KR20070078167A

KR20070078167A - 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법

Info

Publication number: KR20070078167A
Application number: KR1020060008149A
Authority: KR
Inventors: 김기옥; 한종헌; 김봉석; 고광효
Original assignee: 재단법인 제주하이테크산업진흥원
Priority date: 2006-01-26
Filing date: 2006-01-26
Publication date: 2007-07-31

Abstract

본 발명은 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법은 (a) 감귤의 건조 분말을 제조하는 단계, (b) 그 감귤 건조 분말을 극성용매로 추출하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 얻어진 추출물에서 불순물을 제거하는 단계를 포함하여 구성된다.

감귤, 나리루틴, 분리

Description

감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법{Method for Isolating Narirutin From Orange}

도 1은 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼이다.

도 2는 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 실시예에서 얻어진 화합물의 구조식이다.

본 발명은 감귤에서 나리루틴(Narirutine)을 분리하는 방법에 관한 것이다.

감귤은 구연산, 비타민, 카로티노이드, 플라보노이드 등의 많은 생리활성물질들을 함유하고 있어, 피부미용과 피로회복에 좋고, 칼슘의 흡수를 도와주며, 동맥경화, 고혈압 예방에 좋다고 알려져 있다.

특히 감귤의 과피는 예로부터 한방에서 진피라고 하여 약재로 사용되어 왔으며, 유행성 독감, 위장병, 부종, 어패류 중독 등에 사용되어 왔다.

감귤에 함유되어 있는 생리활성물질 중 플라보노이드는 식물계에 널리 분포되어 있는 폴리페놀계 화합물로서 클로로필과 카르티노이드 다음으로 식물에서 가 장 빈번하게 나타나는 색소이며, 비타민 P 또는 비타민 C₂(비타민 C의 상승제)라고도 한다.

플라보노이드는 여러 생리 활성을 지니고 있는데, 항산화 활성, 항균 활성, 항바이러스 활성, 항염 활성, 항암 활성 등을 지니고 있으며, 또한 혈장의 저밀도 지질의 산화를 억제하여 동맥경화를 예방하는 효과를 지니고 있기도 하다.

플라보노이드는 그 종류가 수천 가지에 이르는데, 중요한 플라보노이드로는 플라보놀(flavonol), 플라본(flavone), 플라바온(flvaone), 플라바논(flavanone), 플라바놀(flavanol), 앤소사이아니딘(anthocyanidin), 아이소플라본(isoflavone), 디하이드로플라본(dihydroflavonl), 찰콘(chalcone) 등이 있다.

나리루틴은 나리게닌, 헤스페레딘 등과 더불어 플라바논(flavanone) 화합물에 속한다.

나리게닌, 헤스페레딘 등이 감귤에 함유되어 있는 사실은 잘 알려져 있지만, 현재까지 나리루틴이 감귤에 함유된 사실은 알려진 바 없다.

본 발명자들은 감귤에서 나리루틴을 분리함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.

따라서 본 발명은 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명의 기타의 목적이나 구체적인 양태는 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 다음과 같이 감귤에서 나리루틴을 분리하였다.

먼저 감귤의 건조 분말을 에탄올로 추출하고 추출용매가 제거된 추출물을 얻은 후, 그 추출물을 증류수에 용해시켰다. 그 다음 n-헥산을 첨가하여 n-헥산층과 수층으로 분획한 후 그 수층에 에틸아세테이트를 첨가하여 에틸아세테이트층과 수층으로 분획하였다. 이 에틸아세테이트층 분획에서 유기용매를 제거하고 이를 메탄올에 용해시켜 극성 충전제로 충진된 칼럼 및 소수성 충전제로 충진된 칼럼을 차례로 통과·용출시켰다. 여기서 얻어진 분획을 적당한 유기용매에 용해시킨 후 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 전개시켜 순도 98%의 화합물을 분리한 후, NMR 분석을 통하여 그 구조식을 살펴본 결과 나리루틴(Naringenin-7-O-rutinoside; 5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-7-[3,4,5-trihydroxy-6-[(3,4,5-trihydroxy-6-methyl-oxan-2-yl)oxymethyl]oxan-2-yl]oxy-chroman-4-one)임을 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것이다.

그러므로, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법은 (a) 감귤의 건조 분말을 제조하는 단계, (b) 그 감귤 건조 분말을 극성용매로 추출하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 얻어진 추출물에서 불순물을 제거하는 단계를 포함하여 구성된다.

상기에서 그리고 청구범위를 포함하는 이하에서, 상기 "감귤"이란 그것의 종류를 불문하고 분류학상 감귤류에 속하는 과수(즉 쌍떡잎식물 운향목 운향과 감귤 나무아과에 속하는 과수)로부터 얻어진 열매로서 정의되는데, 구체적으로는 감귤속, 금감속, 탱자나무속에 속하는 각종의 과수와 이들 3개의 속에서 파생된 과수로부터 얻어진 열매의 총칭으로 정의된다.

그러므로 상기 "감귤"에는 하기 실시예에서 사용된 하귤(C. natsudaidai Hayata) 뿐만 아니라 유럽 남부 등지에서 재배되는 시트론(citron), 미국 캘리포니아 등지에서 재배되는 레몬(lemon), 열대 지방 등지에서 재배되는 문단이나 자몽 등의 문단류, 미국의 플로리다 등지에 재배되는 문단의 돌연변이종인 그레이프 프루트(grape fruit), 인도, 이탈리아 등지에서 재배되는 광귤(sour orange), 인도 등 세계 각지에서 재배되는 당귤, 중국이나 우리나라에서 재배되는 유자(柚子), 우리나라 제주도 등에서 재배되는 귤, 중국 등에서 재배되는 금감, 기타 탱귤 등이 모두 포함되는 것으로 이해된다.

그럼에도 바람직하게는 본 발명의 하기 실시예에서 하귤을 사용하였다는 점에서 상기 감귤은 바람직하게는 하귤로서 이해될 수 있다.

한편, 본 발명의 하기 실시예에서 보여지듯이, 미성숙과를 사용하였때가 성숙과를 사용하였을 때보다 나리루틴이 훨씬 더 많이 분리된다.

따라서 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법은 완숙과보다는 미성숙과를 사용하는 것이 바람직하다.

여기서 "미성숙과"란 과육과 과피가 아직 분화되지 않아 서로 결합되어 있는 상태의 과실을 말한다.

한편, 상기에서 "극성용매"란 극성을 띤 분자로 이루어진 용매를 말하는데, 예컨대 물, 증류수, 알콜(바람직하게는 탄소수가 5 이하의 저급 알콜), 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 이들의 혼합 용매를 들 수 있다.

또한 상기에서 "불순물"이란 나리루틴 이외의 극성 또는 무극성의 모든 화합물을 말한다.

바람직한 측면에 있어, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법의 불순물을 제거하는 단계는 단계 (b)에서 얻어진 추출물에 무극성용매를 첨가하여 무극성용매층의 분획를 제거하고 극성용매층의 분획을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 단계 (b)에서 얻어진 추출물은 단계 (b)의 추출용매가 제거되지 않은 상태의 액상의 추출물이거나, 단계 (b)에서 추출용매가 제거될 경우에는 고형상의 추출물이 극성용매에 용해된 형태의 추출물을 말한다. 여기서 극성용매란 앞서 정의한 바 및 예시한 바와 동일하게 이해될 수 있다.

또한 상기에서 무극성용매란 무극성분자로 이루어진 용매로서 예컨대, 탄소수 6 이상의 n-알칸, 특히 하기 실시예에서 사용된 n-헥산을 들 수 있다.

상기에서 무극성용매를 첨가하는 이유는 무극성용매를 첨가함으로써 불순물 중 무극성을 띤 불순물을 제거하기 위한 것이다.

더 바람직한 측면에 있어, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법의 불순물을 제거하는 단계는 상기 극성용매층의 분획을 얻는 단계 후에 이러한 극성용매층의 분획을 극성이 다른 극성용매를 첨가하여 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 극성용매층의 분획이 물이나 증류수를 용매로 하고 있다면 첨가되는 극성이 다른 극성용매는 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 이들의 혼합 용매가 될 것이다. 하기 실시예에서는 상기 극성용매층의 분획이 증류수를 용매로 할 때, 첨가되는 극성이 다른 극성용매는 에틸아세테이트를 사용하였다.

이러한 극성이 다른 극성용매를 첨가하는 이유는 극성을 갖는 불순물을 제거하기 위한 것이다.

또한 더 바람직한 측면에 있어, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법의 불순물을 제거하는 단계는, 상기 극성용매층의 분획을 얻는 단계 후에 또는 상기 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계 후에, 그 극성용매층의 분획을 극성충전제로 충진된 칼럼과 무극성 충전제로 충진된 칼럼을 차례로 통과·용출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기에서, 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계를 거친 후에 상기 통과·용출시키는 단계를 거칠 경우, 상기 두 개의 극성용매층 분획 중 임의의 극성용매층 분획을 사용하여 통과·용출 단계를 거쳐도 무방하지만, 다만 나리루틴의 극성을 고려하여 나리루틴의 극성과 유사한 극성을 갖는 극성용매층 분획을 사용하는 것이 바람직하다. 그것은 극성이 유사하여야 그 극성용매층 분획에 포함된 나리루틴의 함량이 더 높을 것이기 때문이다. 예컨대, 두 개의 극성용매층 분획이 각각 수층 분획 또는 에탄올층 분획이라면, 에탄올층 분획을 사용하여 상기 통과·용출 단계 를 수행하는 것이 바람직하고, 또 두 개의 극성용매층 분획이 각각 에탄올층 분획과 에틸아세테이트층 분획이라면 에틸아세테이트 분획을 사용하여 상기 통과·용출 단계를 수행하는 것이 바람직하다.

한편, 극성용매층 분획을 사용하여 상기 통과·용출 단계를 수행할 경우, 극성용매층 분획을 그대로 사용하여도 무방하지만 그 극성용매를 제거하고 얻어지는 고형상의 추출물을 다른 적당한 극성용매에 용해시켜 상기 통과·용출 단계를 수행할 수도 있다. 여기서 적당한 극성용매란 물, 증류수, 탄소수 5이하의 알콜 등이 될 것이다.

또한 극성용매층 분획을 사용하여 상기 통과·용출 단계를 수행할 경우, 극성충전제나 무극성충전제는 당업계에 공지된 임의의 것을 사용할 수 있으며, 용출용액 또한 그 사용되는 극성충전제나 무극성충전제에 따라 그리고 나리루틴의 극성을 고려하여 당업계에 공지된 임의의 용출용액을 사용할 수 있다.

또한 더 바람직한 측면에 있어, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법의 불순물을 제거하는 단계는, 상기 극성용매층의 분획을 얻는 단계 후나 상기 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계 후에, 또는 상기 통과·용출 단계 후에, 그 극성용매층 분획 또는 용출액을 액체크로마토그래피를 통과시키는 단계를 1회 이상 수행할 수 있다.

여기서 바람직하게는 상기 액체크로마토그래피를 통과시키는 단계는 Prep-LC와 HPLC를 순차적으로 통과시켜 수행하는 것이 바람직하다. 그것은 최종적으로 얻어지는 나리루틴의 순도를 최대한 높이기 위해서이다.

가장 바람직한 측면에 있어서, 본 발명에 따른 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법은 하기 실시예의 공정들을 모두 포함하여 수행하는 경우이다.

구체적으로 (i) 감귤 건조 분말을 에탄올을 사용하여 추출하고 추출잔사 및 추출용매를 제거하여 고형상의 추출물을 얻는 단계, (ii) 고형상의 추출물을 증류수에 용해시키는 단계, (iii) 증류수에 용해된 추출물에 n-헥산을 첨가하여 n-헥산층 분획과 수층 분획을 얻는 단계, (iv) 수층 분획에 에틸아세테이트를 첨가하여 수층과 에틸아세테이트층 분획을 얻는 단계, (v) 에틸아세테이트층 분획에서 에틸아세테이트를 제거하고 다시 메탄올에 용해시켜 극성 실리카겔로 충진된 칼럼을 통과시켜 클로로포름과 메탄올 혼합 용액으로 용출시키는 단계, (vi) 그 용출액을 소수성 옥타데실실란이 충진된 칼럼을 통과시켜 메탄올로 용출시키는 단계, (vii) 그 용출액을 Prep-LC를 통과시켜 단계 및 (viii) 단계 (vii)에서 얻어진 화합물을 메탄올에 용해시킨 후 HPLC를 통과시키는 단계를 포함할 경우이다.

특히, 상기 단계들은 모두 하기 실시예에 개시된 구체적인 조건 하에서 수행되는 것이 바람직할 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 > 감귤에서 나리루틴의 분리 및 동정

< 실시예 1> 감귤 미성숙과로부터 순수화합물의 분리

<1-1> 건조 분말의 제조

감귤 미성숙과는 제주도 서귀포시 일대에 재배되고 있는 무농약 하귤로 7월 중순에 채취한 것을 사용하였다. 먼저 개끗하게 수세하고 습식분쇄기로 파쇄하여 동결건조한 후 분말화시켰다.

<1-2> 감귤 미성숙과의 에탄올 추출

상기 감귤 미성숙과 건조분말 500g을 10L 부피의 원형 바닥 플라스크에 넣고 5L의 70% 에탄올을 가하여 상온에서(25±5℃)에서 교반기를 이용하여 48시간 정도(2일) 환류추출의 과정을 2회 내지 3회 반복 실시하여 약 10L의 추출액을 수득한 후 여과지(0.25mm사이즈)를 이용하여 추출잔사를 제거하였다. 여과액을 회전감압농축기를 사용하여 에탄올을 완전히 제거한 후 물이 조금 남아 있는 상태에서 -80℃상의 초저온 냉동고에 하루 정도 냉동시킨 후 동결건조하여 약 50g의 추출물을 얻었다.

<1-3> 감귤 미성숙과의 유기용매 분배분획

상기 <1-2>에서 얻은 추출물을 500mL의 증류수에 용해시킨 후 2L 부피의 분액깔대기에 1L의 n-헥산을 혼합하여 헥산층과 수층으로 2회 분획하였다. 상기 수층 에 1L의 에틸아세테이트를 첨가하고 에틸아세테이트층과 수층으로 2회 분하였다.

상기에서 얻은 에틸아세테이트층 분획을 감압건조하여 에틸아세테이트를 제거한 뒤 동결건조하여 에틸아세테이트 분획 15.6g을 얻었다.

<1-4> 컬럼크로마토그래피 정제

상기 <1-3>의 에틸아세테이트 분획을 10mL의 메탄올에 용해시켜 극성 실리카켈(Silica gel 60)로 충진된 첫 번째 컬럼 (4×25cm) 상단 부위에 흡착시킨 후 클로로포름과 메탄올을 3:1 비율로 혼합한 용액으로 용출시킨 활성분획 4.1g을 소수성 옥타데실실란(ODS)이 충진된 두 번째 컬럼 (2×25cm)에 흡착시킨 후 40%메탄올을 이용하여 용출시켜 활성분획 492mg을 수득하였다.

<1-5> Prep-LC를 이용한 분리

상기 <1-4>에서 얻어진 492mg을 10mL의 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.45μm 시료용 필터에 통과시킨 것을 안정화된 고속액체크로마토그라피를 이용하여 분리하고자 하였다. 고속액체크로마토그라피는 미국 워터스사 (Waters Co) 썬파이어 컬럼 (SunfirePrep, 5μm, 19×150mm)을 장착한 워터스사 (Waters Co) 모델 델타프렙 (DeltaPrep)을 사용하였고, 아세토니트릴과 증류수를 10대 90의 비율로 혼합, 탈기한 이동상 용매를 10mL/분의 유속으로 흐르게 하여 분리하였다. 워터스 듀얼 업써번스(Dual λ Absorbance) 검출기(Detector)로 물질의 자외선흡광패턴과 파장(254nm)의 흡수도를 이용하여 화합물들을 분리한결과 10분 때의 화합물 312mg 수득 할 수 있었다.

<1-6> HPLC 를 이용한 분리

상기 <1-5>에서 얻어진 312mg을 4mL의 HPLC용 메탄올에 용해한 후 0.2μm 시료용 필터에 통과시킨 것을 안정화된 고속액체크로마토그라피를 이용하여 분리하고자 하였다. 고속액체크로마토그라피는 미국 워터스사 (Waters Co) 에틀란티스 컬럼 (Atlantis, 5μm, 4.6×250mm)을 장착한 워터스사 (Waters Co) 모델 2695 얼라이언스(allience)를 사용하였고, 아세토니드릴과 증류수를 20대 80의 비율로 혼합, 탈기한 이동상 용매 1mL/분의 유속으로 흐르게 하여 분석하였다. 워터스 2996 포토디오드어레이 (Photodidde array, PDA) 검출기(Detecter)로 물질의 자외선흡광패턴을 봤다. 최대흡수 파장은 283nm이고 머무름시간은 12분때에 순수화합물을 수득하여 80mg(순도 98%; Waters사의 Photodioder array detector(모델번호: 2695 allience) 사용)을 얻었다.

< 실시예 2> 감귤 성숙과에서 순수화합물의 분리

상기 <실시예 1>과 동일한 조건과 용매를 사용하여 동일한 공정으로 11월에 채취한 하귤로부터 나리루틴을 분리하였다. 최종적으로 얻어진 순수화합물의 양은 6.43mg(순도 98%)이었다.

< 실시예 3> 화합물의 구조동정

상기 <실시예 1 및 2>에서 분리된 각각의 화합물 완전 건조하여 CD₃OD(1mL)에 용해한 후 5mm NMR 튜브에 주입하고 지올 모델 기종 (JMX-700)으로 FT-NMR을 이용하여 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR을 분석하였다.

그 결과는 각각 <도 1> 및 <도 2>에 나타나 있으며, 그 화학 구조식은 <도 3>에 나타나 있다.

이러한 결과는 상기 <실시예 1 및 2>에서 분리된 화합물이 나리루틴임을 말해준다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법이 제공된다.

특히, 미성숙과에서 분리하는 경우가 성숙과에서 분리하는 경우보다 그 수율이 더 높음을 알 수 있다.

Claims

하기 (a) 내지 (c) 단계를 포함하여 구성되는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.

(a) 감귤의 건조 분말을 제조하는 단계;

(b) 그 감귤 건조 분말을 극성용매로 추출하는 단계; 및

(c) 단계 (b)에서 얻어진 추출물에서 불순물을 제거하는 단계
제1항에 있어서,

상기 감귤은 하귤인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,

상기 감귤은 미성숙과인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 극성용매란 물, 증류수, 탄소수가 5 이하의 저급 알콜, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합 용매으로 구성된 군에서 선택된 용매인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 단계 (c)의 불순물을 제거하는 단계는 상기 단계 (b)에서 얻어진 추출물에 무극성용매를 첨가하여 무극성용매층의 분획를 제거하고 극성용매층의 분획을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 단계 (b)에서 얻어진 추출물은 상기 단계 (b)의 추출용매가 제거되지 않은 상태의 액상의 추출물 또는 상기 단계 (b)에서 추출용매가 제거되어 얻어지는 고형상의 추출물이 극성용매에 용해된 형태의 추출물인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 무극성용매란 탄소수 6 이상의 n-알칸인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 단계 (c)의 불순물을 제거하는 단계는 상기 극성용매층의 분획을 얻는 단계 후에 이러한 극성용매층의 분획에 극성이 다른 극성용매를 첨가하여 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 단계 (c)의 불순물을 제거하는 단계는 상기 극성용매층의 분획을 얻는 단계 후에 그 극성용매층의 분획을 극성충전제로 충진된 칼럼과 무극성 충전제로 충진된 칼럼을 차례로 통과·용출시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징을 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 극성용매층의 분획이 증류수를 용매로 하고 있고, 상기 첨가되는 극성이 다른 극성용매는 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군에서 선택된 용매인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 극성용매층 분획이 증류수를 용매로 하고, 상기 첨가되는 극성이 다른 극성용매는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제8항에 있어서,

상기 단계 (c)의 불순물을 제거하는 단계는, 상기 두 개의 극성용매층 분획을 얻는 단계 후에, 그 중 하나의 극성용매층의 분획을 극성충전제로 충진된 칼럼과 무극성 충전제로 충진된 칼럼을 차례로 통과·용출시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징을 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제12항에 있어서,

상기 두 개의 극성용매층 분획 중 통과·용출시킬 분획은 나리루틴의 극성과 유사한 극성을 갖는 극성용매층 분획인 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
제5항, 제8항, 제9항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서

상기 단계 (c)의 불순물을 제거하는 단계는 상기 극성용매층 분획을 얻는 단계 후에 또는 상기 통과·용출 단계 후에, 그 극성용매층 분획 또는 용출액을 액체크로마토그래피를 통과시키는 단계를 1회 이상 수행하는 것을 특징으로 하는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.
하기 (i) 내지 (vii) 단계를 포함하여 구성되는 감귤에서 나리루틴을 분리하는 방법.

(i) 감귤 건조 분말을 에탄올을 사용하여 추출하고 추출잔사 및 추출용매를 제거하여 고형상의 추출물을 얻는 단계,

(ii) 고형상의 추출물을 증류수에 용해시키는 단계,

(iii) 증류수에 용해된 추출물에 n-헥산을 첨가하여 n-헥산층 분획과 수층 분획을 얻는 단계,

(iv) 수층 분획에 에틸아세테이트를 첨가하여 수층과 에틸아세테이트층 분획을 얻는 단계,

(v) 에틸아세테이트층 분획에서 에틸아세테이트를 제거하고 다시 메탄올에 용해시켜 극성 실리카겔로 충진된 칼럼을 통과시켜 클로로포름과 메탄올 혼합 용액으로 용출시키는 단계,

(vi) 그 용출액을 소수성 옥타데실실란이 충진된 칼럼을 통과시켜 메탄올로 용출시키는 단계,

(vii) 그 용출액을 Prep-LC를 통과시켜 단계 및 (viii) 단계 (vii)에서 얻어진 화합물을 메탄올에 용해시킨 후 HPLC를 통과시키는 단계