KR20070050924A

KR20070050924A - 인간 ｉｌ-18의 투여에 의한 상처 치료 방법

Info

Publication number: KR20070050924A
Application number: KR1020077003853A
Authority: KR
Inventors: 주디탄 리; 킴벌리 에이. 데데
Original assignee: 스미스클라인 비참 코포레이션
Priority date: 2004-08-20
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2007-05-16
Also published as: CN101039696B; DE602005013542D1; JP2008510709A; NO20071238L; EP1793859B1; EP2161032A3; CA2577777A1; ATE526057T1; PT1793859E; RU2007110166A; HK1109054A1; CY1108991T1; PL1793859T3; ZA200700524B; ATE426410T1; EP1793859A4; AU2005277404A1; BRPI0514445A; ES2322605T3; CN101039696A

Abstract

본 발명은 전반적으로, 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 위장관 점막염, 경구 점막염 및 폐 손상의 치료에 있어서, 인터페론-γ-유도 인자(IGIF)로도 알려진 인간 IL-18의 용도에 관한 것이다.

인간 IL-18 폴리펩티드, 사이토카인, 상처 치료, 점막염, 궤양.

Description

인간 ＩＬ-18의 투여에 의한 상처 치료 방법 {METHODS OF HEALING WOUNDS BY ADMINISTERING HUMAN IL-18}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본 출원은 2004년 8월 20일자로 출원된 선행 미국 가출원 60/603,012호를 우선권으로 주장하며, 상기 문헌의 내용은 이 거명에 의해 그 전문이 본원에 포함된다.

본 발명은 전반적으로, 상처의 치료에 있어서 인터페론-γ-유도 인자(IGIF)로도 알려진 인간 IL-18의 용도에 관한 것이다.

본 발명이 흥미로운 이유는 분비된 단백질 치료제를 이들의 작용 부위(체액 또는 세포막)에 표적화하는 것에 대한 상대적 용이성 때문이다. 분비된 단백질, 및 막횡단 단백질의 세포외 영역은 체액 내로 직접적으로 투여되거나, 또는 자연적 경로에 의해 체액 또는 막으로 향할 수 있다. 세포외 공간으로의 단백질 분비를 위한 자연적 경로는 진핵생물에서는 소포체이고, 원핵생물에서는 내막이다(Palade, Science, 189, 347 (1975); Milstein, et al., Nature New Biol, 239, 117 (1972); Blobel, et al., J. Cell. Biol, 67, 835 (1975)). 반면, 세포 외부로부터 세포질 내로 단백질을 보내는 것에 대한 자연적 경로는 공지된 바 없다(음세포 작용, 뱀독 독소의 세포 내로의 침입 기전은 예외). 따라서, 당업계에서 단백질 치료제를 세포 내로 표적화하는 것은 극도로 어려운 실정이다.

IL-18은 최근 발견된 신규 사이토카인이다. 활성 형태의 인간 IL-18은 157개의 아미노산 잔기를 함유한다. 상기 IL-18은 T 세포 및 비장세포에 의한 인터페론-γ-생산의 유도, NK 세포의 세포사멸 활성 증대, 및 미감작(naive) CD4⁺ T 세포의 Th1 세포로의 분화를 비롯한 강력한 생물학적 활성을 가진다. 또한, 인간 IL-18은 GM-CSF의 생산을 증가시키고, IL-10의 생산을 감소시킨다. IL-18은 IL-12에 비해 더 큰 인터페론-γ-유도 능력을 가진다는 것이 입증되었고, 다른 수용체를 가지며 별개의 신호 전달 경로를 활용하는 것으로 보인다.

CD4⁺ T 세포는 모든 면역 반응의 중심적인 조절 요소이다. CD4⁺ T 세포는 2가지 아집단(Th1 및 Th2)으로 나뉜다. 각 아집단은 다른 사이토카인을 분비하는 능력에 의해 정의된다. 흥미롭게도, 분화의 가장 강력한 유도 물질은 사이토카인 그들 자신이다. 미감작 전구체로부터 Th2 세포의 발생은 IL-4에 의해 유도된다. IL-18의 발견 이전에, IL-12는 주요한 Th1 유도 사이토카인으로 생각되었다. IL-18 또한 Th1 유도 사이토카인이며, IL-12에 비해 인터페론-γ의 생산을 자극하는 데 더 강력하다.

Th1 세포는 IL-2, 인터페론-γ 및 TNF-β를 분비한다. 인터페론-γ(시그너쳐(signature) Th1 사이토카인)는 대식세포에 직접적으로 작용하여 대식세포의 살 미생물능 및 식세포능을 증진시킨다. 그 결과, 활성화된 대식세포는 세포내 병원체 및 종양 세포를 효율적으로 파괴할 수 있다. Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 생산하고, 상기 사이토카인은 B 세포가 항체-생산 세포로 발생하는 것을 돕는 작용을 한다. 총체적으로, Th1 세포는 주로 세포-매개 면역을 담당하는 반면, Th2 세포는 체액성 면역을 담당한다.

상처 회복은 다수의 세포 유형, 세포외 매트릭스 성분, 및 성장인자 및 사이토카인을 비롯한 다수의 가용성 매개체가 관여하는 매우 조직적인 상호작용이다. 상처 회복은 조직 손상을 일으키는 외상, 미생물 또는 화학물질에 의해 촉발될 수도 있다. 조직 보전성의 복원이 숙주의 고유 면역반응이기는 하지만, 상처 회복 과정이 손상되는 상황이 있다. 다수의 성장인자가 방사선요법 또는 화학요법을 받는 암 환자의 점막염을 예방하기 위해 사용되어 왔지만, 그 성공에는 한계가 있었다(문헌 [Peterson, Adv. Stud. Med., 4(4B): S299-S310, (2005)] 참고). 과립구 -콜로니 자극인자(Neupogen)는 치료를 받는 암 환자와 관련된 4개의 연구 중 2개의 연구에서 점막염의 발병률 및 중증도에 적당한 효과를 나타냈다. 과립구 대식세포 -콜로니 자극인자(Sargramostim)는 비록 그 결과가 일관성이 없기는 했으나, 화학요법 및 방사선요법에 의해 유도된 점막염의 중증도에 있어 적당한 감소를 유도하였다. 과립구-콜로니 자극인자와 과립구 대식세포-콜로니 자극인자 둘 다 단지 경구 점막염의 예방 효과만이 증명되었다. 각질형성세포 성장인자(Palifermin)는 경구 점막염의 발병률 및 지속 기간을 둘 다 예방하여, 점막염의 예방에 가장 가망성을 보였다. 점막염의 병태생리학을 표적으로 하는 약제의 출현으로, 임상의는 더 이상 방사선요법 또는 화학요법을 변경할 필요가 없고, 점막염의 발병을 예방할 수 있는 약제를 포함시키도록 치료계획서를 맞추어 만들 것이다. 확실히, 당업계에는 상처 회복을 증진시키기 위한, 특히 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 점막염(특히, 위장관 점막염 및 경구 점막염) 및 폐 손상을 치료하기 위한 신규 치료 단백질을 개발할 필요가 있다.

<발명의 개요>

한 측면에서, 본 발명은 상처 치료가 필요한 환자에게 치료 유효량의 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 치료되어야 할 상처는 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 위장관 점막염, 경구 점막염 및 폐 손상의 군으로부터 선택된다.

두 번째 측면에서, 본 발명은 상처 치료가 필요한 환자에게 유효량의 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

도 1은 천연 인간 IL-18의 아미노산 서열(서열 1)을 나타낸다.

도 2는 쥐과동물 IL-18의 아미노산 서열(서열 2)을 나타낸다.

도 3은 쥐과동물 혈소판 유래 성장인자-β(PDGF-β)의 아미노산 서열(서열 3)을 나타낸다. 성숙한 마우스 PDGF-β는 시그널 펩티드(-20 내지 -1) 및 N-말단(1 내지 61)과 C-말단(171 내지 221) 프로펩티드(밑줄) 모두의 제거에 의해 생성된다.

도 4는 인간 KGF의 아미노산 서열(서열 4)을 나타낸다.

도 5는 ob/ob 마우스의 상처 회복에 미치는, 아데노바이러스에 코딩된 쥐과동물 IL-18(서열 2)의 국소 투여의 효과를 나타낸다. 각 데이터 지점은 각 치료군의 평균을 나타낸다.

도 6은 ob/ob 마우스의 상처 회복에 미치는, 복막내 주사에 의해 매일 전신적으로 전달된 쥐과동물 IL-18 정제 단백질(서열 2)의 효과를 나타낸다. 각 데이터 지점은 각 치료군의 평균을 나타낸다.

도 7은 ob/ob 마우스의 상처 회복에 미치는, 매일 국소적으로 전달된 인간 IL-18(서열 1)의 효과를 나타낸다. 각 데이터 지점은 각 치료군의 평균을 나타낸다.

인간 IL-18 폴리펩티드는 EP 0692536A2호, EP 0712931A2호, EP0767178A1호, 및 WO 97/2441호에 개시되어 있다. 인간 IL-18의 아미노산 서열은 서열 1에 기재되어 있다. 인간 IL-18 폴리펩티드는 인터페론-γ 유도 폴리펩티드이다. 인간 IL-18 폴리펩티드는 T 세포 및 비장세포에 의한 인터페론-γ 생산의 유도, NK 세포의 세포사멸 활성 증대, 및 미감작 CD4⁺ T 세포의 Th1 세포로의 분화 촉진을 비롯한 세포-매개 면역에서 주요한 역할을 담당한다.

IL-18은 특히 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 압력 궤양, 점막염(특히, 위장관 점막염 및 경구 점막염) 및 폐 손상 등을 비롯한 환자의 상처를 회복시키는 데 사용될 수 있다. 상처 회복은 손상된 세포의 동일한 유형의 세포에 의한 재생과 관련되어 있다. 상처 회복 과정은 세포의 증식, 이동, 분화, 재형성이라는 세포성 사건들의 체계적인 협동을 수반한다. 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 및 부착분자(adhesion molecule)는 세포 매개체로서 기능하고, 이들 세포 매개체는 이러한 활성과 관련된 특정 세포를 조직화한다(Kampfer, et al., Molec. Med. 6(12): 10160-1027 (2000)). 전-염증성 사이토카인인 인터류킨-18(IL-18)은 종양 괴사 인자-알파, 인터류킨 1-베타, 및 CC와 CXC 케모카인을 유도할 수 있고, 이들 물질은 상처 회복 과정의 염증성 단계 동안 소정의 역할을 담당할 수 있다(Puren, et al., J. Clin. Invest. 101: 711-721 (1998)). 상처 회복에서 소정의 역할을 담당하는 각질형성세포 및 활성화된 대식세포를 비롯한 다수의 다른 세포 유형이 IL-18을 합성한다고 확인되었다. Con A의 자극을 받은 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 인간 IL-18로 처리하여 시험관 내에서 배양하면 과립구 단핵구-콜로니 자극인자(GM-CSF)의 생산이 유도되었다(Ushio, et al., J. Immunol. 156: 4274-4279 (1996)). 또한, IL-18은 T 세포 및 NK 세포에 의해 인터페론-감마(IFN-감마)의 생산을 유도하는 것으로 입증되었다. 과립구 단핵구-콜로니 자극인자는 상처 치료를 촉진하는 것으로 입증되었고(Arnold, et al., J. Wound Care 54: 400-402 (1995)), 만성 정맥 다리 궤양 환자를 치료하기 위해 임상에 사용되어 왔다(DaCosta, et al., Wound Rep. Reg. 7: 17-25 (1999)). 상처 회복의 쥐과동물 절제 모델에서, 본 발명자들은 IL-18이 상처 회복을 촉진시킨다는 것을 증명하였다. IL-18이 상처 회복을 촉진시키는 기전은 사이토카인의 전-염증성 성질 때문이거나, 또는 과립구 단핵구-콜로니 유도인자와 같은 성장인자의 유도제로서의 성질 때문일 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피법, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피법, 소수성 상호작용 크로마토그래피법, 친화도 크로마토그래피법, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피법, 렉틴 크로마토그래피법 및 고성능 액체 크로마토그래피법을 비롯한 널리 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내 합성, 단리 및/또는 정제 과정동안 변성될 때, 단백질의 재접힘(refolding)을 위한 널리 공지된 기술을 이용하여 활성 구조를 재생시킬 수 있다. 활성 형태의 인간 IL-18를 정제하고 생산하는 방법은 WO 01/098455호에 기재되었다.

본 발명은 또한 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 치료 유효량의 화합물을 포함하고, 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물, 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일(예컨대, 땅콩오일, 대두유, 미네랄오일, 참깨오일 등)일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥주사로 투여될 때 담체로 사용될 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액 또한 액체 담체로 사용될 수 있다(예를 들어, 주사 용액). 적절한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡분, 초크, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 원한다면, 조성물은 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액제, 현탁액제, 유제, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 서방제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세리드와 같은 전통적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구 제제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준적인 담체를 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 이와 같은 조성물은 환자에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위한 적절한 양의 담체와 함께 치료 유효량의 화합물(대체로 정제된 형태임)을 함유할 것이다. 제제는 투여의 방식에 적합하여야 한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 조성물은 인간에게 정맥주사로 투여되는 데 적합한 약제학적 조성물로서 통상적 절차에 따라 제제화된다. 전형적으로, 정맥주사를 위한 조성물은 멸균된 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 적절한 경우, 조성물은 주사 부위의 통증을 경감하기 위해 가용화제 및 국부 마취제(예를 들어, 리그노카인(lignocaine)) 또한 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 개별적으로 공급되거나, 또는 단위 투여 형태(예를 들어, 활성제의 양을 표기한 앰플 또는 사켓(sachette)과 같은 밀봉 용기에 든 동결건조 분말 또는 무수 농축물)에 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입을 통해 투여되는 경우, 약제학적 등급의 멸균수 또는 멸균 염수를 함유한 주입병을 이용하여 조성물을 투여할 수 있다. 조성물이 주사를 통해 투여되는 경우, 조성물을 투여하기 전에 성분들을 혼합할 수 있도록, 멸균 주사용수 또는 염수의 앰플이 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구적 투여를 위한 용액 또는 동결건조된 분말로 제제화될 수 있다. 분말은, 사용하기 전에 적절한 희석제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 담체를 가하여 재구성될 수 있다. 액체 제제는 완충된 등장성 수용액일 수 있다. 적절한 희석제의 예로는 보통의 등장성 염수 용액, 표준 5％ 덱스트로오스 수용액, 또는 아세트산나트륨 또는 아세트산암모늄 완충액이 있다. 이러한 제제는 특히 비경구적 투여에 적합하지만, 경구 투여에 사용되거나, 또는 흡입을 위한 계량 흡입기 또는 연무기에 함유될 수도 있다. 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 히드록시 셀룰로오스, 아라비아 고무, 폴리에틸렌 글리콜, 만니톨, 염화나트륨 또는 시트르산나트륨과 같은 부형제를 상기 약제학적 조성물에 가하는 것이 바람직할 수 있다.

별법으로, 폴리펩티드는 경구 투여를 위해 캡슐화되거나, 타정되거나, 유제 또는 시럽으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 고체 또는 액체 담체는 조성물의 증진 또는 안정화를 위해 가해지거나, 또는 조성물의 제조를 용이하게 하기 위해 가해질 수 있다. 고체 담체에는 전분, 락토오스, 황산칼슘 이수화물, 테라 알바(terra alba), 스테아르산마그네슘 또는 스테아르산, 탈크, 펙틴, 아라비아 고무, 한천, 또는 젤라틴이 포함된다. 액체 담체에는 시럽, 땅콩 오일, 올리브유, 염수, 및 물이 포함된다. 또한, 담체는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 서방 물질을 단독으로, 또는 왁스와 함께 포함할 수 있다. 고체 담체의 양은 다양하지만, 투여 단위 당 약 20mg 내지 1g일 것이다. 약제학적 제제는, 적당한 경우 정제 형태를 위한 제분, 혼합, 과립화, 및 압축, 또는 경질 젤라틴 캡슐 형태를 위한 제분, 혼합 및 충전을 포함하는 종래의 약학적 기술에 따라 제조된다. 액체 담체가 사용되는 경우, 상기 제제는 시럽, 엘릭서, 유제, 수성 현탁액제 또는 비수성 현탁액제의 형태일 것이다. 이러한 액체 제제는 경구로 직접 투여(p.o.)되거나 연질 젤라틴 캡슐에 충전되어 투여될 수 있다.

인간 IL-18 폴리펩티드는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 폴리펩티드를 함유하는 약제학적 조성물으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 주사 직전의 형태로 된, 생리학적 pH로 완충된 폴리펩티드 함유 수성 현탁액제 또는 용액제가 사용될 수 있다. 비경구적 투여를 위한 조성물은 흔히 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 칵테일의 용액을 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 수성 담체)에 용해된 채로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어 0.4％ 염수, 0.3％ 글리신 등이 사용될 수 있다. 상기 용액제는 멸균된 상태이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 상기 용액제는 널리 공지된 종래의 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제 등과 같은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 상기 약제학적 제제 내 본 발명의 폴리펩티드의 농도는 광범위하게 달라질 수 있는데, 즉 약 0.5중량％ 미만(통상적으로 약 1중량％ 이하)에서부터 15 또는 20중량％까지 달라질 수 있으며, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 주로 유체의 부피, 점도 등에 근거하여 선택될 것이다.

따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1mL의 완충된 멸균수, 및 약 1ng 내지 약 100mg(예를 들어, 약 50ng 내지 약 30mg, 또는 약 5mg 내지 약 25mg)의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 약 250mL의 멸균 링거액, 및 약 1mg 내지 약 30mg, 또는 약 5mg 내지 약 25mg의 본 발명의 폴리펩티드를 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적 투여가 가능한 조성물을 제조하는 실제적 방법은 널리 공지되었거나, 당업자에게 명백하며, 예를 들어 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 약제학적 제제로 제조될 때, 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 적절한 치료 유효 용량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적절하다면, 이러한 용량은 반응 기간 중에 담당의에 의해 적절하게 선택된 적절한 시간 간격마다 반복될 수 있다.

또한, 최적의 용량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 시험관 내 분석이 임의로 이용될 수 있다. 제제에 사용될 정확한 용량은 투여 경로, 및 질병 또는 장애의 중증도에 따라 좌우될 것이고, 진료의의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유래한 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

폴리펩티드의 경우, 환자에 대한 투여 용량은 전형적으로 환자 체중을 기준으로 0.1mg/kg 내지 100mg/kg이다. 환자에 대한 투여 용량은 환자 체중을 기준으로 0.1mg/kg 내지 20mg/kg, 또는 별법으로, 환자 체중을 기준으로 1mg/kg 내지 10mg/kg일 수 있다. 일반적으로, 인간 폴리펩티드는 다른 종의 폴리펩티드에 비해 인체 내에서 더 긴 반감기를 갖는데, 이는 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응 때문이다. 따라서, 대체로 더 낮은 용량의 인간 폴리펩티드 및 더 적은 투여 빈도가 가능하다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드의 투여 용량 및 빈도는 변형(예를 들어, 지질화(lipidation))에 의해 폴리펩티드의 흡수(uptake) 및 조직 투과(예를 들어, 뇌 내로)를 증진함으로써 감소될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물의 1종 이상의 성분으로 충전된 1개 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩(pack) 또는 키트(kit)를 제공한다. 상기 용기에는 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태의 통지물이 포함될 수 있고, 이 통지물은 인간에게의 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 특정한 징후의 치료를 위해 요구되는 용량을 충족시키는 적절한 개수의 용기가 함유된 키트가 제공될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 소낭(vesicle), 특히 리포좀(문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]; [Treat, et al., in LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; [Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327](일반적으로 상기 문헌 참고) 참고)으로 전달될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시양태에서는, 펌프가 사용될 수 있다(문헌[Langer, supra]; [Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald, et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek, et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참고). 또 다른 실시양태에서는, 중합성 물질이 사용될 수 있다(문헌[MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974)]; [CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)]; [Ranger, et al., J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)]을 참고하며, 또한 문헌[Levy, et al., Science 228:190 (1985)]; [During, et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989)]; [Howard, et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)]을 참고함). 또 다른 실시양태에서는, 제어 방출 시스템이 치료 표적(즉, 뇌)에 근접하게 위치할 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만이 요구될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Goodson, in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참고). 다른 제어 방출 시스템은 랑게르(Langer)의 고찰논문(review)에 논의되어 있다(Science 249:1527-1533 (1990)).

인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)는 임의의 적절한 내부 경로를 통해 투여될 수 있고, 필요한 만큼 반복될 수 있다(예를 들어, 1일 내지 약 3주 동안 일일 1 내지 3회에서부터 1주 1회 또는 2주 1회로). 별법으로, 펩티드는 전하 밀도가 감소되도록 변형될 수 있고, 이로써 경구 생체이용률을 높일 수 있다. 용량 및 치료 지속 기간은 인간의 혈류 내 본 발명의 분자의 상대적인 지속 기간과 관련이 있고, 치료받는 증상 및 환자의 일반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.

본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 포함하는 약제학적 조성물을 인간 환자에게 투여함으로써 치료, 억제 및 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 화합물은 실질적으로 정제되어 있다(예를 들어, 화합물의 효과를 제한하는 물질 또는 원치 않은 부작용을 일으키는 물질이 실질적으로 없음). 화합물이 상기와 같은 폴리펩티드를 포함할 때, 소정의 제제 및 투여 방법이 이용될 수 있으며, 부가적인 적절한 제제 및 투여 경로는 하기의 제제 및 경로 중에서 선택될 수 있다.

예를 들어, 리포좀 내의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 내포작용(예를 들어, 문헌 [Wu, et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참고), 레트로바이러스 벡터 또는 기타 벡터의 부분으로서의 핵산의 구조물 등과 같은 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 화합물을 투여하는 데 이용될 수 있다. 도입의 방법에는 피부내, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하, 비내, 경질막내, 및 경구 경로가 포함되나, 이것에 한정되지는 않는다. 화합물 또는 조성물은, 예를 들어 상피조직 또는 점막피부 내층(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의한 주입 또는 볼루스 주사와 같은 임의의 편리한 경로를 통해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 또한, 뇌실내 및 척수강내 주사를 비롯한 임의의 적절한 경로를 통해 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 중추신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 옴마야 저장소(Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 뇌실내 주사가 용이하게 될 수 있다. 폐 투여 또한 이용될 수 있다(예를 들어, 흡입기 또는 연무기의 사용 및 분무화제를 지닌 제제에 의하여).

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 투여는, 예를 들어(한정하는 것은 아님) 수술 중 국소 주입, 국소 도포(예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께), 주사, 카테터, 좌제, 또는 이식(상기 이식은 실라스틱 막과 같은 막 또는 섬유질을 비롯한 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질로 구성)에 의해 달성될 수 있다. 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하는 것이 권장할 만하다.

본 발명의 폴리펩티드의 투여 방식은 숙주에 약제를 전달하는 임의의 적절한 경로일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 및 약제학적 조성물은 특히 비경구적 투여(즉, 피하, 근육내, 정맥내 또는 비내), 또는 피부의 상처를 회복시키는 데 사용될 경우, 국소투여에 유용하다. 점막염을 치료하기 위해, 폴리펩티드는 비경구적 투여를 통해 환자에게 전달될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 본질 또는 필수적 특징을 이탈하지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위를 나타내는 것으로 상기 명세서 또는 하기 실시예보다는 첨부된 청구항을 참조해야 한다.

<어휘>

하기 정의들은 상기에 빈번히 사용된 특정 용어의 이해를 용이하게 하기 위해 제공되었다.

본원에 사용된, "담체"라는 용어는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지시한다.

"단리된"은 그것의 자연적 상태로부터 "인간에 의해" 바뀐 것을 의미한다(즉, 자연에 존재한다면, 그것의 고유 환경으로부터 변화 또는 제거되거나, 또는 변화 및 제거된 것임). 예를 들어, 살아있는 유기체에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 것이 아니지만, 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 그것의 자연적 상태에서 공존하는 세포 물질 중 1가지 이상으로부터 분리된 것은 본원에 사용되는 용어로서의 "단리된" 것이다. 또한, 형질전환, 유전자 조작 또는 임의의 다른 재조합 방법에 의해 유기체에 도입된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 그것이 상기 유기체(유기체는 살아있을 수도 있고 아닐 수도 있음)에 여전히 존재한다 하더라도 "단리된" 것이다.

본원에 사용된 "점막염"이라는 용어는 기관의 상피 내층의 파괴를 의미한다(예를 들어, 방사선조사 또는 화학요법에 의해 장, 방광, 입에서 발병한 것).

본원에 사용된 "약제학적"이라는 용어는 본 발명의 수의학적 적용을 포함한다. "치료 유효량"이라는 용어는 선택된 조건을 경감시키는 데 유용한 치료제의 양을 지시한다.

본원에 사용된 "약제학적으로 허용되는"이라는 용어는 연방 정부 또는 주정부에 의해 승인된 것, 또는 미국의 약전 또는 동물(더욱 구체적으로, 인간)에 쓰이는 다른 일반적인 공인된 약전 목록에 실린 것을 의미한다. "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합(즉, 펩티드 동배체)에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 지시한다. "폴리펩티드"는 흔히 펩티드, 올리고펩티드 또는 올리고머로 지칭되는 짧은 사슬과, 일반적으로 단백질로 지칭되는 더 긴 사슬 모두를 지시한다. 폴리펩티드는 20가지 유전자-코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 함유할 수 있다. "폴리펩티드"는 자연적 과정(예를 들어, 번역 후 과정)에 의해 변형된 아미노산 서열, 또는 당업계에 널리 공지된 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 방대한 연구 문헌 뿐만 아니라, 기본 교과서 및 더 자세한 연구논문에도 잘 기술되어 있다. 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 아미노 또는 카르복실 말단을 비롯하여 폴리펩티드의 어느 부분에서나 발생할 수 있다. 주어진 폴리펩티드의 여러 부위에서 동일한 유형의 변형이 동일한 정도 또는 다양한 정도로 나타날 수 있다는 것이 인정될 것이다. 또한, 주어진 폴리펩티드는 여러 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로써 분지화(branch)될 수 있고, 분지화 여부와 무관하게 고리형일 수 있다. 고리형, 분지화된, 및 분지화된 고리형 폴리펩티드는 자연적인 번역 후 과정의 결과이거나, 또는 합성 방법에 의해 만들어질 수도 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 비오틴화, 플라빈의 공유 부착, 헴 잔기의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스포티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질에 대한 전이-RNA 매개 부가(예를 들어, 아르기닐화 및 유비퀴틴화)가 포함된다(예를 들어, 문헌 [PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993]; [Wold, F., Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, 1-12, in POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983]; [Seifter et al., Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990]; [Rattan, et al., Ann. NY Acad. Sci., 663: 48-62 (1992)] 참고).

생물학적 활성 화합물의 수용성 중합체에 대한 공유 부착은 이들 화합물의 생체분포(biodistribution), 약물동태학, 및 종종 독성을 변경하고 조절하기 위한 한 방법이다(Duncan, R. and Kopecek, J. (1984) Adv. Polym. Sci. 57:53-101). 폴리(시알산), 덱스트란, 폴리(N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드)(PHPMA), 폴리(N-비닐피롤리돈)(PVP), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(에틸렌 글리콜-코-프로필렌 글리콜), 폴리(N-아크릴로일 모르폴린(PAcM), 및 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)와 같은 다수의 수용성 중합체가 이러한 효과를 달성하기 위해 사용되어 왔다(Powell, G. M. (1980) Polyethylene glycol. In R.L. Davidson (Ed.) HANDBOOK OF WATER SOLUBLE GUMS AND RESINS. McGraw-Hill, New York, chapter 18). PEG는 이상적인 세트의 특성, 즉 매우 낮은 독성(Pang, S. N. J. (1993) J. Am. Coll. Toxicol. 12: 429-456), 수성 용액에서의 우수한 용해도(Powell, 상기문헌), 낮은 면역원성 및 항원성(Dreborg, S. and Akerblom, E. B. (1990) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 315-365))을 가지고 있다. 단백질에 폴리에틸렌글리콜의 단일 또는 다중 사슬을 함유하는, PEG-접합 또는 "PEG화된" 단백질 치료제는 과학 문헌에 기술되어 왔다(Clark, R., et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 21969-21977; Hershfield, M. S. (1997) Biochemistry and immunology of poly(ethylene glycol)-modified adenosine deaminase (PEG-ADA). In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p.145-154; Olson, K., et al. (1997) Preparation and characterization of poly(ethylene glycol)ylated human growth hormone antagonist. In J. M. Harris and S. Zalipsky (Eds) Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications. American Chemical Society, Washington, DC, p170-181).

본 명세서에 사용된 "상처 회복"이라는 용어는 상처 봉합을 비롯한(그러나 이에 한정되지는 않음) 상처 치료에 관련된 조직 회복 과정을 의미한다.

특허 및 특허 출원 등을 비롯하여 본 명세서에 인용된 모든 출판물 및 참조문헌은, 각각의 출판물 및 참조문헌이 각각의 거명에 의해 그 전문이 완전히 본원에 기재된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본 출원에서 우선권으로 주장하는 임의의 특허 출원도 상기 출판물 및 참조문헌에 관해 기술된 방식으로 그 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.

실시예 1: 절제 상처 회복 모형

ob/ob 주(strain)와 같은 당뇨 마우스는 지연된 상처 치료를 나타낸다(Stallmeyer, et al., Diabetologia 44: 471-479 (2001)). ob/ob 마우스는 렙틴을 코딩하는 ob/ob 유전자가 결실된 자연 발생 마우스 주이다. 렙틴은 사이토카인 클래스 I 수용체(obRb)에 결합하여, 식욕을 줄이는 세포내 신호전달 캐스캐이드를 활성화한다. ob/ob 마우스는 렙틴을 생산할 수 없기 때문에, 일반 C57/B16 마우스 체중의 2배로 비만이다. 상기 비만 마우스는 감소된 열 발생, 과식증, 감소된 생식능력, 및 성장 호르몬의 억제를 비롯한 다른 대사 결함 또한 가진다(Ring, et al., Endocrinol. 141(1): 446-449 (2000)). ob/ob 마우스의 상처 치료에 대한 현저한 지연 상태는 이들의 당뇨-유사 표현형 탓이라 생각되어 왔다.

손상된 상처 치료의 모델은 IL-18과 같은 특정한 사이토카인, 및 혈소판-유래 성장인자(PDGF)와 같은 성장인자의 상처 회복에 대한 효과를 조사할 기회를 갖게한다. PDGF-β의 국소 도포는 당뇨 마우스 주(db/db)의 상처 치료를 증진시키는 것으로 입증되었다(Greenlaugh, et al., Am. J. Pathol. 136: 1235-1246 (1990)). db/db 주는 표현형적으로 ob/ob 주와 유사하지만, db/db 마우스는 렙틴 수용체가 결손이다. db/db 마우스의 상처는 현저하게 지연된 세포 침윤, 과립 조직 형성, 및 지연된 상처 치료를 나타낸다. 혈소판-유래 성장인자(PDGF-β)는 평활근 및 섬유아세포의 유사분열물질이자 화학유인물질이고, db/db 마우스에서 상처의 빠른 재상피화를 유발한다. 인터류킨-18(IL-18)은 기존에 상처 치료 모델에서 치료제로 사용되어 오지 않았으나, 연구에서 ob/ob 마우스의 상처 내에서 IL-18의 증가된 발 현 수준(그러나 단백질 생성은 증가되지 않았음)을 보였다(Kampfer, et al., J. Invest. Derm. 113(3): 369-74 (1999)). IL-18은 전-염증성 사이토카인이기 때문에(Kampfer, et al., Eur. Cytokine Netw. 11 : 626-33 (2000)), IL-18은 상처 내로 세포 침윤을 자극함으로써 상처 치료에서 소정의 역할을 담당할 수 있다.

IL-18 또는 PDGF-β의 국소 전달이 상처 회복에 미치는 영향을 측정하기 위해, 케타민(Ketamine) 90mg/kg과 크실라진(Xylazine) 10mg/kg의 칵테일을 사용해 10 내지 14주령의 암컷 ob/ob 마우스를 마취시켰다. 아데노바이러스-매개의 PDGF 과잉발현은 토끼 귀 모델에서 허혈성 상처 치료를 바로잡는 것으로 나타났다(Liechty, et al., J. Invest. Dermatol. 113:375-383 (1999)). 릭티(Liechty) 등은 복제 결핍 아데노바이러스가 PDGF-β 형질전환유전자(transgene)를 상처 부위 내 세포로 직접 효율적으로 전달함을 증명하였다. 각 마우스의 상부 등(upper back)을 면도하였고, 알콜과 베타딘(Betadine)으로 번갈아 닦아내어 멸균 구역을 확립하였다. 멸균 생검 펀치를 이용해 직경 6mm의 전층 원형 절제 상처를 만들되, 마우스 1마리 당 2개의 상처를 만들었다. 국소 전달을 위해, 쥐과동물 IL-18(서열 2), 쥐과동물 PDGF-β(서열 3의 아미노산 1-61 및 171-221)을 코딩하는 아데노바이러스(1x10¹⁰바이러스 입자/상처), 또는 대조군(빈(empty) 아데노바이러스-CMV.Null)을 상처 부위에 직접적으로 가하였다. 염수 대조군 또한 상처에 직접적으로 가하였다. 그 후에 폴록사머(10％ 인산염 완충 염수(PBS)에 든 플루로닉(Pluronic) F127)를 상처 위쪽에 도포하였고, 상처를 투명한 멸균 드레싱으로 덮 었다. 상처 봉합의 속도를 측정하기 위해, 상처의 경계선을 이틀 간격으로 투명한 필름에 표시하였다. 모든 상처가 치료되어 연구가 끝날 때, 투명한 필름을 광학적으로 스캔하였고, 사이온 이미지 소프트웨어(Scion Corporation, Frederick, Maryland, U.S.A)를 이용하여 표면적을 측정하였다. 본 실험의 결과는 하기 도 5에 나타냈다.

대조군 아데노바이러스(Ad.mPDGF-β(서열 3의 아미노산 1-61 및 171-221))는 직접 클로닝 접근법을 이용하여 생성하였다(Sukmanm A. J., Kallarakal, A., Fornwald, J., Kozarsky, K. F., Appelbaum, E., Shatzman, A. R., and Lu, Q. 2002. Generation of recombinant adenovirus vectors by a direct cloning approach. In Gene Cloning and Expression Technologies, M. P. Weiner and Q. Lu (Eds.). p341-355. Eaton Publishing, Westborough, MA). 요약하면, 쥐과동물 PDGF-β의 ORF을 PCR 증폭하였고, CMV IE 프로모터의 조절 하에 유전자가 배치되도록 pAC2XS의 XbaI/SwaI 부위에 클로닝하였다. 아데노바이러스 벡터의 정제된 분자 클론 DNA는 ITR을 노출시키도록 제한효소 PacI으로 절단하여 선형화하였고, 아데노바이러스 구조(rescue)를 위해 HEK293 세포 내로 형질감염(transfection)시켰다. 아데노바이러스는 문헌[Engelhardt, J. 1999. Methods for adenovirus-mediated gene transfer to airway epithelium. In Methods in Molecular Medicine, Gene Therapy Protocols, P. Robbins (Ed.). p.169-184. Humana Press, Totowa]에 기재된 바와 같이 증폭하여 CsCl 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 농축된 아데노바이러스는 바이오-겔 컬럼(Bio-Rad)을 이용하여 탈염하였고, -80℃에서 1xPBS(10％ 글리세롤)에 보관하였다. Ad.m-IL-18 구조물은 문헌[Osaki, et al., Gene Therapy 6: 808-815 (1999)]에 기재된 방법을 이용하여 생성하였다.

아데노바이러스 벡터 중의 단백질 구조물을 국소 전달한 경우, Ad.m-PDGF-β(서열 3의 아미노산 1-61 및 171-221) 및 Ad.m-IL-18(서열 2) 모두 ob/ob 절제 상처 회복 모델에서 상처 봉합을 크게 증진시켰다. 대조군 벡터(Ad.CMV.Null)는 상처가 생긴 후 20일째에 0일째 봉합의 50％에 도달한 것과 대비하여, 양성 대조군 단백질인 Ad.m-PDGF-β(서열 3의 아미노산 1-61 및 171-221) 및 Ad.m-IL-18(서열 2)는 각각 7.5일과 9.5일째에 0일째 봉합의 50％에 도달하였다. 또한, Ad.m-IL-18(서열 2) 및 Ad.m-PDGF-β(서열 3의 아미노산 1-61 및 171-221)는 모두 20일째까지 상처의 완전한 봉합이 가속화되었다. 상처가 생긴 후 22일째인 연구의 종결 시기에, 염수 대조군과 벡터 대조군 모두 완전한 치료를 이루지 못했다. 절제 상처 회복 모델에서 국소적으로 가해진 Ad.IL-18의 긍정적인 효과가 증명된 점에 비추어, 쥐과동물 IL-18 단백질(서열 2)의 전신적 전달을 시험하였다.

쥐과동물 IL-18 단백질(서열 2)의 전신적 전달의 효과를 측정하기 위해, 케타민 90mg/kg과 크실라진 10mg/kg의 칵테일을 사용해 10 내지 14주령의 암컷 ob/ob 마우스를 마취시켰다. 상처를 내는 과정의 2시간 전에, 쥐과동물 IL-18 단백질(서열 2)을 다중 농도(0.1㎍/0.5ml 내지 100㎍/0.5ml)로, 또는 비히클(칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS)를 마우스에게 복강내 주사하였다. 마우스의 상부 등을 면도하였고, 알콜과 베타딘으로 번갈아 닦아내어 멸균 구역을 확립하였다. 멸균 생검 펀치를 이용해 직경 6mm의 전층 원형 절제 상처를 만들되, 마우스 1마리 당 2개의 상처 를 만들었다. 염수를 상처에 직접적으로 가하고, 상처를 투명한 멸균 드레싱으로 덮었다. 상처 봉합의 속도를 측정하기 위해, 상처의 경계선을 이틀 간격으로 투명한 필름에 표시하였다. 모든 상처가 치료되어 연구가 끝날 때, 투명한 필름을 광학적으로 스캔하였고, 사이온 이미지 소프트웨어를 이용하여 표면적을 측정하였다. 전신적 연구 전체 기간에 걸쳐, 마우스의 체중 감소 및 증량을 측정하였다. 본 실험의 결과는 하기 도 6에 나타냈다.

정제된 단백질을 전신적으로 전달한 경우, 쥐과동물 IL-18(서열 2)은 0.1㎍ 내지 100㎍/마우스/일의 용량 범위에 걸쳐, 용량-의존적 방식으로 상처 봉합의 속도를 증진시켰다. 가장 효과적인 용량은 50 및 100㎍/마우스/일이었고, 비히클 대조군이 16일째까지 0일째 봉합의 50％에 도달한 것과 대비하여, 이들은 각각 8일과 9일째까지 0일째 봉합의 50％에 도달하였다. m-IL-18(서열 2) 치료는 PBS 대조군에 비해 완전한 봉합의 속도가 증가하였다.

국소적으로, 그리고 전신적으로 전달된 쥐과동물 IL-18(서열 2)은 모두 ob/ob 상처 회복의 절제 모델에서 상처 봉합을 증진시켰다. PDGF는 본원의 쥐과동물 상처 회복 연구에서 양성 대조군으로 사용되었다. 재조합 인간 혈소판-유래 성장인자는 당뇨 족부 궤양의 치료에 대해 미국 식품의약품안전청의 승인을 받았다(Wieman, et al. Am. J. Surg. 176:745-795 (1998)). 다수의 육체적 질환이 조직 손상에 의해 유발되고, 조직 손상은 조직의 자연적 구성을 붕괴시켜 상처를 유발한다. 본 특허에서 청구된 적응증은 조직 손상의 모든 예이고, 이 조직 손상은 인간 IL-18(서열 1)로 치료하여 회복될 수 있었다.

실시예 2: 절제 상처에 인간 IL -18의 매일 국소 적용

쥐과동물 IL-18(서열 2)가 아데노바이러스 구조물로서 국소적으로 전달될 때 쥐과동물 절제 상처 회복 모델에서 효과적이었기 때문에, 정제된 인간 IL-18(서열 1)을 매일 직접적으로 상기 실시예 1의 상처에 가하는 연구를 수행하였다. 인간 IL-18 단백질(서열 1)을 10㎍/30㎕/상처로 가하였다. 인산염 완충 염수(PBS)는 희석제 대조군으로 사용되었다. 결과는 하기 도 7에 나타냈고, 이는 인간 IL-18(서열 1)이 PBS 대조군에 비해 상처 회복을 가속화시킴을 입증하였다. 임상에서, 인간 PDGF는 당뇨 족부 궤양의 치료를 위해 국소적으로 사용되어 왔다(Wieman et al. Am. J. Surg. 176:745-795 (1998)).

실시예 3: 장 점막염 모델

화학요법 또는 방사선 조사와 같은 항암 치료는 대체로 움(crypt)의 붕괴에 의한 위장관에의 세포독성 손상을 유발한다. 이러한 움 상실(crypt loss)은 위장관 점막염을 유발하는 상피의 노출된 부위를 따라 궤양의 발생을 유발한다. 긴밀하게 연관된 증상인 경구 점막염은 입의 상피 내층이 세포독성제에 의해 손상되었을 때 일어나고, 궤양을 발생하게 한다. 인간 각질형성세포 성장인자(KGF)(서열 4)와 같은 단백질이 장 점막염 모델에서 활성이 있다면, 이 물질은 상피의 증식 및 분화의 자극을 통해 유사분열 인자로서 작용할 수 있다(Potten, et al., Cell Growth Differ. 12: 265-75 (2001)). 별법으로, 인간 KGF(서열 4)는 세포독성 손상에 선행하여 줄기세포 정지상태를 유도함으로써 줄기 세포를 보호하고, 이로써 움 생존을 연장시키는 세포주기 억제제로서 작용할 수 있다(Farrell, et al., Cancer Res. 58: 933-39 (1998)). 유사하게, 경구 점막염에서, 세포독성 손상에 대한 줄기세포의 감수성을 감소시키고/시키거나 노출 후 재생 반응을 향상시키는 치료는 현행 항암 치료 프로토콜의 부작용을 감소시킴으로써 임상적 중요성을 가질 것이다(Sonis, et al., J. Am. Dent. Assoc. 97: 468-472 (1978)).

IL-18의 점막염에 대한 역할을 다루기 위해 1가지 분석 프로토콜(움 생존 분석)을 이용하였다.

A. 움 생존 분석 - 장 점막염의 모델

하기 프로토콜은 에피스템 리미티드(EpiStem, Ltd., Incubator Building, Grafton Street, Manchester, M13 9XX, UK)의 방법을 변형한 것이다.

30마리의 성체(10 내지 12주령) 수컷 BDF1 마우스를 사용하였다. 일주기성 리듬을 안정화하기 위해 모두 2주간 사육하였다(Potten, et al., 1977, Cell Tissue Kinet., 10, 557). 마우스들을 12시간 주:야 주기로 SPF 장벽 단위내 개별적 환기 우리(IVC)에 수용하였다. 동물에게는 음식과 물을 시종 자유롭게 섭취하도록 허락하였다. 모든 과정은 1986년 영국 내무부(동물 조처) 법령에 따라 공인되었다. 동물을 군당 6마리로 무작위 배정하였고, (1) 방사선 조사 전 및 후 ip 염수 주사군, (2) 방사선 조사 전 약물 ip 주사 및 방사선 조사 후 염수 주사군, (3) 방사선 조사 전 ip 염수 주사 및 방사선 조사 후 약물 주사군, (4) 방사선 조사 전 및 후 약물 주사군, (5) 처치하지 않은 대조군, 및 (6) 방사선 조사 전 인간 KGF(서열 4) ip 주사 및 방사선 조사 후 염수 주사군(양성 대조군)의 6개 군이 있었다.

전신 노출로 13Gy X선 방사선의 단회 투여를 이용해 장 손상을 유도하였다. 13Gy가 시험 화합물의 임의의 잠재적 보호 효과를 나타냈기 때문에, 이 값은 연구 시작을 위한 최선의 중간-범위 조사량이었다(Withers, et al., 1969, Rad. Res., 38, 598). 모든 동물은 처치 시작부터 안락사시킬 때까지 일일 1회 체중을 측정하였다. 동물은 방사선 조사 4일 후 안락사시켰다. 소장을 꺼내어 카노이 정착액(Carnoy's fixative)에 고정하였다. 모든 조직은 조직학적으로 가공하였다(파라핀 매몰). 카노이 정착액에 고정된 물질을 이용하여, 각 처치군의 생존 장 움의 개수에 점수를 부여하고, 비처리 대조군(클로노콴트(ClonoQuant, 상표명)에 따름)을 이용하여 크기를 보정하였다. 각 마우스에 대해, 10개의 장 횡단면에 점수를 부여하고, 횡단면 당 움의 평균 개수를 측정하였다(Farrell, et al., 1998, Cancer Res., 58, 933). 크기로 인한 점수 부여 오차를 보정하기 위해 움의 폭 또한 측정하였다. 크기 보정 후, 각 군에 대해 횡단면 당 움의 평균 개수에 점수를 부여하였다. 하기 표 1에 나타낸 주사 프로토콜을 이용하였다. 단백질은 페프로테크(PeproTech)의 카탈로그 100-19번을 구입하였다.

Gp	-3	-2	-1	0	0	+1	+2	+3	+4
1	S	S	S	S	I	S	S	S	C
2	D	D	D	D	I	S	S	S	C
3	S	S	S	S	I	D	D	D	C
4	D	D	D	D	I	D	D	D	C
5									C
6	KGF	KGF	KGF	KGF	I	S	S	S	S
S = 복막내 염수 주사 D = 복막내 약물 주사 KGF = 복막내 양성 대조군 주사 I = 13Gy 방사선 조사 C = 채집 Gp = 군

상기 프로토콜에서, 모든 주사는 09:00시에 수행하였다. 방사선 조사는 15:00시에 수행하였다.

방사선 조사 후 장 움 생존에 대한 쥐과동물 IL-18(서열 2)의 영향은 연구 04/135C에서 측정하였고, 상기 연구는 에피스템 리미티드와의 계약 하에 수행하였다. 에피스템의 클로노콴트(등록상표) 시스템으로 소장 횡단면에서 재생 움을 확인 및 정량하였다. 세포독성 손상 후, 재생 움은 빠르게 증식하였고, 사멸하는 움과 쉽게 구별되었다. 인간 KGF(서열 4)는 6.25mg/kg/일로 투여하였고, 본 연구의 양성 대조군으로 이용하였다. 쥐과동물 IL-18(서열 2)은 5mg/kg/일로 투여하였다. 움 경계선 당 생존 움의 개수에 대한 데이터는 하기 도 6에 나타냈다.

하기 표 2는 방사선 조사에 의해 유도된 점막염 모델로부터 얻은 데이터를 요약한 것이다. 방사선 조사에 의해 유도된 점막염 연구에 대한 양성 대조군(인간 KGF(서열 4))은 방사선 조사 3일 전 투여하였을 때 양호한 활성이 증명되었다. 인간 KGF(서열 4)군은 염수 대조군에 비해 4배 증가된 생존 움의 개수를 나타냈다. 쥐과동물 IL-18(서열 2)은 방사선 조사 3일 전 투여하였을 때, 움 생존이 3배 증가되어 인간 KGF(서열 4)에 필적하는 활성을 가졌다. 쥐과동물 IL-18(서열 2)을 방사선 조사 전 및 후 투여하였을 때, 움 생존의 개수는 염수 대조군과 비교하여 2배 증가하였다. 쥐과동물 IL-18(서열 2)을 방사선 조사 후에만 투여한 경우, 생존 움이 단지 1.6배 증가하여, 가장 적게 효과적이었다. 따라서, 방사선 조사 전에 쥐과동물 IL-18(서열 2)을 3일간 투여하는 것이 가장 효과적인 요법이다.

화학요법 및 방사선요법이 암세포를 사멸하는 데 성공적 치료법이기는 하지만, 건강한 조직 또한 종종 파괴된다. 위장관의 상피 내층이 손상되면, 환자에게 통증을 유발하고, 섭식 불능 및 감염에 대한 감수성을 유발하는 궤양 형성 및 움의 붕괴가 일어날 수 있다. 또한, 점막염의 발병은 방사선요법 또는 화학요법의 완전한 요법을 완료하는 것에 대한 환자의 순응도가 떨어지게 할 수 있다. 쥐과동물 모델에서, KGF는 방사선 및 화학요법에 의해 유발된 경구 및 위장관 상피의 손상을 개선하였다. 재조합 [인간] KGF는 플루오로우라실(fluorouracil)과 류코보린(leucovorin)을 투여하는 전이성 결장직장암 환자의 경구 점막염을 감소시키는 것으로 입증되었다(Meropol et al. J. Clin. Oncol. 21:1452-1458 (2003)). 방사선 조사에 의해 유발된 점막염 모델에서, 쥐과동물 IL-18(서열 2)은 장 움을 보호하는 데 효과를 보였고, 인간에 있어 완화치료에 사용될 수 있다. IL-18은 방사선에 의해 유발된 점막염의 치료에 긍정적인 효과를 보였으므로, 경구 점막염의 손상된 상피 또한 분명히 치료할 수 있다.

원(raw) 데이터: 움 경계선 당 생존 움의 개수

처치	마우스 1	마우스 2	마우스 3	마우스 4	마우스 5	마우스 6	평균
방사선 조사 전 및 후 염수	1.4	4.9	8	3.9	3.1	5	4.4
방사선 조사 전 KGF	17.2	12.4	10.3	20.3	24.2	23.1	17.9
방사선 조사 전 IL-18	21	11	10	6.1	9.6	21	13
방사선 조사 후 IL-18	8	5.6	9.8	3.5	47	10.6	7
방사선 조사 전 및 후 IL-18	10.5	11.4	10.5	8	8.6	5.2	9
처치하지 않고 방사선 조사하지 않은 대조군	105.1	100.3	107.6	102.4	105.5	105.5	104.4

SEQUENCE LISTING <110> DEDE, Kimberly LEE, Judithann <120> METHODS OF HEALING WOUNDS BY ADMINISTERING HUMAN IL-18 <130> PU60998 <140> Herewith <141> 2005-08-05 <150> 60/603,012 <151> 2004-08-20 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapien <400> 1 Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp 20 25 30 Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile 35 40 45 Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile 65 70 75 80 Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys 85 90 95 Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys 100 105 110 Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu 115 120 125 Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 157 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn 1 5 10 15 Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met 20 25 30 Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile 35 40 45 Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser 50 55 60 Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser 85 90 95 Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu 100 105 110 Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu 115 120 125 Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp 130 135 140 Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser 145 150 155 <210> 3 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapien <220> <221> SIGNAL <222> (-241)...(20) <400> 3 Met Asn Arg Cys Trp Ala Leu Phe Leu Pro Leu Cys Cys Tyr Leu Arg -20 -15 -10 -5 Leu Val Ser Ala Glu Gly Asp Pro Ile Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Met 1 5 10 Leu Ser Asp His Ser Ile Arg Ser Phe Asp Asp Leu Gln Arg Leu Leu 15 20 25 His Arg Asp Ser Val Asp Glu Asp Gly Ala Glu Leu Asp Leu Asn Met 30 35 40 Thr Arg Ala His Ser Gly Val Glu Leu Glu Ser Ser Ser Arg Gly Arg 45 50 55 60 Arg Ser Leu Gly Ser Leu Ala Ala Ala Glu Pro Ala Val Ile Ala Glu 65 70 75 Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Gln Ile Ser Arg Asn Leu Ile Asp 80 85 90 Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln 95 100 105 Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Ala Ser 110 115 120 Gln Val Gln Met Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg 125 130 135 140 Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu 145 150 155 Ala Cys Lys Cys Glu Thr Ile Val Thr Pro Arg Pro Val Thr Arg Ser 160 165 170 Pro Gly Thr Ser Arg Glu Gln Arg Ala Lys Thr Pro Gln Ala Arg Val 175 180 185 Thr Ile Arg Thr Val Arg Ile Arg Arg Pro Pro Lys Gly Lys His Arg 190 195 200 Lys Phe Lys His Thr His Asp Lys Ala Ala Leu Lys Glu Thr Leu Gly 205 210 215 220 Ala <210> 4 <211> 164 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Cys Asn Asp Met Thr Pro Glu Gln Met Ala Thr Asn Val Asn Cys 1 5 10 15 Ser Ser Pro Glu Arg His Thr Arg Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly 20 25 30 Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg 35 40 45 Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn 50 55 60 Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile 65 70 75 80 Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys 85 90 95 Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu 100 105 110 Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His 115 120 125 Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val 130 135 140 Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro 145 150 155 160 Met Ala Ile Thr

Claims

상처 치료가 필요한 치료 유효량의 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 상처를 치료하는 방법.
제2항에 있어서, 상처가 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 점막염, 및 폐 손상의 군으로부터 선택된 것인 방법.
제2항에 있어서, 인간 IL-18이 비경구적 투여를 통해 투여되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 비경구적 투여가 피하, 근육내, 정맥내 또는/및 비내 투여의 군으로부터 선택된 것인 방법.
제2항에 있어서, 점막염이 경구 점막염인 방법.
제2항에 있어서, 점막염이 장 점막염인 방법.
상처 치료가 필요한 환자에게, 유효량의 인간 IL-18 폴리펩티드(서열 1)를 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 상처를 치료하는 방법.
제5항에 있어서, 상처가 피부 상처, 수술 상처, 다리 궤양, 당뇨 궤양, 점막염, 및 폐 손상의 군으로부터 선택된 것인 방법.
제8항에 있어서, 점막염이 경구 점막염인 방법.
제8항에 있어서, 점막염이 장 점막염인 방법.
제2항에 있어서, 약제학적 조성물이 비경구적 투여를 통해 투여되는 것인 방법.
제11항에 있어서, 비경구적 투여가 피하, 근육내, 정맥내 또는/및 비내 투여의 군으로부터 선택된 것인 방법.
제8항에 있어서, 상처가 피부 상처이고, 추가로 약제학적 조성물이 환자에게 국소적으로 투여되는 것인 방법.