KR20070082329A - 신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주 및 이로부터분리한 자일라나제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 균주 및 상기 균주로부터 분리한 자일라나제(xylanase)에 관한 것으로서, 구체적으로 곤충으로부터 분리한, 섬유소 분해능이 우수한 패니바실러스 sp. HY-8 균주 및 상기 균주로부터 분리한 자일라나제에 관한 것이다. 본 발명의 HY-8 균주 및 자일라나제는 다양한 식물성 사료 원료에서 섬유소를 분해시킴으로써 사료 효율을 대폭 증가시킬 수 있으므로 사료 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.

패니바실라스 sp. HY-8 균주, 자일라나제

Description

신규한 패니바실러스 ｓｐ. ＨＹ-8 균주 및 이로부터 분리한 자일라나제{Novel Paenibacillus sp. HY-8 strain and xylanase isolated from it}

도 1은 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 균주의 전자현미경 사진이고,

도 2는 HY-8 균주로부터 분리한 자일라나제의 효소활성을 나타낸 그래프이고,

도 3은 HY-8 균주로부터 분리한 자일라나제를 컬럼 크로마토그래피로서 분리정제하는 과정과 아크릴아마이드 겔로 전기영동한 후 결과를 나타낸 그림이고,

도 4는 HY-8 균주로부터 분리한 자일라나제의 생화학적 특성을 나타낸 그래프이고,

도 5는 HY-8 균주로부터 분리한 자일라나제를 식물성 사료에 첨가했을 때, 자일란 분해에 의해 자일로즈가 생성되는 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 신규한 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 균주 및 상기 균주로부터 분리한 자일라나제(xylanase)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 곤충으로부터 분리한, 섬유소 분해능이 우수한 패니바실러스 sp. HY-8 균주 및 상기 균주로부터 분리한 자일라나제에 관한 것이다.

자일라나제(xylanase)는 미생물이 생산하는 다양한 효소 중의 하나로써, 헤미셀룰로즈(hemicellulose)의 주성분인 자일란(xylan)을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세 가지 종류의 효소 즉, 엔도자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나제계 효소로 통칭하고 있다 (Biely, P., Trends. Biotechnol., 3, 286-290, 1985). 현재 고급용지의 생산 및 폐지재생 (Beg, Q. 및 G. S. Hoondal., Appl. Micribiol. Biotechnol. 56, 326-338, 2001), 과일음료 및 맥주의 혼탁물 제거, 커피와 식물성 기름 및 전분의 추출 그리고 사료 효율 증대 등과 같이 다양한 용도로 사용되고 있다 (Bedford, M. R 및 Classen, H. L., Elsevier Amsterdam, 361-370, 1992; Wong, K. K. Y 및 Saddler, J. N.,Crit. Rev. Biotechnol. 12, 413-435, 1992). 최근에는 사료첨가용 효소로서 자일라나제의 유용성이 증대되고 있는데 이는 동물의 에너지 대사에 필요한 탄수화물과 소량의 단백질을 공급하는 사료용 곡물은 대부분의 동물이 이용하지 못하는 섬유질을 함유하고 있는데 자일라나제가 이 섬유질을 분해할 수 있기 때문이다.

곡물중의 섬유질은 비전분성 다당류(nonstarch polysaccharides)와 리그닌 (lignin)으로 구성되며, 식물의 세포벽은 세포의 제일 바깥쪽의 셀룰로즈(cellulose) 층과 그 내부의 알곡 전체를 감싸며 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로즈(hemicellulose) 및 베타-글루칸으로 구성된 비전분성 다당류와 리그닌이 합쳐져 이루어진다. 상기 비전분성 다당류는 가축의 소화효소에 의해 분해되지 않을 뿐만 아니라 곡물 중의 전분이나 단백질을 감싸고 있기 때문에 가축이 영양소를 이용하는 효율을 떨어뜨린다. 특히, 밀과 호밀의 세포벽에 다량 함유되어 있는 수용성 자일란은 소화관내에서 수분을 빨아들여 끈적끈적한 겔 상태가 되어 소화 효소가 영양소로 접근하는 것을 방해하고, 소화관 내 소화물의 흐름을 저해함에 따라, 미생물이 소화물에 부착하면서 이상발효를 일으켜 영양분의 손실을 가져오게 된다 (Kuhad, R. C. 및 Singh, A., Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993).

따라서, 자일라나제(xylanase)를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로즈 층을 가수분해하여 알곡내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태를 개선시킬 수 있다. 특히, 헤미셀룰로즈 함량이 높은 소맥제품을 사료로 사용할 경우 가축에 연변이나 적리 현상이 일어나기 쉬운데 자일라나제는 이러한 현상을 예방할 수 있고, 사료로서의 가치를 높일 뿐 아니라 아니라 소맥제품의 품질의 편차를 개선하여 소맥제품을 안정적인 사료원료로 사용할 수 있게 하므로 사료첨가용 효소로 그 가치가 높다. 또한, 최근 선진국뿐 아니라 생활환경과 소득이 개선된 많은 국가의 국민들의 육류소비가 늘고 있어 자일라나제는 돼지나 닭과 같은 단위(單胃)동물의 사료첨가용 효소로 매우 중요하게 취급되고 있다 (Bedford. M. R., Animal Feed Science and Technology. 53, 145-155, 1995).

지금까지 보고된 사료 첨가용 자일라나제의 생산에 사용되고 있는 미생물은 곰팡이를 들 수 있으며 곰팡이 중에서도 트리코더마(Trichoderma) 속 균주들이 주로 이용되어 왔는데 이들의 효소 생산성은 자일라나제를 생산하는 세균의 효소 생산성에 비해 대체로 우세하며 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다 (Tenkanen, H. 및 Poutanen, K., Enzyme. Microb. Technol. 14, 566-574, 1992). 그러나, 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 자일라나제가 작용해야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이다. 따라서, pH 5.0 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 자일라나제보다는 산도가 중성 부근의 조건에서 활성이 높은 자일라나제가 사료첨가용 효소로 요구되고 있는 실정이다. 중성 부근에서 활성이 높은 산도를 가진 자일라나제를 생산하는 세균으로는 애로모나스(Aeromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 클로스트리디움(Clostridium) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속 등에 속하는 다양한 종류의 세균이 있으며, 세균에 따라 생산하는 자일라나제의 반응특성도 다양하다. 또한, 상기에서 언급한 자일란(xylan)은 목초 헤미셀룰로즈에서는 30%의 당으로 구성되어 있으며, 콩과류 헤미셀룰로즈에서는 20%의 당으로 구성되어 있다. 콩과류 사료의 헤미셀룰로즈가 목초의 헤미셀룰로즈보다 더욱 복잡한 당복합체로 구성되어 있기 때문에 이를 분해하기 위해서 좀 더 복잡한 효소적 분해과정이 요구되고 있으므로 자일라나제와 같은 사료 첨가물의 개발이 더 절실히 요구된다.

현재 알려진 국내의 자일라나제 관련 특허로는 자일라나제를 생산하는 신규 한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 대한 특허(대한민국 공개특허 2001-0111986), 고초균 유래 엔도자일라나제의 신호서열 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 및 그를 이용한 외래단백질의 제조방법에 관한 특허(대한미국 공개특허 2000-0034279), 바실러스 속 AMX-4 (Bacillus sp. AMX-4) 균주의 자일라나제(xylanase)를 코드하는 신규한 자일라나제 유전자(대한민국 공개특허 2003-0085679) 등이 있으나 실제로 국내에서 사료첨가물 등으로 사용되지 못하고 있는 실정이다.

한편, 곤충은 지구상에서 가장 번성한 생물군으로서 다양한 먹이습성과 높은 생물학적 다양성을 나타내고 있다. 최근 들어, 이러한 곤충의 생물특성을 고려한 곤충의 공생 미생물을 유용한 생물자원으로 활용하고자 하는 연구가 증가되고 있으며, 특히 곤충의 생육과 밀접한 관련이 있는 장내 미생물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 실례로, 장내 미생물이 흰개미의 소화 및 영양에 관여하고 있다는 연구 (Breznak, J. A. 및 A. Brune., Ann. Rev. Entomoi. 39, 453-457, 1994)와 동물성 먹이를 포식하는 무당거미로부터 고효율의 단백질 분해효소 생산 균주를 분리하여 산업적으로 응용하고 있는 사례 (Lee, G. E. 및 H. Y. Park., Kor. J. Microbiol. 40, 269-274, 2004), 그리고 나비목, 딱정벌레목을 포함하는 여러 가지 곤충에서 분자생물학적 기법을 활용한 장내 미생물의 생태적 연구들이 발표되고 있다 (Markus, E 및 Friedrich, W., Appl. Environ. Microbiol. 69, 6659-6668. 2003; Nichole, A. 및 Handelsman, J., Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300, 2004).

이에, 본 발명자들은 식물의 잎이나 목피 등 자일란이 풍부한 식물을 먹이로 하는 다수의 곤충으로부터 고효율의 자일라나제 생산 균주를 선별하여 이로부터 분리된 자일라나제를 식물성 사료 원료에 처리한 후 환원당의 증가를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 자일란이 풍부한 식물체를 먹이로 하는 곤충으로부터 선별한 패니바실러스 sp. HY-8 균주로부터 생산되는 자일라나제를 분리, 정제하여 식물성 사료 및 저급사료에 처리하여 사료효율을 증가시키는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 패니바실러스 sp. HY-8 균주를 이용하여 자일라나제를 생산하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 패니바실러스 sp. HY-8 균주를 포함하는 자일란 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 균주를 제공한다.

본 발명의 미생물은 60여 종의 곤충 내장으로부터 세균 분리용 배지에 도말하여 형성된 세균 콜로니를 귀리 자일란이 함유된 제한 배지에 접종하여 배양한 후 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 귀리 자일란의 분해능이 가장 우수한 균주를 선별하여 자일라나제를 생산하는 미생물을 선별하였다. 선별한 균주의 특성을 분석한 결과, 그람포지티브 간균(Gram-positive bacilli)으로 편모는 가지고 있지 않으며(도 1 참조) 16S rDNA의 부분 염기서열을 결정한 결과(서열번호 1), 패니바실러스 파불리, 패니바실러스 아밀리티쿠스 등의 균주와 98-99% 이상의 높은 상동성을 나타냄을 확인하였다. 이에 따라, 본 균주를 패니바실러스 sp.에 속하는 균주로 동정하여 “패니바실러스 sp. HY-8”로 명명하고 상기 균주는 2006년 1월 17일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 10896BP).

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제 효소 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명자들은 분리, 동정한 패니바실러스 sp. HY-8 균주를 귀리 자일란을 포함하는 액체배지에서 배양한 후, 침전제(예: 황산암모늄)를 넣어 수용성 단백질을 침전시키고 이를 투석막으로 투석 후 컬럼으로 정제하여 자일라나제를 수득하였 다 (도 3 b,c). 순수분리된 자일라나제의 귀리 자일란에 대한 특이적인 활성은 147.8 U/mg이었으며, 회수율 19.5%, 순수분리 26.9 배로 측정되었다(표 1 참조).

상기와 같이, 순수 분리한 자일라나제를 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 분자량을 측정하고 (도 3a 참조) 순수분리 된 단백질을 트립신으로 처리한 다음 MS/MS 분석과 database 검색을 통하여 높은 상동성을 나타내는 다른 세균성 자일라나제를 탐색하고 이들 세균성 자일라나제의 비교를 통하여 상동성이 높은 부분을 기준으로 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 제작하였으며 PCR과 DNA walking 기법을 활용하여 633개의 염기로 이루어진 자일라나제의 전사 해독틀을 갖는 211개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 22.9 kDa의 단백질(서열번호 4 및 5)을 규명하였다.

패니바실러스 sp. HY-8 균주가 생산하는 자일라나제는 세균성 자일라나제로 알려진 에로모나스 푼타타(Aeromonas punctata) 자일라나제와 88%의 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 보였고, 지오바실러스 스테아로서모필러스(Geobacillus stearothermophillus) 및 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacilus polymyxa)의 엔도-베타-1,4-자일라나제와 각각 88%, 87%의 상동성을 보이는 신규한 자일라나제로 밝혀졌다.

본 발명에서는 상기와 같이, 패니바실러스 sp. HY-8 균주로부터 분리한 자일라나제를 코딩하는 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제작할 수 있다.

이어, 자일라나제의 최적 반응조건을 조사한 결과, 온도조건은 46℃ 내지 60℃ 바람직하게는 50℃에서 최대 활성을 나타내었으며 산도는 pH 6.0-6.5에서 최대 활성을 나타내어 중성 pH에서도 활성이 높은 자일라나제임을 확인하였다(도 4a 및 4b 참조) 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 온도와 시간을 달리하며 정제 효소액을 각 온도에서 30분간 처리 후 잔존 효소활성을 측정한 결과, 50℃보다 낮은 온도에서는 효소활성이 안정하게 유지됨을 확인하였다(도 4c 참조). 또한, 총 9 종류의 금속이온을 첨가하였을때, 자일라나제의 활성은 Fe²⁺이온과 Cu²⁺이온의 첨가 시 활성이 감소되었으나, Ca, Zn, K, Mg, Na 등의 첨가 시에는 활성이 대체적으로 증가하였고, 특히 코발트 이온 존재 시 효소활성이 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 4d 참조).

또한, 본 발명은

1) 자일란을 포함하는 배지에서 제 1항의 패니바실러스 sp. HY-8 균주 또는 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 상층액인 조효소액을 수득하는 단계;

2) 단계 1에서 수득된 조효소액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계; 및

3) 단계 2에서 침전을 유도한 조효소액을 원심분리 및 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산방법을 제공한다.

단계 2의 침전제로는 황산 암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄 올, 폴리에틸렌글리콜 등이 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명은 패니바실러스 sp. HY-8 균주를 포함하는 자일란 분해 증진용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 자일라나제가 식물성 사료에 대한 첨가제로 적합한지를 조사하기 위해서, 자일란이 풍부한 식물성 사료인 대두박, 면실박, 채종박, 배아박, 소맥피, 대두, 야자박 및 루핀종실을 대상으로 본 발명의 자일라나제 처리 후, 효소활성에 의해 생성된 환원당의 양을 분석하였다. 그 결과, 대부분의 식물성 사료에 대해 자일란의 분해에 의한 환원당의 생성에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로는 효소를 첨가하지 않은 시험군에 대해 환원당을 조사한 다음 처리군에서 그 양을 빼는 방법으로 순수 자일라나제에 의해 생성된 환원당을 측정하였으며, 비교 대조군으로는 트리코더마(Trichoderma) 유래의 자일라나제를 동일 유니트로 첨가하여 처리군과 동일한 방법에 의해 생성된 환원당의 양을 측정하였다. 그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 패니바실러스 sp. HY-8 유래의 자일라나제는 면실박, 소맥피, 대두, 대두박, 야자박 및 루핀 등의 식물성 사료성분에 대해 대조군보다 우수한 자일란의 분해효과를 나타내었으며, 배아박에 대해서는 비교 대조군과 유사한 분해효과를 보였고, 채종박의 경우 비교 대조군이 조금 더 우수한 분해효과를 보였다(도 5 참조). 상기의 결과로부터 본 발명의 자일라나제는 자일란 분해를 촉진함으로써 식물성 사료를 포함하는 사료의 첨가제로 사용 가능함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예에 의해서 한정되지는 않는다.

<실시예 1> 균주 분리 및 선별

본 발명자들은 자일라나제(xylanase)를 생산하는 세균의 분리를 위하여 대전 인근 야산에서 채집한 털두꺼비하늘소를 70%(w/w) 에탄올에 1-2분 정도 침지하여 충체표면의 오염원을 제거한 후, 충체에 묻어 있는 에탄올을 제거하기 위하여 멸균된 증류수로 2번 세척하였다. 세척한 충체는 해부한 후 핀셋으로 내장을 꺼내어 생리식염수(Phospate-buffered saline; 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na₂HPO₄, 0.024% KH₂PO₄)에 넣고 분쇄하였으며, 여기서 수득한 추출물을 0.5% 귀리 자일란(Sigma Chem. Co.)을 첨가한 고체배지(5g/L yeast extract, 10g/L tryptone, 5g/L sodium chloride. 20g/L agar)에 도말하여 25℃에서 2일간 배양 후 Congo-red 염색법(Theater, R. M. 및 Wood, P. J., Appl. Environ. Microbiol. 43, 777-780, 1982)을 통해 자라난 콜로니 주변에 투명환(plaque)을 형성하는 균주를 1차적으로 선별하였다.

상기의 방법으로 1차 선별된 균주들을 0.5% 귀리 자일란이 함유된 제한 배지(K₂HPO₄ 7g/L, KH₂PO₄ 2g/L, (NH₄)₂SO₄ 1g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 1.1g/L, 효모 추출물 0.6g/L) 3 ml에 접종하여 25℃의 진탕 배양기에서 48시간 배양 및 원심분리한 후 상등액을 회수하여 자일라나제 활성을 측정하고, 그 중 자일라나제 활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다. 효소 활성은 DNS(dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller, G. L., Anal. Chem., 55, 952-959, 1959)을 사용하였고, 구체적으로는 100㎕의 효소용액에 100㎕의 기질용액(1% 귀리 자일란이 포함된 50 mM 인산나트륨용액, pH 6.0)을 넣고 50℃에서 10분간 반응시킨 후 700㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에 5분간 처리한 후 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 효소의 1유니트(unit)는 1분 동안에 1μmol의 환원당을 방출시키는 효소양으로 정하였다.

<실시예 2> 균주 동정 및 특성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 분리한 가장 높은 활성을 지닌 자일라나제를 생산하는 균주를 25℃에서 배양한 후 그람염색(gram staining) 및 포자염색(spore staining)(Cappuccino 및 Sherman, Microbiology a laboratory manual, 2nd edition, The Benjamin/Cummings Publishing Co.)을 실시한 결과, 포자를 생성하며 그람 양성균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이 1.1 ㎛의 세포크기와 2.5 ㎛ 내지 4 ㎛의 세포길이를 갖는 막대형(rod)이었으며 편모를 가지는 않는 운동성이 없는 간균으로 나타났다. 또한, 균주의 16S rDNA 염기서열 결정을 위하여 균주의 게놈 DNA를 분리하였으며(DNeasy Tissue kit, Qiagen) PCR을 위한 반응물은 다음과 같은 조성으로 50 ul의 반응을 실시하였 다. 1㎕의 전체 DNA (50-200ng/ul)에 10배의 Taq DNA 중합효소 완충액(MgCl₂ 첨가) 5㎕, 2.5mM의 dNTPs(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 5㎕, 3.2pmol의 정방향 프라이머(서열번호 6 및 7)를 각각 5㎕, 1-2 단위의 Taq DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하여 최종 50ul 반응액이 되도록 증류수를 더하였다. 프라이머들은 진핵세균의 16S rDNA 부위에 해당하는 1465 bp의 뉴클레오티드 증폭을 위해 합성하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간의 변성(denaturation)을 수행한 후 94℃에서 30초의 변성, 65℃에서 30초의 어닐링(annealing), 72℃에서 3분의 연장(extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하고 4℃에서 유지되었다.

그 결과 확보된 증폭단편의 부분염기서열을 결정하고 GenBank database 검색 결과, 패니바실러스 파블리, 패니바실러스 아밀리티쿠스 등의 균주와 98-99% 이상의 높은 상동성을 나타냄을 확인하였고, 본 균주를 패니바실러스 sp.에 속하는 것으로 동정하였으며 패니바실러스 sp. HY-8로 명명하였다. 상기 패니바실러스 sp. HY-8 균주는 2006년 1월 17일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호; KCTC 10896BP).

<실시예 3> 자일라나제의 특성 분석

<3-1> 자일라나제의 분리 및 정제

본 발명자들은 상기 실시예에서 분리, 동정한 패니바실러스 sp. HY-8 균주가 생산하는 자일라나제를 하기와 같이 순수 분리하였다. 구체적으로, K₂HPO₄ 7g/L, KH₂PO₄ 2g/L, (NH₄)₂SO₄ 1g/L, MgSO₄ㆍ7H₂O 1.1g/L, 효모 추출물 0.6g/L, 귀리 자일란 3g/L(Sigma Chem. Co.)로 구성되는 액체배지에서 48시간 배양한 후 원심분리하여 회수한 상층액에 황산암모늄 분말을 70% 포화되게 첨가한 다음 원심분리하여 침전물을 회수하였다. 상기의 침전물에 50 mM 인산나트륨(pH 6.0) 완충액을 가하여 침전물을 용해시킨 다음, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전을 제거한 다음 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.0)로 4℃에서 24시간 투석(Spectrum, MW cutoff 12 kDa)하여 조효소액을 얻었다. 효소의 칼럼 크로마토그래피를 위하여 FPLC system (Amersham-Pharmacia Biotech)을 사용하였다. 우선 Hiload superdex 200 겔 크로파토그래피 (Amersham Pharmacia Biotech Inc) 컬럼을 이용하여 조효소액을 분자의 크기에 따라 2.5ml/mim의 유속으로 용출하였다 (도 3A 참고). 효소 활성 분획만을 취하여 20 mM MES buffer(pH 7.6)로 평형화된 Mono S HR 5/5 이온교환수지(Amersham Pharmacia Biotech Inc) 컬럼을 이용하여 1ml/min의 유속으로 NaCl의 농도를 0-0.5M까지 농도구배로서 용출한 다음 (도 3B 참고), 효소 활성 분획만을 취하여 정제여부를 SDS-PAGE로 확인하였다(도 3C 참고). 활성 분획을 동결건조하여 -20℃에 보관하며 사용하였다.

<3-2> 자일라나제의 효소 활성 측정

상기 실시예 <3-1>의 정제 단계에서 회수한 각각의 시료로부터 자일라나제 효소 활성을 측정하였다. 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, M. M., Anal. Biochem, 86, 142-146, 1997)을 이용하여 측정하였고, 표준 단백질로는 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다. 최종적으로 1L 배양액으로부터 순수 분리된 자일라나제의 귀리 자일란에 대한 특이적인 활성은 147.8 U/mg이었으며, 회수율 19.5%, 순수분리 26.9 배로 정제되었으며 각 분리정제단계의 전체 효소활성과 특이적 효소활성, 정제도 및 회수율을 표 1에 나타내었다.

<3-3> 자일라나제의 분자량 및 아미노산 서열 결정

본 발명자들은 상기 실시예 <3-1>에서 순수 분리된 자일라나제를 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 분자량을 측정하였다. 도 3c에서 레인 1(lane 1)은 크기를 알고 있는 마커 단백질이고, 레인 2(lane 2)는 배양 상등액을, 레인 3(lane 3)은 Mono S 컬럼을 거쳐 최종적으로 정제된 자일라나제 단백질을 나타낸 것이다. SDS-PAGE에 의한 분자량을 측정한 결과, 본 발명의 자일라나제는 약 22.5 kDa의 분자량을 지닌 것으로 나타났다(도 3c).

또한, 상기의 분리된 자일라나제의 클로닝을 위해 단백질 분해효소인 트립신으로 처리한 다음, 기초과학지원연구원에 의뢰하여 MS/MS 분석과 (Q-TOF, Micromass, UK) database 검색을 실시한 결과 애로모나스 푼타타 (Aeromonas punctata) 자일라나제와 높은 상동성을 나타내는 트립신 분해 단편을 확인할 수 있었다. 이 결과를 바탕으로 NCBI에서 제공하는 세균성 자일나나제 서열을 내려 받아 상동성이 높은 여러 세균성 자일라나제의 서열을 비교하여 높은 아미노산 보존 서열을 중심으로 축퇴성 프라이머(degenerate primer)를 제작하였고(서열번호 2 및 3), PCR과 DNA walking 기법 (DNA walking speedup kit, Seegene ver 2.1)을 통해 패니바실러스 sp. HY-8 자일라나제의 전체 염기서열과 아미노산서열을 결정하였다. PCR 증폭 조건은 PCR Premix kit(Bioneer)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍과 주형을 94℃에서 5분 동안 변성시키고, 94℃에서 30초, 52℃에서 40초 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 7분간 연장시켜 반응을 종결하였다.

그 결과, 패니바실러스 sp. HY-8은 633개의 염기로 이루어진 자일라나제의 전사 해독틀(open reading frame)을 가지는 211개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 22.9 kDa의 단백질로서 GenBank 데이터베이스 검색 결과, 세균성 자일라나제로 알려진 에로모나스 푼타타(Aeromonas punctata) 자일라나제와 88%의 가장 높은 아미노산 서열 상동성을 보였고, 지오바실러스 스테아로서모필러스(GeoBacillus stearothermophillus) 및 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacilus polymyxa)의 엔도-베타-1,4-자일라나제와 각각 88%, 87%의 상동성을 보이는 신규한 자일라나제로 판명되었다.

<3-4> 자일라나제의 생화학적 특성조사

자일라나제의 최적 반응조건을 조사하기 위하여 반응 온도, 반응액의 pH 및 금속이온의 영향을 알아보았다.

효소활성 최적온도는 30-90℃범위에서 10℃ 간격으로 효소활성을 측정하였고, 온도를 10℃부터 80℃의 온도에서 각각 30분간 처리한 후 효소의 잔여 활성을 측정하는 방법을 이용하여 효소의 열안정성을 측정하였다. 효소활성 최적 pH는 50 mM Sodium citrate buffer (pH 3.0-6.0), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0-7.0), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0-8.0) 및 50 mM boric acid buffer (pH 8.0-10.0)을 사용하여 결정하였다. 먼저, 반응 온도 및 pH가 자일라나제의 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 50℃와 pH 6.0-6.5에서 최대 활성을 보여 중성 pH에서도 활성이 높은 자일라나제임을 확인하였다(도 4a 및 4b). 또한, 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 온도와 시간을 달리하며 정제 효소액을 각 온도에서 방치한 후 잔존활성을 측정한 결과, 60℃ 에서 30분간 처리했을 때는 활성이 50% 정도로 감소하였고, 50℃에서는 30분 처리에 의해 잔존활성이 약 80% 정도로 나타났지만, 50℃보다 낮은 온도에서는 효소활성이 안정하게 유지됨을 확인하였다(도 4c).

또한, 자일라나제에 대한 금속이온의 영향을 조사한 결과, 코발트 이온 등 총 9 종류의 금속이온(Sigma Chem. Co.)을 10 mM의 농도로 첨가하여 반응시켰을 때, 자일라나제의 활성은 Fe²⁺이온과 Cu²⁺이온의 첨가 시 활성이 감소되었으나, Ca, Zn, K, Mg, Na 등의 첨가 시에는 활성이 대체적으로 증가하였고, 특히 코발트 이온 존재 시 효소활성이 2배 이상 증가함을 확인하였다(도 4d)

<실시예 4> 자일라나제의 사료첨가제로의 유용성 확인

본 발명의 자일라나제가 식물성 사료에 대한 첨가제로 적합한지를 조사하기 위해서, 자일란이 풍부한 식물성 사료인 대두박, 면실박, 채종박, 배아박, 소맥피, 대두, 야자박 및 루핀종실을 대상으로 본 발명의 자일라나제 처리 후, 효소활성에 의해 생성된 환원당의 양을 분석하였다.

구체적으로, 식물성 사료 1 그램을 50 mM 인산나트륨(pH 6.0) 완충액 10 ml에 현탁한 후 자일라나제를 100 unit/ml이 되도록 첨가하여 37℃에서 24시간 처리했을 때, 도 5에 나타난 바와 같이 대부분의 식물성 사료에 대해 자일란의 분해에 의한 환원당의 생성에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로는 효소를 첨가하지 않은 시험군에 대해 환원당을 조사한 다음 처리군에서 그 양을 빼는 방법으로 순수 자일라나제에 의해 생성된 환원당을 측정하였으며, 비교 대조군으로는 트리코더마(Trichoderma) 유래의 자일라나제를 동일 유니트로 첨가하여 처리군과 동일한 방법에 의해 생성된 환원당의 양을 측정하였다. 그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 패니바실러스 sp. HY-8 유래의 자일라나제는 면실박, 소맥피, 대두, 대두박, 야자박 및 루핀 등의 식물성 사료성분에 대해 대조군보다 우수한 자일란의 분해효과를 나타내었으며, 배아박에 대해서는 비교 대조군과 유사한 분해효과를 보였고, 채종박의 경우 비교 대조군이 조금 더 우수한 분해효과를 보였다.

상기의 결과로 볼 때, 본 발명 균주 유래의 자일라나제는 식물성 사료의 자일란 분해를 촉진함으로써 식물성 사료를 포함하는 사료의 첨가제로 적합함을 확인하였다.

본 발명의 신규 균주인 패니바실러스 sp. HY-8(Paenibacillus sp. HY-8) 및 이로부터 분리한 자일라나제는 비교적 넓은 범위의 온도 및 pH 조건에서 우수한 자일란 분해활성을 나타내었으며 곰팡이 유래의 산성 자일라제에 비해, 중성 pH에서도 우수한 활성을 나타내었을 뿐만 아니라 기존의 사료첨가제로 많이 사용되는 트리코더마 유래의 자일라나제에 비해 대부분의 식물성 사료 원료에서 더 우수하거나 비슷한 자일란 분해 효율을 나타내는 우수한 효소로 판단되며, 사료원료의 20-40%를 차지하는 자일란의 효율적인 분해를 통한 사료 효율증대를 가능케 하여 사료첨가용 효소제로서 그 활용도가 높을 것으로 여겨진다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnoloy <120> Novel Paenibacillus pabuli genus HY-8 strain producing xylanase and its application for effective feeds <130> 6p-01-22 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 568 <212> DNA <213> 16S rDNA of Paenibacillus pabuli HY-8 <400> 1 gggtgagtaa cacgtaggca acctgccctc aagcttggga caactaccgg aaacggtagc 60 taataccgaa tagttgtttt cttctcctga agagaactgg aaagacggag caatctgtca 120 cttggggatg ggcctgcggc gcattagcta gttggtgggg taacggctca ccaaggcgac 180 gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 240 cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatgggcg aaagcctgac ggagcaatgc 300 cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gccagggaag aacgcttggg 360 agagtaactg ctctcaaggt gacggtacct ganaagaaag ccccggctaa ctacgtgcca 420 gcagccgcgg taatacgtag ggggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 480 gcaggcggtc atttaagtct ggtgtttaat cccggggctc aaccccggat cgcactggaa 540 actgggtgac ttgagtgcag aaaaagag 568 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of gene coding xylanase <400> 2 tattggcaga attggacc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of gene coding xylanase <400> 3 tggtcggtat gtgcccca 18 <210> 4 <211> 633 <212> DNA <213> ORF(open reading frame) of Paenibacillus pabuli HY-8 xylanase <400> 4 atgtttaaat ttagcaaaaa aatgttgacg gtcattcttg cggcttccat gagttttggc 60 gtgtttgcag caacctcaag tgcagcgaca gattattggc agaattggac cgatggcggc 120 ggtacggtta atgctgtgaa tggatcgggc ggaaattaca gtgtgacatg gcaaaatacg 180 gggaactttg ttgttggtaa aggctggaat gttggatctc caaaccggac aattaactat 240 aatgctgggg tttggtctcc atccggcaat ggctatttga cactctatgg gtggacgaga 300 aatgcactta ttgaatatta cgttgtagat agttggggca cataccgacc aaccggaacg 360 tttaaaggta ctgtcaacag tgatggagga acctatgaca tctatacaac gatgcggtat 420 aatgcgcctt ccattgacgg cacacaaact tttgcccagt actggagcgt aagacagtcg 480 aagagagcga ccggggttaa ctccgcaatt gcgttcagca accatgttaa cgcatgggca 540 agcaaaggaa tgaatctggg tagcagttgg tcttaccagg tgttagcgac agaaggatat 600 caaagtagtg gaagttccaa cgtaacggtg tgg 633 <210> 5 <211> 211 <212> PRT <213> Amino acid of Paenibacillus pabuli HY-8 xylanase <400> 5 Met Phe Lys Phe Ser Lys Lys Met Leu Thr Val Ile Leu Ala Ala Ser 1 5 10 15 Met Ser Phe Gly Val Phe Ala Ala Thr Ser Ser Ala Ala Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr Val Asn Ala Val Asn Gly 35 40 45 Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Thr Trp Gln Asn Thr Gly Asn Phe Val 50 55 60 Val Gly Lys Gly Trp Asn Val Gly Ser Pro Asn Arg Thr Ile Asn Tyr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Val Trp Ser Pro Ser Gly Asn Gly Tyr Leu Thr Leu Tyr 85 90 95 Gly Trp Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Tyr Tyr Val Val Asp Ser Trp 100 105 110 Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Phe Lys Gly Thr Val Asn Ser Asp 115 120 125 Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Met Arg Tyr Asn Ala Pro Ser 130 135 140 Ile Asp Gly Thr Gln Thr Phe Ala Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser 145 150 155 160 Lys Arg Ala Thr Gly Val Asn Ser Ala Ile Ala Phe Ser Asn His Val 165 170 175 Asn Ala Trp Ala Ser Lys Gly Met Asn Leu Gly Ser Ser Trp Ser Tyr 180 185 190 Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val 195 200 205 Thr Val Trp 210 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> 27F primer <400> 6 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> 1492R primer <400> 7 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (13)

1. 자일라나제를 생산하는 패니바실러스 sp.(Paenibacillus sp.) HY-8 균주(KCTC 10896BP).
2. 제 1항의 균주로부터 생산된 자일라나제.
3. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 서열번호 5로 기재되는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
4. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 45℃ 내지 60℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
5. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 pH 6.0-6.5에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
6. 제 2항에 있어서, 상기 자일라나제는 Ca, Zn, K, Mg, Na 또는 Co 첨가 시 효소활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 자일라나제.
7. 제 2항의 효소를 암호화하는 유전자.
8. 제 7항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4로 기재되는 것을 특징으로 하는 유전자.
9. 제 7항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제 9항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
11. 1) 자일란을 포함하는 배지에서 제 1항의 패니바실러스 sp. HY-8 균주 또는 제 10항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 상층액인 조효소액을 수득하는 단 계;

    2) 단계 1에서 수득된 조효소액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계; 및

    3) 단계 2에서 침전을 유도한 조효소액을 원심분리 및 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산방법.
12. 제 11항에 있어서, 단계 2의 침전제는 황산암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 자일라나제 생산방법.
13. 제 2항의 자일리나제를 포함하는 자일란 분해 증진용 사료첨가제.

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