KR20070095296A - Ｔｎｆ 길항제 - Google Patents

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KR20070095296A
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미켈 홀멘 안데르센
헬레 크로흐 오토브
메테 문히
요젭푸스 디르크 닐란트
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보리안 파마 에이피에스
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Abstract

본 발명은 개선된 결합 특성 및 개선된 효능을 지니는, 인간 테트라넥틴 C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD)에 기초한 TNF 결합 폴리펩티드에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 KRWSRYF (SEQ ID NO:1)을 지니는 TNF 결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드는 제조하는 방법을 제공한다. 상기 폴리펩티드는 TNF에 의해 매개되는 병리를 지니는 피검체의 치료, 예를들어 류마티스 관절염의 치료를 위한 약제 조성물의 제조에 사용될 수 있다.

Description

ＴＮＦ 길항제 {TNF ANTAGONISTS}
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 TNF에 결합하고, 이의 길항제로서 작용할 수 있는 폴리펩티드 및 관련 화합물에 관한 것이다.
본 발명 및 종래 기술의 배경
종양 괴사 인자 (TNF)는 본래 특정 마우스 종양의 괴사를 유도하는 이의 능력에 기초하여 확인된, 단핵구 및 대식세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 의해 생성되는 동종삼합체 사이토카인이다. TNF는 면역 및 염증 반응의 주요 매개체중 하나로, 이는 예를들어 인구의 약 0.5-1%가 걸린 통상적인 자가면역 염증 질병인 류마티스 관절염의 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 또한, TNF는 내독소 쇼크, 뇌 말라리아 및 이식편 대 숙주 반응을 포함하는 광범위한 질병의 발병기전과 관련된 것으로 공지되어 있다. TNF의 가용성 및 생활성 형태는 세개의 동일한 17 kD의 단백질 서브유닛 (동종삼합체)으로 구성되어 있는 반면, 막 결합 형태는 세개의 동일한 26 kD의 서브유닛으로 구성되어 있다.
재조합 또는 변형 단백질이 최근 생겨난 부류의 치료제이다. 지금까지, TNF 길항제로 작용하는 여러 재조합 또는 변형 단백질이 기술되어 왔다. 특히, TNF에 결합하여 이를 중화시키는 항체가 TNF 활성을 억제시키는 수단으로 간주되어 왔다. 인플릭시맙(Infliximab, Remicade) 및 엔터나셉트(Eternarcept, Enbrel)가 류마티스 관절염의 치료를 위해 미국 및 유럽 둘 모두에서 판매가 승인된 두개의 TNF 길항제의 예이다. 이러한 두개의 생성물은 또한 건선 및 크론병의 치료에 유효한 것으로 밝혀졌다. 인플릭시맙은 가용성 및 막횡단 형태의 TNF에 결합하여, TNF와 이의 수용체의 결합을 억제함으로써 TNF의 생물학적 활성을 중화시키는, 뮤린 가변 영역 및 인간 IgG1 및 κ 불변 영역을 지니는 키메라 항체이다. 인플릭시맙의 구조는 천연 발생 항체의 구조와 유사하다. 엔터나셉트는 p75 TNF 수용체의 세포외 도메인 및 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 도메인으로 구성된 융합 단백질이다.
WO 2004/0398에는 TNF에 결합할 수 있는 인간 테트라넥틴 C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD)에 기초한 네개의 특이적 결합 폴리펩티드가 기재되어 있다. 상기 단백질은 루프 1 영역 내의 아미노산 서열 KVRSRYF (SEQ ID NO:79 내의 테트라넥틴 아미노산 번호 116-122), 및 루프 3/4 영역 내의 PRHT, PTNN, PTNR 또는 PNNR (SEQ ID NO:79 내의 테트라넥틴 아미노산 번호 146-149)에 있어서 야생형 CTLD와 상이하다 (참조: WO 2004/0398, 표 4, 페이지 46).
본 발명자들은 개선된 결합 특이성 및 개선된 효능을 지니는, 인간 테트라넥틴 C형 렉틴 유사 도메인에 기초한 특이적 TNF 결합 단백질을 확인하고, 이를 분리하였다. 확인된 TNF 결합 단백질은 생체내에서의 TNF의 억제 및 중화 능력에 있어서 종래의 CTLD 기재 TNF 결합 단백질보다 우수하다. 본 발명의 단백질은 예를들어 뮤린 섬유모세포 세포주 검정에서 TNF 알파 매개의 세포독성을 억제하는 이의 능력이 입증되었고, 이는 하기의 실시예로부터 명백해질 것이다. 또한, 분리된 특이적 TNF 결합 단백질은 또한 시판되는 TNF 길항제인 인플릭시맙 (Remicade) 및 엔터나셉트 (Enbrel)에 비해 우수한 TNF 길항 특성을 지니는 것으로 입증되었다.
발명의 개요
따라서, 첫번째 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 KRWSRYF (SEQ ID NO:1)을 포함하는, 종양 괴사 인자 (TNF)에 결합할 수 있는 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산, 및 특정 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 핵산을 발현시키고, 특정 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 특정 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 약제 조성물의 제조, 및 본 발명의 특정 결합제의 유효량을 TNF에 의해 매개되는 병리, 예를들어 류마티스 관절염을 지니는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체를 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 양태 및 기타 양태는 하기에 추가로 상세하게 기술되어 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 높은 친화성 및 낮은 분리속도(off-rate)로 TNF에 결합하고, 높은 종양 괴사 인자 (TNF) 중화 능력을 지니는 폴리펩티드에 관한 것이다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 테트라넥틴 C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD)의 스캐폴드 구조로부터 유래된다. C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD)은 다수의 동물 종으로부터 분리된 다수의 단백질에서 확인된 단백질 도메인과이다. 최초로, CTLD 도메인이 소위 C형 렉틴 (칼슘 의존성 탄수화물 결합 단백질)에 대해 일반적인 도메인으로서 확인되었고, "탄수화물 인지 도메인" ("CRD")로 명명되었다. 보다 최근에, 상기 도메인이 다수의 진핵생물 단백질, 예를들어 테트라넥틴에 공유되어 있고, 이중 몇몇은 당 부분에 결합하지 않아서, 정준 도메인이 CTLD로서 명명되었다. CTLD는 약 120개의 아미노산 잔기로 구성되고, 특징으로서 두개 또는 세개의 사슬내 이황화 브리지(bridge)를 함유한다.
CTLD 도메인은 기존에 리간드 결합 단백질 유닛의 무작위화 라이브러리의 생성에 적합한 것으로 WO/0248189에 기술되었다. 이러한 라이브러리는 CTLD의 루프-영역이 하나 이상의 무작위화 폴리펩티드 분절로 부분적으로 또는 완전히 대체된 테트라넥틴 CTLD 프레임워크 구조를 결합시킴으로써 작제된다.
본 발명의 폴리펩티드는 테트라넥틴의 CTLD 도메인이 신규한 TNF 결합 폴리펩티드의 작제를 위해 사용되는 상기 무작위화 라이브러리 시스템의 사용에 의해 작제된다. 본 발명에 따른 TNF 결합 폴리펩티드는 조심스럽게 처리된 시험관내 고안 단계의 서열을 통해, TNF에 대한 높은 결합 친화성 및 TNF를 억제하고 중화시키는 생체내 능력에 도달하였다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 연속적 단계의 친화성 및 결합 동역학 성숙을 통해, 높은 특이성을 지니지만 낮은 친화성을 지니는 제 1 후보 폴리펩티드를 취하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 여러 선택 및 성숙 단계로부터의 "후손(offspring)"이다.
본 발명이 TNF에 결합하고, 바람직하게는 TNF를 중화시킬 수 있는, SEQ ID NO:1에 나열된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이라는 것이 인지될 것이다. 상기 아미노산 서열은 테트라넥틴 CTLD 프레임워크 (SEQ ID NO:79의 아미노산 번호 116-122) 내의 소위 루프 1 영역에서 생성되었다. 이러한 서열은 높은 TNF 중화 활성을 포함하는 특정한 이로운 특성을 제공한다. 아미노산 서열은 하기 표 1에 나열되어 있다:
표 1
SEQ ID NO 아미노산 서열
1 KRWSRYF
본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드는 TNF의 일부에 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 용어 "종양 괴사 인자 (TNF)에 결합할 수 있는"은 TNF에 결합하는 특정 폴리펩티드를 의미한다. 유용한 구체예에서, 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드는 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하의 결합 친화성 (Kd)을 지닌다. 기타 유용한 구체예에서, Kd 값은 1 x 10-9 M 미만, 1 x 10-10 M 미만, 1 x 10-11 M 미만, 1 x 10-12 M 미만, 1 x 10-13 M 미만, 1 x 1O-14 M 미만, 또는 1 x 10-15 M 미만이다. 추가의 유용한 구체예에서, 본 발명에 따른 TNF 결합 폴리펩티드에 대한 Koff 속도는 표면 플라즈몬 공명으로 측정시 1 x 10-3 S-1 미만, 예를들어 1 x 10-4 S-1 미만, 1 x 10-5 S-1 미만, 및 1 x 10-6 S-1 미만이다. 본원에서 사용되는 용어 "Koff"는 TNF 결합 폴리펩티드/TNF 복합체로부터 본 발명에 따른 TNF 결합 폴리펩티드의 해리에 대한 분리 속도 상수를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "표면 플라즈몬 공명"은 예를들어 비아코어 시스템 (BIAcore system) (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변화를 검출함으로써 실시간의 생명특이적인 상호작용의 분석을 가능케 하는 광학 현상을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드는 TNF의 생물학적 활성 및/또는 기타 TNF 관련 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 중화시키는 방식으로 TNF에 결합할 수 있다. 본원에서 사용되는 표현 "중화시키다"는 생체내 또는 시험관내에서 측정시 TNF의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 TNF 중화 또는 길항 활성은 하기 실시예에 기술되는 뮤린 섬유모세포 L929 세포주 검정 또는 HUVEC 검정과 같은 시험관내 검정에 의해 입증될 수 있다. 대안적으로, 예를들어 하기 실시예에 기술되는 Tg197 트랜스제닉 마우스 계통을 적용시킴으로써 시험관내 동물 시험에 의해 TNF 길항 활성을 측정하는 것이 적절할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 본원에서 사용되는 용어 "종양 괴사 인자" (본원에서 TNF로 약칭함)는 가용성 및 생물학적 활성 형태가 세개의 동일한 17 kD의 비공유적으로 결합된 단백질 서브유닛으로 구성되는 반면, 막 결합 형태가 세개의 동일한 26 kD의 단백질 서브유닛으로 구성되는 인간 사이토카인을 의미한다. 특히, 상기 용어는 ExPASy (the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis Nucleic Acids Res. 31:3784-3788 (2003)) (인터넷 주소 http://www.expasy.org를 통해 접근가능함)에서 기재명 "TNFA_HUMAN" 및 1차 등록 번호 P01375로 기술된 단백질을 의미한다. TNF의 구조는 예를들어 문헌[Pennica D., et al. (1984) Nature 312:724-729]에 추가로 기재되어 있다. TNF에 대해 종종 사용되는 유의어는 TNF-알파, 종양 괴사 인자 리간드 상과 일원 2, TNF-a 및 카켁틴(Cachectin)을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 KRWSRYF (SEQ ID NO:1)로서 나열된 것과 실질적으로 같은 아미노산 서열을 포함한다. "나열된 것과 실질적으로 같음"은 본 발명의 폴리펩티드가 본 발명의 아미노산 서열 KRWSRYF과 동일하거나 매우 유사한 아미노산 서열을 포함할 것이라는 것을 의미한다. "매우 유사한"은 아미노산 서열 KRWSRYF의 7개의 아미노산중 1, 2, 3 또는 4개가 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 것을 의미한다. 그러므로, 본 발명에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 KRWSRYF (SEQ ID NO:1)과 약 43% 이상, 57% 이상, 71% 이상 및 81% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 치환은 본래의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드의 기능적 및 화학적 특성과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 지니는 폴리펩티드를 생성시키는 보존적 치환이다. 천연 발생 아미노산 잔기가 공통적인 측쇄 특성에 기초하여 (중첩되는) 부류로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 알라닌 (Ala; A), 발린 (Val; V), 루신 (Leu; L), 이소루신 (Ile; I), 프롤린 (Pro; P), 트립토판 (Trp; W), 페닐알라닌 (Phe; F), 티로신 (Tyr; Y) 및 메티오닌 (Met, M);
(2) 친수성: 세린 (Ser; S), 트레오닌 (Thr; T), 아스파라긴 (Asn; N), 글루타민 (Glu; Q), 글루탐산 (Glu; E), 아스파르트산 (Asp; D), 리신 (Lys; K), 아르기닌 (Arg; R), 히스티딘 (His; H);
(3) 방향족: 트립토판 (Trp; W), 티로신 (Tyr; Y), 페닐알라닌 (Phe; F);
(4) 산성: 아스파르트산 (Asp; D), 글루탐산 (Glu; E);
(5) 염기성: 리신 (Lys; K), 아르기닌 (Arg; R), 히스티딘 (His; H);
(6) 하전: 아스파르트산 (Asp; D), 글루탐산 (Glu; E), 리신 (Lys; K), 아르기닌 (Arg; R), 히스티딘 (His; H); 및
(7) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: 글리신 (Gly; G), 프롤린 (Pro; P).
보존적 아미노산 치환은 상기 아미노산 부류중 하나의 일원이 동일한 부류의 또 다른 일원으로 변경되는 것을 포함한다. 보존적 변경은 통상적으로 생물학적 시스템에서의 합성이 아닌 화학적 펩티드 합성에 의해 통합되는 비통상적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
하기의 실시예로부터 명백해지는 바와 같이, 상기 서열 KRWSRYF 이외에, X1 및 X2가 각각 독립적인 아미노산 잔기인 일반적인 아미노산 서열 모티프 PX1PX2N (SEQ ID NO:2)을 추가로 포함하는 본 발명의 폴리펩티드가 높은 TNF 중화 활성을 포함하는 특히 이로운 특성을 지님이 본 발명자에 의해 발견되었다.
한 추가 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 X1이 S, T, N, Q, E, D, K, R 및 H로부터 선택된 친수성 아미노산이고; X2 및 X3가 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, X4가 M, A, V, L, P, W, F, Y 및 C로 구성된 군으로부터 선택된 소수성 아미노산인, 추가의 통상적인 아미노산 서열 모티프 X1PX2PX3NX4 (SEQ ID NO:3)를 포함한다. 한 추가의 유용한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 X1이 S, T, N, Q, E, D, K, R 및 H로부터 선택된 친수성 아미노산이고; X2 및 X3이 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, X4가 W, F 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 아미노산인, 아미노산 서열 X1PX2PX3NX4 (SEQ ID NO:3)를 추가로 포함한다.
현재 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 하기 표 2에 나열된 SEQ ID NO 2-28로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다:
표 2
Figure 112007044558063-PCT00001
Figure 112007044558063-PCT00002
서열 모티프 PXPXN이 모든 확인된 서열 (SEQ ID NO: 4-28)에서 발견될 수 있음이 표 2에 명백해 나타나 있다. 따라서, 아미노산 치환, 예를들어 보존적 치환이 또한 상기에 기술된 바와 같이 표 2에 나타낸 아미노산 서열에 대해 적용될 수 있음이 고려된다. 따라서, 서열 SEQ ID NO: 4-28 내의 13개 아미노산중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개가 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있는 것이 고려된다. 그러므로, 본 발명에 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 4-28중 임의의 것과 약 23% 이상, 31% 이상, 38% 이상, 46% 이상, 54% 이상, 62% 이상, 69% 이상, 77% 이상, 85% 이상 또는 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아미노산의 치환은 본래의 아미노산 서열을 지니는 폴리펩티드의 기능적 및 화학적 특성과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 지니는 폴리펩티드를 생성시키는 보존적 치환이다.
당업자는 본 발명에 따라 다양하게 확인된 아미노산 서열이 특정 결합 작용제 구조로 삽입될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 주어진 아미노산 서열은 임의의 적절한 단백질성 프레임워크의 일부를 형성할 수 있거나 이에 포함될 수 있으나, 단, 생성된 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이 TNF에 결합하여, 바람직하게는 TNF의 생물학적 활성을 중화시키는 능력을 보유해야 한다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 생성된 아미노산 서열을 지니기 위한 구조는 일반적으로 생성된 아미노산 서열 SEQ ID NO:1이 인간 테트라넥틴 아미노 (SEQ ID NO:79의 아미노산 번호 116-122)의 루프 1 영역과 같은 CTLD의 루프 1 영역에 해당하는 위치에 위치된, C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD) 또는 이의 실질적인 부분일 것이다. 유사하게, C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD) 또는 이의 실질적인 부분은 인간 테트라넥틴 (SEQ ID NO:79의 아미노산 번호 116-122)의 루프 1 영역과 같이 바람직하게는 CTLD의 루프 3/4 영역에 해당하는 위치에 위치된, SEQ ID NO 2-28로부터 선택된 생성된 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
현재 한 바람직한 구체예에서, 본 발명의 아미노산 서열은 테트라넥틴, 예를들어 인간 테트라넥틴으로부터 유래된 CTLD 프레임워크에 연결됨으로써 이를 지니게 된다. 바람직하게는, 인간 테트라넥틴으로부터 유래된 CTLD 도메인은 SEQ ID NO:79에서 잔기 50-181로 나열된 것과 실질적으로 같은 아미노산 잔기이다.
하기 실시예로부터 명백해지는 바와 같이, 테트라넥틴으로부터 유래된 C형 렉틴 유사 도메인이 SEQ ID NO:79의 잔기 50-181과 실질적으로 동일한 아미노산 잔기이고, 아미노산 번호 165번의 아스파르트산이 글리신으로 변이된 본 발명에 따른 폴리펩티드가 특히 우수한 TNF 중화 특성을 지니는 것이 본 발명자에 의해 추가로 발견되었다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 TN3-2-B1-C22 (SEQ ID NO:29), TN3-2-B1-C31 (SEQ ID NO:30), TN3-2-B1-C24 (SEQ ID NO:31), TN3-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:32), TN3-2-B1-c22-1 (SEQ ID NO:33), TN3-2-B1-c22-2 (SEQ ID NO:34), TN3-2-B1-c22-3 (SEQ ID NO:35), TN3-2-B1-c22-4 (SEQ ID NO:36), TN3-2-B1-c22-6 (SEQ ID NO:37), TN3-2-B1-c22-7 (SEQ ID NO:38), TN3-2-B1-c22-8 (SEQ ID NO:39), TN3-2-B1-c22-9 (SEQ ID NO:40), TN3-2-B1-c22-10 (SEQ ID NO:41), TN3-2-B1-c22-11 (SEQ ID NO:42), TN3-2-B1-c22-12 (SEQ ID NO:43), TN3-2-B1-c22-13 (SEQ ID NO:44), TN3-2-B1-c22-14 (SEQ ID NO:45), TN3-2-B1-c22-15 (SEQ ID NO:46), TN3-2-B1-c22-16 (SEQ ID NO:47), TN3-2-B1-c7 (SEQ ID NO:48), TN3-2-B1-C19 (SEQ ID NO:49), TN3-2-B1-C1 (SEQ ID NO:50), TN3-2-B1-C20 (SEQ ID NO:51), TN3-2-B1-C53 (SEQ ID NO:52) 및 TN3-2-B1-C29 (SEQ ID NO:53)와 같은 폴리펩티드를 포함하는, 테트라넥틴으로부터 유래된 CTLD 프레임워크에 기초한 단량체 TNF 결합 폴리펩티드이다.
개선된 효능 또는 중화 능력을 제공하고/거나, 독성을 감소시키고/거나, 면역원성을 감소시키고/거나, 혈장 반감기를 연장시키고/거나, 단백질 분해의 분해로부터 보호를 제공하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 유용한 구체예에서 아미노산 잔기중 하나의 N-말단 또는 C-말단 또는 측쇄를 통해 비히클에 연결될 수 있다. 예시적인 비히클은 Fc 도메인, 선형 중합체, 예를들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리리신, 덱스트란; 분지쇄 중합체; 지질; 콜레스테롤기 (예를들어, 스테로이드); 탄수화물 또는 올리고다당류; 또는 인간 혈청 알부민을 포함하는 임의의 천연 또는 합성 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. 비히클에 연결되는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 한 예는 실시예 5에서 볼 수 있는 GG-I10-TN-2-B1-C22-7로 명명된 페길화된 TNF 결합 폴리펩티드이다.
한 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드는 다중화 도메인을 지니거나 이에 연결된다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "다중화 도메인"은 기타의 유사하거나 동일한 다중화 도메인과 상호작용할 수 있는 펩티드, 단백질 또는 단백질의 일부이다. 상호작용은 중합 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하는 유형이다. 이러한 상호작용은 다중화 도메인의 성분 사이의 공유 결합 뿐만 아니라 수소결합력, 소수성 결합력, 반 데르 발스 결합력 및 염교(salt bridge)에 의해 야기될 수 있다. 유용한 구체예에서, 다중화 도메인 펩티드는 이합체 도메인, 삼합체 도메인, 사합체 도메인, 오합체 도메인 또는 육합체 도메인이다. 삼합체 도메인의 한 예는 콜렉틴 넥 영역(collectin neck region)을 포함하는 폴리펩티드를 기재하는 WO 95/31540에 기술되어 있다. 콜렉틴 넥 영역을 구성하는 아미노산 서열은 선택된 임의의 폴리펩티드에 부착될 수 있다. 이후, 삼합체는 콜렉틴 넥 영역 아미노산 서열을 포함하는 세개의 폴리펩티드를 이용하여 적절한 조건하에서 제조될 수 있다.
현재 한 바람직한 구체예에서, C형 렉틴 유사 도메인은 테트라넥틴으로부터 유래된 삼합체 도메인을 지니거나 이에 결합되고, 더욱 특히 기존에 WO 98/56906에 상세하게 기술된 테트라넥틴 삼합체 구조 성분(이후 TTSE로 언급함)을 포함한다. TTSE의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:80에 제시되어 있다. TTSE의 삼합체화 효과는 두개의 기타 TTSE의 꼬인 코일 구조(coiled coil structure)와 상호작용하여 비교적 높은 온도에서도 특히 안정한 삼중 알파 나선형 꼬인 코일 삼합체를 형성하는 꼬인 코일 구조에 의해 야기된다. 용어 TTSE는 또한 단백질의 테트라넥틴 과의 천연 발생 일원의 TTSE의 변형체, 및 알파 나선형 꼬인 코일 삼합체를 형성하는 TTSE의 능력에 어떠한 실질적인 정도까지 역효과 없이 아미노산 서열 내에서 변형된 변형체를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 SEQ ID NO:80의 서열과 68% 이상, 예를들어 75% 이상, 87% 이상, 예를들어 92% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지니는 서열을 포함하는 삼합체 도메인으로서 TTSE를 포함할 수 있다. 따라서, TTSE (SEQ ID NO:50)의 50번째 잔기인 시스테인 잔기는 유리하게는 원치않는 다중화를 야기시킬 수 있는 원치 않는 사슬내 이황화 브리지의 형성을 회피하기 위해 세린, 트레오닌, 메티오닌 또는 임의의 기타 적절한 아미노산 잔기로 변이될 수 있다.
한 추가 구체예에서, TTSE 삼합체 도메인 (SEQ ID NO:50)은 (i) 혈액 응고 인자 Xa에 대한 폴리히스티딘 서열 및/또는 분열 부위를 통합시키고, (ii) Cys 50을 Ser으로 대체시키고, (iii) C-말단 KGS 서열을 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형된 TTSE의 예는 SEQ ID NO:81로 주어져 있고, TripA로 명명된다.
본 발명에 따른 여러 삼합체 폴리펩티드의 여러 예는 상기 TTSE 삼합체 도메인이 적용된 하기의 예로 제공된다. 이는 삼합체 CTLD 기재 TNF 결합 폴리펩티드를 포함한다: TN2-2-B1-C22 (SEQ ID NO:54), TN2-2-B1-C31 (SEQ ID NO:55), TN2-2-B1-C24 (SEQ ID NO:56), TN2-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:57), TN2-2-B1-c22-1 (SEQ ID NO:58), TN2-2-B1-c22-2 (SEQ ID NO:59), TN2-2-B1-c22-3 (SEQ ID NO:60), TN2-2-B1-c22-4 (SEQ ID NO:61), TN2-2-B1-c22-6 (SEQ ID NO:62), TN2-2-B1-c22-7 (SEQ ID NO:63), TN2-2-B1-c22-8 (SEQ ID NO:64), TN2-2-B1-c22-9 (SEQ ID NO:65), TN2-2-B1-c22-10 (SEQ ID NO:66), TN2-2-B1-c22-11 (SEQ ID NO:67), TN2-2-B1-c22-12 (SEQ ID NO:68), TN2-2-B1-c22-13 (SEQ ID NO:69), TN2-2-B1-c22-14 (SEQ ID NO:70), TN2-2-B1-c22-15 (SEQ ID NO:71), TN2-2-B1-c22-16 (SEQ ID NO:72), TN2-2-B1-c7 (SEQ ID NO:73), TN2-2-B1-C19 (SEQ ID NO:74), TN2-2-B1-C1 (SEQ ID NO:75), TN2-2-B1-C20 (SEQ ID NO:76), TN2-2-B1-C53 (SEQ ID NO:77), TN2-2-B1-C29 (SEQ ID NO:78) 및 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:79).
본 발명에 따라서, 본 발명에 따른 TNF 결합 폴리펩티드는 삼합체 도메인의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기에 연결될 수 있다. 그러나, 특정 구체예에서 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드를 단량체의 삼합체 도메인의 N-말단 및 C-말단 둘 모두에 연결함으로써, TNF에 결합하여 이를 중화시킬 수 있는 여섯개의 특이적 폴리펩티드를 포함하는 삼합체 폴리펩티드를 제공하는 것이 유리할 수 있다는 것이 또한 예견된다.
가요성 분자 링커가 임의로 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드와 삼합체 도메인 사이에 삽입되어 공유적으로 연결될 수 있음이 인지될 것이다. 특정 구체예에서, 링커는 약 1-20개의 아미노산 잔기의 폴리펩티드 서열이다. 링커는 10개 미만, 가장 바람직하게는 5, 4, 3, 2 또는 1개의 아미노산일 수 있다. 특정 경우에서 9, 8, 7 또는 6개의 아미노산이 적합할 수 있다. 유용한 구체예에서, 링커는 본질적으로 비면역원성이고, 단백질 분해적으로 분해되지 않는 경향이 있고, 기타 잔기 (예를들어, 시스테인 잔기)와 상호작용하는 것으로 공지된 아미노산 잔기를 포함하지 않는다.
본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 한 바람직한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공하고, 이는 아미노산 서열 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2-28, SEQ ID NO 29-53, 더욱 바람직하게는 전체 삼합체 폴리펩티드 SEQ ID NO 54-78로 나열된 것과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 하나 이상의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태의 작제물을 제공한다. 적절한 벡터는 프로모터 서열, 종료자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 표지 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하도록 선택되거나 작제될 수 있다. 벡터는 적절한 플라스미드, 바이러스, 예를들어 파지 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세한 서술은 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참조하라.
본 발명은 또한 상기의 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종유래 폴리펩티드의 발현을 위한 당 분야에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 다수의 기타 세포를 포함한다. 통상적으로, 바람직한 박테리아 숙주는 대장균(E. coli)이다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현은 편리하게는 적절한 조건하에서 핵산, 예를들어 하기 실시예 2에 상세하게 기술되는 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양시킴으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 발현은 요망되는 단백질이 시험관내에서 용이하게 분리되고 재폴딩될 수 있는 발현 시스템에서 수행된다. 일반적으로, 대장균 기재 시스템을 포함하는 원핵생물 발현 시스템이 바람직한데, 이는 고수율의 단백질이 수득될 수 있고, 효율적인 정제 및 재폴딩 방법이 가능하기 때문이다. 따라서, 과도한 실험없이 적절하거나 바람직한 발현 시스템을 선택하는 것은 당업자의 능력 및 재량에 해당된다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 일차 아미노산 서열이 선택되면, 당업자는 선택된 숙주에서의 코돈 바이어스(bias), 숙주에서의 분비 신호 서열의 필요, 신호 서열 내의 단백질분해효소 분해 부위의 도입 등과 같은 요인을 고려하면서 요망되는 단백질을 엔코딩하는 재조합 DNA 작제물과 같은 적절한 폴리누클레오티드를 용이하게 고안할 수 있을 것이다. 이러한 재조합 DNA 작제물은 선택된 숙주에 적합한 임의의 다수의 발현 벡터로 인-프레임(in-frame)으로 삽입될 수 있다. 적절하거나 바람직한 발현 벡터의 선택은 또한 당업자의 능력 및 재량에 해당하는 사항이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 재조합 작제물의 발현을 구동시키기 위한 강력한 프로모터를 포함할 것이다. 최종적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 널리 공지된 적절한 표준 방법을 이용하여 분리될 수 있고, 임의로 동결건조와 같은 추가의 과정에 적용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 당업자에게 널리 공지된 적절한 물질 및 반응 조건을 선택함으로써 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 보통 상기 폴리펩티드 외에 하나 이상의 성분, 및 임의로 기타 치료 성분을 포함할 수 있는 약제 조성물의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명에 따른 약제 조성물은 활성 성분 외에 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 물질을 포함할 것이다. 상기 물질은 기타 성분과 양립되고 이의 수용체에 유해하지 않은 정도에서 허용된다. 일반적으로, 약제 조성물을 제조하기 위한 방법은 활성 성분 및 추가 성분을 회합시키는 단계를 포함한다.
경구 투여용 약제 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고형 담체, 예를들어 젤라틴 또는 애쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 약제 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예를들어 물, 석유, 동물 또는 식물 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 염수 용액, 덱스트로오스 또는 기타 당류 용액 또는 글리콜, 예를들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥 주사 또는 질병 부위의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고, 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 지니는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 것이다. 당업자는 예를들어 등장성 비히클, 예를들어 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액을 이용하여 적절한 용액을 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 산화방지제 및/또는 기타 첨가제가 필요시 포함될 수 있다.
약제 조성물은 치료되는 질환에 따라 동시에 또는 연속적으로 단독으로 또는 기타 치료제와 조합되어 투여될 수 있다. 기타 치료제는 적절한 용량의 동통 완화 약물, 예를들어 비스테로이드성 항염증 약물(예를들어, 아스피린, 파라세타몰, 이부프로펜 또는 케토프로펜) 또는 아편제, 예를들어 몰핀, 또는 항-구토제의 투여를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료는 본 발명의 폴리펩티드 또는 약제 조성물의 치료적 유효량을 TNF에 의해 매개되는 병리를 지니는 피검체에 투여함으로써, 상기 피검체를 치료하는 것을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, TNF는 면역 및 염증 반응의 주요 매개체중 하나이고, 이는 예를들어 TNF에 의해 매개되는 광범위한 질병의 발병기전에서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 "TNF에 의해 매개되는 질병" 또는 "TNF에 의해 매개되는 병리"는 TNF 관련 병리 또는 질병을 의미한다. TNF에 의해 매개되는 병리 또는 질병은 하기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
(A) 급성 및 만성 면역 및 자가면역 병리, 예를들어 비제한적인 예로서 류마티스 관절염 (RA), 유년기 만성 관절염 (JCA), 갑상샘염, 이식편 대 숙주병 (GVHD), 피부경화증, 당뇨병, 그레이브스 병, 알레르기, 급성 또는 만성 면역 질병 관련 동종 이식, 예를들어 비제한적인 예로서 신장 이식, 심장 이식, 골수 이식, 간 이식, 췌장 이식, 소장 이식, 폐 이식 및 피부 이식;
(B) 감염, 예를들어 비제한적인 예로서 패혈증 증후군, 악액질, 급성 또는 만성 박테리아 감염으로부터 야기된 순환 허탈 및 쇼크, 급성 및 만성 기생충 및/또는 감염 질병, 박테리아, 바이러스 또는 진균, 예를들어 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 악액질, 자가면역 장애, AIDS-치매 복합증 및 감염의 증상을 포함하는 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS);
(C) 염증 질병, 예를들어 만성 염증 병리, 예를들어 비제한적인 예로서 사코이드증, 만성 염증성 장질병, 궤양성 대장염, 및 크론 병리; 혈관 염증 병리, 예를들어 비제한적인 예로서 파종혈관내응고, 죽상경화증, 가와사키 병리 및 혈관염 증후군, 예를들어 비제한적인 예로서 결정성 다발 동맥염, 베게너 육아종증, 헤노호-쉐라인 자반증, 거대세포 관절염 및 신장의 현미경적 혈관염; 만성 활성 감염; 쇼그렌 증후군; 척추관절병증, 예를들어 강직성 척추염, 건선성 관절염 및 척추염, 장병성 관절염 및 척추염, 염증성 장질병과 관련된 반응성 관절염 및 척추염; 및 포도막염;
(D) 신경퇴행 질병, 예를들어 비제한적인 예로서 탈수초 질병, 예를들어 다발성 경화증 및 급성 횡단척수염; 중증근무력증; 추체외로계장애 및 소뇌 장애, 예를들어 피질척수계의 병변; 기저핵의 장애 또는 소뇌 장애; 과운동성 운동 장애, 예를들어 헌팅턴 무도병 및 노인성 무도병; 약물에 의해 유발된 운동 장애, 예를들어 중추신경계 (CNS) 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유발된 운동 장애; 저운동성 운동 장애, 예를들어 파킨슨병; 진행성 상핵마비; 소뇌 및 척수소뇌로 장애, 예를들어 소뇌의 구조적 병변; 척수소뇌변성 (척수성 운동실조증, 프리드리히 운동실조증, 소뇌 피질 변성, 다발성 계통 변성 (멘셀(Mencel), 데제린-토마스(Dejerine-Thomas), 샤이-드래거(Shi-Drager), 및 마챠도조셉MachadoJoseph)); 및 전신 장애 (레프섬병, 무베타지단백혈증, 조화운동불능, 모세관혈관확장증, 및 사립체 다발성 전신장애); 운동 단위의 장애, 예를들어 신경성 근위축증 (전방 각질세포 변성, 예를들어 근위축성 측삭경화증, 영아 척수근육위축 및 유년기 척수근육위축); 알츠하이머병; 중년의 다운증후군; 미만성 루이체병; 루이체형의 노인 치매; 베르니케-코르사코프 증후군; 만성 알코올 중독; 원발성 담즙성 간경변; 잠재성 섬유성 폐포염 및 기타 섬유화 폐병; 용혈 빈혈; 크로이츠펠트-야콥병; 아급성 경화 범뇌염, 할러포르텐-스파츠병; 및 권투선수치매, 또는 이들의 임의의 서브셋;
(E) TNF-분비 종양을 포함하는 악성 병리 또는 TNF를 포함하는 기타 악성종양, 예를들어 비제한적인 예로서 백혈병 (급성, 만성 골수구성, 만성 림프구성 및/또는 골수형성이상 증후군); 림프종 (호지킨 및 비호지킨 림프종, 예를들어 악성 림프종 (버킷 림프종 또는 균상식육종));
(F) 악액증 증후군 및 과다 TNF를 포함하는 기타 병리 및 질병, 예를들어 비제한적인 예로서 암의 악액질, 기생충 질병 및 심부전; 및
(G) 알코올에 의해 유발된 간염 및 만성 간염의 기타 형태.
본 발명의 폴리펩티드는 이를 필요로 하는 피검체 또는 환자에게 임의의 적절한 경로, 보통 혈류 또는 TNF 매개 질병의 부위로의 직접적인 주사에 의해 직접적으로 투여될 수 있다.
예를들어, 진단, 검정 방법 및 진단 키트를 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 검출가능하거나 기능적인 라벨로 라벨링될 수 있다. 검출가능한 라벨은 통상적인 화학 분야에서 공지된 단백질 라벨링을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드에 부착될 수 있는 방사선라벨, 예를들어 125I, 131I 및 99Tc, 형광 프로브, 예를들어 형광물질, 로다민, 텍사스 레드, 아미노에틸쿠마린 및 피코에리트린을 포함한다. 라벨은 또한 효소 라벨, 예를들어 호스라디쉬 퍼옥시다아제를 포함한다. 라벨은 화학 부분, 예를들어 특정 인지체 검출가능한 부분, 예를들어 라벨링된 아비딘으로의 결합을 통해 검출될 수 있는 비오틴을 포함한다. 기능적인 라벨은 TNF 감염된 영역의 부위로 표적화도록 고안된 물질을 포함한다. 이러한 기능적인 라벨은 TNF 감염 영역의 부위에서 프로드러그를 활성 약물로 전환시킬 수 있는 독소, 예를들어 리신 및 효소, 예를들어 박테리아 카르복시펩티다아제 또는 니트로리덕타아제를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 (i) 샘플을 본 발명에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 (ii) TNF에 대한 폴리펩티드의 결합을 검출하는 단계를 포함하여, 샘플내의 TNF를 검출하는 검정 방법을 제공한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예 및 도면에서 예시되는 방법으로 기술될 것이다.
도면의 설명
도 1은 엔브렐(Enbrel), 레미케이드(Remicade) 및 TNF 수용체 II 단편 (RII)과 비교한, 완전한 삼합체 포맷(TN2B1C22) 및 단량체(TN3-2-B1-c22)로서의 TNF 길항제 TN2-2-B1-C22를 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 2는 엔브렐, 레미케이드 및 TNF 수용체 II 단편 (RII)과 비교한, 단량체(TN3-B1-C22-7)로서의 TNF 길항제 TN2-2-B1-C22-7을 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 3은 엔브렐, 레미케이드 및 TNF 수용체 II 단편 (RII)과 비교한, 완전한 삼합체 포맷(TN2B1C31)으로서의 TNF 길항제 TN2-2-B1-C31을 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 4는 엔브렐, 레미케이드 및 TNF 수용체 II 단편 (RII)과 비교한, 완전한 삼합체 포맷(TN2B1C24)으로서의 TNF 길항제 TN2-2-B1-C24을 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 5는 엔브렐, 레미케이드 및 TNF 수용체 II 단편 (RII)과 비교한, TNF 길항제 TN2-2-B1-C22-8, TN2-2-B1-C22-14, TN2-2-B1-C22-2, TN2-2-B1-C22-7, TN2-2-B1-C22-12 및 TN2-2-B1-C22-19를 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 6은 엔브렐 및 레미케이드와 비교한, TNF 길항제 TN2-2-B1-C22-8, TN2-2-B1-C22-7 및 TN2-2-B1-C31을 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다.
도 7은 엔브렐 및 레미케이드와 비교한, TN3-2-B1-C31, TN3-2-B1-C22-7, TN3-2-B1-C22-8을 이용한 HUVEC 검정에서의 TNF에 의해 유발된 IL6 및 IL8 생성의 억제를 도시한다.
도 8은 페길화된 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (20KPEG-GG-I10-TN-2-B1-C22-7), 페길화되지 않은 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (GG C22-7), 및 변이되지 않은 TN-2-B1-C22-7 (C22-7) (SEQ ID NO:32)를 이용한 L929 세포 검정에서의 TNF의 억제를 도시한다. 엔브렐 및 레미케이드를 대조군으로 사용하였다.
도 9는 마우스당 12.5, 25 및 50 μg의 세개의 상이한 농도로 TN2-2-B1-C31이 주사된 마우스에서 TNF에 의해 유발된 IL-6 생성의 차단을 도시한다. 30분 후, 3 μg의 인간 TNF를 마우스에 정맥내 주사하였다.
도 10은 마우스당 12.5, 25 및 50 μg의 세개의 상이한 농도로 TN2-2-B1-C31이 주사된 마우스에서 TNF에 의해 유발된 MCP-1 생성의 차단을 도시한다. 30분 후, 3 μg의 인간 TNF를 마우스에 정맥내 주사하였다.
도 11은 염수 (네거티브 대조군), 야생형 테트라넥틴 (네가티브 대조군) 및 레미케이드 (포지티브 대조군)의 3개의 상이한 용량으로 TN2-2-B1-C31 (도면에서 "보리안 작제물(Borean construct)"로 명명됨)로 처리된 마우스의 상이한 그룹에 대한 관절염 스코어를 도시한다.
실시예
실시예 1: TNF 결합 폴리펩티드의 분리 및 작제
기존에 WO/0248189에 기술된 테트라넥틴 (SEQ ID NO:6) C형 렉틴 유사 도메인 (CTLD)의 스캐폴드 구조를 TNF 결합 폴리펩티드의 분리 및 작제에 사용하였다. TNF 결합 폴리펩티드는 시험관내에서 조심스럽게 처리된 일련의 성숙 단계를 통해 이들의 효능을 발달시켰다. 높은 특이성을 지니지만 낮은 친화성을 지니는 첫번째 후보 분자를 친화성 및 결합 동력학 성숙의 연속적 단계를 수행하고, 생성된 후보자는 성숙의 3번째 및 4번째 단계로부터의 "후손"이다. 성숙은 특히 WO/0248189에 기술된 바와 같은 파지 전시 기술을 이용하여 수행하였다.
확인된 단량체 CTLD 기재 TNF 결합 클론을 이들의 상응하는 SEQ ID NO 및 루프 1 및 루프 3/4 아미노산 서열과 함께 하기 표 3에 나열하였다.
표 3
Figure 112007044558063-PCT00003
Figure 112007044558063-PCT00004
a: 테트라넥틴 내의 루프 1 및 루프 3/4 위치 외의 변이; wt: 야생형
확인된 클론을 또한 테트라넥틴 삼합체 구조 성분 (TTSE; SEQ ID NO:80)을 이용하여 삼합체 포맷으로 생성시켰다. 상기 확인된 클론의 상응하는 삼합체 버젼을 하기 표 4에 나열하였다.
표 4
Figure 112007044558063-PCT00005
Figure 112007044558063-PCT00006
실시예 2: TNF 결합 폴리펩티드의 생성 및 정제
본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드를 통상적으로 하기의 방법을 이용하여 생성시키고, 정제하였다. TNF 결합 폴리펩티드의 엔코딩 서열을 함유하는 플라스미드 벡터를 함유하는 BL21-AI의 단일 콜로니로부터 100 μg/mL Amp를 지닌 2 x TY 내의 6 L 배양액을 A600 = 0.8로 성장시키고, 0.2% L-아라비노오스를 이용하여 유도시키고, 4시간 동안 발현을 지속시켰다.
세포를 수거하고, 봉입체를 회수하였다. 6L 배양액으로부터의 패킹된 세포 펠레트를 100 mL의 50 mM Tris-HCI pH 8.0, 25 w/v % 수크로오스, 1 mM EDTA, (용해-완충용액) 중에서 음파처리하여 균질화시켰다. 이후, 100 mL의 용해-완충용액당 100 mg의 라이소자임을 첨가하고, 혼합시킨후, 샘플을 실온에서 15분 동안 두었다. 이후, 샘플을 틈틈이 혼합과 함께 2-5분 동안 음파처리하였다. 100 mL의 0.2 M NaCl, 1 w/v % 데옥시콜레이트, Na 염 1 w/v % 노니뎃(Nonidet) P40, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA (세제-완충용액)을 첨가하고, 샘플을 혼합시키고, 다시 음파처리하였다. 8,000 rpm, 4℃에서 25분 동안 원심분리하여 봉입체를 회수하였다. 상층액을 버리고, 펠레트를 100 mL의 0.5 w/v % Triton X-100, 1 mM EDTA, pH 8에 재현탁시켰다. 봉입체를 8,000 rpm, 4℃에서 25분 동안 원심분리하여 회수하였다. Triton X-100 완충용액 세척을 1회 더 반복하였다. 12,000 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하여 봉입체를 회수하였다.
봉입체를 50 mL의 6M 구아니딘, 50 mM Tris pH 8.0, 50 mM DTT에 재현탁시켰다. 용액을 세파덱스 G-25 미세 매트릭스 컬럼 상에서의 8M 우레아, 50 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM β-merc로 완충용액을 변경시켰다.
이후, 단백질을 NiNTA IMAC 컬럼 (NiNTA Agarose from Qiagen)에서 포획하고, 컬럼을 8M 우레아, 50 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM β-merc으로 세척하였다. 이후, 단백질을 8M 우레아, 50 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl, 5 mM β-merc, 20 mM EDTA에서 용리시켰다.
NiNTA IMAC 포획 컬럼으로부터의 포획 용출액을 1L의 규모의 희석 재폴딩에 사용하였다. 3M 우레아, 50 mM 글리신 pH 9.5, 250 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0.3 mM 시스테인을 함유하는 1L의 재폴딩 완충용액을 여과시키고, 7℃의 저온실에서 2L 병에 두었다. 자기 스트링 바를 첨가하고, 교반을 250 rpm으로 고정시켰다. 이후, 변성된 포획 용출액을 연동 펌프를 이용하여 100 μL/분의 일정한 유속으로 재폴딩 완충용액으로 적하시켰다. 재폴딩이 중지된 때의 최종 단백질 농도는 250 μg/mL이었다.
8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM Tris, 2 mM CaCl2로부터 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM Tris, 2 mM CaCl2, 400 mM NaCl로의 구배 (실온)를 지닌 SP-세파로오스 (Amersham)에서 중합체를 분리시켰다. 이후, 약 400 mL의 총 매트릭스 부피로 세파덱스 G-25 미세 매트릭스로 컬럼을 패킹시키고, 1리터의 1M 우레아, 25 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.0를 10 ml/분에서의 평형화에 사용하였다.
SP-세파로오스로부터의 용출액을 약 8 ml/분의 유속으로 세파덱스 G-25 미세 매트릭스에 적용시켰다. 단백질을 약 8 ml/분의 유속으로 1M 우레아, 25 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7.0를 이용하여 용리시켰다. 용출액을 풀링시키고, 단백질 농도를 측정하였다.
그랜자임 (Granzyme) B를 1:250 % w/w (mg GrB/mg 삼합체 TNF 결합 폴리펩티드)의 비에 부합하도록 첨가하였다. 혼합후, 용액을 천천히 혼합하고, 24시간 동안 25℃에서 인큐베이션시켰다. 분해후, 고형 우레아를 용액에 첨가하여 8M 우레아 용액을 생성시키고, 1M Na아세테이트를 이용하여 pH 4.5로 pH를 조정하였다.
TNF 결합 폴리펩티드를 폴리싱(polishing)시키고, 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM Tris, 2 mM CaCl2로부터 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM Tris, 2 mM CaCl2, 1000 mM NaCl로의 구배 (실온)를 지닌 소스(Source) 15S 컬럼 (Amersham)에서 농축시켰다. 최종적으로, 용리된 단량체 분획을 세파덱스 G-25 미세 매트릭스에서의 젤 여과에 의해 25 mM Na아세테이트 pH 5.0, 50 mM NaCl, 50 mM 수크로오스에서 포뮬레이팅시킬 수 있다. 상기 단계의 수율은 95%를 초과하였고, 단백질은 가시적이거나 측정가능한 침전 없이 A410에 의해 후속되는 바와 같은 다수의 열-냉동 사이클에 견딘다.
실시예 3: TNF 결합 폴리펩티드의 생물학적 활성
TN2-2-B1-C22, TN2-2-B1-C31, TN2-2-B1-C24, TN2-2-B1-C22-7, TN2-2-B1-C22-2, TN2-2-B1-C22-8, TN2-2-B1-C22-12, TN2-2-B1-C22-14, TN2-2-B1-C22-19 및 단량체 TN3-2-B1-C22 및 TN3-2-B1-C22-7 (각각 TN2-2-B1-C22 및 TN2-2-B1-C22-7에 해당함)로 명명된 표 4에 제시된 TNF 결합 폴리펩티드의 선택물을 TNF의 생물학적 활성을 억제하는 능력을 측정함으로써 L929 종양 세포주, 뮤린 섬유모세포 유사 세포를 이용하여 분석하였다. 선택된 클론의 TNF 중화 활성을 시판되는 TNF 길항제 레미케이드 (Eternacept), 엔브렐 (Infliximab) 및 가용성 TNF 수용체 II (TNF RII/TNFRSF1B, R&D Systems Catalog no. 1089-R2-025/CF)과 비교하였다.
TNF 억제 검정을 하기의 검정 프로토콜에 따라 수행하였다: 검정을 설정하기 하루 전에 L929 세포 (ECACC no.: 85011425)를 3 x 105/ml로 플레이팅하였다. 세포를 시험에 첨가하기 전에 부착되고 컨플루언트(confluent)가 되도록 하였다. 75μl 부피의 세포 현탁액을 편평한 바닥의 웰인 96-웰 미세역가 플레이트 (Nunclon; Cat. No.:167008)에 분배시켰다. ELISA 판독기에 대한 블랭크(blank)로서 1열의 8개 웰을 세포가 없도록 두었다. 시험 샘플을 2 μg/ml의 액티노마이신 D를 함유하는 배지에 희석시켜, 세포 첨가시 1 μg/ml의 액티노마이신 D의 최종 배지 농도를 생성시켰다. 액티노마이신 D (Sigma)를 PBS 중에 20 μg/ml (필요시 37℃로 가온시킴)로 용해시키고, 5 ml의 부분 (또는 적절한 부분)으로 -20℃에서 보관하였다. 필요시 인간 TNF를 해동시키고, 희석시켜 배지를 이용하여 4 μg/ml로 희석시키고, 해동된 농축 용액을 4℃에서 2주 이하로 안정시켰다. 시험 샘플의 일련의 희석액을 배지중에서 제조하였다 (TNF QC에 대해 4배가 적절함). 이후, 상이한 용액에서의 시험 샘플을 인간 TNF과 1:1로 희석시켰다. 각각의 희석액에 대해, 3중(triplicate)의 75 μl 부피를 L929 세포에 첨가하였다. 각각의 플레이트에 대해 네거티브 대조군 (즉, 조직 배지 단독) 및 포지티브 대조군 (차단제가 없는 인간 TNF)을 포함시켰다. 시험 샘플을 첨가한 후, 미세역가 플레이트를 16시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포역가 96 비-방사성 세포 증식 검정 키트(CellTiter 96 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit, Promega)의 일부인 MTT (3-[4,5-디메틸-티아졸-2-일]-2,5-디-페닐-테트라졸륨 브로마이드)를 이용하여 세포 증식을 측정하고: MTS- 및 PMS 용액을 해동시켰다. 150 μl의 부피로 배양된 세포를 함유하는 하나의 96 웰 플레이트에 충분한 시약의 제조를 위해, 3.0 ml의 MTS 용액을 무균 기술을 이용하여 황갈색 시약 병으로부터 옮기고, 시험 튜브로 이동시켰다. 세포를 함유하는 배양 플레이트에 첨가하기 직전에 150 μl의 PMS 용액을 3.0 ml의 MTS 용액을 첨가하였다. 튜브를 소용돌이시켜 조합된 MTS/PMS 용액을 완전히 혼합시켰다. 30 μl의 조합된 MTS/PMS 용액을 배지 중에 150 μl의 세포를 함유하는 96 웰 검정 플레이트의 각각의 웰에 피펫으로 옮겼다. 가습된 5%의 CO2 대기중에서 37℃에서 1-4 시간 동안 플레이트를 인큐베이션시켰다. ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 기록하였다.
상기 TNF 억제 검정으로부터의 결과를 도 1, 2, 3, 4, 5 및 6에 도시하였다. 삼합체 클론 TN2B1C22, TN2B1C31 및 TN2B1C24 (단량체 TN3-2-B1-C22, TN3-2-B1-C31 및 TN3-2-B1-C24에 해당함)이 모두 레미케이드 (Infliximab) 및 가용성 TNF 수용체 II (RII)에 비교하여 동등하거나 보다 나은 TNF 중화 능력을 지님이 도 1, 3 및 4로부터 명백히 나타난다. 특히, TN2-2-B1-C22 및 TN2-2-B1-C31이 또한 엔브렐보다 우수함이 도 1 및 3으로부터 확인될 수 있다. 도 1은 TN2B1C22의 단량체 형태 (즉, TN3-2-B1-C22)의 TNF 억제 능력이 레미케이드와 동등한 것을 나타낸다. 도 2로부터, TN2B1C22-7의 단량체 형태 (즉, TN3-B1-C22-7)가 레미케이드보다 우수함이 확인된다.
실시예 4: HUVEC 검정
인간 탯줄 내피 세포 (HUVEC)는 탯줄로부터로부터 분리된 형질되지 않은 일차 인간 세포이다. 세포를 몇번 계대하여 배양을 유지시켰다. 탯줄 내피 세포는 TNF에 민감하다. TNF에 의한 세포의 활성화 후, 세포는 IL8 및 IL6와 같은 염증성 사이토카인을 생성하기 시작했다. 이들은 박테리아 감염 후 제 1선의 방어를 나타내었다. TNF 결합 폴리펩티드의 효능을 연구하기 위해, TNF에 의해 유도된 IL6 및 IL8 생성의 억제를 시험하였다.
EGM-2 배지에서의 검정 설정 하루 전에 HUVEC 세포 (Cambrex Lot. Nr. 2f1828)를 플레이팅하였다. 세포를 시험 전에 부착시키고, 컨플루언트가 되도록 하였다. 웰당 200 μl의 5 x 104/mL HUVEC 세포 현탁액을 편평한 바닥의 웰인 96-웰 미세역가 플레이트 (Nunclon; Cat. No.: 167008)의 웰에 피펫으로 옮겼다. 시험 샘플을 배지에서 희석시켰다. 시험 샘플을 하기와 같이 제조하였다: 지정된 농도의 TNF 결합 폴리펩티드, 엔브렐 또는 레미케이드를 3 ng/ml의 인간 TNF와 함께 15분 동안 인큐베이션시킨 후, 100 μl의 용액을 HUVEC 세포에 첨가하여, 1 ng/ml의 TNF의 최종 농도를 생성시켰다. 희석액의 정확한 범위는 시험 샘플의 특성 및 표적의 민감성에 좌우된다. 각각의 플레이트에 네거티브 대조군 (즉, 조직 배양 배지 단독) 및 포지티브 대조군을 포함시켰다. 시험 샘플의 첨가 후, 미세역가 플레이트를 16-24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션시켰다.
다음날, 상층액을 웰로부터 수거하고, IL6 및 IL8 (10 x 희석됨)의 Elisa를 수행하여 인간 IL-6 & IL-8-ELISA (96 well maxisorp Nunc plate)의 프로토콜에 따라 TNF에 의해 유도된 사이토카인을 측정하였다. 하기의 물질을 ELISA를 위해 사용하였다: 인간 재조합 IL-6: Cat. No.: 206-IL-010 (R&D Systems), 모노클로날 항-인간 IL-6 항체 Code no.: MAB 206 (R&D Systems), 비오티닐화된 항-인간 IL-6 항체 Cat. no.: BAF206 (R&D Systems), 인간 재조합 IL-8: Cat. No.: 208-IL (R&D Systems), 모노클로날 항-인간 IL-8 항체 Code no.: MAB208 (R&D Systems), 비오티닐화된 항-인간 IL-8 항체 Cat. No.: BAF208 (R&D Systems).
TNF 결합 폴리펩티드 TN3-2-B1-C31, TN3-2-B1-C22-7, TN3-2-B1-C22-8를 상기 HUVEC 검정에서 시험하였다. 상기 실험으로부터의 결과를 도 6 및 7에 도시하였다. 상기 도에서 확인될 수 있는 바와 같이, TNF 결합 폴리펩티드 TN3-2-B1-C31, TN3-2-B1-C22-7, TN3-2-B1-C22-8은 IL8 (도 6) 및 IL6 (도 7)의 유도를 완전히 차단할 수 있었다. TNF 결합 폴리펩티드 TN3-2-B1-C22-7 (C22-7) 및 TN3-2-B1-C22-8 (C22-8)은 상기 실험에서 엔브렐과 같이 우수하였고, 레미케이드보다 현저하게 나았다.
실시예 5: 페길화된 TNF 결합 폴리펩티드 GG-I10-TN-2-B1-C22-7
삼합체 TNF 결합 폴리펩티드 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:79)를, 용액을 하기 언급된 세파덱스 G-25 미세 매트릭스 컬럼 상의 페길화 완충용액으로 변경시킨 것을 제외하고는 실시예 2에 기술된 바와 본질적으로 동일하게 제조하였다.
이러한 작제물을 서열 내의 처음 9개의 아미노산을 결실시키고, N-말단에 두개의 글리신을 첨가함으로써 페길화에 대해 채택하였다. 20 mM NaCNBH3를 함유하는 8M 우레아, 50 mM NaH2PO4 pH 6.0, 50 mM NaCl 중의 GG-I10-TN-2-B1-C22-7의 0.5 mg/mL 용액을 20 kDa의 평균 Mw를 지니는 10 몰과량의 메톡시 폴리 (에틸렌 글리콜)-부티르-알데히드 (mPEG-ALD)에 첨가하였다. 반응물을 약 20℃에서 밤새 교반시켰다. 이후, 단백질과 mPEG-ALD 사이의 반응 정도를 SDS-PAGE로 결정하였다.
반응되지 않은 단량체로부터의 페길화된 GG-I10-TN-2-B1-C22-7을 분리시키기 위해, 양이온 교환 컬럼을 수행하였다. 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM CaCl2에서 평형화된 1 mL의 소스 15S 컬럼 (Amersham)에 반응 혼합물을 로딩시키고, 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM CaCl2로부터 8M 우레아, 50 mM Na아세테이트 pH 4.5, 2 mM CaCl2, 1000 mM NaCl로의 선형 구배를 페길화되지 않은 단백질로부터 페길화된 단백질을 분류시키기 위해 사용하였다.
페길화된 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (20KPEG-GG-I10-TN-2-B1-C22-7), 페길화되지 않은 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (GG C22-7), 및 변이되지 않은 TN-2-B1-C22-7 (C22-7) (SEQ ID NO:32)를 이용하여 실시예 3에 기술된 바와 같이 L929 검정을 수행하였다. 엔브렐 및 레미케이드를 대조군으로 사용하였다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시험관내 검정에서의 페길화된 물질의 효능은 페길화되지 않은 물질과 현저하게 상이하지 않았다.
실시예 6: 마우스에서의 염증성 사이토카인 유도의 생체내 차단
마우스당 12.5, 25 및 50 μg의 3개의 상이한 농도로 TNF 결합 폴리펩티드 TN2-2-B1-C31을 마우스에 주사하였다. 30분 후, 마우스에 3 μg의 인간 TNF를 정맥내 주사하였다. 대조군에서 일반적으로 보이는 바와 같이, 인간 TNF는 IL-6 및 MCP-1과 같은 염증성 사이토카인 생성을 유도한다. 그러나, 도 9 및 10으로부터 확인될 수 있는 바와 같이, TNF 결합 폴리펩티드 TN2-2-B1-C31은 상기 염증성 사이토카인의 유도를 차단할 수 있다.
실시예 7: 류마티스 관절염 유발의 생체내 예방
Tg197 트랜스제닉 마우스 계통은 인간 TNF를 발현한다. 마우스는 5개 카피의 인간 TNF를 지니고, 3 내지 4주령에서 다발성관절염이 발달하였다. 상기 질병은 족관절의 종창 및 기형으로 4주에서 임상적으로 검출된다. 이는 8 내지 10 주령에서 후각부의 다리 운동의 중증 관절 파괴 및 손상을 야기시킨다. 진행성 체중 손실이 일반적이다. TNF 중화제의 적절한 투여는 상기 질병의 발달을 예방한다. Tg197 뮤린 관절염 모델의 다발성 관절염의 예방에서 본 발명의 TNF 결합 폴리펩티드의 효능을 시험하기 위해, TN-2-B1-C31를 연령 및 체중이 일치되는 Tg197 마우스의 그룹에 투여하였다. 3-4주령에서 예방 치료를 시작하였다. TNF 결합 폴리펩티드를 5주 동안 복막내(i.p.)로 주 3회 3.3, 1.0 및 0.5 mg/kg의 세개의 용량으로 투여하였다. 제 2의 복막내 주사전 및 연구의 종료시까지 혈액 샘플을 수집하였다.
관절염의 중증도를 평가하고, AS-O으로부터 AS-3까지의 범위의 관절염 스코어로 나타내었으며, 여기서 0은 관절염이 없고, 3은 관절에서의 연골 분해 및 골 분해에 기인한 완전한 손상을 나타낸다.
도 11은 3개의 상이한 용량의 염수 (네거티브 대조군), 야생형 테트라넥틴 (네거티브 대조군) 및 레미케이드 (포지티브 대조군)로 TIM2-2-B1-C31 (도면에서 "보리안 작제물(Borean construct)"으로 명명됨)로 처리된 여러 그룹의 마우스에 대한 관절염 스코어를 도시한다. 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 보다 높은 용량의 TN2-2-B1-C31는 보다 낮은 관절염 스코어를 나타낸다. 이는 TN2-2-B1-C31이 류마티스 관절염의 치료에 효과적임을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Borean Pharma A/S <120> TNF Antagonists <130> 16291 <160> 81 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 1 Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> any amino acid residue <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> any amino acid residue <400> 2 Pro Xaa Pro Xaa Asn 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> hydrophilic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> hydrophobic amino acid <400> 3 Xaa Pro Xaa Pro Xaa Asn Xaa 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 4 Glu Leu Pro Gln His Ala Gln Pro Asp Pro Ser Asn Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial 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155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 71 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 71 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Gln Leu Pro Gln His Ala Asp Pro 130 135 140 Ala Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 72 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 72 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Leu Pro Gln His Glu Gln Pro 130 135 140 Glu Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 73 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 73 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Leu Ala Ser Asp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Ala Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 74 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 74 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Leu Ile Arg Asp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Ala Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 75 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 75 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Leu Leu Ser Asp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Val Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 76 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 76 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Arg Arg Gln Asp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Ser Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 77 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 77 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Arg Leu Ala Asp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Phe Asn Trp Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 78 <211> 181 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Artificial <400> 78 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Tyr Phe Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Gly Ile Glu Trp Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Pro Thr Asn Phe Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Gly Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 79 <211> 181 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu Lys Gly Thr Lys Val His Met Lys Cys Phe Leu Ala Phe 50 55 60 Thr Gln Thr Lys Thr Phe His Glu Ala Ser Glu Asp Cys Ile Ser Arg 65 70 75 80 Gly Gly Thr Leu Ser Thr Pro Gln Thr Gly Ser Glu Asn Asp Ala Leu 85 90 95 Tyr Glu Tyr Leu Arg Gln Ser Val Gly Asn Glu Ala Glu Ile Trp Leu 100 105 110 Gly Leu Asn Asp Met Ala Ala Glu Gly Thr Trp Val Asp Met Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Ile Ala Tyr Lys Asn Trp Glu Thr Glu Ile Thr Ala Gln Pro 130 135 140 Asp Gly Gly Lys Thr Glu Asn Cys Ala Val Leu Ser Gly Ala Ala Asn 145 150 155 160 Gly Lys Trp Phe Asp Lys Arg Cys Arg Asp Gln Leu Pro Tyr Ile Cys 165 170 175 Gln Phe Gly Ile Val 180 <210> 80 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial <400> 80 Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala Lys Lys Asp 1 5 10 15 Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg Leu Asp Thr 20 25 30 Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala Leu Gln Thr 35 40 45 Val Cys Leu 50 <210> 81 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> artificial <400> 81 Met Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Gln Gly Arg Ser 1 5 10 15 Pro Gly Thr Glu Pro Pro Thr Gln Lys Pro Lys Lys Ile Val Asn Ala 20 25 30 Lys Lys Asp Val Val Asn Thr Lys Met Phe Glu Glu Leu Lys Ser Arg 35 40 45 Leu Asp Thr Leu Ala Gln Glu Val Ala Leu Leu Lys Glu Gln Gln Ala 50 55 60 Leu Gln Thr Val Ser Leu Lys Gly Ser 65 70

Claims (26)

  1. 아미노산 서열 KRWSRYF (SEQ ID NO:1)를 포함하는, 종양 괴사 인자 (TNF)에 결합할 수 있는 폴리펩티드.
  2. 제 1항에 있어서, 아미노산 서열이 C형 렉틴 유사 도메인의 일부를 구성함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 2항에 있어서, C형 렉틴 유사 도메인이 테트라넥틴으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  4. 제 3항에 있어서, 테트라넥틴으로부터 유래된 C형 렉틴 유사 도메인이 실질적으로 SEQ ID NO:79에 잔기 50-181로 나열된 것과 같은 아미노산 서열임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  5. 제 4항에 있어서, SEQ ID NO:79의 165번 잔기인 아스파르트산 잔기가 글리신으로 변이된 것임을 특징으로 한는 폴리펩티드.
  6. 제 1항에 있어서, X1 및 X2가 각각 독립적인 아미노산 잔기인 아미노산 서열 PX1PX2N (SEQ ID NO:2)을 추가로 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  7. 제 1항에 있어서, X1이 S, T, N, Q, E, D, K, R 및 H로부터 선택된 친수성 아미노산이고; X2 및 X3가 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, X4가 M, A, V, L, P, W, F, Y 및 C로 구성된 군으로부터 선택된 소수성 아미노산인, 아미노산 서열 X1PX2PX3NX4 (SEQ ID NO:3)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 1항에 있어서, X1이 S, T, N, Q, E, D, K, R 및 H로부터 선택된 친수성 아미노산이고; X2 및 X3가 각각 독립적인 아미노산 잔기이고, X4가 W, F 및 Y로 구성된 군으로부터 선택된 방향족 아미노산인, 아미노산 서열 X1PX2PX3NX4 (SEQ ID NO:3)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  9. 제 1항에 있어서, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:28로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  10. 제 9항에 있어서, TN3-2-B1-C22 (SEQ ID NO:29), TN3-2-B1-C31 (SEQ ID NO:30), TN3-2-B1-C24 (SEQ ID NO:31), TN3-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:32), TN3-2-B1-c22-1 (SEQ ID NO:33), TN3-2-B1-c22-2 (SEQ ID NO:34), TN3-2-B1-c22-3 (SEQ ID NO:35), TN3-2-B1-c22-4 (SEQ ID NO:36), TN3-2-B1-c22-6 (SEQ ID NO:37), TN3-2-B1-c22-7 (SEQ ID NO:38), TN3-2-B1-c22-8 (SEQ ID NO:39), TN3-2-B1-c22-9 (SEQ ID NO:40), TN3-2-B1-c22-10 (SEQ ID NO:41), TN3-2-B1-c22-11 (SEQ ID NO:42), TN3-2-B1-c22-12 (SEQ ID NO:43), TN3-2-B1-c22-13 (SEQ ID NO:44), TN3-2-B1- c22-14 (SEQ ID NO:45), TN3-2-B1-c22-15 (SEQ ID NO:46), TN3-2-B1-c22-16 (SEQ ID NO:47), TN3-2-B1-c7 (SEQ ID NO:48), TN3-2-B1-C19 (SEQ ID NO:49), TN3-2-B1-C1 (SEQ ID NO:50), TN3-2-B1-C20 (SEQ ID NO:51), TN3-2-B1-C53 (SEQ ID NO:52) 및 TN3-2-B1-C29 (SEQ ID NO:53)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  11. 제 3항에 있어서, C형 렉틴 유사 도메인이 테트라넥틴으로부터 유래된 삼합체화 도메인 (trimerising domain)에 연결됨을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  12. 제 11항에 있어서, 테트라넥틴으로부터 유래된 삼합체화 도메인이 SEQ ID NO:80의 서열과 68% 이상의 아미노산 서열 동일성을 지니는 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  13. 제 12항에 있어서, 아미노산 서열 동일성이 92% 이상을 포함하여, 75% 이상, 예를들어 87% 이상임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  14. 제 11항에 있어서, 테트라넥틴으로부터 유래된 삼합체화 도메인이 SEQ ID NO:81의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  15. 제 11항에 있어서, TN2-2-B1-C22 (SEQ ID NO:54), TN2-2-B1-C31 (SEQ ID NO:55), TN2-2-B1-C24 (SEQ ID NO:56), TN2-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:57), TN2-2-B1-c22-1 (SEQ ID NO:58), TN2-2-B1-c22-2 (SEQ ID NO:59), TN2-2-B1-c22-3 (SEQ ID NO:60), TN2-2-B1-c22-4 (SEQ ID NO:61), TN2-2-B1-c22-6 (SEQ ID NO:62), TN2-2-B1-c22-7 (SEQ ID NO:63), TN2-2-B1-c22-8 (SEQ ID NO:64), TN2-2-B1-c22-9 (SEQ ID NO:65), TN2-2-B1-c22-10 (SEQ ID NO:66), TN2-2-B1-c22-11 (SEQ ID NO:67), TN2-2-B1-c22-12 (SEQ ID NO:68), TN2-2-B1-c22-13 (SEQ ID NO:69), TN2-2-B1-c22-14 (SEQ ID NO:70), TN2-2-B1-c22-15 (SEQ ID NO:71), TN2-2-B1-c22-16 (SEQ ID NO:72), TN2-2-B1-c7 (SEQ ID NO:73), TN2-2-B1-C19 (SEQ ID NO:74), TN2-2-B1-C1 (SEQ ID NO:75), TN2-2-B1-C20 (SEQ ID NO:76), TN2-2-B1-C53 (SEQ ID NO:77), TN2-2-B1-C29 (SEQ ID NO:78) 및 GG-I10-TN-2-B1-C22-7 (SEQ ID NO:79)로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  16. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  17. 제 16항의 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  18. 제 17항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. (i) 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 정의된 TNF에 결합할 수 있는 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 제 16항의 분리된 핵산 서열을 발현시키는 단계, 및 (ii) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 정의된 TNF에 결합할 수 있는 폴리펩티드를 제조하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 약제 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 제 20항에 따른 조성물의 유효량을 TNF에 의해 매개되는 병리를 지니는 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 상기 피검체를 치료하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, TNF에 의해 매개되는 병리가 류마티스 관절염, 건선 및 크론병으로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  23. (i) 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 상기 폴리펩티드에 대한 TNF의 결합을 검출하는 단계를 포함하여, 샘플 내의 TNF를 검출하는 검정 방법.
  24. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, 약제로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  25. 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 있어서, TNF에 의해 매개되는 질병을 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  26. 약제 제조물의 제조에 있어서의 제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드의 용도.
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