KR20070072924A - Chemically-modified human growth hormone conjugates - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 hGH와 20K PEG-ALD의 반응 생성물의 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석 및 음이온 교환 정제된 20K PEG-ALD hGH의 사진이다. 레인 1. MW 단백질 표준; 레인 2. 환원된 hGH-10 ug; 레인 3. 환산된 20 K 직쇄 PEG-ALD hGH 반응 mix-10 ug; 레인 4. 환원된 음이온 교환 정제된 20 K 직쇄 PEG-ALD hGH-10 ug 레인 5. 블랭크; 레인 6. 비-환원된 hGH-10 ug; 레인 7. 비-환원된 20 K 직쇄 PEG-ALD hGH 반응 mix-10 ug; 레인 8. 비-환원된 음이온 교환 정제된 20 K 직쇄 PEG-ALD hGH-10 ug; 레인 9. 블랭크; 레인 10. MW 단백질 표준. 1 is a photograph of reduced and non-reducing SDS-PAGE analysis and anion exchange purified 20K PEG-ALD hGH of a reaction product of hGH with 20K PEG-ALD.
도 2는 다양한 음이온 교환 정제된 PEG가 부착된 hGH 분자의 비-환원 SDS-PAGE 분석의 사진이다. 레인 1. MM 단백질 표준; 레인 2. hGH-10 ug; 레인 2. 4-6 x 5K PEG-SPA hGH-10 ug; 레인 3. 20 K 직쇄 PEG-ALD hGH-10 ug; 레인 4.20 K 분지쇄 PEG-ALD hGH-10 ug 레인 5.40 K 분지쇄 PEG hGH-10 ug. FIG. 2 is a photograph of non-reducing SDS-PAGE analysis of various anion exchange purified PEG attached hGH molecules.
도 3은 hGH, 40K Br PEG-ALD hGH 및 40K Br PEG-NHS hGH의 트립신 소화물에 대한 RP-HPLC 용출 프로파일의 사진이다. (40K Br ALD hGH에서 보인 바와 같이) 주로 hGH의 N-말단에 커플링된 PEG는 새로운 PEG가 부착된 T1 피크가 생성되면서 N-말단(T1) 단편 피크를 감소시킨다.3 is a photograph of the RP-HPLC elution profile for trypsin digests of hGH, 40K Br PEG-ALD hGH and 40K Br PEG-NHS hGH. PEG coupled primarily to the N-terminus of hGH (as shown in 40K Br ALD hGH) reduces the N-terminus (T1) fragment peak with the generation of a new PEG attached T1 peak.
도 4는 11일 동안, 뇌하수체가 제거된(hypophysectomized) 래트에서의 체중 증가를 나타냄으로써, 단일 PEG가 부착된 hGH를 매 6일 마다 피하(SC) 주사(1.8 mg/Kg)한 경우에 대한 PEG가 부착되지 않은 hGH를 매일 투여한 (0.3 mg/Kg/일) 경우의 생체내 생리활성을 비교한 것이다.FIG. 4 shows weight gain in hypophystomized rats for 11 days, with PEG for subcutaneous (SC) injection (1.8 mg / Kg) every 6 days with hGH attached to a single PEG In vivo bioactivity was compared when daily hGH without administration (0.3 mg / Kg / day) was applied.
도 5는 11일 동안, 뇌하수체가 제거된 래트에서의 체중 증가를 나타냄으로써, 각각 4-6 x 5K PEG-SPA-hGH, 단일 PEG가 부착된 20K 분지쇄 PEG-ALD hGH, 및 단일 PEG가 부착된 40K 분지쇄 PEG-ALD hGH를 매 6일 마다 피하(SC) 주사(1.8 mg/Kg)한 경우에 대한 PEG가 부착되지 않은 hGH를 매일 SC 투여한 (0.3 mg/Kg/일) 경우의 생체내 생리활성을 비교한 것이다.FIG. 5 shows weight gain in rats without pituitary gland for 11 days, with 4-6 × 5K PEG-SPA-hGH, 20K branched PEG-ALD hGH with single PEG attached, and single PEG attached, respectively. For subcutaneous (SC) injections (1.8 mg / Kg) every 40 days of a 40K branched PEG-ALD hGH dosed daily (0.3 mg / Kg / day) with daily SC administration without PEG-attached hGH It is a comparison of my biological activity.
도 6은 11일 동안, 뇌하수체가 제거된 래트에서의 체중 증가를 나타냄으로써, 각각 4-6 x 5K PEG-CMHBA-hGH, 단일 PEG가 부착된 20K 직쇄 ALD, 단일 PEG가 부착된 30K 직쇄 ALD, 단일 PEG가 부착된 20K 분지쇄 PEG-ALD hGH, 및 단일 PEG가 부착된 40K 분지쇄 PEG-ALD hGH를 매 6일 마다 피하(SC) 주사(1.8 mg/Kg)한 경우에 대한 PEG가 부착되지 않은 hGH를 매일 SC 투여한 (0.3 mg/Kg/일) 경우의 생체내 생리활성을 비교한 것이다.FIG. 6 shows weight gain in rats without pituitary gland for 11 days, with 4-6 × 5K PEG-CMHBA-hGH, 20K straight ALD with single PEG attached, 30K straight ALD with single PEG attached, No PEG attached for 20K branched PEG-ALD hGH with single PEG attached and 40K branched PEG-ALD hGH with single PEG attached subcutaneously (SC) injection (1.8 mg / Kg) every 6 days In vivo physiological activity of non-hGH administered SC daily (0.3 mg / Kg / day).
도 7은 9일 동안의, 뇌하수체가 제거된 래트의 혈장 IGF-1 수준의 증가를 나타냄으로써, PEG가 부착되지 않은 hGH, 단일 PEG가 부착된 5K 직쇄 PEG-ALD hGH, 단일 PEG가 부착된 20K 직쇄 PEG-ALD hGH, 단일 PEG가 부착된 20K 분지쇄 PEG-ALD hGH, 단일 PEG가 부착된 20K 직쇄 PEG-히드라지드 hGH, 단일 PEG가 부착된 30K 직쇄 PEG-ALD hGH, 단일 PEG가 부착된 40K 분지쇄 PEG-ALD hGH, 4-6 x 5K PEG SPA hGH, 4-6 x 5K PEG-CMHBA를 1.8 mg/Kg SC 단일 투여한 경우의 생체내 생리활성을 비교한 것이다.FIG. 7 shows an increase in plasma IGF-1 levels in rats without pituitary gland over 9 days, with hGH without PEG attached, 5K straight PEG-ALD hGH with single PEG attached, 20K with single PEG attached. Straight PEG-ALD hGH, 20K branched PEG-ALD hGH with single PEG, 20K straight PEG-hydrazide hGH with single PEG, 30K straight PEG-ALD hGH with single PEG, 40K with single PEG In vivo physiological activity of 1.8 mg / Kg SC single dose of branched PEG-ALD hGH, 4-6 × 5K PEG SPA hGH, 4-6 × 5K PEG-CMHBA was compared.
본원은 미국 법 §119, 제35장에 의거하여, 2001년 11월 20일 출원된 미국 가출원 제60/331,907호에 대해 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본원에 기재된 것과 같이 그 전체가 인용됨으로써 삽입된다.This application claims priority to US Provisional Application No. 60 / 331,907, filed November 20, 2001, pursuant to United States Code §119, Chapter 35, which is incorporated by reference in its entirety as described herein. do.
본 발명은 인간 성장 호르몬(hGH)의 화학적 및(또는) 생리학적 성질을 변화시킬 수 있는, hGH 및 그 아고니스트 변이체의 화학적 개질에 관한 것이다. PEG 수식된 hGH는 혈장 체류 기간의 증가, 제거율의 감소, 안정성의 증가, 항원성의 감소, 또는 이들이 조합된 성질을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 hGH의 개질을 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개질된 hGH를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 추가적 태양은 성장 및 발달 장애의 치료를 위한 개질된 hGH의 용도이다.The present invention relates to chemical modification of hGH and its agonist variants, which can alter the chemical and / or physiological properties of human growth hormone (hGH). PEG-modified hGH can have an increase in the duration of plasma retention, a decrease in clearance, an increase in stability, a decrease in antigenicity, or a combination thereof. The invention also relates to a method for the modification of hGH. The invention also relates to pharmaceutical compositions comprising modified hGH. A further aspect is the use of modified hGH for the treatment of growth and developmental disorders.
발명의 배경Background of the Invention
인간 성장 호르몬(hGH)는 두 개의 디설파이드 브릿지에 의해 가교된 191 개의 아미노산의 단일 사슬을 포함하는 단백질이고, 단량체 형태는 22 kDa의 분자량을 갖는다. 인간 GH는 뇌하수체에서 분비되고 재조합 유전자 조작에 의해 생성될 수도 있다. hGH는 성장할 수 있는 모든 신체 조직에서 성장을 일으킬 것이다. 재조합 hGH는 수 년 전부터 시판되어 왔다. 두 가지 유형의 치료적으로 유용한 재조 합 hGH 제제가 현재 시판된다: 정품인, 예를 들면 게노트로핀(Genotropin)TM, 또는 뉴트로핀(Nutropin)TM 및 N-말단에 추가의 메티오닌 잔기를 갖는 유사체인, 예를 들면 소마토놈(Somatonorm)TM. hGH는 성장 호르몬 결핍증(GHD) 또는 터너 증후군(Turner's syndrome)으로도 불리는 뇌하수체 저하 왜소증 환자에게서 직선 성장을 자극하는데 사용되지만, 임신기간에 비한 저체중아(SGA)로 태어난 소아의 성장 부진의 장기 치료, 프라더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome; PWS), 만성 신기능부전(CRI), 에이즈 소모성 증후군, 및 노화 환자의 치료를 포함하는 다른 적응증에도 제안되었다.Human growth hormone (hGH) is a protein comprising a single chain of 191 amino acids bridged by two disulfide bridges, the monomeric form having a molecular weight of 22 kDa. Human GH is secreted from the pituitary gland and may be produced by recombinant genetic engineering. hGH will cause growth in all body tissues that can grow. Recombinant hGH has been on the market for many years. Two types of therapeutically useful recombinant hGH formulations are currently commercially available: Genuine, such as Genotropin ™ , or Neutropin ™ and at the N-terminus with additional methionine residues. Analogues such as Somatonorm TM . hGH is used to stimulate linear growth in patients with pituitary hypoplasia dwarfism, also called growth hormone deficiency (GHD) or Turner's syndrome, but long-term treatment of poor growth in children born with low birth weight (SGA) Other indications have also been proposed, including the treatment of Praer-Willi syndrome (PWS), chronic renal failure (CRI), AIDS wasting syndrome, and aging patients.
성장 호르몬(GH)의 주요한 생물학적 효과는 어린 포유류의 성장 및 나이 든 포유류에서 조직의 유지를 촉진시키는 것이다. 영향을 받는 장기 시스템은 골격, 연결 조직, 근육 및 간, 소장 및 신장과 같은 내장을 포함한다. 성장 호르몬은 표적 세포막 상의 특이적 수용체와의 상호작용을 통해 효과를 발휘한다. hGH는 태반 락토겐, 프로락틴 및 기타 유전적 및 종 변이체 또는 성장 호르몬을 포함하는 상동성 호르몬의 패밀리의 일원이다(Nicoll, C. S., et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169). hGH는 넓은 종 특이성을 나타내고 클로닝된 소마토겐(Leung, D. W., et al. [1987] Nature 330;537) 또는 프로락틴 수용체(Boutin, J. M., et al. [1988] Cell; 53: 69)에 결합한다는 점에 있어서 이들 중에서 특징을 갖는다. hGH에 대해 클로닝된 유전자는 에스케리치아 콜라이에서 분비된 형태로 발현되었고(Chang, C. N., et al. [1987] Gene 55:189), 그의 DNA 및 아미노산 서열이 보고되었다 (Goeddel, et al. [1979] Nature 281: 544; Gray, et al. [1985] Gene 39:247).The main biological effect of growth hormone (GH) is to promote the growth of young mammals and the maintenance of tissues in older mammals. Affected organ systems include skeletal, connective tissue, muscle and intestines such as liver, small intestine and kidney. Growth hormones exert their effects through interactions with specific receptors on target cell membranes. hGH is a member of a family of homologous hormones including placental lactogen, prolactin and other genetic and species variants or growth hormones (Nicoll, C. S., et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169). hGH exhibits broad species specificity and binds to cloned somatogens (Leung, DW, et al. [1987] Nature 330; 537) or prolactin receptors (Boutin, JM, et al. [1988] Cell; 53: 69). It has a characteristic in these in point. Genes cloned for hGH were expressed in secreted form from Escherichia coli (Chang, CN, et al. [1987] Gene 55: 189), and their DNA and amino acid sequences were reported (Goeddel, et al. [ 1979 Nature 281: 544; Gray, et al. [1985] Gene 39: 247).
인간 성장 호르몬(hGH)는 정상적 인간 성장 및 발달의 조절의 많은 부분에 관여한다. 이 뇌하수체 호르몬은 직선 성장(소마토제네시스), 유즙분비, 대식세포의 활성화, 인슐린-유사 및 당뇨병 유발 효과를 포함하는 다양한 생물학적 효과를 나타낸다(Chawla, R. K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M. O., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:745). 소아에 있어서 성장 호르몬 결핍은 왜소증을 유발하고, 이는 hGH의 외부 투여에 의해 10년 이상 동안 성공적으로 치료되었다.Human growth hormone (hGH) is involved in much of the regulation of normal human growth and development. These pituitary hormones exhibit a variety of biological effects, including linear growth (somatogenesis), milk secretion, macrophage activation, insulin-like and diabetic effects (Chawla, RK (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, CK et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, MO, et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 745). Growth hormone deficiency in children causes dwarfism, which has been successfully treated for more than 10 years by external administration of hGH.
인간 성장 호르몬(hGH)는 191 개의 아미노산으로 이루어진 단일 사슬 폴리펩티드이다(분자량 21,500). 디설파이드 결합은 53번 및 165번 위치 및 182번 및 189번 위치를 연결한다[Niall, Nature, New Biology, 230:90 (1971)]. hGH는 특히 질소, 인, 칼륨 및 칼슘의 저류에 기인하는 강력한 동화제이다. 뇌하수체 절제된 래트를 GH로 치료하면 래트의 성장율의 적어도 일부분을 회복시킬 수 있다[Moore et al., Endocrinology 122:2920-2926 (1988)]. 뇌하수체 저하(GH-결핍) 환자에 있어서 가장 두드러진 효과 중에는 키의 성장을 일으키는 골-성장-판-연골의 직선 성장의 가속화가 있다(Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964)].Human growth hormone (hGH) is a single chain polypeptide consisting of 191 amino acids (molecular weight 21,500). Disulfide bonds link positions 53 and 165 and positions 182 and 189 (Niall, Nature, New Biology, 230: 90 (1971)). hGH is a powerful assimilation agent, in particular due to the retention of nitrogen, phosphorus, potassium and calcium. Treatment of pituitary excised rats with GH can restore at least a portion of the rat's growth rate (Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1988)). Among the most pronounced effects in patients with pituitary hypoplasia (GH-deficiency) are the acceleration of the linear growth of bone-growth-plate-cartilage that causes height growth (Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
hGH는 다양한 동물 모델에서 직선 골 성장, 유즙분비, 대식세포의 활성화, 인슐린-유사 및 당뇨병성 효과 등을 비롯한 다양한 생리학적 및 대사적 효과를 일으킨다(R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); 0. G. P. Isaksson et al. , Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C. K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. 0. Thomer and M. L. Vance, J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); J. P. Hughes and H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). 특히 폐경기 후의 여성에게서 GH 분비가 연령에 따라 감소하는 것으로 보고되었다[Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6-137-142 (1987)]. 또한, 문헌[Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981)] 및 [Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987)]을 참조하라. 더우기, 제지방 체중의 감소, 지방 조직 크기의 팽창, 및 피부의 얇아짐을 포함하는 노화의 징후 중 일부가 1 주에 3 번 GH 치료에 의해 감소될 수 있다는 보고가 존재한다. 예를 들면 문헌[Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990)] 및 동일한 저널에 반스 박사(Dr. Vance)가 저술한 논문(pp. 52-54)을 참조하라. 이 생물학적 효과는 hGH 및 특이적 세포 수용체 사이의 상호작용으로부터 유래한다. 두 개의 상이한 인간 수용체가 클로닝되었으며, 이는 hGH 간 수용체(D. W. Leung et al., Nature 330: 537 (1987)) 및 인간 프로락틴 수용체(J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinology. 3: 1455 (1989))이다. 그러나, 인간 태반 락토겐 수용체를 비롯한 다른 수용체도 존재하는 것 같다(M. Freemark, M. Comer, G. Komer, and S. Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). 이 상동성 수용체는 글리코실화 세포외 호르몬 결합 도메인, 단일 막횡단 도메인, 및 서열 및 크기에서 상당히 상이한 세포질 도메인을 함유한다. 하나 이상의 수용체가 hGH에 대한 생리적 반응에서 결정적 역할을 하는 것으로 추정된다.hGH produces a variety of physiological and metabolic effects, including linear bone growth, milk secretion, macrophage activation, insulin-like and diabetic effects, in various animal models (RK Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); 0. GP Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); CK Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. 0. Thomer and ML Vance , J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); JP Hughes and HG Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). It has been reported that GH secretion decreases with age, especially in postmenopausal women [Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6-137-142 (1987)]. See also, Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) and Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Moreover, there are reports that some of the signs of aging, including loss of lean body weight, dilation of adipose tissue size, and thinning of the skin, can be reduced by GH treatment three times a week. See, eg, Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) and in a paper by Dr. Vance (pp. 52-54) in the same journal. This biological effect results from the interaction between hGH and specific cellular receptors. Two different human receptors have been cloned, which are the hGH liver receptor (DW Leung et al., Nature 330: 537 (1987)) and the human prolactin receptor (JM Boutin et al., Mol. Endocrinology. 3: 1455 (1989)). to be. However, other receptors, including human placental lactogen receptors, are also likely to exist (M. Freemark, M. Comer, G. Komer, and S. Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). This homologous receptor contains glycosylated extracellular hormone binding domains, single transmembrane domains, and cytoplasmic domains that differ significantly in sequence and size. It is assumed that one or more receptors play a decisive role in the physiological response to hGH.
일반적으로 체내에 투여된 생리적 활성 단백질은 체내에서의 높은 제거율로 인하여 짧은 기간 동안만 약물학적 활성을 나타낼 수 있는 것으로 관찰된다. 또한, 이 단백질의 상대적 소수성은 이들의 안정성 및(또는) 용해도에 제한을 가할 수 있다.In general, it is observed that physiologically active proteins administered in the body may exhibit pharmacological activity only for a short period of time due to the high removal rate in the body. In addition, the relative hydrophobicity of these proteins can place limitations on their stability and / or solubility.
치료적 단백질의 제거율을 감소시키거나, 안정성을 개선시키거나 항원성을 제거할 목적으로, 수용성 중합체로 단백질을 화학적으로 개질하는 몇몇 방법이 제안되었다. 이 유형의 화학적 개질은 단백분해 효소가 단백질 골격 자체에 물리적으로 접촉하는 것을 효과적으로 차단하여 분해를 방지할 수 있다. 특정 수용성 중합체의 화학적 부착은 분자의 유체역학 부피의 증가로 인해 신 제거율을 효과적으로 감소시킬 수 있다. 추가적 이점은 특정한 경우, 치료적 단백질의 안정성 및 순환 시간을 증가시키고, 용해도를 증가시키고, 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 폴리(알킬렌 옥시드), 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)는 치료적 단백질 생성물의 제조에 사용된 이러한 화학적 모이티이다("PEG화하다(pegylate)"라는 동사는 하나 이상의 PEG 분자를 부착시키는 것을 의미한다). 폴리(에틸렌 글리콜)의 부착은 단백분해에 대해 보호하는 것으로 나타났고[Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991)], 특정 폴리(에틸렌 글리콜) 모이티의 부착 방법은 입수 가능하다. 발명의 명칭이 "비-면역원성 폴리펩티드"인 1979년 12월 18일 특허된 데이비스(Davis) 등의 미국 특허 제4,179,337호; 및 발명의 명칭이 "폴리에틸렌 글리콜을 사용한 효소의 개질 및 그에 의해 생성된 생성물"인, 1977년 1월 11일에 특허된 로이어(Royer)의 미국 특허 제4,002,531호를 참조. 리뷰를 위해 서는 문헌[Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)]를 참조.Several methods have been proposed for chemically modifying proteins with water soluble polymers for the purpose of reducing the removal rate of the therapeutic protein, improving stability or removing antigenicity. This type of chemical modification can effectively prevent proteolytic enzymes from physically contacting the protein backbone itself, preventing degradation. Chemical attachment of certain water soluble polymers can effectively reduce the rejection rate due to an increase in the hydrodynamic volume of the molecule. Additional advantages include, in certain cases, increasing the stability and circulation time of the therapeutic protein, increasing solubility, and reducing immunogenicity. Poly (alkylene oxides), in particular poly (ethylene glycol) (PEG), are such chemical moieties used in the preparation of therapeutic protein products (the verb “pegylate” attaches one or more PEG molecules). Means to make). Attachment of poly (ethylene glycol) has been shown to protect against proteolysis [Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991)], and methods of attachment of certain poly (ethylene glycol) moieties It is available. US Patent No. 4,179,337 to Davis et al., Issued December 18, 1979, entitled “Non-Immunogenic Polypeptides”; And US Pat. No. 4,002,531 to Royer, filed Jan. 11, 1977, entitled “Modification of Enzymes with Polyethylene Glycol and Products Produced thereby”. For a review see Abuchowski et al., In Enzymes as Drugs . See JS Holcerberg and J. Roberts, eds. Pp. 367-383 (1981).
에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(-1,3-디옥솔란), 폴리(-1,3,6-트리옥산), 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리-아미노산(동종중합체 또는 랜덤 공중합체)와 같은 다른 수용성 중합체가 사용되었다.Copolymers of ethylene glycol / propylene glycol, carboxymethylcellulose, dextran, poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), poly (-1,3-dioxolane), poly (-1,3,6- Other water soluble polymers such as trioxane), ethylene / maleic anhydride copolymers, poly-amino acids (homopolymers or random copolymers) have been used.
PEG가 부착된 치료적 단백질의 다수의 예가 기재되었다. 아데노신 데아미나제의 PEG가 부착된 제제인 아다겐(ADAGEN)(등록상표)은 중증 복합 면역결핍 질병을 치료용으로 허가되었다. PEG가 부착된 L-아스파라기나제인 온카스파르(ONCASPAR)(등록상표)는 과민성 ALL 환자의 치료용으로 허가되었다. PEG가 부착된 과산화물 디스뮤타제는 두부 상처 치료용으로 임상 실험 중에 있다. PEG가 부착된 α-인터페론(미국 특허 제5,738,846호, 제5,382,657호)은 간염 치료용으로 허가되었고; PEG가 부착된 글루코세레브로시다제 및 PEG가 부착된 헤모글로빈은 전임상 시험 중에 있는 것으로 보고되었다. 다른 예는 IL-6에 첨가된 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 개시하는, 발명의 명칭이 "개질된 hIL-6"인 EF 0 442 724호의 PEG가 부착된 IL-6이다.Many examples of therapeutic proteins with PEG attached have been described. Adagen® (ADAGEN®), a PEG attached agent of adenosine deaminase, has been approved for the treatment of severe combined immunodeficiency diseases. ONCASPAR®, a PEG-attached L-asparaginase, is approved for the treatment of irritable ALL patients. PEG-attached peroxide dismutase is in clinical trials for the treatment of head wounds. Α-interferon with PEG (US Pat. Nos. 5,738,846, 5,382,657) is licensed for the treatment of hepatitis; Glucocerebrosidase with PEG and hemoglobin with PEG have been reported to be in preclinical testing. Another example is IL-6 with PEG attached to
화학적으로 개질된 다른 특이적 치료 단백질은 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)이다. G-CSF는 호중성 과립구의 혈류로의 방출 및 급속한 증식을 유도함으로써 감염에 대항하는 치료적 효과를 제공한다. 발명의 명칭이 "화학적으로 개질된 과립구 콜로니 자극 인자"인, 1990년 12월 12일에 공고된 유럽 특허 공보 EP 0 401 384호에서는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자가 부착된 G-CSF를 제조하는 방법 및 재료에 대해 기재한다. 개질된 G-CSF 및 그의 유사체는 발명의 명칭이 "수용성 중합체에 공유 콘쥬게이트된 폴리펩티드를 포함하는 연속 방출 제약 조성물"인, 1992년 3월 4일에 공고된 EO 0 473 268호에서도 보고되었고, 이 문헌에서는 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 수용성 입자 중합체에 공유 콘쥬게이트된 다양한 G-CSF 및 유도체의 용도에 대해 기재한다. 인간 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 개질된 폴리펩티드는 1989년 10월 4일에 공고된 EP 0 335 423호에 보고되었다. 미국 특허 제5,824,784호에는 단백질 또는 그의 유사체를 N-말단에서 개질시키는 방법, 및 단백질 또는 그의 유사체, 및 N-말단에 화학적으로 개질된 신규 G-CSF 조성물을 포함하는, 그 결과 생성된 조성물을 제공한다. 미국 특허 제5,824,778호에는 화학적으로 개질된 G-CSF가 개시되어 있다.Another specific therapeutic protein that has been chemically modified is granulocyte colony stimulating factor (G-CSF). G-CSF provides a therapeutic effect against infection by inducing release of neutrophil granulocytes into the bloodstream and rapid proliferation. European
폴리(에틸렌 글리콜)에 대해서는, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 단백질에 부착시키기 위하여 다양한 방법이 사용된다. 일반적으로, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 단백질에서 발견되는 반응성 기를 통해 단백질에 연결된다.For poly (ethylene glycol), various methods are used to attach poly (ethylene glycol) molecules to proteins. In general, poly (ethylene glycol) molecules are linked to the protein through reactive groups found in the protein.
리신 잔기 상 또는 N-말단에서의 것과 같은 아미노기가 이러한 부착에 편리하다. 예를 들면 로이어(Royer)(상기 미국 특허 제4,002,531호)는 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 효소에 부착시키기 위하여 환원적 알킬화를 사용하였다고 기재하였다. 발명의 명칭이 "Peg 이미데이트 및 그의 단백질 유도체"인 1993년 4월 28일에 공고된 라이트(Wright)의 EP 0 539 167호에서는 유리 아미노기를 갖는 유기 화합물 및 펩티드를 PEG의 이미데이트 유도체 또는 관련 수용성 유기 중합체로 개질한다고 기재하고 있다. 미국 특허 제5,298,643호 및 미국 특허 제5,637,749호에서는 PEG 아릴 이미데이트를 개시한다.Amino groups such as on lysine residues or at the N-terminus are convenient for this attachment. For example, Royer (US Pat. No. 4,002,531, supra) described the use of reductive alkylation to attach poly (ethylene glycol) molecules to enzymes. In
문헌[Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994)]에서는 환원적 알킬화를 통해 CD4 면역어드헤신을 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 알데히드로 개질시키는 것에 대해 보고한다. 저자는 PEG가 부착된의 정도를 조절할 수 있는 조건 하에서 50%의 CD4-Ig가 MePEG-개질되었다고 보고한다(동일 문헌, 137 페이지). 저자는 또한 개질된 CD4-Ig의 (단백질 gp 120에 대한) 시험관내 결합 능력은 MePEG 수식의 정도와 연관된 속도로 감소한다고 보고한다(동일문헌). 1990년 2월 27일에 특허된 쇼(Shaw)의 미국 특허 제4,904,584호는 반응성 아민기를 통한 폴리(에틸렌 글리콜) 분자의 부착을 위해 단백질에서 리신 잔기의 수를 변경시키는 것에 관계된 것이다.Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994), reports on the modification of CD4 immunoadhesin to monomethoxypoly (ethylene glycol) aldehyde via reductive alkylation. The authors report that 50% of CD4-Ig was MePEG-modified under conditions that could control the extent of PEG attachment (same document, page 137). The authors also report that the in vitro binding capacity (for protein gp 120) of the modified CD4-Ig decreases at a rate associated with the degree of MePEG modification (same literature). Shaw, US Pat. No. 4,904,584, filed February 27, 1990, relates to altering the number of lysine residues in a protein for the attachment of poly (ethylene glycol) molecules through reactive amine groups.
단백질에 중합체를 부착시키는 많은 방법은 연결기로서 작용하는 모이티를 사용하는 것과 관계된다. 그러나, 이러한 모이티는 항원성일 수 있다. 연결기를 관계시키지 않는 트레실(tresyl) 클로라이드 방법을 사용할 수 있지만, 트레실 클로라이드의 사용으로 인해 독성 부산물이 생성될 수 있기 때문에 이 방법은 치료적 생성물을 생산하는데 사용하기 어려울 수 있다. 문헌[Francis et al., In: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern, T. and Manning, M.C.) Plenum, New York, 1991)] 및 [Delgado et al., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", in Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Fisher et al., eds. Plenum Press, New York, N.Y., 1989 pp. 211-213] 참조. Many methods of attaching polymers to proteins involve the use of moieties that act as linking groups. However, such moieties may be antigenic. A tresyl chloride method that does not involve a linker can be used, but this method can be difficult to use to produce therapeutic products because the use of tresyl chloride can produce toxic byproducts. Francis et al., In: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern, T. and Manning, MC Plenum, New York, 1991) and Delgado et al. , "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", in Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology , Fisher et al., Eds. Plenum Press, New York, NY, 1989 pp. 211-213.
또한, 단백질 기질 (인슐린)의 C-말단 카르복실 기에 연결기 카르보히드라지드를 선택적으로 부착시키는 것을 보고하는 문헌[Rose 등, Bio콘쥬게이트 Chemistry 2: 154-159 (1991)]을 참고할 것.See also, Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), which reports the selective attachment of the linking carbohydrazide to the C-terminal carboxyl group of the protein substrate (insulin).
국제 공개 제WO 93/00109호는 3일 이상의 기간 동안 연속적, 효과적 혈장 GH 농도를 유지시키는 것을 포함하는 포유동물 또는 조류의 GH 반응성 조직을 자극하는 방법에 관한 것이다. 그러한 혈장농도를 달성하는 한 방법은 PEG (폴리에틸렌 글리콜)과 같은 거대분자 물질에 커플링된 GH를 사용하는 것으로 기재되어 있다. 거대분자 물질에 커플링하면 개선된 반감기를 나타내는 것으로 언급되어 있다. PEG가 부착된 인간 성장 호르몬은 mPEG 알데히드-5000 및 mPEGN-히드록시숙신이미딜 에스테르 (mPEG-NHS-5000)를 사용하는 국제 공개 제WO 93/00109호에 보고되어 있다. mPEG-NHS를 사용하면, 다수의 PEG가 부착된 형태의 hGH의 불균일한 혼합물이 생성된다. 국제 공개 제WO 93/00109호는 mPEG-말레이미드의 PEG가 부착된 시스테인 hGH 변이체의 사용을 또한 개시한다.WO 93/00109 relates to methods of stimulating GH reactive tissues in mammals or birds, including maintaining continuous, effective plasma GH concentrations for at least three days. One method of achieving such plasma concentrations has been described using GH coupled to macromolecular materials such as PEG (polyethylene glycol). Coupling to macromolecular materials is said to show improved half-life. Human growth hormones with PEG are reported in WO 93/00109 using mPEG aldehyde-5000 and mPEGN-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS-5000). Using mPEG-NHS produces a heterogeneous mixture of hGH in the form of multiple PEG attached. WO 93/00109 also discloses the use of PEG attached cysteine hGH variants of mPEG-maleimide.
국제 공개 제WO 99/03887호는 PEG가 부착된 시스테인 변이체 성장 호르몬을 개시한다. BT-005로 명명된 이 콘쥬게이트는 성장 호르몬 결핍 래트에서 체중 증가를 자극시키는데 보다 효과적이고, hGH 보다 긴 반감기를 갖는 것으로 주장된다.WO 99/03887 discloses cysteine variant growth hormones with PEG attached. This conjugate, named BT-005, is claimed to be more effective at stimulating weight gain in growth hormone deficient rats and to have a longer half-life than hGH.
PEG가 부착된 인간 성장 호르몬은 또한 카르보메틸화된 PEG의 숙신이미딜 에 스테르를 사용하는 클라크(Clark) 등의 문헌[Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996]에도 보고되어 있다. 클라크 등은, 일차 아민에 선택적으로 콘쥬게이트된 mPEG-NHS-5000 사용하여 크기를 증가시킨 hGH 유도체를 기술한다. PEG 개질 수준이 증가하면 그 수용체에 대한 친화도가 감소되고, 세포계(cell-based) 분석에서의 EC50을 1500 배까지 증가시킨다. 올슨(Olson) 등의 문헌[Polymer Preprints 38: 568-569, 1997]은 N-히드록시숙신이미드 (NHS) PEG 및 숙신이미딜 프로피오네이트 (SPA) PEG를 사용하여 다수의 PEG가 부착된 hGH 종을 얻는 것을 개시한다.PEG-attached human growth hormones are also reported in Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996, using succinimidyl esters of carbomethylated PEG. Clark et al. Describe hGH derivatives of increased size using mPEG-NHS-5000 optionally conjugated to primary amines. Increasing PEG modification levels decrease the affinity for that receptor and increase the EC 50 in cell-based assays by 1500-fold. Olson et al. Polymer Preprints 38: 568-569, 1997 describe the use of N-hydroxysuccinimide (NHS) PEG and succinimidyl propionate (SPA) PEG to attach multiple PEGs. Initiate obtaining hGH species.
국제 공개 제WO 94/20069호는 PEG가 부착된 hGH를 흡입제형(formulation for pulmonary delivery)의 일부로서 예상하여 기술한다.International Publication No. WO 94/20069 describes anticipated PEG-attached hGH as part of the formulation for pulmonary delivery.
미국 특허 제4,179,337호는 효소 및 호르몬에 PEG를 부착시켜 생리적으로 활성 비-면역원성, 수용성 폴리펩티드 콘쥬게이트를 수득하는 방법을 개시한다. GH는 PEG가 부착되는 호르몬의 한 예로서 언급된다.US Pat. No. 4,179,337 discloses a method for attaching PEG to enzymes and hormones to obtain physiologically active non-immunogenic, water soluble polypeptide conjugates. GH is mentioned as an example of the hormone to which PEG is attached.
EP 공개 제458064 A2호는 소마토트로핀 중에 도입되거나 천연적으로 존재하는 시스테인 잔기에 PEG를 부착시키는 것을 개시한다. EP 공개 제458064 A2호는 또한, 야생형 소 소마토트로핀의 잔기 102-112에서 위치하는 것으로 제시된 오메가 루프라는 명칭의 루프 내에 두 개의 시스테인 잔기를 도입하는 것을 언급한다. 보다 특정하게는 EP 공개 제458064 A2호는 소 소마토트로핀의 번호 102 및 112로 명명된 잔기가 Ser에서 Cys로, Tyr에서 Cys로 각각 치환되는 것을 개시한다.EP publication 458064 A2 discloses attaching PEG to cysteine residues that are introduced or naturally present in somatotropin. EP publication 458064 A2 also refers to the introduction of two cysteine residues into a loop named omega loop which has been shown to be located at residues 102-112 of wild type bovine somatotropin. More specifically, EP Publication No. 458064 A2 discloses that the residues designated bovine somatotropin, numbers 102 and 112, are substituted for Ser to Cys and Tyr to Cys, respectively.
국제 공개 제WO 95/11987호는 모분자에 존재하거나 부위 지향 돌연변이에 의해 도입된 시스테인 잔기의 티올기에 PEG를 부착시키는 것을 제안한다. 국제 공개 제WO 95/11987호는 단백질분해효소 넥신-1에 PEG를 부착시키는 것에 관한 것이나, hGH 및 기타 단백질에 일반적으로 PEG를 부착시키는 것도 역시 제안되어 있다.WO 95/11987 proposes attaching PEG to thiol groups of cysteine residues present in the parent molecule or introduced by site-directed mutations. WO 95/11987 relates to the attachment of PEG to protease nexin-1, but it is also proposed to attach PEG generally to hGH and other proteins.
국제 공개 제WO 99/03887호는 예를 들면, 세린 잔기에 대하여 추가의 시스테인을 삽입하고, 도입된 시스테인 잔기에 PEG를 부착시켜 개질된 성장 호르몬을 개시한다.WO 99/03887 discloses modified growth hormones, for example, by inserting additional cysteines for serine residues and attaching PEG to the introduced cysteine residues.
국제 공개 제WO 00/42175호는 PEG 부착을 위한 유리 시스테인 잔기를 함유하는 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 국제 공개 제WO 00/42175호는 다음의 hGH 돌연변이 T3C, S144C 및 T148C와, 이들의 시스테인 PEG 부착을 개시한다.WO 00/42175 relates to the preparation of proteins containing free cysteine residues for PEG attachment. WO 00/42175 discloses the following hGH mutations T3C, S144C and T148C and their cysteine PEG attachment.
국제 공개 제WO 9711178호 (및 미국 특허 제5849535호, 제6004931호, 및 제6022711호)는 hGH의 아고니스트 또는 길항제로서의 GH 변이체의 사용에 관한 것이다. 국제 공개 제WO 9711178호는 또한 리신 PEG 부착 및 리신의 도입 또는 대체(예, K168A 및 K172R)를 비롯한 hGH의 PEG 부착을 또한 개시한다. 국제 공개 제WO 9711178호는 또한, G120K 치환을 개시한다. International Publication No. WO 9711178 (and U.S. Pat.Nos. 5,584,535,6004931, and 602711) relates to the use of GH variants as agonists or antagonists of hGH. WO 9711178 also discloses PEG attachment of hGH, including lysine PEG attachment and the introduction or replacement of lysine (eg, K168A and K172R). International Publication No. WO 9711178 also discloses a G120K substitution.
문헌 [Knauf, M. J. 등, J. Biol. Chem. 263: 15064- 15070,1988]에 기술된 바와 같이, PEG가 부착된 hGH에 대한 이전의 보고는, 다중의 PEG 부착을 요구하는데, 이는 바람직하지 않은 생성물 비균일성을 야기시켜 신장 여과의 70K 분자량 컷-오프 보다 큰 유체역학적 부피를 얻는다.See Knauf, M. J. et al., J. Biol. Chem. 263: 15064-15070,1988, previous reports on PEG-attached hGH require multiple PEG attachments, which result in undesirable product non-uniformity resulting in 70K molecular weight of kidney filtration. A hydrodynamic volume greater than the cut-off is obtained.
보다 긴 주기의 반감기를 갖는 GH 분자는 필요한 투여 횟수를 감소시키고, 잠재적으로는 보다 최적의 치료 hGH 농도와 부수적으로 증가된 치료 효과를 제공할 것이다.GH molecules with longer half-lives will reduce the number of doses required and potentially provide more optimal therapeutic hGH concentrations and concomitantly increased therapeutic effects.
본 발명은 감소된 불균일성, 감소된 제거율, 증가된 혈장 체류 기간, 개선된 용해도, 증가된 안정성, 감소된 항원성, 또는 그의 조합을 갖는 화학적으로 개질된 hGH 콘쥬게이트를 제공한다.The present invention provides chemically modified hGH conjugates having reduced heterogeneity, reduced clearance, increased plasma retention, improved solubility, increased stability, reduced antigenicity, or a combination thereof.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명은 감소된 제거율, 증가된 혈장 체류 기간, 증가된 안정성, 개선된 용해도 및 감소된 항원성으로부터 선택되나, 이로 제한되지는 않는 하나 이상의 개선된 화학적 또는 생리학적 성질을 갖는 화학적으로 개질된 hGH 및 그 아고니스트 변이체에 관한 것이다. 따라서, 하기에서 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명은 hGH 및 그 아고니스트 변이체의 화학적 개질 뿐 아니라 다양한 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 이용한 특정 개질에 관한 다수의 측면을 갖는다. The present invention provides a chemically modified hGH having one or more improved chemical or physiological properties selected from, but not limited to, reduced clearance, increased plasma retention period, increased stability, improved solubility and reduced antigenicity. And agonist variants thereof. Thus, as described in more detail below, the present invention has numerous aspects regarding chemical modification of hGH and its agonist variants as well as specific modifications using various poly (ethylene glycol) residues.
본 발명은 또한, 화학적으로 개질된 hGH 및 그 아고니스트 변이체의 제조방법에 관한 것이다.The present invention also relates to methods of preparing chemically modified hGH and agonist variants thereof.
본 발명은 또한 화학적으로 개질된 hGH 및 그 아고니스트 변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. The invention also relates to compositions comprising chemically modified hGH and agonist variants thereof.
본 발명의 개질된 hGH 및 그 아고니스트 변이체는, 왜소증 (GHD), 성인 GHD, 터너 증후군, 임신 기간에 비하여 작은 아기(SGA)의 성장 부전의 장기간의 치료, 프레이더-윌리 증후군(PWS)을 앓는 환자의 치료, 만성 신부전증(CRI), 에이즈 관련 소모성 질환(Aids wasting), 노화, 말기 신부전, 및 낭포성 섬유증의 치료에 유용할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. Modified hGH and its agonist variants of the present invention can be used to treat dwarfism (GHD), adult GHD, Turner syndrome, long-term treatment of growth insufficiency in small babies (SGA) compared to gestational age, and Freuder-Willi syndrome (PWS) It may be useful in the treatment of patients suffering from chronic renal failure (CRI), AIDS related wasting, aging, end stage renal failure, and cystic fibrosis.
상세한 설명details
hGH 및 그 아고니스트 변이체는 미국특허 제4,658,021호 및 제5,633,352호에 기술된 재조합 단백질 부류의 일원이다. 이들의 재조합 생산 및 사용 방법은 미국 특허 제4,342,832호, 제4,601,980호, 제4,898,830호, 제5,424,199호 및 제5,795,745호에 상세히 기술되어 있다. hGH and its agonist variants are members of the recombinant protein class described in US Pat. Nos. 4,658,021 and 5,633,352. Their recombinant production and use methods are described in detail in US Pat. Nos. 4,342,832, 4,601,980, 4,898,830, 5,424,199 and 5,795,745.
재조합 유전 기술을 사용하여 형질전환되거나 트랜스펙트된(transfected) 이. 콜라이 및 동물 세포와 같은 숙주 세포에 의해 생산되는, 임의의 정제되고 단리된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다. 추가의 hGH 변이체는 미국특허출원 일련번호 제07/715,300호(1994년 6월 14일 출원) 및 제07/743,614호(1991년 8월 9일), 및 국제공개 제WO 92/09690호(1992년 6월 11일 공개)에 기술되어 있다. 이들 중에서, 형질전환된 이. 콜라이에 의해 제조된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체가 특히 바람직하다. 그러한 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 높은 순도 및 균일성으로 대량으로 수득될 수 있다. 예를 들면, 상기 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 미국 특허 제4,342,832호, 제4,601,980호, 제4,898,830호, 제5,424,199호 및 제5,795,745호에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있다. 용어 "실질적으로 하기의 아미노산 서열을 갖는다"는, hGH 또는 그 아고니스트 변이체에 대한 작용에 있어서 어떠한 불리한 비-유사성을 일으키지 않는 한, 상 기 아미노산 서열이 하나 이상의 아미노산 변화 (삭제, 부가, 삽입 또는 대체)를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 하나 이상의 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 쌍을 이루지 않은 시스테인 잔기, 유리 N-말단 α-아미노 기 또는 유리 C-말단 카르복실 기가 포함된 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 사용하는 것이 보다 바람직하다. E. transformed or transfected using recombinant genetic techniques. Any purified and isolated hGH or agonist variant thereof produced by host cells such as coli and animal cells can be used in the present invention. Additional hGH variants are described in US Patent Application Serial Nos. 07 / 715,300 (filed June 14, 1994) and 07 / 743,614 (August 9, 1991), and WO 92/09690 (1992). Published June 11, 2011). Among these, transformed E. coli. Particularly preferred are hGH or agonist variants thereof produced by E. coli. Such hGH or agonist variants thereof can be obtained in large quantities with high purity and uniformity. For example, the hGH or agonist variant thereof can be prepared according to the methods disclosed in US Pat. Nos. 4,342,832, 4,601,980, 4,898,830, 5,424,199 and 5,795,745. The term “substantially has the following amino acid sequence” means that the amino acid sequence is one or more amino acid changes (deletes, additions, insertions, or otherwise) unless it causes any adverse non-similarity in its action on hGH or agonist variants thereof. Alternative). The use of hGH or agonist variants substantially having an amino acid sequence comprising at least one lysine, aspartic acid, glutamic acid, unpaired cysteine residues, free N-terminal α-amino groups or free C-terminal carboxyl groups More preferred.
본 발명에 따르면, 폴리 (에틸렌 글리콜)은 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 아미노산 잔기를 통해서 공유결합되어 있다. 다수의 상이한 관능기, 연결기, 구조, 및 분자량를 갖는 다양한 활성화된 폴리 (에틸렌 글리콜)이 당분야에 공지되어 있으며, PEG-hGH 콘쥬게이트 또는 PEG-hGH 아고니스트 변이체 콘쥬게이트를 제조하는데 사용된다 (문헌[Roberts M. J. 등, Adv. Drug Del. Rev. 54: 459-476, 2002), Harris J.M. 등, Drug Delivery Sytems 40: 538-551,2001] 참조). 아미노산 잔기는 예를 들면, 활성화된 폴리 (에틸렌 글리콜)의 말단 반응성 기가 결합될 수 있는 유리 아미노, 카르복실, 설프히드릴 (티올), 히드록실, 구아니디닐, 또는 이미디조일 기를 갖는 임의의 반응성 아미노산 잔기일 수 있다. 유리 아미노 기를 갖는 아미노산 잔기는 리신 및(또는) N-말단 아미노 산 잔기를 포함할 수 있고, 유리 카르복실 기를 갖는 아미노산 잔기는 아스파르트 산, 글루탐산 및(또는) C-말단 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 시스테인과 같은 유리 설프히드릴 (티올)을 갖는 아미노산 잔기, 세린 또는 티로신과 같은 유리 히드록실을 갖는 아미노산 잔기, 아르기닌과 같은 유리 구아니디닐을 갖는 아미노산 잔기, 및 히스티딘과 같은 유리 이미디조일을 갖는 아미노산 잔기 등이 있다. According to the present invention, poly (ethylene glycol) is covalently linked via amino acid residues of hGH or agonist variants thereof. Various activated poly (ethylene glycols) having a number of different functional groups, linking groups, structures, and molecular weights are known in the art and used to prepare PEG-hGH conjugates or PEG-hGH agonist variant conjugates. Roberts MJ et al., Adv. Drug Del. Rev. 54: 459-476, 2002), Harris JM Et al., Drug Delivery Sytems 40: 538-551,2001). The amino acid residue can be, for example, any having a free amino, carboxyl, sulfhydryl (thiol), hydroxyl, guanidinyl, or imidizoyl group to which the terminal reactive groups of the activated poly (ethylene glycol) can be bound. It may be a reactive amino acid residue. Amino acid residues having free amino groups may comprise lysine and / or N-terminal amino acid residues, amino acid residues having free carboxyl groups may comprise aspartic acid, glutamic acid and / or C-terminal amino acid residues , Amino acid residues with free sulfhydryl (thiol) such as cysteine, amino acid residues with free hydroxyl such as serine or tyrosine, amino acid residues with free guanidinyl such as arginine, and free imidizoyl such as histidine. Amino acid residues having;
다른 실시태양에서, 옥심 화학(문헌[Lemieux & Bertozzi Tib Tech 16: 506-513,1998] 참조)이 N-말단 세린 잔기를 표적화하는데 사용된다. In another embodiment, oxime chemistry (see Lemieux & Bertozzi Tib Tech 16: 506-513,1998) is used to target the N-terminal serine residues.
본 발명에 사용되는 폴리 (에틸렌 글리콜)은 임의의 특정 형태 또는 분자량 범위로 제한되지 않는다. 폴리 (에틸렌 글리콜) 분자량은 500 내지 100,000 사이이다. 통상적으로, 500-60,000의 분자량, 바람직하게는 1,000-40,000 이다. 보다 바람직하게는, 5,000 초과 내지 약 40,000 까지의 분자량이 사용된다.The poly (ethylene glycol) used in the present invention is not limited to any particular form or molecular weight range. The poly (ethylene glycol) molecular weight is between 500 and 100,000. Typically, the molecular weight is 500-60,000, preferably 1,000-40,000. More preferably, molecular weights greater than 5,000 up to about 40,000 are used.
다른 실시태양에서, 폴리 (에틸렌 글리콜)은 하나 이상의 PEG 잔기가 부착된 분지쇄 PEG이다. 분지쇄 PEG의 바람직한 예들은 미국특허 제5,932,462호, 제5,342,940호, 제5,643,575호, 제5,919,455호, 제6,113,906호, 제5,183,660호; 국제공개 제WO 02/09766호; 문헌[Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); 및 Yamasaki 등, Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998]에 기술되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 분지쇄 PEG의 각각의 폴리 (에틸렌 글리콜)의 분자량은 5,000 내지 20,000이다. In another embodiment, the poly (ethylene glycol) is a branched PEG with one or more PEG residues attached. Preferred examples of branched PEGs include U.S. Patents 5,932,462, 5,342,940, 5,643,575, 5,919,455, 6,113,906, 5,183,660; International Publication No. WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5: 283-288 (1994); And Yamasaki et al., Agric. Biol. Chem., 52: 2125-2127, 1998. In a preferred embodiment, the molecular weight of each poly (ethylene glycol) of branched PEG is 5,000 to 20,000.
폴리(알킬렌 옥사이드), 특히, 폴리(에틸렌 글리콜)은 PEG와 단백질 사이에 결합 잔기(이격기)를 제공할 수 있거나 제공할 수 없는 말단 반응성기를 통해 hGH 또는 그 아고니스트 변이체와 결합된다. 본 발명의 hGH 콘쥬게이트 또는 그 아고니스트 변이체를 형성하기 위해, 폴리(알킬렌 옥사이드)와 같은 고분자를 당업자에게 공지된 활성 형태로 전환시킨다. 반응성기는 예를 들어, 단백질 상에서 화학 잔기들, 예를 들어, 아미노기, 카르복실기 또는 티올기 및 폴리(에틸렌 글리콜) 사이에 결합을 매개하는 말단 반응성기이다. 통상적으로 말단 고분자 히드록시 종단 -기(즉, 알파 및 오메가 말단 히드록실 기) 중의 하나 또는 둘다가 공유 콘쥬게이션을 가능하게 하는 반응성 관능기로 전환된다. 상기 공정은 종종 "활성화"로서 언급되며, 반응성기를 갖는 폴리(에틸렌 글리콜) 생성물은 이하에서는 "활성화 폴리(에틸렌 글리콜)"이라고 언급된다. α및 ε결합기 모두를 함유하는 고분자를 "비스-활성화 폴리(알킬렌 옥사이드)"라고 언급하며, "이관능기"이라고 언급된다. α및 ε말단 히드록실 상에 동일한 반응성기를 함유하는 고분자는 종종 "호모이관능기" 또는 "호모비스-활성화"라고 언급된다. α및 ε말단 히드록실 상에 상이한 반응성기를 함유하는 고분자는 종종 "헤테로이관능기"(예를 들어, WO 01/26692 참고) 또는 "헤테로비스-활성화"로 언급된다. 단일 반응성기를 함유하는 고분자는 "모노-활성화" 폴리알킬렌 옥사이드 또는 "단일-관능기"이라고 언급된다. 다른 실질적으로 비-항원성 고분자는 유사하게 "활성화" 또는 "관능화"된다.Poly (alkylene oxide), in particular poly (ethylene glycol), is coupled with hGH or agonist variants through terminal reactive groups which may or may not provide a binding moiety (spacer) between PEG and the protein. To form the hGH conjugates or agonist variants thereof of the invention, polymers such as poly (alkylene oxides) are converted into active forms known to those skilled in the art. The reactive group is, for example, a terminal reactive group that mediates the bond between chemical moieties on the protein, such as amino, carboxyl or thiol groups and poly (ethylene glycol). Typically one or both of the terminal polymer hydroxy end-groups (ie, alpha and omega terminal hydroxyl groups) are converted to reactive functional groups that allow covalent conjugation. The process is often referred to as "activation" and the poly (ethylene glycol) product with reactive group is referred to as "activated poly (ethylene glycol)" below. Polymers containing both α and ε bonding groups are referred to as "bis-activated poly (alkylene oxides)" and "difunctional groups". Polymers containing the same reactive groups on the α and ε terminal hydroxyls are often referred to as “homofunctional groups” or “homobis-activation”. Polymers containing different reactive groups on the α and ε terminal hydroxyls are often referred to as “heterofunctional groups” (see eg WO 01/26692) or “heterobis-activation”. Polymers containing a single reactive group are referred to as "mono-activated" polyalkylene oxides or "single-functional groups". Other substantially non-antigenic polymers are similarly "activated" or "functionalized".
따라서, 활성화 고분자는 단백질 상에 화학 잔기, 예를 들어, α- 또는 ε-아미노, 카르복실 또는 티올기 및 폴리(에틸렌 글리콜) 사이에 결합을 매개하는데 적절하다. 비스-활성화 고분자는 2개의 단백질 분자 또는 한개의 단백질 분자와 한 개의 다른 실시태양의 반응성 소분자와 상기 방식으로 반응하여 가교 결합을 통해 단백질 고분자 또는 단백질-소분자 콘쥬게이트를 효과적으로 형성하도록 할 수 있다.Thus, the activating polymer is suitable for mediating a bond between chemical moieties such as α- or ε-amino, carboxyl or thiol groups and poly (ethylene glycol) on the protein. Bis-activated polymers can be reacted in this manner with two protein molecules or one protein molecule and reactive small molecules in one other embodiment to effectively form a protein polymer or protein-small molecule conjugate through crosslinking.
hGH 또는 그 아고니스트 변이체 상에서 발견되는 라이신(lysine)의 아미노 말단 α-아미노기 또는 ε-아미노기 중의 하나와 반응할 수 있는 관능기는 N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 카르보네이트, 예를 들어, p-니트로페닐 또는 숙신이미 딜(미국 특허 제5,808,096호, 미국 특허 제5,612,460호, 미국 특허 제5,324,844호, 미국 특허 제5,5,122,614호); 카르보닐 이미다졸; 아즈락톤(미국 특허 제5,321,095호, 미국 특허 제5,567,422호); 시클릭 이미드 티온(미국 특허 제5,405,877호, 제5,349,001호); 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트(그린왈드(Greenwald) R.B.의 문헌[J. Org. Chem., 60:331-336, 1995]); 트레실 클로라이드(EP 714 402, EP 439 508); 할로겐 포르미에이트(WO 96/40792) 및 알데히드를 포함한다.A functional group capable of reacting with either the amino terminal α-amino group or ε-amino group of lysine found on hGH or its agonist variant is N-hydroxysuccinimidyl ester, carbonate, for example p Nitrophenyl or succinimidyl (US Pat. No. 5,808,096, US Pat. No. 5,612,460, US Pat. No. 5,324,844, US Pat. No. 5,5,122,614); Carbonyl imidazole; Azlactones (US Pat. No. 5,321,095, US Pat. No. 5,567,422); Cyclic imide thiones (US Pat. Nos. 5,405,877, 5,349,001); Isocyanates or isothiocyanates (Greenwald R. B., J. Org. Chem., 60: 331-336, 1995); Tresyl chloride (EP 714 402, EP 439 508); Halogen formate (WO 96/40792) and aldehydes.
hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 카르복실산기, 반응성 카르보닐기 및 산화 카르보히드레이트 잔기와 반응할 수 있는 관능기는 1급 아민; 및 히드라진 및 히드라지드 관능기, 예를 들어, 아실 히드라지드, 카르바제이트, 세미카르바메이트, 티오카르바제이트 등(WO 01/70685)을 포함한다.The functional groups capable of reacting with carboxylic acid groups, reactive carbonyl groups and oxidized carbohydrate moieties of hGH or agonist variants thereof include primary amines; And hydrazine and hydrazide functional groups such as acyl hydrazide, carbazate, semicarbamate, thiocarbazate and the like (WO 01/70685).
hGH 또는 그 아고니스트 변이체 상에서 이용가능한 메르캡토 기는 또한 반응성기, 예를 들어, 티올; 말레이미드, 술폰 및 페닐 글리옥살기를 갖는 적절히 활성화 고분자를 위한 부착 자리로서 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,093,531호 참고, 상기 특허는 본원에 인용문헌으로 삽입됨). 친전자체 중심과 반응할 수 있는 다른 친핵체는 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어, 히드록실, 아미노, 카르복실, 티올, 활성 메틸렌 등을 포함한다.Mercapto groups available on hGH or agonist variants thereof also include reactive groups such as thiols; It can be used as an attachment site for a suitably activated polymer having maleimide, sulfone and phenyl glyoxal groups (see, eg, US Pat. No. 5,093,531, which is incorporated herein by reference). Other nucleophiles capable of reacting with an electrophilic center include, but are not limited to, hydroxyl, amino, carboxyl, thiol, active methylene and the like.
또한, 미국 특허 제5,359,030호; 미국 특허 제5,681,811호; 미국 특허 제5,438,040; 및 미국 특허 제5,359,030호에 개시되어 있는 친유성 및 친수성 잔기를 포함하는 고분자도 포함된다. See also US Pat. No. 5,359,030; US Patent No. 5,681,811; U.S. Patent 5,438,040; And polymers comprising lipophilic and hydrophilic moieties disclosed in US Pat. No. 5,359,030.
또한, PEG를 단백질과 직접 공유결합시키는 아미노기, 티올기 및 방향족 히 드록시기와 반응할 수 있는 할로겐화 PEG도 WO 98/32466에 개시된다. 본 발명의 바람직한 일 실시태양에는, 2급 아민 또는 아미드 결합이 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 라이신의 N-말단 α- 아미노기 또는 ε- 아미노기 및 활성화 PEG를 사용하여 형성된다. 본 발명의 바람직한 또다른 실시태양에서는 2급 아민 결합은 (차모우(Chamow) 등의 문헌[바이오콘쥬게이트 켐. 5:133-140(1994)] 및 미국 특허 제5,824,784호에 개시된 바와 같은) NaCNBH3, NaBH3, 피리딘 보란 등과 같은 적절한 환원제를 이용한 환원에 의해 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 N-말단 1급 α- 또는 ε-아미노기와 직쇄 또는 분지쇄 PEG 알데히드 사이에 형성된다. Also disclosed in WO 98/32466 are halogenated PEGs that can react with amino, thiol and aromatic hydroxyl groups that directly covalently bond PEG to proteins. In one preferred embodiment of the invention, secondary amine or amide bonds are formed using the N-terminal α-amino group or ε-amino group of lysine of hGH or its agonist variant and activating PEG. In another preferred embodiment of the present invention the secondary amine linkage is NaCNBH (as disclosed in Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) and US Pat. No. 5,824,784). Reduction with an appropriate reducing agent such as 3 , NaBH 3 , pyridine borane and the like is formed between the N-terminal primary α- or ε-amino group of the hGH or its agonist variant with a straight or branched PEG aldehyde.
바람직한 실시태양에서는, 70% 이상, 바람직하게는 80%이상, 바람직하게는 81% 이상, 바람직하게는 82% 이상, 바람직하게는 83% 이상, 바람직하게는 84% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 바람직하게는 86% 이상, 바람직하게는 87% 이상, 바람직하게는 88% 이상, 바람직하게는 89% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 바람직하게는 91% 이상, 바람직하게는 92% 이상, 바람직하게는 93% 이상, 바람직하게는 94% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)이 아미노 말단 α-아미노기상에 존재한다.In a preferred embodiment, at least 70%, preferably at least 80%, preferably at least 81%, preferably at least 82%, preferably at least 83%, preferably at least 84%, preferably at least 85% , Preferably at least 86%, preferably at least 87%, preferably at least 88%, preferably at least 89%, preferably at least 90%, preferably at least 91%, preferably at least 92%, Preferably at least 93%, preferably at least 94%, preferably at least 95%, preferably at least 96%, preferably at least 96%, preferably at least 97%, most preferably at least 98% poly (Ethylene glycol) is present on the amino terminal α-amino group.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 아미드-형성 결합기, 예를 들어, 숙신이미딜 에스테르, 시클릭 이미드 티온 등으로 활성화시킨 고분자는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 사이의 결합 및 고분자에 효과를 미치도록 사용된다 (예를 들어, 미국 특허 제5,349,001호; 미국 특허 제5,405,877호 및 그린왈드 등의 문헌[Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000] 참고, 상기 문헌들은 본원에 인용문헌으로 삽입되었음). hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 유리 아미노기와 결합될 수 있는 하나의 바람직한 활성화 폴리(에틸렌 글리콜)은 직쇄 또는 분지쇄 N-히드록시숙시닐이미드 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하며, N-히드록시숙시닐이미드를 이용하여 폴리(에틸렌 글리콜)의 숙신산 에스테르를 활성화함으로써 제조될 수 있다.In another preferred embodiment of the invention, a polymer activated with an amide-forming linker, such as succinimidyl ester, cyclic imide thione, etc., has an effect on the binding and polymer between hGH or its agonist variant. (See, eg, US Pat. No. 5,349,001; US Pat. No. 5,405,877 and Greenwald et al . , Crit . Rev. Ther . Drug Carrier Syst. 17 : 101-161, 2000, which are herein incorporated by reference). Inserted as a citation). One preferred activated poly (ethylene glycol) that can be bound to the free amino group of hGH or its agonist variant includes straight or branched chain N-hydroxysuccinylimide poly (ethylene glycol), N-hydroxysuccinic It can be prepared by activating succinic acid ester of poly (ethylene glycol) with nilimide.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양은 ε-아미노 또는 다른 기를 통해 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 이용하여 고분자의 공유 결합을 형성하기 위해 다른 활성화 고분자를 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 말단 활성화 고분자의 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트 형태는 라이신 아미노기를 이용하여 우레아 및 티오우레아-기재 결합을 형성하도록 사용될 수 있다(그린왈드 R.B.의 문헌[J. Org. Chem., 60:331-336, 1995]).Another preferred embodiment of the present invention involves the use of other activating polymers to form covalent bonds of the polymer using hGH or agonist variants thereof via ε-amino or other groups. For example, isocyanate or isothiocyanate forms of terminally activated polymers can be used to form urea and thiourea-based bonds using lysine amino groups (Grinwald RB, J. Org. Chem. , 60: 331-336, 1995).
본 발명의 또다른 바람직한 면은 카르바메이트 (우레탄) 결합은 미국 특허 제5,122,614호, 제5,324,844호 및 제5,612,640호(상기 특허들은 본원에 인용문헌으로 삽입됨)에 개시된 바와 같은 단백질 아미노기를 이용하여 형성된다. 그 예에는 N-숙신이미딜 카르보네이트, 파라-니트로페닐 카르보네이트 및 카르보닐 이미다졸 활성화 고분자를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 실시태양에서, PEG의 벤조트리아졸 카르보네이트 유도체는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 상에 아미노기와 연결된다.Another preferred aspect of the invention is that carbamate (urethane) linkages can be prepared using protein amino groups as disclosed in US Pat. Nos. 5,122,614, 5,324,844 and 5,612,640, which are incorporated herein by reference. Is formed. Examples include N-succinimidyl carbonate, para-nitrophenyl carbonate and carbonyl imidazole activating polymers. In another preferred embodiment of the invention, the benzotriazole carbonate derivative of PEG is linked to an amino group on hGH or agonist variant thereof.
본 발명의 또다른 면은 유리 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 또는 다른 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 유도체를 방출하는 효소적 또는 pH 지시 가수분해에 의해 분해될 것으로 예상되는 관능성 결합기에 의해 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 분자에 부착된 수용성 고분자, 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 전구약물 또는 지연 방출형을 제공한다. 전구약물은 또한 다단계 잠재화의 이용을 포함하는 "이중 전구약물"(Bundgaard in Advanced Drug Delivery Reviews 3: 39-65, 1989)일 수 있다. 이러한 시스템에서, 가수분해 반응은 초기 속도-제한 (저속) 효소적 또는 pH 지시 단계 및 제1단계 발생후에만 일어나는 고속 비-효소 가수분해를 포함하는 제2단계를 포함한다. 이러한 방출가능 고분자는 임시적이며 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 연속으로 방출하는 저장소로서 작용할 수 있는 단백질 콘쥬게이트를 제공한다. 상기 관능성 결합기는 미국 특허 제5,614,549호; 미국 특허 제5,840,900호; 미국 특허 제5,880,131호; 미국 특허 제5,965,119호; 미국 특허 제5,965,565호; 미국 특허 제6,011,042호; 미국 특허 제6,153,655호; 미국 특허 제6,180,095B1호; 미국 특허 제6,413,507호; 그린왈드 R.B.등의 문헌[J. Med. Chem. 42;3657-3667, 1999]; 리(Lee), S. 등의 문헌[Bioconjugate Chem. 12:163-169, 2001]; 가만(Garman) A.J. 등의 문헌[FEBS Lett. 223:361-365,1987]; 워그히렌(Woghiren) C. 등의 문헌[Bioconjugate Chem. 4:314-318,1993]; 로버츠(Roberts) M.J. 의 문헌[J. Pharm. Sci. 87;1440-1445,1998]; 자오(Zhao) X.의 문헌[Ninth Int. Symp. Recent Adv. Drug Delivery Syst. 199]; 그린왈드 R.B. 등의 문헌[J.Med.Chem. 43:475-487, 2000] 및 그린왈드 R.B.의 문헌 [Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000], 잘리프스키(Zalipsky) 등의 문헌[28th Int. Symp. On controlled Release of Bioactive Materials 1; 73-74, 2001]에 기재되어 있다.Another aspect of the invention is that a hGH or agonist is expected to be degraded by enzymatic or pH directed hydrolysis that releases free hGH or agonist variant thereof or another hGH or agonist variant derivative thereof. Provided are prodrugs or delayed release forms of hGH or agonist variants thereof comprising a water soluble polymer, such as poly (ethylene glycol), attached to the variant molecule. Prodrugs may also be “double prodrugs” (Bundgaard in Advanced Drug Delivery Reviews 3 : 39-65, 1989), which include the use of multistage latents. In such a system, the hydrolysis reaction comprises an initial rate-limiting (low speed) enzymatic or pH indicating step and a second step comprising fast non-enzymatic hydrolysis that occurs only after the first step occurs. Such releasable polymers provide a protein conjugate that is temporary and can act as a reservoir for continuously releasing hGH or agonist variants thereof. Such functional linking groups are described in US Pat. No. 5,614,549; US Patent No. 5,840,900; US Patent No. 5,880,131; U.S. Patent 5,965,119; US Patent No. 5,965,565; US Patent No. 6,011,042; US Patent No. 6,153,655; US Patent No. 6,180,095B1; US Patent No. 6,413,507; Greenwald RB et al ., J. Med. Chem. 42 ; 3657-3667, 1999; Lee, S. et al., Bioconjugate Chem. 12 : 163-169, 2001; Garman AJ et al ., FEBS Lett. 223 : 361-365,1987; Woghiren C. et al., Bioconjugate Chem. 4: 314-318, 1993; Roberts MJ, J. Pharm. Sci. 87 ; 1440-1445,1998; Zhao X., Ninth Int. Symp. Recent Adv. Drug Delivery Syst. 199; Greenwald RB et al ., J. Med. Chem. 43 : 475-487, 2000 and Greenwald RB, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17 : 101-161, 2000, Zalipsky et al., 28th Int. Symp. On controlled Release of
PEG 부착 반응으로 불리는 콘쥬게이션 반응은 역사적으로 과량의 고분자를 갖는 용액 중에서 고분자가 단백질과 부착될 곳은 고려하지 않고 수행되었다. 그러나, 이러한 일반적인 기술은 충분한 생리활성을 보유하면서 비-항원성 고분자와 생리활성 단백질을 콘쥬게이트시키기에 부적절한 것으로 입증되었다. hGH 또는 그 아고니스트 변이체 생리활성을 유지하는 한가지 방법은 고분자 커플링 방법에서 수용체 결합 자리와 결합된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 반응성 기와의 콘쥬게이션을 실질적으로 방지하는 것이다. 본 발명의 또다른 면은 보유 활성을 높은 수준으로 유지시키면서 폴리(에틸렌 글리콜)을 hGH 또는 그 아고니스트 변이체와 콘쥬게이션시키는 방법을 제공하는 것이다.Conjugation reactions, called PEG attachment reactions, have historically been performed without considering where the polymer would attach to the protein in a solution with excess polymer. However, this general technique has proved inadequate for conjugating non-antigenic polymers and bioactive proteins while retaining sufficient bioactivity. One way to maintain hGH or agonist variant physiological activity is to substantially prevent conjugation of hGH or agonist variant reactive groups bound with receptor binding sites in a polymer coupling method. Another aspect of the present invention is to provide a method of conjugating poly (ethylene glycol) with hGH or agonist variants thereof while maintaining high levels of retention activity.
공유 결합을 통한 화학적 개질은 활성화 폴리(에틸렌 글리콜)을 이용하여 생리 활성 물질의 반응에서 일반적으로 채택되는 임의의 적절한 조건하에서 수행될 수 있다. 콘쥬게이션 반응은 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 불활성화시키는 것을 방지하기 위한 상대적으로 온화한 조건하에서 수행된다. 온화한 조건은 3 내지 10의 범위의 반응 용액의 pH 및 약 0℃내지 37℃ 범위의 반응 온도를 유지하는 것을 포함한다. hGH 또는 그 아고니스트 변이체 중의 반응성 아미노산 잔기가 유리 아미노기를 갖는 경우에는 상기 개질은 포스페이트, MES, 시트레이트, 아세테이트, 숙시네이트 또는 HEPES를 포함하는 적절한 완충액(pH 3 내지 10)의 비제한적 종류 중에서, 1 내지 48 시간 동안 4℃ 내지 37℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하다. PEG 알데히드와 같은 시약을 이용하여 N-말단 아미노기를 표적으로 하는 경우 바람직하게는 pH 4-8이 유지된다. 활성화 폴리(에틸렌 글리콜)은 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 유리 아미노기의 수의 몰수의 약 0.05 내지 100 배, 바람직하게는 0.01 내지 2.5배로 사용될 수 있다. 다른 한편, hGH 또는 그 아고니스트 변이체 중의 반응성 아미노산 잔기가 유리 카르복실기를 갖는 경우, 상기 개질은 약 3.5 내지 약 5.5의 pH에서 수행되는 것이 바람직하고, 폴리(옥시에틸렌디아민)을 이용한 개질은 4℃ 내지 37℃에서 1 내지 24시간 동안 카르보디이미드(pH 3.5-5)의 존재하에서 수행된다. 활성화 폴리(에틸렌 글리콜)은 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 유리 카르복실기의 몰수의 0.05 내지 300배로 사용될 수 있다. Chemical modification via covalent bonds can be carried out under any suitable conditions that are generally employed in the reaction of bioactive materials with activated poly (ethylene glycol). The conjugation reaction is performed under relatively mild conditions to prevent inactivating hGH or agonist variants thereof. Mild conditions include maintaining the pH of the reaction solution in the range of 3 to 10 and the reaction temperature in the range of about 0 ° C to 37 ° C. If the reactive amino acid residue in the hGH or agonist variant thereof has a free amino group, the modification is, among other non-limiting kinds of suitable buffers (pH 3-10) comprising phosphate, MES, citrate, acetate, succinate or HEPES. It is preferably carried out at a temperature of 4 ° C. to 37 ° C. for 1 to 48 hours. When targeting an N-terminal amino group with a reagent such as PEG aldehyde, preferably pH 4-8 is maintained. The activated poly (ethylene glycol) may be used at about 0.05 to 100 times the moles of the number of free amino groups of the hGH or agonist variant thereof, preferably 0.01 to 2.5 times. On the other hand, if the reactive amino acid residue in hGH or its agonist variant has a free carboxyl group, the modification is preferably carried out at a pH of about 3.5 to about 5.5, and the modification with poly (oxyethylenediamine) is from 4 ° C to Carbodiimide (pH 3.5-5) is carried out at 37 ° C. for 1 to 24 hours. Activated poly (ethylene glycol) may be used at 0.05 to 300 times the moles of the free carboxyl groups of hGH or agonist variants thereof.
별도의 실시태양에서, 콘쥬게이션 반응에 포함되는 고분자의 양을 위한 상한은 실질적인 양의 고분자량 물질을 형성하지 않고 활성화 고분자 및 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 반응시키는 것이 가능할 정도로, 즉, hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 1 분자 당 약 1 이상의 고분자 스트랜드를 함유하는 콘쥬게이트의 약 20% 이상으로 약 1:1을 초과한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 면을 고려하면 약 6:1 이하의 비율을 사용하여 다음단계에서 임의의 고분자량 물질들로부터 단리될 수 있는 상당한 양의 목적하는 콘쥬게이트를 형성할 수 있다. In a separate embodiment, the upper limit for the amount of polymer involved in the conjugation reaction is such that it is possible to react the activating polymer and the hGH or agonist variant thereof without forming a substantial amount of high molecular weight material, i.e. hGH or its Greater than about 1: 1 with at least about 20% of conjugates containing at least about 1 polymer strand per molecule of agonist variant. For example, taking this aspect of the invention into account, a ratio of about 6: 1 or less can be used to form a significant amount of the desired conjugate that can be isolated from any high molecular weight materials in the next step.
본 발명의 다른 면에서, 이관능기 활성화 PEG 유도체는 다수 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 분자가 PEG를 통해 가교결합되어 있는 고분자 hGH 또는 그 아고니스트 변이체-PEG 분자를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 반응 조건 은 상당한 양의 비개질 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 제공할 수 있지만, 비개질 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 추가 콘쥬게이션 반응을 위한 다음 배치(batch)로 용이하게 재순환될 수 있다. 본 발명의 방법은 놀랍게도 매우 소량의, 즉, 약 30% 미만, 더 바람직하게는 약 10% 미만의 고분자량 물질 및 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 당 1 이상의 고분자 스트랜드를 함유하는 물질을 생성한다. 상기 반응 조건은 고분자 콘쥬게이션 반응에서 통상적으로 사용되던 조건과는 대조적인 것이고, 여기서, 활성환 고분자는 목적 물질에 대해 수배의 초과 몰수로 존재한다. 본 발명의 다른 면에서, 고분자는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 1당량 당 약 0.1/아미노 기 내지 약 50 당량의 양으로 존재한다. 본 발명의 다른 면에서, 고분자는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 1당량 당 약 1 내지 약 10 당량의 양으로 존재한다. In another aspect of the invention, bifunctional activating PEG derivatives can be used to produce polymeric hGH or agonist variant-PEG molecules in which multiple hGH or agonist variant molecules are crosslinked via PEG. While the reaction conditions described herein can provide a significant amount of unmodified hGH or agonist variants thereof, the unmodified hGH or agonist variants thereof can be easily recycled to the next batch for further conjugation reactions. . The process of the invention produces surprisingly very small amounts, ie less than about 30%, more preferably less than about 10%, of high molecular weight materials and materials containing at least one polymeric strand per hGH or agonist variant thereof. The reaction conditions are in contrast to the conditions normally used in polymer conjugation reactions, where the active ring polymer is present in an excess molar number of times the desired material. In another aspect of the invention, the polymer is present in an amount from about 0.1 / amino groups to about 50 equivalents per equivalent of hGH or agonist variant thereof. In another aspect of the invention, the polymer is present in an amount of about 1 to about 10 equivalents per equivalent of hGH or agonist variant thereof.
본 발명의 콘쥬게이트 반응은 처음에 모노- 및 디-PEG-hGH 콘쥬게이트, 미반응 hGH, 미반응 고분자, 및 대개 약 20% 미만의 고분자량 종을 함유하는 반응 혼합물 또는 풀을 제공한다. 고분자량 종은 둘 이상의 고분자 가닥 및(또는) 중합된 PEG-hGH 또는 이의 아고니스트 변이체 종을 함유하는 콘쥬게이트를 포함한다. 미반응 종 및 고분자량 종이 제거된 후, 주로 모노- 및 디-고분자-hGH 또는 그 아고니스트 변이체 콘쥬게이트를 함유하는 조성물을 회수한다. 대부분 콘쥬게이트가 단일 고분자 가닥을 포함한다는 사실로 미루어 보면, 콘쥬게이트는 실질적으로 균질하다. 이들 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 표준 FDC-P1 세포 증식 검정법(클라크(Clark) 등 문헌[Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996), 수용체 결합 검정법(US 5,057,417) 또는 뇌하수체가 절제된 쥐 성장 (클라크, 문헌[Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996]) 을 사용하여 측정하는 경우 천연 또는 비개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체와 관련된 시험관 내 생물적 활성의 약 0.1% 이상을 갖는다. 그러나 본 발명의 선호되는 측면으로, 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 상기 시험관 내 생물적 활성의 약 25%를 갖고, 바람직하게는 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 상기 시험관 내 생물적 활성의 약 50%를 갖고, 더 바람직하게는 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 상기 시험관 내 생물적 활성의 약 75%를 갖고, 매우 바람직하게는 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 동등한 또는 개선된 시험관 내 생리활성을 갖는다.The conjugate reaction of the present invention initially provides a reaction mixture or pool containing mono- and di-PEG-hGH conjugates, unreacted hGH, unreacted polymers, and usually less than about 20% high molecular weight species. High molecular weight species include conjugates containing two or more high molecular strands and / or polymerized PEG-hGH or agonist variant species thereof. After the unreacted species and high molecular weight species have been removed, a composition containing mainly mono- and di-polymer-hGH or agonist variant conjugates is recovered. In view of the fact that most conjugates comprise a single polymer strand, the conjugates are substantially homogeneous. These modified hGH or agonist variants thereof are standard FDC-P1 cell proliferation assays (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996), receptor binding assays (US 5,057,417) or rats with excised pituitary glands. Have at least about 0.1% of the in vitro biological activity associated with natural or unmodified hGH or agonist variants when measured using growth (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996) . However, in a preferred aspect of the invention, the modified hGH or agonist variant thereof has about 25% of the biological activity in vitro, and preferably the modified hGH or agonist variant thereof is About 50%, more preferably the modified hGH or agonist variant thereof has about 75% of the biological activity in vitro, and very preferably the modified hGH or agonist variant thereof is equivalent or improved Has biological activity.
본 발명의 방법은 바람직하게는 고분자 대 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 다소 제한된 비를 포함한다. 따라서, hGH 또는 그 아고니스트 변이체와의 콘쥬게이트가 단지 한 가닥의 고분자만 함유하는 종에 주로 한정된다고 생각되어졌다. 더구나, 고분자의 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 반응성 기와의 부착이 더 많은 몰 과량의 고분자 링커가 사용되는 경우보다 실질적으로 덜 무작위적이다. 반응 풀 내에 존재하는 비개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는, 콘쥬게이트 반응이 켄칭된 후에, 이온 교환 또는 크기별 배제 크로마토그래피 또는 유사한 분리 기술을 사용하여 다음 반응으로 재생할 수 있다.The method of the invention preferably comprises a somewhat limited ratio of polymer to hGH or agonist variant thereof. Therefore, it was considered that conjugates with hGH or agonist variants thereof are mainly limited to species containing only one strand of polymer. Moreover, the attachment of the polymer to the hGH or its agonist variant reactive groups is substantially less random than when more molar excess of the polymer linker is used. Unmodified hGH or agonist variants thereof present in the reaction pool can be regenerated to the next reaction using ion exchange or size-specific exclusion chromatography or similar separation techniques after the conjugate reaction is quenched.
폴리(에틸렌 글리콜)-개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체, 즉 본 발명에 따른 화학적으로 개질된 단백질을 단백질의 정제에 사용되는 전통적인 방법, 예컨 대 투석, 염석, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 겔 크로마토그래피 및 전기영동에 의하여 반응 혼합물로부터 정제할 수있다. 이온 교환 크로마토그래피가 비반응 폴리(에틸렌 글리콜), 및 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 제거하는 데에 특히 효과적이다. 본 발명의 추가의 태양으로, 모노- 및 디-고분자-hGH 또는 그 아고니스트 변이체 종을 반응 혼합물로부터 단리하여 고분자량 종, 및 비개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 제거한다. 혼합된 종을 약 0.5-10mg/ml의 hGH 또는 그 아고니스트 변이체-고분자의 콘쥬게이트를 함유하는 버퍼 용액에 두어 분리시킨다. 적합한 용액은 pH가 약 4 내지 약 8이다. 용액은 바람직하게는 KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H 및 NaOH로부터 선택된 하나 이상의 버퍼 염을 함유한다.Poly (ethylene glycol) -modified hGH or agonist variants thereof, ie chemically modified proteins according to the invention, are used in the purification of proteins, eg dialysis, salting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, hydrophobicity It can be purified from the reaction mixture by interaction chromatography (HIC), gel chromatography and electrophoresis. Ion exchange chromatography is particularly effective at removing unreacted poly (ethylene glycol), and hGH or agonist variants thereof. In a further aspect of the invention, mono- and di-polymer-hGH or agonist variant species thereof are isolated from the reaction mixture to remove high molecular weight species and unmodified hGH or agonist variants thereof. The mixed species are separated by placing them in a buffer solution containing about 0.5-10 mg / ml of hGH or an agonist variant-polymer conjugate thereof. Suitable solutions have a pH of about 4 to about 8. The solution preferably contains at least one buffer salt selected from KCl, NaCl, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , NaBO 4 , CH 3 CO 2 H and NaOH. do.
반응 버퍼에 따라서, hGH 또는 그 아고니스트 변이체와 고분자의 콘쥬게이트 용액이 처음에 버퍼 교환/한외여과를 받아서 임의의 비반응 고분자를 제거하여야 할 수 있다. 예를 들어, PEG-hGH 또는 그 아고니스트 변이체와의 콘쥬게이트 용액을 저분자량 차단(10,000 내지 30,000 돌턴) 반투막을 통해서 한외여과하여 원치않는 물질의 대부분, 예컨대 비반응 고분자, 있다면 계면활성제 등을 제거한다.Depending on the reaction buffer, a conjugate solution of hGH or its agonist variant with the polymer may first be subjected to buffer exchange / ultrafiltration to remove any unreacted polymer. For example, ultrafiltration of a conjugated solution with PEG-hGH or its agonist variant through a low molecular weight blocking (10,000 to 30,000 Dalton) semipermeable membrane removes most of the unwanted material, such as unreacted polymers, surfactants if present. do.
콘쥬게이트를 원하는 종을 함유하는 풀로의 분배는 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피 매개를 사용하여 수행된다. 상기 매개는 PEG-hGH 또는 그 아고니스트 변이체와의 콘쥬게이트를 다소 예상가능하게 변하는 전하의 차이를 통하여 선택적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 표면 전 하는 단백질의 표면의 가능한 전하가 있는 기들의 수에 의하여 결정된다. 이들 전하가 있는 기들은 전형적으로 폴리(알킬렌 옥사이드) 고분자의 전위 부착의 지점으로 작용한다. 따라서, hGH 또는 그 아고니스트 변이체와의 콘쥬게이트는 다른 종들과는 다른 전하를 가질 것이며 선택적인 단리를 가능하게 한다.The distribution of the conjugate to the pool containing the desired species is preferably performed using ion exchange chromatography media. The mediator can selectively bind conjugates with PEG-hGH or agonist variants thereof through a difference in charge that changes somewhat predictably. For example, the surface charge of hGH or its agonist variant is determined by the number of possible charge groups on the surface of the protein. These charged groups typically serve as points of potential attachment of the poly (alkylene oxide) polymer. Thus, conjugates with hGH or agonist variants thereof will have a different charge than other species and allow for selective isolation.
강한 극성 음이온 또는 양이온 교환 수지, 예컨대 각각 4차 아민 또는 술포프로필 수지가 본 발명의 방법을 위해 사용된다. 이온 교환 수지가 특히 바람직하다. 본 발명에 사용하기 적합한 상업적으로 시판되는 양이온 교환 수지를 비제한적으로 나열하면 SP-히트랩(SP-hitrap)(등록상표), SP 세파로스 HP(SP Sepharose HP)(등록상표), 및 SP 세파로스(등록상표) 패스트 플로우(fast flow)가 있다. 다른 적합한 양이온 교환 수지, 예를 들어 S 및 CM 수지도 사용될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 상업적으로 시판되는 음이온 교환 수지의 비제한적으로 나열하면 Q-히트랩(등록상표), Q 세파로스 HP(등록상표), 및 Q 세파로스(등록상표) 패스트 플로우가 있다. 다른 적합한 음이온 교환 수지, 예를 들어 DEAE 수지도 사용될 수 있다. Strong polar anion or cation exchange resins such as quaternary amine or sulfopropyl resins respectively are used for the process of the present invention. Ion exchange resins are particularly preferred. Commercially available cation exchange resins suitable for use in the present invention include, but are not limited to, SP-hitrap®, SP Sepharose HP®, and SP three. Paros® fast flow. Other suitable cation exchange resins such as S and CM resins may also be used. Non-limiting listings of commercially available anion exchange resins suitable for use in the present invention include Q-Hraplab®, Q Sepharose® HP, and Q Sepharose® Fast Flow. Other suitable anion exchange resins such as DEAE resin can also be used.
예를 들어, 음이온 또는 양이온 교환 수지는 바람직하게 칼럼에 채워지고, 통상적인 수단에 의하여 평형화될 수 있다. 고분자 콘쥬게이트된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 용액과 동일한 pH 및 삼투압의 버퍼가 사용된다. 용출 완충액은 바람직하게는 KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, 및 (NH4)2CO3 로부터 선택된 하나 이상의 염을 함유한다. 다음에 콘쥬게이트-함유 용 액은 칼럼 위에서 비반응 고분자와 흡착되고, 일부 고분자량 종은 계속 유지되지 않는다. 로딩의 종결시에, 염의 증가되는 농도로 구배되는 유동을 칼럼에 가하여 원하는 폴리알킬렌 옥사이드-콘쥬게이트된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 분획을 용출한다. 양이온 또는 음이온 교환 분리 단계 후에 용출된 모인 분획들은 균일 고분자 콘쥬게이트로 한정되는 것이 바람직하다. 다음에 임의의 콘쥬게이트 되지 않는 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 종은 통상적인 기술에 의하여 칼럼으로부터 후세척될 수 있다. 원한다면, 모노 및 다중 PEG가 부착된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 종을 부가적으로 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기별 배제 크로마토그래피를 통하여 추가로 서로 분리할 수 있다.For example, the anion or cation exchange resin is preferably filled in a column and can be equilibrated by conventional means. The same pH and osmotic buffer as the polymer conjugated hGH or agonist variant solution thereof is used. The elution buffer preferably contains one or more salts selected from KCl, NaCl, K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , NaBO 4 , and (NH 4 ) 2 CO 3 . It contains. The conjugate-containing solution is then adsorbed with the unreacted polymer on the column and some high molecular weight species are not retained. At the end of the loading, a flow that is gradient to an increasing concentration of salt is added to the column to elute the fraction of the desired polyalkylene oxide-conjugated hGH or agonist variant thereof. The pooled fractions eluted after the cation or anion exchange separation step are preferably limited to homogeneous polymer conjugates. Any non-conjugated hGH or agonist variant species thereof can then be post washed from the column by conventional techniques. If desired, mono and multiple PEG attached hGH or agonist variant species can be further separated from one another via additional ion exchange chromatography or size-specific exclusion chromatography.
염의 농도나 pH를 증가시키는 다중 등용매 단계를 사용하는 기술도 사용할 수 있다. 농도를 증가하는 다중 등용매 용출 단계로 디- 및 다음에 모노-hGH 또는 그 아고니스트 변이체-고분자의 콘쥬게이트의 연속적인 용출을 얻을 수 있다.Techniques using multiple isocratic steps that increase salt concentration or pH may also be used. Multiple isocratic elution steps of increasing concentrations can result in continuous elution of the conjugates of the di- and then mono-hGH or agonist variant-polymers thereof.
용출에 대한 온도 범위는 약 4℃ 내지 약 25℃이다. 바람직하게는, 용출은 약 4℃ 내지 약 22℃의 온도에서 수행된다. 예를 들어, PEG-hGH 또는 그 아고니스트 변이체 분획의 용출을 280nm의 자외선 흡광도에서 검출된다. 분획 수집은 단순 시간 용출 프로파일을 통하여 달성할 수 있다. The temperature range for elution is from about 4 ° C to about 25 ° C. Preferably, the elution is carried out at a temperature of about 4 ° C to about 22 ° C. For example, elution of PEG-hGH or agonist variant fractions thereof is detected at ultraviolet absorbance at 280 nm. Fraction collection can be achieved through a simple time elution profile.
폴리(에틸렌 글리콜) 고분자와 hGH 또는 그 아고니스트 변이체 잔기를 콘쥬게이트하는 과정에서 계면활성제를 사용할 수 있다. 적합한 계면활성제로 이온형 제제, 예컨대 소듐 도데실 술페이트(SDS)를 포함한다. 다른 이온 계면활성제, 예컨대 리튬 도데실 술페이트, 사차 암모늄 화합물, 타우로콜산, 카프릴산, 데칸 술 폰산, 등도 사용할 수 있다. 비이온 계면활성제도 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리(옥시에틸렌) 소르비탄 (트윈류), 폴리(옥시에틸렌) 에테르(트리톤류)와 같은 물질이 사용될 수 있다. 또한, 노이게바우어(Neugebauer) 문헌[A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992), Calbiochem Corp.]를 참조한다. 본 발명에 사용되는 계면활성제에 대한 유일한 제한으로 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 실질적인 비가역적인 변성을 야기하지 않고 고분자 콘쥬게이트을 완전히 억제하지 않는 농도 및 조건에서 사용한다는 것이다. 계면활성제는 반응 혼합물에서 약 0.01-0.5%, 바람직하게는 0.05-0.5%, 및 매우 바람직하게는 약 0.075-0.25%의 양으로 존재한다. 계면활성제의 혼합물도 또한 고려된다.Surfactants may be used in the process of conjugating poly (ethylene glycol) polymers with hGH or agonist variant residues thereof. Suitable surfactants include ionic agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS). Other ionic surfactants such as lithium dodecyl sulfate, quaternary ammonium compounds, taurocholic acid, caprylic acid, decane sulfonic acid, and the like can also be used. Nonionic surfactants may also be used. For example, materials such as poly (oxyethylene) sorbitan (twins), poly (oxyethylene) ethers (tritones) can be used. See also, Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992), Calbiochem Corp. The only limitation to the surfactants used in the present invention is that they are used at concentrations and conditions that do not cause substantial irreversible denaturation of hGH or its agonist variants and do not completely inhibit the polymer conjugate. The surfactant is present in the reaction mixture in an amount of about 0.01-0.5%, preferably 0.05-0.5%, and very preferably about 0.075-0.25%. Mixtures of surfactants are also contemplated.
계면활성제가 고분자 콘쥬게이트 과정 동안 일시적, 가역적인 보호 시스템을 제공한다고 생각된다. 계면활성제는 라이신-기초 또는 아미노 말단 기초 콘쥬게이트이 진행되도록 하는 동안 고분자 응집을 선택적으로 방해하는 데에 효과적임을 보여준다. It is believed that the surfactant provides a temporary, reversible protection system during the polymer conjugate process. Surfactants have been shown to be effective at selectively interfering with polymer aggregation while allowing lysine-based or amino terminal based conjugates to proceed.
본 폴리(에틸렌 글리콜)-개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 아마도 생체 내에서 연장된 반감기에 기인하는 더 지속적인 약리 효과를 갖는다.The present poly (ethylene glycol) -modified hGH or agonist variants thereof have a more sustained pharmacological effect, possibly due to extended half-life in vivo.
또한, 본 폴리(에틸렌 글리콜) 개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체는 성장 호르몬 결핍증(GHD), 어른 성장 호르몬 결핍, 터너 증후군, 임신 기간 동안에 작게 태어난 아이의 성장 실패(SGA), 프라더 윌리 증후군(PWS), 만성 신장 기능부족 (CRI), 에이즈 쇠약 및 노화의 치료에 유용할 수 있다.In addition, this poly (ethylene glycol) modified hGH or agonist variant thereof may be used for growth hormone deficiency (GHD), adult growth hormone deficiency, Turner syndrome, growth failure of small born children during pregnancy (SGA), Prader Willy syndrome ( PWS), chronic renal insufficiency (CRI), AIDS weakness and aging.
이를 환자에게 투여하기 위하여, 본 폴리(에틸렌 글리콜)-개질된 hGH 또는 그 아고니스트 변이체를 제약적으로 허용되는 희석제, 등장액을 제조하기 위한 제제, pH-조절제 등을 함유하는 제약물로 제제화 할 수 있다.To administer it to a patient, the present poly (ethylene glycol) -modified hGH or agonist variant thereof may be formulated into a pharmaceutical formulation containing a pharmaceutically acceptable diluent, preparation for the preparation of isotonic solutions, pH-adjusting agents, and the like. .
상기 제약물은 치료 목적에 따라 피하, 근육내, 정맥내, 폐로, 피부내, 또는 경구로 투여될 수 있다. 투여량은 치료하고자 하는 환자의 질환의 상태 및 종류에 기초할 수 있고, 어른에 대해 보통 0.1mg 내지 5mg 주입량 및 0.1mg 내지 50mg의 경구 투여량일 수 있다.The pharmaceutical can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously, pulmonary, intradermal, or orally depending on the therapeutic purpose. The dosage can be based on the condition and type of disease of the patient to be treated, and can usually be from 0.1 mg to 5 mg infusion and 0.1 mg to 50 mg oral dosage for adults.
포함되는 고분자 물질은 또한 바람직하게는 상온에서 수용성일 수 있다. 이런 고분자를 비제한적으로 나열하면, 폴리(알킬렌 옥사이드) 단독고분자 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(옥시에틸렌화 폴리올), 이들의 공고분자 및 블록 공고분자의 수 용해도가 유지된다는 조건으로 이들의 블록 공고분자를 포함한다. The polymeric material included may also be water soluble, preferably at room temperature. Non-limiting examples of such polymers include water solubility of poly (alkylene oxide) homopolymers such as poly (ethylene glycol) or poly (propylene glycol), poly (oxyethylenated polyols), their co- and block co-polymers. On their condition that they are retained.
PEG-기재 고분자의 대체물로서 유효한 비항원 물질, 예컨대 덱스트란, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(아크릴아미드), 폴리(비닐 알콜), 카르보하이드레이트 기재 고분자 등이 사용될 수 있다. 실로, 이들 고분자 물질의 α- 및 ω-말단 기의 활성화를 폴리(알킬렌 옥사이드)를 전환하는 데에 사용하는 것과 유사한 방식으로 할 수 있고 이는 당업자에게 자명할 것이다. 당업자는 상기의 나열이 단지 예시적이고, 본원에서 기술한 양을 갖는 모든 고분자 물질을 예기할 수 있을 것이다. 본 발명의 목적상, "효과적으로 비항원적"이란 당업계에서 이해되는 비독성이고 포유류에서 명백한 항원 반응을 도출하지 않는 모든 물질을 의미한다.Effective non-antigens such as dextran, poly (vinyl pyrrolidone), poly (acrylamide), poly (vinyl alcohol), carbohydrate based polymers and the like can be used as substitutes for PEG-based polymers. Indeed, activation of the α- and ω-terminal groups of these polymeric materials can be done in a manner similar to that used to convert poly (alkylene oxides) and will be apparent to those skilled in the art. Those skilled in the art will be able to anticipate all polymeric materials having the amounts described herein above are illustrative only. For the purposes of the present invention, "effectively non-antigenic" means any substance which is understood in the art and which does not elicit an apparent antigenic response in mammals.
용어의 정의Definition of Terms
다음은 약어와 본원에서 상호교환적으로 사용되는 대응 의미의 목록이다:The following is a list of abbreviations and their corresponding meanings used interchangeably herein:
g 그람g gram
mg 밀리그람mg milligram
ml 또는 mL 밀리리터ml or mL milliliters
RT 실온RT room temperature
PEG 폴리(에틸렌 글리콜)PEG poly (ethylene glycol)
여기에 개시된 모든 공개, 특허 및 특허 출원의 완전한 내용은 각 개별 공개, 특허, 또는 특허출원이 참고로 혼입되도록 구체적이고 개별적으로 나타낸 것처럼 참고로 혼입되어 있다.The complete contents of all publications, patents, and patent applications disclosed herein are incorporated by reference as if specifically and individually indicated that each individual publication, patent, or patent application is incorporated by reference.
비록 앞선 발명은 이해의 명료함을 목적으로 예시 및 실시예에 의하여 상세하게 기술하였지만, 본 발명의 교시를 비추어 보면 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 변화 및 변형이 가능함이 당업자에게는 충분히 자명할 것이다. 다음의 실시예는 예시의 목적으로만 제공되고, 상기 가장 넓은 의미로 기술된 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.Although the foregoing invention has been described in detail by way of examples and examples for purposes of clarity of understanding, it will be apparent to those skilled in the art that changes and modifications may be made without departing from the spirit and scope of the invention in light of the teachings of the invention. . The following examples are provided for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention described in its broadest sense.
다음의 실시예에서, hGH는 서열 번호(SEQ ID) 제 1의 것이다. 폴리펩티드 군의 hGH 또는 그 아고니스트 변이체의 다른 일원도 다음의 실시예에서 예시된 것과 같은 방식으로 PEG가 부착될 수 있다.In the following examples, hGH is SEQ ID NO (SEQ ID) first. PEG or other members of the hGH or agonist variant thereof of the polypeptide group may be attached in the same manner as illustrated in the following examples.
본원에서 인용된 모든 참고문헌, 특허 또는 출원은 본원에서 전체로서 모두 쓰여진 것처럼 혼입되어 있다.All references, patents, or applications cited herein are incorporated as if written herein in their entirety.
본 발명의 범위를 제한하고자 해석되지 않는 다음의 실시예를 통해 본 발명은 더욱 예시될 것이다.The invention will be further illustrated by the following examples which are not to be construed as limiting the scope of the invention.
[실시예]EXAMPLE
실시예 1Example 1
직쇄 분자량 20,000의 PEG-ALD hGHPEG-ALD hGH with a linear molecular weight of 20,000
실시예 1은 환원적 알킬화에 의해 N-말단에 1개의 PEG가 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. 라이신 잔기의 N-말단에 있는 1차 아민의 상대적 pKa 값과 ε-아미노 위치에 있는 1차 아민의 상대적 pKa 값의 차이를 이용하여 환원적 아민화를 통해 분자량이 약 20,000인 메톡시-직쇄 PEG-프로피온알데히드 반응물(Shearwater Corp.)을 hGH의 N-말단에 선택적으로 커플링했다. pH 6.0의 25 mM MES(Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7.0의 25 mM Hepes(Sigma Chemical, St. Louis, MO), 또는 pH 4.5의 10 mM 소듐 아세테이트(Sigma Chemical, St. Louis, MO)에 10 mg/mL로 용해시킨 hGH 단백질에 M-PEG-ALD를 첨가하여 메톡시-PEG-프로피온알데히드, M-PEG-ALD(Shearwater Corp., Huntsville, AL)와 반응시켜 아민에 대한 PEG:hGH 상대적 몰비 0.1:0.7을 얻었다(임의로 8% 아세토니트릴을 첨가할 수도 있다). H20에 용해시킨 1M NaCNBH4 모액(Sigma Chemical, St. Louis, MO)을 첨가하여 반응을 촉매화하여 최종 농도 10-50 mM을 얻었다. 반응은 18-24시간 동안 4℃ 내지 실온에서 어두운 곳에서 수행하였 다. pH 약 7.6의 1M 트리스(Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 최종 농도 50 mM까지 첨가하여 반응을 종결시키거나 또는 다음 정제를 위해 적당한 버퍼에 희석시켰다.Example 1 shows a method for producing substantially homogeneous hGH with one PEG attached to the N-terminus by reductive alkylation. Methoxy- straight PEG having a molecular weight of about 20,000 through reductive amination using the difference between the relative pKa value of the primary amine at the N-terminus of the lysine residue and the relative pKa value of the primary amine at the ε-amino position. Propionaldehyde reactant (Shearwater Corp.) was selectively coupled to the N-terminus of hGH. 25 mM MES at pH 6.0 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), 25 mM Hepes at pH 7.0 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), or 10 mM sodium acetate at pH 4.5 (Sigma Chemical, St. Louis, M-PEG-ALD was added to hGH protein dissolved at 10 mg / mL in MO) and reacted with methoxy-PEG-propionaldehyde and M-PEG-ALD (Shearwater Corp., Huntsville, AL) to PEG for amines. A relative molar ratio of: hGH of 0.1: 0.7 was obtained (optionally 8% acetonitrile may be added). 1 M NaCNBH 4 mother liquor (Sigma Chemical, St. Louis, MO) dissolved in
실시예 2Example 2
직쇄 분자량 30,000의 PEG-ALD hGHPEG-ALD hGH with a linear molecular weight of 30,000
실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 메톡시-직쇄 분자량 30,000의 PEG-프로피온알데히드 반응물(Shearwater Corp.)를 hGH의 N-말단에 커플링했다.The method described in Example 1 was used to couple PEG-propionaldehyde reactants (Shearwater Corp.) with a methoxy- straight chain molecular weight of 30,000 to the N-terminus of hGH.
실시예 3Example 3
직쇄 분자량 5,000의 PEG-ALD hGHPEG-ALD hGH with a linear molecular weight of 5,000
실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 메톡시-직쇄 분자량 5,000의 PEG-프로피온알데히드 반응물(Fluka)를 hGH의 N-말단에 커플링했다.The PEG-propionaldehyde reactant (Fluka) of methoxy- straight chain molecular weight 5,000 was coupled to the N-terminus of hGH using the method described in Example 1.
실시예 4Example 4
분지쇄 분자량 40,000의 PEG-ALD hGHPEG-ALD hGH with a branched chain molecular weight of 40,000
실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 메톡시-분지쇄 분자량 40,000의 PEG-알데히드(PEG2-ALD) 반응물(Shearwater Corp.)를 hGH의 N-말단에 커플링했다.The method described in Example 1 was used to couple a PEG-aldehyde (PEG2-ALD) reactant (Shearwater Corp.) with a methoxy-branched molecular weight of 40,000 to the N-terminus of hGH.
실시예 5Example 5
분지쇄 분자량 20,000의 PEG-ALD hGHPEG-ALD hGH with branched molecular weight 20,000
실시예 1에 기재된 방법을 사용하고 아민을 기준으로 hGH에 대한 PEG의 몰비를 0.1 내지 0.5로 하여 메톡시-분지쇄 분자량 20,000의 PEG-알데히드(PEG2-ALD) 반응물(Shearwater Corp.)를 hGH의 N-말단에 커플링했다.A PEG-aldehyde (PEG2-ALD) reactant (Shearwater Corp.) with a methoxy-branched chain molecular weight of 20,000 was prepared using the method described in Example 1 and the molar ratio of PEG to hGH based on amines of 0.1 to 0.5. Coupling to the N-terminus.
실시예 6Example 6
직쇄 분자량 30,000의 SPA-PEG hGHSPA-PEG hGH with linear molecular weight 30,000
실시예 6은 N-히드록시숙신이미딜(NHS) 활성 에스테르를 이용하여 PEG가 1개 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. hGH 단백질 모액 용액을 pH 7.2의 0.25 M HEPES 완충액에 10 mg/mL로 용해시켰다(임의로 8% 아세토니트릴을 첨가할 수도 있다). 다음, SPA-PEG를 첨가하여 상기 용액을 메톡시-PEG-숙신이미딜 프로피오네이트(SPA-PEG)와 반응시켜 아민에 대한 PEG:hGH 상대적 몰비 0.1-0.65를 얻었다. 반응은 5분 내지 1시간 동안 4℃ 내지 실온에서 수행하였다. 0.1N 아세트산으로 pH를 4.0까지 낮추거나 5배몰 과량의 트리스 HCl을 첨가함으로써 반응을 종결시켰다.Example 6 shows how to prepare a substantially uniform hGH with one PEG attached using an N-hydroxysuccinimidyl (NHS) active ester. The hGH protein stock solution was dissolved at 10 mg / mL in 0.25 M HEPES buffer at pH 7.2 (optionally 8% acetonitrile may be added). SPA-PEG was then added to react the solution with methoxy-PEG-succinimidyl propionate (SPA-PEG) to obtain a relative molar ratio of PEG: hGH of 0.1 to 0.1-0.65. The reaction was carried out at 4 ° C. to room temperature for 5 minutes to 1 hour. The reaction was terminated by lowering the pH to 4.0 with 0.1 N acetic acid or adding 5 times molar excess of Tris HCl.
실시예 7Example 7
직쇄 분자량 20,000의 SPA-PEG hGHSPA-PEG hGH with linear molecular weight 20,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 직쇄 분자량 20,000의 SPA-PEG 반응물 (Shearwater Corp.)를 hGH의 N-말단에 커플링했다.The SPA-PEG reactant (Shearwater Corp.) with a molecular weight of 20,000 was coupled to the N-terminus of hGH using the method described in Example 6.
실시예 8Example 8
직쇄 분자량 3,400의 바이오틴-SPA-PEG hGHBiotin-SPA-PEG hGH with straight chain molecular weight 3,400
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 3,400의 바이오틴-SPA-PEG-CO2-NHS 반응물(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다.The biotin-SPA-PEG-CO 2 -NHS reactant (Shearwater Corp.) of molecular weight 3,400 was coupled to hGH using the method described in Example 6.
실시예 9Example 9
분지쇄 분자량 10,000의 NHS-PEG hGHNHS-PEG hGH of Branched Chain Molecular Weight 10,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 10,000의 PEG2-NHS(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다.PEG2-NHS (Shearwater Corp.) having a molecular weight of 10,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6.
실시예 10Example 10
분지쇄 분자량 20,000의 NHS-PEG hGHNHS-PEG hGH with Branched Chain Molecular Weight 20,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 20,000의 PEG2-NHS(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다.PEG2-NHS (Shearwater Corp.) with a molecular weight of 20,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6.
실시예 11Example 11
분지쇄 분자량 40,000의 NHS-PEG hGHNHS-PEG hGH with Branched Chain Molecular Weight 40,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 40,000의 분지쇄 PEG2-NHS(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다.Branched chain PEG2-NHS (Shearwater Corp.) having a molecular weight of 40,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6.
실시예 12Example 12
직쇄 분자량 20,000의 PEG-BTC-hGHPEG-BTC-hGH with a linear molecular weight of 20,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 20,000의 PEG-BTC(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다. 실시예 12는 PEG의 벤조트리아졸 카르보네이트 유도체를 사용하여 PEG가 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. PEG-BTC (Shearwater Corp.) with a molecular weight of 20,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6. Example 12 shows how a benzotriazole carbonate derivative of PEG produces a substantially uniform PEG-attached hGH.
실시예 13Example 13
직쇄 분자량 5,000의 PEG-SS-hGHPEG-SS-hGH with a linear molecular weight of 5,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 5,000의 숙신이미딜 숙시네이트-PEG(SS-PEG)(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다. 실시예 13은 가수분해가능한 결합을 이용하여 PEG가 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. Succinimidyl succinate-PEG (SS-PEG) (Shearwater Corp.) of molecular weight 5,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6. Example 13 shows a method for producing PEG-attached hGH substantially uniformly using hydrolyzable bonds.
실시예 14Example 14
직쇄 분자량 20,000의 PEG-CM-HBA-hGHPEG-CM-HBA-hGH with straight chain molecular weight 20,000
실시예 6에 기재된 방법을 사용하여 분자량 20,000의 카르복시메틸 히드록시부티르산-PEG(CM-HBA-PEG)(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다. 실시예 14는 가수분해가능한 결합을 이용하여 PEG가 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. Carboxymethyl hydroxybutyric acid-PEG (CM-HBA-PEG) (Shearwater Corp.) having a molecular weight of 20,000 was coupled to hGH using the method described in Example 6. Example 14 shows a method for producing PEG-attached hGH substantially uniformly using hydrolyzable bonds.
실시예 15Example 15
직쇄 2-4x 분자량 5,000의 PEG-CM-HBA-hGHPEG-CM-HBA-hGH with straight chain 2-4x molecular weight 5,000
실시예 13에 기재된 방법을 사용하여 분자량 5,000의 PEG-CM-HBA(Shearwater Corp.)를 hGH에 커플링했다.PEG-CM-HBA (Shearwater Corp.) having a molecular weight of 5,000 was coupled to hGH using the method described in Example 13.
실시예 16Example 16
직쇄 분자량 20,000의 HZ-PEG-hGHHZ-PEG-hGH with straight chain molecular weight 20,000
PEG-OCH2CONHNH2 PEG-OCH 2 CONHNH 2
실시예 16은 분자량 20,000의 메톡시-PEG-히드라지드, HZ-PEG(Shearwater Corp.)를 사용하여 PEG가 부착된 hGH를 실질적으로 균일하게 제조하는 방법을 보여 주는 것이다. hGH 단백질 모액 용액을 pH 4.0의 10 mM MES에 10 mg/mL로 용해시켰다. 다음, HZ-PEG 덩어리를 첨가하여 상기 용액을 HZ-PEG와 반응시켜 카르복실기에 대한 PEG:hGH 상대적 몰비 0.1-5.0을 얻었다. 카르보디이미드(EDC, EOAC, EDEC)로 반응을 촉매화하여 최종 농도 2 mM 내지 4 mM을 얻었다. 반응은 4℃에서 2시간 내지 밤새도록 또는 실온에서 10분 내지 밤새도록 수행하였다. 양이온 교환으로 정제함으로써 콘주게이션되지 않은 PEG와 카르보디이미드를 제거하여 반응을 종결시켰다.Example 16 shows a method for producing PEG-attached hGH substantially uniformly using methoxy-PEG-hydrazide, HZ-PEG (Shearwater Corp.) with a molecular weight of 20,000. The hGH protein stock solution was dissolved at 10 mg / mL in 10 mM MES at pH 4.0. Next, the solution was reacted with HZ-PEG by adding HZ-PEG mass to obtain a relative molar ratio of PEG: hGH of 0.1-5.0 to carboxyl groups. The reaction was catalyzed with carbodiimide (EDC, EOAC, EDEC) to give a final concentration of 2 mM to 4 mM. The reaction was carried out at 4 ° C. for 2 hours to overnight or at room temperature for 10 minutes to overnight. Purification by cation exchange terminated the reaction by removing unconjugated PEG and carbodiimide.
실시예 17Example 17
PEG가 다중 부착된 종PEG-attached species
실시예 1 및 4에서는 PEG가 2개 이상 부착된 변형된 hGH도 얻었고, 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 PEG가 1개 부착된 종으로부터 분리하였다. PEG가 2개 이상 부착된 변형된 hGH는 또한 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여서도 PEG가 1개 부착된 종으로부터 분리하였다. PEG가 2개 이상 부착된 변형된 hGH는 또한 실시예 2, 3, 5-13에서도 얻었고, 실시예 1 및 4와 유사한 방법으로 정제하였 다.In Examples 1 and 4 modified hGH with two or more PEGs attached were also obtained, and anion exchange chromatography was used to isolate from the species with one PEG attached. Modified hGH with two or more PEGs attached was also isolated from species with one PEG attached using cation exchange chromatography. Modified hGH with two or more PEGs attached was also obtained in Examples 2, 3, 5-13, and purified in a similar manner to Examples 1 and 4.
실시예 18Example 18
PEG가 부착된 hGH의 정제Purification of hGH with PEG attached
단일 이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 PEG가 부착된 hGH 종을 반응 혼합물로부터 95% 이상 정제하였다(SEC 분석).PEG-attached hGH species were purified at least 95% from the reaction mixture using a single ion exchange chromatography step (SEC analysis).
<음이온 교환 크로마토그래피>Anion Exchange Chromatography
단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 사용하여 PEG hGH 종을 반응 혼합물로부터 95% 이상 정제하였다(SEC 분석). 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 PEG가 1개 부착된 hGH를 변형되지 않은 hGH 및 PEG가 다중 부착된 hGH 종으로부터 정제하였다. 앞에서 언급한 전형적인 20K 알데히드 hGH 반응 혼합물(5-100 mg 단백질)을 pH 7.3의 25 mM HEPES(완충액 A)로 평형을 이룬 Q-세파로즈 하이트랩 칼럼(1 또는 5 mL)(Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 또는 Q-세파로즈 고속 유동 칼럼(26/20, 70 mL 베드 부피)(Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)에서 정제하였다. 상기 반응 혼합물을 완충액 A로 5-10배 희석시키고, 2.5 mL/분의 유속으로 칼럼 위에 로딩하였다. 칼럼을 칼럼 8배 부피의 완충액 A로 세척하였다. 이어서, 0-100 mM의 NaCl 선형 구배를 갖는 칼럼에서 이 칼럼 부피의 80 내지 100배의 완충액 A로 다양한 hGH 종을 용출시켰다. 용리액을 280 nm(A280)의 흡광도에서 관찰하고, 5 mL의 분획을 모았다. 분획은 PEG 부착 정도가 예를 들면 1, 2, 3 등인 것까지 모았다(실시예 15에서 평가한 것처럼). 모은 분획 을 센트리프렙(Centriprep) YM10 농축기(Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA)에서 0.5 내지 5 mg/mL까지 농축했다. 모은 분획의 단백질 농도를 흡광 계수 0.78을 사용하여 A280으로 측정하였다. 이 과정에서 얻은 정제된 모노 20K PEG-알데히드 hGH의 총수율은 25 내지 30% 이었다.PEG hGH species were purified at least 95% from the reaction mixture using a single anion exchange chromatography step (SEC analysis). Anion exchange chromatography was used to purify hGH with one PEG attached from unmodified hGH and hGH species with multiple PEG attachments. A typical 20K aldehyde hGH reaction mixture (5-100 mg protein) mentioned above was Q-Sepharose Hitrap column (1 or 5 mL) equilibrated with 25 mM HEPES (buffer A) at pH 7.3 (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway). , NJ) or Q-Sepharose high flow column (26/20, 70 mL bed volume) (Amershan Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). The reaction mixture was diluted 5-10 times with Buffer A and loaded onto the column at a flow rate of 2.5 mL / min. The column was washed with 8 volumes of column buffer A. Subsequently, various hGH species were eluted with a buffer A of 80-100 times the volume of this column in a column with a NaCl linear gradient of 0-100 mM. Eluent was observed at absorbance of 280 nm (A 280 ) and 5 mL fractions collected. Fractions were collected to the extent of PEG attachment, for example 1, 2, 3, etc. (as assessed in Example 15). The combined fractions were concentrated to 0.5-5 mg / mL in a Centrirep YM10 concentrator (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA). The protein concentration of the collected fractions was measured by A 280 using an extinction coefficient of 0.78. The total yield of purified
<양이온 교환 크로마토그래피><Cation Exchange Chromatography>
양이온 교환 크로마토그래피는 pH 4.0의 소듐 아세테이트 10 mM (버퍼 B)로 평형을 이룬 SP 세파로즈 고성능 칼럼(Pharmacia XK 26/20, 70 mL 베드 부피)에서 수행하였다. 상기 반응 혼합물을 완충액 B로 10배 희석시키고, 5 mL/분의 유속으로 칼럼 위에 로딩하였다. 칼럼을 칼럼 5배 부피의 완충액 B로 세척하고, 이어서 칼럼 5배 부피의 12% 완충액 C(10 mM 아세테이트 pH 4.5, 1M NaCl)로 세척하였다. 이어서, 12 내지 27%의 완충액 C 선형 구배를 갖는 칼럼에서 이 칼럼 부피의 20배로 PEG-hGH 종을 용출시켰다. 용리액을 280 nm에서 관찰하고, 10 mL의 분획을 모았다. 분획은 PEG 부착 정도(1, 2, 3 등)에 따라 모으고, pH 4.5의 10 mM 아세테이트 완충액에 교환해 넣고, 아미콘(Amicon) YM10 멤브레인을 부착한 교반 셀에서 1-5 mg/mL까지 농축시켰다. 모은 분획의 단백질 농도는 흡광 계수 0.78을 사용하여 A280으로 측정하였다. 이 과정에서 얻은 정제된 모노 PEG 부착 hGH의 총수율은 10 내지 50% 이었다.Cation exchange chromatography was performed on an SP Sepharose high performance column (Pharmacia XK 26/20, 70 mL bed volume) equilibrated with 10 mM sodium acetate (Buffer B) at pH 4.0. The reaction mixture was diluted 10-fold with Buffer B and loaded onto the column at a flow rate of 5 mL / min. The column was washed with
실시예 19Example 19
<생화학적 특성><Biochemical Characteristics>
정제된 PEG 부착 hGH 분획의 특성을 환원 및 비환원 SDS-PAGE, 변성 및 비변성 크기 배제 크로마토그래피, 분석 음이온 교환 크로마토그래피, N-말단 시퀀싱, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 역상 HPLC로 조사하였다.The purified PEG-attached hGH fractions were characterized by reduced and non-reduced SDS-PAGE, modified and unmodified size exclusion chromatography, analytical anion exchange chromatography, N-terminal sequencing, hydrophobic interaction chromatography and reversed phase HPLC.
<크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)><Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography (SEC-HPLC)>
비변성 SEC-HPLCUnmodified SEC-HPLC
비변성 SEC-HPLC를 사용하여 다양한 결합 화학, 크기, 링커(linker) 및 기하학적 배치를 갖는 메톡시-PEG와 hGH의 반응, 음이온 교환 정제 풀(pool), 및 최종 정제품을 평가하였다. 분석 비변성 SEC-HPLC는 토소하스(Tosohaas) G4000PWXL 칼럼, 7.8 mm x 30 cm(Tosohaas Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) 또는 수퍼덱스(Superdex) 200(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)를 사용하여 0.5 mL/분의 유속으로 pH 7.2의 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl에서 수행하였다. PEG화는 단백질의 유체역학적 부피(hydrodynamic volume)을 크게 증가시키고, 결과적으로 체제 시간을 감소시켰다. 변형되지 않은 hGH와 함께 새로운 종들도 PEG 알데히드 hGH 반응 혼합물에서 관찰되었다. 이들 PEG 부착 및 미부착 종들을 Q-세파로즈 크로마토그래피에서 분리하였다. 생성된 정제된 모노 PEG-알데히드 hGH 종들은 차례로 용출되어 비변성 SEC에서 단일 피크를 나타내는 것으로 관찰되었다(>95% 순도). Q-세파로즈 크로마토그래피 단계는 PEG가 1개 부착된 hGH에서 유리 PEG, hGH, PEG가 복수개 부착된 hGH 종들을 효과적으로 분리하였다. 비변성 SEC-HPLC는 다양한 PEG 부착 hGH의 유효 크기는 이들 각각의 이론적 분자량보다 훨씬 크다는 것을 보여주었다(표 1).Unmodified SEC-HPLC was used to evaluate the reaction of methoxy-PEG with hGH, anion exchange purification pool, and final product with various binding chemistries, sizes, linkers, and geometric configurations. Analytical undenatured SEC-HPLC using a Tosohaas G4000PWXL column, 7.8 mm x 30 cm (Tosohaas Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) or Superdex 200 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) It was performed in 20 mM phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.2 at a flow rate of minutes. PEGylation significantly increased the hydrodynamic volume of the protein and consequently reduced the settling time. New species along with unmodified hGH were also observed in the PEG aldehyde hGH reaction mixture. These PEG attached and unattached species were separated in Q-Sepharose chromatography. The resulting purified mono PEG-aldehyde hGH species were eluted in turn, showing a single peak in undenatured SEC (> 95% purity). The Q-Sepharose chromatography step effectively separated free PEG, hGH, hGH species with multiple PEG attachments from hGH with one PEG attachment. Unmodified SEC-HPLC showed that the effective size of the various PEG attached hGH was much larger than their respective theoretical molecular weights (Table 1).
변성 SEC-HPLCDenatured SEC-HPLC
다양한 메톡시-PEG와 hGH과의 반응, 음이온 교환 정제 및 최종 정제된 산물을 변성 SEC-HPLC를 사용하여 평가하였다 분석적 변성 SEC-HPLC를 0.8 mL/분 유속으로 100 mM 인산염 pH 6.8, 0.1% SDS에서 토소하스 (Tosohaas) 3000SWXL 컬럼 7.8 mm X 30 cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 사용하여 실행하였다. PEG 부착은 단백질의 유체역학적 부피를 증가시켜서 더 이른 잔류 시간으로 이동하는 것을 야기하였다. 비개질된 hGH와 함께 20K PEG 알데하이드 hGH 반응 혼합물에서 새로운 종을 관찰하였다. 상기 PEG가 부착된 종 및 PEG가 부착되지 않은 종을 Q-세파로스 크로마토그래피로 분리하고 결과 정제된 단일 20K PEG 알데하이드 hGH를 후에 변성 SEC (> 95 % 순도)에서 단일 피크로 용출하는 것으로 보였다. 상기 Q-세파로스 크로마토그래피 스텝은 유리 PEG, hGH 및 다중 PEG가 부착된 hGH 종을 단일 PEG가 부착된 hGH로부터 효과적으로 제거하였다.Various reactions of methoxy-PEG with hGH, anion exchange purification and final purified product were evaluated using denaturing SEC-HPLC Analytical denaturation SEC-HPLC was 100 mM phosphate pH 6.8, 0.1% SDS at 0.8 mL / min flow rate. In a Tosohaas 3000SWXL column 7.8 mm × 30 cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). PEG attachment increased the hydrodynamic volume of the protein and caused the migration to earlier retention times. A new species was observed in the 20K PEG aldehyde hGH reaction mixture with unmodified hGH. The PEG attached and non PEG attached species were separated by Q-Sepharose chromatography and the resultant single 20K PEG aldehyde hGH was later eluted with a single peak in denatured SEC (> 95% purity). The Q-Sepharose chromatography step effectively removed free PEG, hGH and multiple PEG attached hGH species from a single PEG attached hGH.
SDS PAGE/PVDF 전이SDS PAGE / PVDF transition
SDS-PAGE를 다양한 PEG 시약과 hGH 및 정제된 최종 산물과의 반응을 평가하는데 사용하였다. 상기 기술 예를 단일 20K 직쇄 및 분지쇄 20K 및 40K PEG 알데하이드 및 4X6 5K SPA PEG를 이용하여 보였다. (도 1 & 2). SDS-PAGE를 환원 및 비환원 조건하에서 1 mm 두께의 10-20 % 트리스 트리신 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 실행하고 노벡스 콜로이달 코마시 G-250 (Novex Colloidal CoomassieTM G-250) 염색 키트 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 염색하였다. 정제된 단일 PEG-알데하이드 hGH 종은 SDS-PAGE에서 1 종인 주요 밴드로 이동하였다. 밴드를 추후의 N-말단 서열 확인을 위하여 PVDF 멤브레인에 블로팅하였다.SDS-PAGE was used to assess the reaction of various PEG reagents with hGH and the purified final product. The above example technology was shown using single 20K straight and branched 20K and 40K PEG aldehydes and 4 × 6 5K SPA PEG. (Figures 1 & 2). SDS-PAGE was run on 1-20 mm thick 10-20% Tris Tricine gel (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) Under reducing and non-reducing conditions and Novex Colloidal Coomassie ™ G-250 Staining was performed using a staining kit (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Purified single PEG-aldehyde hGH species shifted to one major band in SDS-PAGE. The bands were blotted onto PVDF membranes for later N-terminal sequence identification.
분석적 음이온 교환 HPLCAnalytical Anion Exchange HPLC
다양한 mPEG와 hGH와의 반응, 음이온 교환 정제 분획 및 최종 정제된 산물을 평가하기 위하여 분석적 음이온 교환 HPLC을 사용하였다. 분석적 음이온 교환 HPLC를 1 mL/분 유속으로 50 mM 트리스 pH 8.6에서 토소하스 Q5PW 또는 DEAE-PW 음이온 교환 컬럼, 7.5 mm X 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)을 사용하여 실행하였다. 샘플을 5-200 mM NaCl의 선형 구배를 이용하여 용출하였다.Analytical anion exchange HPLC was used to evaluate various mPEG and hGH reactions, anion exchange purified fractions and final purified products. Analytical anion exchange HPLC was performed using a Tosohas Q5PW or DEAE-PW anion exchange column, 7.5 mm × 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) at 50 mM Tris pH 8.6 at 1 mL / min flow rate. Samples were eluted using a linear gradient of 5-200 mM NaCl.
역상 HPLC (RP-HPLC)Reversed Phase HPLC (RP-HPLC)
PEG-GH 반응 혼합물 및 정제된 PEG가 부착된 산물을 RP HPLC로 분석하여 hGH 종, 단일 및 다중 PEG가 부착된 hGH 종을 밝혀내고, 산화된 hGH 형태 및 상이한 위치 (예를 들면, N-말단 대 라이신 ε-아미노기)에 연결된 단일 PEG를 갖는 PEG hGH 이소폼을 모니터하였다. RP-HPLC를 조르박스 (Zorbax) SB-CN 150 또는 250 mm x 4.6 mm (3.5 mm or 5 mm) 역상 HPLC 컬럼을 사용하여 실행하였다. 실험을 샘플당 단백질 10 mg을 전형적으로 로딩하여 주위온도에서 실시하였다. 완충액 A는 물에서의 0.1 % 트리플루오로아세트산이고, 완충액 B는 아세토니트릴에서의 0.1 % 트리플루오로아세트산이다. 분당 B에서 ½ % 증가를 야기하는 구배는 하기와 같았다: The PEG-GH reaction mixture and the purified PEG attached product were analyzed by RP HPLC to identify hGH species, single and multiple PEG attached hGH species, oxidized hGH forms and different positions (e.g., N-terminus). PEG hGH isoform with single PEG linked to lysine ε-amino group) was monitored. RP-HPLC was performed using a Zorbax SB-CN 150 or 250 mm × 4.6 mm (3.5 mm or 5 mm) reversed phase HPLC column. The experiment was conducted at ambient temperature with typically 10 mg of protein per sample loaded. Buffer A is 0.1% trifluoroacetic acid in water and Buffer B is 0.1% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The gradient causing a ½% increase in B per minute was as follows:
N-말단 서열 및 펩티드 매핑N-terminal sequence and peptide mapping
자동화된 에드만 (Edman) 분해 화학을 사용하여 NH2-말단 단백질 서열을 결정하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 모델 494 프로사이스 시퀸서 (Applied Biosystems Model 494 Procise sequencer) (Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 분해에 이용하였다. 퍼킨 엘머/브라운리 2.1 mm (Perkin Elmer/Brownlee 2.1 mm) 상기와 동일한 PTH-C18 컬럼을 이용하여 맞춰진 어플라이드 바이오시스템즈 모델 140C PTH 어낼라이저를 이용하여 온라인 (on-line) 방식으로 RP-HPLC 분석에 의하여 각각의 PTH-AA 유도체를 확인하였다. PVDF 멤브레인에 전이된 20K 직쇄 및 20 및 40K 분지쇄 PEG-ALD hGH 단백질 밴드 또는 정제된 20K 직쇄 및 분지쇄 20 및 40K PEG-ALD hGH의 용액을 서열확인하였다. 주요 신호 (약 88 % 수율)를 산출하는 정제된 20K 직쇄 PEG-hGH가 N-말단 아미노산이 존재하지 않는 때를 제외하고 hGH에 대하여 예측되는 서열을 갖는 것을 관찰하였다. 상기 결과는 알데하이드 화학을 통하여 N-말단에 PEG가 부착된 단백질에 대하여 예측되는 것이다. 첫번째 사이클의 잔기는 부착된 PEG 부분때문에 회수할 수 없었다. 덜 중요한 신호 (약 12 % 수율)은 정확한 N-말단 아미노산 서열을 가졌다. RP-HPCL로부터 수집된 피크가 100 % PEG가 부착된 것을 고려하면, 상기 데이타는 PEG 개질의 약 88 %가 N-말단에서이고 나머지는 명백하게 몇몇 가능한 라이신 잔기에 연결된 것을 의미한다.NH2-terminal protein sequences were determined using automated Edman degradation chemistry. Applied Biosystems Model 494 Procise Sequencer (Perkin Elmer, Wellesley, Mass.) Was used for digestion. Perkin Elmer / Brownlee 2.1 mm For RP-HPLC analysis on-line using an Applied Biosystems Model 140C PTH analyzer fitted using the same PTH-C18 column as above. Each PTH-AA derivative was identified. Solutions of 20K straight and 20 and 40K branched PEG-ALD hGH protein bands or purified 20K straight and branched
1 mg/mL 농도에서 트립신 분해를 실행하고, 전형적으로 분해당 50 ug 물질을 사용하였다. 트립신 대 PEG-hGH 비가 1: 30 (w/w)이 되도록 트립신을 첨가하였다. 트리스 완충액은 30 mM, pH 7.5로 존재하였다. 샘플을 16 ± 0.5 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응을 분해 용액 mL당 1N HC1 50 μl을 첨가하여 정지시켰다. 자동 샘플러에 샘플을 위치시키기 전에 샘플을 6.25 % 아세토니트릴에서의 0.25 mg/ml인 최종 농도로 희석하였다. 아세토니트릴을 처음 첨가하고 (19.8 % 아세토니트릴로), 서서히 혼합하고, 그 후 물을 최종 부피 (개시 부피의 4 배)가 되도록 첨가하였다. 추가 분해 용액을 제거하고 -20 ℃에서 1 주일까지 저장할 수 있다. Trypsin digestion was performed at a concentration of 1 mg / mL and typically 50 ug material per digest was used. Trypsin was added so that the trypsin to PEG-hGH ratio was 1: 30 (w / w). Tris buffer was present at 30 mM, pH 7.5. Samples were incubated at room temperature for 16 ± 0.5 hours. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1N HC1 per mL of digestion solution. Samples were diluted to a final concentration of 0.25 mg / ml in 6.25% acetonitrile before placing the samples in an automated sampler. Acetonitrile was added first (to 19.8% acetonitrile), mixed slowly, and then water was added to the final volume (4 times the starting volume). The additional degradation solution can be removed and stored for one week at -20 ° C.
워터스 얼라이언스 2695 HPLC 시스템 (Waters Alliance 2695 HPLC system)을 분석에 사용하나 다른 시스템도 비슷한 결과를 낳아야 한다. 사용된 컬럼은 5 μm 입자를 가진 아스텍 C-4 폴리머릭 (Astec C-4 polymeric) 25 cm x 4.6 mm 컬럼을 사용하였다. 실험을 샘플당 단백질 50 μg을 전형적으로 로딩하여 주위온도에서 실시하였다. 완충액 A는 물에서의 0.1 % 트리플루오로아세트산이고, 완충액 B는 아세토니트릴에서의 0.85 % 트리플루오로아세트산이다. 구배는 하기와 같았다: The Waters Alliance 2695 HPLC system is used for analysis, but other systems should yield similar results. The column used was an Astec C-4 polymeric 25 cm × 4.6 mm column with 5 μm particles. The experiment was carried out at ambient temperature, typically loading 50 μg of protein per sample. Buffer A is 0.1% trifluoroacetic acid in water and Buffer B is 0.85% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The gradient was as follows:
상기 컬럼을 열 재킷을 사용하여 40 ℃로 가열하였다. 210 및 300 nm에서 데이타를 수집하여 워터스 996 PDA 검출기를 사용하여 피크를 검출하였다. 214 nm에서 추출된 크로마토그램을 샘플 분석에 사용하여 N-말단 PEG 부착 정도 (T-1 단편의 손실)를 결정하여 표 2에 나타내었다.The column was heated to 40 ° C. using a heat jacket. Data was collected at 210 and 300 nm to detect peaks using a Waters 996 PDA detector. The chromatogram extracted at 214 nm was used for sample analysis to determine the extent of N-terminal PEG attachment (loss of T-1 fragment) and is shown in Table 2.
실시예 20Example 20
약동력학적 연구Pharmacokinetic Studies
뇌하수체 제거 래트에서의 효능 연구Efficacy study in pituitary gland rats
할란 랩 (Harlan Lab)에서 뇌하수체가 제거된 암컷 스프라그 돌리 래트 (Sprague Dawley rat)를 7 내지 10 일 기간 동안 성장율에 대하여 미리 선별하였다. 그 후, 성장 연구를 11 일 동안 실행하였다. 래트를 6 내지 8 군으로 나누었다. 군 1은 매일 또는 0 일 및 6 일에 비히클(vehicle)이 피하 투여된 래트로 이루어져 있다. 군 2에게는 매일 GH (0.3 mg/kg/투여량)가 피하 투여되었다. 군 3에게는 0 일 및 6 일에 GH가 피하 투여되었다 (1.8 mg/kg/투여량). 군 4에게는 0, 6 일에 PEG-GH가 피하 투여되었다 (1.8 mg/kg/투여량). 뇌하수체가 제거된 래트를 연구 기간 동안 이틀 간격 이상으로 체중을 재어 중량 증가를 모니터하였다. 일주일에 1 회 20K PEG-ALD hGH, 20K 및 40K 분지쇄 PEG-ALD hGH, 및 4-6x 5PEG-SPA hGH 투여에 대한 중량 증가 (평균 +/- SEM)는 hGH를 매일 투여시킨 것과 비슷하였다. (표 3 & 4). 표 3은 hGH를 매일 투여시킨 것에 비하여 다양한 PEG가 부착된 hGH 분자를 일주일에 1회 투여시킨 것에 대하여 11 일에서의 총 중량 증가 (평균 +/- SEM)를 요약하고 있다.Female Sprague Dawley rats from which the pituitary gland was removed from the Harlan Lab were preselected for growth rate over a period of 7 to 10 days. Thereafter, growth studies were run for 11 days. Rats were divided into 6-8 groups.
각각의 성장 연구를 완결하면서, 동물을 희생시키고 뼈 (정강이뼈) 길이를 분석하였다. 도 6은 다양한 PEG-GH 콘쥬게이트를 0 일 및 6일에 투여시키거나 hGH를 매일 투여시킨 것에 반응하여 11일에서의 정강이뼈 길이 (평균 +/- SEM) 변화를 보여준다.At the completion of each growth study, animals were sacrificed and bone (thigh) length analyzed. FIG. 6 shows changes in tibia length (mean +/- SEM) at 11 days in response to administration of various PEG-GH conjugates on
뇌하수체 제거 래트에서 IGF-1 수준IGF-1 Levels in Pituitary Removal Rats
실험을 상기 중량 증가 연구에서와 같이 실행하나 혈액 샘플을 0, 1, 2, 3, 4, 5 일에 취하고 9 일에 동물을 희생시켰다. IGF-1 수준을 ELISA로 결정하였다. 도 7은 뇌하수체 제거 래트에서 매일 hGH를 투여하거나 또는 hGH를 단일 투여하거나 또는 PEG가 부착된 hGH를 0 일, 6 일에 투여한 후에 혈청 IGF-1 수준 (평균 +/- SEM)에서 증가를 비교하고 있다.The experiment was run as in the weight gain study but blood samples were taken on
약동학적 연구Pharmacokinetic Studies
약동학적 연구를 정상인, 스프라그-돌리 수컷 래트, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 (cynomolgus monkey)에서 실시하였다. 군당 6 마리 래트와 60 마리 이하 마우스를 사용하여 래트와 마우스에서 1.8 mg/kg의 단일 피하 볼루스 또는 1.0 mg/kg GH 또는 PEG-GH의 단일 iv 투여 중 하나로 주입하였다. 시노몰구스 원숭이에서는 군 당 2-4 마리 원숭이를 사용하여 0.18 mg/kg GH 또는 PEG-GH를 단일 피하 볼루스 및 iv 둘 모두로 투여하였다. 관련 PK 변수 (표 4)의 평가를 위하여 적당하게 1 내지 5일에 걸쳐서 혈액 샘플을 취하였다. (t½) = 최종 반감기, (Cl) = 제거, (Tmax) = 최대 농도에 이르는 시간, Vss = 정상 상태에서 부피 분포 (외견적) 및 (Cmax) = GH 최대 농도이고 PEG-GH 혈액 수준을 면역 분석 시험을 사용하여 각각의 샘플한 것에 대하여 모니터하였다.Pharmacokinetic studies were conducted in normal, Sprague-Dawley male rats, mice and cynomolgus monkeys. Six rats and up to 60 mice per group were used to inject either 1.8 mg / kg of a single subcutaneous bolus or a single iv dose of 1.0 mg / kg GH or PEG-GH in rats and mice. In cynomolgus monkeys, 0.18 mg / kg GH or PEG-GH was administered in both a single subcutaneous bolus and iv using 2-4 monkeys per group. Blood samples were appropriately taken over 1 to 5 days for evaluation of the relevant PK parameters (Table 4). (t ½ ) = final half-life, (Cl) = elimination, (T max ) = time to maximum concentration, V ss = volume distribution (normal) at steady state and (C max ) = GH maximum concentration and PEG-GH Blood levels were monitored for each sample using an immunoassay test.
hGH 면역 분석시험hGH immune assay
표준 곡선을 생성하기 위하여 적당한 PEG hGH를 사용하여, hGH 오토델피아 (AutoDELFIA) 키트 형광 면역 시험 분석 (PerkinElmer Life Sciences)을 사용하여래트, 마우스 및 시노몰구스 원숭이 혈장에서 hGH 및 PEG가 부착된 hGH 단백질 농도 수준을 결정하였다.HGH and PEG-attached hGH in rat, mouse and cynomolgus monkey plasma using hGH AutoDELFIA kit fluorescence immunoassay assay (PerkinElmer Life Sciences), using appropriate PEG hGH to generate a standard curve Protein concentration levels were determined.
본 발명에 따르면 보다 긴 주기의 반감기를 갖는 GH 분자를 제공하여 필요한 투여 횟수를 감소시키고, 보다 최적의 치료 hGH 농도와 부수적으로 증가된 치료 효 과를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 감소된 불균일성, 감소된 제거율, 증가된 혈장 체류 기간, 개선된 용해도, 증가된 안정성, 감소된 항원성, 또는 그의 조합을 갖는 화학적으로 개질된 hGH 콘쥬게이트를 제공할 수 있다.According to the present invention, a GH molecule having a longer half-life can be provided to reduce the number of administrations necessary and to provide a more optimal therapeutic hGH concentration and a concomitantly increased therapeutic effect. In addition, the present invention may provide chemically modified hGH conjugates with reduced heterogeneity, reduced clearance, increased plasma retention period, improved solubility, increased stability, reduced antigenicity, or a combination thereof.
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