CN101611051A; US10335458B2; EP1851237A4; US20090053311A1; US20110300184A1; WO2006089023A3

Abstract

뼈 또는 연골 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 약제학적 조성물 및 그의 제조 및 사용 방법이 제공된다.

여기서, 표면 분석에서의 표준 편차는 부피 분석의 것보다 현저히 더 컸다는 점에 유의한다. 이는 2D-계 선형 측정법이 3D 유기체에서의 모든 조직 사항들을 반드시 반영하지는 않을 수도 있다는 것을 강조하기 위해 제공한다.

Description

뼈 상태 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING OR PREVENTING BONE CONDITIONS}

본 발명은 일반적으로는 뼈 상태 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물은 상처 치유 및 조직 수복에서 뼈 및/또는 연골 형성을 유도하기 위해 이용될 수 있다.

정형외과적 및 머리얼굴 뼈 상태 치료에 대한 비용은 상당한 생의학적 부담을 대표한다. 2002 US Health Cost & Utilization Project 에 따르면, 머리 수술 (개두술 및 두개절제술) 및 안면 외상 재건에 대한 병원비만도 각각 약 $549 백만 및 $400 백만으로 추정된다 (Steiner, C., A. Elixhauser, and J. Schnaier, Eff Clin Pract, 2002. 5(3): p. 143-51). 정형외과적 수술 (외상성 및 비외상성을 통틀어) 에 대한 병원비는 정형외과적 산업을 대표할만큼 보다 훨씬 더 높은 경향이 있으며, 그것만으로도 2002 년도에 $13 조로 추정되었다 (Medical Technology Fundamentals, Merrill Lynch, 2003. p. 11).

전반적으로, 정형외과적 및 머리얼굴 뼈 상태의 치료에서 맞닥뜨리는 주된 문제점은 뼈 및/또는 연골 형성의 조절에 관한 것이다. 바람직하게는, 뼈 형성은 특정 상태의 치료 부분 (예를 들어, 정형외과적 또는 머리얼굴 골절 수복, 척추 유 합 수술, 관절 융합 수술, 다친 골다공증 뼈) 으로서 또는 특정 상태 예방의 부분 (예를 들어, 골다공증 뼈에서의 골절 예방) 으로서의 뼈 형성이 더 많이 또는 가속되도록 하는 것이 바람직한 조건 하에서 증가될 수 있다. 긴 뼈의 골절에 있어서, 연골이 비대해지도록 가속화하여 연골내 뼈 형성이 가속화되고 뼈로 대체되는 것이 바람직하다. 더욱더 바람직하게는, 뼈 형성은 또한, 특정 상태 (예를 들어, 두개골조기유합증, 너무 이른 봉합적 융합을 유도하는, 봉합을 통한 너무 이른 두개골 과성장의 상태; 이소골화, 다른 위치에서의 비정상적 뼈 형성의 상태) 의 치료 또는 예방의 일부로서 뼈 형성이 저감 또는 저해되는 것이 바람직한 조건 하에 뼈 형성이 저감될 수 있다. 유사하게, 연골 형성이 더 많이 또는 가속화되는 것이 바람직한 조건 (예를 들어, 관절 보수, 턱관절 재건, 관절원반 수복, 추간판 수복 및 재생성) 하에 연골 형성을 증가시키는 것이 바람직하다 .

수많은 조성물이 뼈 상태의 치료를 위해 기재되어 왔다 (표 1). 대부분, 전부 다는 아니지만, 뼈전도적 (osteoconductive) 및/또는 뼈유도적 (osteoinductive) 특징을 통해 뼈 형성을 촉진하는 조성물을 기재한다. 당업계에서는 뼈전도적 특징을 가진 것보다는 뼈 형성시에 뼈유도적 특징을 가진 조성물이 일반적으로 더욱 효능적임이 잘 확립되어 있으나; 최적의 뼈 형성을 위해서는 두 가지 모두가 필요하다 (표 1). 많은 뼈 상태의 치료를 위한 현재의 "금본위적" 조성물은 자가 뼈 이식인데, 이는 뼈전도적 및 뼈유도적 특징을 모두 갖는다. 그러나, 자가이식체 수합은 통증, 보행장애, 장골 능선 공여 부위에 대한 허벅지 감각이상을 포함하는 심각한 공여 부위 이환율과 연관될 수 있다 (Laurie, S.W., 등, Plast Reconstr Surg, 1984. 73(6): p. 933-8.). 따라서, 더 나은 자가이식 대안책에 대한 중대한 수요가 있다. 뼈유도성 능력을 가진 화합물들 중에는, 뼈 형태형성유전자 단백질 (BMP) 이 집중적으로 기재되어 왔다. 뼈유도성 담체와 커플링된 경우, BMP 는 대다수의 뼈 상태 치료를 위한 자가이식과의 최대의 동등성 또는 그것을 능가하는 유망성을 제공한다 (Valentin-Opran, A., 등 Clin Orthop, 2002(395): p. 110-20).

그러나, BMP 의 공지된 기능적 이질성 (Ducy, p. and G. Karsenty, Kidney Int, 2000. 57(6): p. 2207-14; Wang, S., 등, Kidney Int, 2003. 63(6): p. 2037-49) 및 뼈유도에 필요한 BMP 의 높은 투여량은 비용 고려 및 상악 동낭 (악골 sinus cyst) 형성과 같은 예측하지 못한 부작용 때문에 그의 이용을 제한할 수 있다 (van den Bergh, J.P., 등, J Clin Periodontol, 2000. 27(9): p. 627-36). 결론적으로, 뼈 및/또는 연골 형성 촉진을 위한 BMP 에 대한 대안적이거나 또는 상보적인 뼈유도성 분자에 대한 임상적 및 상업적인 수요가 있다. 추가로, 골유도성 BMP 로는 해결되지 않는 특정 상태에서 뼈 및/또는 연골 형성을 저해하기 위한 임상적 및 상업적 수요가 있다.

하기에 기재되는 구현예들은 상기에 밝힌 문제점 및 수요를 해결할 것이다.

발명의 개요

본 발명의 한 국면에서, 하나 이상의 NELL 펩티드 또는 NELL RNA 와 같은 하나 이상의 약제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 상해 후 뼈 생성, 예를 들어, 긴 뼈의 골절 치유, 척추 유합, 및 머리얼굴 뼈 수복 촉진을 통해 뼈 상태 치료를 위한 유효량의 하나 이상의 NELL 펩티드를 함유한다. 또다른 구현예에서, 상기 약제학적 조성물은 현시적인 뼈 상해의 증거가 꼭 필요없더라도 (예를 들어, 골다공증, 엉덩이뼈 괴사 및 치조골 재흡수) 뼈 생성 촉진을 통한 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 유효량의 하나 이상의 NELL 펩티드를 함유한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 뼈 대사가 2 차적 영향인 다발적인 증상을 수반하는 질병/상태의 징후를 치료, 예방, 경감, 완화 또는 감소시키기 위해 유효하며 이용될 수 있다. 상기 질환 또는 상태의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 신장 골형성장애 및 혈관 석회화를 포함하는 다수의 전신적인 영향력을 야기할 수 있는 만성 신장 질환이 포함된다. Nell 은 바람직하지 않은 뼈 형성을 자극하지 않으면서도 뼈 형성을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 신체에서 비-뼈 세포 (예를 들어, 전암성 (pre-cancerous) 세포) 의 증식을 자극하지 않으면서도 뼈 구획에서만 뼈 형성을 자극할 수 있고, 그 결과 표적으로 하는 뼈 형성이 신장 손상으로 인한 뼈 감소를 경감시킨다. NELL-유도성 광화는 또한, 소비되지 않으면 혈관과 같은 정상적으로는 비-석회화 조직에서의 병리학적 석회화를 형성하는 칼슘 및 포스페이트 이온을 소비한다. 병리학적 석회화의 기타 형태는 다중-인자 기원 (박테리아, 주변분비, 자가분비 등) 일 수 있다. 뼈 침전화 및 뼈 재흡수 사이의 균형을 맞추는 Nell 의 능력은 본원에 기재된 조성물이 뼈 구획에서의 필수적인 이온을 유지하고 비-뼈 조직에서의 그들의 생체이용능을 감소시킴으로써, 이소성 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막 및/또는 전립선 결석에 대한 위험성을 감소시키도록 한다.

본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 뼈 생성 (예를 들어, 두개골조기유합증 또는 이소골화, 뼈화석증) 저해를 위한 유효량의 NELL 펩티드 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 뼈 생성 저해를 위한 충분히 높은 넉넉한 투여량의 NELL 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 뼈 생성, 예를 들어, 머리얼굴 또는 긴 뼈 생성을 촉진하기 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2펩티드의 수용체의 조절제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조절제는 NELL2펩티드 또는 NELL1 의 수용체의 아고니스트일 수 있다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 골다공증 및 치조골 재흡수와 같은 뼈 질량을 감소시키는 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 뼈 생성 촉진을 위해 유효량의 펩티드 NELL2 또는 NELL1 의 수용체의 안타고니스트의 수용체의 조절제를 포함한다. 조절제는 펩티드 NELL2 또는 NELL1 의 수용체의 아고니스트일 수 있다.

본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 뼈 생성, 예를 들어, 머리얼굴 또는 긴 뼈 생성의 저해를 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 조절제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 조절제는 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 안타고니스트일 수 있다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 뼈화석증과 같은 뼈 질량을 증가시키는 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 뼈 생성 저해를 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 조절제를 포함한다. 조절제는 펩티드 NELL2 또는 NELL1 의 수용체의 안타고니스트일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 NELL 펩티드에 대한 하나 이상의 증강제를 포함하는 뼈 생성용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 연골 관련 뼈 상태 (예를 들어, 관절 보수, 턱관절 재건, 관절염 수복, 또는 추간판 수복) 의 치료 또는 예방을 위한, 연골의 생성을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시키기 위한 유효량의 하나 이상의 약제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 연골 생성의 직접적인 촉진을 위한 약제들 중 하나는, 이에 제한되지 않으나, 연골모세포, 연골세포, 또는 연골 전구 세포, 줄기 세포, 골수 세포, 골수 간질 세포, 섬유모세포, 또는 지방 유도 세포와 같은 연골발생 세포에 적용되는 NELL 펩티드일 수 있다. 연골 생성의 간접적인 촉진 (예를 들어, 연골모세포/연골세포 분화 유도를 통해) 을 위한 약제는 예를 들어, NELL 펩티드 중 하나 또는 NELL 펩티드 수용체의 아고니스트들일 수 있다.

뼈에 의한 추가적인 연골 치환을 방지하기 위해 연골내 뼈 형성의 저해가 바람직한 경우 특정한 특이적 조건 하에, 약제학적 조성물은 예를 들어, NELL 펩티드 수용체의 하나 이상의 저해제 또는 안타고니스트, 높은 투여량의 NELL 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 이에 제한되지 않으나, 뼈모세포, 뼈 조상 세포, 줄기 세포, 골수 세포, 섬유모세포, 경막 세포, 골막 세포, 혈관 주위 세포 및/또는 근육 세포와 같은 잠재적인 또는 수임된 뼈발생 세포를 저해에 의한 뼈모세포 분화 저해에 유효하다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 뼈 형성은 NELL 프로모터를 조절하는 소형 분자들을 통해 유도될 수 있다.

상기 기재된 약제학적 조성물은 임의로는 전신 또는 환부 전달을 위한 적합한 양태를 위해 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체는 경구적 전달, 폐 전달, 비경구적 전달 또는 삽입을 위한 담체일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 뼈 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 그 방법은 일반적으로 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함한다.

약제학적 조성물은 적합한 전달 양태를 위한 각종 제형물로 제형화될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 래트 NELL1 단백질 및 마우스 트롬보스폰딘 (TSP)-1 의 도식적인 구조를 나타낸다. 시그널 펩티드 영역 (색칠된 흑색 박스), TSP-N 모듈 (TSP-N, 빗금친 박스), 시스테인-풍부 (CR) 도메인 (CR , 색칠된 백색 박스), 표피 성장 인자 (EGF)-형 도메인 (E, 음영진 박스), 코일드-코일 영역 (CC , 막대), Ca² ⁺-결합 유형 EGF-형 도메인 (*), 및 RGD 펩티드 도메인 (RGD , 색칠된 백색 박스) 이 표시되어 있다.

도 2A 는 골격 염색 (상부, 가운데) 및 마이크로-컴퓨터로 한 단층 X 선 사진 (CT) (하부) 에서의 정상 골격 패턴을 나타내는 야생형 마우스의 골격 패턴을 나타낸다. 도 2A 는 또한 미네랄화의 전형적인 경계선 (점으로 된 연청색 선) 뿐만 아니라 대천문 (적색 별표) 및 후천문 (청색 별표) 의 위치를 나타낸다. 올바른 관상 봉합 (녹색 별표) 의 흐릿한 윤곽을 볼 수 있다. 관상 봉합은 일반적으로 엉덩이 봉합보다도 더 중첩되므로 덜 보인다. 중간 도면에서, 정상 크기의 빗장뼈 (흑색 화살표) 도 보인다. 마이크로-CT 는 전형적인 머리얼굴 뼈 형태를 밝혀낸다. 관상 봉합 (녹색 별표) 및 대천문 (적색 별표) 이 강조되었다. 도 2B 는 이형접합 코어-결합 인자 □₁ 넉아웃 동물 (Cbfa1 ^+/-) 의 골격 패턴을 나타낸다. Cbfa1 결핍 동물은 뼈 형성 결함을 갖는다. 상기 마우스들은 광범위한 패턴 (patent) 중심선 봉합 및 천문을 증명한다. 결함이 있는 미네랄화 및 뼈 형성이 중심선 두개골의 결함의 측면으로 조악하게 염색된 조직 (황색 및 연청색 점선 사이) 에 존재한다. 뇌실주위투명은 또한 관상 봉합의 영역 (녹색 화살표, 상부 및 하부 도면) 에서 볼 수 있다. 가운데 도면에서, 상당한 정도의 빗장뼈의 형성저하증이 확인된다 (흑색 화살표). 도 2C 는 NELL1 과발현 동물 (NELL1 ^overexp ) 과 짝지어준 Cbfa ^+/- 동물 유래 자손의 골격 패턴을 나타낸다. Cbfa ^+/- + NELL1 ^overexp 동물은 골격 염색 및 마이크로-CT 에 있어서 Cbfa1 ^+/- 홑배수체 결핍 동물에 비해 현저하게 증가된 두개골의 뼈 형성을 나타냈다. 가운데 도면에서, 더 낮은 수준의 빗장뼈의 형성저하증 (흑색 화살표) 이 있다. 도면은 또한 관상 봉합시 뼈 중첩 (bony overlap) 의 회복을 나타낸다 (녹색 화살표, 상부 및 하부 도면). 도 2D 는 NELL1 이 과발현되거나 또는 NELL1 단백질이 첨가된 경우 생체외 두개골의 뼈 장기 배양에서 두개골의 뼈 과성장 및 이소성 뼈 형성을 보여준다. 도 2E 는 NELL1 단백질 첨가시 정상 마우스 두개골의 체외이식편을 보여준다. 녹색 형광은 신규한 뼈 성장을 나타낸다. NELL1 단백질은 뼈 과성장 (적색 화살표), 및 같은 자리 (orthotopic) 뼈 형성 (황색 화살표) 을 유도한다. 종합적으로, 도 2 는 머리얼굴 영역 (예를 들어, 머리덮개뼈) 및 축방향의 골격 영역 (예를 들어, 위가슴뼈 (clavical)) 모두에서의 NELL1 과발현의 결과로서 증가된 뼈 성장을 나타낸다.

도 3A 는 긴 뼈로부터 유도된, 아데노바이러스의 NELL1 (AdNELL1) 형질도입 골수 간질 세포 (BMSC) 의 본 코사씨 (Von Kossa's) 염색을 나타낸다. 세포는 80% 융합성 (confluency) 까지 배양한 후, 50 플라크 형성 단위 (pfu)/세포 AdNELL1 (우측) 으로 감염시켰다. 대조군은 50 pfu/cell Adß-Gal (좌측) 으로 감염시켰다. 11 일째에, 본 코사씨 염색 (Von Kossa's stained) 된 뼈 결절을 계수하고, 뼈 결절 갯수를 평균 + SEM 으로 나타낸다. 각각의 실험은 3 벌씩 수행했다. 염색된 뼈 결절의 대표적인 시료들을 표시한다 (녹색 화살표). AdNELL1 형질도입 BMSC 에는 현저히 더 많은 미네랄화 및 뼈 형성이 있었다. 도 3B, 3C 및 3D 는, 누드 마우스의 근육으로 주사된 형질도입된 BMSC 를 나타낸다. 도 3B 는 적층형 패턴이 있는 상대적으로 더 성숙한 뼈의 조직학을 나타낸다. 도 3C 는 더 성숙한 뼈 패턴이 있는 AdNELL1 형질도입된 BMSC 를 방사선사진술로 나타낸다. 도 3D 는 더 많은 뼈 형성이 있는 AdNELL1 형질도입된 BMSc 를 방사선사진술로 나타낸다. 종합적으로, 도 3A 내지 3D 는 비-두개골의 공급원으로부터 유도된 세포에서의 NELL1 과발현의 결과로서 증가된 뼈 미네랄화 및 뼈 형성을 증명한다. 상기의 경우, NELL1 은 줄기 세포가 뼈를 형성하도록 유도한다.

도 4 는 NELL1 또는 BMP2 처리한 두개골의 결함의 부피 분석이며, NELL1 (녹색선) 및 BMP2 (적색선) 에 대해 대조군 (청색선) 보다 현저히 증가된 뼈 형성을 나타낸다. 이는 NELL1 이 뼈를 재생/수복할 수 있음을 증명한다.

도 5A-D 는 4 주째의 치료된 머리덮개뼈의 마이크로-CT 영상이다. 도 5A 는 NELL1-로딩된 멤브레인 (녹색에서 원래 결함의 윤곽), 및 BMP2-로딩된 PLGA 멤브레인 (적색에서 원래 결함의 윤곽) (두개내 광경) 으로 처리한 4 주차 두개골의 박편을 나타낸다. 도 5B 는 도 5A 와 동일한 검체를 나타낸다 (두개외 광경). 도 5C 는 NELL1-로딩된 PLGA 멤브레인 (녹색에서 원래 결함의 윤곽) (두개내 광경) 으로 처리된 4 주째 두개골 박편을 나타낸다. 대측 미처리 대조군도 역시 보인다 (황색에서 원래 결함의 윤곽). 도 5D 는 도 5C 와 동일한 검체를 나타낸다 (두개외 광경). 바아 스케일: 3 mm (황색, 하단 좌측). 종합적으로, 도 5A-5D 는 NELL1 및 BMP2 처리로 인한 동일하게 증가된 뼈 미네랄화 및 뼈 형성을 증명한다.

도 6A-C 는 4 주째의 처리된 머리덮개뼈의 조직학적 박편을 보여준다. 박편들은 메이슨씨 트리콤 (Masson's trichome) 으로 염색했다. 도 6A 는 NELL1-로딩된 멤브레인으로 처리된 4 주째 두개골의 박편을 나타낸다. 결함을 통틀어 완전한 뼈 재생이 보인다. 도 6B 는 BMP2-로딩된 멤브레인으로 처리된 4 주째 두개골의 박편을 나타낸다. 역시, 결함을 통틀어 완전한 뼈 재생이 있다. 도 6C 는 로딩되지 않은 멤브레인으로 처리된 4 주째 두개골의 박편을 나타낸다. 결함을 통틀어 최소한의 뼈 재생만이 있다. 종합적으로, 도 6A-C 도 NELL1 및 BMP2 처리로 동일하게 증가된 뼈 형성을 증명한다.

도 7A-D 는 NELL1 이 상이한 미세환경 조건 하에 연골 형성 및 연골내 뼈 형성을 유도한다는 것을 보여준다. 도 7A 는 NELL1 이 관절 연골 영역 (상단 패널) 및 또한 연골내 긴 뼈 형성 영역 (하단 패널) 을 모두 포함하는 경골에서 발현된다는 것을 보여준다. 상단 패널은 NELL1 이 관절 연골 영역에서 연골 분화를 조절 및 증가시킬 수 있음을 증명한다. 따라서, 상기 데이터는 증가된 NELL 펩티드 활성이 직접적으로 (예를 들어, NELL 펩티드 첨가 또는 증가된 NELL 펩티드 발현을 통해) 또는 간접적으로 (예를 들어, NELL 펩티드 증강제 및/또는 NELL 펩티드 수용체 아고니스트 및/또는 활성화제의 첨가를 통해) 연골 형성을 촉진한다는 것을 보여준다. 하단 패널에서, 연골내 뼈 형성의 기원이 되는 긴 뼈 축 영역에서, 증가된 NELL1 이 연골 형성에 이어 비대화 및 증가되는 연골내 뼈 형성을 야기하며, Cbfa1 넉아웃 모델에서의 연골내 뼈 형성없이 덜 분화된 관절 연골모세포/연골세포 표현형의 유지를 가능케 한다. 따라서, 이들 데이터는 증가된 NELL 펩티드 활성이 직접적으로 (예를 들어, NELL 펩티드의 첨가 또는 증가된 NELL 펩티드 발현을 통해) 또는 간접적으로 (예를 들어, NELL 펩티드 증강제 및/또는 NELL 펩티드 수용체 아고니스트 및/또는 활성화제의 첨가를 통해) 연골 형성, 연골 비대화 및 연골내 골화를 촉진한다는 것을 보여준다. 이는 연골내 뼈 형성, 예컨대 골절에서 유용하다. 외인성의 NELL1 의 부재는 제어되는 관절 연골모세포/연골세포 표현형 및 뼈로 대체되는 관절 연골 방지에 중요한 비대화의 억제와 상관있다. 따라서, NELL 펩티드 활성을 직접적으로 (감소된 NELL 펩티드 발현 또는 NELL 펩티드 저해제의 이용을 통해) 또는 간접적으로 (NELL 펩티드 수용체 안타고니스트 및/또는 저해제를 통해) 저해하는 것은 연골 비대화 및 연골내 고화를 방지하고, 관절 연골 표현형 유지를 촉진시킬 수 있다. 전체적으로, 상기 데이터는 제한의 의미가 있는 것이 아니라, NELL 이 뼈연골형성 전구 세포 유형들에 대해 광범위한 효과가 있으며, NELL 에 의해 유도되는 정확한 표현형은 NELL 적용의 양 및 시간 사이의 복합적인 상호작용, 정확한 세포 유형, 세포 분화 상태 및 미세환경에 따라 좌우된다는 것을 보여준다.

도 7B 는 입천장 확장 (distraction) 모델에서, NELL1 단백질은 연골을 유도한다는 것을 보여준다 (청색 염색). 도 7C 은 NELL1 이 Sox 9 염색 증가로 표시되는 연골모세포 증식을 증가시킨다는 것을 보여준다. Sox 9 은 연골발생성 세포 증식의 마커이다. 도 7D 는 유형 X 콜라겐 염색으로 표시되는 바와 같이, NELL1 은 연골이 추가 증식되도록 유도한다는 것을 보여준다. 또다시, 도 7D 은 NELL1 이 연골 분화/형성 및 또한 연골 기재의 연골내 뼈 형성을 가속화시킬 수 있음을 증명한다. 종합적으로, 도 7A-D 는 NELL1 이 연골 분화 및 비대를 조절할 수 있음을 증명한다. 증가된 NELL1 은 연골 형성 및 비대, 및 상이한 미세환경 하에서의 증가된 연골내 뼈 형성을 초래하며, NELL1 의 부재는 더 적은 관절 연골모세포/연골세포 표현형의 유지를 가능케 한다.

도 8 은 시험관내 (A) 및 생체내 (B, C) 에서의 NELL1 과 BMP2 의 상승적 효과를 보여준다. 상기 데이터는 NELL1 및 BMP 가 뼈모세포의 분화 마커 발현 유도 및 뼈 형성 유도에 있어서 상승적임을 증명한다.

도 9 는 탈미네랄화 뼈 매트릭스를 담체로서 사용한 NELL1 의 척추 유합을 보여준다. Nell1 처리된 융합물 척추의 6 주째 샘플 (A, B 및 C) 및 유착불량 (nonunion) 의 대조군 샘플 (D, E 및 F) 에 대한 방사선사진술 및 마이크로-CT 3 차원 재건 영상. (A) 적색 화살표는 L4 및 L5 세절에서의 척추의 양측 상에서의 방사선이 통과하지 않는 조직 덩어리를 밝혀낸다. 각각의 덩어리의 중간 테두리 (녹색 화살표) 는 대조군 뼈와 동일한 최고의 밀도를 나타내며; (B) 이 마이크로-CT 3D 영상은 뼈와 동일한 밀도를 가진 윤곽이 분명한 조직 덩어리 (적색 화살표) 가 2 개의 횡돌기 및 이들 사이의 공간의 등쪽 표면 상에서 무리를 이루고 있음을 나타냈다 (녹색 화살표); (C) 이 3D 마이크로-CT 의 관상 절단 평면 영상에 나타낸 바와 같은 양쪽 횡돌기 (황색 화살표) 로 명확하게 연결된 가교를 이루는 뼈 (녹색 화살표); (D) 이 방사선사진에 나타낸, 더 낮은 방사선 비투과성의 더 작은 조직 덩어리 (적색 화살표); (E) 횡돌기와 가까이 접하지 않은 L4 및 L5 영역에 걸친 조직 덩어리 (적색 화살표);(F) 3D 마이크로-CT 의 관상 절단 평면에서, 분열 (핑크색 화살표) 이 식별되었다. 상기 데이터는 NELL1 이 하나의 가교 형성을 통해 척추 유합을 유도할 수 있음을 증명한다.

도 10 은 NELL1 에 의한 융합의 6 주째 샘플 (A, B, C, G 및 H) 및 대조군 (D, E, F, I 및 J) 에서의 유착불량의 조직학을 보여준다. (A) 녹색 화살표는 H&E 염색된 박편 상에서 점성으로 나타낸 2 개의 횡돌기를 연결하는 가교성 뼈와 같은 외피의 뼈를 가리킨다. (B 및 C) 에서의 가교성 뼈의 규정 영역에서의 층상 뼈의 고배율 도면. (D) H&E 염색은 점선으로 표시한 횡돌기에 근접한 더 작은 뼈 덩어리를 보여준다; (E 및 F) 도 2D 에서의 규정 영역에서의 미성숙 뼈의 고배율 도면. (G 및 H) 메이슨 (Masson) 트리크롬 염색 박편 상에서 시멘트선을 형성하는 뼈세포 로 표시된 바와 같은 신규한 뼈 성장. (I 및 J) 리모델링 DBMDBM 입자로부터 생긴 더욱 연골성인 조직 (화살표). A 및 D 에 대한 원래 배율: 9.8 X; B, E, G 및 I: 100X; C, F, H 및 J: 200X. 상기 데이터는 NELL1 이 뼈 가교 형성을 통해 척추 유합을 유도할 수 있음을 증명한다.

도 11A 및 11B 은 인간, 마우스 및 래트 NELL1 프로모터가 다중 OSE2 콘센서스 모티브를 포함한다는 것을 보여준다. 도 11A 는 추정되는 OSE2 결합 부위를 나타내며, A, B 및 C 는 전사 개시 부위에 대한 서열 및 위치를 따라 보여진다. 불명한 OSE2 부위는 빗금친 박스로 도시한다. 도 11B 은 인간, 마우스 및 래트 NELL1 프로모터의 비교 도식이다 (규모는 나타내지 않음). 마우스 및 래트 프로모터에서의 2 개의 OSE2 사이트 (각각, 사이트 m1 및 2, 및 사이트 r1 및 3) 는 81% 상동성인 영역에 위치한다. 불명한 사이트는 빗금친 박스로 표시한다. 상기 데이터는 Nell 의 프로모터의 서열이 Nell 발현 유도를 위한 약물 스크리닝에 이용될 수 있음을 보여준다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 한 국면에서, 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 NELL 펩티드와 같은 하나 이상의 약제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 조절 (예를 들어, 뼈 생성 촉진, 예를 들어, 머리얼굴 뼈 생성, 치과적 임플란트 통합, 치주 뼈 생성, 치과적 또는 정형외과적 임플란트 통합, 장기간 골절 치유, 척추 유합 또는 이들의 조합) 을 위한 유효량의 하나 이상의 NELL 펩티드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 골다공증과 같은 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 유효량의 하나 이상의 NELL 펩티드를 포함한다.

본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 두개 봉합을 거친 뼈 과성장을 치료 또는 예방하기 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2 펩티드 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 국면에서, 본 발명은 뼈 생성, 예를 들어, 머리얼굴 뼈 생성을 촉진하기 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 조절제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 조절제는 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트일 수 있다. 조절제는 자체로 수용체를 활성화 또는 저해할 수 있다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 골다공증과 같은 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 유효량의 NELL1 또는 NELL2 펩티드 수용체의 조절제를 포함한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 연골 관련 뼈 상태를 치료 또는 예방하기 위한 연골의 생성을 촉진하기 위한 유효량의 하나 이상의 약제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 약제는 NELL 펩티드 저해제, NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트, 및 이들의 조합 중 하나일 수 있다.

상기 기재된 약제학적 조성물은 전신적 또는 환부 전달에 적합한 양태를 위해 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 담체는 경구적 전달, 비경구적 전달 또는 삽입을 위한 담체일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본 발명은 뼈 상태의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포유류에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 뼈 매트릭스와 접합하여 뼈 형성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 뼈 매트릭스는 탈미네랄화 뼈 매트릭스 또는 미네랄화 뼈 매트릭스일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 줄기 세포와 조성물을 접촉시킴으로써 줄기 세포가 뼈모세포로 분화되도록 유도하기 위해 사용될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포 또는 성인 줄기 세포일 수 있다. 추가로, 약제학적 조성물은, 골수 간질 세포와 본원에 기재된 조성물을 접촉시킴으로써 골수 간질 세포가 뼈를 형성하도록 유도하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 예를 들어, 극미중력으로 인한 뼈 감소, 불사용 위축, 장기간의 침상 요양 등과 연관된 상태의 징후를 치료, 예방, 완화, 경감 또는 감소시키기 위해 유효하며 이용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 뼈 대사가 2 차적인 효과인 다중적 징후를 수반하는 질환/상태의 징후를 치료, 예방, 완화, 경감 또는 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 질환 또는 상태의 예시에는, 이제 제한되지 않으나, 신장 골형성장애 및 혈관 석회화를 포함하는 다수의 전신적 영향력을 야기할 수 있는 만성 신장 질환이 포함된다. Nell 은 원하지 않는 뼈 형성을 자극함이 없이 뼈 형성을 증가시킬 수 있으므로, 신체에서 비-뼈 세포 (예를 들어, 전암성 세포) 의 증식을 자극하지 않으면서 오직 뼈 구획에서만 뼈의 형성을 자극할 수 있고, 그 결과 표적으로 하는 뼈 형성이 신장 손상으로 인한 뼈 감소를 완화시킨다. NELL-유도성 미네랄화는 또한, 그렇게 하지 않는 경우 정상적으로는 혈관과 같은 비-석회화 조직에서 병리학적 석회화를 형성하는 칼슘 및 포스페이트 이온을 소비한다. 기타 형태의 병리학적 석회화는 다중-인자성 기원 (박테리아성, 주변분비, 자가분비 등) 을 갖는다. 뼈 침착 및 뼈 재흡수 사이의 균형이 맞도록 해 주는 Nell 의 능력은 본원에 기재된 조성물이, 뼈 구획에 필수적인 이온들을 유지하도록 하고 비-뼈 조직에서의 생체이용율을 저하시켜 유효한 조성물이 되도록 함으로써, 국소적인 이소성 (ectopic) 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막 및/또는 전립선 결석의 위험을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본 발명은 포유류 세포에서의 뼈 형성을 촉진하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 포유류 세포의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 줄기 세포, 골수 간질 세포, 섬유모세포, 또는 지방 유도 세포 (adipose derived cell) 가 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "NELL (Nel-형 분자-1; Nel (표피 성장 인자형 도메인을 코딩하며 신경 조직에서 강하게 발현되는 단백질)) 펩티드" 는 NELL1 또는 NELL2 폴리펩티드, 또는 그의 절편, NELL1 또는 NELL2 관련 폴리펩티드, 또는 그의 절편; "NELL 펩티드" 와 상당한 상동성을 가진 임의의 폴리펩티드 또는 그의 절편일 수 있다. 상당한 상동성은 "NELL 펩티드" 에 대해 50% 초과의 상동성, 예를 들어, "NELL 펩티드" 에 대한 60% 초과의 상동성, "NELL 펩티드" 에 대한 70% 초과의 상동성 또는 "NELL 펩티드" 에 대한 80% 초과의 상동성을 의미하는 것으로 해석될 수 있다. NELL 펩티드는 천연 및/또는 비-돌연변이화 야생형 서열이 있는 재조합 NELL 펩티드 또는 NELL 펩티드에 대한 상당한 상동성을 여전히 내포하는 돌연변이화 야생형 서열이 있는 재조합 NELL 펩티드일 수 있다. 추가로, NELL 펩티드는 이에 제한되지 않으나, 인간 세포, 박테리아, 효모 또는 곤충 또는 식물 세포와 같은 유기체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "NELL 펩티드" 에는 NELL 펩티드의 구조적, 기능적 또는 입체배좌적 등가물이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, NELL 펩티드의 구조적 등가물은 NELL 펩티드의 것 또는 NELL 펩티드의 기능적 도메인의 것과 동등하거나 또는 실질적으로 동일한 구조를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. NELL 펩티드의 기능적 등가물은 NELL 펩티드 또는 NELL 펩티드의 기능적 도메인의 것과 동등하거나 또는 실질적으로 동일한 기능을 갖는 단백질 또는 펩티드를 의미한다. NELL 펩티드의 입체배좌적 등가물은 NELL 펩티드 또는 NELL 펩티드의 기능적 도메인의 것과 동등하거나 또는 실질적으로 동일한 입체배좌를 가진 단백질 또는 펩티드를 의미한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 NELL 펩티드는 NELL 펩티드의 유도체일 수 있다. 용어 "유도체" 는, 본원에 사용된 바와 같이, NELL 펩티드로부터 유도된 화학적 또는 생물학적 화합물 또는 재료, 또는 그의 구조적 등가물 또는 그의 입체배좌적 등가물을 의미한다. 예를 들어, 상기 유도체에는, NELL 펩티드가 더욱 안정하게 하거나 또는 더 나은 친골성 (osteophilicity) 또는 친지성 (lipophilicity) 을 갖도록 하는 NELL 펩티드의 임의의 프로드러그 형태, PEG화 형태 또는 임의의 기타 형태가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 유도체는 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(아미드산), C1-C20 탄소가 있는 히드로카르빌 단쇄 또는 생체적합성 중합체에 부착된 NELL 펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 용어 "유도체" 에는 NELL 펩티드 모사체가 포함될 수 있다. 펩티드 모사체의 합성은 당업계에 잘 입증되어 있다. 하기는 펩티드 모사체를 포함하는 펩티드 합성을 위한 기본적인 과정의 예시를 기재한다:

펩티드 합성 개시 전에, 아미노산 (출발 재료) 의 아민 말단은 FMOC (9-플루오로메틸 카르바메이트) 또는 기타 보호기로 보호할 수 있고, Merrifield 수지 (자유 아민) 과 같은 고체 지지체를 개시제로 이용한다. 단계 (1) 에서 단계 (3) 까지의 반응들을 수행하고, 원하는 펩티드가 수득될 때까지 반복한다: (1) 자유-아민을 카르보디이미드 화학을 이용하여 카르복실 말단과 반응시킴, (2) 아미노산 서열을 정제함, 및 (3) 보호기, 예를 들어, FMOC 보호기를 약한 산성 조건 하에 제거하여 자유 아민을 수득함. 이어서, 펩티드는 수지로부터 제거하여 자유 정치 펩티드 또는 펩티드 모사체를 수득한다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 펩티드 유도체에는 물리적으로 또는 화학적으로 개질된 NELL 펩티드가 포함된다. 물리적으로 개질된 펩티드는, 예를 들어 상대이온 (counterion) 과의 이온쌍 형성과 같은 이온력에 의한 개질, 수소 결합에 의한 개질, pH 변화에 의한 개질, 용매 선택에 의한 개질, 또는 폴딩/언폴딩 온도, pH, 용매 및, 폴딩/언폴딩의 상이한 단계에서의 기간 선택을 수반할 수 있는, 상이한 단백질 폴딩/언폴딩 과정을 이용한 개질로써 개질될 수 있다.

일부 구현예에서, 펩티드 유도체에는 화학적으로 개질된 NELL 펩티드가 포함될 수 있다. 예를 들어, 짧은 탄화수소기(들) (예를 들어, 메틸 또는 에틸) 은 펩티드의 화학적 및/또는 물리적 특징 개질을 위해 NELL 펩티드 분자 상에 하나 이상의 부위에 선택적으로 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 모노-, 올리고- 또는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG) 기(들)은, 일반적으로 공지된 단백질 PEG 화 과정으로 펩티드의 화학적 및/또는 물리적 특징을 개질하기 위해, NELL 펩티드 분자 상의 하나 이상의 부위에 선택적으로 부착될 수 있다 (예를 들어, Mok, H., 등, Mol. Ther., 11(1):66-79 (2005) 를 참조).

용어 "NELL 펩티드의 저해제" 는 NELL 펩티드의 활성을 저해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 NELL 펩티드의 발현을 억제할 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 포괄한다. NELL 펩티드의 저해제는 NELL 펩티드 전사물 또는 번역 생성물과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용할 수 있다. 예시로서, 상호작용 방법에는, 이에 제한되지 않지만, NELL 펩티드의 전사 또는 번역의 저감, NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 안정성 저하, NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 활성 저하, 및 NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 분해 증가가 포함된다. 용어 "NELL 펩티드의 증강제" 는 NELL 펩티드 활성을 증강시킬 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 NELL 펩티드 발현을 증강시킬 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 포괄한다. 예시로서, 상호작용 방법은, 이에 제한되지 않지만, NELL 펩티드의 전사 또는 번역의 증가, NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 안정성 증가, NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 활성 증가, 및 NELL 펩티드 전사물 또는 단백질 생성물의 분해 저하가 포함된다.

용어 "NELL 펩티드 수용체의 조절제" 는 NELL 펩티드에 대해 또는 이것에 의한 NELL 펩티드 수용체의 결합을 촉진 또는 저해할 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물, 또는 NELL 펩티드의 존재 또는 부재와 상관없이 NELL 펩티드 수용체 활성을 조절할 수 있는 화학적 또는 생물학적 화합물을 지칭한다. NELL 펩티드에 대해 또는 이것에 의해 NELL 펩티드 수용체의 결합 및/또는 활성화를 촉진하는 조절제는 수용체의 "아고니스트" 로 지칭되며, NELL 펩티드에 대해 또는 이것에 의해 NELL 펩티드 수용체의 결합 및/또는 활성화를 저해하는 조절제는 수용체의 "안타고니스트" 로 지칭된다. NELL 펩티드와 상관없이 NELL 펩티드 수용체의 활성화를 촉진하는 조절제는 수용체의 "활성화제" 로 지칭되며, NELL 펩티드와 상관없이 NELL 펩티드 수용체의 활성화를 저해하는 조절제는 수용체의 "저해제" 로 지칭된다.

용어 "NELL 펩티드", "NELL 펩티드의 저해제" 또는 "NELL 펩티드 수용체(들)의 조절제" 는 또한 명세서 전반에서 "약제" 로 지칭된다.

용어 "뼈 상태" 에는, 이제 제한되지 않으나, 하기의 것을 포함할 수 있다: 1) 사고 후 또는 의인성 (iatrogenic) 정형외과적 손상과 같은 뼈 형성 증가 또는 감소에 의한 뼈 치유 및 재생의 변화 [예를 들어, 외상 (예를 들어, 긴 뼈 골절) (도 7B-D 참조), 또는 수술 (예를 들어, 척추 유합술)] 도 2, 9 및 10 참조); 2) 명백한 정형외과적 손상의 증거없이 뼈 형성이 증가 또는 감소에 의한 뼈 덩어리의 변화 [예를 들어, 엉덩이뼈 괴사, 골다공증 (뼈 질량 감소), 뼈화석증 (뼈 질량 증가)]; 3) 사고후 또는 의인성 머리얼굴 뼈 및/또는 치주 손상과 같은 뼈 형성의 증가 또는 감소에 의한 뼈 치유 및 재생의 변화 [예를 들어, 외상 (예를 들어, 머리얼굴 골절), 수술 (예를 들어, 구순열/구개열 수복, 두개 결함 수복) (도 4, 5 및 6 참조), 또는 치과적 과정 (예를 들어, 발치, 치과적 임플란트 장착) 에 의한 것]; 4) 명백한 머리얼굴 뼈 및/또는 치주 손상의 증거없이 뼈 형성의 증가 또는 감소에 의한 뼈 덩어리의 변화 (예를 들어, 악골 및 하악 치조의 치아 능선의 회복 및/또는 보존; 봉합을 통한 미성숙 두개골의 과성장 방지); 5) 뼈의 통합 촉진을 위한 철물 삽입 부위에서의 뼈 형성 증가를 통한 뼈 치유 및 재생의 변화 (예를 들어, 무릎 전체 임프란트, 치아 임플란트, 척추 임플란트); 6) 비대 연골 형성에 의한 연골 치유 및 재생의 변화 (예를 들어, 심각한 관절 손상, 심각한 골관절염 또는 진행성의 관절 표면 손상이 있는 류마티스성 관절염을 초래하는 내부관절 골절과 같은, 비대해지지 않은 연골이 바람직한 뼈 상태에 있는 연골 비대화의 방지; 연골내 석회화의 가속화와 같은, 비대화된 연골이 바람직한 뼈 상태에서의 연골 비대화 촉진; 막 내의 석회화와 같은, 비대화된 연골이 바람직하지 않은 뼈 상태에서의 연골 비대화 방지).

용어 "줄기 세포" 는, 이에 제한되지 않으나, 성인 줄기 세포, 태아 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 골수 줄기 세포를 포괄할 수 있다.

뼈모세포 형성 및 기능

뼈모세포 형성 및 기능은 뼈 생물학의 두가지 중요한 개념을 포괄한다 (Aubin, J.E., Rev Endocr Metab Disord, 2001. 2(1): p. 81-94 Ducy, P., 등, Genes Dev, 1999. 13(8): p. 1025-36). 두 개념은 뼈유도 및 뼈 재생에서 중심적인 것이다. Aubin (Aubin, 2001) 에 따르면, 뼈모세포 형성은, 결과로서 일어나는 뼈모세포, 및 최종적으로는 뼈세포 및 아폽토시스 세포로의 분화가 있는 뼈 조상 세포 직계에 수임된 초기의 중간엽 줄기 세포 (MSC) 로 이루어진 여러 개의 분화 단계를 수반한다. 한편, 뼈모세포 기능은 매트릭스 퇴적 및 뼈 형성에서 이미 분화된 뼈모세포의 활성을 수반한다. 뼈모세포 형성 및 기능을 모두 필요로 하는 뼈 형성은 배아 발생, 성장, 리모델링, 골절 수복 도중 및, 실험적으로는 탈석회화 뼈 매트릭스의 이식 또는 정제된 BMP (Id.) 의 첨가에 의해 일어날 수 있다. 이에 따라, 뼈모세포 분화 및 기능은 두가지의 적절한 뼈모세포 기능이 적절한 뼈모세포 분화의 상황에서만 발할 수 있는, 반드시 나누어져 있는 것은 아닌 과정이다.

뼈연골형성 전구세포 직계에 대한 미분화 중간엽 줄기 세포 (MSC) 의 수임은 먼저 Cbfa1 발현에 의해 나타난다 (Nakashima, K. and B. de Crombrugghe, Trends Genet, 2003. 19(8): p. 458-66; Yamaguchi, A., T. Komori, and T. Suda, Endocr Rev, 2000. 21(4): p. 393-411). Cbfa1 은 뼈모세포 형성 및 기능에 있어서 필수적이다. Cbfa1 null (Cbfa1 ^-/- ) 마우스는 뼈모세포 및 뼈형성에 있어서 완전한 결핍을 나타내며, 호흡을 유지시켜 줄 단단한 흉곽의 부재로 인한 호흡 불충분으로 인해 출생전후기 단계에서 폐사한다 (Komori, T., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 755-64; Otto, F., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 765-71 Ducy, P., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 747-54). 한편, 이형접합 Cbfa1 기능소실 (Cbfa1 ^+/- ) 마우스는 빗장뼈의 형성저하증, 막골의 더딘 발생 및, 열려있는 대천문 및 후천문, 더 작은 두정 및 두정내 두개뼈 및 다중적인 Wormian 뼈 (봉합에서 작은 뼈들) 을 초래하는 두개뼈의 더딘 석회화, 인간에서의 밀폐형 두개 형성이상 (CCD) 과 동일한 표현형을 나타낸다 (Otto, F., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 765-71; Mundlos, S., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 773-9). Cbfa1 ^+/- 마우스의 표현형은 막 내의 석회화가 Cbfa1 일배체형 결핍에 특히 영향받기 쉬울 수 있음을 시사한다.

공지된 연구에 의하면, 대부분의 종래 기재된 뼈유도성 인자들은 Cbfa1 의 상류방향에서 기능하는 것으로 나타난다 (표 1). 예를 들어, BMP2, BMP7, 인슐린-형 성장 인자-I (IGF-I), 및 형질전환 성장 인자-β1 (TGF-β1) 는 Cbfa1 전사를 상향조절하는 것으로 공지되어 있다 (Nakashima, K. and B. de Crombrugghe, Trends Genet, 2003. 19(8): p. 458-66 Tou, L., N. Quibria, and J.M. Alexander, Mol Cell Endocrinol, 2003. 205(1-2): p. 121-9 Pei, Y., 등, Acta Pharmacol Sin, 2003. 24(10): p. 975-84 Lee, M.H., 등, J Cell Biochem, 1999. 73(1): p. 114-25). 표 1 은 일부 입증된 뼈유도성 인자들을 보여준다: 섬유모세포 성장 인자 2 (FGF2), 부갑상선 호르몬 (PTH) (Franceschi, R.T. and G. Xiao, J Cell Biochem, 2003. 88(3): p. 446-54 Kim, H.J., 등, J Biol Chem, 2003. 278(1): p. 319-26), FGF 수용체 1 (FGFR1) (Zhou, Y.X., 등, Hum Mol Genet, 2000. 9(13): p. 2001-8), 혈관 혈관형성 인자인 내피 성장 인자 (VEGF) (Zelzer, E., 등, Mech Dev, 2001. 106(1-2): p. 97-106) 및 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 성장판 혈관형성에서 Cbfa1 와 연합하여 기능할 수 있는 다관능성 성장 인자 (Himeno, M., 등, J Bone Miner Res, 2002. 17(7): p. 1297-305).

표 1. 뼈 이식편 분류 체계
이식편 유형	설명	단점
자가이식	환자로부터 취한 뼈 이식편	1. 제 2 의 외과수술 부위 2. 마취시간 연장 3. 단기간 및 장기간의 공여 부위 이환율 4. 제한된 공급
동종이식 기재	사체의 뼈 이식편을 탈단백질화 또는 탈미네랄화시킬 수 있다	1. 감염, 질환 전파에 대한 위험 2. 제한된 뼈유도성 능력 (오직 탈미네랄화된 이식편에서만) 3. 제한된 공급
이종이식 기재	비-인간 종들 (예를 들어, BioOss-a 소 이식편) 유래의 탈단백질화 (탈미네랄화는 되지 않음) 뼈 이식편	1. 뼈유도성 능력이 없음 2. 약간 제한된 공급 3. 감염, 질환 전파에 대한 위험
세포 기재	다공성 스캐폴드에 환자 자신의 세포를 시딩함	1. 제 2 의 외과수술 부위 2. 추가적인 배양 시간 및 취급을 요할 수 있음
세라믹 기재	예시에는 칼슘 포스페이트, 칼슘 설페이트 및 바이오글래스가 포함됨	오직 미미한 뼈유도성 능력을 가짐
중합체 기재	분해성 및 비분해성 중합체 양방	뼈유도성 능력 없음
성장 인자 기재	BMP, 비-BMPs (예를 들어, FGF, TGF-β, IGF, VEGF, PDGF, PTH/PTHrp)*, 및 유전자 요법	1. 적당한 전달 또는 뼈유도성 비히클을 필요로 함 2. 다중적 세포 유형 상에서 다면발현적 효력 3. 예측불가한 생체내 뼈유도성 효력 (즉, 많은 경우에 있어서, 특이성은 담체에 좌우됨)
*약어: FGF (섬유모세포 성장 인자s), TGF-β (형질전환 성장 인자-β, IGF (인슐린-형 성장 인자), VEGF (혈관 내피 성장 인자), PDGF (혈소판-유도성 성장 인자), PTH (부갑상선 호르몬)/PTHrp (PTH-조절화 단백질)
Laurencin, C. and Y. Khan, Bone Graft Substitute Materials .emedicine, 2004: p. http://www.emedicine.com/orthoped/topic611.htm 에서의 부분을 각색함

Cbfa1 의 뼈유도성 특징도 또한 연구되었다. 아데노바이러스의 Cbfa1 (Ad Cbfa1) 가 형질도입된 골수 간질 세포 (BMSC) 는 시험관 내에서의 미네랄화 증가 및 마우스 임계-크기 두개골의 결함에서의 뼈 형성 증가를 증명했다 (Zheng, H., 등, Calcif Tissue Int, 2004. 74(2): p. 194-203). 더욱이, 쥐과동물 다능성 중간엽 세포주인 C3H10T1/2 세포에 대한 AdCbfa1 및 AdBMP2 공동-형질도입은 시험관내에서의 뼈모세포 분화, 및 형질도입된 C3H10T1/2 세포를 면역결핍 마우스에 피하로 이식한 경우 시험관내 뼈 분화를 상승적으로 자극하며 생체내에서의 뼈 형성을 현저히 증가시킨다는 것을 증명했다 (Franceschi, R.T., 등, Cells Tissues Organs, 2004. 176(1-3): p. 95-108 Yang, S., 등, J Bone Miner Res, 2003. 18(4): p. 705-15). 상기 결과들은 BMP 에 대한 뼈 조상 세포 세포 집단의 응답성이 뼈 조상 세포 직계의 주된 조절자인 Cbfa1 에 의해 시험관내에서 및 생체내에서 증강될 수 있음을 보여준다 (Franceschi, R.T., 등, Cells Tissues Organs, 2004. 176(1-3): p. 95-108).

Cbfa1 의 하류방향 표적으로서의 NELL 펩티드

NELL 펩티드는 Cbfa1 의 하류방향의 표적일 수 있다 (Kuroda, S., 등, Biochem. Biophys Res Commun,1999. 265:79-86; Ting, K., 등, J Bone Miner Res, 1999. 14:80-89). Cbfa1 은 그의 프로모터 영역에서의 뼈모세포-특이적 시스-작용 (cis-acting) 인자 2 (OSE2) 응답 인자들에 대한 결합에 의해 다수의 하류방향 뼈모세포 유전자, 예컨대 α1 type I 콜라겐 (Col1 - a1), 뼈 시알로단백질 (Bsp), 오스테오폰틴 (Op), 및 Oc 의 전사를 촉진시키는 것으로 공지되어 있다 (Ducy, P., 등, Genes Dev, 1999. 13(8): p. 1025-36). 연구들은 인간 NELL1 유전자 상의 3 개의 기능성 OSE2 응답 인자의 존재성을 나타내 NELL1 이 Cbfa1 조절 유전자임을 확인한다는 것을 나타냈다 ((데이터는 나타내지 않음), 도 11 참조).

NELL1 은 처음, 아데노바이러스의 NELL1 과발현이 시험관내에서, NIH3T3 섬유모세포와 같은 비-뼈모세포에서는 그렇지 않지만, 뼈모세포에서는 분화 및 미네랄화를 선택적으로 현저히 증가시켰을 때 (Zhang, X., 등, J. Clin Invest, 2002. 110(6): p. 861-70), 및 생체내 NELL1 과발현이 트랜스제닉 동물의 두개 봉합을 거친 조숙한 뼈 형성 및 뼈질의 두개골의 과성장을 현저하게 증가시켰을 때, 뼈 형성과 관련하여 주목을 받았다. 상기 단락에서와 같이, NELL1 발현은 뼈모세포 형성 및 기능의 중요한 중재자인 Cbfa1/Runx2 에 의해 하류방향에서 직접적으로 조절되어, 추가로 분화될 뼈발생 직계 세포 (즉, 수임된 뼈모세포) 상에서 더욱 특이적으로 또는 바람직하게 작용할 수 있음을 나타낸다.

NELL1 은 종을 넘나들어 고도로 보존된다. 래트 및 인간 NELL1 은 93% 의 상동성이 예측되는 아미노산 상동성을 공유한다 (Ting, K., 등, J Bone Miner Res, 1999. 14:80-89). NELL1 은 분비 시그널 펩티드, NH₂-말단 TSP-1-형 모듈, 5 개의 코르딘-형 CR 도메인 및 6 개의 EGF-형 도메인을 포함하여, 여러개의 매우 고도로 보존되는 모티프를 포함한다 (도 1) (Kuroda, S., 등, Biochem Biophys Res Commun, 1999. 265(1): p. 79-86). 래트 NELL1 은 지속 변성 후 130-kDa 단백질로 전환되는 400-kDa 단백질로서 배지에 분비된다 (Id.). 130-kDa 단량체는 코일드-코일 영역 또는 CR 도메인을 통한 단독삼량체로 회합될 것으로 예측된다 (Voorberg, J., 등, Journal of Cell Biology, 1991. 113(1): p. 195-205). 연구들은 NELL1 이 결정적으로 Cbfa1 의 하류방향 효력의 일부, 예컨대 뼈모세포 분화 및 기능의 지속 (Ting, K., 등, J Bone Miner Res, 1999. 14:80-89) 및 Cbfa1 의 하류방향 기능의 지속 (Zhang, X., 등, J Clin Invest, 2002. 110(6): p. 861-70 Otto, F., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 765-71) 을 결정적으로 중재할 수 있음을 시사한다.

생체내에서, 내인성 NELL1 발현은 봉합 융합의 발달하는 뼈발생 전면과 시간적으로 및 공간적으로 대응한다는 것이 밝혀졌다. 트랜스제닉 NELL1 과발현 마우스는 또한 두개 봉합을 통해 병리학적 뼈의 두개골의 과성장을 증명했다 (Zhang, X., 등, J Clin Invest, 2002. 110(6): p. 861-70).

뼈모세포 분화 및 기능에서의 Cbfa1 의 하류방향 중재자로서의 NELL1 은 NELL1 에 의한 Cbfa1 결핍의 일부 측면의 기능 벌충으로 더욱 확립되었다. 한 연구에서, NELL1 과발현 마우스 (NELL1 ^overexp ) 및 Cbfa1 ^+/- 마우스의 상호혼화 (intercrossed) F₂ 자손 를 시험했다. 뼈모세포 표현형의 최소한의 구제가 NELL1^overexp+Cbfa1 ^-/- 마우스에서 관찰되었고, 이는 추측컨대 수임된 뼈모세포가 결핍되었을 것이다. 추가로, NELL1 ^overexp Cbfa1 ^-/- 마우스는 NELL1 가 연골내 석회화와 연관된 중요한 프로세스임을 나타내는 증가된 연골세포 비대화를 증명했다 (도 7A 참조). 11 마리의 NELL1 ^overexp Cbfa1 ^+/- 마우스 중 9 마리는 수임된 것을 포함했으나, 뼈모세포가 불완전하게 기능하여, 일반적인 CCD-형 표현형으로부터의 명확한 구제를 나타냈다 (Otto, F., 등, Cell, 1997. 89(5): p. 765-71). 마이크로-CT 분석에 동반된 알리자린 레드 (Alizarin red) 및 알시안 블루 (Alcian blue) 염색은 천문 크기 및 봉합 너비가, 비-구제 Cbfa1 ^+/- 마우스에 비해 NELL1 ^overexp Cbfa1 ^+/- 마우스에서 더 적은 저형성 빗장뼈와 일치되게 상당히 더 작았음을 확인시켜줬다 (도 2).

연구들은 또한, 다른 것들 중에서도 특히, 다음과 같음을 보여줬다: 1) Cbfa1 는 NELL1 발현을 상향조절한다; 2) NELL1 과발현은, 영향받기 쉬운 세포 유형에서 뼈모세포-타입 분화를 선택적으로 증가시킨다 (즉, ALP 활성, OP 및 OC 발현 증가); 3) NELL1 과발현은 추가의 분화된 뼈발생 직계 세포 (즉, 수임된 뼈모세포) 에 작용한다; 및 4) NELL1 과발현은 두개봉합시 뼈의 과성장을 증가시킨다; 5) NELL1 과발현은 Cbfa1 결핍의 일부 측면에 대해 기능적으로 벌충할 수 있다; 및 6) NELL1 과발현은 연골내 뼈 형성과 연관된 과정들 (예를 들어, 연골세포 비대) 을 선택적으로 증가시킨다.

NELL 펩티드는 또한 비-머리얼굴 뼈 생성에 유효하다. 예를 들어, 긴 뼈에서 분리된 골수 간질 세포 (BMSC) 에 대한 형질도입된 AdNELL1 의 시험관내 효과 및 누드 마우스에 대한 AdNELL1 주입의 생체내 효과가 연구되었다. 상기 연구는 AdNELL1 형질도입 BMSC 가 상기 Ad β- Galactosidase (Ad β- Gal) 대조군보다도 훨씬 더 증가된 미네랄화 뼈 결절 형성을 보여주며 (도 3), AdNELL1 주입은 근육에서의 이소성 석회화 결절을 야기한다는 것을 증명하여, NELL1 이 비-머리얼굴 뼈모세포 분화 및 뼈 형성을 증가시킬 수 있음을 보여준다.

더욱이, NELL 펩티드는 또한 뼈모세포 분화 마커를 상향조절하고 BMP 단백질, TGFβ 단백질, FGF, IGF (인슐린형 성장 인자), VEGF, 또는 이들의 조합과 상승적으로 작용하여 시험관내 뼈 분화 마커 (예를 들어, ALP , OC) 의 발현 및 생체내 뼈 형성을 증가시킨다 (도 8 참조). 예를 들어, NELL2 및 BMP2 는 뼈모세포 분화 유도에서 상승적일 수 있다. 도 8 에 나타낸 바와 같은 예시는 NELL2 및 NELL1 과 같은 NELL 펩티드가 뼈모세포 분화를 조절하여 뼈 형성을 촉진시킬 수 있음을 증명한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 NELL 펩티드의 발현을 유도하는 분자의 식별 방법을 제공한다. 그 방법은 하기 단계를 포함한다: (1) NELL1 프로모터 유전자와 시험 화합물을 접촉시키는 단계, (2) NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준을 탐지하는 단계, (3) NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준을 시험 화합물 부재시의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계, 및 (4) 시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준과 상이한 경우, 시험 화합물을 NELL 펩티드 발현의 조절제로서 지정하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법 단계는 추가로 하기 단계를 포함한다: (5) 시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준보다 더 낮은 경우, 조절제를 NELL 펩티드 발현의 저해제로서 지정하거나, 또는 (6) 시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준보다 더 높은 경우, 조절제를 NELL 펩티드 발현의 증강제로 지정하는 단계. 상기 방법에 따라 식별되는 조절제는 포유류에서 NELL 펩티드의 발현 조절제로서 사용될 수 있다.

NELL 펩티드를 발현하는 계

NELL1 펩티드는 NELL1 유전자 또는 cDNA 또는 RNA 또는 그의 임의의 절편에 의해 발현될 수 있는 단백질이다. 상기 NELL1 유전자, cDNA, RNA 또는 그의 절편에는, 인간 NELL1 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 1 내지 11, 마우스 NELL1 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 17 내지 71, 및 래트 NELL1 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 75 및 76 이 포함된다. NELL1 펩티드에는 뼈발생 세포 분화, 뼈모세포 분화, 뼈 형성 또는 연골 재형성을 유도하는 능력을 보유하는 NELL1 펩티드 절편이 포함될 수 있다.

NELL2 펩티드는 NELL2 유전자, cDNA 또는 RNA 또는 그의 임의의 절편에 의해 발현될 수 있는 단백질이다. 상기 NELL2 유전자, cDNA 또는 RNA 또는 그의 임의의 절편에는, 인간 NELL2 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 12 내지 16, 마우스 NELL2 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 72 내지 74, 래트 NELL2 펩티드 또는 그의 절편을 코딩하는 서열 식별 번호 77 내지 81 이 포함된다. NELL2 펩티드에는 상기 기재된 NELL2 펩티드와 동일한 능력을 보유하는 NELL2 펩티드 절편이 포함될 수 있다.

NELL1 또는 NELL2 펩티드는 임의의 상기 기재된 NELL1 또는 NELL2 유전자를 포함하는 핵산 구축물에서 발현될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명에는 기능성 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 또는 NELL2 펩티드를, 곤충 세포주를 이용하여 발현하는 방법을 포함한다. 한 구현예에서, 곤충 세포는 하이 파이브 세포 (high five cell), Sf9 및 기타 Sf 세포일 수 있다.

한 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 NELL1 또는 NELL2 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 제공을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한, 실질적 서열 유사성, 예컨대 상기 열거된 서열의 임의의 부분과 약 75% 이상의 서열 유사성을 가진 것과 같은 서열을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산은 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 또는 NELL2 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 pIZT/V5-His (Invitrogen) 일 수 있으며, 선별 마커는 또한 블라스트시딘 및 네오마이신일 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 서열은 또한 유전자 발현 수준을 모니터링하기 위한 리포터 생산물 (reporter product) 을 코딩하거나 또는 펩티드 발현 수준 모니터링 분야에서 공지된 방법을 이용하여 가시화될 수 있는 펩티드 태그를 코딩하는 추가적인 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 서열은 핵산 발현 또는 발현된 펩티드 생성물의 기능에 방해가 되지 않도록 선별될 수 있다.

핵산 구축물은 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 시그널 펩티드는 임의의 NELL 시그널 펩티드일 수 있다. 상기 시그널 펩티드의 일부 예시는, 인간, 래트, 마우스 또는 개 NELL 시그널 펩티드이다. NELL 시그널 펩티드의 일부 다른 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 핵산 서열 식별 번호 88 로 코딩되는 인간 NELL2 시그널 펩티드 서열 식별 번호 89, 핵산 서열 식별 번호 90 으로 코딩되는 래트 NELL2 시그널 펩티드 서열 식별 번호 91, 핵산 서열 식별 번호 92 로 코딩되는 마우스 NELL2 시그널 펩티드 서열 식별 번호 93, 핵산 서열 식별 번호 94 로 코딩되는 개 NELL2 시그널 펩티드 서열 식별 번호 95 가 포함된다. 핵산은 NELL 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 발현을 위한 발현 벡터를 포함할 수 있다. 더욱이, 핵산 서열은 유전자 발현 수준의 모니터링을 위한 리포터 산물을 코딩하거나, 또는 펩티드 발현 수준의 모니터링을 위한 당업계에 공지된 방법을 이용하여 가시화될 수 있는 펩티드 태그를 코딩하는 추가적인 핵산을 포함할 수 있다.

핵산 구축물은 발현 및 클로닝 벡터를 포함할 수 있으며, 이는 선별가능 마커라고도 일컬어지는 선별 유전자, 예컨대 벡터로 형질전환된 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함해야 한다. 상기 유전자의 존재로, 벡터가 결실된 세포는 형질전환된 숙주의 성장 또는 생식에서 유리한 장점을 수득하지 못하도록 보장한다. 전형적인 선별 유전자는, (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 내성을 가진 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 벌충하는 단백질을 코딩한다.

핵산 구축물은 또한 숙주 유기체에 의해 인식되며, NELL 코딩 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터는 유도성 및 구조성 프로모터를 포함하는, 그의 제어 하의 전사 및 핵산의 번역을 조절하는 구조 유전자 (일반적으로, 약 100 내지 1000 bp) 의 개시 코돈으로부터 상류방향에 위치된 번역되지 않는 서열이다. 유도성 프로모터는 배양 조건에서의 소정의 변화, 예를 들어, 영양물의 존재성 또는 부재성 또는 온도 변화에 응답성인 그의 제어 하에 DNA 로부터의 전사 수준 증가를 개시하는 프로모터이다. 이때, 각종 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 대다수의 프로모터는 널리 공지되어 있다. NELL1 프로모터 핵산 서열의 일부 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 NELL1 프로모터, 마우스 NELL1 프로모터, 및 래트 NELL1 프로모터를 각각 코딩하는 서열 식별 번호 82, 84, 및 86 이 포함된다. NELL2 프로모터 핵산 서열의 일부 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 인간 NELL2 프로모터, 마우스 NELL2 프로모터, 및 래트 NELL2 프로모터를 각각 코딩하는 서열 식별 번호 83, 85, 및 87 이 포함된다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치되어 있는 경우 작동적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 예비서열 (presequence) 또는 분비 리더 (secretory leader) 에 대한 DNA 는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질 (preprotein) 로서 발현되는 경우의 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되어 있으며; 프로모터 또는 증강제는 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치되는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결되어 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드를 포유류 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포) 에서 발현하기 위한 핵산 구축물을 포함할 수 있다. 핵산 서열은 NELL 펩티드의 적어도 기능성 부분을 코딩하는 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA 일 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열에는 상기 기재된 NELL1 또는 NELL2 유전자가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 서열에는 또한 실질적인 서열 동일성을 가진 것과 같은 서열들, 예컨대 상기 열거된 서열의 임의의 부분과 약 75% 이상의 서열 동일성을 가진 서열이 포함될 수 있다.

일부 구현예에서, 포유류 세포 (예를 들어, CHO 세포) 에서 NELL1 및/또는 NELL2 펩티드를 생산하기 위해, NELL1 및/또는 NELL2 에 대한 발현계에는 내인성 시그널 펩티드를 발현하는 핵산 또는 cDNA 가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, NELL1 및/또는 NELL2 펩티드에 대한 발현계에는 NELL2 시그널 펩티드를 발현하는 핵산 또는 cDNA 가 포함될 수 있다. NELL2 시그널 핵산 또는 cDNA 의 NELL1 펩티드 발현계로의 혼입은 NELL1 펩티드의 생산을 더욱 효율적으로 되도록 한다.

한 구현예에서, 본 발명은 기능성 NELL 펩티드를 발현하는 세포를 포함한다. 한 구현예에서, 그 세포는 곤충 세포일 수 있다. 한 구현예에서, 그 곤충 세포는 하이 파이브 세포 (high five cell) 일 수 있다.

한 구현예에서, 세포는 NELL 펩티드를 코딩하는 핵산 구축물로 트랜스펙션될 수 있다. 예를 들어, 세포주는 NELL 펩티드를 코딩하는 핵산 구축물로 일시적으로 또는 안정하게 트랜스펙션될 수 있다. 한 구현예에서, NELL 발현 핵산 (예를 들어, cDNA(들)) 은 유전자 발현 벡터 또는 세포 (예컨대, 곤충 세포 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)) 를 트랜스펙션하기 위해 수임되는 바이러스 입자들에 클로닝될 수 있다. 일부 구현예에서, 구축물은 임의의 프레프로트립신 (Preprotrypsin), 인간 tPA, Ig 의 면역글로불린 경쇄 및 Fc 절편, 인터류킨일 수 있는 시그널 펩티드를 이용해 pTB701 과 같은 벡터를 포함할 수 있다. pTB701 벡터는 [Kuroda 등, Biochemical & Biophysical Research Communications, 265:79-86 (1999)] 에서 보고되었다.

핵산 서열은 또한 곤충 분비 시그널 펩티드를 코딩하는 핵산이 있는 프레임 내에 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 또는 NELL2 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 기능성 NELL 펩티드를 발현하며 기능성 단백질을 분비할 수 있는 세포를 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 또는 NELL2 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (아미노산 서열) 을 포함할 수 있으며, 분비 (secretory) 시그널 펩티드를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, NELL 펩티드 또는 단백질을 발현하는 유전자 서열은 전체 NELL 분자 또는 그의 절편을 발현하는 임의의 유전자 서열을 포함할 수 있다. 상기 유전자 서열은 임의로는 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 게놈 서열은 크게 다음과 같이 분류될 수 있다: (1) 기능성 단백질을 코딩하는 게놈 서열 (이는 상이한 mRNA 스플라이스 변이체를 포함할 수 있음), (2) 기능성 단백질의 발현을 조절할 수 있는, 비-코딩성의 전사되지 않는 게놈 서열 (프로모터 영역, 기타 전사되지 않는 DNA 영역 등), 및 (3) 기능성 단백질의 발현을 조절할 수 있는, 비코딩성의 전사되는 게놈 서열 (예를 들어, tRNA 및 rRNA, 또한 인트론, 5' 및 3'-UTR, 전이성 인자들, 유전자간 (intergenic) 영역 및 안티센스 능력이 존재 또는 부재하는, 흥미롭게도 수천개의 상이한 소형의 안정한 RNA.

각각의 DNA 분자는 다수의 유전자 -- 유전의 기본적인 물리적 및 기능적 단위를 포함한다. 유전자는, 그의 서열이, 세포의 구조적인 구성원 뿐만 아니라 필수적인 생화학적 반응에 대한 효소를 제공하는 단백질 구축에 필요한 정보를 담고 있는 특이적인 뉴클레오티드 염기의 서열이다. 인간 게놈은 30,000 개를 초과하는 유전자를 포함할 것으로 추정된다.

인간 유전자는, 종종 천단위의 염기를 넘어서는, 길이에 있어서 광범위하게 다양하지만, 게놈의 오직 약 10% 만이 유전자의 단백질-코딩 서열 (엑손) 을 포함하는 것으로 공지되어 있다. 대다수 유전자 내에 내포된 것은 인트론 서열로, 코딩 기능이 없다. 게놈의 균형은, 그의 기능이 불분명한 기타 비코딩 영역 (예컨대, 조절 서열 및 유전자 사이의 영역) 으로 이루어지는 것으로 생각된다. 모든 살아있는 유기체들은 대부분 단백질로 이루어져 있으며; 인간은 100,000 가지 이상의 상이한 종류를 합성할 수 있다. 단백질은 아미노산으로 지칭되는 하위단위의 긴 사슬로 된 큰, 복잡한 분자이다. 20 가지의 상이한 종류의 아미노산이 일반적으로 단백질에서 발견된다. 유전자 내에서, 3 개 DNA 염기의 각각의 특이적인 서열 (코돈) 은 세포 단백질-합성 조직이 특이적인 아미노산을 추가하도록 지령한다. 예를 들어, 염기 서열 ATG 는 아미노산 메티오닌을 코딩한다. 3 개의 염기가 1 개의 아미노산을 코딩하므로, 평균-크기의 유전자 (3000 bp) 에 의해 코딩되는 단백질은 1000 개의 아미노산을 포함할 것이다. 이에 따라, 유전자 코드는 특이적이 단백질을 제공하기 위해 어떤 아미노산이 필요한지 지정하는 일련의 코돈이다.

유전자로부터의 단백질-코딩 지령은 단일 가닥의 DNA 와 유사한 일시적인 중계자적 분자인 메신저 리보핵산 (mRNA) 을 통해 간접적으로 전달된다. 발현될 유전자 내의 정보에 대해서는, 상보적인 RNA 가닥이 핵 내의 DNA 주형으로부터 제공된다 (전사라고 지칭되는 과정). 상기 mRNA 는 핵으로부터 세포의 세포질로 움직여서, 단백질 합성에 대한 주형으로서 제공된다. 이어서, 세포 단백질-합성 조직은 코돈을, 그가 코딩할 단백질 분자를 구성할 아미노산의 스트링으로 번역한다. 실험실에서는, mRNA 분자가 분리될 수 있으며, 염색체 지도 상에서 상응하는 유전자에 위치시키기 위해 이용될 수 있는 상보적인 DNA (cDNA) 가닥을 합성할 주형으로 이용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 성공적인 전달까지는 기타 화학물을 이용한 결합 또는 나노케이지 또는 생체적응재료로의 혼입에 의해 안정화되어야 한다. 인간에서는 코딩 영역보다는 더 많은 비코딩 영역이 있다. 게놈의 비코딩 부분은 중요한 조절적 역할을 담당한다. 인간 게놈의 절반 이상은 전사된다. 이렇게 전사된 것의 약 95% 가 tRNA 및 rRNA 뿐만 아니라, 인트론 5' 및 3'-UTR, 전위성 인자, 유전자간 영역 및 흥미롭게도 수천개의 상이한 소형 안정 RNA 를 포괄하는 비코딩 RNA (ncRNA) 이다. 나노케이지 또는 생체적응재료는 하기 기재되는 담체 또는 스캐폴드일 수 있다.

다수의 이들 전사된 영역은 인간과 설치류 사이에 진화론의 맥락으로 보존되어 (인간과 마우스 사이에 95% 까지의 보존성), 지속되는 기능임을 시사한다. 상기 비코딩 RNA 의 광범위한 분획의 핵심적인 특징은 그의 안티센스 능력 (antisense capability) 이다: 이들은 다소간의 확장된 염기쌍 상보성을 통해 또다른 RNA 를 표적으로 할 수 있다. 이는 snoRNA 및 miRNA 에 대해 증명된다. NcRNA 는 소정의 예상치않은 기능을 만족시킨다. 이들은 발생, 이질염색질 형성, 전사, 교대적인 스플라이싱 및 에디팅 (alternative splicing and editing) 을 포함하는 세포 프로세스의 조절에 중요한 역할을 한다. 정확하게 알려진 기능이 있는 대부분의 ncRNA 는 도처에 존재하며, 대부분의 신규하게 동정된 ncRNA 는 발생시에, 즉 성별-, 조직- 또는 세포 특이적 방식으로 조절되는 것으로 발견되었다. 안티센스 ncRNA 중에서도 특히, 커다란 패밀리가 신속히 부상하고 있다: 마이크로-RNA (miRNA). 이들은 고등 유기체 사이에서 고도로 보존성이며, 일시적인 세포 직계 결정 및 조직-특이적 유전자 조절에 수반되며, 각종 발생학적 및 생리학적 프로세스를 조절한다. 그의 일반적인 작용 양태는 번역의 붕괴 또는 저해를 위한 mRNA 를 표적화하는 것이다.

NELL 펩티드의 저해제

본 발명의 한 국면에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 조숙하거나 또는 과도한 뼈 생성과 연관되어 있는 뼈 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 NELL 펩티드 활성을 저해하는 약제를 포함할 수 있다. 약제는, 이에 제한되지 않으나, NELL1 저해제 또는 NELL2 저해제 또는 이들의 조합일 수 있다. 용어 "NELL 펩티드의 저해제" 는 개요 부분에서 기재된 바 있다.

단백질과 같은 생물활성 화합물의 저해제에 대한 임의의 스크리닝 검정 방법이 NELL 펩티드 저해제에 대한 스크리닝에 이용될 수 있다. 일부 검정 방법은 PCT/2003/029281 (WO 2004/024893) 에 기재되어 있다.

대표적인 NELL1 또는 NELL2 저해제에는, 전사 단계에서 (예를 들어, NELL1 또는 NELL2 는 프로모터에 Cbfa1 결합 부위를 포함하므로, Cbfa1 특이적 siRNA, 항체) 및/또는 번역 단계에서 (예를 들어, NELL1 특이적 siRNA, NELL2 특이적 siRNA, 또는 NELL1 또는 NELL2 에 결합하는 수용체, 예컨대 NELL-1 또는 NELL2 특이적 항체) 에서 NELL1 또는 NELL2 를 특이적으로 저해할 수 있는 임의의 약제가 포함된다.

NELL 펩티드의 증강제

또다른 구현예에서, 하나 이상의 NELL 펩티드의 증강제를 포함하는 약제학적 조성물에 제공된다.

NELL 펩티드 수용체의 조절제

본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 NELL 펩티드 수용체의 조절제를 포함할 수 있다. NELL1 및 NELL2 단백질은 멤브레인 결합 수용체에 결합하는 분비 분자이다 (Kuroda, S., 등, Biochem Biophys Res Commun, 265(1): p. 79-86) (1999).

NELL 펩티드 수용체의 조절제는 수용체 조절제에 대한 임의의 확립된 스크리닝 방법에 의해 식별될 수 있다. 한 구현예에서, NELL 펩티드 수용체의 조절제는 경쟁적 결합에 의해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 조절제에 대한 한 가지 스크리닝 방법에는 하기의 단계들이 포함될 수 있다: (1) NELL 펩티드의 수용체 분자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계, (2) NELL 펩티드를 수용체 분자 및 시험 화합물과 접촉시키는 단계, (3) 시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도를 탐지하는 단계, (4) NELL 펩티의 수용체 분자에 대한 결합 정도를, 시험 화합물의 부재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도를 탐지하여 수득되는 대조군의 결합 정도와 비교하는 단계, 및 (5) 시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대조군의 결합 정도와 상이한 경우, 시험 화합물을 NELL 펩티드 수용체의 조절제로서 지정하는 단계. 조절제는 수용체의 안타고니스트 또는 아고니스트로서 지정될 수 있다. 시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대조군의 결합 정도보다 더 낮다면, 그 조절제는 NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트이다. 시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대조군의 결합 정도보다 더 높다면, 그 조절제는 NELL 펩티드 수용체의 아고니스트이다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 NELL 조절제에는 NELL 및/또는 NELL 수용체를 안정화 또는 분해하는 분자 뿐만 아니라, 초기 수용체 라이게이션 후 NELL-수용체 복합체의 안정화 및 인산화에 참여하는 분자들도 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조절제에는 상기 언급된 아고니스트 및 안타고니스트의 아고니스트가 포함될 수 있다. 예를 들어, NELL-안타고니스트의 저해제를 포함하는 조성물은 뼈 대사를 증가시킬 수 있다. 모든 경우에 있어서, 상기 문단에서 논의된 것이 포함되도록 임상 적용을 확장하길 바란다.

NELL 펩티드 수용체의 조절제는 수동적인 시험에 의해 또는 조합적인 화학을 근거로 하는 계와 같은 자동화된 계에 의해 스크리닝될 수 있다. 조합적인 화학을 근거로 하는 스크리닝계의 한 예시는 PCT/2003/029281 (WO 2004/024893) 에 기재되어 있다.

연골 재형성

관절 연골은 대부분 물 (60 내지 80 중량%) 로 이루어지며, 나머지 ECM 은 대부분 타입 II 콜라겐 (50 내지 90% 의 건조 질량) 및 프로테오글라이칸 (5 내지 10%) 을 포함한다. 기타 콜라겐 및 미량의 ECM 분자들은 소량으로만 존재함이 밝혀졌다. 이는 ECM 의 전혀 다른 구역으로의 조직화이며, 관절을 가로지르는 생의학적 힘의 흡수 및 전달에 필요한 강인함을 제공하는 여러 구역에서의 물과 ECM 사이의 상호작용, 및 동시에 관절 운동에 필요한 마찰이 없는 유체절 (articulating) 표면이다. 일상적인 걸음걸이 및 점프 동안 각각 인간 고관절에서는 4 내지 20 MPa 의 높은 응력이 있음이 보고되었다. 관절 연골에서는 놀랍게도, 불행하게도 수복시 최소한의 역량만을 나타낸다. 이천만명이 넘는 미국인들이 매년 $600 억이 넘는 건강관리 부담과 연계된 골관절염 및 퇴행성 관절 질환을 앓고 있다. 광범위한 대열의 스캐폴드, 싸이토카인 및 성장 인자가 연골 조직 공학에 대해 연구되어 오고 있다 (예를 들어, Frenkel, S.R., 등, Ann. Biomed. Eng. 32:26-34 (2004); Tuli, R., 등, Arthritis Res. Ther. 5:235-238 (2003); and Ashammakhi, N. and Reis, RL. Topics in Tissue Engineering, Vol. 2, 2005 를 참조). 연골세포의 생물학적 응답성 및 조직 리모델링에 걸리는 정적 대 동적 압축, 전단력, 정수 압력, 유체 유동, 전기 흐름 전위, 생물반응기 및 복합체의 역할이 집중적으로 연구되어 왔으며, 역학적전이 (mechanotransduction) 경로는 (Ashammakhi, N. and Reis, RL. Topics in Tissue Engineering, Vol. 2, 2005) (도 7A 내지 D 참조) 에서 개괄되었다.

따라서, 본 발명의 또다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물에는 연골 형성을 위한 연골모세포 및 연골세포를 유도하기에 유효한 양으로, 적어도 NELL 펩티드 또는 NELL 펩티드 수용체의 아고니스트가 포함된다. NELL 단백질, 펩티드, DNA, RNA, 및 NELL 아고니스트, 및 안타고니스트 저해제가, 추가적인 성장 인자의 존재 또는 부재 하에, 세포의 존재 또는 부재 하에, 기계적 자극의 존재 또는 부재 하에, 단독으로 또는 스캐폴드와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 구현예에서, 약제학적 조성물은 추간판, 관절 연골 수복 및 재생에서의 연골 재생에 유효할 수 있다. 또다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 조직 공학에서 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에 세포에 대한 단백질 적용 및 생체외 유전자 요법을 통해 연골 형성시 유효할 수 있다.

전달 방법 및 지엽적 환경에 따라서는, NELL 펩티드 (예를 들어, NELL1 펩티드) 를 포함하는 조성물은 연골만을 분화 및 형성하기 위해 연골세포 또는 연골모세포와 같이 뼈발생 세포를 유도하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 특히 관절 연골 결함에서, 본원에 기재된 조성물은 연골만을 형성할 연골세포/배아와 같은 뼈발생연골발생 세포를 유도할 수 있다. 조성물은 결손된 연골 영역에 스캐폴드/담체로서 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 임의로는 세포들 (줄기 세포, 연골모세포 등) 을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 유전자 요법으로서 적용될 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 연골 조직 공학에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 연골모세포가 "진동", 즉 간헐적 스트레스 장력 환경 상에서 배양되는 경우, NELL1 펩티드는 연골을 분화 및 형성하는 연골모 세포를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 진동 스트레스의 적용 기간은 또한 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 진동력이 연속적으로 적용되는 경우, NELL1 펩티드가 있는 조성물은 연골내 뼈 형성을 유도할 수 있다. 따라서, 진동의 적용시, 스트레스는 뼈발생 세포 (예를 들어, 연골세포/모세포) 가 연골 단계에서 정지하여 연골내 뼈 형성으로의 세포 분화를 피할 수 있도록 간헐적이어야 한다.

따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 수복 연골의 재생/수복, 예를 들어, 관절 연골 및 추간판에서의 디스크 수복에 이용될 수 있다.

본원에 개시된 약제학적 조성물로 치료, 예방 또는 완화될 수 있는 기타 예시적인 연골 상태에는, 이에 제한되지 않으나, 연골석회화, 골관절염 및/또는 병리학적 연골 퇴행을 특징으로 하는 기타 질환이 포함된다.

기타 약제

일부 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물에는 NELL 펩티드 및 뼈 생성 촉진에 유효한 기타 약제가 포함될 수 있다. 상기 기타 약제에는, 예를 들어 뼈 형태발생 단백질 (BMP), 예컨대 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17, BMP-18, BMP-19, BMP-20, BMP-21, FGF (섬유모세포 성장 인자, 예를 들어, FGF1 및 FGF2, FGF4, FGF7, FGF10, FGF19, FGF21, FGF23), TGF-β (형질전환 성장 인자-β, 예를 들어, TGF-1), IGF (인슐린-형 성장 인자, 예를 들어, IGF-I), VEGF (혈관 내피 성장 인자), PDGF (혈소판-유래 성장 인자), PTH (부갑상선 호르몬)/PTHrp (PTH-조절화 단백질), 옥시스테롤, 친지성 (lipophilic) 스타틴, 성장/분화 인자 5 (GDF5); 및 3 가지 이상의 스플라이스 변이체 (splice variants) 가 존재하는 LIM 미네랄화 단백질 (LMP) 이 포함된다. 이들 인자 및 이들이 작용하는 메카니즘에 관한 일부 연구가, Nakashima, K. and B. de Crombrugghe, Trends Genet, 2003. 19(8): p. 458-66; Tou, L., N. Quibria, and J.M. Alexander, Mol Cell Endocrinol, 2003. 205(1-2): p. 121-9; Pei, Y., 등, Acta Pharmacol Sin, 2003. 24(10): p. 975-84; Lee, M.H., 등, J Cell Biochem, 1999. 73(1): p. 114-25; Franceschi, R.T. and G. Xiao, J Cell Biochem, 2003. 88(3): p. 446-54; Kim, H.J., 등, J Biol Chem, 2003. 278(1): p. 319-26; Zelzer, E., 등, Mech Dev, 2001. 106(1-2): p. 97-106; Himeno, M., 등, J Bone Miner Res, 2002. 17(7): p. 1297-305; Kha, H. T. 등 J Bone Miner Res 19, 830-40, 2004; Izumo, N. 등 Methods Find Exp Clin Pharmacol 23, 389-94, 2001; Hatakeyama, Y. 등 J Cell Biochem 91, 1204-17, 2004; Pola, E. 등 Gene Ther 11, 683-93, 2004) 에 기재되어 있다. 한 연구에서는 FGF 수용체1 (FGFR1) 에서의 돌연변이화 활성화가 마우스에서 Cbfa1 발현, 뼈모세포 증식 및 분화, 및 두개 봉합을 거친 후 골질 두개골의 과성장을 극적으로 증가시켰다고 보고했다 (Zhou, Y.X., 등, Hum Mol Genet, 2000. 9(13): p. 2001-8).

한 구현예에서, 약제학적 조성물은 NELL1 펩티드 및 BMP 펩티드를 포함한다. 예시로서, 인간 뼈육종 세포주, Saos-2 (McQuillan, D.J., 등, Bone, 1995. 16(4): p. 415-26; Fedde, K.N., Bone Miner, 1992. 17(2): p. 145-51) 는, 각각 100 ng/ml 및 200 ng/ml 의 농도로 재조합 NELL1 및 BMP2 단백질과 함께 배양된다. 시험 결과는 BMP2 배양에 비해 조합된 NELL1/BMP2 배양에서 ALP 활성이 5 배 증가함을 증명하여, NELL1 가 BMP 에 대한 뼈모세포-형 세포 군집의 반응성을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 임의로는 LIM 단백질을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 구체적으로는 하나 이상의 상기 기재된 약제를 배제할 수 있다.

투여량

NELL 펩티드 및 기타 약제의 투여량은 약제의 유형, 질환 및 연령 및 성별과 같은 기타 인자를 기준으로 당업계에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.

한 구현예에서, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에 뼈 형성을 위한 NELL 펩티드의 투여량은 일반적으로 0.001 pg/mm² 내지 1 pg/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/mm² 내지 1 ng/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/mm² 내지 1㎍/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/mm² 내지 1 mg/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/mm² 내지 1 g/mm² 의 범위이다. 또다른 구현예에서, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에 뼈 형성을 위한 NELL 펩티드의 투여량은 일반적으로 0.001 pg/ml 내지 1 pg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/ml 내지 1 ng/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/ml 내지 1㎍/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/ml 내지 1 mg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/ml 내지 100 g/ml 의 범위이다. 또다른 구현예에서, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, 뼈 형성을 위한 NELL 펩티드의 투여량은 일반적으로 0.001 pg/kg 내지 1 pg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/kg 내지 1 ng/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/kg 내지 1㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 mg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 gm/kg 내지 1 gm/kg, 더욱 바람직하게는 0.001 kg/kg 내지 1 kg/kg 의 범위이다. 더욱이, 모든 투여량이 연속적으로 제공되거나 또는 주어진 정해진 기간마다 나누어 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 정해진 기간의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 매 시간, 2 시간 마다, 4 시간 마다, 6 시간 마다, 8 시간 마다, 12 시간 마다, 24 시간 마다, 48 시간 마다, 또는 72 시간 마다, 또는 매주, 2 주마다, 4 주마다, 또는 매월, 2 개월마다, 4 개월마다 등이 포함된다.

그러나, NELL 펩티드는 시험관내 뼈모세포 아폽토시스에 대한 유효성이 있으므로 (Zhang, X., 등, J Bone Miner Res, 2003. 18(12): p. 2126-34), 최적 범위를 현저하게 상회하는 NELL 투여량 (예를 들어, NELL1 투여량) 은 뼈 형성을 증가시키지 않을 수도 있다. 따라서, NELL 펩티드의 더욱 바람직한 투여량은 최적 투여량 범위를 현저하게 상회하지 않아야 한다. NELL 펩티드의 더욱더 바람직한 최적 투여량은 포유류 대상체의 유형, 연령, 부위 및 성별; 이용되는 담체 또는 스캐폴드; 상이한 NELL 펩티드의 순도 및 강력함에 따라 가변적일 수 있다. 한 구현예에서, NELL 펩티드의 더욱더 바람직한 최적 투여량 범위에는, 이제 제한되지 않으나, 1 ng/mm² 내지 100 ng/mm², 또는 더욱 바람직하게는 100 ng/mm² 내지 1000 ng/mm², 또는 더욱더 바람직하게는 1 ㎍/mm² 내지 100 ㎍/mm², 또는 더욱더 바람직하게는 100 ㎍/mm² 내지 1000 ㎍/mm² 이 포함된다. 또다른 구현예에서, NELL 펩티드의 더욱더 바람직한 최적 투여량 범위에는, 이에 제한되지 않으나, 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 또는 더욱 바람직하게는 100 ng/ml 내지 1000 ng/ml, 또는 더욱더 바람직하게는 1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 또는 더욱더 바람직하게는 100 ㎍/ml 내지 1000 ㎍/ml 이 포함된다. 또다른 구현예에서, 뼈 형성을 위한 더욱 바람직한 NELL 펩티드의 최적 투여량은 일반적으로, 특정한 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, 1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 100 ㎍/kg 내지 1000 ㎍/kg, 또는 더욱더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 100 mg/kg 이다. 더욱이, 모든 투여량이 연속적으로 제공되거나 또는 주어진 정해진 기간에 대해서 나누어 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 정해진 기간의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 매 1 시간, 2 시간 마다, 4 시간 마다, 6 시간 마다, 8 시간 마다, 12 시간 마다, 24 시간 마다, 48 시간 마다, 또는 72 시간 마다, 또는 매주, 2 주마다, 4 주마다, 또는 매월, 2 개월마다, 4 개월마다 등이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "최적 범위를 현저하게 초과함" 은, 예를 들어, 최적 범위를 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 또는 약 40% 내지 50% 초과함을 의미한다.

NELL 펩티드 저해제의 투여량은 저해제의 유형, 치료, 예방 또는 완화할 뼈 또는 연골 상태, 저해제를 포함하는 약제학적 조성물을 수용할 포유류 대상체의 연령, 부위 및 성별에 따라 가변적이다. 일반적으로, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, NELL 펩티드 저해제의 투여량은, 이에 제한되지 않으나: 0.001 pg/mm² 내지 1 pg/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/mm² 내지 1 ng/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/mm² 내지 1㎍/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/mm² 내지 1 mg/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/mm² 내지 1 g/mm² 이다. 또다른 구현예에서, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에 NELL 펩티드 저해제의 투여량은 일반적으로 0.001 pg/ml 내지 1 pg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/ml 내지 1 ng/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/ml 내지 1㎍/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/ml 내지 1 mg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/ml 내지 100 g/ml 이다. 또다른 구현예에서, 특정 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, NELL 펩티드 저해제의 투여량은 일반적으로 0.001 pg/kg 내지 1 pg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/kg 내지 1 ng/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/kg 내지 1㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 mg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 gm/kg 내지 1 gm/kg, 더욱 바람직하게는 0.001 kg/kg 내지 1 kg/kg 의 범위이다. 더욱이, 모든 투여량이 연속적으로 제공되거나 또는 주어진 정해진 기간에 대해서 나누어 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 정해진 기간의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 매 1 시간, 2 시간 마다, 4 시간 마다, 6 시간 마다, 8 시간 마다, 12 시간 마다, 24 시간 마다, 48 시간 마다, 또는 72 시간 마다, 또는 매주, 2 주마다, 4 주마다, 또는 매월, 2 개월마다, 4 개월마다 등이 포함된다.

NELL 펩티드 수용체의 조절제에 대한 투여량은, 저해제의 유형, 수용체의 유형, 치료, 예방 또는 완화시킬 뼈 또는 연골 상태, NELL 펩티드 수용체의 조절제를 포함하는 약제학적 조성물을 수용하는 포유류 대상체의 연령, 부위 및 성별에 따라 가변적이다. 일반적으로, NELL 펩티드 수용체의 조절제에 대한 투여량은, 이에 제한되지 않으나, 하기의 범위이다: 특정한 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재하에, 0.001 pg/mm² 내지 1 pg/mm² ^,또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/mm² 내지 1 ng/mm^2,또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/mm² 내지 1㎍/mm² ^,또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/mm² 내지 1 mg/mm², 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/mm² 내지 1 g/mm^2. 또다른 구현예에서, NELL 펩티드 수용체의 조절제의 투여량은 일반적으로, 특정한 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, 0.001 pg/ml 내지 1 pg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/ml 내지 1 ng/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/ml 내지 1㎍/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/ml 내지 1 mg/ml, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 g/ml 내지 100 g/ml 이다. 또다른 구현예에서, NELL 펩티드 수용체의 조절제의 투여량은 일반적으로, 특정한 담체 또는 스캐폴드의 존재 또는 부재 하에, 0.001 pg/kg 내지 1 pg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ng/kg 내지 1 ng/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 ㎍/kg 내지 1㎍/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 1 mg/kg, 또는 더욱 바람직하게는 0.001 gm/kg 내지 1 gm/kg, 더욱 바람직하게는 0.001 kg/kg 내지 1 kg/kg 이다. 더욱이, 모든 투여량이 연속적으로 제공되거나 또는 시행 기간에 대해서 나누어 제공될 수 있음이 이해될 것이다. 시행 기간의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 매 1 시간, 2 시간 마다, 4 시간 마다, 6 시간 마다, 8 시간 마다, 12 시간 마다, 24 시간 마다, 48 시간 마다, 또는 72 시간 마다, 또는 매주, 2 주마다, 4 주마다, 또는 매월, 2 개월마다, 4 개월마다 등이 포함된다.

제형물 담체

본원에 기재된 약제학적 조성물은 액체 또는 고체 형태로 경구 및 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 골수내), 비강내, 좌제로서 또는 "플래쉬" 제형물을 이용하여, 즉 물을 이용할 필요없이 구강에서 의약물이 용해되도록 하여, 국소적으로, 경피적으로, 피하 및/또는 점막을 통한 투여를 포함하는 각종 투여 경로로 치료가 필요한 대상체에게 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 각종 투여 형태, 예를 들어, 추출물, 필, 정제, 마이크로입자, 캡슐, 경구 액체로 제형화될 수 있다.

약제학적 조성물의 일부로서 약제학적으로 상용성인 결합제 및/또는 보조 재료가 포함될 수 있다. 활성 재료는 또한 원하는 작용을 방해하지 않고/않거나 원하는 작용을 보조하는 항생제, 항진균제, 기타 바이러스 사멸제 및 면역자극제와 혼합될 수 있다.

한 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 투여 양태는 경구이다. 경구 조성물에는 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체가 포함된다. 이들은 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 또는 정제로 타정될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적으로, 상기 언급된 화합물들은 부형제와 혼입되어 정제, 환제, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 츄잉 검 등의 형태로 이용될 수 있다. 그러나, 치료할 대상체의 상태에 따라 투여량에 있어서 소정의 변화가 필수적으로 있을 것이다. 상기 제제는 약 0.01 nM 내지 1,000,000 nM, 예를 들어, 약 0.2 내지 40 μM 의 활성 성분의 혈청 농도를 제공해야 한다. 바람직한 농도 범위는 0.2 내지 20 μM 이며, 가장 바람직하게는 약 1 내지 10 μM 이다. 그러나, 약물 조성물 중의 활성 성분의 농도는 자체로 약물의 생체이용율 및 당업자에게 공지된 기타 인자들에 좌우된다.

또다른 구현예에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물의 투여 양태는 국소 또는 점막 투여이다. 점막 투여의 특이적으로 바람직한 양태는 여성의 생식관을 통한 투여이다. 점막 투여의 또다른 바람직한 양태는 직장 투여이다.

각종 중합체성 및/또는 비중합체성 재료가 본원에 개시된 약제학적 조성물의 점막접착성 증강을 위한 보조제로서 사용될 수 있다. 보조제로서 적합한 중합체성 재료는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 대표적인 천연 중합체에는, 예를 들어 전분, 키토산, 콜라겐, 당, 젤라틴, 펙틴, 알기네이트, 카라야 검, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸에틸셀룰로오스, 및 히드록시프로필셀룰로오스가 포함된다. 대표적인 합성 중합체에는, 예를 들어, 폴리(아크릴산), 트라가칸트, 폴리(메틸 비닐에테르-코-말렌산 무수물), 폴리(에틸렌 옥시드), 카르보폴, 폴리(비닐 피롤리딘), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알콜), 폴리(히드록시에틸메틸아크릴레이트) 및 폴리카르보필이 포함된다. 약물 제형 업계에서 이용가능한 기타 생체접착성 재료가 또한 이용될 수 있다 (예를 들어, Bioadhesion Possibilities and Future Trends, Gurny and Junginger, eds., 1990 참조).

투여량 값들은 또한 경감시킬 질환 상태의 특이적인 심각성에 따라 가변적이라는 점에 유의한다. 추가로, 임의의 특정한 대상체에 대해서는, 특이적인 투약 요법이 개인의 필요 및 상기 언급된 조성물을 투여하거나 또는 투여를 관장할 사람의 전문적인 판단에 맞춰져야 함이 이해되어야 한다. 또한, 본원에 설정된 농도 범위는 오직 예시적인 것이며, 이들은 본 발명의 요지 또는 수행을 제한하지 아니한다는 점이 이해되어야 한다. 활성 성분은 한번에 투여될 수 있거나, 또는 시간 간격을 달리하여 투여될 투여량보다 더 적게 여러 번 나누어질 수 있다.

제형물은 하기의 성분을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 미세결정성 셀룰로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔 (Primogel), 옥수수 전분 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로우트 (Sterotes); 유동화제, 예컨대 콜로이드성 실리콘 디옥사이드; 및 당화제, 예컨대 수크로오스 또는 사카린 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 풍미가 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 재료에 추가하여, 액체 담체, 예컨대 지방 오일을 포함할 수 있다. 기타 투여 단위 형태는 투여 단위의 물리적 형태를, 예를 들어 코팅으로 변경시킬 기타 각종 재료를 포함할 수 있다. 이에 따라, 정제 또는 필은 당, 쉘락 또는 기타 장용 코팅제로 코팅될 수 있다. 상기 각종 조성물의 제조에 이용되는 재료는 약제학적으로 순수하며 사용되는 양으로는 무독성이어야 한다.

용액 또는 현탁액은 또한 하기의 성분들을 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정화 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항박테리아제, 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸파라벤; 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 나트륨 비설파이트; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 및 등장성 조정제, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 덱스트로오스. 비경구 제제는 앰플, 1 회용 주사기 또는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 투여 바이알에 봉입될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 제형물로서 제조될 수 있다. 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형물과 같은 신체로부터의 신속한 제거에 대항하여 활성 화합물을 보호할 상기 담체가 바람직하다. 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐 및 폴리아세트산과 같은 생분해성, 생체상용성 중합체가 사용될 수 있다. 상기 제형물의 제조 방법은 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

리포좀 현탁액 (바이러스 항원에 대한 모노클로날 항체를 이용해 감염된 세포를 표적으로 하는 리포좀 포함) 은 또한 약제학적으로 허용되는 담체로서 바람직하다. 리포좀에 대한 화합물의 캡슐화 또는 혼입 방법은, [Cozzani, I.; Jori, G.; Bertoloni, G.; Milanesi,C.; Sicuro, T. Chem. Biol. Interact. 53, 131-143 (1985)] 및 [Jori, G.; Tomio, L.; Reddi, E.; Rossi, E. Br. J. Cancer 48, 307-309 (1983)] 에 기재되어 있다. 이들은 또한 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 미국특허 4,522,811 (본원에 전문이 참고문헌으로 포함됨) 에 기재된 바와 같은 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형물은 적당한 지질(들) (예컨대, 스테아로일 포스파티딜 에탄올아민, 스테아로일 포스파티딜 콜린, 아라카도일 포스파티딜 콜린 및 콜레스테롤) 을 차후 증발시킬 무기 용매 중에 용해시키고, 용기의 표면에 건조시킨 지질의 박막을 남겨두어 제조될 수 있다. 이어서, 활성 화합물의 수용액을 용기 내에 도입한다. 이어서, 용기를 손으로 휘둘러 용기 측면으로부터 지질 재료를 떨어뜨리고 지질 응집물을 분산시킴으로써 리포좀 현탁액을 형성한다.

리포좀에 화합물을 캡슐화시키고 신체의 표적 영역에 보내는 방법은, [Sicuro, T.; Scarcelli, V.; Vigna, M. F.; Cozzani, I. Med. Biol. Environ. 15(1), 67-70 (1987)] 및 [Jori, G.; Reddi, E.; Cozzani, I.; Tomio, L. Br. J.Cancer, 53(5), 615-21 (1986)] 에 기재되어 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 단일하게 (예를 들어, 1 일 1 회) 또는 다중적 투여량 또는 지속적 주입으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 희석제와 조합되어, 단독 또는 다중 투여량으로 하여 투여될 수 있다. 적합한 약제학적 담체, 비히클 및 희석제에는, 비활성 희석제 또는 필러, 멸균 수용액 및 각종 유기 용매가 포함된다. 이어서, 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 희석제를 조합하여 형성된 약제학적 조성물은, 정제, 분말제, 마름모제, 시럽, 주사가능한 용액 등과 같은 각종 투약 형태로 용이하게 투여된다. 상기 약제학적 조성물들은, 필요에 따라, 특정 투여 형태에 따라 풍미제, 결합제, 부형제 등과 같은 추가적인 성분들을 포함할 수 있다.

이에 따라, 예를 들어, 경구 투여의 목적을 위해서는, 나트륨 시트레이트, 칼슘 카르보네이트 및/또는 칼슘 포스페이트와 같은 각종 부형제를 포함하는 정제가, 폴리비닐피롤리돈, 수크로오스, 젤라틴 및/또는 아카시아와 같은 결합제와 함께, 전분, 알킨산 및/또는 특정 복합 실리케이트와 같은 각종 붕해제와 이용될 수 있다. 추가적으로, 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 술페이트 및 탈크가 종종 타정 목적으로 유용하다. 유사한 유형의 고체 조성물이 또한 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐에 이용될 수 있다. 이를 위한 바람직한 재료에는, 락토오스 또는 유당 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다. 수성 현탁액 또는 엘릭서가 경구 투여용으로 바람직한 경우, 그 안의 활성 약제학적 약제는 각종 당화제 또는 풍미제, 염색 물질 또는 염료, 및 필요한 경우 에멀전화 또는 현탁화제를, 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 글리세린 및/또는 이들의 조합과 함께 배합될 수 있다.

비경구 투여를 위해, 참기름 또는 낙화생유, 수성 프로필렌 글리콜, 또는 멸균 수용액 중의 본 발명의 화합물의 용액이 이용될 수 있다. 상기 수용액은 필요한 경우 적합하게 완충화되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장화되어야 한다. 이들 특정한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 적합하다. 이러한 맥락에서, 이용되는 멸균 수성 매질은 모두 당업자에게 공지된 표준 기술로 쉽게 입수가능하다.

비강 투여 또는 흡입 투여를 위해, 본 발명의 화합물은 통상적으로 환자가 짜거나 펌핑하는 펌프 스프레이 용기에서의 용액 또는 현탁액의 형태로 또는 적합한 추친체, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 이용하는 가압 용기 또는 분무기로 제시되는 에어로졸 스프레이로서 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공하여 결정될 수 잇다. 가압 용기 또는 분무기는 본 발명의 화합물의 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 흡입기 또는 흡출기 (insufflator) 용의 캡슐 및 카트리지 (예를 들어 젤라틴으로 제조된 것) 는 본 발명의 화합물 또는 화합물들 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토오스 또는 전분의 분말 믹스를 포함하여 제형화될 수 있다.

본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 또한 신경이상, 심혈관 이상, 암, AIDS, 우울증 및/또는 유형-1 및 유형-2 당뇨병과 같은 질환에 유효한 또다른 약제학적 활성 약제와 사용될 수 있다. 상기 추가적인 약제는, 예를 들어, 항바이러스제, 항생제, 항우울제, 항암제, 면역억제제, 항진균제 및 이들의 조합일 수 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물은 단독으로 또는 다른 약제와 함께, 단독 투약 형태로 또는 별개의 투여 형태로 제형화될 수 잇다. 특정한 양의 활성 성분이 있는 각종 약제학적 제형물의 제조 방법은 공지되어 있거나, 또는 당업자에게는 본 개시의 견지에서 자명할 것이다. 약제학적 제형물의 제조 방법은, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 19th Edition (1995) 를 참조한다.

스캐폴드

한 구현예에서, 본 발명은 담체 또는 기판 중 NELL 펩티드의 혼입 방법 및 수득되는 기판을 포함한다.

한 구현예에서, 뼈 형성 유도를 위한 조성물은, 이에 제한되지 않으나 NELL 펩티드, 예를 들어, NELL1펩티드, NELL2펩티드, NELL1 펩티드의 발현을 변경시키는 제, NELL1 펩티드의 활성을 변경시키는제, NELL2 펩티드의 발현을 변경시키는 제, NELL2 펩티드의 활성을 변경시키는 제를 포함하는 군으로부터 선택되는 뼈 형성 유도를 위한 유효량의 제 1 제; 및 임의의 담체를 포함할 수 있다.

조성물은 이에 제한되지 않으나 TGF-베타, BMP2, BMP4, BMP7, bFGF, FGF, IGF (인슐린형 성장 인자), VEGF, 콜라겐, 뼈, 뼈 매트릭스, 힘줄 (tendon) 매트릭스 또는 인대 매트릭스, 뼈발생 및/또는 뼈모세포를 포함하는 제 2 제를 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 담체는 예컨대 효소적 또는 가수분해적 메카니즘에 의해 분해가능한 생분해성일 수 있다. 담체의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 합성 흡수성 중합체, 예컨대 이에 제한되지 않으나 폴리(α-히드록시산), 예컨대 폴리 (L-락타이드) (PLLA), 폴리 (D, L-락타이드) (PDLLA), 폴리글리콜라이드 (PGA), 폴리 (락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA), 폴리 (-카프로락톤), 폴리 (트리메틸렌 카르보네이트), 폴리 (p-디옥사논), 폴리 (-카프로락톤-코-글리콜라이드), 폴리 (글리콜라이드-코-트리메틸렌 카르보네이트) 폴리(D,L-락타이드-코-트리메틸렌 카르보네이트), 폴리아크릴레이트, 폴리히드록시부티레이트 (PHB), 폴리안하이드라이드, 폴리 (안하이드라이드-코-이미드), 프로필렌-코-푸마레이트, 폴리락톤, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 다가음이온성 중합체, 폴리안하이드라이드, 폴리에스테르-아미드, 폴리(아미노산), 호모폴리펩티드, 폴리(포스파젠), 폴리(글락사논), 다당류, 및 폴리(오르토에스테르), 폴리글락틴, 폴리글락틴산, 폴리알돈산, 폴리아크릴산, 폴리알카노네이트; 이들의 공중합체 및 혼합물, 및 임의의 유도체 및 개질체가 포함된다. 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 4,563,489, 및 PCT 국제 출원 WO/03024316 를 참조. 담체의 기타 예시에는 셀룰로오스계 중합체, 예컨대 이에 제한되지 않으나 알킬셀룰로오스, 히드록시알킬셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 및 이들의 양이온성 염이 포함된다. 담체의 기타 예시에는 합성 및 천연 바이오세라믹, 예컨대 이에 제한되지 않으나 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 아파타이트, 생물활성 글래스 재료, 및 산호-유도성 아파타이트가 포함된다. 예를 들어 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국특허 출원 2002187104; PCT 국제 출원 WO/9731661; 및 PCT 국제 출원 WO/0071083 를 참조.

한 구현예에서, 담체는 천연 혈청 농도의 칼슘 및 포스페이트 농도가 약 1.5 내지 7 배이며, 담체 재료에 따라 각종 수단으로 약 2.8 내지 7.8 의 pH 범위, 약 15 내지 65℃ 의 온도의 용액으로 조정된 가상 체액과 같은, 졸-겔 기술 또는 투입 (immersion) 기술에 의한 아파타이트 또는 바이오글라스를 포함하는 조성물로 추가로 코팅될 수 있다. 예를 들어 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국특허 6,426,114 및 6,013,591; 및 PCT 국제 출원 WO/9117965 를 참조.

담체의 기타 예시에는, 콜라겐 (예를 들어, 콜레스타트 (Collastat), 헬리스타트 (Helistat) 콜라겐 스폰지), 히알루로난, 피브린, 키토산, 알기네이트, 및 젤라틴 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 예를 들어 그의 교시가 본원에 참고문헌으로 포함되는 PCT 국제 출원WO/9505846; WO/02085422 를 참조.

한 구현예에서, 담체에는, 이에 제한되지 않으나 헤파린-형 중합체, 예를 들어, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린 설페이트, 푸칸, 알기네이트, 또는 이들의 유도체; 및 헤파린 친화성을 증가시키기 위한 아미노산 개질이 있는 펩티드 절편을 포함하는 헤파린-결합제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 그의 교시가 본원에 참고문헌으로 포함되는 Journal of Biological Chemistry (2003), 278(44), p. 43229-43235 를 참조.

한 구현예에서, 기판은 액체, 고체 또는 겔의 형태일 수 있다.

한 구현예에서, 기판은 유출성 겔 형태인 담체를 포함할 수 있다. 겔은, 예컨대 뼈 형성이 필요한 부위에서 주사기를 통해 주사가능하도록 선택될 수 있다. 겔은 1 차적인 결합에 의해 형성되며, pH, 이온기 및/또는 용매 농도가 조절된 화학물 겔일 수 있는 화학물 겔일 수 있다. 겔은 또한 2 차적인 결합 및 온도 및 점도가 조절된 물리적 겔일 수 있다. 겔의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 플루오닉스, 젤라틴, 히알루로난, 콜라겐, 폴리락타이드-폴리에틸렌 글리콜 용액 및 콘쥬게이트, 키토산, 키토산 & b-글리세로포스페이트 (BST-gel), 알기네이트, 아가로스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 폴리에틸렌 옥사이드, N-메틸-2-피롤리돈 중 폴리락타이드/글리콜라이드가 포함된다. 예를 들어, 그의 교시가 본원에 참고문헌으로 포함되는 Anatomical Record (2001), 263(4), 342-349 를 참조.

한 구현예에서, 담체는 예컨대 약 250 nm 이상의 파장을 가진 전자기성 조사에 의해 광중합가능한 것일 수 있다. 광중합가능한 중합체의 예시에는, 폴리에틸렌 (PEG) 아크릴레이트 유도체, PEG 메타크릴레이트 유도체, 프로필렌 푸마레이트-코-에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알콜 유도체, PEG-코-폴리(-히드록시 산) 디아크릴레이트 마크로머, 및 개질된 다당류, 예컨대 히알루론산 유도체 및 덱스트란 메타크릴레이트가 포함된다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국특허 5,410,016 를 참조.

한 구현예에서, 기판은 온도 민감성 담체를 포함할 수 있다. 예시에는, N-이소프로필아크릴아미드 (NiPAM), 또는 에틸 메타크릴레이트 및 N-아크릴록시숙신이미드; 또는 알킬 메타크릴레이트, 예컨대 부틸메타크릴레이트, 헥실메타크릴레이트 및 도데실메타크릴레이트의 혼입에 의해 저감된 더 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 및 증강된 펩티드 (예를 들어, NELL1) 로 개질된 NiPAM 으로 제조된 담체가 포함된다 (PCT 국제 출원 WO/2001070288; 미국특허 5,124,151, 이들의 교시는 본원에 참고문헌으로 포함됨).

한 구현예에서, 수용체 매개 메카니즘을 통한 세포-매트릭스 결합을 촉진할 수 있는 담체가 세포 접착 분자, 접착 펩티드 및 접착 펩티드 유사체 및/또는 비-수용체 매개성 메카니즘 결합을 통해 부착을 촉진할 수 있는 분자성 부분들로 수식 및/또는 고정화된 표면을 가질 수 있는 경우, 예컨대 이에 제한되지 않으나 다가양이온성 폴리아미노-산-펩티드 (예를 들어, 폴리-라이신), 다가음이온성 폴리아미노-산-펩티드, Mefp-클래스 접착성 분자 및 기타 DOPA-풍부 펩티드 (예를 들어, 폴리-라이신-DOPA), 다당류 및 프로테오글리칼을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그의 교시가 본원에 참고로 포함되는 PCT 국제 출원 WO/2004005421; WO/2003008376; WO/9734016 를 참조.

한 구현예에서, 담체는, 이에 제한되지 않으나, 콜라겐, 젤라틴, 히알루론산, 알기네이트, 폴리(에틸렌 글리콜), 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필-메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스를 포함하는 알킬셀룰로오스 (히드록시알킬셀룰로오스 포함), 혈액, 피브린, 폴리옥시에틸렌 옥시드, 칼슘 설페이트 헤미히드레이트, 아파타이트, 카르복시비닐 중합체 및 폴리(비닐 알콜) 과 같은 금속이온 봉쇄제를 포함하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국 특허 6,620,406 를 참조.

한 구현예에서, 담체는 이에 제한되지 않으나 폴리옥시에스테르 (예를 들어, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 또는 플루로닉 F-68) 과 같은 담체 재료 내에서의 NELL1 또는 NELL2 안정성 및/또는 분포를 촉진시킬 계면활성제를 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 담체는 이에 제한되지 않으나 글리신, 글루탐산 히드로클로라이드, 나트륨 클로라이드, 구아니딘, 헤파린, 글루탐산 히드로클로라이드, 아세트산, 숙신산, 폴리소르베이트, 덱스트란 설페이트 및 아미노산과 같은 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고 문헌으로 포함되는 미국특허 5,385,887 를 참조. 한 구현예에서, 담체는 상기 열거된 것과 같은 재료의 조합을 포함할 수 있다.

예시로서, 담체는 PLGA/콜라겐 담체 멤브레인일 수 있다. 멤브레인은 예를 들어, NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 약제의 용액에 잠겨질 수 있다.

한 구현예에서, 인체용 임플란트는 예를 들어 NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 약제를 임플란트에 인접한 뼈 형성 유도에 충분한 양으로 포함하는 기판을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 인체용 임플란트는, 임플란트에 인접한 뼈 형성 유도에 충분한 양으로 NELL1 펩티드, NELL2 펩티드 또는 이들의 혼합물과 같은 약제를, 포함하는 표면을 가진 기판을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 인체용 임플란트는 뼈발생 세포를 포함하는 표면을 가진 기판, 예를 들어 NELL1 또는 NELL2 를 뼈 형성에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 임플란트는, 이에 제한되지 않으나 자가 세포, 뼈발생 또는 뼈모세포, NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들의 혼합물 또는 또다른 뼈발생 분자를 발현하는 세포를 포함하는 세포에 시딩 (seeding) 될 수 있다.

임플란트는 메쉬, 핀, 스크류, 플레이트 또는 인공 관절의 형태로 형성되는 기판을 포함할 수 있다. 예시로서, 기판은 치과적 또는 정형외과적 임플란트의 형태일 수 있으며, 예를 들어 NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들의 혼합물과 같은 약제를 포함할 수 있고, 임플란트에 인접한 뼈의 통합성을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 임플란트에는 콜라겐을 포함하는 기판과 같이 재흡수성인 기판이 포함될 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물은 시간 조절 정제 (time release tablet) 에 포함될 수 있다.

NELL 펩티드, 예를 들어, NELL1 펩티드, NELL2 펩티드 또는 이들 펩티드의 혼합물과 같은 약제는 약학적 조성물 형성에 허용되는 담체와 배합될 수 있다. 허용되는 담체는, 예를 들어, 조성물을 안정화시키거나 또는 약제의 흡수를 증가 또는 감소시키는 생리학적으로 허용되는 화합물을 포함할 수 있다. 생리학적으로 허용되는 화합물에는, 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 또는 덱스트란, 산화방지제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이팅제, 저분자량 단백질, 유사분열방지제의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충제가 포함될 수 있다.

기타 생리학적으로 허용되는 화합물에는, 습윤제, 에멀전화제, 분산제 또는 미생물의 성장 및 작용을 방지하기 위해 특히 유용한 방부제가 포함된다. 각종 방부제가 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 당업자는 생리학적으로 허용되는 화합물을 포함하여 담체의 선택이, 예를 들어 투여 경로에 좌우된다는 것을 감안할 것이다.

조성물은 투여 방법에 따라 각종 단위 투여량 형태로 투여될 수 있다. 예를 들어, 적합한 단위 투여량 형태에는 분말, 정제, 필, 캡슐이 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 수용성 펩티드를 위한 수성 담체 중에 용해된 NELL 펩티드, 예컨대 NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들 펩티드의 혼합물과 같은 약제의 용액을 포함할 수 있다. 각종 담체, 예를 들어, 완충 식염수 등이 이용될 수 있다. 상기 용액들은 멸균이며, 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 이들 조성물은 통상적인, 널리 공지된 멸균 기술로 멸균될 수 있다. 조성물은 적당한 생리학적 조건에 대한 필요에 따라 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어, 나트륨 아세테이트, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 나트륨 락테이트 등을 포함할 수 있다.

상기 제형물 중의 NELL 펩티드, 예를 들어, NELL1 펩티드, NELL2 펩티드, 또는 이들 펩티드의 혼합물과 같은 약제의 농도는 광범위하게 가변적일 수 있고, 주로 선택된 특정 투여 양태 및 환자의 필요에 따라 체액 부피, 점도, 체중 등을 기준으로 선택될 것이다.

일부 구현예에서, 스캐폴드는 포함할 수 있다 담체의 기타 예시에는 합성 및 천연 바이오세라믹, 예컨대 이에 제한되지 않으나 칼슘 카르보네이트, 칼슘 포스페이트, 아파타이트, 생물활성 유리 재료 및 산호-유래 아파타이트가 포함된다. 예를 들어 미국특허 출원 2002187104; PCT 국제 출원 WO/9731661; 및 PCT 국제 출원 WO/0071083 를 참조하며, 이들의 교시는 본원에 참고로서 포함된다. 바이오세라믹 담체의 추가적인 예시에는, 온전하거나 또는 탈-단백질화 또는 탈-미네랄화된 자가, 동종이형 및 이종 뼈이식이 포함된다. 담체의 기타 예시에는 지엽적 미세환경의 지엽적 칼슘 및 포스페이트 농도가 각각 0.01 내지 10 mM (칼슘) 및 0.01 내지 3 mM (포스페이트) 인 경우 뼈모세포 또는 그의 전구세포의 오스테오폰틴 (osteopontin) 유전자 발현을 1.5 배 이상 증가시키는 합성 및 천연 바이오세라믹 및 중합체 및 이들의 복합체; 지엽적 미세환경의 지엽적 칼슘 및 포스페이트 농도가 각각 0.01 내지 10 mM (포스페이트) 및 0.01 내지 3 mM (칼슘) 인 경우 뼈모세포 또는 그의 전구세포의 오스테오폰틴 (osteopontin) 유전자 발현을 1.5 배 이상 증가시키는 합성 및 천연 바이오세라믹 및 중합체 및 이들의 복합체가 포함된다.

한 구현예에서, 담체는 추가로, 칼슘 및 포스페이트 농도가 천연 혈청 농도의 약 0.1 내지 10 배이며, 담체 재료에 따라 각종 수단으로 약 2.8 내지 9.8 의 pH 범위, 약 15 내지 65℃ 의 온도로 조정된 가상 체액과 같은, 졸-겔 기술 또는 투입 (immersion) 기술에 의한 아파타이트 또는 바이오글라스를 포함하는 조성물로 코팅될 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함되는 미국특허 6,426,114 및 6,013,591; 및 국제 출원 WO/9117965 를 참조. 코팅 재료에 대한 기타 예시에는, 지엽적 미세환경의 지엽적 칼슘 및 포스페이트 농도가 각각 0.01 내지 10 mM (칼슘) 및 0.01 내지 3 mM (포스페이트) 인 경우 뼈모세포 또는 그의 전구세포의 오스테오폰틴 (osteopontin) 유전자 발현을 1.5 배 이상 증가시키는 합성 및 천연 바이오세라믹 및 중합체 및 이들의 복합체; 및 지엽적 미세환경의 지엽적 칼슘 및 포스페이트 농도가 각각 0.01 내지 10 mM (포스페이트) 및 0.01 내지 3 mM (칼슘) 인 경우 뼈모세포 또는 그의 전구세포의 오스테오폰틴 (osteopontin) 유전자 발현을 1.5 배 이상 증가시키는 합성 및 천연 바이오세라믹 및 중합체 및 이들의 복합체가 포함된다.

약제학적 조성물의 용도

본 발명의 구현예에 따르면, 각종 기재된 구현예의 약제학적 조성물이 뼈 상태 또는 뼈 관련 상태의 치료 또는 예방을 위해 포유류에 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포유류" 는 인간 및 동물을 포함하는 모든 포유류 대상체를 포함한다.

한 구현예에서, 약제학적 조성물이 뼈 생성이 바람직한 뼈 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위해 포유류에 투여될 수 있다.

또다른 구현예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 뼈 생성이 과도하거나 또는 바람직하지 않은 뼈 상태를 치료, 예방 또는 완화하기 위해 포유류에 투여될 수 있다. 추가 구현예에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은 뼈 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위해 포유류에 투여될 수 있다.

본원에 기재된 약제학적 조성물로 치료, 예방 및/또는 완화될 수 있는 각종 뼈 상태는 상기에 기재되어 있다.

실시예

본 발명의 구현예들은 하기에 제시된 실시예로 상세하게 설명될 것이다. 모든 파라미터 및 데이터는, 그 의도와 달리 본 발명의 구현예의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1. 두개골의 부상 모델을 이용한 뼈 형성

일반적 과정

한 구현예에서, 유착불량 (nonunion) 모델에서의 임계값 크기의 결함이 두개골의 수복에서의 NELL1 에 대한 적절한 농도 결정에 이용될 수 있다. 두개골의 결함은 비-부담 조건 (non-load bearing conditions) 하에서의 뼈 재생을 시험하기 위한 모델로서 이용되었다 (Hollinger, J.O. and J.C. Kleinschmidt, J Craniofac Surg, 1990. 1(1): p. 60-8). 예시적인 과정은 하기에 기재되어 있다.

표준화. 뼈 수복 특징을 표준화하기 위해서, 성장하는 (골격상으로 미성숙한 동물) 동물들보다는 골격상으로 성숙한 5 월령의 수컷 Sprague-Dawley 래트가 생존 수술에 이용될 것이다 (Allen, M.R. and S.A. Bloomfield, J Appl Physiol, 2003. 94(2): p. 642-50). 마취 유도 후, 성체 래트의 두피 영역을 면도하고, 알콜 및 베타딘을 이용해 3x 를 제작한 후, 멸균 천으로 두른다. 전체 두께의 두피 절개를 하고, 골막이 쌍방의 두정뼈에 노출되도록 한다. 멸균 식염수를 이용한 일정한 관주 하에 천두 드릴 (trephine drill) 을 이용하여 뼈 경계의 과열을 방지한다. 밑에 깔린 경질막에 대한 손상을 피하기 위해 조심하면서 각 두정에서 전체 두께의 개두술 결함을 제공한다 [즉, 래트마다 2 개의 두정 결함; 각 결함 직경 = 5 mm(임계값 크기)]. 쌍방의 미처리된 5 mm 결함의 추정되는 치유 비율은 표 2 에 제공된다.

표 2. 개재군	5 mm 직경 (임계) = 19.6 mm2 총 면적
군 I - 최종 농도 = 총 NELL1 ( ng )/총 면적 ( mm ² )	적용된 총 NELL1( ng )	동물 개체수
세라믹/콜라겐 담체 (대조군)	--	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 5 ng/mm² NELL1	98	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 15 ng/mm² NELL1	294	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 30 ng/mm² NELL1	589	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 60 ng/mm² NELL1	1178	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 120 ng/mm² NELL1	2356	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 240 ng/mm² NELL1	4712	래트 5 마리
군 I 에서 사용된 동물 개체수	래트 35 마리
군 II - 최종 농도 = 총 BMP ( ng ) /총 면적 ( mm ² )	적용된 총 BMP ( ng )	동물 개체수
세라믹/콜라겐 담체 (대조군)	--	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 30 ng/mm² BMP2	589	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 60 ng/mm² BMP2	1178	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 120 ng/mm² BMP2	2356	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 240 ng/mm² BMP2	4712	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 30 ng/mm² BMP7	589	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 60 ng/mm² BMP7	1178	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 120 ng/mm² BMP7	2356	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 240 ng/mm² BMP7	4714	래트 5 마리
군 II 에 사용된 동물 개체수	래트 45 마리

제작 후, 각각의 결함은 식염수로 평평하게 만들어 뼈 찌꺼기를 제거한 후, 멸균 식염수가 혼합된 대조군 세라믹 담체 또는 최적의 NELL1 처리 농도를 결정하기 위한 구분되는 NELL1 투여량이 혼합된 세라믹 담체를 이식한다. NELL1 농도는 결함 영역에 따라 표준화한다 (즉, mm² 당 NELL1 단백질의 양 (ng)) (표 2, 군 I). 군 I 에서는 (총 N = 35 래트) 5 마리의 래트 (N = 10 결함) 가 각각의 개재 하위군에 대해 이용된다 (표 2). 추가로, 상이한 농도의 BMP2 및 BMP7 가 5 mm 결함 모델에 대해 동일한 양상으로 적용된다 (표 2, 군 II) (N = 45 래트). NELL1 시험에 대한 농도는 예비 연구를 기준으로 한다. BMP 시험에 대한 농도는 BMP 농도 (면적 기준) 가 약 20 ng/mm² 내지 약 600 ng/mm² 의 범위인 8 mm 직경 래트 두개골 결함에 대한 공지된 연구를 기준으로 한다 (표 3).

표 3. 공지된 래트 두개골의 임계-크기의 결함 모델에서의 BMP2 투약
최종 농도 = 총 BMP2 (ng) /총 면적 (mm²)	적용된 총 BMP2 (㎍)	결함 직경	결함 면적 (mm²)	종족	나이	성별	전달계	참조
200 및 600* ng/ mm²	10 및 30* (rhBMP2)	8 mm	50	Long Evans	28-35	M F	PLGA 마이크로입자	a
20, 100 및 400* ng/ mm²	1, 5, 및 20* (nglBMP2)	8 mm	50	Sprague Dawley	84-92	F	피브린 매트릭스	b
44 및 130* ng/ mm²	2.2 및 6.5* (rhBMP2)	8 mm	50	Long Evans	28-35	M F	ICBM	c
100 ng/ mm²	5 (rhBMP2)	8 mm	50	NA	NA	NA	PEG-기재 히드로겔	d
*은 최대 뼈 형성이 있을 때의 적용 투여량을 표시함. 약어: F (암컷; ICBM (인슐린 콜라겐성 뼈 매트릭스); M (수컷); NA (없음); nglBMP2 (비-글리코실화 BMP2); PEG (폴리에틸렌 글리콜); PLGA (폴리 (D,L-락타이드-코-글리콜라이드의 마이크로입자); rhBMP2 (재조합 BMP2) ^a Kenley, R., 등, J Biomed Mater Res, 1994. 28(10): p. 1139-47; ^b Schmoekel, H., 등, J Orthop Res, 2004. 22(2): p. 376-81; ^c Marden, L.J., 등, J Biomed Mater Res, 1994. 28(10): p. 1127-38; ^d Lutolf, M.P., 등, Nat Biotechnol, 2003. 21(5): p. 513-8

군 I 및 II 유래의 각각의 개재 하위군에서의 5 마리의 래트 (표 2) 는 확립된 프로토콜을 이용하여 8 주 연속하여 마이크로-CT 로 매 주 라이브 연속 영상을 찍는다 (Cowan, C.M., 등, Adipose - derived adult stromal cells heal critical -size mouse calvarial defects. Nat Biotechnol, 2004. 22(5): p. 560-7). 라이브 마이크로-CT 는 골밀도 및 뼈 재생 면역 및 부피에 대한 정확한 실시간 정량적 데이터 뿐만 아니라 상이한 개재 하위군에서의 뼈 형태에 대한 소정의 정량적인 데이터를 제공할 것이다. 8 주째에, 고해상능의 사체 마이크로-CT 분석 및 조직학을 위해 희생시킨다. 두개골의 분할물들은 뼈 형성량을 조직학적으로 평가하기 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 한다. 연골이 관찰되는 경우, 알시안 블루 (Alcian blue) 가 그러한 발견을 확인하기 위해 이용될 것이다. NELL1, BMP2 및 BMP7 에 대한 최적 농도는 8 주째에 조직학적으로 확인된 뼈의 최대 CT-유도 영역을 유도하는 농도로서 정해질 것이다. 뼈 형성에서의 정점이 특정 조건 하에 관찰된다면, 정점이 도달하는 최저 종도가 "최적" 이 될 것이다.

장비. 고해상도 마이크로-CT 는, 선행기술 (Zhang, X., 등, J Clin Invest, 2002. 110(6): p. 861-70)에서 공개된 바와 같이 (Scanco, PA) 으로부터의 최신의 9 내지 20 ㎛ 해상능 기술을 이용할 것이다. 마이크로-CT 데이터는 50 kVp 및 160μA 에서 수집될 수 있으며, Scanco 의 마이크로-CT 스캐너로 공급되는 콘-빔 알고리즘 (cone-beam algorithm) 을 이용하여 재건될 수 있다. 생물학적 거동의 최적 특징화를 보장하기 위해서 2D 및 3D 데이터를 모두 수득하여 분석한다. 데이터의 가시화 및 재건은 MetaMorph^® Imaging System (for 2-D) (Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA), Image Pro Plus version 5.0 (Media Cybernetics, Carlsbad, CA) (for 2D), 및 Amira^TM (3-D 용) (Visual Concepts GmbH, Berlin, Germany) 를 이용하여 수행될 수 있다.

하기를 포함하는 공지된 뼈-특이적 3-D 구조 파라미터의 CT-기준 형태측정 분석: 1) 뼈 부피/조직 부피 - 관심대상의 부피 (VOI) 중의 뼈 용적화소의 갯수를 VOI 에서의 조직 용적화소의 총 갯수로 나눔; 2) 미네랄화 밀도 - 뼈 덩어리의 방사선불투과성을 뼈 덩어리의 부피로 나눔; 및 3) 지주 두께, 지주 갯수 및 지주 분리 (뼈 부피 및 표면적으로부터 유도됨) 가 수행될 수 있다 (Borah, B.D., T.E. 등, JBMR, 2000. 15(9): p. 1786-1797).

스캐폴드 조직화. MTF 에서 공급하는 세라믹 담체는 상표명 Synthacer 으로 시판된다. Synthacer 는 블록 원기둥 형태 (95% 히드록시아파타이트; 200 내지 800 미크론 포어 크기, 65 내지 80% 다공성) 및 루스 파우더 형태로 이용가능하다. 실험은 결함에 대응하여 맞게 MTF 에서 공급하여 제작된 블록 Synthacer 디스크를 이용한다. 아파타이트 담체에 대한 초기의 연구는 콜라겐/성장 인자-코팅된 아파타이트에서는 무-콜라겐 대조군에 비해 더 빠른 뼈유도성 응답성을 증명했으며, 이에 따라 모든 성장 인자는 타입 I 콜라겐 용액에 혼입된다. 0℃ 에서 성장 인자를 pH-조정 콜라겐 용액에 첨가하여 용액을 제조할 수 있다. 이어서, 미리 측정된 양의 콜라겐 I/성장 인자 용액을 각각의 디스크에 적용하여, 겔화를 위해 제형화된 스캐폴드를 20℃ 로 한 후, 공기 건조시켜 콜라겐/성장 인자의 박막을 형성한다. 필요에 따라, 콜라겐 성분의 대체를 위해 기타 생체적응재료 (히알루로난, 피브린 또는 알기네이트) 를 이용할 수도 있다.

최적화된 NELL1 , BMP2 , 및 BMP7 농도를 이용한 머리얼굴 뼈 형성의 분석. 동물 수술은 임계 결함 (유착불량; nonunion) 모델에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행된다. 최적화된 NELL1, BMP2 및 BMP7 농도는 세라믹 담체 (표 4) 를 이용하여 적용된다. 대조군은 세라믹 담체 및 멸균 식염수로 이루어진다. 새로 형성된 뼈를 조직학에서 일시적으로 윤곽을 그리기 위해, 동물들에게 제 0 (수술 직후) 일에 칼세인 블루 (30 mg/kg 체중) 를 복막내 단독 주사하고, 14 일째에 자일레놀 오렌지 (90 mg/kg 체중) 를 복막내 단독 주사하고, 28 일째에 칼세인 (10 mg/kg 체중) 을 복막내 단독 주사하여 연속적인 생체내 형광 표지를 수행한다. 칼세인 블루 (청색 발광), 자일레놀 오렌지 (오렌지색 발광), 및 칼세인 (녹색 발광) 은 활성 뼈 또는 연골 매트릴스 미네랄화의 부위에 침착하는 방사선표지 칼슘과 유사한 분포 패턴을 가진 킬레이팅 플루오로크롬이다 (Lee, T.C., 등, J Anat, 2003. 203(2): p. 161-72 에서 개관). 투여 간격으로 인해 나누어진 상이한 플루오로크롬 밴드 사이의 거리 측정은 Iwamoto 등에 의해 기재된 미네랄 병치 속도 (MAR) (Iwamoto, J., J.K. Yeh, and J.F. Aloia, J Bone Miner Res, 2000. 15(9): p. 1842-9) 의 계산을 가능하게 한다.

표 4. 최적화된 중재 군들	5 mm 직경 (임계) = 19.6 mm² 총 면적
상처 수합 시간	1 주	2 주	4 주	8 주
세라믹/콜라겐 담체(대조군)	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 최적화된 NELL1	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 최적화된 BMP2	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리
세라믹/콜라겐 + 최적화된 BMP7	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리	래트 5 마리
사용된 동물 전체 개체수	래트 80 마리

추가로, 각각의 동물은 희생시킬 때까지, 확립된 프로토콜을 이용하여 매 주 마이크로-CT 및 마이크로-PET 로 라이브의 일련의 영상을 남기게 한다 (Cowan, C.M., 등, Nat Biotechnol, 2004. 22(5): p. 560-7 Berger, F., 등, Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2002. 29(9): p. 1225-36). 마이크로-PET 는 NELL1, BMP2 또는 BMP7 첨가가 어떻게 시간적 또는 공간적 양상에서 뼈 대사 활성에 영향을 줄 수 있는지에 대한 정량적 분석을 용이하게 한다. 하위군 동물들은 1, 2, 4 및 8 주째에 희생된다. 동일하게 처리된, 각 동물 유래의 짝을 이룬 두개골의 피검물은 구분하여 수합하고 가공한다. 한 피검물은 정상 조직의 커다란 테로 수합하고, 조직학 및 후속 제 II 상 세포 분석을 위해 4% 파라포름알데히드에 고정한다. 나머지 피검물은 정상 조직의 작은 테 (2 mm 미만) 로 수합하고, 액체 질소에 즉시 냉동시키고, 더욱 상세한 제 II 상 분자 분석에 대비해 -70℃ 로 저장한다.

고정된 피검물은 먼저 상기 기재된 고해상도 마이크로-CT 및 영상 소프트웨어를 이용한 형태학적 분석에 들어간다. 이후, 고정된 피검물을 이등분한다. 피검물의 절반을 탈미네랄화시키고, 탈수시키고 파라핀에 내입시키고, 박편화하고 (5 ㎛ 두께), H&E 염색했으며; 나머지 반은 비-탈석회화를 진행시키고 메틸 메타크릴레이트에 내입시켰다. 생체내 표지의 가시화를 위해, 4 개의 염색되지 않은, 비-탈석회화, 비-연속적인 박편 (10 ㎛ 두께) 이 형광 현미경을 이용해 검사될 것이다. 추가적인 박편들 (4 ㎛ 두께) 은 Hollinger 등 (Hollinger, J.O., D. Buck, and J.p. Schmitz, Clin Plast Surg, 21(3): p. 463-75)(1994) 에 의해 기재된 바와 같은 지주 뼈 부피 및 표면 밀도와 같은 조직형태적 측정을 위해 메이슨-골드너씨 (Masson-Goldner's) 트리크롬으로 염색한다.

마이크로-PET 는 천공 테 (trephine rim) 또는 결함 중심부에서 활성이 가장 집중되는지 여부 및 NELL1 또는 BMP 첨가를 최적화하는 방법에 대한 상세한 대사적 정보를 제공할 것이다. NELL1 및 BMP 는 모두 천공 테 및 결함 중심부에서 뼈 대사 활성을 증가시킬 것이다. 추가로, 상이한 플루오로크롬의 이용은 계산된 MAR 와 마이크로-PET 상에서의 마이크로-CT 및 대사 활성에 대한 관찰된 뼈 형성이 상관되게 할 뿐만 아니라, 새롭게 침전된 뼈의 시간적 및 공간적 배열 (예를 들어, 중심 대 테의 뼈 침착, 경뇌막 대 골막 뼈 침착의 비율) 을 더욱더 정확하게 결정할 수 있게 할 것이다.

NELL1 에 의한 두개골 뼈의 재생

두개골의 결함 제공. 임계값 크기 두개골의 결함은 비골성 (non-osseous) 의 유착 (union) 모델 [3 개월째 3 차원적 (3D) 부피 측정시 10% 미만의 치유로 정의됨] 로 대표되며, 임계값 이하의 크기 두개골의 결함은 지연성의 골성 (뼈의) 유착 (union) 모델 (3 개월째 3D 부피 측정시 15% 미만의 치유로 정의될 수 있음) 로 대표된다. 래트 모데에서의 쌍방의, 미처리 임계값 크기 (5 mm 직경) 및 임계값 이하의 크기 (3 mm 직경) 두개골의 결함의 추정되는 치유 비율이 표 5 에 제시되어 있다. 5 mm 결함에 대한 10% 미만의 치유는 문헌에서의 다른 기록들과 일치한다 (Bosch, C., 등, J. Craniofac Surg, 1998. 9(4): p. 310-6). 일부 래트 임계값 크기 결함 모델이 시상의 봉합 전반에서 중심에 단독적인 8 mm 직경 결함을 수반하며 (Kenley, R., 등, J Biomed Mater Res, 1994. 28(10): p. 1139-47 Schmoekel, H., 등, J Orthop Res, 2004. 22(2): p. 376-81), 쌍방의 모델 (5 mm 까지의 이중적인 결함을 도모할 수 있다) 은 하기의 이유로 선택되었다: 1) 시상의 봉합 내에서의 섬유상 조적의 봉입을 특이적으로 회피할 수 있음; 2) 정중시상의 구멍 (sinus) 에 대한 손상을 최소화함; 및 3) 쌍을 이루는 실험의 고안을 가능하게 함 (Bosch, C., 등, J Craniofac Surg, 1998. 9(4): p. 310-6).

골격상으로 미성숙한 동물 (약 3 월령) 인 지연된 유착 모델 (delayed union model) (즉, 3 mm 직경 임계값 이하의 크기 결함) 을 이용했다. 래트에 대해서는, 골격 성숙은 약 5 개월째에 도달한다 (Allen, M.R. and S.A. Bloomfield, J Appl Physiol, 2003. 94(2): p. 642-50). 폴리락타이드-코-글리콜라이드 (PLGA)/콜라겐 담체 멤브레인은 PLGA 의 하기와 같은 성질때문에 생체활성 분자 혼입에 이용했다: 1) 입증된 생체적합성 및 기존 FDA 승인 장치에서의 이용; 2) 상대적인 타성 (비-뼈유도성; non-osteoinductive); 3) 용이한 취급성 및 생체활성 분자 방출 제어에 있어서의 이용가능성 (Dhiman, N., 등, Indian J Exp Biol, 2000. 38(8): p. 746-52 Panyam, J. and V. Labhasetwar, Adv Drug Deliv Rev, 2003. 55(3): p. 329-47), 및 4) 분해 프로파일 (Bessho, K., 등, J Biomed Mater Res, 2002. 61: p. 61-65).

PLGA 스캐폴드는 선행기술에 기재된 바와 같이 제작했다 (Cowan, C.M., 등, Nat Biotechnol, 2004. 22(5): p. 560-7). 스캐폴드 조직 후, 스캐폴드를 NELL1, BMP2 또는 멸균 식염수 대조군와 적량으로 미리 혼합한 유형 I 콜라겐 (Vitrogen

; Cohesion, Palo Alto, CA) 으로 코팅했다. 파일럿 (pilot) 연구를 위해 NELL1 및 BMP2 의 전체 투여량으로 천공한 (trephined) 결함에 알맞는 맞춤편 (snug fit) 을 제공하기 위해 각각의 3 mm 직경 PLGA 스캐폴드마다 200 ng 로 했다. 대조군은 PLGA 멤브레인으로만 이루어졌다. 동물들은 머리덮개뼈의 마이크로-CT 및 조직학적 분석을 위해 0, 1, 2, 3 및 4 주째에 희생시켰다.

상기 연구에서, 초기 투여량 200 ng 은 시험관내 NELL1 세포 배양 및 생체내 BMP2 임계값 크기 결함 데이터로부터 경험적으로 도출되었다 (표 3, 상기 문헌). 5 내지 50 ng/ml 범위의 시험관내 NELL1 농도는 아폽토시스 및 뼈 결절 형성을 수반하여 증가시키고, 100 ng/ml 를 상회하는 농도는 아폽토시스는 증가시키나, 뼈 결절 형성을 감소시켰고, 200 ng/ml 를 상회하는 농도는 아폽토시스 증가 및 최소한의 뼈 결절 형성을 제공했다 (Zhang, X., 등, J Bone Miner Res, 2003. 18(12): p. 2126-34). 이에 따라, 이는 과도한 NELL1 투약이 뼈 형성을 감소시킬 것이라는 점을 나타낸다. 공개된 BMP2 연구에서는, 상대적으로 낮은 1 ㎍ 의 총 적용 투여량이 3 주 내에 8 mm 직경 결함의 46% 내지 74% 를 봉합시켰다 (Schmoekel, H., 등, J Orthop Res, 2004. 22(2): p. 376-81). 전체 결함 영역으로 정상화하는 경우, 1 ㎍ 의 투여량은 20 ng/mm² 와 동등했다 (부피보다는 결함 영역에 대한 표준화가, 두개골의 두께가 늘 부피 계산에 대해 적용가능하지는 않은 공개된 연구에 대한 상기 실시예에서의 투약 비교를 용이하게 했다). 본원에 사용된200 ng 의 총 투여량은 3 mm 직경 결함에 대한 총 면적 (즉, 7 mm² = 총 면적) 으로 나누어, 28 ng/mm² 에 대응한다.

NELL -1 에 의한 두개골의 뼈 재생의 유도. PLGA 멤브레인 상에 로딩된 총 200 ng 의 투여량 (28 ng/mm²) 의 NELL1 및 BMP2 를 이용한 연구는 NELL1 및 BMP2 처리된 피검물 모두에서 PLGA 를 로딩하지 않은 대조군에 비해 현저한 뼈 형성을 증명했다 (매 시점마다, 처리된 하위 군마다 N = 4 내지 6 결함). 부피 분석은, 4 주간에 걸친 연구 기간에서 NELL1 및 BMP-2 모두에 대해 대조군보다 훨씬 더 증가된 뼈 형성을 증명했다 (도 4). 도 4 에 나타낸 바와 같이, NELL1 는 1 주째에 BMP2 보다 훨씬 더 많은 뼈를 유도했다.

전체적으로, 3 개월째에 15% 이하의 뼈 부피 재생이 추정되었다 (표 5). 2 주째에는, NELL1 및 BMP2 가 표면 분석으로는 약 70 내지 80% 결함 봉합을, 부피 분석으로는 35 내지 45% 부피 재생을 나타냈다 (도 4). 조직학적 박편은 뼈의 존재를 확인시켜줬다. 풋뼈 침전 (osteoid deposition) 및 지주 분지형 패턴은 NELL1 및 BMP2 사이에서는 크게 차이나지 않았다. 도 5 는 NELL1 및 BMP2 시험 피검물에서, 3D 부피 분석에 의한 45 내지 50% 부피 재생에 상응하는 4 주째에 표면 분석으로 대략 90 내지 100% 결함 봉합을 증명한다. 조직학적 박편은 뼈의 존재를 확인시켜줬다 (도 6A-6C). 또다시, NELL1 및 BMP2 유도성 뼈 사이에는 특기할 조직학적 차이가 없었다 (도 6A-6C).

표면 분석에 대한 표준 편차는 부피 분석에 대한 것보다 현저히 더 크다는 것에 유의한다. 이는, 2D-기준 선형 측정이 3D 유기체에서의 모든 조직 현상을 반드시 반영하지 않을 수도 있다는 것을 강조한다.

표 5. 추정되는 치유 비율 = 신규한 뼈의 부피 ( mm ³ ) /결함 부피 ( mm ³ )
결함 직경	면적 (π r ² )	부피*	2 주	1 개월	2 개월	3 개월
3 mm (임계값 이하)	7 mm²	4.2 mm³	~ 10%	10-15%	~ 15%	~ 15%
5 mm (임계값)	19.6 mm²	11.8 mm³	< 10%	< 10%	< 10%	< 10%
*부피는 면적 x 두개골의 두께로 계산되었다. 조직학적 박편으로부터 측정된 평균 두개골 두께는 0.6 mm 였다.

물론, NELL1 및 BMP2 처리 머리덮개뼈에 대해 2D-기준 "결함성 봉합" 이 일어난 경우라도, 결함에서 재생된 뼈의 횡단면의 두께는 다치지 않은 뼈와 같은 두께는 아니라는 점을 조직학적 피검물로부터 알 수 있다 (도 6A-6C). 이에 따라, 2D-기준 결함성 "봉합" 은 3D-기준 결함성 "재건" 에 반드시 대응하는 것은 아니다. Gosain 등은 또한 임계, 특히 임계값 이하의 크기 결함의 평가에서 횡단면 또는 그 이상의 "3D" 기준 데이터 입수 및 분석 파라미터의 중요성을 강조했다 (Gosain, A.K., 등, Plast Reconstr Surg, 2000. 106(2): p. 360-71; discussion 372).

상기 연구들은, 재조합 NELL1 이 생체내에서 뼈유도성이며, NELL1 유도성 뼈가 4 주째에 BMP2 유도성 뼈와 구분되지 않는다는 점을 증명한다.

실시예 2. 재조합 인간 NELL ( rhNELL1 ) 의 발현을 위한 포유류 계

NELL1 및 NELL2 단백질/펩티드의 기능을 연구하기 위해, 펩티드를 생산 및 정제에 대한 시도를 후속하여 수행했다. 본 발명에서의 비-바이러스성 DNA 전달에 의한 rhNELL1 생산에 이용되는 포유류 발현계에는, 이에 제한되지 않으나, 표 6 에 열거된 일반적으로 이용되는 안정한 발현계가 포함될 수 있다. 벡터 고안, 숙주 세포주 배양, 트랜스펙션 및 안정한 세포주의 선별 뿐만 아니라 HEK 293 및 CHO 계에서의 rhNELL1 의 정제를 포함하는 상세한 프로토콜은 참고를 위해 하기에 기재한다.

표 6. rhNELL1 생산을 위한 포유류 발현계
계	부모 벡터	리더 서열	유전자 증폭
CHO	p3Xflag-CMV	프레프로트립신	No/임의
DXB11	mp19-Lp	인간 tPA	DHFR/MTX
HEK293	pSecTag	면역글로불린	No/임의
NS/0 또는 Sp2/0	pdCs-Fc-X	Ig 의 경쇄 및 Fc 절편	DHFR/MTX
	pEE12	N/A	GS/MSX
DHFR: 디히드로폴레이트 리덕타아제;MTX: 메토트렉세이트; GS: 글루타민 합성효소; MSX: 메티오닌 술폭시민

A. CHO 계

벡터 고안: cDNA 절편은 발현 벡터 p3XFlag-CMV (Sigma) 에 라이게이션했다. 수득한 발현 구축물, pCMV-rhNell-3Xflag 에는, 프리프로트립신 리딩 (leading) 서열, 성숙 인간 NELL1 코딩 영역 및 C-말단에서의 3Xflag 서열의 cDNA 절편이 포함된다.

숙주 세포주: CHO-K1 는 유착 세포주이며, 무혈청 배지 중의 현탁 배양에 적응될 수 있다. pCMV-rhNELL1-3Xflag 의 구축물은 리포펙타민 (Invitrogen) 또는 칼슘 포스페이트로 트랜스펙션했다. 약 2 주 동안 G418 (400-600 ug/ml) 를 세포 배양물에 첨가하여 안정한 세포주를 선별했다. 안정한 형질전환주는 희석 제한으로 높은 rhNELL1 생산의 단일 클론에 대해 추가로 스크리닝했다. 선별된 안정한 세포주는 rhNELL1 생산을 위해 실험실 규모 또는 공업적 규모의 생물반응기에서 사용될 수 있다.

정제 과정: 배지 및 세포 분해물을 포함하는 rhNELL1 펩티드를 그의 자연 상태에서 항-flag 항체 M2 (Sigma) 친화성 컬럼을 통해 정제하고 3Xflag 펩티드로 용출했다.

B. HEK293 계

벡터 고안: cDNA 절편을 발현 벡터 pSecTagA (Invitrogen) 에 라이게이션시켰다. 수득한 발현 구축물, pSec-hNELL1-Tag 에는, 쥐과동물 면역글로불린 κ-사슬 리더 (leader) 서열, 성숙 인간 NELL1 코딩 영역의 cDNA 절편 및 C-말단에서의 Myc 및 His 서열의 이중 태그가 포함된다.

숙주 세포주: 무혈청 배지 및 성장 인서스펜션 (insuspension) 포맷에 적응된 인간 배아 신장 세포주, HEK-293 를 NELL1 펩티드 발현 벡터, pSec-hNELL1-Tag 으로 트랜스펙션시켰다. 세포를 rhNELL1 의 정제를 위한 조건화된 배지 수집 전에 일시적인 트랜스펙션으로서 수일간 배양하거나 또는 안정한 발현 세포주의 선별을 위한 Zeocin (250ug/ml) 로 처리했다. 안정한 형질전환주는 희석을 제한하여 높은 rhNELL1 생산의 단일 클론에 대해 추가로 스크리닝했다. 선별된 안정한 세포주는 rhNELL1 생산에 대해 실험실 규모 또는 공업적 규모의 생물반응기에서 사용될 수 있다.

정제 과정: 배지를 포함하는 rhNELL1 펩티드는 그의 자연 상태에서 Ni²⁺친화성 컬럼을 통해 정제되며, 1M 이미다졸로 용출된다. 4℃ 에서의 20 시간 동안의 1000 배 이상의 부피의 PBS (pH 7.4) 에 대한 집중적인 투석 후 그의 통합성 (integrity), 순도 및 생물에 대한 활성 (bioactivity) 에 대해 시험했다.

추가로, 기존 리더 (leader) 서열을 래트 혈청 알부민, CD33, tPA 및 인간 인터류킨-2 리더 (leader) 서열과 같은 신규한 것으로 대체하거나 또는, DHFR 또는 GS 와 같은 유전자 증폭 표적을 백본 (backbone) 서열에 추가하기 위한 부모 (parental) 벡터의 변경은 신규한 발현 벡터 및 계를 제공할 것이다. 본 발명에서, 인간 NELL1 의 천연 시그널 펩티드는 단백질 분비를 안내하기에는 충분히 유효하지 않으며, 심지어 외부 리딩 서열 (external leading sequence) 이 작용하지도 않았다. 이에 따라, 인간 과립구-마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 와 같은 소형 천연 분비 단백질의 프레임 융합 (frame fusion) 에서의 인트라단백질 (intraprotein) His 태그 및 "MPHHHHHHGGGDDDDKDPM" 와 같은 단백질분해성 절단 부위 (proteolytic cleavage site) 을 포함하는 스페이서에 의한 발현 벡터의 구축이 필요할 수도 있다. NELL1 의 정제에 사용되는 에피토프 태그는: 6X히스티딘, 3XFlag, Myc, GST (글루타티온 S-트랜스퍼라아제), EGFP 또는 CTHS (소형 유비퀴틴 개질 단백질을 나타내는 SUMO 의 C-말단 절반) 등 중 하나일 수 있으나, 표 6 에서 제시된 플라스미드 pSecTag 의 His 및 Myc 의 쌍일 수 있다.

더욱이, IRES 를 이용하는 다이시스트로닉 (dicistronic) 또는 멀티시스트로닉 (multicistronic) 벡터는 특정 조건 하에서의 rhNELL1 의 조절적 또는 유도성 발현을 위해 구축될 수 있다. 테트라싸이클린 유도성 계 및 Flp-In 특이적 사이트 통합 계와 같은 특별한 수요에 부합하거나 또는 더 길게 지속하는 증식 및 더 길게 지연되는 아폽토시스를 수득하기 위한 숙주 세포주의 유전자적 변경이 rhNELL1 생산 개선을 위해 고려될 수 있다.

상기 언급된 rhNELL1 제조를 위한 계의 안정한 발현 외에도, 안정한 계의 백업 대안 또는 보충으로서 HEK 293 또는 BHK 현탁 세포를 양이온성 중합체 PEI 로 트랜스펙션하이 위해서는 멀티-밀리그램 정제 플라스미드 벡터 (pREP4) 를 이용하는 규모가 큰 일시적인 트랜스펙션 (LST) 접근법을 이용할 수 있다.

본 발명의 특정한 구현예가 제시 및 기재되었지만, 당업자에게는 본 발명의 가장 넓은 범위에서 벗어나지 않고 변화 및 변경이 가능할 수 있다는 것이 자명할 것이다. 따라서, 첨부되는 청구의 범위는 본 발명의 진의 및 요지에 닿는 한 모든 상기 변화 및 변경까지도 포함하는 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> SOO, CHIA TING, KANG KURODA, SHUNICHI WU, BEN <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING OR PREVENTING BONE CONDITIONS <130> 39370.28 <140> <141> <150> 60/653,722 <151> 2005-02-16 <160> 95 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 3329 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atatgcgagc gcagcacccg gcgctgccga gccacctccc ccgccgcccg ctagcaagtt 60 tggcggctcc aagccaggcg cgcctcagga tccaggctca tttgcttcca cctagcttcg 120 gtgccccctg ctaggcgggg accctcaaga gcgatgccga tggatttgat tttagttgtg 180 tggttctgtg tgtgcactgc caggacagca gaagatatga agccacccgt gttatcgctg 240 atatggagaa ctagagttct gaagtctctg cttcagcaat cccttcaggg agtggtgggc 300 tttgggatgg accctgacct tcagatggat atcgtcaccg agcttgacct tgtgaacacc 360 acccttggag ttgctcaggt gtctggaatg cacaatgcca gcaaagcatt tttatttcaa 420 gacatagaaa gagagatcca tgcagctcct catgtgagtg agaaattaat tcagctgttc 480 cagaacaaga gtgaattcac cattttggcc actgtacagc agaagccatc cacttcagga 540 gtgatactgt ccattcgaga actggagcac agctattttg aaccggagag cagtggcctg 600 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gggaccggga ggcacagctg tgccaatgat accatttgct 2160 tcaatttgga tggcggatat gattgtcgat gtcctcatgg aaagaattgc acaggggact 2220 gcatccatga tggaaaagtt aagcacaatg gtcagatttg ggtgttggaa aatgacaggt 2280 gctctgtgtg ctcatgtcag aatggattcg ttatgtgtcg acggatggtc tgtgactgtg 2340 agaatcccac agttgatctt ttttgctgcc ctgaatgtga cccaaggctt agtagtcagt 2400 gcctccatca aaatggggaa actttgtata acagtggtga cacctgggtc cagaattgtc 2460 aacagtgccg ctgcttgcaa ggggaagttg attgttggcc cctgccttgc ccagatgtgg 2520 agtgtgaatt cagcattctc ccagagaatg agtgctgccc gcgctgtgtc acagaccctt 2580 gccaggctga caccatccgc aatgacatca ccaagacttg cctggacgaa atgaatgtgg 2640 ttcgcttcac cgggtcctct tggatcaaac atggcactga gtgtactctc tgccagtgca 2700 agaatggcca catctgttgc tcagtggatc cacagtgcct tcaggaactg tgaagttaac 2760 tgtctcatgg gagatttctg ttaaaagaat gttctttcat taaaagacca aaaagaagtt 2820 aaaacttaaa ttgggtgatt tgtgggcagc taaatgcagc tttgttaata gctgagtgaa 2880 ctttcaatta tgaaatttgt ggagcttgac aaaatcacaa aaggaaaatt actggggcaa 2940 aattagacct caagtctgcc 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gcgctcccgc cctagctcaa ggggagcgca gtcgtagcgg ggttcagagc cccagccccg 3780 tgccaccgcc acccgcggtg gggggtgggc tgggggcggg gcagctgggg ttgccttccc 3840 gggcgcgatc cccgagcgcg gcacccggcg ccgccgagcc acctcccctg ccgcccgcca 3900 gcaagtttgg cggcttcgag cccagagagc cacggctttc tgcctcgtgt ctgaccgaca 3960 agtcgtgtaa catgcaggat tcacagctgt gtaagatcgc tgatgacaat gctctcccag 4020 tggcctgcag agttcatccc agcacgatga aatcttcgcc agcaggcagg acaaaaactg 4080 gccctattcc gacttggttt gtttgtgtcc tgcggccaaa gtgtgtggtg tctccacagt 4140 accaatagaa tttcgtacag ttcgggaagc agactgtgac ctttatgagg tgactggctt 4200 gtaaagggca ggcaagcttg gaggcagtga ggacagccag aaaagagata tgaatgggtt 4260 ggagggttga gggcactggg gctgctgaga aaaccacctt tcctaacaga ttctggcaga 4320 gtttacggtt tacatgtagg catagggtag ttgagggtag ccaggcgtta tttgattggg 4380 tcatgtagtg aaggctagtg ctttctctta gaacttggca ggaaacaagt ttgggcaaag 4440 ggagaaacca gaaatcaaaa attctacttg gtcatcatta tagacactat taaggaattt 4500 tccaaaatac atattccaga tataactcac atgccacatg atttaccaaa gtacacaatg 4560 taatggtttt ttagtacatt gtgacgtcta cgaaggccac gcacccatca actttagaac 4620 attttatgac ctccaaagga aaccctacgt tctctagcca tcattctcct cctcactcct 4680 catctggagg caaagtctca tcaactttct gtttctataa atttgatttt ttctggagaa 4740 atggaataga tgccatgctg ttcatcgact ttgctgagga gaggtgaaag aaacatttat 4800 ttaccccaaa cgaggagggt gtatgcagac ccaaggaaga tgctaagtct aaactgtgaa 4860 ataagtgaaa ttcttgctat tacttatgaa gccatggggg attcacagga agttttatca 4920 ctggaaagtt cccgtctcca gccaccgaac acctactttt tttgtggcat tttatctcta 4980 gggaatttaa ggtaggcctg gttgggttcg gggtacaagc cttgttactg tgaggaacac 5040 cattgtgtgg taagcacaac agaaattcac tgggcctatt ctctgatgga ccaacaggtc 5100 caccccttcc cccatcccca ctcaagagtg tacctacgtg aggaaatcga ggtacttagt 5160 tatctaggga agatttatgt gcttgttaag attaacttgt taccgctaat ggatgcgagg 5220 ccgcagagct atgacaggac atatgtctca cttaattttt ttaatggaac acgcggaaac 5280 cctcatccca caggaccagc tacacagtta gtcttaaaga ttaaggttca aaagatacaa 5340 gtcccctgct gggaccactg tgccttttag gccttctggg atttctgaga ttaagaaaag 5400 gggctagggg ggttgggtat ttagctcagt ggtagagcgt ttgcctagca agcacaaggc 5460 cctgggttcg gtccccagct ccggggggga aaaaaaagaa agaaagaaag aaagaaggaa 5520 agaaagaaag gaagaaagga agaagagggg ctagggaaaa gcactctgaa gtgctaagga 5580 agtgcatttt ttgagggaga gttgggggtg ggtgggacgt ggtcctcaca gcacagcttg 5640 gcatccggta gccttactta ggaggcccag tgaaactggg gaatctaact tttttgcaaa 5700 gtgtgtgtga ttttagtgtt gtcattgagt gttgcatgct tctggaggaa tggaaagccc 5760 cgactctgta tgggagacac aggagtaagg gtctgctctg gggccaagtt gaattttgag 5820 agtgttggag gatagactat agacacagtt tagttggtag agtgcttggc cgggatgcat 5880 aagtctgtgg gttccatccc caacactatg taaactaggt gtggtggccc agacctatga 5940 ccctagcact taggaggtga agggacaaga ggatcaaggt tcaaggttat cttcagatac 6000 ataacaaatg gtcctggaca catgtcacaa tagcctgtac ttccagcagt gggacatcca 6060 acatcctctt ctgttctcca agggcacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 6120 cgcacacaca cacacactta aaagctggtg agtaagttgg gccttgacct ccacttggta 6180 atagctcagt tcaattgcac tgcagtgggc acttcttgaa atgatttaac ttccatagtt 6240 cctttcttca cctgcccagg aaggtcatac atgaagtaaa tggacaaggg catgtataca 6300 gaatgccctg aaaaatagga caaagttcag aggaccatgt aggtaagacc tttcatcttc 6360 aaacgttgca cagctaaatt ggtgaccccc cactggtctc ctggggtcaa aggtatataa 6420 agttaagctt ctgggaacac agaggatatg caaatgccag agagaaaccc tggaaagaaa 6480 gcagggctct tttggagaat tccttttcct tttggatccc tgaggatata tgggtttagg 6540 catcttaaat agtattggat gttgcgggga gccggggggg gcatagatgg aggtacaggg 6600 caagctgggg ctccggagac ccagaggctc cgacctacag gttctgtgac tgcatcatct 6660 ctagatagac tgaggcacac agggactctt gcaggtcggt tccaggttcc aataacagag 6720 gatactctag acgggagaga ctcctctgct tgtccactgg tcgccagcaa agcccagctt 6780 ttctatctac agagtggcgt tacagtaggg gtctccaagg aaagcagggg agagcggccc 6840 agagagccag ttttgaagaa aaccatccag aaagtcacaa atggtttaga acttccccta 6900 tgtggcagca tttggcctgt agaacgaaat ttgcaaacac ttcttaaatt ccagccatag 6960 attgctccaa gctcagggac ttccacctca gcaccctcca ccagcactcc taaaagccag 7020 aatccagtca caagagcctt tggctgggaa tagatagcaa gtacaggtgg ccgttgggga 7080 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gcccagcaca gctcggggta aaagcgctag aaaagatgtt ctggcgagcg tcctcttccc 7980 cagggacgca gctgcgggca ttcagtgtgc agggtgcggc cgggtggtcg cacccttgtg 8040 tggctagcta gtagcttccc ggttctgggg agtcagaacc cgctgcagcg ctgccagcga 8100 tccctacatc cttgaacttg cagggtgcgg tggacgaggg tgtcactgag ccgcgggagt 8160 tccacccgca gagggagcgc gtgtagcaag caggtacggc cagggctggg gggagccaga 8220 cgcctcacag gagagggctg cgaggaaagc ggggacctgc gagctcttct gtggctccca 8280 catggttccc ggaggggaac tctaggattg ttctcctttt atgggctccg cgcctaaaca 8340 actgggcgaa caattattag gagggaattt ggagcagtgg agacaactgg aagattttct 8400 cacccgctaa accgtgtttc taatgctatc atcaaagatt gcagggcggg accaggggcc 8460 aaggaaattg gcctaatggc caagtcccta agagaagctg cctgctggag gtggccttat 8520 gatgaccctg aggagcactc ccctctttct tcttccacag gggttccctg actccaggtc 8580 cctggggttc aagaatgtag cctacttcac tggaggcagg ag 8622 <210> 87 <211> 3060 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 87 tggcatctgc tggagaagca acaagtggtt ctgaaatcac ctctgctcgt ttagaataga 60 tttgatagca caggaaactt gtacatgaag tttgtatgaa atctgggagc ggagcacctc 120 accgtttttc ttttttgttg ttgatgtttc tattcttgct atgacatttt acacactata 180 taaaatactg gcagcattct caatttacta taaatggaac ctcagaacgc ttggtggtat 240 gactgctctt gtctctctaa gccccgtggg atcccgggaa acagcacaat gcaggactga 300 gtccttatca aacctgctgc tcgcctgctg tctgaggaga ggccttacca aggcgatgca 360 caaccaccca tcagtcacct gtcatcgact tcaaaattca aatcttataa taagagttta 420 ctaaagtaca gtccatatat caggaacgca ggccttgcaa ggccatggca gacggtagag 480 agtggctaat acacaaagat actcaatgag gctggaagtg taattccaca tctttgagtg 540 aaaactagat ttgtgaagcc tttgctcttt ctaatattga gcttggtatt atctaggaaa 600 caaaagaagt tcaccagtgg gagccggcat ccgccaactg agcacaatta aaagaaaaca 660 cagcacgggc catgcttttt aaacacaaca catactttaa agaagctgac tatttatata 720 gaaataacta ttgttttaaa ttaactagaa gaggaaactt gataccctga gactattgcc 780 tagaaactgt caaactgttt gatatgtaat tgtccaattg tctcacaaaa aactgtacat 840 ttctggtttc tgcttgtgat agatgtacat tctgtatagg aagccagtac ccttaggaag 900 gctagagggg gcctgtgcgg ttatcataag aatacagaca 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taatgaataa ccaatgtcca 1800 ctgacttcaa aaagaaaaaa aagttttaaa attctacaat tacggtgata tgaggctgtg 1860 cttctgtgaa catccccttg aaacgatttc aaaataattg taacagtatc gtgcccttcc 1920 cctggccact gatgggaagg gaagaatggg tagcgctcca tggtactctg cttcaagtac 1980 agagatgtgc agtagaaata ccgtaaggga attcctctgg gcaggcacca cagcgccgaa 2040 actttgggag gtcagtatct taaccaagat tgagctatct tgtttccttc ccaaatccat 2100 tccacccaaa tgaggcgttt gtgttacaat ttattgttcc ctagacgccc aaatcaccca 2160 tctgcctctg gagtttctag tcggtaatta aggcactatc cattacaacc gccaagtgca 2220 ccaagtgagg aggaggaggg cgcaggaaat gaagggggag aacccacttt aaaagagcca 2280 ggccctgagc gcacagagcc cttcacccca gctgggaccc tccgcctgcc caccccagtg 2340 cagcgcgaag ccaagttagc aagagccgca gggccagctc cccacgacac acagggggct 2400 tctcactggg ccataccttg gaagaggaag gctttcgtcc cattatgcag tcctgggact 2460 tggcgcactc cagctgtgga ctccccaagt tctaactctg ataagacgtc aatctgtagg 2520 gaggggtcca caccaagtcc ccaaactggt gggagtggag aggggtagga aagaaaggaa 2580 gagagaaaga aagggggcca ttaaaacgca agcttccaca gcagcaaaga aagcacgcgt 2640 cttggcgaca atatttggaa gtgctgacaa gaggcaacac gctcctccac agggagagcc 2700 ttacctggac gcgctgtcaa gcttaaaata gcagagcgct gggtcccatc tcctgaccta 2760 ctttaagccc ctctctgtac aaagttcccc cacagccaca gaccctaagg gtgtgacccg 2820 ccttgctgtc gccaggacaa gcacagaaag gactcaaatg caaaccctcc agaggtcccc 2880 aatccagagg gaaaccgggc ggcgacccca tggcggggag catcccggcc cagctcggcg 2940 gccactcacc cgcttcgagc ccgaggatca cgcagaacgt tctcagtaat acccgggatt 3000 ccatggcgtg catcgtctca gtccatcgtc tccctcttta aaaaataaag ataaaaacca 3060 <210> 88 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 88 atggagtctc gggtcttact gagaacattc tgtttgatct tcggtctcgg agcagtttgg 60 gggcttggtg tg 72 <210> 89 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val 20 <210> 90 <211> 72 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 90 atggaatccc gggtattact gagaacgttc tgcgtgatcc tcgggctcga agcggtttgg 60 ggacttggtg tg 72 <210> 91 <211> 24 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Claims

유효량의 NELL 펩티드, 또는 NELL RNA 를 포함하는, 포유류에서의 뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화용 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL 펩티드의 최적 투여량 범위를 실질적으로 초과하지 않는 투여량으로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1, NELL2, NELL1 펩티드의 절편, NELL2 펩티드의 절편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 머리얼굴 뼈 생성, 비-머리얼굴 뼈 생성, 긴 뼈 생성, 치주 뼈 생성, 막 내의 뼈 생성, 연골내 뼈 생성, 연골 재형성, 연골 비대 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 골다공증, 극미중력으로 인한 뼈 감소, 불사용 위축, 장기간의 침상 요양, 및 뼈 대사가 2 차적인 영향인 다중적 징후를 수반하는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 병리학적 석회화를 야기하는 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 신장 골형성장애 및/또는 혈관 석회화를 초래하는 만성 신장 질환인 약제학적 조성물.
제 5 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 국소적인 이소성 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막 또는 전립선 결석 (prostate stones) 인 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, NELL RNA 가 mRNA, 비코딩 RNA (noncoding RNA), 마이크로RNA (microRNA), dsRNA, 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, NELL RNA 가 화학물로 또는 나노케이지 또는 생체적응재료 중의 NELL RNA 에서의 혼입으로 안정화되는 조성물.
포유류에서의 두개 봉합을 거친 뼈 과성장을 치료, 예방 또는 완화시키기 위한 유효량의 약제를 함유하는 약제학적 조성물로서, 약제가 NELL 펩티드, NELL 펩티드의 저해제, NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
연골 재생에 유효한 하나 이상의 약제를 유효량으로 포함한, 포유류에서의 연골 관련 뼈 상태의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물로서, 약제가 NELL 펩티드, NELL 펩티드의 저해제, NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트, NELL 펩티드의 증강제, NELL RNA 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1, NELL2, NELL1 펩티드의 절편, NELL2 펩티드의 절편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, NELL RNA 가 mRNA, 비코딩 RNA, 마이크로RNA, dsRNA, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, NELL RNA 가 화학물로 또는 나노케이지 또는 생체적응재료 중의 NELL RNA 에서의 혼입으로 안정화되는 약제학적 조성물.
제 12 항에 있어서, 약제가 관절 보수, 턱관절 재건, 관절염 수복, 또는 추간판 수복에 유효한 약제학적 조성물.
뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 유효량의 NELL 펩티드 수용체의 조절제를 포함하는 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 조절제가 NELL 펩티드 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트, NELL 펩티드를 안정화시키거나 또는 분해하는 분자, NELL 펩티드 수용체를 안정화시키거나 또는 분해하는 분자, 초기 수용체 라이게이션 후 수용체 및 NELL 펩티드의 복합체의 안정화 및 인산화에 수반되는 분자, NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트 또는 아고니스트의 아고니스트, NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트 또는 아고니스트의 안타고니스트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 골다공증, 극미중력으로 인한 뼈 감소, 불사용 위축, 장기간의 침상 요양, 및 뼈 대사가 2 차적인 영향인 다중적 징후를 수반하는 질환으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 병리학적 석회화를 야기하는 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 신장 골형성장애 및/또는 혈관 석회화를 초래하는 만성 신장 질환인 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 국소적인 이소성 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막, 또는 전립선 결석인 약제학적 조성물.
유효량의 NELL 펩티드 유도체를 포함하는, 포유류에서의 뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화를 위한 약제학적 조성물.
제 23 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 약제학적 조성물.
제 24 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체가 경구 투여, 국소 투여, 인시투 임플란트 (in situ implant), 정맥내 투여, 비경구 투여, 환부 투여, 동맥내 주사, 골절 부위로의 주사 및 생분해성 매트릭스에서의 전달로 이루어지는 군으로부터 선택되는 전달 양태를 위한 담체인 약제학적 조성물.
제 23 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 극미중력으로 인한 뼈 감고, 불사용 위축, 장기간의 침상 요양, 및 뼈 대사가 2 차적인 영향인 다중적 징후를 수반하는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 26 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 병리학적 석회화를 야기하는 약제학적 조성물.
제 26 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 신장 골형성장애 및/또는 혈관 석회화를 초래하는 만성 신장 질환인 약제학적 조성물.
제 23 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 국소적인 이소성 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막, 또는 전립선 결석인 약제학적 조성물.
제 23 항에 있어서, NELL 펩티드 유도체가 물리적으로 개질된 NELL1 펩티드 또는 NELL2 펩티드인 약제학적 조성물.
제 23 항에 있어서, NELL 펩티드 유도체가 화학적으로 개질된 NELL1 펩티드 또는 NELL2 펩티드인 약제학적 조성물.
제 31 항에 있어서, NELL 펩티드 유도체가 PEG화 NELL1 펩티드, PEG화 NELL2 펩티드, 하나 이상의 짧은 탄화수소기를 포함하는 NELL1 펩티드, 또는 하나 이상의 짧은 탄화수소기를 포함하는 NELL2 펩티드로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 31 항에 있어서, 화학적으로 개질된 NELL 펩티드가 NELL1 펩티드 모사체 또는 NELL2 펩티드 모사체인 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 제 2 제를 포함하는, 뼈 생성 또는 뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화에 유효한 약제학적 조성물.
제 35 항에 있어서, 제 2 제가 BMP 단백질, TGFβ 단백질, FGF 단백질, IGF (인슐린형 성장 인자), VEGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 36 항에 있어서, 뼈 상태가 골절, 척추 유합, 긴 뼈 골절, 머리얼굴 뼈 치유 또는 형성, 치과적 또는 정형외과적 임플란트 통합, 치과적 임플란트 통합, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
제 35 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 경구적 전달, 비경구적 전달, 폐 전달 및 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되는 전달 양태에 적합한 제형물 중의 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화 방법.
하기 단계를 포함하는 골모세포 또는 뼈 형성의 유도 방법:

NELL 펩티드, NELL RNA 및 임의의 제 2 제를 포함하는 조성물을 세포와 접촉시키는 단계.
제 41 항에 있어서, 세포가 포유류 세포인 방법.
제 41 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1, NELL2, NELL1 펩티드의 절편, NELL2 펩티드의 절편, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되며,

제 2 제가 BMP 단백질, TGFβ 단백질, FGF 단백질, IGF, VEGF 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며,

세포가 줄기 세포, 골수 간질 세포, 섬유모세포 또는 지방 유도 세포 (adipose derived cell) 인 방법.
제 41 항에 있어서, NELL RNA 가 mRNA, 비코딩 RNA, 마이크로RNA, dsRNA, 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
제 41 항에 있어서, NELL RNA 가 화학물로 또는 나노케이지 또는 생체적응재료 중의 NELL RNA 에서의 혼입으로 안정화되는 약제학적 조성물.
하기 단계를 포함하는 뼈 형성 유도 방법:

NELL 펩티드, NELL RNA 및 임의로는 제 2 제를 포함하는 조성물을 뼈 매트릭스에 접촉시키는 단계.
제 46 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1, NELL2, NELL1 펩티드의 절편, NELL2 펩티드의 절편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며,

제 2 제가 BMP 단백질, TGFβ 단백질, FGF 단백질, IGF (인슐린형 성장 인자), VEGF 및 이들의 조합으로부터 선택되며,

뼈 매트릭스가 탈미네랄화 뼈 매트릭스 또는 미네랄화 뼈 매트릭스인 방법.
제 46 항에 있어서, NELL RNA 가 mRNA, 비코딩 RNA, 마이크로RNA, dsRNA, 또는 이들의 조합인 약제학적 조성물.
제 46 항에 있어서, NELL RNA 가 화학물로 또는 나노케이지 또는 생체적응재료 중의 NELL RNA 에서의 혼입에 의해 안정화되는 약제학적 조성물.
하기 단계를 포함하는, NELL 관련 펩티드 수용체의 조절제를 식별하는 방법:

NELL 펩티드의 수용체 분자와 시험 화합물을 접촉시키는 단계,

NELL 펩티드와 수용체 분자 또는 시험 화합물을 접촉시키는 단계,

시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도를 탐지하는 단계,

시험화합물의 부재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도를 탐지함으로써 수득되는 대조군의 결합 정도와, 시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도를 비교하는 단계, 및

시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대조군의 결합 정도와 상이한 경우, 해당 시험 화합물을 NELL 펩티드 수용체의 조절제로서 지정하는 단계.
제 50 항에 있어서, 지정하는 단계가 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:

시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대조군의 결합 정도보다 더 낮은 경우, 해당 조절제를 NELL 펩티드 수용체의 안타고니스트로 지정하거나, 또는

시험 화합물의 존재 하에 NELL 펩티드의 수용체 분자에 대한 결합 정도가 대 조군의 결합 정도보다 더 높은 경우, 해당 조절제를 NELL 펩티드 수용체의 아고니스트로 지정하는 단계.
숙주 세포에서 NELL 유전자를 코딩하는 핵산 구축물을 발현시키는 것을 포함하는 NELL 펩티드의 제조 방법.
제 52 항에 있어서, 핵산 구축물이 시그널 펩티드의 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제 52 항에 있어서, 구축물이 서열 식별 번호 1 내지 81 로부터 선택되는 서열을 가진 유전자를 포함하는 방법.
제 54 항에 있어서, 구축물이 서열 식별 번호 82 내지 87 로부터 선택되는 프로모터 유전자 및/또는 서열 식별 번호 88 내지 95 로부터 선택되는 시그널 펩티드를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제 54 항에 있어서, 핵산 구축물이 NELL 펩티드의 게놈 DNA 중의 비코딩 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제 56 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1 인 방법.
제 52 항에 있어서, 숙주 세포가 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cell) 인 방법.
제 54 항에 있어서, 구축물이 분비를 촉진하는 펩티드를 발현하는 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제 52 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따라 제조된 재조합체 NELL 펩티드.
하기 단계를 포함하는, NELL 펩티드의 발현을 유도하는 분자의 식별 방법:

NELL1 프로모터 유전자와 시험 화합물을 접촉시키는 단계,

NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준을 탐지하는 단계,

NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준과 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준을 비교하는 단계, 및

시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준과 상이한 경우, 해당 시험 화합물을 NELL 펩티드의 발현 조절제로서 지정하는 단계.
제 50 항에 있어서, 지정하는 단계가 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:

시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준보다 더 낮은 경우, 해당 조절제를 NELL 펩티드 발현의 저해제로서 지정하거나, 또는

시험 화합물 존재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준이 시험 화합물 부재 하의 NELL1 프로모터 유전자의 발현 수준보더 더 높은 경우, 해당 조절제를 NELL 펩티드 발현의 증진제로 지정하는 단계.
제 61 항 또는 제 62 항에 따라 식별된 조절제를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 NELL 펩티드 발현의 조절 방법.
제 61 항 또는 제 62 항에 따라 식별된 조절제를 포함하는 약제학적 조성물.
유효량의 NELL 펩티드, 또는 NELL RNA 를 포함하는 스캐폴드 (scaffold).
제 65 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL 펩티드의 최적 투여량 범위를 실질적으로 초과하지 않는 투여량으로 존재하는 스캐폴드.
제 65 항에 있어서, NELL 펩티드가 NELL1, NELL2, NELL1 펩티드의 절편, NELL2 펩티드의 절편, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐폴드.
제 65 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 머리얼굴 뼈 생성, 비-머리얼굴 뼈 생성, 긴 뼈 생성, 치주 뼈 생성, 막 내의 뼈 생성, 연골내 뼈 생성, 연골 재형성, 연골 비대 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐폴드.
제 65 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 골다공증, 극미중력으로 인한 뼈 감소, 불사용 위축, 장기간의 침상 요양, 및 뼈 대사가 2 차적인 영향인 다중적 징후를 수반하는 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐폴드.
제 69 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 병리학적 석회화를 야기하는 스캐폴드.
제 70 항에 있어서, 다중적인 징후를 수반하는 질환이 신장 골형성장애 및/또는 혈관 석회화를 초래하는 만성 신장 질환인 스캐폴드.
제 69 항에 있어서, 뼈 관련 상태가 국소적인 이소성 연조직 석회화, 담석, 콩팥 결석, 송과선 석회화, 백내장, 타석, 심장 판막, 또는 전립선 결석인 스캐폴드.
제 65 항에 있어서, NELL RNA 가 mRNA, 비코딩 RNA, 마이크로RNA, dsRNA, 또 는 이들의 조합인 스캐폴드.
제 65 항에 있어서, NELL RNA 가 화학물로 또는 나노케이지 또는 생체적응재료 중의 NELL RNA 에서의 혼입으로 안정화되는 스캐폴드.
제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항의 스캐폴드를 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 뼈 관련 상태의 치료, 예방 또는 완화 방법.