KR20070031936A - Conserved inner core lipopolysaccharide epitopes as multi?species vaccine candidates - Google Patents

Abstract

본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애( Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap ), 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mannheimia haemolytica , Mh ) 및 파스튜렐라 멀토시다( Pasteurella multocida , Pm)를 포함하는 일정 범위의 질병 유발 원균 단리체의 지질다당류(LPS) 상에서 발현되는 보존된 내부코어 올리고당 에피토프를 개시한다. 말단 노출된 구조로서의 보존된 내부코어 OS 에피토프를 배타적으로 발현하는 돌연변이 박테라아 균주의 설립은, 3종의 유기체 모두에 공통인 내부코어 LPS의 동정, 생산 및 단리를 가능하게 하였다. 또한, 면역원성 담체에 연결된 LPS 내부코어를 포함하는 글리코보조제 및 보존된 LPS 내부코어에 대해 증가된 관련 백신, 항체를 제공한다.The present invention is a bad boy pneumoniae Bacillus Tino flu (Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap), but hey Mia Hemolytica ( Mannheimia A conserved internal core oligosaccharide epitope expressed on a range of lipopolysaccharides (LPS) of a range of disease-causing prokaryotic isolates, including haemolytica , Mh ) and Pasteurella multocida ( Pm ). The establishment of a mutant bactera strain that exclusively expresses a conserved inner core OS epitope as a terminal exposed structure has allowed identification, production and isolation of inner core LPS common to all three organisms. Also provided are glycoadjuvant comprising LPS inner cores linked to immunogenic carriers and associated vaccines, antibodies increased against conserved LPS inner cores.

Description

다종 백신 후보로서의 보존된 내부 코어 지질다당류 에피토프{CONSERVED INNER CORE LIPOPOLYSACCHARIDE EPITOPES AS MULTI―SPECIES VACCINE CANDIDATES}CONSERVED INNER CORE LIPOPOLYSACCHARIDE EPITOPES AS MULTI--SPECIES VACCINE CANDIDATES}

본 발명은 LPS의 내부 코어(inner core) 올리고당 부분의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 수의학적 박테리아성 병원균 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)에 관한 것이다. 본 발명은 악티노바실러스 플루로뉴모니애( Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap ), 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mannheimia haemolytica , Mh ) 및 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida, Pm)를 포함하는 그러나 이에 제한되지 않는 일정 범위의 질병 유발 원균에 대해 박테리아성 수의학적 병원균의 LPS 상에서 발현되는 보존된 에피토프를 동정한다. The present invention relates to a veterinary bacterial pathogen lipopolysaccharide (LPS) comprising one or more epitopes of the inner core oligosaccharide portion of LPS. The present invention is a bad boy pneumoniae Bacillus Tino flu (Actinobacillus pleuropneumoniae, Ap), but hey Mia Hemolytica ( Mannheimia A conserved epitope expressed on the LPS of bacterial veterinary pathogens is identified for a range of disease-causing proteases, including but not limited to haemolytica , Mh ) and Pasteurella multocida (Pm ).

박테리아 병원균들은 인간을 비롯한 광범위한 동물 집단에 있어서 건강 문제뿐만 아니라 상업적 농장 경영에 경제적 손실을 야기하는 중요한 원인이다. Bacterial pathogens are an important cause of economic losses to commercial farm management as well as health problems in a wide range of animal populations, including humans.

수의학적 질병에 연루된 가장 일반적인 세가지 박테리아 병원균으로 만헤이미아 (파스튜렐라) 헤몰리티카 ( Mh ), 악티노바실러스 플루로뉴모니애 ( Ap ) 및 파스튜렐라 멀토시다(Pm)가 있다. Mh는 주로 소와 양의 병원균이고, Ap는 돼지의 병원균이며, Pm은 가금류, 축우 및 돼지를 비롯한 다종 병원균으로 사람에게서 개 및 고양이의 교상으로 인한 감염증을 일으키는 원인균이다. 이들은 모두 동물 사육 산 업에 막대한 경제적 손실을 초래하는 질병을 유발한다.Be involved in a medical illness, only three kinds of the most common bacterial pathogens Hey Mia (par stew Pasteurella) H. Morley Utica (Mh), Bacillus evil Martino Pluronyumoniae ( Ap ) and Pasteurella multocida (Pm ). Mh is mainly bovine and sheep pathogens, Ap is pig pathogen, and Pm is a multi-pathogen including poultry, cattle and pigs, which causes infection of dogs and cats in humans. They all cause diseases that cause huge economic losses to the animal husbandry industry.

최근, 백신으로 세균 백신 또는 천연 그대로 변성된 생균주를 사용하는 것이 실행되고 한다. 이러한 시도는 효과가 불충분하고 역효과 발생률이 현저하기 때문에 전적으로 만족스럽지는 못하다. In recent years, the use of bacterial vaccines or naturally modified live strains as vaccines has been carried out. This approach is not entirely satisfactory because the effect is insufficient and the incidence of adverse effects is significant.

현재 이들 Mh, Ap 및 Pm 3종에 의해 유발되는 전염병에 대한 종간 예방이 가능한 단일 백신은 존재하지 않는다. 이들 병원균 박테리아에 대한 백신이 개발된다면 유용할 것이다. Mh에 의해 유발되는 질병에 대항하기 위한 백신 접근은 여전히 세균 백신 및 약독화 생균주에 주로 기초한다. 보다 최근의 생백신 개발은 뉴라미니다제(neuraminidase), 백혈구 독소, 시알로글리코프로테아제(sialoglycoprotease), 외막 및 규명되지 않은 단백질과 같은 분비된 또는 추출된 Mh 항원을 이용한다. 백혈구 독소는 무독성 백혈구 독소를 발현시키는 돌연변이 균주에 의한 면역화가 여전히 송아지 공격 모델에서 일부 독성을 나타내고, 캡슐 다당류와 배합된 백혈구 독소는 방어적 면역 반응을 할 수 없음에도 불구하고 주요 하위 단위 백신으로 사용되어 왔다. 이와 반대로, LPS는 백혈구 용해 작용을 안정화하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서, LPS와 해독시킨 백혈구 독소에 기초한 결합 백신이 유망할 수 있다[Li, J., and K. D. Clinkenbeard. 1999. Infect. Immun. 67: 2920-2927]. At present there is no single vaccine capable of interspecies prevention against infectious diseases caused by these three Mh , Ap and Pm species. It would be useful if vaccines against these pathogen bacteria were developed. Vaccine approaches to combat diseases caused by Mh are still primarily based on bacterial vaccines and attenuated live strains. More recent live vaccine developments utilize secreted or extracted Mh antigens such as neuraminidase, leukocyte toxin, sialoglycoprotease, outer membrane and unidentified proteins. Leukocyte toxins still show some toxicity in calf attack models when immunization with mutant strains expressing nontoxic leukocyte toxins, and leukocyte toxins combined with capsular polysaccharides are used as major subunit vaccines, even though they do not have a protective immune response. Has been. In contrast, LPS has been found to stabilize leukocyte lysis, and thus, binding vaccines based on LPS and detoxified leukocyte toxins may be promising [Li, J., and KD Clinkenbeard. 1999. Infect. Immun. 67: 2920-2927.

Ap에 의해 유발되는 질병에 대항하는 최근의 접근법은 약독화 생균주에 기초하고 있는데 이는 이들이 방어에 필요한 항체를 중화시키는 매우 불안정한 Apx 독소를 함유하고 있기 때문이다. Apx 독소는 Ap에 대응하는 주요 하위 단위 백신의 기초를 형성하지만 단지 부분적인 임상 방어만을 유도하는 것으로 보인다. LPS의 핵 OS를 비롯한 부착소(adhesion)가 개선된 백신 후보로 제안된 바 있다 [Van Overbeke L, 등. 2003. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 50: 289-293]. 현재, 돼지의 Pm 질병을 예방하는 백신은 톡소이드와 협막 및 외막 단백질과 같은 균체 항원으로 이루어져 있다. Pm은 파스퇴르에 의해 최초로 닭에서 조류 콜레라를 유발하는 것으로 밝혀졌으며 이 질병에 대한 현재의 방법은 약독화 Pm 균주를 사용하는 것이다. 그러나, 일반적으로 이 방법은 매우 제한적인데, 이는 면역 반응이 혈청형에 제한되며 다른 혈청형에 대한 교차 보호를 제공할 수 없기 때문이다. Pm의 LPS는 감염에 대한 면역에 있어서 일정 부분 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Recent approaches against Ap- induced diseases are based on attenuated live strains because they contain very unstable Ap x toxins that neutralize the antibodies needed for defense. Ap x toxins form the basis of major subunit vaccines corresponding to Ap but appear to induce only partial clinical defenses. Adhesions, including nuclear OS of LPS, have been proposed as improved vaccine candidates [Van Overbeke L, et al. 2003. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 50: 289-293]. Currently, the vaccine for preventing Pm disease in pigs consists of cell antigens such as toxoids and capillary and outer membrane proteins. Pm was first discovered by Pasteur to cause avian cholera in chickens and the current method for this disease is to use attenuated Pm strains. In general, however, this method is very limited because the immune response is limited to serotypes and cannot provide cross protection for other serotypes. LPS of Pm has been shown to play a role in immunity to infection.

이들 각각의 세균으로부터 얻어지는 LPS가 하위 단위 백신 설계에 있어 우수한 후보가 될 수 있음을 나타내는 많은 증거들이 축적되어 있다. LPS는 가시적일 뿐만 아니라 Mh 및 mAb들 표면 상의 주요 항원 결정인자로서 시험관 내(in viro)에서의 보체 매개성 사멸이 아닌 A1 LPS 촉진 식균작용을 초래하는 것으로 밝혀졌다 [Wilson, C. F., 등 1992. Vet. Microbiol. 31: 161-168]. There is a great deal of evidence that indicates that LPS from each of these bacteria can be a good candidate for subunit vaccine design. LPS is not only visible but also in vitro as a major antigenic determinant on the surface of Mh and mAbs. viro ), but not complement mediated killing but resulted in A1 LPS promoted phagocytosis [Wilson, CF, et al. 1992. Vet. Microbiol. 31: 161-168.

Pm에서, 리보좀-LPS 백신이 동종 Pm 균주로부터 발병되는 조류 콜레라로부터 닭을 보호하였다 [Phillips, M., 및 R. B. Rimler. 1984. Am. J. Vet. Res. 45: 1785-1789]. 그 밖에도, LPS-단백질 복합체는 동종 균주로 공격당했으나 방어가 불가능한 복합체의 개개 성분들이 분리되었을 때 쥐에 있어서 100% 방어력을 제공하였다. Pm에서 LPS로 생육된 mAb들만이 쥐 모델에서 부분적인 방어능력을 보였 으며, 이들이 비록 식균작용을 나타내지만 보체 존재 하에서는 살균성을 보이지는 않았다. 그러나, 또 다른 연구에서는, Pm LPS의 mAb가 상동 공격에 대해 쥐를 완벽하게 보호했으며 살균성을 보였다 [Wijewardana, T. G., 등 1990. J. Med. Microbiol. 33: 217-222]. 유형 A로부터 얻은 LPS를 모의한 항 유전자형 백신은 동족 미생물로 공격당했을 때 쥐 모델에서 방어능을 보였다. At Pm , the ribosomal-LPS vaccine protected chickens from avian cholera that originated from the homologous Pm strain [Phillips, M., and RB Rimler. 1984. Am. J. Vet. Res. 45: 1785-1789. In addition, LPS-protein complexes provided 100% protection in mice when individual components of the unprotected complex were attacked with homologous strains. Only mAbs grown at Pm to LPS showed partial protection in the mouse model, although they showed phagocytosis but were not bactericidal in the presence of complement. However, in another study, mAbs of Pm LPS completely protected mice against homologous attack and showed bactericidal [Wijewardana, TG, et al. 1990. J. Med. Microbiol. 33: 217-222. Anti-genotype vaccines simulating LPS from type A showed protection in a rat model when attacked with cognate microorganisms.

Ap에서, LPS 및 보다 구체적으로 LPS의 코어 영역은 박테리아의 접착 능력에 관련되어 있다. Ap 혈청형 1 LPS에 연결된 BSA의 결합 백신은 이종 공격이 아닌 동종 공격 뒤에 쥐를 보호할 수 있으며, 혈청형 5 및 1로부터의 부드럽거나(smooth) 거친(rough) Ap LPS 결합체 모두는 Ap 세포벽의 탄수화물 부분이 돼지 면역 반응에서 중요한 역할을 한다고 제안되었다 [Fenwick, B., 및 B. I. Osburn. 1986. Infect. Immun. 54: 583-586]. At Ap , LPS and more specifically the core region of LPS are related to the adhesion ability of bacteria. Binding vaccines of BSA linked to Ap serotype 1 LPS can protect mice following allogeneic but not heterologous attacks, and both smooth or rough Ap LPS conjugates from serotypes 5 and 1 are present in the Ap cell wall. It has been suggested that the carbohydrate moiety plays an important role in the porcine immune response [Fenwick, B., and BI Osburn. 1986. Infect. Immun. 54: 583-586.

이러한 맥락에서, 앞서 언급한 수의학적 생물들이 백신 후보로서 고려될 수 있는 표면이 노출된 탄수화물 부분들을 함유하고 있다. 이들 탄수화물 부분들은 LPS 및 협막(capsular) 다당류를 포함한다. 협막 다당류는 박테리아의 표면에 직접 연결된 몇몇 탄수화물 잔기로 이루어진 반복 단위인 반면, LPS는 3개의 영역으로 이루어져 있는데, 지방산 잔기를 통해 LPS 분자를 박테리아 표면에 연결시키는 지질 A 영역, 지질 A 영역을 제 3의 영역에 연결시키는 비교적 보존된 코어 올리고당 영역, 가변성 다당류 항원(O-항원)이 그것이다. 균주간의 협막 및 O-항원 다당류의 이질성은 동종 균주들에 대해서만 적용될 수 있는 그들의 능력 때문에 경제적으로 살아남을 수 있는 백신 후보로서의 자격을 저해한다. 최근의 분자 유전학, 분자 구조 분석 및 면역 화학에서의 진보로 강력한 방편을 얻게 되었으며 이는 과학자들로 하여금 후보 백신 항원으로서의 탄수화물 구조의 확인을 가능하게 하였다. In this context, the aforementioned veterinary organisms contain exposed surface carbohydrate moieties that may be considered vaccine candidates. These carbohydrate moieties include LPS and capsular polysaccharides. The capsular polysaccharide is a repeating unit consisting of several carbohydrate moieties directly linked to the surface of the bacterium, while the LPS consists of three domains: the lipid A region, the lipid A region, which links LPS molecules to the bacterial surface via fatty acid residues. It is a relatively conserved core oligosaccharide region, variable polysaccharide antigen (O-antigen) that links to the region of. Heterogeneity of the capsular and O-antigen polysaccharides between strains hinders qualification as vaccine candidates that can survive economically because of their ability to be applied only to homologous strains. Recent advances in molecular genetics, molecular structure analysis, and immunochemistry have provided powerful tools, enabling scientists to identify carbohydrate structures as candidate vaccine antigens.

지질다당류(LPS)는 Mh, Ap 및 Pm의 필수적이고 특징적인 표면-노출 항원이다(앞서 논의한 바와 같이, 본원에 사용된 용어인 지질다당류 및 LPS는 단쇄 지질다당류 및 지질올리고당(LOS)을 포함한다). Pm 균주들은 다수의 올리고당 에피토프들 중에서 광범위한 항원의 다양성을 발현시킬 수 있는 저분자량 LPS의 이종 개체들을 발현시키며, 이로서 Mh 및 Ap의 균주들은 저분자량 LPS 및 O-항원 중합체를 갖는 전통적인 LPS 분자 모두를 발현시킨다. 본 출원인에 의해 서술된 Mh, Ap 및 Pm의 LPS 탄수화물 구조는 적절한 방식으로, 예를 들면, 단백질-접합체로 숙주 면역 체계에 주어진 경우, 방어 항원의 공급원을 제공할 수 있다. 본 출원인의 연구에서 LPS는 백신 후보로서 유용한 것으로 증명되었는데, 이는 예기치 않게 표면이 노출된 탄수화물 항원이 유전학적으로 생리학적으로 안정하고 여러 균주 범위에 걸쳐 보존되고, Mh, Ap 또는 Pm 3종 모두에서 제거 기전을 주관할 수 있는 올리고당 에피토프를 갖고 있는 것으로 증명되었기 때문이다. Lipopolysaccharide (LPS) is an essential and characteristic surface-exposed antigen of Mh , Ap and Pm (as discussed above, the terms lipopolysaccharide and LPS as used herein include short-chain lipopolysaccharides and lipopolysaccharides (LOSs). ). Pm strains express heterologous individuals of low molecular weight LPS capable of expressing a wide range of antigenic diversity among a plurality of oligosaccharide epitopes, such that strains of Mh and Ap are capable of expressing both traditional LPS molecules with low molecular weight LPS and O-antigen polymers. Expression. The LPS carbohydrate structures of Mh , Ap and Pm described by the Applicant can provide a source of protective antigen in a suitable manner, eg, given to the host immune system in a protein-conjugate. Applicants' studies have shown that LPS is useful as a vaccine candidate, in which unexpectedly exposed carbohydrate antigens are genetically physiologically stable and conserved over a range of strains, and in all three Mh , Ap or Pm species. It has been proven to have oligosaccharide epitopes that can control the elimination mechanism.

Mh, Ap 및 Pm LPS 분자의 탄수화물 영역은 숙주 면역 반응에 의한 인식의 표적을 제공한다. 구조를 결정하는 것은 Mh, Ap 및 Pm LPS의 생물학과 박테리아 독성에서 이들의 역할을 이해하는데 중요하다. Mh, Ap 및 Pm LPS는 가변성 올리고당 부분과 막 고정-지질A 성분으로 이루어진 분자들의 이종 혼합물과 Mh 및 Ap의 몇몇 균주의 경우에는 중합체 O-항원을 포함한다. 본원에 서술된 실험들을 바탕으로, 포스포릴화 케토데옥시 옥토노에이트(phosphorylated ketodeoxy octonoate, Kdo) 잔기에 의해 지질 A 성분에 부착되고 이제껏 검사한 모든 균주에 보존되며 존재하는 것으로 밝혀진 테트라-헵토실-디-글루코실 내부 코어 부분으로 이루어진 Mh, Ap 및 Pm LPS의 구조 모델을 확인하였다. The carbohydrate region of the Mh , Ap and Pm LPS molecules provide a target of recognition by the host immune response. Determining the structure is important for understanding their role in the biology and bacterial toxicity of Mh , Ap and Pm LPS. Mh , Ap and Pm LPS include heterologous mixtures of molecules consisting of variable oligosaccharide moieties and membrane fixed-lipid A components and polymer O-antigens for some strains of Mh and Ap . Based on the experiments described herein, tetra-heptosyl has been found to be attached to the lipid A component by phosphorylated ketodeoxy octonoate (Kdo) residues and conserved and present in all strains tested so far. A structural model of Mh , Ap and Pm LPS consisting of the di-glucosyl inner core portion was identified.

구조 분석을 통해, 3종 모두에서 절대적으로 보존되는 최대 구조는 하기 구조식 I에 예시된 바와 같다. Through structural analysis, the maximum structure that is absolutely conserved in all three species is as illustrated in Formula I below.

상기에서, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)이고, Hep는 헵토스이고, Glc는 글루코스이고, P는 포스페이트이며, 지질 A는 해독되었다. In the above, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid, Hep is heptose, Glc is glucose, P is phosphate Lipid A was detoxified.

백신 개발에 항원을 이용하기 위해서는 네가지 필수 조건이 반드시 충족되어야 한다. 후보 항원의 면역원 에피토프는: To use an antigen in vaccine development, four essential conditions must be met. Immunogen epitopes of candidate antigens are:

유전적으로 안정해야 하고; Must be genetically stable;

교차 종들 간에 임상학적으로 관련된 균주들에서 보존되어야 하고; Must be preserved in clinically relevant strains between cross species;

면역 메커니즘을 주관(시험관내 및 생체내)할 수 있어야 하며; Immune mechanisms must be able to be controlled (in vitro and in vivo);

생체 내(in vivo)에서 방어적 항체를 유도할 수 있어야 한다. In vivo (in It should be possible to induce protective antibodies in vivo .

본 발명은 이들 조건 대부분을 만족시키는 것으로 밝혀진 보존 LPS 탄수화물 에피토프를 확인하였다. The present invention identified conserved LPS carbohydrate epitopes found to satisfy most of these conditions.

i) 유전적 안정성: 보존 내부 코어 올리고당의 생합성에 연루된 유전자들은 상기 3개의 박테리아 종에서 확인되었다(Pm 균주 2종, Mh 균주 1종 및 Ap 균주 2종). 이들 박테리아 종에 의해 나타나는 여러가지 외핵 변종에 연루된 유전자는 가변성인 것으로 밝혀졌으며, 이들 데이터는 이들 게놈 균주와 각각의 박테리아 종의 추가 균주에 대한 구조적 데이터로 확인되었다. 그러나, 구조적 및 유전적 분석은 모두(표 A 참조) 내부 코어 생합성을 책임지는 것으로 알려진 유전자가 언제나 존재하기 때문에 내부 코어 구조가 구조적으로 보존된 것으로 나타났다. i) Genetic Stability: Genes involved in the biosynthesis of conserved internal core oligosaccharides have been identified in these three bacterial species (two Pm strains, one Mh strain and two Ap strains). Genes implicated in the various extranuclear variants represented by these bacterial species have been found to be variable, and these data have been identified as structural data for these genomic strains and additional strains of each bacterial species. However, both structural and genetic analysis (see Table A) showed that the internal core structure was structurally conserved because there was always a gene known to be responsible for internal core biosynthesis.

표 A. 수의학적 병원균들의 보존된 내부 코어 LPS의 글리코실트랜스퍼라제Table A. Glycosyltransferases of conserved internal core LPS of veterinary pathogens

수의학적 병원균 게놈 균주에서 보존된 내부 코어 글리코실트랜스퍼라제Internal Core Glycosyltransferase Conserved in Veterinary Pathogen Genome Strains

ii) 구조적 보존: 본 출원인에 의해 현재까지 조사된 모든 균주에서, 이 테트라-헵토실-디-글루코실 부분은 하기의 구조적 요소(구조식 II)내에 포함되어 있었다.ii) Structural Conservation: In all strains investigated to date by the Applicant, this tetra-heptosyl-di-glucosyl moiety was contained within the structural element (Formula II) below.

상기에서, -R은 H 또는 포스포에탄올아민(PEtn)이고, P는 포스페이트이고, R' 및 R"은 H 또는 올리고당 사슬 연장부로, 바람직하게는 β-D-Galp-(l-7)-D-α- D-Hepp-(1-6)을 포함하지 않으며, R'"은 Ap에서 가변성 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다. In the above, -R is H or phosphoethanolamine (PEtn), P is phosphate, R 'and R "are H or oligosaccharide chain extension, preferably β-D-Gal p- (l-7) Does not contain -D-α- D-Hep p- (1-6), R '"is a variable O-antigen at Ap , Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, Lipid A was detoxified.

표 B: 수의학적 병원균 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mh ), 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Ap) 및 파스튜렐라 멀토시다(Pm)로부터 얻어진 LPS의 핵 올리고당에서 보존된 영역과 가변성 영역의 구조Table B: Veterinary Pathogens Manhemia Structures of the conserved and variable regions in the nuclear oligosaccharides of LPS obtained from hemolytica ( Mh ), actinobacillus flulogneumoniae (Ap) and Pasteurella multocida (Pm )

상기 표에서, Pm 헵토스 잔기에 대하여, Hep^IV는 L-α-D 구조이다. 또한, Pm에서, Kdo의 4-위치에 P-R 대신 두번째 Kdo 잔기가 있을때, Hep^I의 6위치에 있는 α-글루코스는 소수의 단백당형(glycoforms)에는 없고, Kdo 잔기에서 구조적 차이에 수반하는 것이다.In the table above, for Pm heptose residues, Hep ^IV is a L-α-D structure. In addition, at Pm , when there is a second Kdo residue in place of PR at the 4-position of Kdo, α-glucose at the 6-position of Hep ^I is absent in a few glycoforms and is accompanied by structural differences in the Kdo residue.

제 1 헵토스 잔기(Hep^I)는 유일한 헵토스 잔기로, 이로부터 코어 올리고당 연장이 일어나는 것이 3종 모두에서 발견되었다. 외부 코어의 연장은 HepIV 잔기F 로부터 추가로 발생한다. 어떠한 종에서도 Hep^II 또는 Hep^III로부터 코어 올리고당의 연장은 관찰되지 않았다. Ap 혈청형 5에서 O-항원 연장은 Hep^III 잔기로부터 일어나는 것으로 밝혀졌으며 [St. Michael, F. 등 2004, Carbohydr. Res., 339: 1973-1984], 코어 OS에 O-항원이 부착된 것이 Mh에서는 관찰되지 않았다. Pm에서는 어떠한 항원 중합체의 반복단위도 관찰되지 않았다. 4개의 유전자가 rfbP 및 rfbU를 포함하는 Ap 혈청형 1에서의 O-항원 생합성에 관여하는 것으로 밝혀졌다 [Labrie, J. 등 2002, J. Endotox. Res., 8: 27-38]. 3종 모두의 내부 코어는 Pm 균주 Pm70 내 Hep^II 잔기의 3-위치나, Ap, Mh, 및 Pm 내 Kdo-P 잔기가 포스포에탄올아민 잔기로 추가로 치환될 수 있다. Pm에서, 적은 수의 LPS 단백당형 개체가 Kdo-P 또는 Kdo-P-PEtn 부분 대신 두개의 Kdo 잔기를 동화시키는 것으로 밝혀졌으며 두번째 Kdo 잔기의 존재가 내부 코어 α-Glc 잔기의 유실과 동시에 일어난다. 상기 3종 내에서 그리고 3종 간에 외부 코어 변이가 관찰되었다. Ap 혈청형 1에서, 외부 코어 연장은 NMR에 의해 구조적으로 완전히 규명되었으며,(1S)-GalaNAc-(1-4,6)-α-Gal-(1-3)-β-Gal을 말단기로 하는 드물게 발견되는 개방쇄 N-아세틸갈락토사민 구조를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 구조는 혈청형 9 및 11에서도 질량 스펙트럼 관찰에 의해 예상되었다. Ap 혈청형 2에서, Hep^IV 잔기는 4-위치가 β-Glc 잔기로 치환되고 6-위치가 D,D-α-Hep^V 잔기로 치환되어 이치환된 것으로 밝혀졌다. Ap 혈청형 5에서는, D,D-α-Hep^V 잔기만이 Hep^IV에 치환되었다. Ap 혈청형 5에서 발견된 것과 유사한 외부 코어 연장이 Mh에서 관찰되었는데, 두번째 D,D-α-Hep^V 잔기 자체가 7-위치에서 β-Gal 잔기로 치환되었다. Pm에서는, 두개의 혈청형 1 균주인 VP161 및 X73에 대한 연구에서, 특이한 외부 코어 연장부가 관찰되었는데, Hep^IV 잔기가 4-위치와 6-위치 모두에서 β-Gal 잔기로 대칭적으로 치환되었으며, 이들 자체가 또한 3-위치의 포스포콜린 부분들이 일치환되었거나, 포스포콜린 잔기 외에도, β-Gal 잔기(X73)의 6-위치가 포스포에탄올아민 잔기로 치환되었다. 게놈 서열이 밝혀진 균주 Pm70에 대한 또다른 연구에서는 4-위치와 6-위치가 다시 한번 이치환된 것으로 밝혀졌다. 4-위치는 β-글루코스 잔기로 치환되었으며 6-위치는 특이하게도 5당류인 α-GalNAc-(l-3)-β-GalNAc-(l-3)-α-Gal-(l-4)-βGal-(l-4)-β-Glc으로 치환되었다. The first heptose moiety (Hep ^I ) is the only heptose moiety from which all three have been found to result in core oligosaccharide extension. Extension of the outer core further occurs from HepIV residue F. No extension of core oligosaccharides from Hep ^II or Hep ^III was observed in any species. O-antigen extension in Ap serotype 5 was found to occur from Hep ^III residues [St. Michael, F. et al. 2004, Carbohydr. Res., 339: 1973-1984], the attachment of O-antigen to the core OS was not observed in Mh . No repeating units of any antigenic polymer were observed in Pm . Four genes were found to be involved in O-antigen biosynthesis in Ap serotype 1, including rfbP and rfbU [Labrie, J. et al. 2002, J. Endotox. Res., 8: 27-38. All three inner cores may be further substituted with the 3-position of the Hep ^II residues in the Pm strain Pm70 or with the KdO-P residues in Ap , Mh , and Pm with phosphoethanolamine residues. At Pm , a small number of LPS protein glycosides have been found to assimilate two Kdo residues instead of Kdo-P or Kdo-P-PEtn moieties and the presence of a second Kdo residue coincides with the loss of the inner core α-Glc residue. Outer core variations were observed within and among the three species. In Ap serotype 1, external core extension was structurally fully characterized by NMR, with (1S) -GalaNAc- (1-4,6) -α-Gal- (1-3) -β-Gal as terminal Was found to contain the rarely found open chain N-acetylgalactosamine structure. This structure was also predicted by mass spectral observations in serotypes 9 and 11. In Ap serotype 2, Hep ^IV residues were found to be disubstituted with 4-positions substituted with β-Glc residues and 6-positions replaced with D, D-α-Hep ^V residues. In Ap serotype 5, only D, D-α-Hep ^V residues were substituted for Hep ^IV . External core extension similar to that found in Ap serotype 5 was observed in Mh , with the second D, D-α-Hep ^V residue itself replaced by a β-Gal residue at the 7-position. In Pm , in the study of two serotype 1 strains, VP161 and X73, unusual external core extensions were observed, with Hep ^IV residues symmetrically substituted with β-Gal residues at both 4- and 6-positions, They themselves also have monosubstituted phosphocholine moieties at the 3-position, or in addition to the phosphocholine residues, the 6-position of the β-Gal residue (X73) has been replaced with a phosphoethanolamine residue. Another study of strain Pm 70, in which the genomic sequence was identified, found that the 4- and 6-positions were once again disubstituted. The 4-position was substituted with the β-glucose residue and the 6-position was specifically the 5-saccharide α-GalNAc- (l-3) -β-GalNAc- (l-3) -α-Gal- (l-4)- substituted with βGal- (l-4) -β-Glc.

iii) 접근성: 이 내부 코어 구조는 상기 3종에서 일관되게 발현되기 때문에, 이 내부 코어 구조의 에피토프들이 외부 코어, O-항원 및 다른 세포 표면 구조들에서의 다양성에 상관없이 접근가능하고 구조적으로 보존되는지를 확인하는 것이 중요하다. 말단 구조로서 정의되는데 필요한 이 보존된 구조를 얻기 위해 이 구조를 노출시키는 것으로 글리코실트랜스퍼라제를 지정하였다. 균주들의 LPS 구조에 대한 완벽한 지식(실시예 3 참조)과 함께 Pm 균주 Pm70의 완전한 게놈 서열이 유효하여 Pm70 LPS 구조의 생합성을 초래하는 글리코실트랜스퍼라제들의 시험적인 동정이 용이하였다. 다른 게놈 서열 또한 두번째 Pm 균주(P-3480), 2종의 Ap 균주들(혈청 형 1 및 5) 및 1종의 Mh 균주(혈청형 Al)에 대해 전개 중이며 돌연변이 유도를 위한 표적 유전자의 확인을 위해 생물정보학적 접근을 시도하였다. 생체내 존재하는 O-항원의 양이 Ap에 비해 낮으며, 따라서 후속 면역학 연구에 방해되지 않기 때문에 Mh 균주 Al를 돌연변이 연구를 위해 선택하였다. 이후 예시되는 바와 같이, 후보 글리코실트랜스퍼라제들은 a) Mh 균주 Al과 b) Ap 혈청형 1 모두에서 확인되었다.iii) Accessibility: Since this inner core structure is consistently expressed in the three species, epitopes of this inner core structure are accessible and structurally conserved regardless of the diversity in the outer core, O-antigen and other cell surface structures. It is important to verify that Glycosyltransferases were designated as exposing this structure to obtain this conserved structure needed to be defined as a terminal structure. With complete knowledge of the LPS structure of the strains (see Example 3), the complete genome sequence of the Pm strain Pm70 was valid, facilitating the experimental identification of glycosyltransferases resulting in biosynthesis of the Pm70 LPS structure. Other genomic sequences are also being developed for the second Pm strain (P-3480), two Ap strains (serum types 1 and 5) and one Mh strain (serum type Al) and confirmed the identification of target genes for mutation induction. A bioinformatics approach was attempted. Mh strain Al was chosen for mutational studies because the amount of O-antigen present in vivo is low compared to Ap and therefore does not interfere with subsequent immunological studies. As exemplified later, candidate glycosyltransferases were identified in both a) Mh strain Al and b) Ap serotype 1.

H. 듀크레이 ( ducreyi ) lbgA 갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 상동체 [Tullius, M. V. 등 2002, Infect. Immun. 70: 2853-2861]가 미니-TnlO 트랜스포손 돌연변이 유도(transposon mutagenesis)에 의해 코어 올리고당 생합성에 관련된 것으로 밝혀진 두개 유전자 사이에 위치한 것으로 Ap에서 확인되었다 [Galarneau, C. 등 2000, Pathogenesis, 1: 253-264]. Ap, lbgB에서 이웃한 유전자들은 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi)로부터 유도된 O-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제에 대해 상당한 상동성을 보였다. Ap로부터 얻어진 lbgB 유 전자 서열을 갖는 Mh 게놈 서열(Baylor College, Houston)의 Blast 분석에서 Mh 게놈 서열의 D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제에 대해 두개의 이웃한 상동체가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 확인된 가장 우수한 lbgB 상동체는 제 1 L-글리세로-D-만노-헵토스 잔기(Hep^I)로부터의 연장부에 D-글리세로-D-만노-헵토스 잔기(Hep^IV)를 추가하는 것에 관여하는 D-글리세로-O-만노-헵토실트랜스퍼라제여야 하는 것으로 확인되었으며, 따라서 본 출원인은 두번째 상동체(losB 로 명명)는 제2 O-글리세로-O-만노-헵토스 잔기(Hep^V)의 추가에 관여하는 D-글리세로-D-만노-헵토스실트랜스퍼라제인 것으로가정하였다. H. Duke ray (ducreyi) homologues of galactosyl transferase gene chamber go lbgA [Tullius, MV, such as 2002, Infect. Immun. 70: 2853-2861 has been identified in Ap as being located between two genes found to be involved in core oligosaccharide biosynthesis by mini-TnlO transposon mutagenesis [Galarneau, C. et al. 2000, Pathogenesis, 1: 253]. -264]. Neighboring genes in Ap and lbgB showed significant homology to O-glycero-D- manno-heptosyltransferase derived from Haemophilus ducreyi . Blast analysis of the Mh genome sequence (Baylor College, Houston) with the lbgB gene sequence obtained from Ap indicated that there are two neighboring homologues for D-glycero-D- manno - heptosyltransferase of the Mh genomic sequence. Turned out. The best lbgB homologues identified are those that add a D-glycero-D- manno - heptose residue (Hep ^IV ) to the extension from the first L-glycero-D- manno - heptose residue (Hep ^I ). It has been found that it must be a D-glycero-O- manno-heptosyltransferase that is involved in it, and therefore the Applicant finds that the second homologue (named losB ) is the second O-glycero-O- manno-heptos residue ( Hep ^V ) was assumed to be D-glycero-D-manno-heptosyltransferase.

표준 분자생물학 기술을 이용하여 이 유전자를 돌연변이시키고, 얻어진 돌연변이 균주로부터 유도된 LPS를 구조적으로 특성화하여 의도한 보존된 내부 코어 구조가 얻어진 것으로 확인하였다(실시예 7 참조). 상기 수의학적 병원균들의 일정 범위 균주들에 대한 상기 구조의 보존도 및 접근성을 검사하기 위해 내부 코어 LPS 구조로 mAb 및 pAb를 생장시켰다. 얻어진 폴리클론 혈청은 이들 Mh, Ap 및 Pm 3종 각각의 LPS 및 전세포 모두에 대해 교차 반응성을 가졌다. 1회 융합으로 얻어진 4개의 mAb(G3, G8, E8 및 D8)는 Mh 전세포 상에 제시되었을 때 내부 코어 구조에 특이적이었다. 후속 융합에 의해 얻어진 3개의 mAb(3-4, 3-5 및 3-16)은 Mh, Ap 및 Pm 균주 모두로부터 유도된 LPS와 교차 반응할 수 있었으며, 따라서 이들 수의학적 병원균 3종 간에 공통된 보존된 교차반응성 LPS 에피토프의 가능성을 확립하였다. 복수액(ascites fluid)을 이들 4개의 mAb(G3, G8, 3-5 및 3-16)에서 생장시키고 전 세포 ELISA로 검사하였다. 검사 결과, 이들 mAb에 의해 인식된 LPS 에피토프들은 전세포에 접근가능했으며 따라서 보존된 내부 코어 에피토프들은 세포 표면에 접근가능함이 입증되었다. 또한, mAb G3 및 G8는 Mh 감염증에 걸린 쥐 모델에서 수동적 방어를 촉진했으며, 이는 생체내에서 내부 코어 구조에 대한 접근성을 나타내는 것이다. This gene was mutated using standard molecular biology techniques and the structural characterization of the LPS derived from the resulting mutant strains confirmed that the intended conserved internal core structure was obtained (see Example 7). MAb and pAb were grown with an internal core LPS structure to examine the conservation and accessibility of the structure to a range of strains of the veterinary pathogen. The resulting polyclonal sera had cross reactivity against all LPS and whole cells of each of these Mh , Ap and Pm species. Four mAbs (G3, G8, E8 and D8) obtained in one fusion were specific to the internal core structure when presented on Mh whole cells. Three mAbs (3-4, 3-5 and 3-16) obtained by subsequent fusion were able to cross react with LPS derived from all of the Mh , Ap and Pm strains, thus conserving common between these three veterinary pathogens The possibility of isolated cross-reactive LPS epitopes was established. Ascites fluid was grown in these 4 mAbs (G3, G8, 3-5 and 3-16) and examined by whole cell ELISA. Examination demonstrated that LPS epitopes recognized by these mAbs were accessible to whole cells and thus conserved internal core epitopes were accessible to the cell surface. In addition, mAb G3 and G8 promoted passive defense in a rat model with Mh infection, indicating access to internal core structures in vivo.

iv) 기능성 항체들: 상기 3종의 LPS와 교차반응성을 갖는 폴리클론 혈청 함유 항체들, 및 mAb G8 및 G3은 Mh 세포들의 보체-매개 용해를 촉진할 수 있다. 수동적 방어 연구를 Mh 감염증의 쥐모델에서 수행하였으며, Mh의 보존된 내부 코어 LPS 구조에 특이적인 mAb(G3 및 G8)를 제공함으로써 질병에 대한 방어가가능한 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 보존된 탄수화물 구조가 캐리어 단백질 HAS에 연결된 결합 백신을 생산하였으며, 이 결합 백신으로 면역화한 후 생장된 쥐 혈청은 상기 3종으로부터 얻어진 LPS 및 전세포와 교차 반응성을 갖는 것으로 밝혀졌다. iv) Functional Antibodies: Polyclonal serum containing antibodies that cross-react with the three LPS, and mAb G8 and G3, can promote complement-mediated lysis of Mh cells. Passive defense studies were performed in a mouse model of Mh infection and were found to be able to defend against disease by providing mAbs (G3 and G8) specific for the conserved inner core LPS structure of Mh . Finally, a conserved carbohydrate structure produced a binding vaccine linked to the carrier protein HAS, and mice immunized with this binding vaccine were found to have cross-reactivity with LPS and whole cells obtained from the three species.

본 발명은 백신, 백신 성분, 및 수의학적 박테리아성 병원균의 지질다당류(LPS)로부터 유도된 면역성 수반 B-세포 활성화 분자의 제공에 적합한 이들의 사용방법을 제공하며, 상기 분자들은 지질다당류의 내부 코어 올리고당 부분 중 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 본원에 공개된 내용은 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Ap), 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mh ) 및 파스튜렐라 멀토시다(Pm)를 포함하는 그러나 이에 제한되지 않는 질병을 유발하는 일정 범위의 원균에 대해 박테리아성 수의학적 병원균의 LPS 상에서 발현되는 에피토프를 동정하고 특성화한다. 본원에서는 백신 제조에 사용하기 적합한 것으로 규명된 하위 단위 항원을 동정한다. 백신 후보인 항원들은 자연 상태에서 박테리아의 표면에서 발현되는 것이 바람직한데, 이는 백신 항원에 대한 면역 반응이 이후 살아있는 생물을 표적으로 할 수 있기 때문이다. The present invention provides vaccines, vaccine components, and methods of use thereof suitable for the provision of immunosuppressive B-cell activating molecules derived from lipopolysaccharides (LPS) of veterinary bacterial pathogens, the molecules comprising the inner core of lipopolysaccharides. At least one epitope of the oligosaccharide moiety. Disclosed herein are Actinobacillus flulognumoniae (Ap), Manhemia Identify and characterize epitopes expressed on LPS of bacterial veterinary pathogens against a range of progeny that cause diseases including but not limited to hemolytica ( Mh ) and Pasteurella multocida (Pm ). . The subunit antigens identified herein as suitable for use in vaccine preparation are identified. Antigens that are vaccine candidates are preferred to be expressed on the surface of bacteria in their natural state, since an immune response to vaccine antigens can then target living organisms.

본 출원인은 3종의 생물 모두에서 공통되는 내부 코어 LPS를 발견하여 이를 생산하였다. LPS는 이들 수의학적 병원균 각각에 대한 면역성에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 만일 LPS 항원이 구조적으로 보존될 수 있다면, 면역반응이 동종 및 이종 균주(strain)들 뿐만 아니라 종(species)까지도 인식할 수 있을 것이다. Applicants have discovered and produced internal core LPS common to all three organisms. LPS has been shown to be involved in immunity to each of these veterinary pathogens, and if the LPS antigen can be conserved structurally, the immune response can recognize species as well as homogeneous and heterologous strains. will be.

구조적 분석 데이터에 따르면, 이들 수의학적 병원균들은 공통이거나 보존된 내부 코어 OS 구조를 공유하는 것으로 나타났다. 따라서, LPS-기초 백신의 가능성을 조사해보기로 결정하였다. Structural analysis data show that these veterinary pathogens share a common or preserved internal core OS structure. Therefore, it was decided to investigate the possibility of LPS-based vaccines.

이 방법의 제 1 단계는 말단 노출 구조로서 보존된 내부 코어 OS 에피토프를 배타적으로 발현시키는 돌연변이 균주를 구성하는 것이다. 본 연구에서는 말단 노출 부분으로 보존된 내부 코어 에피토프를 제시하기 위해 Mh 균주 Al로부터 α-1, 6-D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제 유전자에 돌연변이를 발생시켰다. The first step of this method is to construct a mutant strain that exclusively expresses the internal core OS epitope preserved as a terminal exposed structure. In this study, mutations were made to the α-1, 6-D-glycero-D-manno-heptosyltransferase gene from Mh strain Al to present an internal core epitope that was preserved as a terminal exposed portion.

이들 수의학적 병원균의 균주들의 일정 범위에 대한 이들 구조의 보존성 및 접근성 정도를 검사하기 위해 mAb 및 pAbs를 이들 내부 코어 LPS 구조로 생장시켰다. 3종의 mAb을 얻었으며 Ap, Pm 및 Mh로부터 관심있는 모든 균주들의 LPS와 교차반응할 수 있었다. 따라서, 이들 3종의 중요한 수의학적 병원균 간에 공유된 보존된 교차반응성 LPS 에피토프의 가능성을 확인하였다. MAbs and pAbs were grown into these internal core LPS structures to examine the degree of conservability and accessibility of these structures over a range of strains of these veterinary pathogens. Three mAbs were obtained and were able to cross react with LPS of all strains of interest from Ap , Pm and Mh . Thus, the possibility of conserved cross-reactive LPS epitopes shared between these three important veterinary pathogens was identified.

전세포 ELISA 분석에서는 이들 LPS 에피토프들이 전세포 상에서 mAb에 의해 인식되는 것으로 나타났으며, 따라서, 내부 코어 에피토프들이 세포 표면에 접근할 수 있다는 사실이 입증되었다. 내부 코어 올리고당을 인식하는 mAb는 Mh 세포의 보체 매개 살균 용해를 촉진할 수 있다. Mh에 감염된 널리 알려진 쥐 모델에서 수동적 방어 시험을 실시하였으며, 이로서 이들 보존된 내부 코어 LPS 구조에 특이적인 mAb를 제공함으로서 질병으로부터 보호될 수 있는 것으로 나타났다. 마지막으로, 보존된 탄수화물 구조를 캐리어 단백질 HAS에 연결시켜 결합 백신을 생산하였으며, 이 결합 백신으로 면역 유도시킨 후 생장시킨 쥐 혈청은 이들 3종과 교차반응성을 갖는 것으로 밝혀졌다. Whole cell ELISA analysis showed that these LPS epitopes were recognized by mAbs on whole cells, thus demonstrating that internal core epitopes could access the cell surface. MAbs that recognize internal core oligosaccharides can promote complement mediated bactericidal lysis of Mh cells. Passive defense tests were conducted in a well-known rat model infected with Mh , indicating that mAbs specific for these conserved internal core LPS structures could be protected from disease. Finally, the conserved carbohydrate structure was linked to the carrier protein HAS to produce a binding vaccine, which was found to have cross-reactivity with these three sera after immunization with the binding vaccine.

다른 양태(aspect)에서, 본 발명은가변성의 외부 코어 올리고당 사슬 연장부가 없는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부 코어를 포함하는 지질다당류 부분을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a lipopolysaccharide moiety comprising a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core that is free of variable outer core oligosaccharide chain extensions.

다른 양태에서, 본 발명은 하기 구조식 II를 갖는 디-글루코실-테트라-헵토실 내부 코어 부분을 포함하는 지질다당류 부분을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a lipopolysaccharide moiety comprising a di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety having formula II:

상기에서, -R은 H 또는 포스포에탄올아민(PEtn)이고, P는 포스페이트이고, R' 및 R"은 H 또는 올리고당 사슬 연장부로서, β-D-Galp-(l-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)를 포함하지 않는 것이 바람직하며, R'"은 Ap에서는가변성 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이며, 지질 A는 해독되었다. In the above, -R is H or phosphoethanolamine (PEtn), P is phosphate, R 'and R "are H or oligosaccharide chain extension, β-D-Gal p- (l-7) -D preferably do not contain -α-D-Hep p- (1-6), R '"is a variable O-antigen at Ap , Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid Lipid A was detoxified.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 서술된 지질다당류 부분들 중 하나를 포함하는, Mh, Ap 또는 Pm에 의해 유도된 질병에 대해 동물 숙주 내에서 방어능을 제공하는 면역원성 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides an immunogenic composition that provides protection in an animal host against a disease induced by Mh , Ap or Pm , comprising one of the lipopolysaccharide moieties described above.

다른 양태에서, 본 발명은 Mh, Ap 또는 Pm에서 지질다당류를 생산하기 위한 LPS 생합성 경로 중에 1종 이상의 유전자를 사용하여 상기 서술된 지질다당류 부분들 중 하나를 포함하는 돌연변이 균주를 얻는 방법을 제공한다. In another aspect, the invention provides a method of obtaining a mutant strain comprising one of the lipopolysaccharide moieties described above using at least one gene in the LPS biosynthetic pathway for producing lipopolysaccharide at Mh , Ap or Pm . .

다른 양태에서, 본 발명은 Mh, Ap 또는 Pm에 대응하는 기능성 교차반응성 항체를 유도하는 1종 이상의 면역원성 에피토프를 사용하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 에피토프는 상기 서술한 지질다당류 부분들 중 하나를 포함한다. In another aspect, the present invention provides a method of using one or more immunogenic epitopes that induce functional cross-reactive antibodies corresponding to Mh , Ap or Pm , wherein the epitope comprises one of the lipopolysaccharide moieties described above. Include.

다른 양태에서, 본 발명은 Mh, Ap 또는 Pm에 대해 교차반응성을 보이고, 상기 서술된 지질다당류 부분들 중 하나에 의해 유도되는 기능성 항체를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a functional antibody which is cross-reactive with Mh , Ap or Pm and is induced by one of the lipopolysaccharide moieties described above.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 상기 서술된 지질다당류 부분들 중 하나에 대한 항체들을 생성하고, (b) 이들 항체들을 다수의 Mh, Ap 및 Pm 균주들에 대해 검사하고, 및 (c) 교차반응성을 보이는 항체들을 선택하는 것을 포함하는 Mh, Ap 또는 Pm에 대한 기능성 교차반응성 항체를 생산하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides an antibody comprising (a) generating antibodies against one of the lipopolysaccharide moieties described above, (b) examining these antibodies against a number of Mh , Ap and Pm strains, and (c) Provided are methods for producing functional cross-reactive antibodies against Mh , Ap or Pm comprising selecting antibodies that exhibit cross-reactivity.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 서술된 면역원성 조성물을 면역학적으로 유효한 양만큼 숙주에 투여하는 것을 포함하는 Mh, Ap 또는 Pm에 감염되어 유도된 질병에 대해 숙주를 면역화하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for immunizing a host against a disease induced by Mh , Ap or Pm comprising administering to the host an immunologically effective amount of the immunogenic composition described above.

하기 보존된 내부 코어 LPS 구조는 Ap, Mh 및 Pm에서 확인되었다. 이 구조는 모든 균주들에 광범위하게 작용하는 백신 후보로서 유용하다. 상기 3종 모두 이 확인 구조 단위로 설명되었으며, 이로서 이 보존된 구조에 기초한 다종 백신의 제조가 가능하다. The following preserved inner core LPS structures were identified at Ap , Mh and Pm . This structure is useful as a vaccine candidate that works extensively on all strains. All three have been described in terms of these confirmatory structural units, thereby allowing the production of multiple vaccines based on this conserved structure.

상기에서, -R은 H 또는 포스포에탄올아민(PEtn)이고, P는 포스페이트이고, R' 및 R"은 H 또는 올리고당 사슬 연장부로서, β-D-Galp-(l-7)-D-α-D-Hepp-(1-6)를 포함하지 않는 것이 바람직하며, R"'는 Ap에서는 가변성 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이며, 지질 A 는 해독되었다. In the above, -R is H or phosphoethanolamine (PEtn), P is phosphate, R 'and R "are H or oligosaccharide chain extension, β-D-Gal p- (l-7) -D preferably does not contain -α-D-Hep p- (1-6), R "'is a variable O-antigen at Ap , Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octuloxonic acid Lipid A was detoxified.

각 종의 보존된 구조 특성을 알아보기 위해 수행된 구조 분석에 대해 실시예 1(Mh), 실시예 2(Ap) 및 실시예 3∼5(Pm)에 상세히 서술하였다. 실시예 1은 파스튜렐라 헤몰리티카의 혈청형 A1 LPS의 구조 분석에 대해 서술하였다. 실시예 2는 Ap의 몇몇 혈청형으로부터 얻은 LPS의 구조 분석에 대해 서술하였으며, 먼저, Mh 및 Ap의 내부 코어 분자간의 구조적 관련성을 확인하였다. 실시예 3은 Pm의 게놈 균주로부터 얻은 LPS의 구조 분석에 대해 서술하였으며, 먼저, 3종 모두의 내부 코어 분자들의 구조 보존을 확인하였다. 실시예 4는 Pm 균주 VP161의 LP의 구조 분석에 대해 서술하였다. 실시예 5는 Pm 균주 X73의 코어 올리고당의 구조 분석에 대해 서술하였다. 실시예 6은 Pm의 orfH 유전자, Hep III에서 Hep II의 동정에 대해 서술하였다. 실시예 7은 수의학적 병원균 특이 보존된 LPS 구조를 보이는 만헤이미아 헤몰리티카의 D-글리세로-O-만노-헵토실트랜스퍼라제 돌연변이의 생산 방법 및 LPS 구조에 대한 항체의 성장 및 교차 반응성에 대해 서술하였다. 실시예 8은 탄수화물 부분으로서 보존된 내부 코어 LPS 분자를 사용하여 글리코 결합 백신을 생산하여 그에 대해 조사하였다. 실시예 9는 내부 코어 특이 모노클로날 항체들 및 폴리클론 혈청을 사용하여 얻어진 살균성 분석 데이터에 대해 서술하였다. 실시예 10은 내부 코어 특이 모노클로날 항체들을 사용하여 얻어진 수동적 방어 실험 데이터에 대해 서술하였다. 이들 실시예를 통해 알 수 있는 것은 내부 코어 지질다당류 에피토프들이 상기 내부 코어구조를 갖는 LPS 분자를 함유한 박테리아 종에 의해 유발되는 질병의 예방을 위한 백신 후보로 가능하다는 것이다. Structural analyzes performed to determine the conserved structural properties of each species are detailed in Examples 1 ( Mh ), Examples 2 ( Ap ) and Examples 3-5 ( Pm ). Example 1 described the structural analysis of the serotype A1 LPS of Pasteurella haemolytica. Example 2 described the structural analysis of LPS from several serotypes of Ap , first confirming the structural relationship between the inner core molecules of Mh and Ap . Example 3 described the structural analysis of LPS obtained from the Pm genomic strain, first confirming the structural conservation of all three internal core molecules. Example 4 described the structural analysis of LP of Pm strain VP161. Example 5 described the structural analysis of the core oligosaccharide of Pm strain X73. Example 6 described the identification of Hep II in the orfH gene of Pm , Hep III. Example 7 shows a method for the production of a D-glycero-O-manno-heptosyltransferase mutant of Manhemia haemolytica showing a veterinary pathogen specific conserved LPS structure and the growth and cross-reactivity of antibodies to the LPS structure. It was described. Example 8 produced and investigated glyco binding vaccines using internal core LPS molecules preserved as carbohydrate moieties. Example 9 describes bactericidal assay data obtained using internal core specific monoclonal antibodies and polyclonal serum. Example 10 describes passive defense experimental data obtained using internal core specific monoclonal antibodies. It can be seen from these examples that internal core lipopolysaccharide epitopes are possible as vaccine candidates for the prevention of diseases caused by bacterial species containing LPS molecules having the internal core structure.

협막 다당류로 이루어진 백신은 캡슐에 쌓인 상동 박테리아에 의해 유발되는 질병을 예방하는데 효과적이다. 이들 탄수화물 항원은 T-세포 의존 반응의 결핍으로 인해 인간에서는 종종 약한 면역원성을 보인다. 그러나, 특이 다당류 항원을 적합한 단백질 담체에 결합시킴으로써 탄수화물 항원의 면역원성이 다당류 하나일 때 보다 월등히 향상될 수 있다. 타입 b H. 인플루엔자(Hib) 및 타입 c 수막구균(Neisseria meningitidis) e.g. ProHiBit, MenC의 특이적 협막 다당류에 기초한 당결합 백신은 침해성 Hib 및 수막구균성 질병의 제어에 성공적인 것으로 이미 입증된 바 있다. Vaccines composed of capsular polysaccharides are effective in preventing diseases caused by homologous bacteria accumulated in capsules. These carbohydrate antigens often show weak immunogenicity in humans due to a lack of T-cell dependent responses. However, by binding specific polysaccharide antigens to suitable protein carriers, the immunogenicity of carbohydrate antigens can be significantly improved than when one polysaccharide is present. H. influenza type b (Hib) and type c meningococcal (Neisseria meningitidis) ProHiBit eg, coupling sugar, based on the specific capsular polysaccharide vaccine MenC already proven successful in the control of invasive Hib and meningococcal disease bar .

일반적인 전략은 숙주의 면역화 이후 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 보존된 내부 코어 LPS 분자를 적합한 담체 분자에 적절한 방법으로 결합시키는 것이다. The general strategy is to bind the conserved inner core LPS molecule to a suitable carrier molecule in a suitable way to elicit the desired immune response after the host's immunization.

면역원성 담체 단백질은 테타누스 독소/톡소이드, 디프테리아 독소/톡소이드(CRM₁₉₇), 해독된 P. 에루기노사(P. aeruginosa) 독소 A, 콜레라 독소/톡소이드, 페르투시스(pertussis) 독소/톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠(Clostridium perfringens) 외독소/톡소이드, B형 간염 표면 항원, B형 간염 코어 항원, 로타바이러스 VP7 단백질, 호흡기 합포체(respiratory syncytial) 바이러스 F 및 G 단백질 또는 다른 적합한 담체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. Immunogenic carrier proteins include tetanus toxin / toxoid, diphtheria toxin / toxoid (CRM ₁₉₇ ), detoxified P. aeruginosa toxin A, cholera toxin / toxoid, pertussis toxin / toxoid, From the group consisting of Clostridium perfringens exotoxin / toxoid, hepatitis B surface antigen, hepatitis B core antigen, rotavirus VP7 protein, respiratory syncytial virus F and G proteins or other suitable carriers It is preferred to be selected.

보조제는 프로인트 보조제(Freund's adjuvant), 명반 및 Ribi 또는 임의의 다른 제약학적으로 허용되는 보조제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.The adjuvant is preferably selected from the group consisting of Freund's adjuvant, alum and Ribi or any other pharmaceutically acceptable adjuvant.

본 발명의 한 양태에 따르면, 보존된 내부 코어 LPS 분자를 투여하는 것을 포함하는 동물, 어류 또는 조류에서 박테리아 병원균에 대한 면역성을 유도하거나 증가시키는 방법이 제공된다. 예를 들면, 박테리아 병원균은 만헤이미아 , 악티노바실러스 또는 파스튜렐라 변종들이다. 투여는 적합한 경로로 이루어지며, 주입, 점막 투여, 경피 투여, 경구(코팅제가 바람직하다) 투여 등이 있다. 몇몇 경우에는, 내부 코어 LPS 분자가 적합한 담체 분자에 연결되거나 결합될 수 있다. 몇몇 경우에는, 내부 코어 LPS이 살균제 또는 다른 면역 자극제와 함께 투여될 수 있다. 몇몇 경우에는, 보존된 내부 코어 LPS 분자가 구조식 I의 내부 코어 LPS일 수 있다. 몇몇 경우에는, 보존된 내부 코어 LPS 분자가 앞서 정의된 R 및 R¹ 중 하나가 없거나 둘다 없는 구조식 II의 내부 코어 LPS 일 수 있다. 몇몇 경우에는, 보존된 내부 코어 LPS는 하기 중 하나 이상일 수 있다:According to one aspect of the invention there is provided a method of inducing or increasing immunity to bacterial pathogens in an animal, fish or bird comprising administering a conserved internal core LPS molecule. For example, bacterial pathogens, but hey mia, bad Tino Bacillus stew or files are Pasteurella strains. Administration is by any suitable route, including infusion, mucosal administration, transdermal administration, oral (preferably coated) administration, and the like. In some cases, the inner core LPS molecule may be linked or linked to a suitable carrier molecule. In some cases, the inner core LPS may be administered with a fungicide or other immune stimulant. In some cases, the conserved inner core LPS molecule may be the inner core LPS of formula I. In some cases, the conserved inner core LPS molecule may be the inner core LPS of formula II without or with both of R and R ¹ as defined above. In some cases, the preserved inner core LPS may be one or more of the following:

이고, P는 포스페이트이다.And P is phosphate.

몇몇 경우에, 보존된 내부 코어 LPS는 상기 하나 이상의 분자 a-f 또는 개시된 유전자 구조(R 및 R¹을 갖고 있거나 갖지 않음) 중 하나의 변이형일 수 있다(상기에서 하나 이상의 말단 당은 이성질체이거나 또는 특정 이성질체 형태로 보존되도록 변성되었다). In some cases, the conserved inner core LPS may be a variant of the one or more molecules af or one of the disclosed gene structures (with or without R and R ¹ ), wherein the one or more terminal sugars are isomers or certain isomers Denatured to preserve form).

본 발명의 한 양태에 따르면, 다른 올리고당에 대한 공유 결합이 없는 상기 서술된 항원성 LPS 유래 올리고당이 제공된다. According to one aspect of the present invention there is provided the above-described antigenic LPS derived oligosaccharide which is free of covalent bonds to other oligosaccharides.

본 발명의 한 양태에 따르면, 보존된 내부 코어 LPS 분자 또는 그의 일부분 및(또는) 변이체를 면역원성 담체 단백질에 연결시키는 것을 포함하는 백신 제조 방법이 제공된다. 몇몇 경우에, 보조제는 LPS 분자-담체 단백질과 함께 제공될 수 있다. According to one aspect of the present invention there is provided a vaccine preparation method comprising linking a conserved internal core LPS molecule or portion thereof and / or variant to an immunogenic carrier protein. In some cases, adjuvants may be provided with LPS molecule-carrier proteins.

도 1은 D₂O(300K, pH 3) 내 M. 헤몰리티카 혈청형 A1 LPS으로부터 얻어진 코어 올리고당 성분의 양자 NMR 스펙트럼(600MHz)을 나타낸다. HOD 공명(resonance)은 4.756 ppm이었다. 4.4ppm 이상 아노머 영역에서의 공명은 Kdo 메틸렌 공명과 함께 표지하였다. A1로 명명된 구조와 잔기의 명칭 또한 나타내었다. 골격 올리고당의 부분적인 절단으로 인한 이종 성분은 연결 부위에서 점선으로 나타내었다. 본문에서, 이종 성분으로 인한 f에 대한 소량 성분은 f로 나타내었다. Hep_I, Hep_II 및 Hep_III은 D-D-헵토스를 나타낸다. 다른 잔기들은 D-구조를 갖는다. 1 shows the quantum NMR spectrum (600 MHz) of the core oligosaccharide component obtained from M. hemolytica serotype A1 LPS in D ₂ O (300K, pH 3). HOD resonance was 4.756 ppm. Resonance in the anomer region of at least 4.4 ppm was labeled with Kdo methylene resonance. The structures and residues named A1 are also shown. Heterogeneous components due to partial cleavage of the framework oligosaccharides are indicated by dotted lines at the linking sites. In the text, the minor component for f due to the heterogeneous component is denoted by f. Hep _I , Hep _II and Hep _III represent DD-heptose. Other residues have a D-structure.

도 2는 아노머 영역(a)의 HMQC 스펙트럼 및 아노머 및 고리 영역의 COSY(b) 및 NOESY(c) 스펙트럼을 나타내는 A1에 대한 2D NMR 실험 결과를 도시한다. 화살표는 k5 주변에서 관찰되는 b2 공명의 위치를 나타낸다. FIG. 2 shows the results of 2D NMR experiments for A1 showing HMQC spectra of anomer region (a) and COSY (b) and NOESY (c) spectra of anomer and ring regions. The arrow indicates the location of b2 resonance observed around k5.

도 3은 A1의 이핵 ¹H-¹³C 2D NMR 스펙트럼에서 선택된 플롯들을 도시한다. (a) 고리 영역의 HMQC 스펙트럼에서, 몇몇 지점들은 가능한 경우 표지되어 있다. (b) HMQC-TOSCY 스펙트럼에서, C7-H7s-C6-H6, C4-H4-C5-H5 TOCSY 상관관계 및 b2 대한 상관관계가 표지되어 있다. (c) HMBC 스펙트럼에서, Hl-Cl-Ol-Cx 당과 당 사이의 상관관계가 내부 잔기 상관관계와 함께 아노머 양자 공명에 대해 도시되어 있다. 3 shows selected plots from the binucle ¹ H- ¹³ C 2D NMR spectrum of A1. (a) In the HMQC spectrum of the ring region, some points are labeled where possible. (b) In the HMQC-TOSCY spectrum, the C7-H7s-C6-H6, C4-H4-C5-H5 TOCSY correlation and the correlation for b2 are labeled. (c) In the HMBC spectrum, the correlation between Hl-Cl-Ol-Cx sugars and sugars is shown for anomer quantum resonance with internal residue correlations.

도 4는 A1에서 비-헵토스 잔기의 지정을 위한 1D 선택 실험을 도시한다. (a) 1D TOCSY(a1, 180ms);(b) 1D TOCSY(h1, 180ms);(c) 1D TOCSY(i1 k4, 180ms);(d) 1D NOESY-TOCSY(i1 k4, 400ms; k6 180ms);(e) 1D NOESY-TOCSY(de1, 400ms;g3 k7, 180ms);(f) 1D TOCSY(c1, 180ms);(g) 1D TOCSY j1, 180ms); 및 (h) 1D TOCSY-NOESY j1, 180ms; j4, 400ms). 이종성으로 인해 f 및 h에 대한 미량 성분은 각각 f' 및 h'로 나타내었다. 제1 선택 단계에 대한 공명은 밑줄치고, 제2 선택 단계의 공명은 가능한 경우 두번 밑줄쳤다. 아노머 영역에서 선택된 공명 스펙트럼의 왼쪽에 나타내었다. 4 depicts 1D selection experiments for the designation of non-heptose residues in A1. (a) 1D TOCSY (a1, 180ms); (b) 1D TOCSY (h1, 180ms); (c) 1D TOCSY (i1 k4, 180ms); (d) 1D NOESY-TOCSY (i1 k4, 400ms; k6 180ms) (e) 1D NOESY-TOCSY (de1, 400ms; g3 k7, 180ms); (f) 1D TOCSY (c1, 180ms); (g) 1D TOCSY j1, 180ms); And (h) 1D TOCSY-NOESY j1, 180 ms; j4, 400 ms). Due to heterogeneity, trace components for f and h are shown as f 'and h', respectively. Resonance for the first selection step is underlined, and resonance for the second selection step is underlined twice if possible. The left side of the selected resonance spectrum in the anomer region is shown.

도 5은 A1에서 이극성 상호작용을 검색하는 1D 선택 실험을 도시한다. (a)-(g) 각각에 b1, c1, de1, f1, g1, i1/k4에 대한 아노머 영역의 공명의 1D NOESY 스펙트럼(200ms 혼합 시간) 및 j1에 대한 1D ROESY(f1, 500ms). 선택된 아노머 공명 은 스펙트럼의 왼쪽에 나타내었다. 5 shows a 1D selection experiment to search for bipolar interactions in A1. 1D NOESY spectrum (200 ms mixing time) of resonance of the anomer region for b1, c1, de1, f1, g1, i1 / k4 and (1) 1 (2 ms) for j1 in each of (a)-(g). Selected anomer resonance is shown on the left side of the spectrum.

도 6은 헵토스 단당류의 양자(proton) 스펙트럼을 도시한다. D-L-헵토스의 확장 해상도 스펙트럼(600MHz, D₂O, 300 K)(a) 및 α(b) 및 β 형태(c)의 확장 스펙트럼. D-D-헵토스의 확장 해상도 스펙트럼(600MHz, D₂O, 300 K)(d) 및 α(e) 및 β 형태(f)의 스핀 모의 스펙트럼. 아노머 및 H-5β 공명은 도시되지 않았다. H-3, H-4 공명의 강한 커플링 및 H-5 공명의 가상 커플링이 (b)에서 정확히 재생되었다. 6 shows proton spectra of heptose monosaccharides. Extended resolution spectrum of DL-heptos (600 MHz, D ₂ O, 300 K) (a) and extended spectrum of α (b) and β form (c). Extended resolution spectrum of DD-heptose (600 MHz, D ₂ O, 300 K) (d) and spin simulation spectrum of α (e) and β form (f). Anomer and H-5β resonances are not shown. Strong couplings of H-3, H-4 resonances and virtual couplings of H-5 resonances were correctly reproduced in (b).

도 7은 A1에서 헵토스 잔기의 지정을 위한 1D 선택 실험을 도시한다. (a) b3, b4 및 b5를 검색하기 위한 1D TOCSY-TOCSY(b1,75ms; b2, 75ms);(b) b5-b6 및 b5-b3 NOE를 검색하기 위한 1D TOCSY-NOESY(b2, 150ms; b5, 400ms). b(l-3)d 연결로 인해 강한 b5-d2 NOE가 나타난다;(c) e3, e4 및 e5를 검색하기 위한 1d TOCSY-TOCSY(de1, 75ms; e2, 75ms);(d) d3, d4 및 d5를 검색하기 위한 1D TOCSY-TOCSY(de1, 75ms; d2, 75ms);(e) g3 내지 g5를 검색하기 위한 1d TOCSY-TOCSY(g1, 90ms; g2, 150ms);(f) g(1-6)I 연결에 따른 g5-g6 및 g5-g3 NOE, 및 g5-i6 NOE를 도시하는 1D TOCSY-NOESY(g2, 150ms; g5, 400ms);(g) f(1-6)g 연결에 따른 f1-g6 당-당 NOE로부터 얻은 g7 공명의 1D NOESY-TOCSY(f1, 400ms; g6, 180ms);(h) H-6 이하의 f 및 f' 공명을 검색하기 위한 1D TOCSY-TOCSY(f1, 90ms; f2, 150ms). f5 및 f5'에 대한 분명한 다중 패턴이 나타난다;(i) 오직 짧은 스핀 록(spin lock) 타임으로 인한 f7 공명을 검색하기 위한 1D TOCSY(f6, 40 ms). 제1 선택 단계에 대한 공명은 밑줄치고, 제2 선택 단계의 공명은 가능한 경우 두번 밑줄쳤다. 아노머 영역에서 선택된 공명은 스펙트럼의 왼쪽에 나타내었다. 7 depicts 1D selection experiments for the designation of heptose residues in A1. (a) 1D TOCSY-TOCSY (b1,75 ms; b2, 75 ms) for searching b3, b4 and b5; (b) 1D TOCSY-NOESY (b2, 150 ms) for searching b5-b6 and b5-b3 NOE; b5, 400 ms). b (l-3) d concatenation results in strong b5-d2 NOE; (c) 1d TOCSY-TOCSY (de1, 75ms; e2, 75ms) for searching e3, e4 and e5; (d) d3, d4 And 1D TOCSY-TOCSY (de1, 75ms; d2, 75ms) to search d5; (e) 1d TOCSY-TOCSY (g1, 90ms; g2, 150ms) to search g3 to g5; (f) g (1 -6) 1D TOCSY-NOESY (g2, 150 ms; g5, 400 ms) showing g5-g6 and g5-g3 NOE and g5-i6 NOE according to I linkage; (g) f (1-6) g linkage 1D NOESY-TOCSY (g1, 400 ms; g6, 180 ms) of g7 resonance obtained from f1-g6 sugar-sugar NOE according to (h) 1D TOCSY-TOCSY (f1) for searching f and f 'resonances below H-6 , 90 ms; f2, 150 ms). Obvious multiple patterns for f5 and f5 'appear; (i) 1D TOCSY (f6, 40 ms) to search for f7 resonances only due to short spin lock time. Resonance for the first selection step is underlined, and resonance for the second selection step is underlined twice if possible. Resonances selected in the anomer region are shown to the left of the spectrum.

도 8은 A1의 내부 코어 7탄당의 MMC 계산에서 얻은 최소 에너지 순응의 분자 모델을 도시한다. 산소는 큰 구로 묘사하였고 히드록실 양자는 제거하였다. 관련 양자는 표지하였다. g-i 가지에 대한 e-b 가지의 근접성 및 잔기 B의 아노머 양자에 대한 잔기 e의 외향 고리의 근접성은 관찰된 긴 범위의 NOE와 일치하였다. 또한, L-D-헵토스(잔기 d, b, e)와 D-D-헵토스(잔기 g) 사이의 외향 고리 배치에서 차이가 발견되었다. 8 shows the molecular model of the minimum energy compliance obtained in the MMC calculation of the inner core saccharide of A1. Oxygen is depicted as a large sphere and both hydroxyls are removed. Relevant protons were labeled. The proximity of the e-b branch to the g-i branches and the outward ring of the residue e to both the anomers of residue B were consistent with the long range of NOEs observed. In addition, a difference was found in the outward ring arrangement between L-D-heptose (residues d, b, e) and D-D-heptose (residue g).

도 9는 (a)-(g) 각각에서 b1-e5, b1-e7, e1-i4, e1-g2, g1-b2, g1-b3에 대한 A1 내부 코어 7탄당의 MMC 계산으로 내부 양자 거리® 대 거시 이동의 변화를 도시한다. 2-4 Å 범위의 내부 양자 거리가 발생하는 것은 관찰된 긴 범위 b-e, e-i 및 e-g NOE와 일치하였다. FIG. 9 shows the internal quantum distance® by MMC calculation of A1 inner core octane for b1-e5, b1-e7, e1-i4, e1-g2, g1-b2, g1-b3 in (a)-(g), respectively. The change in the macroscopic movement is shown. The occurrence of internal quantum distances in the 2-4 kHz range was consistent with the observed long ranges b-e, e-i and e-g NOE.

도 10은 H. 인플루엔자(H. influenzae )로부터 얻은 LPS에 대해 보고된 지방 아실 치환 패턴을 갖는 지질 A를 사용하여 구성한 M. 헤몰리티카 A1의 LPS의 분자 모델을 도시한다. 지질 A 부분은 착색하였는데, Kdo는 회색, 헵토스는 적색 또는 보라색, 글루코스는 녹색 및 갈락토스는 청색이다. PO₄ 기는 황색이다. 히드록실 양자는 제거되었다. Figure 10 shows a molecular model of the LPS of H. M. Morley urticae A1 configured with a lipid A having a fatty acyl substitution pattern reported for the LPS obtained from the H. influenza (H. influenzae). The lipid A portion was stained with Kdo gray, heptose red or purple, glucose green and galactose blue. PO ₄ groups are yellow. Both hydroxyls were removed.

도 11은 Ap 혈청형 5a 코어 OS의 음이온 전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. FIG. 11 shows anion electron injection mass spectra of Ap serotype 5a core OS.

도 12는 Ap 혈청형 a) 5a; b) 5b; c) 2; d) 1으로부터 얻은 코어 OS의 ¹H- NMR 스펙트럼에서 아노머 영역을 도시한다. pH 7.0 및 25 ℃의 D₂O에서 스펙트럼을 기록하였다. 12 shows Ap serotype a) 5a; b) 5b; c) 2; d) The anomer region is shown in the ¹ H-NMR spectrum of the core OS obtained from ¹ . Spectra were recorded at D ₂ 0 at pH 7.0 and 25 ° C.

도 13은 Ap 혈청형 5a 잔기들로부터 얻은 코어 OS의 선택적 1D-TOCSY NMR 스펙트럼의 고리 영역을 도시한다. a) Hep I; b) Hep II; c) Hep III; d) Hep IV; e) Hep V; f) Glc II; g) Glc I; h) Gal I. 각각의 잔기에 대한 문자 지정은 실시예 2의 표 2에 나타낸 바와 같다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였으며, 혼합 시간은 헵토스 잔기의 경우 150ms였고, 6탄당 잔기의 경우 90ms였다.FIG. 13 shows the ring region of the selective 1D-TOCSY NMR spectrum of the core OS obtained from Ap serotype 5a residues. a) Hep I; b) Hep II; c) Hep III; d) Hep IV; e) Hep V; f) Glc II; g) Glc I; h) Gal I. The letter designation for each residue is shown in Table 2 of Example 2. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.), mixing time was 150 ms for heptose residues and 90 ms for hexasaccharide residues.

도 14는 Ap 혈청형 5a 잔기들로부터 얻은 코어 OS의 선택적 1D-NOESY NMR 스펙트럼의 고리 영역을 도시한다. a) Hep III; b) Hep II; c) Glc I; d) Glc II; e) Hep IV; f) Hep V. 각각의 잔기에 대한 문자 지정은 실시예 2의 표 2에 나타낸 바와 같다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였으며, 혼합 시간은 400 ms였다. FIG. 14 depicts ring regions of selective 1D-NOESY NMR spectra of core OS obtained from Ap serotype 5a residues. a) Hep III; b) Hep II; c) Glc I; d) Glc II; e) Hep IV; f) Hep V. The letter designation for each residue is shown in Table 2 of Example 2. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.) and mixing time was 400 ms.

도 15는 Ap 혈청형 5a로부터 얻은 코어 OS의 O-사슬 Gal I 잔기 위치를 결정하는 것을 도시한다. a) Gal I의 아노머 ¹H-공명의 1D-NOESY NMR 스펙트럼. b) NOESY 단계의 Gal I 잔기의 아노머 ¹H-공명 및 TOCSY 단계의 Hep III 잔기의 H-7 ¹H-공명으로부터 얻은 1D-NOESY-TOCSY 스펙트럼. c) TOCSY 단계의 Hep III 잔기의 아노머 ¹H-공명 및 NOESY 단계의 Hep III 잔기의 H-4 / H-5 ¹H-공명으로부터 얻은 1D-TOCSY-NOESY 스펙트럼. d) Gal I 및 Glc I의 아노머 ¹H-공명으로 인한 HMBC를 나타내는 ¹³C -¹H-HMBC NMR 스펙트럼 영역. e) Hep III의 H-7 ¹H-공명, Hep V의 H-2 ¹H-공명 및 Hep II의 H-3 ¹H-공명으로부터의 ¹³C 교차 피크를 나타내는 ¹³C -¹H-HSQC NMR 스펙트럼 영역. 스펙트럼은 pH 7.0 및 25 ℃의 D₂O에서 기록하였다. FIG. 15 depicts determining the O-chain Gal I residue positions of core OS obtained from Ap serotype 5a. a) 1D-NOESY NMR spectrum of anomer ¹ H-resonance of Gal I. b) 1D-NOESY-TOCSY spectra obtained from the anomer ¹ H-resonance of the Gal I residues of the NOESY stage and the H-7 ¹ H-resonance of the Hep III residues of the TOCSY stage. c) 1D-TOCSY-NOESY spectra obtained from anomer ¹ H-resonance of Hep III residues of the TOCSY stage and H-4 / H-5 ¹ H-resonance of Hep III residues of the NOESY stage. d) ¹³ C- ¹ H-HMBC NMR spectral region showing HMBC due to anomer ¹ H-resonance of Gal I and Glc I. e) Hep III of the H-7 ¹ H- 0 people, Hep V in H-2 ¹ H- resonance and Hep II of H-3 ^{1 13} 0 people from H- C ¹³ C showing the cross-peak - ¹ H-HSQC NMR Spectral region. Spectra were recorded at pH 7.0 and D ₂ O of 25 ℃.

도 16은 Ap 혈청형 1로부터 얻은 코어 OS의 양이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. 생성물 이온 스펙트럼(m/z 930²⁺). FIG. 16 shows cation capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of core OS obtained from Ap serotype 1. FIG. Product ion spectrum ( m / z 930 ²⁺ ).

도 17은 Ap 혈청형 1로부터 얻은 코어 OS의 개방쇄 N-아세틸갈락토사민 잔기의 동정을 도시한다. a) Ap 혈청형 1로부터 얻은 코어 OS의 2D-¹³C-¹H-HSQC NMR 스펙트럼의 고리 영역. b) Ap 혈청형 1로부터 얻은 코어 OS의 ¹H-NMR 스펙트럼의 고리 영역. c) GalNAc 잔기의 H-1 ¹H-공명으로부터 얻은 1-D NOESY 스펙트럼. d) GalNAc 잔기의 H-4 ¹H-공명으로부터 얻은 1-D TOCSY 스펙트럼. e) GalNAc 잔기의 H-2 ¹H-공명으로부터 얻은 1-D NOESY 스펙트럼. f) HexNAc 잔기의 H-4 ¹H-공명으로부터 얻은 1-D NOESY 스펙트럼. 스펙트럼은 pH 7.0 및 25 ℃의 D₂O에서 기록하였다. 공명의 명칭은 도면에 나타낸 바와 같다(i, GalNAc; j, Gal II). FIG. 17 shows the identification of open chain N-acetylgalactosamine residues of core OS obtained from Ap serotype 1. FIG. a) Ring region of 2D- ¹³ C- ¹ H-HSQC NMR spectrum of core OS obtained from Ap serotype 1. b) Ring region of the ¹ H-NMR spectrum of the core OS obtained from Ap serotype 1. c) 1-D NOESY spectrum obtained from H-1 ¹ H-resonance of GalNAc residues. d) 1-D TOCSY spectrum obtained from H-4 ¹ H-resonance of GalNAc residues. e) 1-D NOESY spectrum obtained from H-2 ¹ H-resonance of GalNAc residues. f) 1-D NOESY spectrum obtained from H-4 ¹ H-resonance of HexNAc residues. Spectra were recorded at pH 7.0 and D ₂ O of 25 ℃. The names of the resonances are as shown in the figures (i, GalNAc; j, Gal II).

도 18은 Ap 혈청형 1, 2, 5a 및 5b로부터 얻은 코어 올리고당의 한 실시태양의 대표적인 구조를 도시한다. 혈청형 1에서, R은 α-GaloNAc-(l-4,6)-βGal II- (l-3)-β-Gal I이고, R'은 H이며, o는 개방쇄 배치를 나타낸다. 혈청형 2에서, R은 β-Glc III이고, R'은 D-α-D-Hep V이다. 혈청형 5a 및 5b에서, R은 H이고, R'은 D-α-D-Hep V이다. 18 shows representative structures of one embodiment of core oligosaccharides obtained from Ap serotypes 1, 2, 5a, and 5b. In serotype 1, R is α-GaloNAc- (l-4,6) -βGal II- (l-3) -β-Gal I, R 'is H and o represents an open chain configuration. In serotype 2, R is β-Glc III and R ′ is D-α-D-Hep V. In serotypes 5a and 5b, R is H and R 'is D-α-D-Hep V.

도 19는 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70 코어 OS의 음이온 전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. 19 is Pasteurella multocida strain Anion electron injection mass spectra of the Pm70 core OS are shown.

도 20은 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70 코어 OS MS/MS(m/z 1246.5²⁺)의 양이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. Figure 20 Pasteurella multocida strain Cationic capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of Pm70 core OS MS / MS ( m / z 1246.5 ²⁺ ) are shown.

도 21은 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70 코어 OS 전구체 이온 스캔(m/z 316⁺)의 양이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. Figure 21 Pasteurella multocida strain Cation capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of the Pm70 core OS precursor ion scan ( m / z 316 ⁺ ) are shown.

도 22는 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70로부터 얻는 완전히 탈아실화된 LPS의 ¹H-NMR 스펙트럼의 아노머 영역을 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. 잔기들은 실시예 3의 표 2에서와 같이 표지하였다. . FIG. 22 shows the anomer regions of the ¹ H-NMR spectrum of fully deacylated LPS obtained from Pasteurella multocida strain Pm70. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.). The residues were labeled as in Table 2 of Example 3. .

도 23은 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70로부터 얻은 코어 OS의 TOCSY 스펙트럼 중 아노머 영역 일부를 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(25 ℃)에서 기록하였다. FIG. 23 shows part of the anomer region in the TOCSY spectrum of the core OS obtained from Pasteurella multocida strain Pm70. Spectra were recorded at D ₂ O (25 ° C.).

도 24는 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70로부터 얻은 코어 OS의 NOESY 스펙트럼 중 아노머 영역 일부를 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(25 ℃)에서 기록하였다. FIG. 24 shows part of the anomer region of the NOESY spectrum of the core OS obtained from Pasteurella multocida strain Pm70. Spectra were recorded at D ₂ O (25 ° C.).

도 25는 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70로부터 얻은 코어 OS의 ¹H-¹³C HMBC NMR 스펙트럼 중 아노머 영역을 도시한다. 삽입은 N-아세틸-아미노 당에 대한 진단 신호를 보이는 스펙트럼 영역에서 이루어졌다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. Figure 25 Pasteurella multocida strain The anomer region in the ¹ H- ¹³ C HMBC NMR spectrum of the core OS obtained from Pm70 is shown. Insertion was made in the spectral region showing diagnostic signals for the N-acetyl-amino sugars. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.).

도 26은 추정 글리코실트랜스퍼라제들이 표지된 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70의 코어 올리고당 구조를 도시한다. FIG. 26 shows the core oligosaccharide structure of Pasteurella multocida strain Pm70 labeled with putative glycosyltransferases.

도 27은 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 LPS-OH의 음이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. a) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 992^3- 이상), b) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 999^3- 이상), c) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 1040^3- 이상). 27 is Anion capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of LPS-OH obtained from Pm strain VP 161 are shown. a) product ion spectrum ( m / z 992 ^3- or greater), b) product ion spectrum ( m / z 999 ^3- or greater), c) product ion spectrum ( m / z 1040 ^3- or greater).

도 28은 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS의 양이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. a) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 903²⁺ ), b) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 984²⁺ ), c) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 424²⁺, 높은 오리피스 전압 이용). 28 is Cation capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of core OS obtained from Pm strain VP 161 are shown. a) product ion spectrum ( m / z 903 ²⁺ ), b) product ion spectrum ( m / z 984 ²⁺ ), c) product ion spectrum ( m / z 424 ²⁺ using high orifice voltage).

도 29은 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS의 2D-NOESY NMR 스펙트럼 영역을 도시한다. 각 잔기에 표시된 문자는 실시예 4의 표 2에 기재되어 있다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였으며, 혼합 시간은 400 ms였다. 29 is The 2D-NOESY NMR spectral region of the core OS obtained from Pm strain VP 161 is shown. The letters shown in each residue are shown in Table 2 of Example 4. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.) and mixing time was 400 ms.

도 30은 아노머 ¹H-공명(하위 케이스 문자)과 고리 ¹³C-공명(상위 케이스 문자) 사이의 상관관계를 보여주는 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS의 2D-¹³C-¹H- HMBC NMR 스펙트럼 영역을 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. 30 shows the correlation between anomer ¹ H-resonance (lower case letter) and ring ¹³ C-resonance (upper case letter) The 2D- ¹³ C- ¹ H- HMBC NMR spectral region of the core OS obtained from Pm strain VP 161 is shown. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.).

도 31은 g-1 내지 g-4 및 h-1 내지 h-4로 표지된 갈락토스 잔기들에 대한 ³¹P-공명(x-축)과 및 ¹H-공명(y-축)과 콜린 공명 사이의 상관관계를 보여주는 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS의 2D-³¹P-¹H-HSQC-TOCSY NMR 스펙트럼 영역을 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. FIG. 31 shows ³¹ P-resonance (x-axis) and ¹ H-resonance (y-axis) and choline resonance for galactose residues labeled g-1 to g-4 and h-1 to h-4. Showing the correlation of 2D- ³¹ P- ¹ H-HSQC-TOCSY NMR spectral regions of the core OS obtained from Pm strain VP 161 are shown. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.).

도 32는 Pm 균주 VP161로부터 얻은 완전히 탈아실화된 LPS의 ¹H-NMR 스펙트럼을 도시한다; a) Kdo 잔기 하나를 갖는 단백당형; b) Kdo 잔기 두개를 갖는 단백당형 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. 각 잔기에 표시된 문자는 실시예 4의 표 2에 기재되어 있다. Gal I(g) 및 Gal II(h)의 H-4 양자 공명에 대한 하위 필드 시프트는 KOH 처리 중에 PCho 잔기의 가수분해 및 전이 때문이다. 32 is ¹ H-NMR spectrum of fully deacylated LPS from Pm strain VP161 is shown; a) a protein glycoform with one Kdo residue; b) Protein glycotype spectra with two Kdo residues were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.). The letters shown in each residue are shown in Table 2 of Example 4. The subfield shift for H-4 quantum resonance of Gal I (g) and Gal II (h) is due to hydrolysis and transfer of PCho residues during KOH treatment.

도 33은 Pm 균주 X73로부터 얻은 코어 OS의 양이온 모세관 전기영동-전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. a) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 1108²⁺ 이상), b) 생성물 이온 스펙트럼(m/z 451.5⁺ 이상, 높은 오리피스(orifice) 전압 이용). 33 is Cation capillary electrophoresis-electron injection mass spectra of core OS obtained from Pm strain X73 are shown. a) The product ion spectrum (m / z 1108 ²⁺ or higher), b) the product ion spectrum (m / z ⁺ 451.5 or more, high orifice (orifice) voltage use).

도 34는 ³¹P-공명(x-축)과 ¹H-공명 사이의 상관관계를 보여주는 Pm 균주 X73로부터 얻은 코어 OS의 2D-³¹P-¹H-HMQC-TOCSY NMR 스펙트럼 영역을 도시한다(혼합 시간은 PEtn 및 갈락토스 잔기 사이의 ³¹P-¹H 커플링을 위해 10 Hz에서 최적화하였다). 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. 34 shows the correlation between ³¹ P-resonance (x-axis) and ¹ H-resonance 2D- ³¹ P- ¹ H-HMQC-TOCSY NMR spectral region of core OS obtained from Pm strain X73 (mixing time optimized at 10 Hz for ³¹ P- ¹ H coupling between PEtn and galactose residues) . Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.).

도 35는 갈락토스 잔기의 C-5, C-6, H-5 및 H-6 공명들 간의 상관관계를 나타내는 ¹³C-레조넌스(y-축)과 ¹H-공명 사이의 상관관계를 도시하는 Pm 균주 X73로부터 얻은 코어 OS의 2D-¹³C-¹H-HSQC-TOCSY NMR 스펙트럼 영역을 도시한다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였다. FIG. 35 shows the correlation between ¹³ C-Resonance (y-axis) and ¹ H-resonance showing the correlation between C-5, C-6, H-5 and H-6 resonances of galactose residues. 2D- ¹³ C- ¹ H-HSQC-TOCSY NMR spectral regions of the core OS obtained from Pm strain X73 are shown. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.).

도 36은 SDS-PAGE 및 전세포 용해질의 은 염색에 의한 P. 멀토시다 LPS 분석을 도시한다. (A) 야생형 VP161의 P. 멀토시다 LPS 프로필(레인 1); 헵토실트랜스퍼라제 돌연변이 AL251(레인 2); 대조군 균주 AL438(AL251 함유 벡터 플라스미드 pAL99)(레인 3) 및 보체가 결합된 돌연변이 균주 AL298(레인 4)의 비교. (B) P. 멀토시다 헵토실트랜스퍼라제 돌연변이 AL251의 LPS 프로필(레인 1); 야생형 VP161(레인 2) 및 AL251을 접종한 3개의 다른 닭에서 단리한 P. 멀토시다 야생형 복귀 돌연변이체(레인 3, 4 및 5)의 비교. 36 shows P. multocida LPS assay by SDS-PAGE and silver staining of whole cell lysate. (A) P. multocida LPS profile of wild type VP161 (lane 1); Heptosyltransferase mutant AL251 (lane 2); Comparison of control strain AL438 (AL251 containing vector plasmid pAL99) (lane 3) and mutant strain AL298 (lane 4) with complement. (B) LPS profile of P. multocida heptosyltransferase mutant AL251 (lane 1); Comparison of P. multocida wild type return mutants (lanes 3, 4 and 5) isolated from three different chickens inoculated with wild type VP161 (lane 2) and AL251.

도 37은 P. 멀토시다 코어 OS의 음이온 모세관 전기영동 전자 분사 질량 스펙트럼을 도시한다. (A) 모체 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS의 2가 전하 영역;(B) 돌연변이 균주 AL251로부터 얻은 코어 OS의 1가 전하 영역. FIG. 37 shows anion capillary electrophoretic electron injection mass spectra of P. multocida core OS. (A) Divalent charge region of core OS obtained from parental strain VP 161; (B) Monovalent charge region of core OS obtained from mutant strain AL251.

도 38은 (A) P. 멀토시다 모체 균주 VP 161 및 (B) P. 멀토시다 돌연변이 균주 AL251의 LPS로부터 유도된 코어 OS의 ¹H-NMR 스펙트럼 영역을 도시한다. 스펙트 럼은 25 ℃에서 기록하였고 내부 아세톤(2.225 ppm)을 참조하였다. FIG. 38 depicts the ¹ H-NMR spectral region of the core OS derived from LPS of (A) P. multocida parent strain VP 161 and (B) P. multocida mutant strain AL251. Spectra were recorded at 25 ° C. and referenced to internal acetone (2.225 ppm).

도 39는 P. 멀토시다 VP161 코어 OS의 NOESY 스펙트럼 영역을 도시한다. NOE 연결은 표시된 바와 같다. 인세트(inset); VP 161로부터 얻은 내부 코어 OS 구조. 스펙트럼은 25 ℃에서 기록하였고 내부 아세톤(2.225 ppm)을 참조하였다. Fig. 39 shows the NOESY spectral region of the P. multocida VP161 core OS. NOE connections are as indicated. Inset; Internal core OS structure obtained from VP 161. Spectra were recorded at 25 ° C. and referenced to internal acetone (2.225 ppm).

도 40은 (A) 모체 균주 VP l61 및 (B) 돌연변이 균주 AL251로부터 얻은 P. 멀토시다의 내부 코어 LPS 구조를 도시한다(R은 Glc부터의 올리고당 사슬 연장부이다). Figure 40 depicts the inner core LPS structure of P. multocida obtained from (A) parent strain VP l61 and (B) mutant strain AL251 (R is oligosaccharide chain extension from Glc).

도 41은 a) 만헤이미아 헤몰리티카 균주 A1, b) 악티노바실러스 플루로뉴모니애 혈청형 1으로부터 얻은 코어 올리고당의 구조를 나타낸다. 외부 코어 장식의 제 1 단계를 주관하는 글리코실트랜스퍼라제를 표시하였다. Figure 41 shows a) Manhemia Hemolytica strain A1, b) actinobacillus The structure of the core oligosaccharide obtained from Pluronomymoniae serotype 1 is shown. Glycosyltransferases presided over the first step of outer core decoration.

도 42는 a) 만헤이미아 헤몰리티카 돌연변이 균주 losB로부터 얻은 O-탈아실화 LPS 및 b) losB 유전자를 함유한 pNF2176AAlosB로 트랜스 보체 결합된 만헤이미아 헤몰리티카 돌연변이 균주 losB로부터 얻은 O-탈아실화 LPS의 음이온 모세관 전기영동-전자 분사 이온화 질량 스펙트럼을 도시한다. 42 shows a) Manhemia H. Molina urticae mutant strain obtained from O- talah losB acylated LPS, and b) only the trans-complement binding to pNF2176AAlosB containing losB gene Hay Mia H. Molina urticae mutant strain electric anion capillary O- deacylation of the LPS obtained from the gel losB - shows the electrospray ionisation mass spectrum.

도 43은 야생형 만헤이미아 헤몰리티카 균주 A1 및 돌연변이 균주 losB로부터 얻은 완전히 탈아실화된 LPS의 2D-TOCSY NMR 스펙트럼 영역들을 도시한다. 각 잔기의 명칭은 동그라미쳐진 losB 돌연변이 균주가 없는 외부 코어 잔기들로 나타내었다. 스펙트럼은 D₂O(pH 7.0 및 25 ℃)에서 기록하였으며, 혼합 시간은 400ms였다. 43 shows wild type Manhemia Is H. Molina urticae strains showing 2D-TOCSY NMR spectrum range of a fully deacylation LPS obtained from the A1 and mutant strain losB. The name of each residue is indicated by the outer core residues without the circled losB mutant strain. Spectra were recorded at D ₂ O (pH 7.0 and 25 ° C.) and mixing time was 400 ms.

도 44는 균주 Mh losB(▲) 및 wt(■)로부터 얻은 정제된 LPS에 대한 쥐 # 1-5로부터 얻은 D42 폴리클로날 혈청의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 쥐의 명칭은 도면에 나타낸 바와 같다. 모든 혈청의 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. 44 is strain Mh ELISA (OD ₄₀₅ ) of D42 polyclonal serum obtained from rats # 1-5 against purified LPS obtained from losB (▲) and wt (■). The name of the rat is as shown in the figure. Dilution rates of all serum are as shown in the figure.

도 45는 균주 Mh losB 및 wt, App 혈청형 1 및 5a 및 Pm 균주 VP 161 및 X73으로부터 얻은 LPS, 및 Mh 및 Pm 균주로부터 얻은 LPS-OH에 대하여, 9개 내부 코어 LPS mAb의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. mAb 명칭 및 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. 45 shows strains Mh losB and wt, App serotypes 1 and 5a and For LPS from Pm strains VP 161 and X73, and LPS-OH from Mh and Pm strains, ELISA (OD ₄₀₅ ) of nine internal core LPS mAbs is shown. mAb names and dilution rates are as shown in the figure.

도 46은 균주 Mh losB 및 wt, App 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP 161 및 X73로부터 얻은 LPS에 대한 쥐 # 1, 쥐 # 2 + 3, 쥐 # 4 및 쥐 # 5의 D42 폴리클론 혈청의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 쥐의 명칭은 도면에 나타낸 바와 같다. 모든 혈청은 1:50의 희석률로 사용하였다. 46 shows strains Mh losB and wt, App serotypes 1 and 5a, and ELISA (OD ₄₀₅ ) of D42 polyclonal serum of rat # 1, rat # 2 + 3, rat # 4 and rat # 5 against LPS obtained from Pm strains VP 161 and X73. The name of the rat is as shown in the figure. All sera were used at a dilution of 1:50.

도 47은 균주 Mh losB 및 wt, App 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP161 및 X73로부터 얻은 LPS에 대한 쥐 # 5의 D 152 폴리클론 혈청의 ELISA(OD_4O5)를 도시한다. 모든 혈청의 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. 47 shows strains Mh losB and wt, App serotypes 1 and 5a, and ELISA (OD _4O5 ) of D 152 polyclonal serum of rat # 5 against LPS obtained from Pm strains VP161 and X73 is shown. Dilution rates of all serum are as shown in the figure.

도 48은 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP 161 및 X73로부터 얻은 LPS에 대한 두개의 대표 내부 코어 LPS mAb로부터의 약해진 상층액의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. mAb 명칭 및 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. 48 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5a, and The ELISA (OD ₄₀₅ ) of the weakened supernatant from two representative internal core LPS mAbs for LPS obtained from Pm strains VP 161 and X73 is shown. mAb names and dilution rates are as shown in the figure.

도 49는 Mh losB KOH 처리 LPS의 음이온 모세관 전기영동 전자 분사 질량 스 펙트럼을 도시한다. FIG. 49 shows anion capillary electrophoretic electron injection mass spectrum of Mh losB KOH treated LPS.

도 50은 MhlosB-HSA 결합체의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 12.5% SDS-PAGE 겔 상에 용리하고, 1: 10⁶의 희석율로 사용된 mAb G8 특이 탄수화물과 함께 블롯팅하고 스크리닝하였다. 50 depicts SDS-PAGE and Western blot analysis of MhlosB- HSA conjugates. Eluted on a 12.5% SDS-PAGE gel and blotted and screened with mAb G8 specific carbohydrates used at a dilution of 1: 10 ⁶ .

도 51은 a) HSA; b) USA-MhlosB 복합당질(glycoconjugate)의 CE-ES-MS 분석을 도시한다. 51 is a) HSA; b) CE-ES-MS analysis of USA- MhlosB glycoconjugate.

도 52는 균주 Mh losB로부터 얻은 정제된 LPS에 대한 백신 접종한 쥐 # Vl - V5 및 대조군 쥐 C6, C8 및 C9의 D23 폴리클론 혈청의 ELISA(OD_4O5)를 도시한다(IgG 반응(▲) 및 IgM 반응(■)을 검사). 쥐의 명칭은 도면에 나타낸 바와 같다. 모든 혈청의 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. FIG. 52 depicts ELISA (OD _4O5 ) of D23 polyclonal serum of vaccinated mice # Vl-V5 and control mice C6, C8 and C9 against purified LPS obtained from strain Mh losB (IgG response (▲) and IgM response (■) is examined). The name of the rat is as shown in the figure. Dilution rates of all serum are as shown in the figure.

도 53은. 균주 Mh losB로부터 얻은 정제된 LPS에 대한 백신 접종한 쥐 # Vl - V5 및 대조군 쥐 C6, C8 및 C9의 D45 폴리클론 혈청의 ELISA(OD_4O5)를 도시한다(IgG 반응(▲) 및 IgM 반응(■)을 검사). 쥐의 명칭은 도면에 나타낸 바와 같다. 모든 혈청의 희석률은 도면에 나타낸 바와 같다. 53. ELISA (OD _4O5 ) of D45 polyclonal sera of vaccinated mice # Vl-V5 and control mice C6, C8 and C9 against purified LPS obtained from strain Mh losB (IgG response (▲) and IgM response ( ■) check). The name of the rat is as shown in the figure. Dilution rates of all serum are as shown in the figure.

도 54는 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP161 및 X73로부터 얻은 LPS에 대한 폴리클론 혈청 V2(1:25 희석)의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 54 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5a, and ELISA (OD ₄₀₅ ) of polyclonal serum V2 (1:25 dilution) against LPS from Pm strains VP161 and X73 is shown.

도 55는 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP161 및 X73로부터 얻은 전세포에 대한 폴리클론 혈청 V2(1:25 희석)의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한 다. 55 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5a, and ELISA (OD ₄₀₅ ) of polyclonal serum V2 (1:25 dilution) on whole cells obtained from Pm strains VP161 and X73 is shown.

도 56은 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP161 및 X73로부터 얻은 전세포에 대한 폴리클론 혈청 Mh #1(1:100 희석)의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 56 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5a, and ELISA (OD ₄₀₅ ) of polyclonal serum Mh # 1 (1: 100 dilution) on whole cells obtained from Pm strains VP161 and X73 is shown.

도 57은 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5a, 및 Pm 균주 VP161 및 X73로부터 얻은 LPS에 대한 폴리클론 혈청 Mh #1(1:100 희석)의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 57 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5a, and The ELISA (OD ₄₀₅ ) of polyclonal serum Mh # 1 (1: 100 dilution) for LPS from Pm strains VP161 and X73 is shown.

도 58은 균주 Mh losB 및 wt로부터 얻은 LPS에 대한 a) mAb G3 및 b) mAb G8의 복수액의 ELISA(OD₄₀₅)을 도시한다. FIG. 58 depicts ELISA (OD ₄₀₅ ) of ascites fluids of a) mAb G3 and b) mAb G8 for LPS obtained from strains Mh losB and wt.

도 59는 균주 Mh losB 및 wt, Ap 혈청형 1 및 5 a, Pm 균주 VP161, X73 및 Pm70로부터 얻은 전세포에 대한 대한 a) mAb G3 및 b) mAb G8의 복수액의 ELISA(OD₄₀₅)을 도시한다. 59 shows strains Mh losB and wt, Ap serotypes 1 and 5 a, The ELISA (OD ₄₀₅ ) of ascites fluid of a) mAb G3 and b) mAb G8 on whole cells obtained from Pm strains VP161, X73 and Pm70.

도 60은 균주 Mh wt 및 Pm 균주 VP161로부터 얻은 LPS에 대한 a) mAb 3-5 및 b) mAb 3-16의 복수액의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 60 shows strain Mh wt and The ELISA (OD ₄₀₅ ) of ascites solution of a) mAb 3-5 and b) mAb 3-16 for LPS obtained from Pm strain VP161 is shown.

도 61은 균주 Mh wt 및 losB, Ap 혈청형 1, Pm 균주 VP161 및 X73, 및 수막구균(Neisseria meningitidis) 균주 L2 galE로부터 얻은 전세포에 대한 a) mAb 3-5 및 b) mAb 3-16의 복수액의 ELISA(OD₄₀₅)를 도시한다. 61 shows strain Mh wt and losB , Ap serotype 1, The ELISA (OD ₄₀₅ ) of ascites fluid of a) mAb 3-5 and b) mAb 3-16 for whole cells obtained from Pm strains VP161 and X73, and Neisseria meningitidis strain L2 galE .

도 62는 mAb G3 및 대응하는 보체 결핍 대조군의 면역 혈청 희석물들을 혈청 살균력 분석한 것을 도시한다(생존률% = [평균 #CFU T30 검사/ 평균 # CFU T30 Mh 단독] x 100%. FIG. 62 shows serum bactericidal analysis of immune serum dilutions of mAb G3 and the corresponding complement deficient control (% survival = [mean #CFU T30 test / mean # CFU T30 Mh alone] × 100%.

도 63은 mAb G8 및 대응하는 보체 결핍 대조군의 면역 혈청 희석물들을 혈청 살균력 분석한 것을 도시한다(생존률% = [평균 #CFU T30 검사/ 평균 # CFU T30 Mh 단독] x 100%.FIG. 63 shows serum bactericidal analysis of immune serum dilutions of mAb G8 and corresponding complement deficient controls (% survival = [mean #CFU T30 test / mean # CFU T30 Mh alone] × 100%.

도 64는 Mh losB 전세포 면역화 쥐(Mh #1 D140) 및 대응하는 보체 결핍 대조군의 폴리클론 혈청 희석물들을 혈청 살균력 분석한 것을 도시한다(생존률% = [평균 #CFU T30 검사/ 평균 # CFU T30 Mh 단독] x 100%. FIG. 64 shows serum bactericidal analysis of polyclonal serum dilutions of Mh losB whole cell immunized mice ( Mh # 1 D140) and corresponding complement deficient controls (% survival = [mean #CFU T30 test / mean #CFU T30 Mh alone] x 100%.

도 65는 Mh wt 균주로부터 얻은 LPS에 대한 복수액 사전 및 사후 컬럼의 ELISA(OD₄₀₅)에 의해 측정한 a) mAb G3 및 b) mAbG8 복수액의 단백질 A 컬럼 정제를 도시한다. FIG. 65 shows Protein A column purification of a) mAb G3 and b) mAbG8 ascites measured by ELISA (OD ₄₀₅ ) of ascites pre and post column for LPS obtained from Mh wt strains.

도 66는 중간 크기의 기관지관내 적정수의 호중구가 존재하는 것을 보여주는 dpi 3에 희생된 그룹 B 쥐의 폐를 도시한다. FIG. 66 depicts the lungs of group B mice sacrificed at dpi 3 showing the presence of a moderate number of neutrophils in the bronchus of medium size.

도 67는 몇몇 영역에서 소수의 임파 세포(lymphoid cell)가 존재하는 기관지 폐렴의 분석을 보여주는 dpi 3에 희생된 그룹 C 쥐의 폐를 도시한다. FIG. 67 shows lungs of group C mice sacrificed in dpi 3 showing analysis of bronchial pneumonia with few lymphocytes in some regions.

실시예Example 1 One

이 실시예는 [Can. J. Chem. 80, 1715(2002). Investigation of M. haemolytica serotype A1]에 공개된 것을 기초로하여 이루어졌다. M. 헤몰리티카 혈청형 A1의 LPS 분석에서 Hex₃Hep₅Kdo가 주요 코어 올리고당 성분으로 밝혀졌다. 이는 LPS 샘플의 약산 가수분해(1% HOAc, 100 ℃, 3 시간) 후 얻어진 올리고당 분액의 1D 1H NMR 및 FAB-MS 분석에 의해 결정하였다. 코어 올리고당은 알디톨 아세테이트 및 2-부틸 글리코사이드 유도체의 GLC-MS 분석에 의해 결정된 주요 분액 내에 2:1:3:2의 몰비로 D-글루코스, D-갈락토스, L-D-헵토스 및 DD-헵토스를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. D-Gal 잔기는 메틸화 분석에서 말단 비환원 부분인 것으로 밝혀졌으며, Hex₂Hep₅Kdo의 조성을 갖는 코어 올리고당 분액의 미량 성분내에 존재하지 않는 것으로 밝혀졌다. LPS 내 Kdo의 발생률은 비색 분석에 의해 조사되었다.This example is described in Can. J. Chem. 80 , 1715 (2002). Investigation of M. haemolytica serotype A1]. LPS analysis of M. hemolytica serotype A1 revealed Hex ₃ Hep ₅ Kdo as the main core oligosaccharide component. This was determined by 1D 1H NMR and FAB-MS analysis of oligosaccharide fractions obtained after weak acid hydrolysis (1% HOAc, 100 ° C., 3 hours) of LPS samples. The core oligosaccharides are D-glucose, D-galactose, LD-heptose and DD-hep in a molar ratio of 2: 1: 3: 2 in the main aliquots determined by GLC-MS analysis of alditol acetate and 2-butyl glycoside derivatives. It was found to contain toss. The D-Gal residue was found to be a terminal non-reducing portion in the methylation analysis and was not found in the trace component of the core oligosaccharide fraction having a composition of Hex ₂ Hep ₅ Kdo. The incidence of Kdo in LPS was examined by colorimetric analysis.

M. 헤몰리티카 LPS를 무수 히드라진으로 처리한 후 강 알칼리로 처리하면 수용성, 탈아실화 LPS 올리고당을 얻었다. 탈아실화 LPS 샘플은 코어 및 지질 A 올리고당 부분들을 함유한 고유 물질의 완전한 골격 올리고당을 대표하였다. 이는 전자 분사 이온화 ESI-MS에 의해 확인하였으며, 그 결과 주요 올리고당 성분으로 Hex₃Hep₅Kdo₁HexN₂(H₂PO₃)₃에 대응하는 분자 이온을 얻었다(실험예 참조). Treatment of M. hemolytica LPS with anhydrous hydrazine followed by strong alkali yielded a water soluble, deacylated LPS oligosaccharide. Deacylated LPS samples were representative of the complete backbone oligosaccharides of the native material containing core and lipid A oligosaccharide moieties. This was confirmed by electron injection ionization ESI-MS. As a result, molecular ions corresponding to Hex ₃ Hep ₅ Kdo ₁ HexN ₂ (H ₂ PO ₃ ) ₃ were obtained as main oligosaccharide components (see Experimental Example).

양자 스펙트럼(도 1) 및 HMQC 및 COSY 스펙트럼(도 2)에서, 10개의 아노머 ¹H NMR 공명과 메틸렌 양자 공명이 관찰되었다. 아노머 공명은 ¹H NMR의 화학적 시프트가 감소되는 순으로 a에서 j로 표기하였고, k3_eq 및 k3_ax는 Kdo의 메틸렌 양자들을 나타낸다. b1 및 de1 및 j1 아노머 피크의 적분값은 다른 아노머 공명 보다 40% 적었으며, 이는 샘플 내에 이종성이 있음을 입증한다. 또한, h1에 이종성이 존재하였으며, h1 주변의 4.91 ppm에서 다운필드 이중항(doublet)이 나타났다. In the quantum spectrum (FIG. 1) and the HMQC and COSY spectra (FIG. 2), ten anomer ¹ H NMR resonances and methylene quantum resonances were observed. Anomer resonance is indicated from a to j in order of decreasing chemical shift of ¹ H NMR, k3 _eq and k3 _ax represent methylene protons of Kdo. The integral of the b1 and de1 and j1 anomer peaks was 40% less than other anomer resonances, demonstrating heterogeneity in the sample. In addition, heterogeneity was present in h1, and a downfield doublet appeared at 4.91 ppm around h1.

표준 동종핵 및 이종핵 2D-NMR 분석을 수행하였다. 도 2의 COSY 스펙트럼으로부터 H-2 공명의 위치를 결정할 수 있었다. 잔기 b, d, e, f, 및 g의 경우, J _{1 ,2} 는 작았으며(만노-헵토스의 경우 일반적임), H-1에서 H-2로 자기화를 이동시키는데 2D-TOCSY를 사용할 수 없음을 알았다. 도 3의 HMQC 스펙트럼으로부터 헵토스 잔기의 H-2가 다른 공명과 겹쳐져 2D-TOCSY가 이들 잔기를 분석하는 것을 어렵게 하였다. 2D-NOESY 스펙트럼은 또한, b1, de1 공명에 대해 특히 많은 수의 NOE를 보였다. 또한, 아노머 영역에서 몇몇 공명의 겹침이 관찰되었다. 따라서, 스펙트럼이 복잡하고 샘플이 이종성을 보이기 때문에 1D 선택 방법을 이용하여 표준 2D 방법들을 사용하여 얻을 수 없는 스펙트럼 파라미터를 도출하고, 구조의 해상도 및 배좌 분석을 가능하게 하였다. HMQCTOCSY 및 HMBC 실험이 또한 특히 헵토스 단위들에 대한 완전한 명칭 지정에 매우 중요하였다. 이러한 접근법을 이용하여, 주요 골격 올리고당(A1)대한 ¹H 및 ¹³C NMR 화학 시프트의 완전한 지정(할당)이 가능할 수 있었다(실시예 1, 표 1). Standard homonuclear and heteronuclear 2D-NMR analysis was performed. The position of the H-2 resonance could be determined from the COSY spectrum of FIG. 2. For residues b, d, e, f, and g, J _{1 , 2} were small (typical for mannose-heptose) and 2D-TOCSY was used to transfer magnetization from H-1 to H-2. I knew I could not. H-2 of the heptose residues overlapped with other resonances from the HMQC spectrum of FIG. 3, making it difficult for 2D-TOCSY to analyze these residues. The 2D-NOESY spectrum also showed a particularly large number of NOEs for b1, de1 resonances. In addition, some resonance overlap was observed in the anomer region. Therefore, because the spectrum is complex and the sample is heterogeneous, the 1D selection method is used to derive spectral parameters that cannot be obtained using standard 2D methods, and to enable the resolution and alignment analysis of the structure. HMQCTOCSY and HMBC experiments were also very important especially for full naming of heptose units. Using this approach, complete assignment (allocation) of ¹ H and ¹³ C NMR chemical shifts to the major backbone oligosaccharides (A1) could be possible (Example 1, Table 1).

Kdo-GlcN_II-GlcN_I 서열 및 부분적인 규명이 앞선 연구들로부터 알려져 있으며, 본원에서 이루어진 지정과 일치한다. 잔기 a 및 h에 대한 1D-TOCSY으로 공명의 지정 및 양자 커플링 상수의 측정이 가능하였다(도 4a, 4b). 포스페이트기의 위치는 앞서 수행된 바와 같이 ³¹P HMQC 실험으로부터 확인되었다. 이어서, ¹³C NMR 화학 시프트의 지정이 HMQC, HMQC-TOCSY, 및 HMBC 스펙트럼으로부터 수행하였다. 이 정보를 통해, 지질 A 부분의 α-D-GlcN 및 β-D-GlcN 피라노실 단위로서 잔기 a 및 h의 정의가 이루어졌다. 대부분의 양자, ³¹P 및 ¹³C NMR 화학 시프트는 유사한 구조 성분을 갖는 것으로 보고된 바 있는 물질들과 유사하였다. h1의 1D-TOCSY에서, 3.62 ppm의 h'5 피크는 Kdo-(2-6)-β-D-GlcN_II 글리코사이드 연결의 가수분해 때문이다. 용액 상태로 수개월간 방치하면 연결은 완전히 가수분해되어, 각각 3.82 및 3.92 ppm에서 h'6 및 h'6이 나타난다. 3.91 ppm에서의 아노머 신호 또한 이 이탄당의 h'1 때문에 발견되었다. Kdo-GlcN _II -GlcN _I sequences and partial identifications are known from previous studies and are consistent with the designations made herein. 1D-TOCSY for residues a and h allowed the specification of resonance and measurement of quantum coupling constants (FIGS. 4A, 4B). The location of the phosphate group was identified from ³¹ P HMQC experiments as previously performed. Subsequent designation of the ¹³ C NMR chemical shift was performed from the HMQC, HMQC-TOCSY, and HMBC spectra. Through this information, the residues a and h were defined as α-D-GlcN and β-D-GlcN pyranosyl units of the lipid A moiety. Most proton, ³¹ P and ¹³ C NMR chemical shifts were similar to those reported to have similar structural components. In 1D-TOCSY of h1, the h'5 peak of 3.62 ppm is due to hydrolysis of the Kdo- (2-6) -β-D-GlcN _II glycoside linkage. After several months in solution, the linkage is fully hydrolyzed, resulting in h'6 and h'6 at 3.82 and 3.92 ppm, respectively. Anomer signal at 3.91 ppm was also found due to h'1 of this peat sugar.

Kdo의 경우, H-4 및 H-5 공명들은 H-3_eq 또는 H-3_ax의 선택적인 여기를 이용하여 1D-TOCSY 실험에 의해 지정하였다. H-4 공명은 C-4의 포스페이트기 때문에 다운필드로 이동되었으며, ³¹P HMQC에 의해 확인하였다. 작은 J _{5 ,6} < 1 Hz가 H-5로의 TOCSY 이동을 저해하였다(도 4c). 그러나, Kdo의 X-레이 구조에 따라, 도 2c에서 강한 NOE가 k4 및 k6 사이에 관찰되었다. 1D NOESY-TOCSY(k4, k6)를 이용하여 지정을 마쳤다(도 4d). 이후 밝혀지는 바와 같이, HepI-(l-5)-Kdo 연결의 경우, d1-k7 NOE 또한 관찰되었으며, 이는 Kdo의 C-5에서 치환이 있을 경우 나타나는 것이다. NOE를 이용하여, Kdo 공명들을 1D-NOESY-TOCSY(de1, k7)로부터 검출하였으며(도 4e) 앞서의 실험에서 관찰된 것들과 동일한 화학 시프트 및 유사한 다중항 패턴을 갖는 것으로 밝혀져 Kdo ¹H NMR 지정을 확인하였다. 이어서, HMQC 스펙트럼 으로부터 얻어진 Kdo에 대한 ¹³C NMR 지정은 HMQC-TOCSY 스펙트럼으로 확인하였다. For Kdo, H-4 and H-5 resonances were designated by 1D-TOCSY experiment using selective excitation of H-3 _eq or H-3 _ax . H-4 resonance was shifted downfield due to the phosphate group of C-4 and confirmed by ³¹ P HMQC. Small J _{5 , 6} <1 Hz inhibited TOCSY shift to H-5 (FIG. 4C). However, according to Kdo's X-ray structure, strong NOE was observed between k4 and k6 in FIG. 2C. Designation was completed using 1D NOESY-TOCSY (k4, k6) (FIG. 4D). As will be seen later, for HepI- (l-5) -Kdo linkages, d1-k7 NOE was also observed, which appears when there is a substitution at C-5 of Kdo. Using NOE, Kdo resonances were detected from 1D-NOESY-TOCSY (de1, k7) (FIG. 4E) and found to have the same chemical shift and similar multinomial pattern as those observed in the previous experiments, and designated Kdo ¹ H NMR designation. It was confirmed. The ¹³ C NMR designation for Kdo obtained from the HMQC spectrum was then confirmed with the HMQC-TOCSY spectrum.

잔기 i는 6-치환 β-D-글루코스로 확인되었으며, Glc1로 표기하였다. 잔기i에 대한 아노머 공명은 Kdo의 H-4 공명과 겹쳐져 있다. 이들 두개의 겹쳐진 공명에 대한 1D-TOCSY에서는, Kdo에 대한 작은 J _{5 ,6} 커플링 상수 때문에 잔기 i에 대한 공명들을 구별할 수 있다(도 4c). H-6까지의 모든 공명들을 검출할 수 있었으며, 다중항들의 커플링 상수들을 측정할 수 있었다. β-D 구조 때문에, i1-i3 및 i1-i5 NOE들 또한 NOESY 스펙트럼에서 관찰되었다(도 2 및 도 5f). Glc1에 대한 ¹³C NMR 지정은 HMQC 스펙트럼으로부터 얻었으며, HMQC-TOCSY 스펙트럼으로부터 확인하였다. 말단 글루코스의 화학 시프트와 비교하여, 3.7 ppm의 글리코사이드화 다운-필드 시프트가 관찰되었으며, 이는 상기 위치에서의 치환을 나타낸다. -2.2 ppm의 실질적인 시프트가 또한 C-5에 대해 관찰되었다. C-5―C-6 결합 주변의 로타머(rotamer) 분포는 도 5에서 i1-i5 NOE에 대해 관찰되는 H-5 다중항으로부터 결정할 수 있었으며, J_{5 .6} 및 J_{5 .6'}이 Hz 보다 작은 값을 갖는 것이 분명하였으며, 이는 H-5 다중항이 10 Hz의 큰 J _{4 ,5} 커플링이 우세한 이중항으로 나타나기 때문이다. 이는 H-6 및 H-6' 모두가 H-5 때문이며, O6-C6-C5-O5 = -60°로타머가 용액 중에서는 바람직하다. Residue i was identified as 6-substituted β-D-glucose and designated Glc1. The anomeric resonance for residue i overlaps the H-4 resonance of Kdo. In 1D-TOCSY for these two overlapping resonances, the resonances for residue i can be distinguished because of the small J _{5 , 6} coupling constants for Kdo (FIG. 4C). All resonances up to H-6 could be detected and the coupling constants of the multiple terms could be measured. Because of the β-D structure, i1-i3 and i1-i5 NOEs were also observed in the NOESY spectrum (FIGS. 2 and 5F). ¹³ C NMR designation for Glc1 was obtained from the HMQC spectrum and confirmed from the HMQC-TOCSY spectrum. Compared to the chemical shift of terminal glucose, a glycoside down-field shift of 3.7 ppm was observed, indicating a substitution at this position. Substantial shifts of -2.2 ppm were also observed for C-5. C-5-C-6 rotamers (rotamer) distributed around the coupling has been able to determine from the H-5 multiplet is observed for the i1-i5 NOE in Fig. 5, J _5, and J _{5 .6 .6 'a} Hz It was evident that they had a smaller value, since the H-5 multiplet appeared as a double term with a large J _{4 , 5} coupling at 10 Hz. This is because both H-6 and H-6 'are H-5, with O6-C6-C5-O5 = -60 ° rotamers being preferred in solution.

잔기 c는 말단 α-D-글루코스로 결정되었고, Glc_II로 표기하였다. c1에 대한 1D-TOCSY(도 4f)로부터 H-5 이하의 공명들을 검출하였으며, 이는 잔기 c가 측정 된 양자 커플링 상수에 근거하여 α-글루코스임을 나타낸다. HMQC 스펙트럼 및 말단 글루코스 모델 화합물의 화학 시스프트와 비교하여, 모든 ¹H 및 ¹³C NMR 지정을 완료하였다. Residue c was determined by terminal α-D-glucose and denoted Glc _II . Resonances below H-5 were detected from 1D-TOCSY (FIG. 4F) for c1, indicating that residue c is α-glucose based on the measured quantum coupling constant. All ¹ H and ¹³ C NMR assignments were completed compared to the chemical system of the HMQC spectra and terminal glucose model compounds.

Gal로 표시된 말단 갈락토스, 잔기 j는 J1의 1D-TOCSY에서 확인하였으며, H-4 까지의 공명이 관찰되었다(도 4j). 작은 J _{4 ,5} 커플링 상수를 극복하고 H-5를 확인하기 위해, 1D-TOCSY-NOESY(j1, j4)를 수행하였다(도 4h). HMQC 스펙트럼 및 말단 갈락토스 모델 화합물의 화학 시프트 비교를 통해, 모든 ¹H 및 ¹³C NMR 지정을 완료하였다. Terminal galactose, residue j, denoted Gal, was identified in 1D-TOCSY of J1, and resonances up to H-4 were observed (FIG. 4J). To overcome the small J _{4 , 5} coupling constants and identify H-5, 1D-TOCSY-NOESY (j1, j4) was performed (FIG. 4H). All ¹ H and ¹³ C NMR assignments were completed through chemical shift comparison of the HMQC spectra and the terminal galactose model compound.

헵토스 잔기들을 지정하기 위해, 모델 화합물을 합성하고 정확한 ¹H 및 ¹³C NMR 화학 시프트 및 J_{H ,H} 값을 얻었다. 이들은 화학 시프트 비교에 말단 헵토스 단위 지정에 중요하였다. 또한, 글리코사이드화 중에, 치환된 탄소의 ¹³C NMR 공명은 실질적인 다운-필드 글리코사이드 시프트를 경험한다. D-D-헵토스 및 D-L-헵토스의 양자 스펙트럼이 도 6에 도시되어 있다. 용액 상태에서, α 및 β 형태들은 둘 다 각 화합물에 존재한다. 이들의 ¹H NMR 스펙트럼을 1D-TOCSY 실험을 이용하여 지정하였다. 정확한 커플링 상수 및 화학 시프트를 얻기 위해, 양자 스펙트럼의 스핀 모의를 수행하였다. 모의된 스펙트럼을 도 6에 도시하였다. 모의된 스펙트럼은 정확히 관찰된 스펙트럼을 재생하였으며, 특히 D-α-L-헵토스에서 H-3-H에 대한 강한 커플링을 재생하였다(도 6b). ¹³C NMR 화학 시프트는 HMQC를 이용하여 지정하였다. 헵토스 단당류에 대한 NMR 데이터는 실시예 1, 표 2에 기재되어 잇다. L-D-헵토스에 대한 화학 시프트는 D-L-헵토스와 동일한데, 이는 이들이 서로에 대해 에난티오머(enantiomer)이기 때문이다. To designate heptose residues, model compounds were synthesized and the correct ¹ H and ¹³ C NMR chemical shifts and J _{H , H} values were obtained. These were important for terminal heptose unit assignment for chemical shift comparison. In addition, during glycosidation, the ¹³ C NMR resonance of substituted carbons experiences a substantial down-field glycoside shift. Quantum spectra of DD-heptose and DL-heptose are shown in FIG. 6. In solution, both α and β forms are present in each compound. Their ¹ H NMR spectra were designated using 1D-TOCSY experiments. To obtain accurate coupling constants and chemical shifts, spin simulations of quantum spectra were performed. The simulated spectrum is shown in FIG. 6. The simulated spectra reproduced the exactly observed spectra, in particular the strong coupling to H-3-H in D-α-L-heptose (FIG. 6B). ¹³ C NMR chemical shifts were designated using HMQC. NMR data for heptose monosaccharides are described in Example 1, Table 2. The chemical shifts for LD-heptose are the same as for DL-heptose because they are enantiomers with respect to each other.

A1에서 잔기 b, d, e, f, 및 g 들은 작은 J1, 2 커플링 및 TOCSY에서 H-1로부터 H-2 이상의 자기화 이동이 부족하여 좁은 아노머 공명을 보이는 것 때문에 헵토스로 확인되었다. A1에서 모든 헵토스들은 α-D 구조를 보였으며, H-1로부터의 오직 내부-잔기 NOE 만이 H-2에 이르렀다(도 2). 1D-TOCSY-TOCSY(H-1, H-2)를 사용하여 모든 헵토스 잔기들을 지정하였다. H-1로부터 제1 TOCSY 단계는 H-2로 자기화를 이동시켰으며 추가 이동은 1.8 Hz의 작은 J _{1 ,2} 값으로 인해 저해되었다. 그러나, H-2에서 제2 단계는 3 Hz의 큰 J _{2 ,3} 값으로 인해 자기화를 보다 높은 스핀으로 이동 시킬 것이다. 그러나, L-D-헵토스의 경우, 자기화 이동이 H-5에서 멈추었는데 이는 J _{5 ,6} 값이 1.6 Hz로 작기 때문이다. D-D-헵토스의 경우, 자기화 이동은 덜 방해를 받았으며, 이는 J _{5 ,6} 값이 3.2 Hz로 크기 때문이다. 그러나, 이완 효과가 자기화의 이동을 방해할 수 있으며, L-D-헵토스 확인의 증명으로 H-5 이상의 이동의 결핍을 이용할 수 없다. Residues b, d, e, f, and g at A1 were identified as heptose due to the small J 1, 2 coupling and the lack of magnetization shifts from H-1 to H-2 above in TOCSY showing narrow anomer resonance. It became. At A1 all heptoses showed α-D structure, and only the inner-residual NOE from H-1 reached H-2 (FIG. 2). All heptose residues were designated using 1D-TOCSY-TOCSY (H-1, H-2). Claim 1 proceeds from TOCSY H-1 is stylized to move the magnetization to the H-2 further movement is inhibited due to the small J _{1, 2} value of 1.8 Hz. However, the second step in H-2 will shift the magnetization to a higher spin due to the large J _{2 , 3} value of 3 Hz. However, for LD-heptose, the magnetization shift stopped at H-5 because the J _{5 , 6} value is small at 1.6 Hz. In the case of DD-heptose, the magnetization shift was less disturbed because the J _{5 , 6} value was 3.2 Hz. However, the relaxation effect can interfere with the migration of magnetization and the lack of migration above H-5 cannot be exploited as evidence of LD-heptose confirmation.

잔기 b는 2-치환 L-α-D-헵토스로 결정하였으며, Hep_II로 표기하였다. 1 D-TOCSY-TOCSY(bl, b2) 로 공명들을 3.64 ppm 및 3.9 ppm에서 확인하였다(도 7a). 3.64 ppm에서의 다중항 패턴은 H-5 공명을 나타내며, 3.9 ppm에서의 다중항은 단당류에서 관찰되는 강하게 결합된 H-3 및 H-4 공명들에 유사하였다(도 6b). H-6를 확인하기 위해, 1D-TOCSYNOESY(b2, b5)를 수행하였다(도 1b). b2의 제1 TOCSY 단계에서, a6 공명 또한 조사하였지만 제2 단계에서만 b5 공명을 선택하였다. b2로 인한 NOE이 b3 및 b6에서 d2의 내부 잔기 NOE와 함께 관찰되었다. 일단 b6의 위치가 정해지면, C-7-H-7s-C-6-H-6로부터의 HMQC-TOCSY를 이용하여 H-7 및 H-7' 공명들을 지정하였다(도 3b). 이어서, 다른 공명들에 대한 지정을 HMQC 스펙트럼으로부터 수행하고 HMQC-TOCSY 및 HMBC 스펙트럼으로 확인하였다(도 3). L-α-D-헵토스와의 화학 시프트 비교를 통해, C-2에 대한 9 ppm 다운-필드 시프트 및 C-2에서의 치환을 나타내는 C-3의 -0.8 ppm 업-필드 시프트가 확인되었다. C-4에서 C-7 화학 시프트는 당당류의 시프트의 0.6 ppm 내에 존재하였다. Residue b was determined by 2-substituted L-α-D-heptose, designated Hep _II . Resonances with 1 D-TOCSY-TOCSY (bl, b2) were confirmed at 3.64 ppm and 3.9 ppm (FIG. 7A). The polynomial pattern at 3.64 ppm showed H-5 resonance, and the polynomial at 3.9 ppm was similar to the strongly bound H-3 and H-4 resonances observed in monosaccharides (FIG. 6B). To confirm H-6, 1D-TOCSYNOESY (b2, b5) was performed (FIG. 1B). In the first TOCSY stage of b2, a6 resonance was also investigated but b5 resonance was selected only in the second stage. NOE due to b2 was observed with internal residue NOE of d2 at b3 and b6. Once b6 was located, H-7 and H-7 ′ resonances were designated using HMQC-TOCSY from C-7-H-7s-C-6-H-6 (FIG. 3B). Subsequent assignments to other resonances were made from the HMQC spectrum and confirmed with the HMQC-TOCSY and HMBC spectra (FIG. 3). A chemical shift comparison with L-α-D-heptose confirmed a -0.8 ppm up-field shift of C-3, indicating a 9 ppm down-field shift for C-2 and a substitution at C-2. . The C-7 chemical shifts at C-4 were within 0.6 ppm of the shift of sugar sugars.

잔기 e는 말단 L-α-D-헵토스로 결정되었으며 Hep_III로 표기하였다. d1 및 e1 공명들이 겹치지만, H-2 공명들이 겹치지 않기 때문에 중요하지 않다. 1D-TOCSY-TOCSY(de1, e2)으로 e3, e4, 및 e5 스핀을 확인하였다(도 7c). 도 5a의 bl NOE으로부터, e5 공명이 또한 관찰되었다. 다중항 패턴이 관찰됨에 따라 1D 선택 실험의 고 디지털 해상도가 여러 다른 실험들 간의 공명을 정확히 배합할 수 있다. 도 5a에서 b1-e7 및 b1-e7' NOE가 또한 관찰되었다. 이후 제시되는 바와 같이, 이들 NOE들은 e5 및 e7 및 e7' 양자들에 대한 b1 양자의 인접성 때문이다. H-6 공명은 C-7-H-7s-C-6-H-6에 의한 HMQC-TOCSY에 위치하였다. ¹H 및 ¹³C NMR 지정은 HMQC 및 HMQCTOCSY로 완료하였다. 잔기 e의 ¹H 및 ¹³C NMR 화학 시프트는 L-α-D-헵토스의 것과 유사하였다. Residue e was determined by terminal L-α-D-heptose and denoted Hep _III . The d1 and e1 resonances overlap, but this is not important because the H-2 resonances do not overlap. 1D-TOCSY-TOCSY (de1, e2) confirmed the e3, e4, and e5 spins (FIG. 7C). From bl NOE in FIG. 5A, e5 resonance was also observed. As the multinomial pattern is observed, the high digital resolution of the 1D selection experiment can accurately blend the resonance between different experiments. In Figure 5a b1-e7 and b1-e7 'NOE were also observed. As will be shown later, these NOEs are due to the proximal proximity of both to e5 and to e7 and e7 'quantum. H-6 resonance was located in HMQC-TOCSY by C-7-H-7s-C-6-H-6. ¹ H and ¹³ C NMR assignments were completed with HMQC and HMQCTOCSY. ¹ H and ¹³ C NMR chemical shifts of residue e were similar to those of L-α-D-heptose.

잔기 d는 3,4,6-삼치환 L-α-D-헵토스로 확인되었으며, Hep_I로 표기하였다. 1D-TOCSY-TOCSY(de1, d2) 로 4.17에서 좁은 다중항이 확인되었고 4.01 ppm에서 넓은 다중항이 확인되었다(도 1d). b1의 1D-NOESY에서 4.01 ppm 및 4.17 ppm(d2)에서 다중항이 또한 관찰되었다(도 5a). i1에 대한 1D-NOESY에서 4.17 ppm의 공명이 또한 관찰되었다(도 5f). HMQC 스펙트럼에서는, 두개의 좁은 크로스 피크(δc, δh)(74.9, 4.17),(72.5, 4.17) 및 넓은 크로스 피크(75.3, 4.01)가 확인되었다. 이들 교차 피트 간에는 HMQC-TOCSY 상관관계가 또한 관찰되었다. ¹³C NMR 화학 시프트와 α-D-헵토피라노스의 비교를 통해(실시예 1, 표 2),(74.9, 4.17) 및 (75.3, 4.01)에서의 크로스 피크를 ¹³C NMR 다운 전계 글리코사이드 시프트되었음이 명백하다. 이들 3개 크로스 피크는 d3, d4, 또는 d5에 의한 것이기 때문에, 오직 d5 크로스 피크만이 큰 글리코사이드 시프트를 경험하지 않는데 이는 헵토스 상의 치환이 C-5에서는 일어나지 않기 때문이다. 따라서, (72.5, 4.17)에서의 크로스 피크를(C-5, H-5)로 지정하였다. (75.3, 4.01)의 크로스 피크는 HMBC(d3, d1) 및(d3, b1) 상관관계에 근거하여(C-3, H-3) 로 지정하였다. 따라서, (74.9, 4.01)에서의 크로스 피크는(d4, d1)로 지정하였으며 HMBC(d4, i1) 상관관계 및(i1, d4) NOE에서 관찰된 것과 일치한다(도 3 및 도 5f). d6 공명은 i1으로 인한 1D-NOESY로부터 지 정하였으며, 이는 GlcI-(1-4)-HepI 연결의 경우, 만일 잔기 d가 L-D-헵토스라면 H-6에 대한 강한 NOE가 예상되기 때문이다. C1에 대한 1D-NOESY에서 d6 공명이 또한 관찰되었다(도 5b). H-7 및 H-7' 공명들은 HMQCTOCSY(C-7, H-6) 크로스 피크(도 3) 및 1DNOESY-TOCSY(i1, d6)(도시안됨)로부터 위치를 결정하였다. L-α-D-헵토스와의 화학 시프트 비교를 통해, C-3, C-4, 및 C-6 각각에 대한 3.9, 7.9, 및 11.6 ppm 다운-필드 글리코사이드 시프트가 확인되었다. Residue d was identified as 3,4,6-trisubstituted L-α-D-heptose, designated Hep _I. 1D-TOCSY-TOCSY (de1, d2) identified a narrow multiplet at 4.17 and a wide multiplet at 4.01 ppm (FIG. 1D). Multiple terms were also observed at 4.01 ppm and 4.17 ppm (d2) in 1D-NOESY of b1 (FIG. 5A). Resonance of 4.17 ppm was also observed in 1D-NOESY for i1 (FIG. 5F). In the HMQC spectrum, two narrow cross peaks (δc, δh) (74.9, 4.17), (72.5, 4.17) and wide cross peaks (75.3, 4.01) were identified. An HMQC-TOCSY correlation was also observed between these crossover pits. ¹³ C NMR by comparison of the chemical shifts of the α-D- heptyl topira North (Example 1, Table 2), (74.9, 4.17), and the cross-peaks at (75.3, 4.01), ¹³ C NMR shifts down field-glycoside It is obvious. Since these three cross peaks are due to d3, d4, or d5, only the d5 cross peak does not experience a large glycoside shift because no substitution on heptose occurs at C-5. Therefore, the cross peak at (72.5, 4.17) was designated as (C-5, H-5). A cross peak of (75.3, 4.01) was designated as (C-3, H-3) based on the HMBC (d3, d1) and (d3, b1) correlations. Thus, the cross peak at (74.9, 4.01) was designated as (d4, d1) and is consistent with that observed in the HMBC (d4, i1) correlation and (i1, d4) NOE (FIGS. 3 and 5F). The d6 resonance was specified from 1D-NOESY due to i1 because for GlcI- (1-4) -HepI ligation, strong NOE for H-6 is expected if residue d is LD-heptose. D6 resonance was also observed in 1D-NOESY for C1 (FIG. 5B). H-7 and H-7 ′ resonances were located from the HMQCTOCSY (C-7, H-6) cross peak (FIG. 3) and 1DNOESY-TOCSY (i1, d6) (not shown). Chemical shift comparisons with L-α-D-heptose confirmed 3.9, 7.9, and 11.6 ppm down-field glycoside shifts for C-3, C-4, and C-6, respectively.

이후 도시되는 바와 같이, 분지 헵토스 상의 이종성으로 인해 4,6-이치환 L-α-D-헵토스(d')가 존재한다(도 1). 아노머 영역에 대한 HMQC 및 COSY 스펙트럼으로부터, 다른 공명들과의 겹침으로 인한 별개 신호가 H-1 또는 H-2에서 관찰되지 않았다. d'1의 양자 화학 시프트는 d1과 동일하며, d'2는 e2와 유사한 화학 시프트를 보였다. As shown hereafter, 4,6-disubstituted L-α-D-heptose (d ') is present due to heterogeneity on branched heptoses (FIG. 1). From the HMQC and COSY spectra for the anomer region, no distinct signal was observed in H-1 or H-2 due to overlap with other resonances. The quantum chemical shift of d'1 is the same as d1, and d'2 showed a chemical shift similar to e2.

잔기 g는 6-치환 D-α-D-헵토스로 결정되었으며, Hep_IV로 표기하였다. 1D-TOCSY-TOCSY(g1, g2)로 g3, g4, 및 g5 스핀을 확인하였다(도 7e). 3.94에서의 다중항 패턴은 H-5 공명을 나타내었다. H-6를 확인하기 위해, 1D-TOCSY-NOESY(g2, g5) 를 얻었다(도 7f). g2로부터의 NOE가 i6의 추정 내부 잔기와 함께 g3 및 g6에서 관찰되었다. 일단 g6의 위치가 결정되면, C-7-H-7s-C-6-H-6(도 3b)의 HMQC-TOCSY 및 1D-NOESY-TOCSY(f1, g6)(도 Ig)를 이용하여 H-7 및 H-7' 공명들을 지정하였다. 이어서, HMQC 스펙트럼으로부터 다른 공명들을 HMQC-TOCSY 스펙트럼으로 확인하였다(도 3). 1D-NOESY(f1)에서, g6 및 g5 공명들이 관찰되었다(도 5d). NOE f1-g5 NOE는 잔기 g가 분자 모델링 연구에서 D-D-헵토스인 경우에만 가능할 수 있다(하기 참조). D-α-D-헵토스와의 화학 시프트 비교에서 C-6에 대한 4.3 ppm 다운-필드 시프트가 나타났다. Residue g was determined as 6-substituted D-α-D-heptose, designated Hep _IV . The g3, g4, and g5 spins were identified by 1D-TOCSY-TOCSY (g1, g2) (FIG. 7E). The multinomial pattern at 3.94 showed H-5 resonance. In order to confirm H-6, 1D-TOCSY-NOESY (g2, g5) was obtained (FIG. 7F). NOE from g2 was observed at g3 and g6 with putative internal residues of i6. Once the location of g6 is determined, H using HMQC-TOCSY and 1D-NOESY-TOCSY (f1, g6) (FIG. Ig) of C-7-H-7s-C-6-H-6 (FIG. 3B). -7 and H-7 'resonances were designated. Subsequently, other resonances from the HMQC spectrum were identified by the HMQC-TOCSY spectrum (FIG. 3). In 1D-NOESY (f1), g6 and g5 resonances were observed (FIG. 5D). NOE f1-g5 NOE may be possible only if the residue g is DD-heptose in molecular modeling studies (see below). A chemical shift comparison with D-α-D-heptose showed a 4.3 ppm down-field shift for C-6.

잔기 f는 7-치환 D-α-D-헵토스로 결정되었으며, HepV로 표기하였다. 1D-TOCSY-TOCSY(f1, f2)에 따르면, f6 이하의 스핀들은 잔기 f가 D-D-헵토스임을 나타내었다. f5 다중항 패턴은 매우 명확하였다. f6에서 출발하는 1D-TOCSY으로부터, f7, 및 f7' 공명들을 확인하였다. 이어서, HMQC 스펙트럼에 의해 ¹³C NMR 지정을 수행하고 HMQCTOCSY 스펙트럼으로 확인하였다. α-D-D-헵토스와의 화학 시프트 비교에서 C-7에 대한 8.8ppm 다운필드 시프트가 나타났다. f'로 표기되는 말단 D-α-D-헵토스는 이 연결 부위에서의 이종성으로 인해서만 검출되었다. 1D-TOCSY-TOCSY(f1, f2)에서 알 수 있는 바와 같이, f'5 및 f'6 공명은 HMQC 및 HMQC-TOCSY 스펙트럼에서의 교차피크와 함께 검출될 수 있으며, 이는 실시예 1 표 2의 D-α-D-헵토스 와 유사한 말단 D-α-D-헵토스에 해당한다. Residue f was determined as 7-substituted D-α-D-heptose, denoted HepV. According to 1D-TOCSY-TOCSY (f1, f2), spindles below f6 indicated that residue f was DD-heptose. The f5 multinomial pattern was very clear. From 1D-TOCSY starting at f6, f7, and f7 'resonances were identified. ¹³ C NMR designations were then performed by HMQC spectra and identified by HMQCTOCSY spectra. A chemical shift comparison with α-DD-heptose showed an 8.8 ppm downfield shift for C-7. Terminal D-α-D-heptose, denoted f ', was detected only due to heterogeneity at this linking site. As can be seen from 1D-TOCSY-TOCSY (f1, f2), f'5 and f'6 resonances can be detected with cross peaks in the HMQC and HMQC-TOCSY spectra, which are shown in Example 1 Table 2 Corresponds to terminal D-α-D-heptose similar to D-α-D-heptose.

코어 8탄당의 서열은 도 5에 제시된 아노머 공명에 대한 1D-NOESY 스펙트럼 및 아노머 양자 공명(도 3c)의 HMBC 스펙트럼 으로부터 결정하였다. 도 1b 및 1f의 1D-TOCSY-NOESY 실험에서 내부-잔기 NOE가 또한 관찰되었다. 결과를 실시예 1, 표 3에 기재하였으며, 구조는 도 1에 도시하였다. 아노머 공명들의 통합과 시간에 따른 새로운 공명들의 외형을 토대로 이종성이 나타나는 연결 부위를 결정하였다. k(2-6)h 연결 및 b(1-3)d 연결은 수개월에 걸쳐 용액(pH 3) 중에서 가수분해하였으 며, j(1-7)f 연결은 안정하였다. The sequence of the core octasaccharide was determined from the 1D-NOESY spectrum for the anomer resonance shown in FIG. 5 and the HMBC spectrum of the anomer quantum resonance (FIG. 3C). Intra-residual NOE was also observed in the 1D-TOCSY-NOESY experiment of FIGS. 1B and 1F. The results are shown in Example 1, Table 3, and the structure is shown in FIG. The site of heterogeneity was determined based on the integration of anomer resonances and the appearance of new resonances over time. The k (2-6) h linkages and the b (1-3) d linkages were hydrolyzed in solution (pH 3) over several months and the j (1-7) f linkages were stable.

5개의 연속 잔기들에 걸쳐 현저하게 큰 수의 긴범위 NOE가 관찰되었다. α-D 당의 경우, H-1-H-2 내부-잔기 NOE가 예상된다. β-D-당의 경우에는, H-1-H-3 및 H-1-H-5 내부-잔기 NOE가 예상된다. (1-x) 연결에 대해서는 H-1-C-1-0-1-C-x-H-x 내부 글리코사이드 NOE가 예상된다. 2개의 연결된 당 사이의 내부-잔기 아노머 NOE가 H-x ±1 및 H-x ±2에서 발생할 수도 있다. 글리코사이드 연결 주변이 아닌, 다른 내부-잔기 NOE는 실시예 1의 표 3에 기재된 바와 같이 긴범위 NOE일 것으로 예상된다. A significantly large number of long range NOEs were observed over five consecutive residues. For α-D sugars, H-1-H-2 internal-residue NOE is expected. In the case of β-D-sugars, H-1-H-3 and H-1-H-5 internal-residue NOE are expected. For (1-x) linkages, H-1-C-1-0-1-C-x-H-x internal glycoside NOE is expected. Intra-residing anomer NOE between two linked sugars may occur at H-x ± 1 and H-x ± 2. Other inner-residual NOEs, not around the glycosidic linkages, are expected to be long range NOEs as described in Table 3 of Example 1.

많은 수의 긴범위 NOE를 설명하기 위해, Metropolis Monte Carlo(MMC) 방법을 이용하여 분자의 글리코사이드 연결각을 변화시키고 분자의 다중 배좌의 샘플을 얻어 배좌 분석을 수행하였다. 환원성 말단에 Kdo를 갖는 내부 코어 올리고당에 대해 이 방법을 사용하면, 모든 관찰되는 긴범위 NOE이 g-i 분지에 e-b 분지의 인접성에 의해 설명할 수 있었다. 이들 긴범위 NOE는 Hep_I의 3개 분지 지점에 의해 발생되는 내부 코어 잔기의 제한으로 인해 가능하였다. To account for a large number of long-range NOEs, the metropolis Monte Carlo (MMC) method was used to vary the glycoside linking angle of the molecule and to obtain a sample of the multiple locus of the molecule to perform a site analysis. Using this method for internal core oligosaccharides with Kdo at the reducing end, all observed long range NOEs could be explained by the proximity of the eb branch to the gi branch. These long range NOEs were possible due to the limitation of internal core residues caused by the three branching points of Hep _I.

계산으로부터 얻은 최소 에너지 순응체가 도 8에 도시되어 있다. 이 배좌로부터 측정된 다양한 내부 양자 거리가 실시예 1의 표 3에 제시되어 있다. 관찰되는 바와 같이, 대부분의 NOE가 발생되는 것은 짧은 내부 양자 거리에 의해 설명할 수 있다. g1-b2 및 g1-b3에 대한 긴범위 NOE들은 도 8에 도시된 분자 모델로부터 얻어지는 거리와 일치하지 않는다. (3,4,6)-Hep_I 치환 패턴으로 인한 마찰이 있음을 감안하더라도, 글리코사이드 연결 주변에 유연성이 있을 수 있으며 이는 반드시 고려해야 한다. 도 9에 도시된 바와 같이, g1-b2 및 g1-b3 거리에 대해, 짧은 내부 양자 거리를 갖는 다중 구조의 샘플을 수집하였으며, 이는 관찰된 NOE와 일치한다. 동일한 상황이 모든 다른 긴범위 및 내부 잔기 NOE에 적용될 수 있었다. g1-b2 및 g1-b3 및 e1-i4에 대한 긴범위 NOE는 전체 6 df에 대한 3개 글리코사이드(φ,ψ) 각 주변에서 이동성을 갖는 4개의 잔기들에 걸쳐져 있다. 5개의 잔기들(e-b-d-i-g)에 걸쳐져 있는 e1-g2 및 e1-g3 사이의 긴범위 NOE는 글리코사이드 각 주변의 8 df로 인해 더 많이 변화되며, g(1-6)i 연결에 대한 C-5―C-6 결합의 가능한 유연성은 고려하지 않았다. b1-e5, b1-e7, 및 b1-e7'는 e(1-2)b 글리코사이드 결합 주변의 이동성과 잔기 e의 C-6-C-7 주변의 회전에 의존한다. 어느 경우에나, 짧은 내부 양자 거리를 갖는 다중 구조가 발생하는 것은 관찰된 내부 잔기 및 긴범위 NOE와 일치한다. The minimum energy conformal body obtained from the calculation is shown in FIG. 8. Various internal quantum distances measured from this locus are shown in Table 3 of Example 1. As observed, most of the generation of NOE can be explained by the short internal quantum distance. Long range NOEs for g1-b2 and g1-b3 do not match the distances obtained from the molecular model shown in FIG. 8. Even considering the friction due to the (3,4,6) -Hep _I substitution pattern, there may be flexibility around the glycoside linkage and this must be taken into account. As shown in FIG. 9, for g1-b2 and g1-b3 distances, samples of multiple structures with short internal quantum distances were collected, consistent with the observed NOE. The same situation could apply to all other long range and internal residue NOEs. The long range NOE for g1-b2 and g1-b3 and e1-i4 spans four residues with mobility around each of the three glycosides (φ, ψ) for a total of 6 df. The long range NOE between e1-g2 and e1-g3 spanning five residues (ebdig) is more varied due to 8 df around each glycoside angle, C-5 for g (1-6) i linkage The possible flexibility of the C-6 binding was not taken into account. b1-e5, b1-e7, and b1-e7 'depend on the mobility around the e (1-2) b glycoside bond and the rotation around C-6-C-7 of residue e. In either case, the occurrence of multiple structures with short internal quantum distances is consistent with the observed internal residues and long range NOE.

본 연구에서는, M. 헤몰리티카 A1 LPS 분자의 지질 A 영역이 비스-4,4'-포스포릴화 β-1,6 연결 D-글루코사민 이탄당 부분을 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 이탄당에 결합된 지방 아실기의 자연상태 및 치환 패턴은 보고된 바 없다. 완전히 아실화된 LPS 분자는 박테리아 막의 최외각을 구성하며, 막 보전 상태를 유지하는데 필수적이다. 분자의 글리코스 부분은 박테리아 막으로 정의되는 p 레인으로부터 밖으로 멀리 연장된다. LPS 올리고당 부분은 독성에 중요하며 숙주 면역 반응을 유도하는데 관련되어 있다. 이 LPS 분자의 코어 올리고당 및 막 고정 지질 A 영역의 상대적 크기 및 배위에 대한 지식을 얻기 위해, 관련 미생물인 헤모필루 스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)에서 발견되는 지질 A 지방산 치환 패턴을 이용하여 분자 모델을 구성하였다. 이는 도 10에 도시하였다. H. 인플루엔자 지질 A는 6개의 지방 아실기를 갖고 있는 것으로 보고되었으며, 이때, 환원성 글루코사민 잔기의 아미드 기(C-2) 및 C-3 히드록실기는 3-히드록시테트라데칸산에 의해 아실화되며, 비환원 잔기의 C-2' 아미드 및 C-3' 히드록실기는 3-테트라데카노일옥시테트라데칸산에 의해 아실화된다. 도 10에서 관찰되는 바와 같이, 꽤 견고한 구조를 제공하는 내부 코어 때문에, 글리코스 부분은 박테리아 막을 형성하는 지질 A 부분으로부터 밖으로 돌출되어 있다. 말단 잔기들, 특히 말단 Gal 잔기에서 보다 원활한 이동성이 관찰되었다. 도 2의 NOESY 스펙트럼에서 아노머 공명에 대한 어떤 NOE도 관찰되지 않았으며, 이는 이 잔기의 이동성이 증가되었다는 사실과 일치한다. In this study, it was found that the lipid A region of the M. haemolytica A1 LPS molecule contains a bis-4,4′-phosphorylated β-1,6 linked D-glucosamine peat sugar moiety. The natural state and substitution patterns of fatty acyl groups bound to this peat sugar have not been reported. Fully acylated LPS molecules constitute the outermost part of the bacterial membrane and are essential for maintaining membrane integrity. The glycos part of the molecule extends outward from the p lane, which is defined as a bacterial membrane. The LPS oligosaccharide moiety is important for toxicity and is involved in inducing a host immune response. In order to gain knowledge about the relative size and coordination of the core oligosaccharide and membrane-fixed lipid A regions of this LPS molecule, the related microorganism Haemophilus The molecular model was constructed using lipid A fatty acid substitution patterns found in influenzae ). This is shown in FIG. H. influenza lipid A has been reported to have six fatty acyl groups, wherein the amide groups (C-2) and C-3 hydroxyl groups of the reducing glucosamine residues are acylated by 3-hydroxytetradecanoic acid , C-2 'amide and C-3' hydroxyl groups of non-reducing residues are acylated by 3-tetradecanoyloxytetradecanoic acid. As observed in FIG. 10, due to the inner core providing a fairly robust structure, the glycos moiety protrudes out from the lipid A moiety forming the bacterial membrane. More smooth mobility was observed at the terminal residues, especially at the terminal Gal residues. No NOE for anomer resonance was observed in the NOESY spectrum of FIG. 2, which is consistent with the increased mobility of this residue.

몇몇 LPS의 코어 구조들은 심하게 분지되어 있는 것으로 밝혀졌으며, 이로써 내핵의 보다 잘 정의된 배좌를 제공할 수 있다. 앞선 연구에서, 모락크셀라 카타르랄리스(Moraxella catharrhalis)의 LPS는 특이한 배좌를 적용하고 있는 것으로 밝혀졌는데, 매우 드문 항 순응체가 관찰되었다. 이 LPS 분자의 심하게 분지된 3,4,6-삼치환 D-글루코스 잔기의 경우, 거의 180°2면각(C-1'-O-1'-C-4-H-4)이 분지된 글루코스 단위에 대한 β-D-Glcp-(l-4)-DGlcp 연결에서 검출되었다. The core structures of some LPS have been found to be heavily branched, thereby providing a better defined locus of the inner core. In previous studies, the LPS of Moraxella catharrhalis was found to have a unique locus , a very rare anticompliant observed. For heavily branched 3,4,6-trisubstituted D-glucose residues of this LPS molecule, nearly 180 ° 2 angles (C-1'-O-1'-C-4-H-4) branched glucose Detected at β-D-Glc p- (l-4) -DGlc p linkage to the unit.

이 연구 결과 M. 헤몰리티카 혈청형 A1의 LPS 코어 올리고당 영역의 구조에 대한 자세한 그림을 얻었다. 본 출원인은 M. 헤몰리티카 LPS의 올리고당 영역이 쥐, 양 및 소의 면역원이며, 12종 M. 헤몰리티카 혈청형들 중 8종(i.e., 혈청형 Al, A5, A6, A7, A8, A12, A14, 및 A16)이 공통의 코어 올리고당 결정소를 공유하고 있음을 밝힌 바 있다. 혈청형 A1 및 A8 으로부터 얻은 코어 올리고당은 거의 동일한 ¹H NMR 스펙트럼을 보이는데, 이는 공통의 기본 구조가 존재함을 나타낸다. 이 연구의 결과를 토대로, M. 헤몰리티카 혈청형 A8로 설명되어지는 O-사슬 결핍 LPS는 O-사슬 결합 부위를 제공할 수 있는 잔기인 코어 올리고당 내 말단 Gal 단위가 없음이 명확해졌다. M. 헤몰리티카 혈청형들 간의 LPS 구조를 이해함으로써 M. 헤몰리티카 소(bovine) 파스튜렐로시스에 대한 백신의 기초가 제공될 수 있었다. 혈청형 A1는 지구상의 전체 축우 사망의 30%의 원인이 되는 이질병에 책임이 있는 주요 미생물이다. 보다 독성이 덜한 그의 혈청형 또는 항원들을 백신 제제에 사용한다면, 효과적인 질병 관리 방책을 제공할 수 있을 것이다. As a result of this study, a detailed picture of the structure of LPS core oligosaccharide region of M. hemolytica serotype A1 was obtained. Applicants have found that the oligosaccharide regions of M. hemolytica LPS are immunogens of rats, sheep and cattle, and 8 of 12 M. hemolytica serotypes (ie, serotypes Al, A5, A6, A7, A8, A12 , A14, and A16) share a common core oligosaccharide crystallite. Core oligosaccharides from serotypes A1 and A8 show nearly identical ¹ H NMR spectra, indicating that a common basic structure exists. Based on the results of this study, it became clear that O-chain deficient LPS, described as M. hemolytica serotype A8, lacks a terminal Gal unit in the core oligosaccharide, a residue capable of providing an O-chain binding site. Understanding the LPS structure between M. hemolytica serotypes could provide a basis for a vaccine against M. hemolytica bovine pasteurosis. Serotype A1 is a major microorganism responsible for dysentery, which accounts for 30% of all cattle deaths on earth. The use of less toxic serotypes or antigens in vaccine formulations may provide effective disease management measures.

실시예Example 1에 대한 실험 Experiment on 1

M. 헤몰리티카 LPS의 제조Preparation of M. Hemolytica LPS

파스튜렐라( Mannheimia ) 헤몰리티카 혈청형 A1(NRCC 4212)을 "Veterinary Infectious Diseases Organization(VIDO), Saskatoon, SK, Canada"로부터 얻었다. LPS를 문헌 [Severn 등 Carbohydr. Res. 240, 277(1993)]에 이미 기재된 고온 수성 페놀 방법에 의해 발효기 생장 박테리아 배양액으로부터 추출하고 정제하였다. Wave stew Pasteurella (Mannheimia) H. Molina urticae serotype A1 (NRCC 4212) were obtained from the "Veterinary Infectious Diseases Organization (VIDO) , Saskatoon, SK, Canada". LPS, Severn et al. Carbohydr. Res. 240 , 277 (1993)] and extracted from fermenter growing bacterial cultures by the high temperature aqueous phenol method already described.

LPS의 탈아실화에 의한 골격 올리고당 제조Skeletal Oligosaccharide Preparation by Deacylation of LPS

Holst 등의 탈아실화 절차를 변형하여 문헌 [Severn 등 J. Bacteriol. 178, 1731(1996)]에 기재된 바와 같이 골격 올리고당을 제조하였다. 샘플(400 ㎎)을 주변 온도에서 무수 히드라진(20 ㎖, 37 ℃, 30 분)으로 처리하여 LPS의 지질 A로부터 에스테르 결합 지방산들을 제거하였다. 과량의 히드라진은 아세톤(3배수 부피)을 냉각시킨 반응 혼합물(0℃)에 첨가하여 제거하였다. 침전된 O-탈아실화 LPS 생성물을 원심분리(5000 rpm, 10 min)에 의해 분리하고, 아세톤으로 세척하고, 물에서 동결건조시켰다. O-탈아실화 샘플(200 ㎎)을 수성(4 M, 10 ㎖) 내에서 100℃에서 20 시간 가열하여 N-아실기를 제거하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고(0℃), 4 M HCl로 중화하고, 침전된 지방산은 원심분리(12000 x g, 30 min)에 의해 제거하였다. 상층액은 500-분자량 컷오프 막(Amicon; YC05) 으로 Amicon 농도 세포에서 여과하고, 탈이온수를 클로라이드 이온이 없을때까지 세척하였다(수성 AgNO₃로 결정함). 투석 물질을 동결건조시켜 탈아실화 LPS(약 80 ㎎)를 얻었다. 올리고당을 DEAE A-25 상에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 골격 올리고당 분획(약 50 ㎎)은 양이온 ESI-MS에서 주요 이온으로 이가 전하를 갖는 이온(m/z 1124.8)을 보였으며, 이는 Hex₃Hep₅Kdo HexN₂(H₂PO₃)₃(M, 2246.9) 조성물에 대응한다. 이가 전하를 갖는 이온의 MS-MS로 m/z 500(HexN₂(H₂PO₃)₂) 및 801(KdoHexN₂(H₂PO₃)₂)에서 특징적인 분획을 얻었으며, 이는 각각 탈아실화 지질 A 및 Kdo-P 치환 단위들에 해당한다.By modifying the deacylation procedure of Holst et al., Severn et al. J. Bacteriol. 178, 1731 (1996), to prepare skeletal oligosaccharides. Sample (400 mg) was treated with anhydrous hydrazine (20 mL, 37 ° C., 30 min) at ambient temperature to remove ester binding fatty acids from lipid A of LPS. Excess hydrazine was removed by adding acetone (3 times volume) to the cooled reaction mixture (0 ° C.). The precipitated O-deacylated LPS product was separated by centrifugation (5000 rpm, 10 min), washed with acetone and lyophilized in water. The O-deacylated sample (200 mg) was heated in aqueous (4 M, 10 mL) at 100 ° C. for 20 hours to remove N-acyl groups. The reaction mixture was cooled (0 ° C.), neutralized with 4 M HCl, and the precipitated fatty acid was removed by centrifugation (12000 × g, 30 min). Supernatants were filtered on Amicon concentration cells with a 500-molecular weight cutoff membrane (Amicon; YC05) and deionized water was washed until free of chloride ions (determined with aqueous AgNO ₃ ). The dialysis material was lyophilized to give deacylated LPS (about 80 mg). Oligosaccharides were purified by anion exchange chromatography on DEAE A-25. The skeletal oligosaccharide fraction (about 50 mg) showed a divalent charge ion ( m / z 1124.8) as the main ion in cationic ESI-MS, which was Hex ₃ Hep ₅ Kdo HexN ₂ (H ₂ PO ₃ ) ₃ (M, 2246.9) to the composition. MS-MS of divalent charged ions gave the characteristic fractions at m / z 500 (HexN ₂ (H ₂ PO ₃ ) ₂ ) and 801 (KdoHexN ₂ (H ₂ PO ₃ ) ₂ ), respectively, which were deacylated Corresponds to lipid A and Kdo-P substitution units.

D-글리세로-L-만노-헵토스D-glycero-L-manno-heptose

알칼리성 메탄올 내에서 니트로 메탄과 함께 D-갈락토스를 농축하여 헵토스 를 제조하였다. 탈이온 생성물(mp 158℃, 21% 수율)의 수용액으로부터 얻은 결정성 1-데옥시-1-니트로-D-글리세로-L-만노-헵티톨을 나트륨 염으로 전환시켰다. 희석한 황산(35℃)으로 처리하고, Rexyn 101(H⁺) 및 Amberlite A4(OH^-) 이온-교환 수지로 탈이온화한 뒤, 용액을 동결건조시켜 시럽 형태의 헵토스를 얻었다(80% 수율). 생성물을 용리액으로 부탄-1-올-물(1:10 부피/부피)를 사용하여 셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 분류하였다. 헵토스를 함유한 분획을 감압하에 건조될때까지 농축시켰다. [α]D-14°(c 0.2, 물) 인 D-글리세로-L-만노-헵토스를 종이 크로마토그래피에 의해 정제하고, 환원시키고(NaBH₄) 아세틸화한 생성물을 GLC하여 단일 피크를 얻었으며, 이는 순도가 알려진 진정한 헵타-O-아세틸-D-글리세로-L-만노-헵티톨의 체류 시간과 일치하였다. Heptose was prepared by concentrating D-galactose with nitro methane in alkaline methanol. Crystalline 1-deoxy-1-nitro-D-glycero-L-manno-heptitol obtained from an aqueous solution of deionized product (mp 158 ° C., 21% yield) was converted to the sodium salt. Treated with dilute sulfuric acid (35 ° C.), deionized with Rexyn 101 (H ⁺ ) and Amberlite A4 (OH ⁻ ) ion-exchange resins, and the solution was lyophilized to give heptose in syrup form (80% yield). ). The product was fractionated by cellulose column chromatography using butan-1-ol-water (1:10 volume / volume) as eluent. Fractions containing heptose were concentrated to dryness under reduced pressure. D-glycero-L-manno-heptose, which is [α] D-14 ° (c 0.2, water), was purified by paper chromatography, reduced (NaBH ₄ ) and acetylated product was subjected to GLC to yield a single peak. Obtained, which is consistent with the residence time of known true hepta-O-acetyl-D-glycero-L-manno-heptitol.

D-글리세로-D-만노-헵토스D-glycero-D-manno-heptose

D-알트로스를 니트로메탄과 함께 농출하여 1-데옥시-1-니트로-D-글리세로-D만노-헵티톨(mp 109℃, [α]_D -7.0°(c 1.1, EtOH), 27% 수율))을 얻고, 이의 수성 나트륨염 용액을 0℃에서 교반된 20%(부피/부피) 황산에 서서히 적가하여 D-글리세로-D-만노-헵토스로 전환시킴으로써 헵토스를 제조하였다. 반응 혼합물을 염으로 중화시켰다. Ba(OH)₂ 용액을 여과하고, Rexyn 101(H⁺) 및 Duolite A4(OH^-) 이온-교환 수지에 통과시켜 나머지 이온 물질을 제거한 후 시럽으로 농축시켰다(92% 수율). 종이 크로마토그래피로 알 수 있는 바와 같이, 헵토스 생성물을 알트로스와 변 화되지 않은 1-데옥시-1-니트로-D-글리세로-D-만노-헵티톨(약 2 내지 3%)로 오염되어 있었다. 생성물을 이동상으로 부탄-1-올-물(1:10 부피/부피)을 사용하는 셀룰로오즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. O-글리세로-D-만노만노스는 [α]D +22°(c 2, MeOH)이었다. 환원되고(NaBH₄) 아세틸화한 샘플을 GLC 하여 진정한 헵타-O-아세틸-D-글리세로-D-만노-D헵티톨에 대응하는 단일 피크를 얻었으며, 이는 합성 헵토스의 신원과 순도를 나타낸다 D-altose was concentrated together with nitromethane to yield 1-deoxy-1-nitro-D-glycero-Dmanno-heptitol (mp 109 ° C., [α] _D −7.0 ° (c 1.1, EtOH), 27 % Yield)) and heptose was prepared by converting its aqueous sodium salt solution into D-glycero-D-manno-heptose by slowly dropwise addition to 20% (volume / volume) sulfuric acid stirred at 0 ° C. The reaction mixture was neutralized with salt. The Ba (OH) ₂ solution was filtered and passed through Rexyn 101 (H ⁺ ) and Duolite A 4 (OH ⁻ ) ion-exchange resins to remove the remaining ionic material and then concentrated to syrup (92% yield). As can be seen by paper chromatography, the heptose product is contaminated with altrose and 1-deoxy-1-nitro-D-glycero-D-manno-heptitol (about 2-3%) unaltered It was. The product was purified by cellulose column chromatography using butan-1-ol-water (1:10 volume / volume) as the mobile phase. O-glycero-D-mannnomannose was [α] D + 22 ° (c 2, MeOH). GLC of the reduced (NaBH ₄ ) acetylated sample yielded a single peak corresponding to true hepta-O-acetyl-D-glycero-D-manno-Dheptitol, which revealed the identity and purity of the synthetic heptose Indicates

전자 분사 질량 스펙트럼 분석Electron Injection Mass Spectrum Analysis

전자 분사 이온 공급원이 장착된 VG Quattro 트리플 사중극자 질량 분광기(Micromass, Manchester, U.K.)에서 샘플들을 분석하였다. 골격 올리고당을 0.5% 아세트산을 함유한 아세토니트릴-물(대략 1:2 부피/부피)용해하였다. 주입 부피는 10 ㎕이었으며 유속은 4 ㎖/분이었다. 전자 분사 팁의 전압은 관행상 2.7 kV이었으며 질량 분광기는 m/z 50에서 2500 까지 스캔하였고, 스캔 시간은 10 s이었다. MS-MS 실험을 위해, 전구체 이온들을 제1 사중극자를 사용하여 선택하고, RF-유일 사중극자 세포에서 아르곤과의 충돌 활성화에 의해 형성된 파편 이온들은 제3 사중극자를 스캔하여 질량분석하였다. 충돌 에너지는 관행상 60 ev(참조 문헌의 실험실 체제)이었다. Samples were analyzed on a VG Quattro triple quadrupole mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) equipped with an electron jet ion source. The backbone oligosaccharides were dissolved in acetonitrile-water (approx. 1: 2 volume / volume) containing 0.5% acetic acid. The injection volume was 10 μl and the flow rate was 4 ml / min. The voltage of the electron injection tip was conventionally 2.7 kV, the mass spectrometer scanned from m / z 50 to 2500 and the scan time was 10 s. For MS-MS experiments, precursor ions were selected using a first quadrupole, and fragment ions formed by collisional activation with argon in RF-only quadrupole cells were subjected to mass spectrometry by scanning a third quadrupole. The impact energy was conventionally 60 ev (laboratory system in reference).

핵자기 공명Nuclear magnetic resonance

NMR 스펙트럼은 표준 소프트웨어를 사용하는 Bruker AMX 600, AMX 500, 또는 Varian Inova 600 분광기에서 수행하였다. 모든 측정은 300 K 및 pH 3에서 이루어 졌으며 D₂O 0.6 ㎖에 용해된 샘플 10 ㎎을 함유하였다. 측정은 pH 3에서 수행하여 이미 실행된 바와 같이 양자 스펙트럼의 해상도를 개선하였다(Cox, 1996). 아세톤을 내부 또는 외부 참조값으로 사용하였다(¹H 스펙트럼의 경우 2.225 ppm 및 ¹³C 스펙트럼의 경우 31.07 ppm). 코어 올리고당의 총체적인 지정을 위해 표준 동종핵 및 이종핵 관련 2D 기술을 사용하였다: COSY, TOCSY, NOESY, 트리플 양자 동종핵 관련 실험, HMQC, HMQC-TOCSY, 및 HMBC 및 ³¹P HMQC. 헵토스 단당류들에 대한 스핀 모의를 표준 Varian 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 정밀한 화학적 시프트 및 커플링 상수는 스핀 모의를 수행하는 데 사용된 파라미터로부터 얻었으며 스펙트럼의 피크 리스트로부터는 얻지 못하였다. NMR spectra were performed on a Bruker AMX 600, AMX 500, or Varian Inova 600 spectrometer using standard software. All measurements were made at 300 K and pH 3 and contained 10 mg of sample dissolved in 0.6 ml of D ₂ O. The measurement was performed at pH 3 to improve the resolution of the quantum spectrum as already performed (Cox, 1996). Acetone was used as internal or external reference (2.225 ppm for the ¹ H spectrum and 31.07 ppm for the ¹³ C spectrum). Standard homonuclear and heteronuclear related 2D techniques were used for the overall designation of core oligosaccharides: COSY, TOCSY, NOESY, triple quantum homonuclear related experiments, HMQC, HMQC-TOCSY, and HMBC and ³¹ P HMQC. Spin simulations for heptose monosaccharides were performed using standard Varian software. Precise chemical shift and coupling constants were obtained from the parameters used to perform the spin simulations and not from the peak list of the spectra.

완전한 잔기 지정 및 내부-잔기 ¹H-¹H 핵 오버하우저 상승 효과 결정을 위해, 선택적인 1D-TOCSY, 1D-NOESY, 1D-TOCSY-TOCSY, 1D-TOCSY-NOESY, 및 1 D-NOESY-TOCSY 실험을 수행하였다. 1D 선택 서열의 사용을 기재하는데 사용된 명명법은 1D EXP(스핀, 혼합 시간) 및 1D EXP1-EPX2(스핀 1, 혼합 시간; 스핀2, 혼합 시간)이며, 상기에서 EXP, EXP1, 및 EXP2는 TOCSY 또는 NOESY를 나타낸다. 또한, 도면에서 선택된 공명들은 밑줄을 쳤다. 두번 밑줄친 공명은 이 공명이 제2 선택 단계로 선택되었음을 의미한다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 모든 잔기는 문자로 표지되어 있으며, 스핀들은 원자 번호로 표지되어 A1은 잔기의 H-1 공명을 나타낸다. Selective 1D-TOCSY, 1D-NOESY, 1D-TOCSY-TOCSY, 1D-TOCSY-NOESY, and 1 D-NOESY-TOCSY for complete residue designation and determination of internal-residue ¹ H- ¹ H nuclear overhauser synergy The experiment was performed. The nomenclatures used to describe the use of 1D selection sequences are 1D EXP (spin, mixing time) and 1D EXP1-EPX2 (spin 1, mixing time; spin2, mixing time), where EXP, EXP1, and EXP2 are TOCSY. Or NOESY. Also, the resonances selected in the figures are underlined. Resonance underlined twice means that this resonance was chosen as the second selection step. As shown in FIG. 1, all residues are labeled with letters, spindles are labeled with atomic numbers, and A1 represents the H-1 resonance of the residue.

AMX 분광기에서 선택적인 여기는 1/2-가우시안 펄스에 의해 성취하였다. TOCSY에 사용된 혼합 시간은 스핀 시스템에 좌우되었다. 일반적으로 30 내지 180 ms의 혼합 시간(스핀 록 시간) 범위를 이용하여 스핀 시스템을 지정하였다. 1D-NOESY의 혼합 시간은 분자의 상관 시간 및 글리코사이드 연결 주변의 내부 운동에 좌우되었다. NOESY 혼합 시간은 150 내지 400 ms 범위내 이었다. 말단 Gal 잔기에 대한 내부 잔기 NOE를 검색하기 위해, 1D-ROESY 실험을 수행하였으며, 혼합 시간은 500 ms이었다. 중복 선택 실험을 위해, 선택 펄스를 가능한한 짧게 유지하여 이환 효과로 인한 신호 강도의 손실을 피했다. 각 부분을 한번에 하나씩 최적화하였다. 1D-TOCSY는 대략 수분 내에 수행할 수 있었다. 1D-NOESY는 NOE의 크기에 따라 수분에서 수시간이 소요되었다. 몇몇 중복 선택 실험은 12시간이 소요되었다. 1D-TOCSYTOCSY 및 1D-TOCSY-NOESY이 가장 효율적이었다. 샘플이 시간이 감에 따라 분해되기 때문에 몇몇 실험은 펄스장 등급을 이용하는 Inova 600 분광기에서 수행하였다. Selective excitation in an AMX spectrometer was achieved by 1 / 2-Gaussian pulses. The mixing time used for TOCSY was dependent on the spin system. Typically the spin system was specified using a mix time (spin lock time) range of 30 to 180 ms. The mixing time of 1D-NOESY was dependent on the correlation time of the molecules and the internal motion around the glycoside linkages. The NOESY mixing time was in the range of 150 to 400 ms. To search for internal residue NOE for terminal Gal residues, a 1D-ROESY experiment was performed and the mixing time was 500 ms. For redundant selection experiments, the selection pulses were kept as short as possible to avoid loss of signal strength due to the morbidity effect. Each part was optimized one at a time. 1D-TOCSY could be performed in approximately minutes. 1D-NOESY took several hours to several minutes depending on the size of the NOE. Some duplicate selection experiments took 12 hours. 1D-TOCSYTOCSY and 1D-TOCSY-NOESY were the most efficient. Some experiments were carried out on an Inova 600 spectrometer using pulse field ratings as the samples decomposed over time.

분자 모델링Molecular modeling

문헌 [Peters 등 Carbohydr. Res. 238, 49(1993)]에 이미 기재된 Metropolis Monte Carlo 방법을 이용하여 배좌 분석을 수행하였다. PFOS 전위를 이용하였다. Quantum Chemistry Program Exchange(QCPE)로부터 입수가능한 MM3를 사용하여 단당류에 대한 최소화된 등위를 얻었다. 각각의 이탄당에 대한 최소 에너지 배좌를 출발 배좌로 사용하였다. 환원 말단에 위치한 Kdo로부터 출발하여 완전한 구조를 마칠때까지 다양한 올리고당에 대해 계산하였다. 내부 코어 8탄당의 경우, 5 × 10⁴ 마크로 이동을 이용하였으며 글리코사이드 연결에 대한 단계 길이는 5°1 × 10³ K의 온도를 이용하여 수용비율이 0.36이었다. 내부 코어 8탄당에 대한 분자 모델은 최소 에너지 순응체를 이용하여 생성하였다. 매 마크로 이동 마다 저장된 등위로부터 거리를 유도하였다. 지질 A를 갖는 완전한 LPS는 지질 A 구조 및 Kdo 연결에 대한 최소 에너지 순응체에 의해 생성하였다. E. Keeler(University of Freiburg, Germany)로부터 얻은 Schakal97을 이용하여 분자를 그렸다. Peters et al. Carbohydr. Res. 238 , 49 (1993)] was performed using the Metropolis Monte Carlo method already described. PFOS potential was used. Minimal equivalence for monosaccharides was obtained using MM3 available from Quantum Chemistry Program Exchange (QCPE). The minimum energy account for each peat was used as the starting account. Calculations were made for various oligosaccharides starting from Kdo located at the reducing end and completing the complete structure. In the case of the inner core octane, a 5 × 10 ⁴ mark shift was used and the step length for glycoside linkages was 0.36 using a temperature of 5 ° 1 × 10 ³ K. Molecular models for the inner core octasaccharide were generated using the minimum energy conformer. The distance is derived from the saved equivalence with every mark movement. Complete LPS with lipid A was produced by minimal energy conformation to lipid A structure and Kdo linkages. Molecules were drawn using Schakal97 from E. Keeler (University of Freiburg, Germany).

실시예Example 2 2

이 실시예는 문헌 [Carbohydr. Res. 339: 1973(2004)]을 기초로 이루어졌다. A. 플루로뉴모니애 혈청형 5a, b, 2 및 1의 조사.This example is described in Carbohydr. Res. 339 : 1973 (2004). A. Investigation of Pluronomymoniae serotypes 5a, b, 2 and 1.

컬럼-분류한 LPS의 당 분석에서 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal), N-아세틸-글루코사민(GlcNAc), O-글리세로-D-만노-헵토스(DD-Hep), 및 L-글리세로-D-만노-헵토스(LD-Hep)이 각각 대략 2:1.5:1:2:3의 비율로 나타났다. 코어 OS를 재료 및 방법 에 기재된 바와 같이 산 가수분해의 겔 여과 크로마토그래피 분류법으로 정제하고 코어 OS가 풍부하고 비교적 O-항원이 없는 분획을 얻어 당 분석을 한 결과, Glc, Gal, DD-Hep, 및 LD-Hep이 각각 2:1:2:3의 비율로 나타났다. 혈청형 5b의 협막 다당류는 N-아세틸-D-글루코사민 및 케토스 잔기를 함유하고 있었으며, 본 출원인은 LPS가 약간의 협막(CPS) 오염이 있으며, 분류된 코어 OS 샘플은 코어 OS를 얻기 위해 이용된 산 가수분해 조건에 대한 케토사이드 결합의 민감성으로 인해 CPS가 없는 것이 아닌가 생각하였다. 또한, 유일한 O-항원 잔기인 비교적 소량의 갈락토스는 검사한 분획인 주로 유의한 O-항원 연장이 없는 코어 OS가 대부분임을 시사하였다. In glucose analysis of column-sorted LPS, glucose (Glc), galactose (Gal), N-acetyl-glucosamine (GlcNAc), O-glycero-D-manno-heptose (DD-Hep), and L-glycerol -D-manno-heptose (LD-Hep) was shown in a ratio of approximately 2: 1.5: 1: 2: 3 respectively. The core OS was purified by gel filtration chromatography fractionation of acid hydrolysis as described in Materials and Methods, and fractionated with GOS, Gal, DD-Hep, And LD-Hep were found to be 2: 1: 2: 3, respectively. The capsular polysaccharide of serotype 5b contained N-acetyl-D-glucosamine and ketose residues, and Applicants found that LPS had some capsular (CPS) contamination, and the sorted core OS samples were used to obtain core OS. The sensitivity of the ketoside bonds to the acid hydrolysis conditions was thought to be due to the absence of CPS. In addition, a relatively small amount of galactose, the only O-antigen residue, suggested that most of the core OS without the significant fraction of the O-antigen extension was the fraction examined.

LPS-OH를 제조하고 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분류하였다. 소량의 O-항원을 함유한 것과 같은 부피로 용출된 분획을 CE-ES-MS(실시예 2, 표 1)에 의해 분석하였다. 2Hex, 5Hep, Kdo, P, 지질 A-OH의 조성물과 일치하는 2537 amu의 분자에 대응하는 간단한 질량 스펙트럼이 관찰되었다. 2가 이온에 대한 CE-MS/MS 분석(데이터 도시 안됨) (m/z 1268)에서 2개의 1가 피크(m/z 951 및 1584)가 관찰되었으며, 이로서 O-탈아실화 지질 A의 크기가 952 amu이고 코어 OS가 1584인 것이 확인되었다. O-탈아실화 지질 A 종(952 amu)은 N-아실화(3-OH C 14:0) 글루코사민 잔기들의 이당으로 이루어져있으며, 각각의 잔기는 포스페이트 분자로 치환되어 있다. 분류된 OS 샘플의 ES-MS 및 CE-ES-MS 분석에서 질량이 1505 Da인 것으로 밝혀졌으며, 2Hex, 5Hep, Kdo(실시예 2, 표 1)의 조성으로 이루어져 있다(도 11). 이후 용출되는 코어 OS 분획의 CE-ES-MS 스펙트럼에서는 질량이 1562으로 나타났으 며, 이는 주요 단백당형 보다 57 amu 더 큰것이다(실시예 2, 표 1). 이러한 질량은 수막구균 및 헤모필루스 인플루엔자의 LPS에서 최근 관찰된 아미노산 글리신에 대응한다. CE-ES-MS/MS 분석에 따르면, 이 글리신 잔기는 Kdo 분자로부터 두번째 헵토스 잔기(Hep II)에 위치하였다(데이터 도시 안됨). LPS-OH was prepared and sorted by gel filtration chromatography. Fractions eluted in the same volume as containing small amounts of O-antigen were analyzed by CE-ES-MS (Example 2, Table 1). A simple mass spectrum corresponding to a molecule of 2537 amu consistent with the composition of 2Hex, 5Hep, Kdo, P, lipid A-OH was observed. In the CE-MS / MS analysis (data not shown) for divalent ions ( m / z 1268) two monovalent peaks ( m / z 951 and 1584) were observed, indicating the size of O-deacylated lipid A It was confirmed that it is 952 amu and the core OS is 1584. O-deacylated lipid A species (952 amu) consists of a disaccharide of N-acylated (3-OH C 14: 0) glucosamine residues, each residue substituted with a phosphate molecule. ES-MS and CE-ES-MS analysis of the sorted OS samples revealed a mass of 1505 Da, consisting of 2Hex, 5Hep, Kdo (Example 2, Table 1) (FIG. 11). In the CE-ES-MS spectrum of the eluted core OS fraction, the mass was found to be 1562, which is 57 amu larger than the main protein glycoform (Example 2, Table 1). This mass corresponds to the recently observed amino acid glycine in the LPS of meningococcal and Haemophilus influenza. According to the CE-ES-MS / MS analysis, this glycine residue was located at the second heptose residue (Hep II) from the Kdo molecule (data not shown).

분자의 연결 패턴을 결정하기 위해 코어 OS에 대한 메틸화 분석을 수행하였다. 코어 OS만 대응하는 분획을 분석하였을 때 대략 같은 몰의 말단 Glc, 6-치환 Glc, 말단 DD-Hep, 말단 LD-Hep, 6-치환 DD-Hep, 2-치환 LD-Hep 및 3,4,6-트리-치환 LD-Hep이 존재하는 것으로 나타났다. 주로 O-항원을 함유하고 있는 OS의 초기 분획 분석에서 6-치환 Gal(O-항원 성분) 이 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 O-항원의 연결 패턴을 입증한다. Methylation analysis was performed on the core OS to determine the connectivity patterns of the molecules. Only core OS analyzed the corresponding fractions of approximately equal moles of terminal Glc, 6-substituted Glc, terminal DD-Hep, terminal LD-Hep, 6-substituted DD-Hep, 2-substituted LD-Hep and 3,4, 6-tri-substituted LD-Hep was shown to be present. Initial fractional analysis of OS containing predominantly O-antigens revealed the presence of 6-substituted Gal (O-antigen component), demonstrating the linking pattern of O-antigens.

OS의 정확한 위치와 연결 패턴을 규명하기 위해, O-항원이 부재하는 OS 분획에 대한 NMR 연구를 수행하였다(도 12a). OS의 ¹H 공명에 대한 지명은 COSY 및 TOCSY 실험에 의해 수행하였다. 도 13은 OS 내 각 잔기의 아노머 ¹H-공명에 대한 일련의 선택적 1D-TOCSY 실험들을 도시한다. NMR 분석 중에, Ap 5a OS가 구조적으로 만헤이미아 헤몰리티카 코어 OS의 구조에 관련되어 있음이 명백해졌으며 Ap 5a OS 스펙트럼의 지명은 이 ¹H NMR 데이터를 참조하여 수행하였다(실시예 2, 표 2). To identify the exact location and linking pattern of the OS, NMR studies were performed on OS fractions lacking O-antigens (FIG. 12A). The nomination for ¹ H resonance of the OS was performed by COSY and TOCSY experiments. FIG. 13 shows a series of selective 1D-TOCSY experiments on anomer ¹ H-resonance of each residue in the OS. During NMR analysis, Ap 5a OS is structurally Manhemia It became clear that it was related to the structure of the hemolytica core OS and the nomination of the Ap 5a OS spectrum was performed with reference to this ¹ H NMR data (Example 2, Table 2).

Ap 5a OS의 선택적 스펙트럼에서, 헵토스 잔기(Hep I(도 13a), Hep II(도 13b), Hep III(도 13c), Hep IV(도 13d) 및 Hep V(도 13e))의 스핀 시스템은 만노-피라노실 고리 시스템에 표시된 스핀 시스템의 외형과 커플링된 5.11(Hep I), 5.70(Hep II), 5.17(Hep III), 4.96(Hep IV) 및 5.03(Hep V) ppm에서 아노머 ¹H 공명에 의해 쉽게 확인되었다. Hep I 및 Hep II(도 12a)의 아노머 양자들에 대해 관찰되는 이종성은 산 가수분해시 Kdo 잔기의 배치 때문이다. 5.21 ppm(Glc II)의 α-아노머 영역 내 나머지 잔기는 스핀 시스템의 외형에 근거하여 글루코-피라노스 당으로 결정하였다(도 13f). 스펙트럼의 하위 전계 영역(4.45 - 6.00 ppm) 내 아노머 공명의 나머지는 모두 아노머 ¹H 공명에 의한 β연결 잔기들 때문이며, 용해된 잔기들의 경우에는 높은 J _{1 ,2} (∼8 Hz) 커플링 상수때문이다. 4.66 ppm(Glc I)에서의 공명중 중 하나는 스핀 시스템의 외형으로부터 글루코-구조로 지정하였다(도 13g). 4.49(Gal I) ppm에서 하위 전계 영역 내 나머지 공명은 TOCSY 실험에서 H-4 공명에 대한 특징적인 스핀 시스템의 외형으로부터 갈락토-피라노실 잔기로 지정하였다(도 13h). 4.48 ppm에서 Kdo의 H-6 ¹H 공명 또한 조사함에 따라 Kdo 스핀 시스템 또한 이 실험에서 이용하였으며 4.10 및 4.21 ppm에서 각각 H-4 및 H-5 ¹H 공명을 나타냈다. 그러나, Kdo의 스핀 시스템은 코어 가수분해 시 Kdo 잔기의 재배치로 인해 완전히 결정하기 어려우며, 매우 낮은 메틸렌 H-3 양자들의 강도 수준은 아마도 중수소 교환으로 인한 것이다. 그러나, 1.92 ppm에서 H-3 축 양자로부터 다른 1-D TOCSY 실험에서 스핀 시스템을 지정하였으며, 2.08 ppm에서 수평축 양자 및 4.10 ppm에서 H-4 양자대한 ¹H 공명을 보였다(데이터 도시안됨). In the selective spectrum of Ap 5a OS, spin system of heptose residues (Hep I (FIG. 13A), Hep II (FIG. 13B), Hep III (FIG. 13C), Hep IV (FIG. 13D) and Hep V (FIG. 13E)). Silver anomer at 5.11 (Hep I), 5.70 (Hep II), 5.17 (Hep III), 4.96 (Hep IV) and 5.03 (Hep V) ppm coupled with the appearance of the spin system shown in the manno-pyranosyl ring system Easily confirmed by ¹ H resonance. The heterogeneity observed for the annomeric quantum of Hep I and Hep II (FIG. 12A) is due to the placement of Kdo residues upon acid hydrolysis. The remaining residues in the α-anomer region of 5.21 ppm (Glc II) were determined as gluco-pyranose sugars based on the appearance of the spin system (FIG. 13F). The remainder of the anomer resonance in the lower electric field of the spectrum (4.45-6.00 ppm) is all due to β-linked residues by anomer ¹ H resonance, and in the case of dissolved residues, high J _{1 , 2} (∼8 Hz) coupling. Because of constants. One of the resonances at 4.66 ppm (Glc I) was designated gluco-structure from the appearance of the spin system (FIG. 13G). The remaining resonance in the lower electric field region at 4.49 (Gal I) ppm was designated as galacto-pyranosyl residue from the appearance of the characteristic spin system for H-4 resonance in the TOCSY experiment (FIG. 13H). As the H-6 ¹ H resonance of Kdo was also investigated at 4.48 ppm, the Kdo spin system was also used in this experiment, showing H-4 and H-5 ¹ H resonances at 4.10 and 4.21 ppm, respectively. However, Kdo's spin system is difficult to fully determine due to the rearrangement of Kdo residues during core hydrolysis, and the very low methylene H-3 proton levels are probably due to deuterium exchange. However, the spin system was specified in another 1-D TOCSY experiment from the H-3 axis proton at 1.92 ppm and showed ¹ H resonance for the horizontal axis proton at 2.08 ppm and H-4 proton at 4.10 ppm (data not shown).

OS 내 글리코실 잔기의 서열은 인접한 글리코실 잔기들 상에서 아노머와 아 글리콘 양자 사이의 내부-잔기 ¹H-¹H NOE 측정에 의해 결정하였으며, 메틸화 분석 데이터를 확인하고 확장하였다. Ap 5a OS의 연결 패턴은 이 방법으로 결정하였다(도 14)(실시예 2, 표 2). 따라서, 양자쌍 Hep III H-1과 Hep II H-2(도 14a) 및 Hep II H-1과 Hep I H-3(도 14b) 사이의 강한 트랜스글리코사이드 NOE 연결은 3개의 LD-헵토스 잔기들의 서울 및 부착 지점을 나타낸다. 이 연결 패턴은 주로 M. 헤몰리티카 및 H. 인플루엔자로부터 얻은 내부 코어 OS에서 발견된다. 더욱이, 아노머 양자 Hep III H-1 및 Hep II H-1 사이의 내부-잔기 NOE는 1,2-연결을 확인하게 해주었다. Glc I의 H-1로부터 NOE연결을 시험했을 때, 이 글루코스 잔기는 Hep I H-4 및 Hep I H-6에 대한 내부 잔기 NOE로 인해 4-위치에서 Hep I에 연결된 것으로 나타났다(도 14c). H-6에 대한 내부-잔기 NOE의 외형이 4-치환 헵토스 잔기들에 공통적으로 발생한다. Glc I의 H-1과 Glac II의 H-1 사이의 긴범위 NOE 연결이 발생하는 것은 α-배열 글루코스 잔기(Glc II)가 6-위치의 Hep I를 치환했음을 시사하며, 이는 앞서 M. 헤몰리티카로부터 얻은 OS에 대해서 관찰된 바 있다. Glc II의 H-1로부터 출발하는 NOE 연결을 검사하여 이 글루코스 잔기가 Hep I H-6에 대한 내부 잔기 NOE의 도움으로 6-위치의 Hep I에 연결되어 있음을 확인하였다(도 14d). Glc I와 유사하게, 긴범위 NOE 연결이 Glc I 및 Glc II의 아노머 ¹H 공명들 사이에서 관찰되었다. 나머지 헵토스 잔기들(Hep IV 및 Hep V)의 연결 위치는 다음과 같이 유추하였다. HepIV의 H-1로부터 NOE 연결을 검사한 결과, 이 헵토스 잔기는 Glc I H-6 및 H-6'에 대한 내부-잔기 NOE의 도움으로 6-위치의 Glc I에 연결 되어 있음을 확인하였다(도 14e). 마지막으로, Hep V는 Hep V H-1에서 Hep IV H-6에 이르는 NOE 연결의 도움으로 6-위치의 Hep IV를 치환하고 있는 것으로 결정하였다(도 14f). 추가로, 혈청형 5a로부터 얻은 OS의NMR 분석을 통해 O-사슬 갈락토스 잔기의 결합 지점을 확인할 수 있었다. 갈락토스 잔기만을 함유한 분획을 이 실험에 사용하였다. 아노머 ¹H-공명으로부터 얻은 NOE 연결은 3.68 및 3.93 ppm에서의 H-3 및 H-5에 대한 내부 연결 및 393 ppm의 내부 연결을 포함한다(도 15a). 이어서, 선택적인 1-D 실험들을 이용하여 3.93 ppm에서 양자 공명의 스핀 시스템을 확인하였다. NOESY 단계에서 Gal의 H-1 양자로부터 1D NOESY-TOCSY 실험을 수행한 후 TOCSY단계에서 3.93 ppm의 공명을 선택적으로 여기시켜 3.93 ppm의 공명과 4.06 ppm의 공명이 연결되어 있음을 확인하였다(도 15b). 혼합 시간 150 ms를 이용한 5.16 ppm에서 Hep III 잔기의 아노머 양자 공명의 1-D TOCSY 실험에서는 3.82 ppm에서 이 스핀-시스템의 H-4 및 H-5 양자 공명들이 나타났다(도 13c). 이어서, 이 공명을 NOESY 단계에서 선택적으로 조사하였으며, 4.06 ppm에서 Hep III H-6 공명을 나타내어 O-사슬의 결합 지점으로 HEPIII의 7-위치를 확인하였다(도 15c). 확인 데이터는 ¹³C-¹H HMBC 실험으로부터 얻었으며, -CH₂-기를 나타내는 ¹³C-¹H HSQC 스펙트럼에서 양성 피크로 나타나는 3.93 ppm(도 15e)에서의 양자 공명과 관련된 것으로 ¹³C-¹H HSQC 실험에서 밝혀진 70.3 ppm(도 15d)의 ¹³C-공명과 관련된 4.48 ppm에서의 O-사슬 갈락토스 잔기의 아노머 ¹H-공명으로부터 크로스 피크를 확인하였으 며, 이는 O-사슬 결합 지점으로 헵토스 잔기의 7-위치를 확인하였다. 이러한 결론은 7-치환 LD-Hep 잔기가 존재하는 것을 나타내는 갈락토스 잔기 만을 함유한 분획에 대한 메틸화 분석으로 확인되었으며, 이 과메틸화 알디톨 아세테이트 유도체는 O-사슬이 없는 코어 OS 분획의 다음 메틸화 분석에서는 관찰되지 않았다. The sequence of glycosyl residues in the OS was determined by internal-residue ¹ H- ¹ H NOE measurements between both anomer and aglycone on adjacent glycosyl residues, confirming and expanding methylation assay data. The connection pattern of Ap 5a OS was determined by this method (FIG. 14) (Example 2, Table 2). Thus, strong transglycoside NOE linkages between quantum pairs Hep III H-1 and Hep II H-2 (FIG. 14A) and Hep II H-1 and Hep I H-3 (FIG. 14B) resulted in three LD-heptoses. Seoul and the point of attachment of the residues are shown. This linkage pattern is mainly found in internal core OS obtained from M. haemolytica and H. influenza . Moreover, the internal-residual NOE between the annomeric protons Hep III H-1 and Hep II H-1 allowed the identification of 1,2-links. When testing NOE linkage from H-1 of Glc I, this glucose residue was shown to be linked to Hep I at 4-position due to internal residue NOE for Hep I H-4 and Hep I H-6 (FIG. 14C). . The appearance of the internal-residue NOE for H-6 occurs in common with 4-substituted heptose residues. The generation of long range NOE linkages between H-1 of Glc I and H-1 of Glac II suggests that the α-arranged glucose residue (Glc II) has substituted Hep I at the 6-position, previously described by M. He. Observations have been made for operating systems obtained from Mortica . Examination of the NOE linkage starting from H-1 of Glc II confirmed that this glucose residue was linked to Hep I at the 6-position with the aid of the internal residue NOE for Hep I H-6 (FIG. 14D). Similar to Glc I, long range NOE linkage was observed between the anomer ¹ H resonances of Glc I and Glc II. The linkage positions of the remaining heptose residues (Hep IV and Hep V) were inferred as follows. Examination of the NOE linkage from H-1 of HepIV confirmed that this heptose residue was linked to Glc I at the 6-position with the help of the internal-residual NOE for Glc I H-6 and H-6 '. (FIG. 14E). Finally, Hep V was determined to replace Hep IV at the 6-position with the aid of NOE linkages from Hep V H-1 to Hep IV H-6 (FIG. 14F). In addition, NMR analysis of OS from serotype 5a confirmed the point of attachment of O-chain galactose residues. Fractions containing only galactose residues were used in this experiment. NOE linkages obtained from anomer ¹ H-resonance included internal linkages to H-3 and H-5 at 3.68 and 3.93 ppm and 393 ppm internal linkages (FIG. 15A). Then, selective 1-D experiments were used to confirm the quantum resonance spin system at 3.93 ppm. After performing 1D NOESY-TOCSY experiment from H-1 protons of Gal in NOESY step, it was confirmed that 3.93 ppm resonance and 4.06 ppm resonance were connected by selectively exciting 3.93 ppm resonance in TOCSY step (FIG. 15B). ). 1-D TOCSY experiments of the anomeric quantum resonance of Hep III residues at 5.16 ppm with a mixing time of 150 ms showed H-4 and H-5 quantum resonances of this spin-system at 3.82 ppm (FIG. 13C). This resonance was then selectively examined in the NOESY step, showing Hep III H-6 resonance at 4.06 ppm to confirm the 7-position of HEPIII as the point of attachment of the O-chain (FIG. 15C). Check data was obtained from ¹³ C- ¹ H HMBC experiment, -CH ₂ - to be associated with both resonances in the ¹³ C- ¹ H HSQC spectrum 3.93 ppm (Fig. 15e) that appears as a positive peak in the represents a ¹³ C- ¹ H Cross peaks were identified from the anomer ¹ H-resonance of the O-chain galactose residue at 4.48 ppm associated with ¹³ C-resonance found in the HSQC experiment (FIG. 15D), which was heptose as the O-chain binding point. The 7-position of the residue was confirmed. This conclusion was confirmed by methylation analysis for fractions containing only galactose residues, indicating the presence of 7-substituted LD-Hep residues. The hypermethylated alditol acetate derivatives were subjected to subsequent methylation analysis of the core OS fraction without O-chains. Not observed.

[A. 플루로뉴모니애 혈청형 5b의 조사][Investigation of A. Pluronomymoniae serotype 5b]

혈청형 5로부터 얻은 LPS, LPS-OH 및 OS의 모든 분석은 혈청형 5a에 대해 서술한 앞의 분석과 동일하거나 매우 유사하였다(실시예 2, 표 1 및 2; 도 12b). All analyzes of LPS, LPS-OH and OS from serotype 5 were the same or very similar to the previous assay described for serotype 5a (Examples 2, Tables 1 and 2; FIG. 12B).

[A. 플루로뉴모니애 혈청형 2의 조사][Investigation of A. Pluronomymoniae serotype 2]

손상되지 않은 LPS의 당 분석에서, Glc, DD-Hep, LD-Hep, Rha, Gal, GlcNAc 및 GalNAc가 대략 8:2:2:1:2:1:2의 비율로 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 이 물질의 O-항원 및 협막 다당류 존재와 일치한다. 분류된 산 가수분해물의 당 분석에서는, 초기 용출 분획에 Glc, Rha, Gal 및 GalNAc가 대략 2:1:1:1의 비율로 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 O-항원이 풍부한 분획과 일치한다. O-항원이 없는 이후 분획에는 오직 Glc, DD-Hep 및 LD-Hep이 대략 3:2:3의 비율로 존재하는 것으로 나타났으며, 이는 코어 OS 분획으로부터 얻은 O-항원이 없는 분획과 일치한다. In the sugar analysis of intact LPS, Glc, DD-Hep, LD-Hep, Rha, Gal, GlcNAc, and GalNAc were present in approximately 8: 2: 2: 1: 2: 1: 2 ratios. This is consistent with the presence of O-antigens and capsular polysaccharides of this substance. Sugar analysis of the sorted acid hydrolysates showed that the initial elution fractions contained Glc, Rha, Gal, and GalNAc in approximately 2: 1: 1: 1 ratios, consistent with O-antigen-rich fractions. . Subsequent fractions without O-antigens showed only Glc, DD-Hep and LD-Hep present in the ratio of approximately 3: 2: 3, consistent with the fraction without O-antigens obtained from the core OS fraction. .

LPS-OH를 제조하고 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분류하였다. 낮은 비율의 O-항원을 함유한 것으로 나타난 일정 부피로 용출된 분획을 음이온 모드에서 CE-ES-MS 로 분석하였다(실시예 2, 표 1). 2700 amu의 분자에 대응하는 간단한 질량 스펙트럼이 관찰되었으며, 질량이 80amu 보다 작은 미량의 제2 분자를 갖는 3Hex, 5Hep, Kdo, P, 지질 A-OH로 이루어져 있으며, 포스페이트 잔기는 없는 것으 로 확인되었다. 3가 이온 m/z 899 CE-MS/MS 분석(데이터 도시 안됨)에서는 m/z 951에서 1가 피크가 관찰되었으며, 질량 2700 amu의 주요 분자에 대해 O-탈아실화 지질 A의 크기를 952 amu로 확인하였다. O-항원이 없는 분류된 코어 OS 샘플의 CE-ES-MS 분석에서 질량 1667 Da이 나타났으며, 3Hex, 5Hep, Kdo의 조성을 확인하였다(실시예 2, 표 1). 따라서, 질량 스펙트럼 분석은 혈청형 2의 코어 OS가 혈청형 5a 및 b에 비해 추가 글루코스 잔기를 갖는 것으로 확인하였다. LPS-OH was prepared and sorted by gel filtration chromatography. Fractions eluted at a constant volume appearing to contain low proportions of O-antigen were analyzed by CE-ES-MS in anion mode (Example 2, Table 1). A simple mass spectrum corresponding to a molecule of 2700 amu was observed, consisting of 3Hex, 5Hep, Kdo, P, lipid A-OH with trace second molecules with mass less than 80 amu, and no phosphate residues. . Trivalent ions m / z 899 CE-MS / MS analysis (data not shown) showed monovalent peaks at m / z 951 and increased the size of O-deacylated lipid A to 952 amu for a major molecule of mass 2700 amu. It was confirmed as. CE-ES-MS analysis of the classified core OS samples without O-antigen revealed a mass of 1667 Da and confirmed the composition of 3Hex, 5Hep, Kdo (Example 2, Table 1). Thus, mass spectral analysis confirmed that the core OS of serotype 2 had additional glucose residues compared to serotypes 5a and b.

O-항원이 없는 코어 OS 분획의 메틸화 분석에서 말단 Glc, 6-치환 Glc, 말단 DD-Hep, 말단 LD-Hep, 2-치환 DD-Hep, 2-치환 LD-Hep, 4,6-디-치환 DD-Hep, 및 3,4,6-트리-치환 LD-Hep이 대략 6:3:3:2:1:2:3:2의 비율로 존재하는 것이 밝혀졌다. 혈청형 2와 5b의 메틸화 데이터 간의 주요한 차이는 모노-6-치환 DD-Hep이 4,6-디-치환 DD-Hep로 대체된 것이며, 추가 글루코스 잔기의 결합 지점으로 내부 DD-Hep 잔기의 4-위치를 시험적으로 확인하였다. 혈청형 2와 5간의 말단 글루코스 잔기들의 비율은 메틸화 분석에 의해 확인하였으며 혈청형 2의 코어 OS의 추가 말단 글루코스 잔기의 존재를 나타내었다. Terminal Glc, 6-substituted Glc, terminal DD-Hep, terminal LD-Hep, 2-substituted DD-Hep, 2-substituted LD-Hep, 4,6-di- in methylation analysis of the core OS fraction without O-antigen Substituted DD-Hep, and 3,4,6-tri-substituted LD-Hep, were found to be present in approximately 6: 3: 3: 2: 1: 2: 3: 2 ratio. The main difference between the methylation data of serotypes 2 and 5b is that the mono-6-substituted DD-Hep was replaced with 4,6-di-substituted DD-Hep and 4 of the internal DD-Hep residues as binding points for additional glucose residues. -The location was tested experimentally. The proportion of terminal glucose residues between serotypes 2 and 5 was confirmed by methylation analysis and indicated the presence of additional terminal glucose residues of the core OS of serotype 2.

¹H-NMR 데이터(실시예 2, 표 2,(도 12c))는 질량 스펙트럼 분석 및 메틸화 분석 데이터를 다시한번 확인하였으며, 혈청형 2의 코어 OS가 혈청형 5b에서 확인된 것과 동일하며, 추가 말단 α-배열 글루코스 잔기(Glc III)와 동일함을 확인하였다. NOE 데이터는 4.53 ppm에서의 Glc III 아노머 양자의 ¹H 공명에서부터 3.96 ppm에서의 Hep IV의 4-위치의 ¹H 공명(데이터 도시 안됨)에 이르는 내부 NOE 연결의 도움으로 Hep IV의 4-위치에서 Glc III 잔기의 결합 지점을 정의하였다. NOE 연결은 또한 Hep IV 6-위치에 대해 관찰되었으며, 앞서 4-치환 헵토스 잔기들에 대해 관찰된 바 있다. ¹ H-NMR data (Example 2, Table 2, (FIG. 12C)) once again confirmed mass spectral analysis and methylation analysis data, the core OS of serotype 2 is the same as that identified in serotype 5b, and further It was confirmed to be identical to the terminal α-array glucose residues (Glc III). NOE data of 4.53 ppm Glc III from the anomeric proton ¹ H resonance with the help of internal NOE connectivity up to ¹ H resonance (data not shown) of the 4-position of Hep IV at 3.96 ppm at the 4-position of Hep IV The point of attachment of the Glc III residues at was defined. NOE linkage was also observed for Hep IV 6-position, which was previously observed for 4-substituted heptose residues.

[A. 플루로뉴모니애 혈청형 1의 조사][Investigation of A. Pluronomymoniae serotype 1]

컬럼 분류한 LPS의 당 분석 결과, Rha, Glc, Gal, GlcNAc, DD-Hep 및 LD-Hep이 대략 1:3:1:0.5:1:3의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. Rha 및 GlcNAc를 확인함으로써 몇몇 O-항원 성분들이 이 분획에 여전히 존재하는 것으로 나타났다. O-항원이 없는 코어 OS 분획의 당 분석에서는 Glc, Gal, DD-Hep, 및 LD-Hep가 2:1.5:1:3의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 전장 O-항원을 함유한 초기 분획들의 당 분석에서는 Rha, Glc및 GlcNAc이 대략 2:1:1의 비율로 나타났으며, 이 혈청형의 O-항원에 대해 공개된 구조와 일치하였다. Sugar analysis of column sorted LPS revealed that Rha, Glc, Gal, GlcNAc, DD-Hep and LD-Hep were present in a ratio of approximately 1: 3: 1: 0.5: 1: 3. Identification of Rha and GlcNAc showed that some O-antigen components were still present in this fraction. Sugar analysis of the core OS fraction without O-antigen revealed that Glc, Gal, DD-Hep, and LD-Hep were present in a ratio of 2: 1.5: 1: 3. Sugar analysis of the initial fractions containing full length O-antigen showed Rha, Glc and GlcNAc in a ratio of approximately 2: 1: 1, consistent with the published structure for the O-antigen of this serotype.

LPS-OH를 제조하고 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분류하였다. 낮은 비율의 O-항원을 함유한 것으로 나타난 일정 부피로 용출된 분획을 음이온 모드에서 CE-ES-MS 로 분석하였다(실시예 2, 표 1). 2874 amu의 분자에 대응하는 간단한 질량 스펙트럼이 관찰되었으며, 질량이 123 amu 보다 높은 미량의 제2 분자가 4Hex, HexNAc, 4Hep, Kdo, P, 지질 A-OH 조성으로 이루어져 있으며, 추가 포스포에탄올아민 잔기라 존재하는 것으로 확인되었으며, 질량이 80 amu 보다 작은 제3의 분자가 존재하며 포스페이트 잔기는 없는 것으로 확인되었다. 3가 이온 m/z 957에 대한 CE-MS/MS 분석(데이터 도시 안됨)에서는 m/z 951에서 1가 피크가 관찰되었으며, 질량 2874 amu의 주요 분자에 대해 O-탈아실화 지질 A의 크기를 952 amu로 확인하였 고, m/z 959의 2가 이온은 코어 OS에 해당하였다. O-항원이 없는 몇몇 코어 OS 분획에 대한 CE-ES-MS 분석에서 질량 1667 Da이 나타났으며, 4Hex, HexNAc, 4Hep, Kdo의 조성을 확인하였다(실시예 2, 표 1). m/z 930에서 2가 이온에 대한 양이온 모드의 CE-MS/MS 분석은 HexNAc m/z 204, Hex-Hex-HexNAc m/z 528, Hep-Hex-Hex-HexNAc m/z 7201를 포함한 혈청형 1 코어 OS에서 하기 그룹의 잔기들이 존재하는 1가 이온을 나타내었다(도 16). 따라서, 질량 스펙트럼 분석에 의해 혈청형 1의 코어 OS가 혈청형 5a 및 b로부터 얻은 코어 OS에 비해 하나 작은 DD-Hep 잔기를 갖지만 추가 2 Hex 및 HexNAc 잔기를 가짐을 확인하였다. 그런, O-항원이 없는 코어 OS의 당분석에서 HexNAc에 대한 증거가 없는 것은 처음에는 혼란스러웠다. LPS-OH was prepared and sorted by gel filtration chromatography. Fractions eluted at a constant volume appearing to contain low proportions of O-antigen were analyzed by CE-ES-MS in anion mode (Example 2, Table 1). A simple mass spectrum corresponding to a molecule of 2874 amu was observed, the trace second molecule with a mass higher than 123 amu consisting of 4Hex, HexNAc, 4Hep, Kdo, P, lipid A-OH composition, and additional phosphoethanolamine The residue was identified as being present, with a third molecule having a mass of less than 80 amu and no phosphate residue. CE-MS / MS analysis of trivalent ions m / z 957 (data not shown) showed monovalent peaks at m / z 951, indicating the size of O-deacylated lipid A for the main molecule of mass 2874 amu. It was identified as 952 amu, divalent ions of m / z 959 corresponded to the core OS. CE-ES-MS analysis of several core OS fractions without O-antigen revealed mass 1667 Da and confirmed the composition of 4Hex, HexNAc, 4Hep, Kdo (Example 2, Table 1). CE-MS / MS analysis of the cation mode for divalent ions at m / z 930 was performed with serum containing HexNAc m / z 204, Hex-Hex-HexNAc m / z 528, Hep-Hex-Hex-HexNAc m / z 7201 In the Type 1 core OS, monovalent ions with the residues of the following groups are shown (FIG. 16). Thus, mass spectral analysis confirmed that the core OS of serotype 1 had one smaller DD-Hep residue but more 2 Hex and HexNAc residues than the core OS obtained from serotypes 5a and b. However, the lack of evidence for HexNAc in the glucose analysis of the core OS without O-antigen was confusing at first.

O-항원이 없는 코어 OS 분획에 대한 메틸화 분석에서, 말단 Glc, 6-치환 Glc, 3-치환 Gal, 말단 LD-Hep, 4,6-이치환 Gal, 4-치환 DD-Hep, 2-치환 LD-Hep 및 3,4,6-삼치환 LD-Hep이 대략 같은 몰의 양으로 존재하는 것으로 나타났다. HexNAc 잔기에 대한 어떠한 증거도 나타나지 않은 것이 다시 한번 당황스러웠다. In methylation analysis for core OS fractions without O-antigen, terminal Glc, 6-substituted Glc, 3-substituted Gal, terminal LD-Hep, 4,6-disubstituted Gal, 4-substituted DD-Hep, 2-substituted LD -Hep and 3,4,6-trisubstituted LD-Hep were found to be present in approximately equal molar amounts. It was once again embarrassing that no evidence for HexNAc residues appeared.

따라서, 질량 스펙트럼 분석, 당 및 메틸화 분석 데이터는 혈청형 2, 5a 및 5b에서 관찰되는 내부 코어 구조와 일치하였고, ¹H NMR 데이터는 이들 추론을 확인시켰다(도 12d)(실시예 2, 표 2). ¹H NMR 데이터로 인해 추가 코어 OS 잔기가 혈청형 2, 5a 및 5b로부터 얻은 코어 OS에 존재하지 않는 것을 확인할 수 있었다. α-배열 갈락토스 잔기(Gal II)를 TOCSY 실험에서 H-4 ¹H 공명에 대한 특징적인 스핀 시스템의 도움으로 5.18 ppm에서 확인하였다. β-배열 갈락토스 잔기(Gal I)는 아 노머 양자의 ¹H-공명을 참고하고 특징적인 스핀 시스템의 외형을 참고하여 4.55 ppm에서 확인하였다. α-배열 N-아세틸 헥소아민 잔기(HexNAc)는 4.34 ppm에서 H-2 양자의 ¹H 공명 도움으로 4.88 ppm에서 지정하였으며, 이는 ¹³C-¹H HSQC 실험에서 52.6 ppm의 ¹³C 화학 시프트와 관련이 있다(도 17a). ¹³C 화학 시프트는 질소 치환 탄소 원자와 일치한다. 그러나, H-2 양자 이상에서 HexNAc 잔기의 스핀 시스템을 입수하기가 매우 힘들며, H-2 양자의 화학 시프트는 상당히 낮은 필드에 존재할 것으로 보였다. 내부-잔기 NOE 연결로 4.55 ppm에서 Gal I 잔기의 아노머 양자와 3.94 ppm에서 HepIV의 4-위치 간의 연결패턴을 확인하였다. 유사한 방법으로 5.18 ppm에서의 Gal II의 아노머 양자와 3.79 ppm에서의 Gal I 잔기의 3-위치 간의 NOE 연결이 이 연결임을 확인하였다. 그러나, 4.88 ppm에서 HexNAc 잔기의 아노머 양자와 4.25 ppm에서 Gal II 잔기의 4-위치 및 4.12 및 4.01 ppm에서 이 잔기의 6-위치 간의 내부 잔기 NOE 연결은 HexNAc 잔기가 4- 및 6-위치에서 Gal II 잔기를 치환하고 있음을 시사하였으며, 이는 메틸화 분석 데이터와도 일치하였으며, 그럼에도 불구하고 혼란스러웠다(도 17c). 메틸화 OS에 대한 FAB-MS로 OS의 이 부분의 당 서열에 대해 보다 잘 알 수 있게 되었다. 관찰된 A-타입 1차 글리코실 옥소늄 이온들 및 2차 이온들(메탄올 유실)의 m/z는 다음과 같다, 464→432(Hex, HexNAc)⁺, 668→636(Hex₂, HexNAc)⁺, 916→884(Hex₂, HexNAc, Hep)⁺, 1120→1088(Hex₃, HexNAc, Hep)⁺, 1368(Hex₃, HexNAc, Hep₂)⁺, 1572→1540(Hex₄, HexNAc, Hep₂)⁺, 및 1865→1833(Hex₃, HexNAc, Hep₄)⁺. 이 FAB 데이터는 NOE 및 양이온 CE-ES-MS/MS 데이터와 일치하였으며, 말단 HexNAc 잔기에 대한 증거가 부족하여 혼란스러웠으나, 당 분석 및 메틸화 분석 데이터에는 일치하였다. 따라서, HexNAc 잔기에 대한 결정적인 데이터가 부족하여 보다 복잡한 NMR연구를 수행하여 예상된 HexNAc 잔기의 본질을 확인하고 혈청형 1로부터 얻은 코어 OS의 연결 패턴을 확인하고자 하였다. Thus, mass spectral analysis, sugar and methylation analysis data were consistent with the internal core structures observed in serotypes 2, 5a and 5b, and ¹ H NMR data confirmed these inferences (FIG. 12D) (Example 2, Table 2). ). ¹ H NMR data confirmed that no additional core OS residues were present in the core OS obtained from serotypes 2, 5a and 5b. α-array galactose residues (Gal II) were identified at 5.18 ppm with the help of a characteristic spin system for H-4 ¹ H resonances in TOCSY experiments. β-array galactose residues (Gal I) were identified at 4.55 ppm with reference to ¹ H-resonance of both anomers and the appearance of the characteristic spin system. α- arrangement N- acetyl-hexyl children min residue (HexNAc) is from 4.34 ppm was specified at 4.88 ppm in ¹ H 0 people help of H-2 protons, which ¹³ of 52.6 ppm in the C- ¹ H HSQC experiment ¹³ C chemical shifts and Related (FIG. 17A). ^{The 13} C chemical shift is consistent with nitrogen substituted carbon atoms. However, it is very difficult to obtain a spin system of HexNAc residues above both H-2 protons, and the chemical shift of both H-2 appears to be in a fairly low field. Intra-residual NOE linkage confirmed the linkage pattern between the anomer of the Gal I residue at 4.55 ppm and the 4-position of HepIV at 3.94 ppm. A similar method confirmed that the NOE linkage between the anomer of Gal II at 5.18 ppm and the 3-position of the Gal I residue at 3.79 ppm was this linkage. However, the internal residue NOE linkage between the anomer of both HexNAc residues at 4.88 ppm and the 4-position of the Gal II residues at 4.25 ppm and the 6-position of this residue at 4.12 and 4.01 ppm indicates that the HexNAc residues are at 4- and 6-positions. It was suggested that the Gal II residue was substituted, which was consistent with the methylation analysis data and was nevertheless confused (FIG. 17C). FAB-MS for methylated OS provides a better understanding of the sugar sequences in this part of the OS. The observed m / z of A-type primary glycosyl oxonium ions and secondary ions (methanol loss) are: 464 → 432 (Hex, HexNAc) ⁺ , 668 → 636 (Hex ₂ , HexNAc) ⁺ , 916 → 884 (Hex ₂ , HexNAc, Hep) ⁺ , 1120 → 1088 (Hex ₃ , HexNAc, Hep) ⁺ , 1368 (Hex ₃ , HexNAc, Hep ₂ ) ⁺ , 1572 → 1540 (Hex ₄ , HexNAc, Hep ₂ ) ⁺ , and 1865 → 1833 (Hex ₃ , HexNAc, Hep ₄ ) ⁺ . This FAB data was consistent with NOE and cationic CE-ES-MS / MS data and was confused with lack of evidence for terminal HexNAc residues, but was consistent with sugar and methylation assay data. Therefore, lack of critical data on HexNAc residues, more complex NMR studies were conducted to confirm the nature of the expected HexNAc residues and to identify the linkage pattern of core OS obtained from serotype 1.

혼합 시간 30-150 ms로 HexNAc 잔기의 H1-H 공명(4.88 ppm)로부터 얻은 일련의 1D 실험을 통해 H-2 ¹H-공명을 4.34 ppm에서 확인하고, 약한 신호들을 4.13 ppm에서는 H-3으로 3.36 ppm에서는 H-4로 지정하였다. 이들 추론을 확인하고, 이 HexNAc 잔기의 지정을 완료하기 위해 선택적인 추가 실험을 수행하였다. 3.36 ppm에서 H4-H-공명으로부터 A1-D TOCSY 실험을 수행하였으며, H-2 및 H-3 지정을 확인하고, 3.93, 3.66 및 3.64 ppm 각각에서 H-5 및 H-6, 6' 공명들을 확인하였다(도 17d). 4.34 ppm에서 H-2 ¹H-공명으로부터 1-D NOESY 실험을 수행하였으며, H-3 및 H-4 지정을 확인하였다(도 17e). 3.36 ppm에서의 H-4 ¹H-공명으로부터 1-D NOESY 실험을 수행하였으며, H-2, H-3, H-5 및 H-6, 6' 지정을 확인하였다(도 17f). 커플링 상수는 이들 실험에서 결정하였고, J _{1 ,2} 4.8 Hz, J _{2 ,3} 1.0 Hz, J _{3 ,4} 9.7 Hz, J _{4 ,5} 1.4 Hz, J_{5 ,6} 6.5 Hz, J _{5 ,6'} 6.5 Hz 및 J _{6 ,6'} -12 Hz인 것으로 밝혀졌다. 2D-¹³C-¹H-HSQC NMR 스펙트럼을 수행하였으며,(도 17e) HexNAc 분자의 C-1에서 C-6 위치에 대한 ¹³C 화학 시프트를 각각 101.1 ppm, 52.6 ppm, 68.5 ppm, 70.0 ppm, 70.7 ppm 및 64.1 ppm에서 확인하였다. 그러나, 이러한 데이터는 처음에는 혼란스러웠으며, 조직내 탄수화물 데이터 베이스를 조사하여 프로테우스 종으로부터 얻은 코어 OS에서 발견되는 개방쇄 N-아세틸 갈락토사민 잔기의 유사한 세트를 확인하였다. 놀랍게도 개방쇄 잔기를 확인한 결과, 이러한 잔기는 당 및 메틸화 분석에 사용되는 가수분해 조건에 민감하다는 것과 FAB 분석에서 말단 잔기에 대한 글리코실 옥소늄 이온의 형성은 이 잔기의 개방쇄 배열에 의해 제외된다는 것이 당, 메틸화 및 FAB 분석 데이터와 일치하였으다. A series of 1D experiments obtained from H1-H resonances (4.88 ppm) of HexNAc residues with a mixing time of 30-150 ms confirmed H-2 ¹ H-resonance at 4.34 ppm and weak signals to H-3 at 4.13 ppm. At 3.36 ppm it was designated H-4. These inferences were confirmed and optional further experiments were performed to complete the assignment of this HexNAc residue. A1-D TOCSY experiments were performed from H4-H-resonance at 3.36 ppm, confirming H-2 and H-3 designations, and H-5 and H-6, 6 'resonances at 3.93, 3.66 and 3.64 ppm respectively. It was confirmed (FIG. 17D). 1-D NOESY experiments were performed from H-2 ¹ H-resonance at 4.34 ppm, confirming H-3 and H-4 designations (FIG. 17E). 1-D NOESY experiments were performed from H-4 ¹ H-resonance at 3.36 ppm, confirming H-2, H-3, H-5 and H-6, 6 ′ designations (FIG. 17F). Coupling constants were determined in these experiments, J _{1 , 2} 4.8 Hz, J _{2 , 3} 1.0 Hz, J _{3 , 4} 9.7 Hz, J _{4 , 5} 1.4 Hz, J _{5 , 6} 6.5 Hz, J _{5 , 6 '} It was found to be 6.5 Hz and J _{6 ,} 6′-12 Hz. 2D- ¹³ C- ¹ H-HSQC NMR spectra were performed (FIG. 17E) and ¹³ C chemical shifts for C-6 to C-6 positions of HexNAc molecules were 101.1 ppm, 52.6 ppm, 68.5 ppm, 70.0 ppm, respectively. It was confirmed at 70.7 ppm and 64.1 ppm. However, these data were confusing at first, and the tissue carbohydrate database was examined to identify a similar set of open chain N-acetyl galactosamine residues found in the core OS obtained from Proteus species. Surprisingly, open chain residues have been identified, indicating that these residues are sensitive to the hydrolysis conditions used in sugar and methylation assays, and that the formation of glycosyl oxonium ions for terminal residues in FAB analysis is excluded by the open chain configuration of these residues. Is consistent with sugar, methylation and FAB analysis data.

따라서, 1, 2, 5a 및 5b 혈청형으로부터 얻은 코어 OS의 구조 분석을 마쳤으며, 도 18에 도시된 바와 같이 보존된 구조와 다른 구조를 갖는 모든 균주에서 보존된 내부 코어 구조를 확인하였다. Therefore, the structural analysis of core OS obtained from 1, 2, 5a and 5b serotypes was completed, and the internal core structure was conserved in all strains having a structure different from that of the conserved structure as shown in FIG. 18.

코어 타입 I, II, II 및 II를 대표하는 혈청형 1, 2, 5a 및 5b으로부터 얻은 코어 올리고당의 구조 분석에서 비교적 보존된 구조가 나타났다. 내부 코어 OS는 Kdo 잔기에 연결된 L-글리세로-D-만노-헵토스 잔기들의 3탄당으로 이루어진 각각의 균주와 동일하였다. 각 혈청형에서, 가장 가까운 헵토스 잔기(Hep I)는 L-글리세로-D-만노-헵토스 3탄당의 제2 L-글리세로-D-만노-헵토스 잔기(Hep II)에 의해 3-위치가 치환되고, β-글루코스 잔기(Glc I)에 의해 4 위치가 치환되고, α-글루코 스 잔기 (Glc II)에 의해 6 위치가 치환되어 있었다. D-글리세로-D-만노-헵토스 잔기(Hep IV)는 각 균주의 Glc I 잔기의 6-위치에서 발견되었다. 제 2 D-글리세로-D-만노-헵토스 잔기(Hep V)는 혈청형 2, 5a 및 5b의 6-위치에서 Hep IV를 치환하고 있었다. 혈청형 2 및 5a, 5b에 있어서 유일한 차이점은 추가 글루코스 잔기가 혈청형 2에서 Hep IV 잔기의 4-위치에 연결되어 있는 것이다. 이들 OS 구조들과 M. 헤몰리티카 혈청형 A1으로부터 얻어진 OS에 대해 앞서 발견된 구조 간에는 놀라운 유사성이 있었다. 5b, 5a OS 구조들과 M. 헤몰리티카 혈청형 A1 코어 OS 간의 유일한 차이는 M. 헤몰리티카 A1 OS에서 발견되는 Hep v의 추가 말단 갈락토스 잔기가 없다는 것이다. 혈청형 1에서는 Hep V 잔기는 없으며, Hep IV는 4-위치가 α-GaloNAc-(l-4,6)-α-Gal-(l-3)-β-Gal-의 3탄당에 의해 교대로 치환되어 있으며, 상기에서 HexNAc 잔기는 흔히 볼 수 없는 개방쇄 배열을 갖고 있었다. 혈청형 1의 Hep I로부터 초기 3탄당 연장으로 확인된 구조 배열은 헤모필루스 듀크레이 균주 2665 LPS에서 앞서 발견된 것과 동일하였으나, H. 듀크레이에서 발견되는 DD-Hep 삽입 락토-N-네오테트라오스 구조와 비교했을 때 Gal I 잔기 이상에서는 다른 연장부를 가졌다. Structural analysis of core oligosaccharides obtained from serotypes 1, 2, 5a and 5b representing core types I, II, II and II showed relatively conserved structures. The inner core OS was identical to each strain consisting of the trisaccharide of L-glycero-D-manno-heptose residues linked to the Kdo residue. In each serotype, the closest heptose residue (Hep I) is 3 by the second L-glycero-D-manno-heptose residue (Hep II) of L-glycero-D-manno-heptos pentose. -Position was substituted, 4 position was substituted by the β-glucose residue (Glc I), and 6 position was substituted by the α-glucose residue (Glc II). D-glycero-D-manno-heptose residue (Hep IV) was found at the 6-position of the Glc I residue of each strain. The second D-glycero-D-manno-heptose residue (Hep V) was substituted for Hep IV at the 6-position of serotypes 2, 5a and 5b. The only difference between serotypes 2 and 5a, 5b is that additional glucose residues are linked to the 4-position of the Hep IV residues in serotype 2. There was a surprising similarity between these OS structures and those previously found for the OS obtained from M. hemolytica serotype A1. The only difference between the 5b, 5a OS structures and the M. hemolytica serotype A1 core OS is that there are no additional terminal galactose residues of Hep v found in the M. hemolytica A1 OS. In serotype 1, there is no Hep V residue, and Hep IV is alternating in the 4-position by the trisaccharide of α-GaloNAc- (l-4,6) -α-Gal- (l-3) -β-Gal- HexNAc residues were substituted and had an open chain configuration which was not commonly seen. The structural arrangement identified by the initial trisaccharide extension from Hep I of serotype 1 is Haemophilus. In Duke ray, but the same as that previously found in the strain 2665 LPS, as compared with the DD-Hep inserted Lactobacillus -N- neo-tetrahydro agarose structures found in H. Duke ray I Gal residues had more than other parts extend.

따라서, Ap LPS에서 두개 코어 유형의 SDS-PAGE 관찰을 통해 구조적 설명이 가능해졌다. 코어 타입 II의 혈청형 2, 5a 및 5b는 LPS 구조들과 매우 유사하였으며 단지 혈청형 2에 추가 글루코스 잔기가 있는 것만이 달랐다. 그러나, 코어 타입 I의 혈청형 1은 DD-Hep 잔기가 없고 두개의 6탄당과 새로운 개방쇄 HexNAc 잔기를 가졌다. 이 새로운 개방쇄 HexNAc 잔기가 다른 코어 타입 I 혈청형에서 발견되 는지 조사하기 위해 혈청형 6, 9 및 11로부터 얻어진 LPS를 검사하였다. 개방쇄 HexNAc에 대한 증거 자료는 혈청형 9 및 11의 MS 및 NMR 연구(데이터 도시안됨)에서 얻었다(혈청형 6 제외). 코어 유형을 분류하기 위해 사용된 SDS-PAGE 프로필을 면밀히 검토한 결과 혈청형 6은 두개의 코어 타입의 LPS 이동 패턴을 모두 갖고 있으며 따라서, 본 출원인이 시험한 혈청형 6 균주는 단지 코어 타입 II 프로필만을 가질 수 있는 것으로 나타났다. Therefore, the structural explanation is made possible by SDS-PAGE observation of two core types in Ap LPS. Serotypes 2, 5a and 5b of core type II were very similar to LPS structures, except that there was an additional glucose residue in serotype 2. However, Serotype 1 of Core Type I had no DD-Hep residues and had two hexasaccharides and a new open chain HexNAc residue. LPS obtained from serotypes 6, 9 and 11 was examined to determine if this new open chain HexNAc residue was found in other core type I serotypes. Evidence for open chain HexNAc was obtained from MS and NMR studies (data not shown) of serotypes 9 and 11 (except serotype 6). A close examination of the SDS-PAGE profile used to classify core types shows that serotype 6 has LPS migration patterns of both core types, so that the serotype 6 strains tested by the applicant are only core type II profiles. It turns out that you can only have.

Ap에서 LPS 생합성의 유전자 대조군에 대한 데이터는 거의 없다. Galarneau 등에 의한 최근 논문에서는 트랜스포손 돌연변이 유도 후 3개의 유전자를 확인하였으며, 이들은 Ap 혈청형 1 LPS의 코어 OS 영역의 생합성에 관련되어 있는 것으로 나타났다. 이들 유전자는 다른 글리코실트랜스퍼라제에 대한 상동성에 근거하여 글리코실트랜스퍼라제로 시험적으로 확인되었다. 3개의 유전자들은 lbgB, α-l,6-DD-헵토실트랜스퍼라제, lbgA, β-l,4-갈락토실트랜스퍼라제 및 6탄당 또는 N-아세틸-헥소아민 트랜스퍼라제로 가정하였다. 앞의 두개 유전자들인 lbgAB은 혈청형 1 코어 OS에서 확인된 구조를 가졌으며, H. 듀크레이 LPS에서 발견되는 것과 동일한 위치 배열을 가졌다. Rioux 일동의 다른 논문에서는 UTP-α-D-글루코스-1-포스페이트 우리딜 트랜스퍼라제의 구조 유전자인 유전자 galU이 확인되었다. 혈청형 1 Ap galU 돌연변이 균주로부터 분리된 LPS의 SDS-PAGE는 코어-지질 A 영역이 번갈아 이동하는 패턴을 보였으며, 이 돌연변이 균주는 돼지 기관 세포들에 잘 접착하지 않았고 돼지에서는 독성이 덜하였는데, 이는 코어 OS 영역의 본성 또는 위치의 변화가 이 동물 병원균의 독성에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. There is little data on the genetic control of LPS biosynthesis at Ap . A recent paper by Galarneau et al. Identified three genes after transposon mutation induction, and found to be involved in the biosynthesis of the core OS region of Ap serotype 1 LPS. These genes have been experimentally identified as glycosyltransferases based on homology to other glycosyltransferases. Three genes were assumed to be lbgB , α- 1,6 -DD- heptosyltransferase , lbgA , β- 1,4 -galactosyltransferase and hexasaccharide or N-acetyl-hexamine transferase. LbgAB which are in front of the two genes had a structure found in serotypes 1, core OS, had the same arrangement position as that found in the H. Duke ray LPS. In another paper in Rioux, the gene galU, a structural gene of UTP-α-D-glucose-1-phosphate uridil transferase, was identified. SDS-PAGE of LPS isolated from serotype 1 Ap galU mutant strain showed alternating patterns of core-lipid A regions, which did not adhere well to pig organ cells and were less toxic in pigs. This suggests that changes in the nature or location of the core OS region may affect the toxicity of this animal pathogen.

새로운 개방쇄 HexNAc 잔기를 발견한 것이 흥미롭다. 이 구조는 오직 두개의 프로테우스 종에서 확인되었으며, 최근 스완넬라 오네이덴시스( Shewanella oneidensis)에서 확인되었는데, 특징은 알려져 있지 않다. 존재하는 문헌에서 알 수 있는 바와 같이, 확인된 개방쇄 잔기들은 현재 4- 및 6-위치에서 이웃 잔기를 2치환 하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서, 이것이 이들 잔기들의 공통적인 배열일 수 있다. It is interesting to find new open chain HexNAc residues. This structure has been identified in only two of the Proteus species was recently found in the Swan Nella ohneyi Den System (Shewanella oneidensis), characteristics are not known. As can be seen in the existing literature, the identified open chain residues have now been found to disubstitute neighboring residues at the 4- and 6-positions, thus this may be a common arrangement of these residues.

Hep I로부터의 올리고당 연장에서 DD-Hep 잔기를 확인하는 것은 M. 헤몰리티카, H. 듀크레이 및 유형을 결정할 수 없는 H. 인플루엔자를 포함한 몇몇 균주에 대해 전에 관찰된 바 있다. M. 헤몰리티카에서, 두개의 DD-Hep 잔기들이 관찰되었으며, H. 듀크레이 및 H. 인플루엔자에서는 오직 하나의 DD-Hep 잔기만이 관찰되었다. Ap에서는, 두가지 사항이 모두 존재하여, 혈청형 2 및 5a, 5b가 두개의 DD-Hep 잔기를 갖고 혈청형 1이 오직 DD-Hep 잔기를 Hep I로부터의 올리고당 연장부에 가졌다. 트리-LD-헵토실 내부 코어 그룹 또한 M. 헤몰리티카, H. 듀크레이 및 H. 인플루엔자에서 이미 관찰된 바 있다. App의 모든 균주에 대해 본원에서 발견된 3,4,6-삼치환 Hep I 잔기는 전에 M. 헤몰리티카 LPS에서 관찰된 바 있으나, H. 듀크레이 LPS는 H. 인플루엔자에서 발견된 바와 같이 오직 3,4-디-치환 Hep I 잔기만을 서술한다. Identifying DD-Hep residues in oligosaccharide extension from Hep I has been previously observed for several strains, including M. hemolytica , H. duray and H. influenza , whose type cannot be determined. In M. haemolytica , two DD-Hep residues were observed, and only one DD-Hep residue was observed in H. duray and H. influenza . In Ap , both were present, with serotypes 2 and 5a and 5b having two DD-Hep residues and serotype 1 having only DD-Hep residues in the oligosaccharide extension from Hep I. Tree -LD- heptyl group tosyl inner core also has already been observed in M. H. Molina urticae, H. Duke ray and H. influenza. The 3,4,6-trisubstituted Hep I residues found herein for all strains of App have been previously observed in M. hemolytica LPS, while H. duchy LPS is only found in H. influenza . Only 3,4-di-substituted Hep I residues are described.

Hep III잔기의 7-위치를 혈청형 5a에서 O-항원 갈락토스 잔기의 결합 지점으로 확인한 것이 흥미로우며, 이는 혈청형 1에서 3개의 다양하게 끝이 절단된 코어 올리고당 돌연변이들이 여전히 O-항원을 결정하고 있다는 관찰과 일치하는데, 이는 3개의 돌연변이 유전자 생성물의 예측된 기능이 내부 코어 LD-헵토실 3탄당 단위의 생합성을 저해하지 않으며, 따라서, O-항원 결합에 대한 수용체가 여전히 돌연변이 LPS 코어 올리고당에 존재하기 때문이다. It is interesting to identify the 7-position of the Hep III residue as the binding point of the O-antigen galactose residue in serotype 5a, which indicates that three variously truncated core oligosaccharide mutations in serotype 1 still determine the O-antigen. This is consistent with the observation that the predicted function of the three mutant gene products does not inhibit the biosynthesis of the internal core LD-heptosyl pentose units, so that the receptor for O-antigen binding is still present in the mutant LPS core oligosaccharides. Because it exists.

이 연구는 대표적인 2개의 코어 타입인 Ap의 몇몇 균주들의 코어 올리고당 영역 특징을 구조적으로 조사한 것이며, 보존된 내부 코어 구조 및 새로운 외부 코어 구성 성분을 확인하였다. 이 영역은 Ap의 접착에 관련된 것으로 알려져 있으며, 따라서 독성을 갖는다. 이 연구는 따라서, 이후 Ap LPS의 코어 올리고당 영역의 관련성에 대한 연구가 이 생물의 잠재된 독성까지 이르게 할 것이다. This study structurally examined the core oligosaccharide region characteristics of several strains of Ap , two representative core types, and identified conserved inner core structures and new outer core components. This region is known to be involved in the adhesion of Ap and is therefore toxic. This study will therefore lead to further studies of the relevance of the core oligosaccharide region of Ap LPS to the potential toxicity of this organism.

재료 및 방법 - Materials and Methods- 실시예Example 2 2

배지 및 생장 조건Medium and growth conditions

Ap 혈청형 1(균주 4074), 2(균주 4226), 5a(균주 K17) 및 5b(균주 L20) 를 먼저 초콜릿 한천 평판(37 ℃)에서 밤새 생장시키고, 생장물은 β NAD(Sigma N-7004)(최종 농도 5 ug/㎖), 헤민(haemin)(Sigma H-2250)(최종 농도 5 ug/㎖) 및 1% 글루코스(10 g)이 보충된 뇌-심장 침출(brain-heart infusion, BHI) 배지 1 L를 접종하는데 사용하였다. 이어서, 배양물을 37 ℃, 200 rpm에서 6 시간 동안 인큐베이션시키고, 28 L NBS 발효기 내 BHI 액체 배지(상기한 바와 같이 보충됨) 24 L를 접종하는데 사용하였다. 다음으로, 배양물을 37 ℃ 및 24 l/분 탄산가스 포화도에서 생장시키고, 200 rpm으로 18 시간 동안 교반하였다. 세포를 죽이고(2% 페놀 중량/부피, 4시간), Sharples 연속 흐름 원심분리(약 40 g)에 의해 세포를 수거하였다. Ap serotypes 1 (strain 4074), 2 (strain 4226), 5a (strain K17) and 5b (strain L20) were first grown overnight on chocolate agar plates (37 ° C), and the growth was β NAD (Sigma N-7004). ) (Final concentration 5 ug / ml), hemin (Sigma H-2250) (final concentration 5 ug / ml) and 1% glucose (10 g) supplemented with brain-heart infusion (BHI) ) Was used to inoculate 1 L of medium. The culture was then incubated at 37 ° C., 200 rpm for 6 hours and used to inoculate 24 L of BHI liquid medium (supplemented as described above) in a 28 L NBS fermentor. Next, the cultures were grown at 37 ° C. and 24 l / min carbon dioxide saturation and stirred at 200 rpm for 18 hours. Cells were killed (2% phenol weight / volume, 4 hours) and cells were harvested by Sharples continuous flow centrifugation (about 40 g).

지질다당류의 단리 및 정제Isolation and Purification of Lipopolysaccharide

고온 물/페놀 방법에 의해 지질다당류(LPS)를 건조된 세포 덩어리로부터 분리한후, 건조된 세포 덩어리를 혈청형 5a 및 5b 용 유기 용매들로 세척하였다. 수성상을 물에 대해 투석하고 동결건조시켰으며, 혈청형 2의 경우에는 LPS를 과도한 투석 페놀상으로부터 분리하였다. 건조된 샘플을 물에 용해하여 1-2% 용액(중량/부피)을 얻고, 데옥시리보누클레아제 I(DNase)(0.01 ㎎/㎖) 및 리보누클레아제(RNase)(0.01 ㎎/㎖)로 37 ℃에서 3 시간 동안 처리한 후, 단백질가수분해 효소 K(0.01 ㎎/㎖)로 3 시간 동안 처리하였다. 투석하고 건조된 샘플을 물에 용해하여 1 % 용액을 만들고 고속 원심분리하였다(5hrs, 100,000 g). LPS 펠릿을 물에 재용해하고 동결건조시키고 Bio-Gel P-2(1 cm X 100 cm) 상에서 용리액으로 물을 사용하여 겔여과에 의해 정제하고 당을 함유한 분획을 모아 동결건조켰다. 정제된 LPS를 37 ℃에서 1 시간 동안 교반하며 무수 히드라진으로 처리하여 O-탈아실화 LPS(LPS-OH)를 제조하였다. 빙욕을 이용하여 반응을 냉각시키고, 서서히 차가운 아세톤(-70 ℃, 5 vols.)을 첨가하여 과량의 히드라진을 파괴하고, 침전된 LPS-OH을 원심분리의해 분리하였다. 샘플을 상기 서술한 바와 같이 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 정제하였다. 정제된 LPS(100 ㎎)를 1 % 아세트산(lO ㎎/㎖, 100℃, 1.5 시간)으로 처리하여 코어 올리고당(OS) 분리하고 원심분리(5000 g)에 의해 불용성 지질 A를 제거하였다. 동결건조시킨 OS를 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 추가로 정제하고, 개개의 분획을 동결건조시켰다.After lipopolysaccharide (LPS) was separated from the dried cell mass by hot water / phenol method, the dried cell mass was washed with organic solvents for serotypes 5a and 5b. The aqueous phase was dialyzed against water and lyophilized, and for serotype 2, LPS was separated from the excess dialysis phenol phase. The dried sample was dissolved in water to obtain a 1-2% solution (weight / volume), deoxyribonuclease I (DNase) (0.01 mg / ml) and ribonuclease (RNase) (0.01 mg / ml) ) Was treated at 37 ° C. for 3 hours, followed by proteolytic enzyme K (0.01 mg / ml) for 3 hours. The dialyzed and dried sample was dissolved in water to make a 1% solution and centrifuged at high speed (5hrs, 100,000 g). LPS pellets were redissolved in water, lyophilized and purified by gel filtration using water as eluent on Bio-Gel P-2 (1 cm X 100 cm) and the fractions containing sugar were collected and lyophilized. Purified LPS was stirred at 37 ° C. for 1 hour and treated with anhydrous hydrazine to prepare O-deacylated LPS (LPS-OH). The reaction was cooled using an ice bath, slowly cooled acetone (-70 ° C., 5 vols.) Was added to destroy excess hydrazine, and the precipitated LPS-OH was separated by centrifugation. Samples were purified on Bio-Gel P-2 columns as described above. Purified LPS (100 mg) was treated with 1% acetic acid (100 mg / ml, 100 ° C., 1.5 h) to separate core oligosaccharides (OS) and centrifuged (5000 g) to remove insoluble lipid A. Lyophilized OS was further purified on Bio-Gel P-2 columns and individual fractions were lyophilized.

분석 방법Analytical Method

당을 GLC-MS에 의해 알디톨 아세테이트 유도체로 결정하였다. 샘플들을 4 M 트리플루오로 아세트산을 사용하여 100℃ 에서 4 시간 동안 가수분해한 후, H₂O에서 밤새 환원시키고(NaBD₄), 촉매로 잔류 아세트산 나트륨을 이용하여 100 ℃에서 2 시간 동안 무수 아세트산으로 아세틸화하였다. GLC-MS에는 30 M DB-17 모세관 컬럼(180 ℃ - 260 ℃, 3.5 ℃/분)이 장착되어 있었으며, MS는 Varian Saturn II 질량 분광기의 전자 충격 모드에서 수행하였다. NaOH / DMSO /요오드화 메틸 방법으로 메틸화 분석을 수행하고, 상기와 같이 GLC-MS에 의해 분석하였다. Sugars were determined by GLC-MS as alditol acetate derivatives. Samples were hydrolyzed at 100 ° C. for 4 hours with 4 M trifluoro acetic acid, then reduced overnight in H ₂ O (NaBD ₄ ) and acetic anhydride at 100 ° C. for 2 hours with residual sodium acetate as catalyst. Acetylated. GLC-MS was equipped with a 30 M DB-17 capillary column (180 ° C.-260 ° C., 3.5 ° C./min) and MS was performed in the electron impact mode of a Varian Saturn II mass spectrometer. Methylation analysis was performed by NaOH / DMSO / methyl iodide method and analyzed by GLC-MS as above.

질량 스펙트럼 분석Mass spectral analysis

0.5% 아세트산을 함유한 25% 수성 아세토니트릴 중에 샘플을 직접 주입하여 VG Quattro 질량 분광기(Micromass, Manchester, U.K.)의 음이온 모드에서 ESI-MS를 수행하였다. 미세분사 계면을 통해 API 3000 질량 분광기(Perkin-Elmer/Sciex)결합시킨 크리스탈 모델 310(CE) 장치(AYI Unicam) 상에서 모세관 전기영동(CE)-ESI-MS을 수행하였다. 외장 용액(이소프로판올-메탄올, 2:1)을 유속 1 ㎕/분으로 낮은 정체 부피 탑관(250 ㎛ i.d., Chromatographic Specialties)에 옮겼다. 모든 수성 용액을 사용하기 전 0.45-㎛ 필터(Millipore) 를 통해 여과하였다. 전자 분사 스테인레스 니들(27 gauge)을 낮은 정체부피 탑관에 대해 돌출시켜 외장 용액애 모세관 컬럼 말단으로 이동할 수 있게 하였다. 5% 메탄올을 함유한 탈이온수(pH 9.0) 중의 10 mM 암모늄 아세테이트/수산화 암모늄을 사용하여 약 90 cm 길이의 속이 빈 융합 실리카 모세관에서 분리하였다. 주입에는 관례적으로 20 kV 전압이 인 가되었다. 모세관의 출구는 레이저 풀러(Sutter Instruments)를 사용하여 대략 15 ㎛ i.d로 테이핑하였다. 전체 질량 스캔 모드에서 1 m/z 단위 단계 당 3.0 ms의 체류 시간으로 질량 스펙트럼을 얻었다. MS/MS 데이터는 1 m/z 단위 단계 당 1.0 ms의 체류 시간으로 얻었다. RF-유일 사중극자 충돌 세포에서 질소와 선택된 전구체 이온의 충돌 활성화에 의해 형성된 파편 이온들을 제3의 사중극자를 스캐닝하여 질량 분석하였다. ESI-MS was performed in anion mode of a VG Quattro mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) by directly injecting the sample in 25% aqueous acetonitrile containing 0.5% acetic acid. Capillary electrophoresis (CE) -ESI-MS was performed on a Crystal Model 310 (CE) device (AYI Unicam) coupled with an API 3000 mass spectrometer (Perkin-Elmer / Sciex) via a microspray interface. The external solution (isopropanol-methanol, 2: 1) was transferred to a low static volume column (250 μm id, Chromatographic Specialties) at a flow rate of 1 μl / min. All aqueous solutions were filtered through a 0.45-μm filter (Millipore) before use. Electron sprayed stainless needles (27 gauge) were projected against the low stagnation volume column to allow movement to the capillary column ends in the sheath solution. 10 mM ammonium acetate / ammonium hydroxide in deionized water (pH 9.0) containing 5% methanol was used to separate in a hollow fused silica capillary tube about 90 cm long. 20 kV voltage was customarily applied to the injection. The outlet of the capillary was taped to approximately 15 μm id using a laser puller (Sutter Instruments). Mass spectra were obtained with a dwell time of 3.0 ms per 1 m / z unit step in full mass scan mode. MS / MS data was obtained with a dwell time of 1.0 ms per 1 m / z unit step. Fragment ions formed by collision activation of nitrogen and selected precursor ions in RF-only quadrupole impingement cells were subjected to mass spectrometry by scanning a third quadrupole.

핵자기 공명Nuclear magnetic resonance

5 mm 또는 3 mm 트리플 공명(¹H, ¹³C, ³¹P) 탐침을 사용하여 Varian Inova 400, 500 및 600 MHz 분광기들 상에서 NMR 실험을 수행하였다. 동결건조시킨 당 샘플을 99% D₂O 600 ㎕(5mm) 또는 140 ㎕(3mm)에 용해시켰다. 실험은 25 ℃에서 수행하였으며, HOD(중수소 H₂O) 신호 억제는 4.78 ppm이었다. 아세톤의 메틸 공명을 내부 참조표로 사용하였으며 ¹H 스펙트럼의 경우는 2.225 ppm을 ¹³C 스펙트럼의 경우에는 31.07 ppm이었다. Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³C-¹H HSQC, ¹³C-¹H HSQC-TOCSY 및 ¹³C-¹H HMBC로부터 얻은 표준 동종핵 및 이종핵 관련 2D 펄스를 일반적인 지정에 사용하였다. Z-필터를 이용한 선택적 1D-TOCSY 실험 및 1D-NOESY 실험, 및 3-D NOESY-TOCSY 및 TOCSY-NOESY 실험의 1-D 유사 실험을 수행하여 완전한 잔기 지명을 수행하고 ¹H-¹H 핵 오버하우저 상승 효과(nuclear Overhauser enhancements) 를 결정하였다. 선택 펄스의 펄스 폭은 30-80 Hz이었다. 1D-TOCSY 실험에는 30-150 ms의 혼합 시간이 이용되었다. 1D-NOESY 실험에는 400-800 ms의 혼합 시간이 이용되었다. NMR experiments were performed on Varian Inova 400, 500 and 600 MHz spectroscopy using 5 mm or 3 mm triple resonance ( ¹ H, ¹³ C, ³¹ P) probes. Lyophilized sugar samples were dissolved in 600 μl (5 mm) or 140 μl (3 mm) of 99% D ₂ O. The experiment was performed at 25 ° C., and HOD (deuterium H ₂ O) signal inhibition was 4.78 ppm. The methyl resonance of acetone was used as internal reference table and 2.225 ppm for the ¹ H spectrum and 31.07 ppm for the ¹³ C spectrum. Standard homonuclear and heteronuclear related 2D pulses from Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³ C- ¹ H HSQC, ¹³ C- ¹ H HSQC-TOCSY and ¹³ C- ¹ H HMBC were used for general designation. Selective 1D-TOCSY experiments and 1D-NOESY experiments with Z-filters, and 1-D similar experiments of 3-D NOESY-TOCSY and TOCSY-NOESY experiments were performed to perform complete residue nomination and ¹ H- ¹ H nuclear over Nuclear Overhauser enhancements were determined. The pulse width of the selection pulses was 30-80 Hz. A mixing time of 30-150 ms was used for the 1D-TOCSY experiment. A mixing time of 400-800 ms was used for the 1D-NOESY experiment.

실시예 3. 이 실시예는 문헌 [Glycobiology. 15_: 323(2005)]을 토대로 구성되었다. P. 멀토시다 균주 Pm70의 조사. Example 3. This example is described in Glycobiology. 15_ : 323 (2005)]. Investigation of P. multocida strain Pm70.

정제된 LPS의 당분석에서 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal) 및 L-글리세로-O-만노-헵토스(LD-Hep)가 대략 4:2:3의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 소량의 N-아세틸-글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)이 또한 확인되었으며, 최근에 연구된 다른 수의학적 병원균과 달리, O-글리세로-O-만노-헵토스(DD-Hep)는 확인되지 않았다(Brisson 등, 2002; St. Michael 등, 2004). 코어 올리고당(OS) 유도 부틸-글리코사이드의 GLC 분석에서 Glc, Gal 및 GalNAc 잔기들이 D-이성질체로 존재하는 것으로 밝혀졌다. Glucose (Glc), galactose (Gal) and L-glycero-O-manno-heptose (LD-Hep) were present in approximately 4: 2: 3 ratio in the sugar analysis of purified LPS. Small amounts of N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) and N-acetyl-galactosamine (GalNAc) have also been identified and, unlike other veterinary pathogens studied recently, O-glycero-O-manno-heptose (DD -Hep) has not been identified (Brisson et al., 2002; St. Michael et al., 2004). GLC analysis of core oligosaccharide (OS) derived butyl-glycosides revealed that the Glc, Gal and GalNAc residues exist as D-isomers.

O-탈아실화 LPS(LPS-OH)를 제조하고 겔 여과 크로마토그래피에 의해 분류하고, CE-MS에 의해 분석하였다(실시예 3, 표 1). 3525 amu의 분자에 대응하고 HexNAc2, Hep4, Hex6, PEtn, Kdo, P, 지질 A-OH의 조성을 갖는 m/z 1173.8의 주요 3가 이온들과 m/z 1132.93- 및 1215.23-로 나타난 주요 종들에서 PEtn 잔기가 있거나 없는 소량의 이온이 간단한 질량 스펙트럼에서 관찰되었다. 3가 이온 m/z 1173.8에 에 대한 CE-MS/MS 분석(데이터 도시 안됨)에서는 m/z 951에서 1가 피크 및 m/z 1236.5에서 2가 이온이 관찰되었으며, O-탈아실화 지질 A의 크기는 질량 2874 amu 및 코어 OS의 크기는 2475 amu 로 확인하였다. O-탈아실화 지질 A 기본 종(952 amu)은 N-아실화(3-OH C 14:0) 글루코사민 잔기들의 이탄당들로 이루어지며, 이때 각각의 잔기는 포스페이트 분자로 치환되어 있다. 흥미로운 것은, Kdo 분자가 획득이 수반되는 6탄당 및 포스페이트 분자들의 유실에 대응하는 소량의 단백당형들은 m/z 1125.7^3- 및 1166.7^3-로 나타나는 것인데, 이는 Kdo-P 또는 Kdo-Kdo 배열로 분자의 Kdo 영역에 두개 서로 다른 배열이 존재함을 시사한다(실시예 3, 표 1). 1개 및 두개의 Kdo 잔기함유 단백당형의 유사한 단백질이 KOH 처리 LPS의 CE-MS 스펙트럼에서 관찰되었다(실시예 3, 표 1). 분류된 코어 OS 샘플의 ES-MS 및 CE-MS 분석에서는, 분류된 코어 OS 샘플의 질량이 2492 Da로 밝혀졌으며, HexNAc2, Hep4, Hex6, PEtn, Kdo의 조성이 확인되었다(실시예 3, 표 1)(도 19). OS 분자 내 몇몇 관능기의 위치에 대한 정보를 얻기 위해 양이온 모드로 CE-MS/MS 분석을 수행하였다. m/z 1246.5²⁺의 2가 이온의 MS/MS 분석에서 몇몇 생성물 이온들이 나타났다(도 20). 203.5⁺의 HexNAc 잔기 및 407.5⁺의 HexNAc 잔기 두개에 대응하는 1가 이온들이 우세하였다. 다른 생성물 이온들을 또한 확인하였으며, 도 20에 나타난 조성물에 해당한다. m/z 316의 이온(Hep-PEtn 기에 대응)을 전구체 이온 스캐닝 한 후 m/z 817.5²⁺(Hex3, Hep4, Kdo, PEtn), 898.5²⁺(Hex4, Hep4, Kdo, PEtn), 979.5²⁺(Hex5, Hep4, Kdo, PEtn), 1059.5²⁺(Hex6, Hep4, Kdo, PEtn) 및 1263.5²⁺(HexNAc2, Hex6, Hep4, Kdo, PEtn)의 수화 2가 이온들을 확인함으로써 내부 코어의 헵토스 잔기(Hep)에 대한 코어 OS의 PEtn 부분의 위치를 결정하였다(도 21). m/z 407의 이온에 대한 전구체 이온 스캐닝에서(HexNAc-HexNAc기에 대응) 893⁺의 1가 이온이 발견되었으며, 이는 Hex3, HexNAc2(데이터 도시안됨)의 조성을 가졌다. 따라서, 이들 두개의 전구체 이온 실험에서 Hex3, Hep4, Kdo, PEtn의 내부 코어 조성과 3Hex 및 2HexNAc 잔기들의 외부 코어 연장이 제안되었다. O-deacylated LPS (LPS-OH) was prepared and sorted by gel filtration chromatography and analyzed by CE-MS (Example 3, Table 1). Corresponding to 3525 amu molecules and the main species shown in HexNAc2, Hep4, Hex6, PEtn, Kdo, P, the main trivalent ion of m / z 1173.8 having a composition of lipid A-OH with m / z 1132.93- and 1215.23- Small amounts of ions with or without PEtn residues were observed in simple mass spectra. CE-MS / MS analysis of trivalent ions m / z 1173.8 (data not shown) showed monovalent peaks at m / z 951 and divalent ions at m / z 1236.5, indicating that O-deacylated lipid A The size was confirmed by the mass 2874 amu and the size of the core OS was 2475 amu. The O-deacylated lipid A base species (952 amu) consists of peat sugars of N-acylated (3-OH C 14: 0) glucosamine residues, with each residue substituted with a phosphate molecule. Interestingly, small amounts of protein glycoforms corresponding to the loss of the hexasaccharide and phosphate molecules involved in the acquisition of the Kdo molecule are represented by m / z 1125.7 ^3- and 1166.7 ^3- , which are molecules in the Kdo-P or Kdo-Kdo array. It is suggested that two different arrangements exist in the Kdo region of (Example 3, Table 1). Similar proteins of one and two Kdo residue-containing protein glycotypes were observed in the CE-MS spectra of KOH treated LPS (Example 3, Table 1). In ES-MS and CE-MS analysis of the sorted core OS samples, the mass of the sorted core OS samples was found to be 2492 Da, and the composition of HexNAc2, Hep4, Hex6, PEtn, Kdo was confirmed (Example 3, Table). 1) (FIG. 19). CE-MS / MS analysis was performed in cationic mode to obtain information on the location of some functional groups in the OS molecule. MS / MS analysis of divalent ions of m / z 1246.5 ²⁺ showed some product ions (FIG. 20). Are monovalent ions were predominantly corresponding to the HexNAc moiety couple of 203.5 ⁺ 407.5 ⁺ and HexNAc residues. Other product ions were also identified, corresponding to the composition shown in FIG. 20. m / z 316 ion (corresponding groups Hep-PEtn) of the precursor ion scanning and then ^{m / z 817.5 2+ (Hex3,} Hep4, Kdo, PEtn), 898.5 2+ (Hex4, Hep4, Kdo, PEtn), 979.5 2 Hep of the inner core by identifying the hydration divalent ions of ⁺ (Hex5, Hep4, Kdo, PEtn), 1059.5 ²⁺ (Hex6, Hep4, Kdo, PEtn) and 1263.5 ²⁺ (HexNAc2, Hex6, Hep4, Kdo, PEtn) The location of the PEtn portion of the core OS relative to the toss residue (Hep) was determined (FIG. 21). In precursor ion scanning for ions of m / z 407 (corresponding to HexNAc-HexNAc groups), 893 ⁺ monovalent ions were found, having compositions of Hex3, HexNAc2 (data not shown). Therefore, in these two precursor ion experiments, the inner core composition of Hex3, Hep4, Kdo, PEtn and the outer core extension of 3Hex and 2HexNAc residues were proposed.

분자의 연결 패턴을 결정하기 위해 코어 OS에 대해 메틸화 분석을 수행하였으며, 말단 Glc, 6-치환 Glc, 4-치환 Glc, 4-치환 Gal, 3-치환 Gal, 말단 LD-Hep 및 4,6-2치환 LD-Hep이 대략 2:1:1:1:1:1:1의 몰비로 존재하고, 그 보다 적은 양으 로 말단 Gal, 2-치환 LD-Hep, 3,4-2치환 LD-Hep 및 3,4,6-3치환 LD-Hep이 존재하는 것으로 관찰되었다. 또한, 악티노바실루스 플루로뉴모니애 ( Ap) 혈청형 2로부터 얻은 과메틸화 알디톨 아세테이트에 대한 비교에서, 4,6 디-치환 LD-Hep 잔기에 대한 보류 시간을 4,6 디-치환 DD-Hep 잔기로부터 결정하였으며, Pm의 LPS 내에 DD-Hep가 부재함을 확인하였다. Methylation analysis was performed on the core OS to determine the linking pattern of the molecules, with terminal Glc, 6-substituted Glc, 4-substituted Glc, 4-substituted Gal, 3-substituted Gal, terminal LD-Hep and 4,6- The bisubstituted LD-Hep is present in a molar ratio of approximately 2: 1: 1: 1: 1: 1: 1 and in smaller amounts the terminal Gal, 2-substituted LD-Hep, 3,4-2 substituted LD-Hep And 3,4,6-3 substituted LD-Hep were observed. Also, Actinobacillus In comparison to the hypermethylated alditol acetate obtained from Pluronomymoniae ( Ap ) serotype 2, the retention time for 4,6 di-substituted LD-Hep residues was determined from the 4,6 di-substituted DD-Hep residues. And It was confirmed that DD-Hep was absent in the LPS of Pm .

OS의 정확한 위치와 연결 패턴들을 설명하기 위해, OS 분획에 대해 NMR 조사를 수행하였으며, 가장 결정적이고 등질의 스펙트럼 및 완전히 탈아실화(KOH 처리) 물질을 얻었다(도 22). 만헤이미아 헤몰리티카(Mh) mdAp로부터 얻은 구조적으로 관련있는 코어 OS에 참고하여 OS 및 KOH 처리 LPS의 ¹H 공명을 COSY 및 TOCSY(도 5a) 실험에 의해 지정하였다(Brisson, 일동, 2002; St. Michael 일동, 2004)(실시예 3, 표 2). In order to explain the exact location and linking patterns of the OS, an NMR survey was performed on the OS fraction, yielding the most critical and homogeneous spectral and fully deacylated (KOH treated) material (FIG. 22). Manhemia H. Molina urticae (Mh) See the relevant core OS that is structurally derived from mdAp by the ¹ H resonance of the OS and KOH treated LPS designated by COSY and TOCSY (FIG. 5a) experiment (Brisson, Nitto, 2002; St. Michael All, 2004) (Example 3, Table 2).

Pm70 OS 및 KOH 처리 LPS의 ¹H-NMR 스펙트럼에서, 헵토스 잔기들(Hep I(E), Hep II(F), Hep III(G) 및 Hep IV(J))로부터 발생한 스핀 시스템은 만노-피라노실 고리 시스템을 나타내는 스핀 시스템의 외형과 결합된 5.10_{OS (}OS 샘플) / 5.19_KOH(KOH 처리 샘플)(Hep I, E), 5.87_OS / 5.74_KOH(Hep II, F), 5.23_{OS & KOH}(Hep III, G) 및 5.12_OS&KOH(Hep IV, J) ppm에서의 아노머 ¹H 공명으로부터 쉽게 확인되었다. 산 가수 분해 후 이웃한 Kdo 분자의 다양한 재배열 생성물이 존재함에 따라 OS 샘플 내 Hep I의 아노머 양자에 대해 이종성이 관찰되었다(OS 샘플 내 주요 Hep I 신호로부터의 지정이 설명되어 있다). Hl 및 H2 공명들 간의 내부-잔기 NOE 발생으로부터 헵토실 잔기들에 대해 α-배열들이 분명했다. 5.22_{OS & KOH} ppm(Glc II, H) 및 5.09_OS / 5.53_KOH ppm(GalNAc II / GalN II, P)에서 α-아노머 영역 내 나머지 두개의 잔기는 스핀 시스템의 외형에 따라 각각 글루코- 및 갈락토-피라노스 당으로 결정하였다. 5.09_OS / 5.53_KOH ppm에서 갈락토-배열 잔기는 ¹³C-¹H HSQC 실험에서 50.4_OS / 51.5_KOH ppm의 ¹³C 화학 시프트와 관련된 4.24_OS / 3.65_KOH ppm에서 H-2 양자의 ¹H 공명의 도움으로 아미노 당으로 결정하였다. ¹³C 화학 시프트는 질소 치환 탄소원자와 일치한다. 4.95_OS / 4.99_KOH ppm(Gal II, N)에서 α-아노머 영역의 나머지 잔기는 TOCSY 실험에서 H-4 공명에 대한 특징적인 스핀 시스템의 외형에 의해 갈락토-피라노실 당으로 결정하였다(도 23). 스펙트럼의 로우 필드 영역(4.45 - 6.00 ppm)에서 나머지 아노머 공명들은 모두 아노머 ¹H 공명들의 화학 시프트로 인해 βlinked 잔기들로부터 기인한 것이며, 분해된 잔기들의 경우는 높은 J _{1 ,2} (∼ 8 Hz) 커플링 상수 때문이다. 4.65_{OS & KOH} ppm(Glc I, I), 4.70_{OS & KOH} ppm(Glc III, K) 및 4.69_{OS & KOH} ppm(Glc IV, L)에서의 공명들을 스핀 시스템 외형에 의해 글루코 배열로 지정하였다. 4.53_{OS & KOH} ppm(Gal I, M) 및 4.73_OS / 5.01_KOH ppm(GalNAc I / GalN I, O)에서 로우 필드 영역의 나머지 공명들은 TOCSY 실험에서 H-4 공명에 대한 특징적인 스핀 시스템의 외형에 의해 갈락토-피라노실 잔기로 지정하였다. ¹³C-¹H HSQC 실험에서 51.9_OS / 53.1_KOH ppm의 ¹³C 화학 시프트와 관련된 4.12 / 3.53 ppm에서의 H-2 양자의 ¹H 공명의 도움으로 4.73_OS / 5.01_KOH ppm의 갈락토-배열 잔기가 아미노당인 것으로 결정되었다. ¹³C 화학 시프트는 질소 치환 탄소원자와 일치한다. PEtn 부분의 CH₂ 양자들에 대한 신호가 OS 샘플에서는 3.27 및 4.16 ppm에서 관찰되었으며, 이는 ¹³C-¹H HSQC 실험에서 40.1 및 62.2 ppm의 특징적인 ¹³C 화학 시프트와 관련이 있다. 그밖의 아미노 당의 아세틸기에 대한 특징적인 신호가 OS 샘플에서는 2.06 및 2.04 ppm에서 관찰되었으며, 이는 ¹³C-¹H HSQC 실험에서 22.4 및 22.1 ppm의 특징적인 ¹³C 화학 시프트와 관련이 있다. In the ¹ H-NMR spectrum of the Pm70 OS and KOH treated LPS, the spin system generated from heptose residues (Hep I (E), Hep II (F), Hep III (G) and Hep IV (J)) was manno- 5.10 _{OS (} OS sample) / 5.19 _KOH (KOH treated sample) (Hep I, E), 5.87 _OS / 5.74 _KOH (Hep II, F), 5.23 _{OS & KOH} combined with the appearance of the spin system representing the pyranosyl ring system Easily identified from anomer ¹ H resonance at (Hep III, G) and 5.12 _{OS & KOH} (Hep IV, J) ppm. Heterogeneity was observed for both Hep I anomers in the OS sample as the presence of various rearrangement products of neighboring Kdo molecules after acid hydrolysis (designation from the main Hep I signal in the OS sample is described). Α-arrays were evident for heptosyl residues from the internal-residual NOE generation between H1 and H2 resonances. At 5.22 _{OS & KOH} ppm (Glc II, H) and 5.09 _OS / 5.53 _KOH ppm (GalNAc II / GalN II, P), the remaining two residues in the α-anomer region were gluco- and gal, respectively, depending on the appearance of the spin system. Determined by lacto-pyranose sugar. 5.09 going from _OS / 5.53 _KOH ppm galacto-array residues ¹³ C- ¹ H HSQC experiments on _OS 50.4 / 51.5 ppm _KOH in ¹³ related to a chemical shift of 4.24 C _OS / _KOH 3.65 ppm in ¹ H resonances of both H-2 Determined as amino sugar with help. ^{The 13} C chemical shift is consistent with the nitrogen substituted carbon atom. The remaining residues of the α-anomeric region at 4.95 _OS / 4.99 _KOH ppm (Gal II, N) were determined to be galacto-pyranosyl sugar by the appearance of the characteristic spin system for H-4 resonance in the TOCSY experiment (FIG. 23). The remaining anomer resonances in the low field region of the spectrum (4.45-6.00 ppm) are all due to βlinked residues due to chemical shifts of the anomeric ¹ H resonances, and high J _{1 , 2} (∼8) for degraded residues. Hz) due to coupling constants. Resonances at 4.65 _{OS & KOH} ppm (Glc I, I), 4.70 _{OS & KOH} ppm (Glc III, K) and 4.69 _{OS & KOH} ppm (Glc IV, L) were specified in the gluco array by spin system geometry. The remaining resonances in the low field region at 4.53 _{OS & KOH} ppm (Gal I, M) and 4.73 _OS / 5.01 _KOH ppm (GalNAc I / GalN I, O) show the appearance of a characteristic spin system for H-4 resonances in TOCSY experiments. By the galacto-pyranosyl residue. Galacto-array residues of 4.73 _OS / 5.01 _KOH ppm with the help of ¹ H resonance of both H-2 at 4.12 / 3.53 ppm associated with ¹³ C chemical shift of 51.9 _OS / 53.1 _KOH ppm in ¹³ C- ¹ H HSQC experiment Was determined to be an amino sugar. ^{The 13} C chemical shift is consistent with the nitrogen substituted carbon atom. Signals for the CH ₂ quantum of the PEtn moiety were observed at 3.27 and 4.16 ppm in the OS sample, which is related to the characteristic ¹³ C chemical shifts of 40.1 and 62.2 ppm in the ¹³ C- ¹ H HSQC experiment. Characteristic signals for the acetyl groups of other amino sugars were observed at 2.06 and 2.04 ppm in the OS samples, which correlated with characteristic ¹³ C chemical shifts of 22.4 and 22.1 ppm in the ¹³ C- ¹ H HSQC experiment.

OS에서 글리코실 잔기들은 서열은 이웃한 글리코실 잔기들에 대한 아노머 및 아글리콘 양자 간의 내부-잔기 ¹H-¹H NOE 측정을 통해 결정하였으며, 메틸화 분석 데이터를 확인하고 확장하였다. Pm70 탈아실화 올리고당의 연결 패턴을 이 방법으로 결정하였다(도 24)(실시예 3, 표 2). 그리하여, 양자쌍 Hep III(G) H-1 및 Hep II(F) H-2, Hep II(F) H-1 및 Hep I(E) H-3, 및 Hep I(E) H-1 및 Kdo(C) H-5 간의 강한 트랜스글리코사이드 NOE 연결이 발생되면 종종 관찰되는 트리헵토실 부분으로 3개의 L,D-헵토스 잔기들의 서열 및 결합 지점을 알 수 있으며, 이 연결 패턴은 통 상적으로 헤모필루스 인플루엔자(Hi) 및 Mh으로부터 얻은 내부 코어 OS에서 발견된다(Cox 일동, 2001a; Brisson 일동, 2002). 더욱이, 아노머 양자들 Hep III(G) H-1 및 Hep II(F) H-1 간의 내부-잔기 NOE는 1,2-연결을 확인하게 해주었다(Romanowska 일동, 1988). Glc I(I)의 H-1로부터의 NOE 연결을 검사한 결과, 이 글루코스 잔기가 Hep I(E) H-4 및 Hep I(E) H-6에 대한 내부-잔기 NOE의 도움으로 4-위치에서 Hep I(E)에 연결되어 있는 것으로 나타났다. H-6에 대한 내부-잔기 NOE의 출현은 4-치환 헵토스 잔기들에서는 통상적인 발견된다(Backman 일동, 1988). Glc I(I)의 H-1과 Glc II(H)의 H-1 사이의 긴범위 NOE 연결 발생은 α-배열 글루코스 잔기(Glc II(H))가 6-위치에서 Hep I를 치환한 것을 시사하며, 이는 Mh 및 Ap 로부터 얻은 OS에서 관찰된 바와 같다(Brisson, 일동, 2002; St. Michael 일동, 2004). Glc II(H)의 H-1로부터의 NOE 연결을 검사한 결과, 이 글루코스 잔기가 Hep I(E) H-6에 대한 내부-잔기 NOE의 도움으로 6-위치에서 Hep I(E)연결되어 있는 것으로 나타났다. Glc I(I)에 유사하게, 긴범위 NOE 연결이 Glc I(I) 및 Glc II(H)의 아노머 ¹H 공명들 사이에서 관찰되었다. Hep IV(J)의 H-1로부터의 NOE 연결을 검사한 결과, 이 헵토스 잔기가 Glc I(I) H-6a 및 H-6b에 대한 내부-잔기 NOE의 도움으로 6-위치에서 Glc I(I)에 연결되어 있는 것으로 나타났다. 이러한 내부 코어 글리코스 구조는 Mh 및 Ap 둘다에서 관찰된 바 있지만, 이들 경우에서는, HepIV 잔기(J) 가 O-글리세로-D-만노 배열을 가진반면, 여기에서는 HepIV 잔기(J) 가 L-글리세로-D-만노 배열을 가졌는데, 이는 당분석에서 밝혀진 유일한 헵토스 잔기 배 열이다. 외부 코어 잔기들의 연결 패턴은 메틸화 분석 데이터와 함께 NOE 연결 및 ¹³C-¹H-HMBC 증거로부터 추론하였다. 4.70_{OS & KOH} / 4.69_{OS & KOH} ppm에서 아노머 양자 공명을 갖는 두개의 글루코-배치 잔기들(K & L)은 4.15_{OS & KOH} 및 4.31_{OS & KOH} ppm에서 Hep IV 잔기의 H-4 및 H-6 양자 공명들에 대한 내부-NOE 연결을 보였으며, 이는 메틸화 분석에서 관찰된 4,6-이치환 LD-헵토스 잔기와 일치하고 Ap 혈청형 2에서 앞서 관찰된 DD-HepIV의 배열과 유사하였다(St. Michael 일동, 2004). ¹H-¹³C HMBC 실험(도 25)에 의해, Glc HE(K)이 4-위치에서 HepIV(J)에 연결되고 Glc IV(L)이 6-위치에서 HepFV(J)에 연결된것으로 결정할 수 있었다. Gal I(M)의 아노머 양자 공명(4.53_{OS & KOH} ppm)에서부터 Glc IV(L)의 H-4 양자 공명에 이르는 내부-NOE 연결은 Gal I(M)이 4-위치에서 Glc IV(L) 를 치환하였음을 시사한다. Gal II(N)의 아노머 양자 공명에서부터 Gal I(M)의 H-4 양자 공명에 이르는 내부-NOE 연결은 Gal II(N)이 4-위치에서 Gal I(M)을 치환하였음을 시사하며, 이는 두개의 4-연결 6 탄당 잔기들, 즉 4-연결 글루코스 및 4-연결 갈락토스 잔기를 분석한 메틸화 분석 데이터와 일치한다. GalNAc I / GalN I(O)의 아노머 양자 공명에서부터 Gal II(N)의 H-3 양자 공명에 이르는 내부-NOE 연결은 GalNAc I / GalN I(O)가 3-위치에서 Gal II(N)를 치환하였음을 시사하며, 메틸화 분석에 의해 3-연결 6탄당 잔기를 갖는 것으로 확인되었다. 마지막으로, GalNAc II / GalN II(P)의 아노머 양자 공명에서부터 GalNAc I / GalN I(O)의 H-3 양자 공명에 이르는 내부-NOE 연결은 GalNAc II / GalN II(P)가 3-위치 에서 GalNAc I / GalN I(O)를 치환하였음을 시사하며, HexNAc-HexNAc 이탄당이 MS/MS에서 확인된 것과 일치한다. OS 샘플에 대한 ³¹P-¹H-HSQC 및 ³¹P-1H-HSQC-TOCSY 실험들을 통해 PEtn 치환 위치로 Hep II(F)의 3-위치가 확인되었다. HSQC 실험에 의해 인 신호로부터 Hep II 잔기(F)의 3-위치로 지정한 4.41 ppm의 양자 공명에 이르는 크로스-피크를 확인하였으며, 이는 4.31 및 5.87 ppm에서 H-2 및 H-1 양자 공명을 나타내는 HSQC-TOCSY 실험에서 확인하고 확장되었다(데이터 도시안됨). Glycosyl residues in the OS were determined by internal-residue ¹ H- ¹ H NOE measurements between both anomer and aglycone for neighboring glycosyl residues, confirming and expanding methylation analysis data. The linking pattern of Pm70 deacylated oligosaccharides was determined by this method (FIG. 24) (Example 3, Table 2). Thus, quantum pairs Hep III (G) H-1 and Hep II (F) H-2, Hep II (F) H-1 and Hep I (E) H-3, and Hep I (E) H-1 and Triheptosyl moieties often observed when strong transglycoside NOE linkages between Kdo (C) H-5 occur, revealing the sequence and binding points of the three L, D-heptose residues. As found in internal core OS from Haemophilus influenzae (Hi) and Mh (Cox, 2001a; Brisson, 2002). Moreover, the intra-residual NOE between the anomer quantum Hep III (G) H-1 and Hep II (F) H-1 allowed the identification of 1,2-links (Romanowska et al., 1988). Examination of the NOE linkage of Glc I (I) from H-1 revealed that this glucose residue was found to be 4- with the help of the internal-residual NOE for Hep I (E) H-4 and Hep I (E) H-6. It appears to be linked to Hep I (E) at the position. The appearance of internal-residual NOE for H-6 is commonly found in 4-substituted heptose residues (Backman et al., 1988). The generation of long range NOE linkages between H-1 of Glc I (I) and H-1 of Glc II (H) indicates that the α-arranged glucose residue (Glc II (H)) substituted Hep I at the 6-position. Suggestive, as observed in the OS obtained from Mh and Ap (Brisson, Dong, 2002; St. Michael Dong, 2004). Examining the NOE linkage of Glc II (H) from H-1 revealed that this glucose residue was Hep I (E) linked at the 6-position with the aid of the internal-residual NOE to Hep I (E) H-6. Appeared to be. Similar to Glc I (I), long range NOE linkage was observed between the anomer ¹ H resonances of Glc I (I) and Glc II (H). Examination of the NOE linkage from H-1 of Hep IV (J) revealed that this heptose residue was present at Glc I at the 6-position with the aid of the internal-residual NOE for Glc I (I) H-6a and H-6b. It appears to be linked to (I). This internal core glycos structure has been observed in both Mh and Ap , but in these cases HepIV residue (J) has an O-glycero-D-manno configuration, where HepIV residue (J) is L- It had a glycero-D-manno configuration, which was the only heptose residue sequence found in the sugar assay. The ligation pattern of the outer core residues was deduced from NOE ligation and ¹³ C- ¹ H-HMBC evidence with methylation assay data. Two gluco-batch residues (K & L) with anomer quantum resonance at 4.70 _{OS & KOH} / 4.69 _{OS & KOH} ppm are H-4 and H of Hep IV residues at 4.15 _{OS & KOH} and 4.31 _{OS & KOH} ppm Internal-NOE linkages for -6 quantum resonances were shown, consistent with the 4,6-disubstituted LD-heptose residues observed in the methylation assay and similar to the arrangement of DD-HepIV previously observed in Ap serotype 2. (St. Michael Allies, 2004). ^{By 1} H- ¹³ C HMBC experiment (FIG. 25), it can be determined that Glc HE (K) is linked to HepIV (J) at 4-position and Glc IV (L) is connected to HepFV (J) at 6-position. there was. Intra-NOE linkages from the anomeric quantum resonance of Gal I (M) (4.53 _{OS & KOH} ppm) to the H-4 quantum resonance of Glc IV (L) resulted in Glc IV (L) at the 4-position of Gal I (M). ) Is substituted. Internal-NOE linkages from the anomer quantum resonance of Gal II (N) to the H-4 quantum resonance of Gal I (M) suggest that Gal II (N) substituted Gal I (M) at the 4-position. This is consistent with methylation analysis data analyzing two 4-linked 6-sugar residues, namely 4-linked glucose and 4-linked galactose residues. Internal-NOE linkages from the annomeric quantum resonance of GalNAc I / GalN I (O) to the H-3 quantum resonance of Gal II (N) resulted in Gal IIc (N) at the 3-position of GalNAc I / GalN I (O). Suggesting that the compound was substituted and identified by methylation analysis as having a 3-linked hexasaccharide residue. Finally, the intra-NOE linkage from the annomeric quantum resonance of GalNAc II / GalN II (P) to the H-3 quantum resonance of GalNAc I / GalN I (O) results in a 3-position of GalNAc II / GalN II (P). It is suggested that the substitution of GalNAc I / GalN I (O) in the HexNAc-HexNAc peat sugar is consistent with that identified in MS / MS. ^31- P- ¹ H-HSQC and ³¹ P-1H-HSQC-TOCSY experiments on OS samples confirmed the 3-position of Hep II (F) as the PEtn substitution site. HSQC experiments confirmed the cross-peak from the phosphorus signal to 4.41 ppm quantum resonance, designated as 3-position of Hep II residue (F), which showed H-2 and H-1 quantum resonances at 4.31 and 5.87 ppm. Confirmed and expanded in HSQC-TOCSY experiment (data not shown).

Hep I-Kdo-지질 A 영역(E-C-B-A)의 연결들을 L-α-D-Hep I-(l-5)-α-Kdo4P-(2-6)-β-GlcN4P-(l-6)-α-GlcNlP로서 KOH 처리 LPS에 대한 분석으로 확인하였다(실시예 3, 표 2). 두개의 Kdo 함유 분획을 크로마토그래피에 의해 분리였으나 NMR 분석에는 충분하지 않은 양이 얻어졌다. Links of the Hep I-Kdo-lipid A region (ECBA) are L-α-D-Hep I- (l-5) -α-Kdo4P- (2-6) -β-GlcN4P- (l-6) -α It was confirmed by analysis for KOH treated LPS as -GlcNlP (Example 3, Table 2). Two Kdo containing fractions were separated by chromatography, but an amount not sufficient for NMR analysis was obtained.

구조적으로 및 분류학적으로 관련된 종들에서 유사한 OS 구조들을 합한 글리코실트랜스퍼라제들에 대한 정보와 결합된 OS 구조에 대한 완전한 지식과 함께 Pm70 균주(May 등, 2001)에 대한 게놈 서열이 유효해짐에 따라 Pm70 OS의 생합성을 위한 몇몇 후보 글리코실트랜스퍼라제들을 확인할 수 있게 되었다(도 26). 몇몇 추정 헵토실트랜스퍼라제들을 Pm70 게놈 서열에서 확인하였으며, Hep III Tase PM1294, Hep II Tase PM1844, 두개의 Hep I Tases PM1302 및 PM1843 및 Hep IV Tase PM1144을 포함한다. 데이터베이스에 이들 유전자 각각의 최상의 동족체가 실시예 3, 표 3에 기재되어 있으며, 높은 상동성은 후보 PM 유전자가 지적된 기능을 가짐을 나타낸다. 앞서, 본 출원인들과 협력자들은 PM1294이 다른 Pm 균주 VP161 에서 Hep III Tase임을 밝힌 바 있다(Harper 일동, 2004). α-글루코스(H)를 Hep I(E)의 6-위치에 첨가하는 유전자는 알려져 있지 않지만 4-위치에서 Hep I(E)를 치환하는 β-글리코실트랜스퍼라제에 대한 우수한 동족체 PM1306는 있다. Kdo 트랜스퍼라제는 많은 수의 우수한 동족체들로 인해 쉽게 PM1305 확인되지만, Pm 게놈에서는, 오직 한 개의 Kdo 트랜스퍼라제 동족체만이 확인되었다. 흥미로운 것은, Kdo(C)5 Hep I(E), Glc I(I) 영역의 생합성에 관여하는 몇몇 유전자들이 염색체의 이 영역에서 군생체를 이루고 있다는 것이다. 외부 코어 영역에 대한 추정 글리코실트랜스퍼라제들은 PM1138에서 PM1144에 이르는 염색체 범위의 영역에서 군생체를 이루고 있다. 글리코실트랜스퍼라제 유전자들의 군생이 이 속에서 언제나 관찰되는 것은 아니며, 실제로, Hi OS에 대한 글리코실트랜스퍼라제는 게놈 전체에 자유롭게 흩어져 있다. 추정 글리코실트랜스퍼라제들의 다른 병소가 Pm 게놈 PM0506에서 PM0512까지의 다른 영역에서 발견될 수 있다. 이 병소는 Hi 및 헤모필루스 듀크레이(Hd) 둘다로부터 얻은 소위 lsg 병소와 함께 잘 조사되어 왔다. Hi OS의 생합성에서 이 병소의 역할은 어떠한 명쾌한 답도 주어지지 않은체 몇몇 논쟁의 소재가 되어왔다(Phillips 일동, 1996, 2000; Cox 일동, 2001b). 그러나, 이 Pm70 중에서, 이 병소는 Pm70 게놈(PM0188 및 PMl 174)의 3개 시알릴트랜스퍼라제 동족체들 중 하나의 시아릴트랜스퍼라제 동족체(PM0508)이며, 구조에 대한 연구는 Pm70 LPS가 적절한 생장 조건 하에서 시알릴화될 수 있는지 알아보기 위해 진행중이다. 활성화된 누클레오티드 당 공여체의 형성을 위한 후보 유전자들이 또한 실시예 3, 표 3에 열거되어 있다. As the genomic sequence for the Pm70 strain (May et al., 2001) becomes valid with complete knowledge of the OS structure combined with information on glycosyltransferases that combine similar OS structures in structurally and taxonomically related species, Several candidate glycosyltransferases for biosynthesis of Pm70 OS can be identified (FIG. 26). Several putative heptosyltransferases have been identified in the Pm70 genomic sequence and include Hep III Tase PM1294, Hep II Tase PM1844, two Hep I Tases PM1302 and PM1843 and Hep IV Tase PM1144. The best homologs of each of these genes in the database are listed in Example 3, Table 3, with high homology. Indicates that the PM gene has the indicated function. Earlier, applicants and collaborators found that PM1294 Hem III Tase has been identified in Pm strain VP161 (Harper et al., 2004). The gene that adds α-glucose (H) to the 6-position of Hep I (E) is unknown but there is an excellent homologue PM1306 for β-glycosyltransferase that substitutes Hep I (E) at the 4-position. Kdo transferase is easily identified as PM1305 due to the large number of good homologues, In the Pm genome, only one Kdo transferase homologue was identified. Interestingly, several genes involved in biosynthesis of the Kdo (C) 5 Hep I (E) and Glc I (I) regions are colonized in this region of the chromosome. Putative glycosyltransferases for the outer core region are colonized in the chromosomal range of regions from PM1138 to PM1144. The population of glycosyltransferase genes is not always observed therein. In fact, glycosyltransferases for Hi OS are freely scattered throughout the genome. Other lesions of putative glycosyltransferases Pm genomes can be found in other regions from PM0506 to PM0512. The lesions have been well investigated with a so-called lsg lesions obtained from Hi and Haemophilus Duke ray (Hd) both. The role of this lesion in the biosynthesis of Hi OS has been the subject of some debate, given no clear answers (Phillips, 1996, 2000; Cox, 2001b). However, among these Pm70s, this lesion is the cyclyltransferase homolog (PM0508) of one of the three siallyltransferase analogs of the Pm70 genome (PM0188 and PMl 174), and studies on the structure have shown that Pm70 LPS is suitable for growth conditions. It is underway to see if it can be sialylated under. Candidate genes for the formation of activated nucleotide sugar donors are also listed in Example 3, Table 3.

논의Argument

Pm의 Pm70 게놈 균주의 올리고당을 구조분석한 결과, 관련된 종인 Mh(Brisson 일동, 2000), Ap (St. Michael 일동, 2004), Hd (Schweda 일동, 1994) 및 Hi (Cox 일동, 2001a)에 대해 앞서 결정한 LPS 코어 올리고당 구조들과 유사성이 있는 구조가 나타났다. 각각의 경우, 코어 OS는 Kdo 잔기에 부착된 똑같이 연결된 트리-헵토실 단위를 갖는다. 흥미롭게도, Pm에서, HepII 잔기의 3-위치는 대부분의 경우 PEtn 잔기로 치환되어 있는 반면, Ap, Hd 및 Mh은 PEtn 잔기를 갖지 않고 Hi는 Hep II의 6-위치에 PEtn 잔기를 갖고 있다. Pm의 Hep I 잔기에서의 치환패턴은 두개의 글루코스 잔기들이 4- 및 6-위치에 존재하는 본 발명의 수의학적 병원균 Ap 및 Mh와 동일하며, Hi 및 Hd 내의 Hep I 잔기는 4-위치에만 치환되어 있다. 또한, Hep I의 4-위치에 있는 글루코스 잔기는 3종의 수의학적 병원균들, Hd 및 Hi의 몇몇 균주들에서 6-위치에서 헵토스 잔기로 모두 치환되어 있다. 그러나, Ap, Hd, Mh 및 Hi의 몇몇 균주들 내의 D-글리세로-D-만노 배좌를 갖는 헵토스 잔기에 비교할 때, Pm (및 몇몇 Hi의 균주)에서, 글루코스 잔기를 치환하는 헵토스 잔기는 L-글리세로-D-만노 배좌를 갖는다. 이 헵토스 잔기의 치환 패턴은 이들 균주들 간에 크게 달라질 수 있으며, 여러가지 균주들 간의 보존된 내부 코어 구조 유사성은 OS 구조의 이 지점에서 마무리된다. 헵토스 잔기가 동일한 위치에 2치환되어 있는 Ap 혈청형 2와 유사하게, Pm에서도, 헵토스 잔기는 4- 및 6-위치가 두개의 글루코스 잔기로 2치환되어 있으나, 글루코스 잔기가 아닌 또 다른 헵토스 잔기가 4-위치에 치환되어 있다. Mh 또한 4-위치에 추가 D,D-헵토스 잔기를 가지며, Ap 혈청형 1, Hd 및 Hi 역시 이 네번째 헵토스 잔기로부터 연장된 6탄당을 가지지만 신규한 GalNAc-GalNAc 이탄당을 말단기로 하는 연장부는 관찰된 바 없다. As a result of structural analysis of oligosaccharides of Pm70 genome strain of Pm , the related species Mh ( Brisson, 2000), Ap ( St. Michael, 2004), Hd ( Schweda, 1994) and Hi ( Cox, 2001a) A structure similar to the previously determined LPS core oligosaccharide structures was shown. In each case, the core OS has identically linked tri-heptosyl units attached to Kdo residues. Interestingly, In Pm , the 3-position of the HepII residue is in most cases substituted with a PEtn residue, whereas Ap , Hd and Mh have no PEtn residue and Hi has a PEtn residue at the 6-position of Hep II. The substitution pattern at the Hep I residue of Pm is identical to the veterinary pathogens Ap and Mh of the present invention where two glucose residues are present at 4- and 6-positions, and the Hep I residues in Hi and Hd are substituted only at 4-positions. It is. In addition, the glucose residue at the 4-position of Hep I is all substituted with heptose residue at the 6-position in several strains of three veterinary pathogens, Hd and Hi . However, when compared to heptose residues with D-glycero-D-manno locus in several strains of Ap , Hd , Mh and Hi , In Pm (and some strains of Hi), heptyl monohydrate residue substituted for glucose moiety has a -D- manno conformation with L- glycero. The substitution pattern of this heptose residue can vary greatly between these strains, and the conserved internal core structure similarity between the various strains ends at this point in the OS structure. Similar to Ap serotype 2, where the heptose residues are bisubstituted at the same position, Also in Pm , the heptose residue is bisubstituted with two glucose residues in the 4- and 6-positions, but another heptose residue, which is not a glucose residue, is substituted in the 4-position. Mh also has additional D, D-heptose residues at the 4-position, and Ap serotypes 1, Hd and Hi also have hexasaccharides extending from this fourth heptose residue, but the new GalNAc-GalNAc peat sugars as terminal groups No extension has been observed.

Pm70 OS 구조에 기초하여, 유사한 특이성을 갖는 글리코실트랜스퍼라제들의 동족체들을 Pm70 게놈에서 확인하였다. 하나 또는 두개의 Kdo 잔기의 존재에 의존하는 두개의 LPS 군체를 새롭게 발견한 것을 보면, Kdo 트랜스퍼라제에 대해 오직 한 개의 동족체가 Pm 게놈에서 확인된 것은 매우 흥미롭다. Kdo 트랜스퍼라제의 다면적인 본성이 널리 알려져 있기 때문에, 즉 동일한 Kdo 트랜스퍼라제는 Kdo 잔기를 지질 A에 전달할 수 있고, 제2의 Kdo 잔기는 초기 Kdo 잔기에 전달 할 수 있기 때문에 놀라운 것이 아니다. 하나 및 두개의 Kdo 잔기가 확인된 군체들이 확인되었지만 Pm LPS의 새로운 특성은 전에는 관찰된 바 없다. 그러나, Hep I(E)에 대한 Pm70 게놈에는 Kdo(C)(α-1,5 헵토실트랜스퍼라제) 트랜스퍼라제에 대해 우수한 2개의 동족체가 있는 것으로 관찰되었다. 그 중 하나의 트랜스퍼라제는 Hi의 HI 0261(OpsX)에 대해 높은 상동성을 가졌는데, 이때 LPS 구조는 하나의 Kdo 잔기를 함유하였고, 두번째 트랜스퍼라제는 LPS 구조 내에 두개의 Kdo 잔기를 갖는 대장균(Escherichia coli) 및 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae)로부터 얻은 WaaC에 대해 가장 높은 상동성을 가졌다. 따라서, 두개의 Hep I 트랜스퍼라제를 확인한 결과 Pm 70 LPS의 Kdo 영역내에 두개의 구조 배치가 존재하는 것으로 나타났으며, 이 생물로부터 얻은 Kdo 트랜스퍼라제의 제어를 이해하게 된 것이 흥미롭다. Based on the Pm70 OS structure, homologues of glycosyltransferases with similar specificities were identified in the Pm70 genome. New discovery of two LPS colonies that depend on the presence of one or two Kdo residues suggests that only one homologue for Kdo transferase What has been identified in the Pm genome is very interesting. It is not surprising because the multifaceted nature of Kdo transferases is well known, ie the same Kdo transferase can deliver Kdo residues to lipid A, and the second Kdo residue can transfer to the initial Kdo residue. Colonies with one and two Kdo residues identified No new properties of Pm LPS have been observed before. However, it was observed that the Pm70 genome for Hep I (E) has two homologs that are excellent for Kdo (C) (α-1,5 heptosyltransferase) transferase. One of the transferases had high homology to Hi 0261 (OpsX) of Hi , where the LPS structure contained one Kdo residue and the second transferase had two Kdo residues in the LPS structure. Highest homology to WaaC obtained from Escherichia coli ) and Klebsiella pneumoniae . Therefore, the identification of two Hep I transferases revealed that two structural arrangements exist within the Kdo region of Pm 70 LPS, and it is interesting to understand the control of Kdo transferases obtained from this organism.

이 연구에서는 Pm의 게놈 균주의 코어 OS 영역을 구조적으로 분석하여 특성 을 결정하였으며, 코어 OS의 완전한 생합성을 위한 추정 글리코실트랜스퍼라제들을 확인하였다. In this study The core OS region of the genomic strain of Pm was structurally analyzed and characterized to identify putative glycosyltransferases for complete biosynthesis of the core OS.

재료 및 방법Materials and methods

배지 및 생장 조건 Medium and growth conditions

Pm 균주 Pm70(NRCC # 6232) 를 먼저 초콜릿 한천 평판(37 ℃)에서 밤새 생장시키고, 생장물은 β NAD(Sigma N-7004)(최종 농도 5 ug/㎖), haemin(Sigma H-2250)(최종 농도 5 ug/㎖) 및 1% 글루코스(10 g)이 보충된 뇌-심장 침출(brain-heart infusion, BHI) 배지 1L를 접종하는데 사용하였다. 이어서, 배양물을 37 ℃, 200 rpm에서 6 시간 동안 인큐베이션시키고, 28 L 발효기 내 BHI 액체 배지 24 L를 접종하는데 사용하였다. 다음으로, 배양물을 37 ℃ 및 24 l/분 탄산가스 포화도에서 생장시키고, 20% O₂ 포화도에서 200 rpm으로 18 시간 동안 교반하였다. 히알루론산 분해 효소(1g, Sigma)으로 처리한 후, 세포를 죽이고(2% 페놀 중량/부피, 4시간), Sharples 연속 흐름 원심분리(∼240 g wet wt.)에 의해 세포를 수거하였다.Pm strain Pm70 (NRCC # 6232) was first grown overnight on chocolate agar plates (37 ° C.), and the growth was β NAD (Sigma N-7004) (final concentration 5 ug / ml), haemin (Sigma H-2250) ( Final concentrations of 5 ug / ml) and 1% glucose (10 g) were used to inoculate 1 L of brain-heart infusion (BHI) medium. The culture was then incubated at 37 ° C., 200 rpm for 6 hours and used to inoculate 24 L of BHI liquid medium in a 28 L fermentor. Next, the cultures were grown at 37 ° C. and 24 l / min carbon dioxide saturation and stirred at 200 rpm at 20% O ₂ saturation for 18 hours. After treatment with hyaluronic acid degrading enzyme (1 g, Sigma), cells were killed (2% phenol weight / volume, 4 hours) and cells were harvested by Sharples continuous flow centrifugation (-240 g wet wt.).

지질다당류의 단리 및 정제 Isolation and Purification of Lipopolysaccharide

동결건조시킨 세포 덩어리(약 7Og)를 유기 용매로 세척하여 약 50g을 얻고, 상기 세척하고, 동결건조시킨 세포 덩어리 10g으로부터 고온 물/페놀 방법(Westphal 및 Jann, 1965)에 의해 지질다당류(LPS)를 분리하였다. 수성상을 물에 대해 투석하고 동결건조시켰다. 건조된 샘플을 물에 용해하여 1-2% 용액(중량/ 부피)을 얻고, 데옥시리보누클레아제 I(DNase)(0.01 ㎎/㎖) 및 리보누클레아제(RNase)(0.01 ㎎/㎖)로 37 ℃에서 3 시간 동안 처리한 후, 단백질가수분해 효소 K(0.01 ㎎/㎖)로 3 시간 동안 처리하였다. 투석하고 건조된 샘플을 물에 용해하여 1 % 용액을 만들고 8K에서 고속 회전시킨 후, 45 K에서 고속 원심분리하여 모든 불용성 물질(124 ㎎)을 제거하였다. 45K 회전에서 얻은 LPS 펠릿을 물에 재용해하고 동결건조시켰다(180 ㎎). 정제된 LPS(75 ㎎)를 37 ℃에서 1 시간 동안 교반하며 무수 히드라진으로 처리하여 O-탈아실화 LPS(LPS-OH)를 제조하였다. 빙욕을 이용하여 반응을 냉각시키고, 서서히 차가운 아세톤(-70 ℃, 5 vols.)을 첨가하여 과량의 히드라진을 파괴하고, 침전된 LPS-OH을 원심분리(60 ㎎)에 의해 분리하였다. 샘플을 상기 서술한 바와 같이 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 정제하였다. 정제된 LPS(100 ㎎)를 1 % 아세트산(lO mg/㎖, 100 ℃, 1.5 시간)으로 처리하여 코어 올리고당(OS) 분리하고 원심분리(5000 g)에 의해 불용성 지질 A를 제거하였다. 동결건조시킨 OS(50 mg) Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 추가로 정제하고, 개개의 분획을 동결건조시켰다. LPS-OH(약 20 ㎎)을 4N KOH로 125 ℃에서 16 시간 동안 처리하여 완전히 탈아실화한 LPS를 분리한 후 중화하고, 앞서 서술한 바와 같이, 음이온 교환 액체 크로마토그래피로 분류하였다(Vinogradov, E 및 Bock, K. 1999). The lyophilized cell mass (about 70 g) was washed with an organic solvent to obtain about 50 g, and from the washed and 10 g of the lyophilized cell mass, lipopolysaccharide (LPS) by hot water / phenol method (Westphal and Jann, 1965). Was separated. The aqueous phase was dialyzed against water and lyophilized. The dried sample was dissolved in water to obtain a 1-2% solution (weight / volume), deoxyribonuclease I (DNase) (0.01 mg / ml) and ribonuclease (RNase) (0.01 mg / ml) ) Was treated at 37 ° C. for 3 hours, followed by proteolytic enzyme K (0.01 mg / ml) for 3 hours. The dialyzed and dried sample was dissolved in water to make a 1% solution, rotated at 8K at high speed, and then centrifuged at 45K to remove all insoluble material (124 mg). LPS pellets obtained at 45K revolutions were redissolved in water and lyophilized (180 mg). Purified LPS (75 mg) was stirred for 1 hour at 37 ° C. and treated with anhydrous hydrazine to prepare O-deacylated LPS (LPS-OH). The reaction was cooled using an ice bath, slowly cold acetone (-70 ° C., 5 vols.) Was added to destroy excess hydrazine and the precipitated LPS-OH was separated by centrifugation (60 mg). Samples were purified on Bio-Gel P-2 columns as described above. Purified LPS (100 mg) was treated with 1% acetic acid (10 mg / ml, 100 ° C., 1.5 h) to separate core oligosaccharides (OS) and centrifuged (5000 g) to remove insoluble lipid A. Further purification on lyophilized OS (50 mg) Bio-Gel P-2 column and individual fractions were lyophilized. LPS-OH (about 20 mg) was treated with 4N KOH for 16 hours at 125 ° C. to completely deacylated LPS, which was then neutralized, and classified by anion exchange liquid chromatography as described above (Vinogradov, E And Bock, K. 1999).

분석 방법 Analytical Method

당을 GLC-MS(Sawardeker 일동, 1965)에 의해 알디톨 아세테이트 유도체로 결정하였다. 샘플들을 4 M 트리플루오로 아세트산을 사용하여 100 ℃에서 4 시간 동 안 가수분해한 후, H₂O에서 밤새 환원시키고(NaBD₄), 촉매로 잔류 아세트산 나트륨을 이용하여 100 ℃에서 2 시간 동안 무수 아세트산으로 아세틸화하였다. GLC-MS에는 30 M DB-17 모세관 컬럼(180 ℃ - 260 ℃, 3.5 ℃/min)이 장착되어 있었으며, MS는 Varian Saturn II 질량 분광기의 전자 충격 모드에서 수행하였다. NaOH / DMSO /요오드화메틸 방법(Ciucanu 및 Kerek, 1994)으로 메틸화 분석을 수행하고, 상기와 같이 GLC-MS에 의해 분석하였다. 부틸 글리코사이드 유도체의 GLC 분석(St. Michael 일동, 2004)에 의해 절대적인 구조를 결정하였다. Sugars were determined as alditol acetate derivatives by GLC-MS (Sawardeker et al., 1965). Samples were hydrolyzed at 100 ° C. for 4 hours with 4 M trifluoro acetic acid and then reduced overnight in H ₂ O (NaBD ₄ ) and anhydrous for 2 hours at 100 ° C. using residual sodium acetate as catalyst. Acetylated with acetic acid. GLC-MS was equipped with a 30 M DB-17 capillary column (180 ° C.-260 ° C., 3.5 ° C./min) and MS was performed in the electron impact mode of a Varian Saturn II mass spectrometer. Methylation analysis was performed by NaOH / DMSO / methyl iodide method (Ciucanu and Kerek, 1994) and analyzed by GLC-MS as above. The absolute structure was determined by GLC analysis of the butyl glycoside derivative (St. Michael Dong, 2004).

질량 스펙트럼 분석 Mass spectral analysis

0.5% 아세트산을 함유한 25% 수성 아세토니트릴 중에 샘플을 직접 주입하여 VG Quattro 질량 분광기(Micromass, Manchester, U.K.)의 음이온 모드에서 ESI-MS를 수행하였다. 미세분사 계면을 통해 API 3000 질량 분광기(Applied Bio시스템 / Sciex, Concord, Canada)에 결합시킨 Prince CE 시스템(Prince Technologies, The Netherlands) 상에서 모세관 전기영동(CE)-MS을 수행하였다. 외장 용액(이소프로판올-메탄올, 2:1)을 유속 1 ㎕/분으로 낮은 정체 부피 탑관(250 ㎛ i.d., Chromatographic Specialties)에 옮겼다. 모든 수성 용액을 사용하기 전 0.45-㎛ 필터(Millipore) 를 통해 여과하였다. 전자 분사 스테인레스 니들(27 gauge)을 낮은 정체부피 탑관에 대해 돌출시켜 외장 용액애 모세관 컬럼 말단으로 이동할 수 있게 하였다. 5% 메탄올을 함유한 탈이온수(pH 9.0) 중의 10 mM 암모늄 아세테이트/수산화 암모늄을 사용하여 약 90 cm 길이의 속이 빈 융합 실리카 모세관에서 분 리하였다. 주입에는 관례적으로 20 kV 전압이 인가되었다. 모세관의 출구는 레이저 풀러(Sutter Instruments)를 사용하여 대략 15 ㎛ i.d로 테이핑하였다. 전체 질량 스캔 모드에서 1 m/z 단위 단계 당 3.0 ms의 체류 시간으로 질량 스펙트럼을 얻었다. MS/MS 데이터는 1 m/z 단위 단계 당 1.0 ms의 체류 시간으로 얻었다. RF-유일 사중극자 충돌 세포에서 질소와 선택된 전구체 이온의 충돌 활성화에 의해 형성된 파편 이온들을 제3의 사중극자를 스캐닝하여 질량 분석하였다. ESI-MS was performed in anion mode of a VG Quattro mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) by directly injecting the sample in 25% aqueous acetonitrile containing 0.5% acetic acid. Capillary electrophoresis (CE) -MS was performed on a Prince CE system (Prince Technologies, The Netherlands) coupled to an API 3000 mass spectrometer (Applied Biosystem / Sciex, Concord, Canada) via a microspray interface. The external solution (isopropanol-methanol, 2: 1) was transferred to a low static volume column (250 μm id, Chromatographic Specialties) at a flow rate of 1 μl / min. All aqueous solutions were filtered through a 0.45-μm filter (Millipore) before use. Electron sprayed stainless needles (27 gauge) were projected against the low stagnation volume column to allow movement to the capillary column ends in the sheath solution. 10 mM ammonium acetate / ammonium hydroxide in deionized water (pH 9.0) containing 5% methanol was separated in a hollow fused silica capillary tube about 90 cm long. The injection was customarily applied with a 20 kV voltage. The outlet of the capillary was taped to approximately 15 μm id using a laser puller (Sutter Instruments). Mass spectra were obtained with a dwell time of 3.0 ms per 1 m / z unit step in full mass scan mode. MS / MS data was obtained with a dwell time of 1.0 ms per 1 m / z unit step. Fragment ions formed by collision activation of nitrogen and selected precursor ions in RF-only quadrupole impingement cells were subjected to mass spectrometry by scanning a third quadrupole.

핵자기 공명 Nuclear magnetic resonance

5 mm 또는 3 mm 트리플 공명(¹H, ¹³C, ³¹P) 탐침을 사용하여 Varian Inova 400, 500 및 600 MHz 분광기들 상에서 NMR 실험을 수행하였다. 동결건조시킨 당 샘플을 99% D₂O 600 ㎕(5mm) 또는 140 ㎕(3mm)에 용해시켰다. 실험은 25 ℃에서 수행하였으며, HOD(중수소 H₂O) 신호 억제는 4.78 ppm이었다. 아세톤의 메틸 공명을 내부 참조표로 사용하였으며 ¹H 스펙트럼의 경우는 2.225 ppm을 ¹³C 스펙트럼의 경우에는 31.07 ppm이었다. Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³C-¹H HSQC, ¹³C-¹H HSQC-TOCSY 및 ¹³C-¹H HMBC로부터 얻은 표준 동종핵 및 이종핵 관련 2D 펄스를 일반적인 지정에 사용하였다. Varian Inova 200 분광기 상에서 1D ³¹P 실험을 수행하였으며, 스위프 폭(sweep width)은 40 ppm이었고, 20000 과도 전류와 획득 시간은 1.6 s이었다. 6 시간 동안 Varian Inova 400 분광기 상에서 2D 1H-³¹P HSQC 실험을 수행하 였다. 커플링 상수는 일련의 1D-HSQC 실험을 수행하여 10 Hz에서 최적화하였다. 스위프 폭은 F2(¹H) 크기에서는 6.0 ppm이었고, F1(³¹P) 크기에서는 16.2 ppm이었다. 이완 지연 중의 물의 예비 포화도는 1.5 s이었고, t2에서 획득 시간은 0.21 s이었으며, 증분 당 180(HMQC) 스캔으로 32 증분을 얻었다. HSQC 실험과 동일한 파라미터를 사용하여 8 시간 동안 Varian Inova 400 분광기 상에서 2D ¹H-³¹P HSQC-TOCSY 실험을 수행하였으며, TOCSY 혼합시간은 80 ms이었다.NMR experiments were performed on Varian Inova 400, 500 and 600 MHz spectroscopy using 5 mm or 3 mm triple resonance ( ¹ H, ¹³ C, ³¹ P) probes. Lyophilized sugar samples were dissolved in 600 μl (5 mm) or 140 μl (3 mm) of 99% D ₂ O. The experiment was performed at 25 ° C., and HOD (deuterium H ₂ O) signal inhibition was 4.78 ppm. The methyl resonance of acetone was used as internal reference table and 2.225 ppm for the ¹ H spectrum and 31.07 ppm for the ¹³ C spectrum. Standard homonuclear and heteronuclear related 2D pulses from Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³ C- ¹ H HSQC, ¹³ C- ¹ H HSQC-TOCSY and ¹³ C- ¹ H HMBC were used for general designation. 1D ³¹ P experiments were performed on a Varian Inova 200 spectrometer, the sweep width was 40 ppm, the 20000 transient and the acquisition time was 1.6 s. 2D 1H- ³¹ P HSQC experiments were performed on a Varian Inova 400 spectrometer for 6 hours. Coupling constants were optimized at 10 Hz by performing a series of 1D-HSQC experiments. The sweep width was 6.0 ppm in the F2 ( ¹ H) size and 16.2 ppm in the F1 ( ³¹ P) size. The preliminary saturation of water during the relaxation delay was 1.5 s, the acquisition time at t2 was 0.21 s, and 32 increments were obtained with 180 (HMQC) scans per increment. The 2D ¹ H- ³¹ P HSQC-TOCSY experiment was performed on a Varian Inova 400 spectrometer for 8 hours using the same parameters as the HSQC experiment, and the TOCSY mixing time was 80 ms.

실시예Example 4 4

이 실시예는 문헌 [Carbohydrate Research 340, 59(2005)]에 공개된 것을 기초로 하여 구성되었다. 파스튜렐라 멀토시다 균주 VP 161의 지질다당류의 구조 분석 This example was constructed on the basis of what is disclosed in Carbohydrate Research 340 , 59 (2005). Structural Analysis of Lipopolysaccharide of Pasteurella Multocida Strain VP 161

이 실시예에서는, 파스튜렐라 멀토시다 균주 VP 161의 지질다당류의 구조를 밝힌다. 지질다당류를 여러가지 분해 과정을 거치게 하였다. 정제된 생성물의 구조는 단당류 및 메틸화 분석, NMR 스펙트럼 분석 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 규명하였다. 지질다당류에 대한 하기 구조는 이들 실험으로부터 얻은 데이터를 통합한 것을 기초로 하여 결정하였다. In this example, the structure of lipopolysaccharide of Pasteurella multocida strain VP 161 is revealed. Lipopolysaccharide was subjected to various decomposition processes. The structure of the purified product was characterized by monosaccharide and methylation analysis, NMR spectral analysis and mass spectral analysis. The following structures for lipopolysaccharides were determined based on integrating the data from these experiments.

상기에서, NMR 데이터에 기초했을 때, 모든 당은 피라노스 고리 형태로 밝혀졌으며, Kdo는 2-케토-3-데옥시-옥툴로손산이고, L-α-D-Hep은 L-글리세로-D-만노-헵토스이고, PPEtn은 피로포스포에탄올아민이고, PCho는 포스포콜린이다. 흥미로운것은, O- 및 완전히 탈아실화된 LPS을 시험했을 때, 분자의 Kdo-P 부분 배열에 변이가 있었다는 것이다. 단백당형이 Kdo-Kdo 기를 형성할 뿐만 아니라 Kdo-P 부분을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, Glc II 잔기는 Kdo 잔기가 두개 존재할 때는 Hep I에 결합되지 않았지만 Kdo-P 배열이 형성되었을 때는 결합되어 있었으 며, 이는 입체 방해 또는 부적합한 수용체 배합으로 인한 생합성 부적합성을 암시한다. 이러한 LPS의 Kdo 영역의 변이는 또한 게놈 균주 Pm70를 포함한 조사된 몇몇 다른 파스튜렐라 멀토시다 균주에서도 관찰되었다. In the above, based on NMR data, all sugars were found to be in the form of pyranose rings, Kdo is 2-keto-3-deoxy-octulonic acid, and L-α-D-Hep is L-glycer- D-manno-heptose, PPEtn is pyrophosphoethanolamine and PCho is phosphocholine. Interestingly, when testing O- and fully deacylated LPS, there was a variation in the Kdo-P subarray of the molecule. The protein glycoforms were found not only to form Kdo-Kdo groups but also to have Kdo-P moieties. Moreover, the Glc II residues were not bound to Hep I in the presence of two Kdo residues but were bound when the Kdo-P sequence was formed, suggesting biosynthetic incompatibility due to steric hindrance or inappropriate receptor combination. Variations in this Kdo region of LPS were also observed in several other Pasteurella multocida strains investigated, including genomic strain Pm70.

파스튜렐라 멀토시다(Pm)는 그램-음성 박테리아이며, 다종 병원균으로 식용 동물 및 인간에게서 심각한 질병을 유발한다. 이 박테리아는 닭 및 칠면조에서 조류 콜레라, 소에서 패혈증(hemorrhagic septicaemia), 돼지에서 위축성 비염(atrophic rhinitis), 및 인간에서 개 및 고양이 교상 감염을 유발하는 원인균이다. 몇몇 Pm 병독성 인자가 이미 확인되었으며, 혈청군 A 및 B, 및 LPS 캡슐이 이에 포함된다. 그러나, Pm으로부터 분리된 LPS의 내독성에 대한 보고서들 간에 논쟁이 있다. 혈청형 B:2 균주로부터 분리된 LPS는 내독성을 보일 수 있으며, 정맥내로 투여된 LPS는 버팔로에서 패혈증의 임상학적 징후를 재발시킬 수 있다. 그러나, 칠면조 새끼들은 염증 반응 및 현미경상의 간 손상이 포유동물 숙주에서 관찰되는 것과 유사하지만 Pm의 혈청형 A 균주로부터 분리된 LPS의 치명적인 영향에 비교적 내성을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 이와 반대로, 닭 배아 및 쥐는 Pm LPS의 독성 영향에 대해 매우 민감한 것으로 밝혀졌다. Pasteurella multocida ( Pm ) is a gram-negative bacterium and is a multi-pathogen that causes serious disease in food animals and humans. These bacteria are the causative agents of avian cholera in chickens and turkeys, hemorrhagic septicaemia in cows, atrophic rhinitis in pigs, and dog and cat bite infections in humans. some Pm virulence factors have already been identified, including serogroups A and B, and LPS capsules. But, There is a debate among reports on the endogenous toxicity of LPS isolated from Pm . LPS isolated from serotype B: 2 strains may be toxic, and intravenously administered LPS may relapse clinical signs of sepsis in buffalo. However, turkey cubs have similar inflammatory responses and microscopic liver damage to those observed in mammalian hosts. It was found to be relatively resistant to the lethal effects of LPS isolated from serotype A strains of Pm . In contrast, chicken embryos and mice It has been found to be very sensitive to the toxic effects of Pm LPS.

Pm 균주들은 LPS에 대한 항체 반응에 따라 Heddleston 혈청형들로 분류되며, 가열 사멸시킨 Pm 백신에 대응하여 생장된 항체들은 주로 LPS에 대응하고 같은 혈청형을 갖는 균주들에 대해 숙주를 보호한다. 앞선 연구에서 고온 페놀/물 방법을 이용하여 정제되어 쥐와 토끼에게 주입된 LPS는 불량한 항체 반응을 유도하고 Pm 감염에 대한 어떠한 방어도 보이지 않는 것으로 나타났으나, 동일한 LPS를 닭에게 주입한 경우에는 우수한 항체 반응을 유도하여 질병에 대한 수용체를 수동적으로 보호하는 것으로 밝혀졌다. 혈청형 A 균주로부터 얻은 LPS에 대응하여 생장된 모노클로날 항체들은 살균성을 가지며 동족 공격에 대해 쥐를 완벽하게 보호하는 것으로 나타났다. 그밖에도, Pm LPS의 혈청형 B 균주에 대한 옵소닌 모노클로날 항체는 Pm 감염에 대해 쥐를 부분적으로 보호하는 것으로 밝혀졌다. Pm strains are classified into Heddleston serotypes according to the antibody response to LPS, and antibodies grown in response to heat killed Pm vaccines mainly protect the host against strains that correspond to LPS and have the same serotype. In previous studies, LPS purified using high temperature phenol / water methods and injected into rats and rabbits induced poor antibody responses. No protection against Pm infection was shown, but when the same LPS was injected into chickens, it was found to induce a good antibody response to passively protect the receptor against disease. Monoclonal antibodies grown against LPS from serotype A strains were bactericidal and were shown to completely protect mice against cognate attack. In addition, Opsonin monoclonal antibodies against serotype B strains of Pm LPS It has been shown to partially protect mice against Pm infection.

변성된 LPS 구조는 생체 내에서 Pm의 생존 능력에 영향을 미치는 것이 분명하다. 최근, 심하게 약독화된 3종의 Pm 균주 VP 161 각각이 유전자 pml294(waaQ _PM 로 명명)에 단일 트랜스포슨(transposon) 삽입을 갖고 있는 것으로 확인되었다. 이 유전자는 이후 헵토실트랜스퍼라제를 암호화하는 것으로 밝혀졌으며, 돌연변이를 유도한 경우에는 심하게 절단된 LPS 구조를 초래하였다. 또한, Pm galE 돌연변이가 이미 제작되었으며, LPS에 대한 구조 분석은 보고된 바 없지만 쥐에서 약독화도 이루어졌다. Pm 분리물들은 협막 항원들에 기초하여 5 개 혈청군 A, B, D-F으로 분류될 수 있으며, 분류에는 협막 항원에 민감한 적혈구를 이용한 수동적 적혈구 응집 반응 검사를 이용한다. 혈청군 A(히아루론산), D(헤파린) 및 F(콘드로이틴) 캡슐에 대한 구조 정보가 보고되어 있으며, 각각은 널리 알려진 글리코스아미노글리칸의 실례이다. 체강(LPS) 유형 또한 균주의 확인에 사용될 수 있으며, 2개의 주요 시스템이 보고되었다. 나미오카(Namioka) 시스템은 관 응집력 검사에 기초하며 11개 혈청형을 인식할 수 있고, 헤들스톤(Heddleston) 시스템은 겔 확산 침전법을 이용하며, 16 개 혈청형을 인식할 수 있고, 현재 선호되는 방법이다. Denatured LPS Structures in Vivo It is obvious that this affects the viability of Pm . Recently, three kinds of severely attenuated It was confirmed that each of the Pm strain VP 161 had a single transposon insertion into the gene pm l294 (named waaQ _PM ). This gene was later found to encode heptosyltransferase, resulting in a severely truncated LPS structure when inducing mutations. Also, Pm galE mutations have already been produced and structural analysis of LPS has not been reported, but attenuation in mice has also been made. Pm isolates can be classified into five serogroups A, B, and DF based on capillary antigens, using a passive erythrocyte agglutination test with red blood cells sensitive to the capillary antigen. Structural information has been reported for serogroup A (hyaluronic acid), D (heparin), and F (chondroitin) capsules, each of which is a well-known example of glycosaminoglycans. Body cavity (LPS) type can also be used to identify strains, two main systems being reported. The Namioka system is based on vascular cohesion testing and can recognize 11 serotypes, and the Heddleston system uses gel diffusion sedimentation, can recognize 16 serotypes, and is currently preferred That's how.

1981 년, P. 멀토시다 혈청형의 확인을 위한 표준 시스템이 문자 A, B, D, E 및 F로 표시된 카터(Carter 협막 유형)과 숫자로 표시된 헤들스톤 체강 유형 시스템 둘 다를 사용할 것이 권고되었다. Pm은 중합체 O-항원을 갖지 않는 LPS 분자들, 소위 비정제 LPS를 발현시킨다. 최근, 본 출원인들은 비정제 LPS 구조를 보이는 게놈 균주 Pm70의 LPS 구조를 분석하였다. 상기 연구에서도 LPS는 분자의 Kdo 영역에 변이가 있는 것으로 나타났다. 이 연구는 Pm LPS 구조에 대해 보다 많은 것을 관찰하고 이 균주 내에 Kdo 영역의 가변성이 존재할 수 있는지를 알아 보기 위해 다른 Pm 균주로, 매우 독성이 강한 혈청형 A: 1 균주인 VP161에 대해 실시하였다. 본 출원인은 앞서 VP 161에서 헵토실트랜스퍼라제 돌연변이의 코어 OS의 특성을 조사한 바 있으며, 본원에는 LPS 분자의 Kdo 영역 내 새로운 배열을 비롯한 LPS의 완전한 구조를 보고한다. In 1981, it was recommended that standard systems for the identification of P. multocida serotypes use both Carter (Carter's capsular type), denoted by the letters A, B, D, E, and F, and the numbered Hedstone Celiac type system. . Pm expresses LPS molecules without a polymer O-antigen, so-called crude LPS. Recently, Applicants have analyzed the LPS structure of genomic strain Pm70 showing an unrefined LPS structure. The study also showed that LPS had mutations in the Kdo region of the molecule. This study Observe more about the Pm LPS structure and see if there may be variability in the Kdo region within this strain. Pm strain was performed against VP161, a highly toxic serotype A: 1 strain. Applicants have previously investigated the characteristics of the core OS of the heptosyltransferase mutant at VP 161, which reports the complete structure of the LPS, including a new arrangement in the Kdo region of the LPS molecule.

실험Experiment

배지 및 생장 조건 Medium and growth conditions

P. 멀토시다 균주 VP 161를 먼저 초콜릿 한천 평판(37 ℃)에서 16 시간 동안 생장시키고, 생장물은 β NAD(Sigma N-7004)(최종 농도 5 ug/㎖), haemin(Sigma H-2250)(최종 농도 5 ug/㎖) 및 1% 글루코스(10 g)이 보충된 뇌-심장 침출(brain-heart infusion, BHI) 배지 1 L를 접종하는데 사용하였다. 이어서, 37 ℃, 200 rpm에서 6 시간 동안 배양하고 발효기를 접종하는데 사용하였다. 다음으로, P. 멀토시다 균주 VP161을 BHI 액체 배지 24 L 내 28 L 발효기에서 18 시간 동안(37 ℃, 20% DO 포화도) 생장시켰다. 페놀을 2%까지 첨가하여 세포를 죽이고, 페놀 처리 3 시간 후, 히알루론산 분해 효소(Roche 제제) 1 g를 첨가하고, 1시간 동안 교반한 후 Sharples 연속 흐름 원심분리(∼210 g)에 의해 세포를 수거하였다. P. multocida strain VP 161 was first grown on a chocolate agar plate (37 ° C.) for 16 hours, and the growth was β NAD (Sigma N-7004) (final concentration 5 ug / ml), haemin (Sigma H-2250). ) (Final concentration 5 ug / ml) and 1 L glucose (10 g) were used to inoculate 1 L of brain-heart infusion (BHI) medium. It was then incubated at 37 ° C., 200 rpm for 6 hours and used to inoculate the fermentor. Next, P. multocida strain VP161 was grown for 18 hours (37 ° C., 20% DO saturation) in a 28 L fermenter in 24 L of BHI liquid medium. Add 2% phenol to kill cells, and after 3 hours of phenol treatment, add 1 g of hyaluronic acid degrading enzyme (Roche formulation), stir for 1 hour, and then mix the cells by Sharples continuous flow centrifugation (˜210 g). Was collected.

지질다당류의 단리, 정제 및 분해 Isolation, Purification and Degradation of Lipopolysaccharides

P. 멀토시다 세포들(-210 g wet wt.)을 동결건조시켜 약 56 g을 얻었다. 동결건조시킨 세포들을 유기 용매들(I x 에탄올, 2 x 아세톤, 2 x 경유 에테르)로 세척하여 지질 및 다른 친지질 성분들을 제거하고 LPS 추출 효율을 향상시켰다. 세척한 세포들(10g∼42g)을 고온 페놀/물 방법으로 추출하고, 수성상을 합친 뒤 48 시간 동안 물을 흘려보내며 투석하였다. 회수물을 동결 건조시켜 약 1.6 g을 얻고, 이를 물에 2% 용액으로 만들어 DNase 및 RNase로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리한 후 단백질가수분해 효소 K로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 작은 펩티드를 투석에 의해 제거하였다. 동결 건조시킨 후, 회수물(약 0.2 g)을 물에 2 % 용액으로 만들고, 8,000 g에서 15 분 동안 원심분리한 후(8K 펠릿 약 85 ㎎), 상층액을 100,000 g에서 5 시간 동안 추가로 원심분리하였다. 정제된 LPS를 함유한 펠릿을 재용해시키고, 동결건조시켰다(약 17 ㎎). 8K 펠릿 물질(약 40 ㎎)을 37 ℃에서 1 시간 동안 무수 히드라진으로 교반하며 처리하여 O-탈아실화 LPS(LPS-OH)을 얻었다. 빙욕을 이용하여 반응을 냉각시키고, 서서히 차가운 아세톤(-70 ℃, 5 vols.)을 첨가하여 과량의 히드라진을 파괴하고, 침전된 LPS-OH을 원심분리하고, 재용해한 펠릿(약 35 ㎎)을 동결건조시켰다. 이어서, 샘플을 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 정제하고, 개개의 분획을 동결건조시켰다. 8K 펠릿 물질(약 45 ㎎) 및 LPS(약 17 ㎎)을 따로 1% 아세트산(10 ㎎/㎖, 100 ℃, 1.5 시간) 으로 처리하여 코 어 올리고당(OS)을 분리하고, 불용성 지질 A를 원심분리(5,000 x g)에 의해 제거하였다. 그리고나서, 8K 펠릿으로부터 얻은 동결건조시킨 OS 샘플을 앞서 기재한 바와 같이 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 추가로 정제하였다. LPS-OH(약 12 ㎎)을 4N KOH로 125 ℃에서 16 시간 동안 처리하여 완전히 탈아실화한 LPS를 분리한 후 중화하고, 음이온 교환 액체 크로마토그래피로 분류하였다. P. multocida cells (-210 g wet wt.) Were lyophilized to yield about 56 g. Lyophilized cells were washed with organic solvents (I x ethanol, 2 x acetone, 2 x light ether) to remove lipids and other lipophilic components and to improve LPS extraction efficiency. The washed cells (10g-42g) were extracted by hot phenol / water method, and the aqueous phases were combined and dialyzed with running water for 48 hours. The recovered product was lyophilized to obtain about 1.6 g, which was made into a 2% solution in water, treated with DNase and RNase for 4 hours at 37 ° C, and then treated with proteolytic enzyme K at 37 ° C for 4 hours. Small peptides were removed by dialysis. After freeze-drying, the recovery (about 0.2 g) was made into a 2% solution in water, centrifuged at 8,000 g for 15 minutes (8K pellets about 85 mg), and then the supernatant was further added at 100,000 g for 5 hours. Centrifuged. Pellets containing purified LPS were redissolved and lyophilized (about 17 mg). 8K pellet material (about 40 mg) was treated with anhydrous hydrazine for 1 hour at 37 ° C. to obtain O-deacylated LPS (LPS-OH). Cool the reaction using an ice bath, slowly add acetone (-70 ° C., 5 vols.) To destroy excess hydrazine, centrifuge the precipitated LPS-OH, and re-dissolve the pellet (about 35 mg). Was lyophilized. Samples were then purified on Bio-Gel P-2 columns and individual fractions were lyophilized. 8K pellet material (about 45 mg) and LPS (about 17 mg) were separately treated with 1% acetic acid (10 mg / ml, 100 ° C., 1.5 hours) to separate core oligosaccharides (OS) and centrifuged insoluble lipid A Removed by separation (5,000 × g). The lyophilized OS samples obtained from 8K pellets were then further purified on Bio-Gel P-2 columns as described above. LPS-OH (about 12 mg) was treated with 4N KOH at 125 ° C. for 16 hours to separate completely deacylated LPS, then neutralized and classified by anion exchange liquid chromatography.

분석 방법 Analytical Method

당을 GLC-MS에 의해 알디톨 아세테이트 유도체로 결정하였다. 샘플들을 4 M 트리플루오로 아세트산으로 100 ℃에서 4 시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물을 H₂O에서 16 시간 동안 환원시키고(NaBD₄), 촉매로 잔류 아세트산 나트륨을 이용하여 100 ℃에서 2 시간 동안 무수 아세트산으로 아세틸화하였다. GLC-MS에는 30 M DB-17 모세관 컬럼(180 ℃ - 260 ℃, 3.5 ℃/min)이 장착되어 있었으며, MS는 Varian Saturn II 질량 분광기의 전자 충격 모드에서 수행하였다. NaOH / DMSO /요오드화 메틸 방법으로 메틸화 분석을 수행하고 GLC-MS에 의해 분석하였다. 부틸 글리코사이드 유도체의 GLC 분석에 의해 절대적인 구조를 결정하였다. Sugars were determined by GLC-MS as alditol acetate derivatives. Samples were hydrolyzed with 4 M trifluoro acetic acid at 100 ° C. for 4 hours. The hydrolyzate was reduced for 16 hours in H ₂ O (NaBD ₄ ) and acetylated with acetic anhydride at 100 ° C. for 2 hours using residual sodium acetate as catalyst. GLC-MS was equipped with a 30 M DB-17 capillary column (180 ° C.-260 ° C., 3.5 ° C./min) and MS was performed in the electron impact mode of a Varian Saturn II mass spectrometer. Methylation analysis was performed by NaOH / DMSO / methyl iodide method and analyzed by GLC-MS. The absolute structure was determined by GLC analysis of the butyl glycoside derivatives.

질량 스펙트럼 분석 Mass spectral analysis

0.5% 아세트산을 함유한 25% 수성 아세토니트릴 중에 샘플을 직접 주입하여 VG Quattro 질량 분광기(Micromass, Manchester, U.K.)의 음이온 모드에서 ESIMS를 수행하였다. 미세분사 계면을 통해 API 3000 질량 분광기(Applied Bio시스템 / Sciex, Concord, Canada)에 결합시킨 Prince CE 시스템(Prince Technologies, The Netherlands) 상에서 모세관 전기영동(CE)-MS을 수행하였다. 외장 용액(이소프로판올-메탄올, 2:1)을 유속 1 ㎕/분으로 낮은 정체 부피 탑관(250㎛ i.d., Chromatographic Specialties)에 옮겼다. 모든 수성 용액을 사용하기 전 0.45-㎛ 필터(Millipore) 를 통해 여과하였다. 전자 분사 스테인레스 니들(27 gauge)을 낮은 정체부피 탑관에 대해 돌출시켜 외장 용액애 모세관 컬럼 말단으로 이동할 수 있게 하였다. 5% 메탄올을 함유한 탈이온수(pH 9.0) 중의 10 mM 암모늄 아세테이트/수산화 암모늄을 사용하여 약 90 cm 길이의 속이 빈 융합 실리카 모세관에서 분리하였다. 주입에는 관례적으로 20 kV 전압이 인가되었다. 모세관의 출구는 레이저 풀러(Sutter Instruments)를 사용하여 대략 15 ㎛ i.d로 테이핑하였다. 전체 질량 스캔 모드에서 1 m/z 단위 단계 당 3.0 ms의 체류 시간으로 질량 스펙트럼을 얻었다. MS/MS 데이터는 1 m/z 단위 단계 당 1.0 ms의 체류 시간으로 얻었다. RF-유일 사중극자 충돌 세포에서 질소와 선택된 전구체 이온의 충돌 활성화에 의해 형성된 파편 이온들을 제3의 사중극자를 스캐닝하여 질량 분석하였다. ESIMS was performed in anion mode of a VG Quattro mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) by directly injecting the sample in 25% aqueous acetonitrile containing 0.5% acetic acid. Capillary electrophoresis (CE) -MS was performed on a Prince CE system (Prince Technologies, The Netherlands) coupled to an API 3000 mass spectrometer (Applied Biosystem / Sciex, Concord, Canada) via a microspray interface. The external solution (isopropanol-methanol, 2: 1) was transferred to a low static volume column (250 μm id, Chromatographic Specialties) at a flow rate of 1 μl / min. All aqueous solutions were filtered through a 0.45-μm filter (Millipore) before use. Electron sprayed stainless needles (27 gauge) were projected against the low stagnation volume column to allow movement to the capillary column ends in the sheath solution. 10 mM ammonium acetate / ammonium hydroxide in deionized water (pH 9.0) containing 5% methanol was used to separate in a hollow fused silica capillary tube about 90 cm long. The injection was customarily applied with a 20 kV voltage. The outlet of the capillary was taped to approximately 15 μm id using a laser puller (Sutter Instruments). Mass spectra were obtained with a dwell time of 3.0 ms per 1 m / z unit step in full mass scan mode. MS / MS data was obtained with a dwell time of 1.0 ms per 1 m / z unit step. Fragment ions formed by collision activation of nitrogen and selected precursor ions in RF-only quadrupole impingement cells were subjected to mass spectrometry by scanning a third quadrupole.

핵자기 공명 Nuclear magnetic resonance

5 mm 또는 3 mm 트리플 공명(¹H, ¹³C, ³¹P) 탐침을 사용하여 Varian Inova 400, 500 및 600 MHz 분광기들 상에서 NMR 실험을 수행하였다. 동결건조시킨 당 샘플을 99% D₂O 600 ㎕(5mm) 또는 140 ㎕(3mm)에 용해시켰다. 실험은 25 ℃에서 수행하였으며, HOD(중수소 H₂O) 신호 억제는 4.78 ppm이었다. 아세톤의 메틸 공명을 내 부 참조표로 사용하였으며 ¹H 스펙트럼의 경우는 2.225 ppm을 ¹³C 스펙트럼의 경우에는 31.07 ppm이었다. Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³C-¹H HSQC, ¹³C-¹H HSQC-TOCSY 및 ¹³C-¹H HMBC로부터 얻은 표준 동종핵 및 이종핵 관련 2D 펄스를 일반적인 지정에 사용하였다. Varian Inova 200 분광기 상에서 1D ³¹P 실험을 수행하였으며, 스위프 폭(sweep width)은 40 ppm이었고, 20000 과도 전류와 획득 시간은 1.6 s이었다. 6 시간 동안 Varian Inova 400 분광기 상에서 2D ¹H-³¹P HSQC 실험을 수행하였다. 커플링 상수는 일련의 1D-HSQC 실험을 수행하여 10 Hz에서 최적화하였다. 스위프 폭은 F2(¹H) 크기에서는 6.0 ppm이었고, Fl(³¹P) 크기에서는 16.2 ppm이었다. 이완 지연 중의 물의 예비 포화도는 1.5 s이었고, t2에서 획득 시간은 0.21 s이었으며, 증분 당 180(HMQC) 스캔으로 32 증분을 얻었다. HSQC 실험과 동일한 파라미터를 사용하여 8 시간 동안 Varian Inova 400 분광기 상에서 2D ¹H-³¹P HSQC-TOCSY 실험을 수행하였으며, TOCSY 혼합시간은 150 ms이었다. NMR experiments were performed on Varian Inova 400, 500 and 600 MHz spectroscopy using 5 mm or 3 mm triple resonance ( ¹ H, ¹³ C, ³¹ P) probes. Lyophilized sugar samples were dissolved in 600 μl (5 mm) or 140 μl (3 mm) of 99% D ₂ O. The experiment was performed at 25 ° C., and HOD (deuterium H ₂ O) signal inhibition was 4.78 ppm. The methyl resonance of acetone was used as an internal reference table, with 2.225 ppm for the ¹ H spectrum and 31.07 ppm for the ¹³ C spectrum. Standard homonuclear and heteronuclear related 2D pulses from Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³ C- ¹ H HSQC, ¹³ C- ¹ H HSQC-TOCSY and ¹³ C- ¹ H HMBC were used for general designation. 1D ³¹ P experiments were performed on a Varian Inova 200 spectrometer, the sweep width was 40 ppm, the 20000 transient and the acquisition time was 1.6 s. 2D ¹ H- ³¹ P HSQC experiments were performed on a Varian Inova 400 spectrometer for 6 hours. Coupling constants were optimized at 10 Hz by performing a series of 1D-HSQC experiments. The sweep width was 6.0 ppm in the F2 ( ¹ H) size and 16.2 ppm in the Fl ( ³¹ P) size. The preliminary saturation of water during the relaxation delay was 1.5 s, the acquisition time at t2 was 0.21 s, and 32 increments were obtained with 180 (HMQC) scans per increment. The 2D ¹ H- ³¹ P HSQC-TOCSY experiment was performed on a Varian Inova 400 spectrometer for 8 hours using the same parameters as the HSQC experiment, and the TOCSY mixing time was 150 ms.

결과 및 분석Results and analysis

P. 멀토시다 균주 VP 161의 조사 Investigation of P. multocida strain VP 161

정제된 LPS 및 8K 펠릿 물질의 당분석 결과, 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal) 및 L-글리세로-D-만노-헵토스(LD-Hep)가 대략 2:1:4의 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 소량의 N-아세틸-글루코사민(GlcNAc) 또한 확인되었다. 부틸-글리코사이 드로부터 유도된 코어 올리고당(OS)의 GLC 분석에서는 Glc 및 Gal이 D-이성질체로 밝혀졌다. Sugar analysis of purified LPS and 8K pellet material showed glucose (Glc), galactose (Gal) and L-glycero-D-manno-heptose (LD-Hep) in a ratio of approximately 2: 1: 4. Appeared. Small amounts of N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) were also identified. GLC analysis of core oligosaccharides (OS) derived from butyl-glycosides revealed that Glc and Gal were D-isomers.

LPS-OH를 발효기 생장 세포들의 LPS로부터 제조하고 CE-MS에 의해 분석하였다(실시예 4 표 1). 가장 작은 분자의 경우 2PCho, 4Hep, 3Hex, 2Kdo, 지질 A-OH 조성에 해당하는 3가 이온들이 m/z 992.0, 999.0 및 1040.0에서 관찰되었다. 이후 밝혀지는 바와 같이, 그중 큰 단백당형들은 제2의 Kdo 잔기 대신의 포스페이트 분자, 코어 올리고당의 하나 이상의 6탄당 잔기 및 가장 큰 단백당형(m/z 1040.0)의 경우 Kdo-P 상의 추가 PEtn 잔기를 갖는 분자에 대응하였다. 초콜릿 한천 평판에서 생장시킨 후, 추가 단백당형들은 m/z 1033.0 및 1081.0의 3가 이온으로 밝혀졌다(실시예 4 표 1). MS/MS 분석에서는 두개의 다른 지질 A-OH 종이 단백당형 혼합물에서 발견되었는데, 하나는 MS/MS 후 m/z 475.5 및 951.5의 2가 및 1가 이온들에 의해 나타나는 952 amu의 분자 질량을 갖는 기본 종이고, 다른 하나는 MS/MS 후 발견되는 m/z 536.5의 2가 이온의 도움으로 추가 PEtn 잔기를 갖는 종이다(도 27c). O-탈아실화 지질 A 기본 종들(952 amu)은 N-아실화(3-OH C 14:0) 글루코사민 잔기들의 이탄당으로 이루어졌으며, 각각의 잔기는 포스페이트 분자로 치환되어 있다. 큰 지질 A 종들은 3가 이온들 이온 m/z 1033.0, 1040.0 및 1081.0에 대해 생장된 세포들의 플레이트에서만 관찰되었다. 또한, 부분 P-PEtn의 증거가 m/z 219.5의 1가 이온의 도움으로 3가 이온 m/z 1040.0 및 1081.0에 해당하는 단백당들에 대한 MS/MS에서 관찰되었다(도 27c). 이 이온은 m/z 992.0, 999.0 및 1033.0인 3가 이온에 대한 MS/MS에서는 관찰되지 않았다. 또한, MS/MS 실험들은 코어 OS 분자들의 크기를 나타내었다. m/z 992.0의 3가 이온의 경우, 코어 OS 는 m/z 1012.5의 2가 이온에 의해 나타나는 바와 같이 2027 amu 이었다(도 27a). 이는 2Kdo, 2PCho, 4Hep, 3Hex의 조성에 해당한다. m/z 999.0의 3가 이온의 경우, 코어 OS는 m/z 1023.5의 2가 이온에 의해 나타나는 바와 같이 2049 amu 이었다(도 27b). 이는 Kdo, P, 2PCho, 4Hep, 4Hex의 조성에 해당한다. m/z 1040.0의 3가 이온의 경우, 코어 OS 는 m/z 1084.5의 2가 이온에 의해 나타나는 바와 같이 2172에서 관찰되었거나 또는 m/z 536.5의 2가 이온에 의해 나타나는 바와 같이 2049 amu인, 추가 PEtn 잔기를 갖는 기본 지질 A 종에 해당할 것으로 추측되었다(도 27c). 따라서, m/z 1040.0의 이 이온은 m/z 475.5 및 536.5의 두개 지질 A 종에 대해 두개의 진단 2가 이온들이 증명하는 바와 같이 Kdo 상의 P-PEtn 부분 또는 지질 A 상의 추가 PEtn을 갖는 이성질체 단백당형들에 해당한다. 종종, MS/MS 분석에서 Kdo로부터 CO₂가 유실된 증거가 또한 관찰되었다. LPS-OH was prepared from LPS of fermentor growing cells and analyzed by CE-MS (Example 4 Table 1). For the smallest molecules, trivalent ions corresponding to 2PCho, 4Hep, 3Hex, 2Kdo, lipid A-OH compositions were observed at m / z 992.0, 999.0 and 1040.0. As will be found later, the larger protein glycoforms include phosphate molecules instead of the second Kdo residues, one or more hexasaccharide residues of the core oligosaccharide, and additional PEtn residues on Kdo-P for the largest protein glycoform ( m / z 1040.0) Corresponding to a molecule having. After growing on chocolate agar plates, additional protein glycoforms were found to be trivalent ions of m / z 1033.0 and 1081.0 (Example 4 Table 1). In MS / MS analysis, two different lipid A-OH species were found in a protein glycoform mixture, one with a molecular mass of 952 amu represented by divalent and monovalent ions of m / z 475.5 and 951.5 after MS / MS. It is the base species, the other one with additional PEtn residues with the help of the divalent ions of m / z 536.5 found after MS / MS (FIG. 27C). O-deacylated lipid A base species (952 amu) consisted of peat sugars of N-acylated (3-OH C 14: 0) glucosamine residues, each residue substituted with a phosphate molecule. Large lipid A species were observed only in plates of cells grown for trivalent ions ions m / z 1033.0, 1040.0 and 1081.0. In addition, the portion P-PEtn evidence m / z 219.5 1 a with the help of ion trivalent ion m were observed in the MS / MS for the protein corresponding to the per / z 1040.0 and 1081.0 of the (Fig. 27c). This ion was not observed in MS / MS for trivalent ions with m / z 992.0, 999.0 and 1033.0. In addition, MS / MS experiments showed the size of the core OS molecules. For trivalent ions of m / z 992.0, the core OS was 2027 amu, as indicated by the divalent ions of m / z 1012.5 (FIG. 27A). This corresponds to the composition of 2Kdo, 2PCho, 4Hep, 3Hex. For trivalent ions of m / z 999.0, the core OS was 2049 amu as shown by the divalent ions of m / z 1023.5 (FIG. 27B). This corresponds to the composition of Kdo, P, 2PCho, 4Hep, 4Hex. For the trivalent ion of m / z 1040.0, core OS is added to the, 2049 amu, as indicated by the divalent ions or observed in the 2172 or the m / z 536.5 as indicated by the divalent ions of m / z 1084.5 It was assumed to correspond to a basic lipid A species with a PEtn residue (FIG. 27C). Thus, the ion of m / z 1040.0 is isomer protein having additional PEtn on Kdo on the P-PEtn moiety or lipid A as described for two of the diagnostic divalent ions are demonstrated with respect to the longitudinal both lipid A of the m / z 475.5 and 536.5 Corresponds to the molds. Often, evidence of CO ₂ loss from Kdo was also observed in MS / MS analysis.

코어 올리고당 단독(LPS 및 8K 펠릿 물질로부터 유도; 동일한 스펙트럼 생성)에 대한 MS 분석에서 m/z 903.0 및 984.0의 2가 양이온과 다른 프레그먼트화 패턴을 얻었는데, 이는 실시예 4 표 1에서 m/z 902.0 및 983.0의 2가 음이온들에 해당하며, Kdo에 대한 추정 헵토스 잔기(Hep I)에 6 탄당 잔기가 존재하거나 없다. m/z 903의 2가 이온에 대한 MS/MS(도 28a)에서는 Hep I의 Hex 잔기가 없는 프레그먼트화 패턴이 나타났다. m/z 984의 2가 이온에 대한 MS/MS에서는 큰 OS가 상기와 비교했을 때 추가 6탄당 잔기를 갖는 것으로 나타났으며, 이 6탄당 잔기는 m/z 682.0에 2가 이온이 존재하고, 이 신호가 없지만 m/z 903.0의 MS/MS 후 m/z 697.0의 2가 이온이 존재하기 때문에 Hep I 잔기에 위치한다(도 28a). 모든걸 고려하면, 이 데이터는 VP 161 LPS에 의해 생성된 신규한 단백당형 혼합물이 일부는 포스페이트 또는 피로포스포에탄올아민 부분들이 결합된 하나의 Kdo 종을 가지며, 다른 군체는 두개의 Kdo 부분을 가짐을 시사한다. 두개의 Kdo 분자를 갖는 종에서는, 헥소스 잔기가 코어 OS의 인접한 헵토스 잔기에 존재하지 않는데, 이는 이 배열의 생합성이 가능하지 않음을 시사한다. PCho 잔기의 위치 또한 양이온 모드의 이들 MS/MS 실험으로부터 결정하였다. m/z 424.5의 2가 이온은 2PCho, 2Hex, Hep의 조성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이 2가 이온에 대한 후속 MS/MS/MS에서는, m/z 328.5 및 520.5의 1가 이온들이 각각 PCho-Hex 및 PCho-Hex-Hep에 해당하는 것으로 나타나, 두개의 PCho-Hex 부분들이 Hep 잔기에 부착되었음을 시사하였다(도 28c). Core oligosaccharide alone; I at the MS analysis of the (LPS and 8K derived from a pelletized material produced the same spectrum) the two of the m / z 903.0 and 984.0 scored positive and the other fragment is patterned, which m in Example 4. Table 1 / z corresponds to the divalent anions of 902.0 and 983.0, with or without the hexose residue in the putative heptose residue (Hep I) for Kdo. MS / MS for divalent ions of m / z 903 (FIG. 28A) showed a fragmentation pattern without Hex residues of Hep I. MS / MS for the divalent ion of m / z 984 showed that the large OS had an additional hexasaccharide residue when compared to the above, and the hexasaccharide residue had divalent ions at m / z 682.0, and this signal is not located in the Hep I residue since the presence of divalent ion MS / MS after the m / z of 697.0 m / z 903.0 (Fig. 28a). All things considered, this data shows that the novel protein glycoform mixture produced by VP 161 LPS has one Kdo species, some with phosphate or pyrophosphoethanolamine moieties, while the other colonies have two Kdo moieties. Suggests. In species with two Kdo molecules, hexose residues are not present in adjacent heptose residues of the core OS, suggesting that biosynthesis of this configuration is not possible. The location of PCho residues was also determined from these MS / MS experiments in cationic mode. Divalent ions of m / z 424.5 were found to have compositions of 2PCho, 2Hex, Hep, and in subsequent MS / MS / MS for these divalent ions, the monovalent ions of m / z 328.5 and 520.5 were PCho-Hex, respectively. And PCho-Hex-Hep, indicating that two PCho-Hex moieties were attached to the Hep residue (FIG. 28C).

말단 Glc, 6-치환 Glc, 말단 LD-Hep, 2-치환 LD-Hep 및 4,6-2-치환 LD-Hep 이 대략 1:1:1:1:1의 몰비로 존재하고 그보다 더 적은 양의 말단 Gal, 3,4-이치환 LD-Hep 및 3,4,6-3치환 LD-Hep가 관찰되는 분자에 대한 연결 패턴을 결정하기 위해 메틸화 분석을 O-탈아실화 LPS(LPS-OH)에 대해 수행하였다. 가수분해시 포스포릴화 당의 최적의 방출을 배제하는 포스페이트 잔기들을 제거하기 위한 HF 처리 후, 메틸화 분석을 반복하여, t-Gal 잔기를 제외한 동일한 비율로 존재했던 몇몇 당들이 이제는 다른 성분의 양의 2배로 존재함을 알았는데, 이는 PCho 잔기들이 Gal 당들을 치환했음을 시사한다. Terminal Glc, 6-substituted Glc, terminal LD-Hep, 2-substituted LD-Hep and 4,6-2-substituted LD-Hep are present in a molar ratio of approximately 1: 1: 1: 1: 1 and less Methylation analysis was performed on O-deacylated LPS (LPS-OH) to determine the linking pattern for the molecule on which the terminal Gal, 3,4-disubstituted LD-Hep and 3,4,6-3 substituted LD-Hep were observed. Was performed. After HF treatment to remove phosphate residues that exclude optimal release of phosphorylated sugars during hydrolysis, the methylation assay was repeated, so that some sugars that were present at the same ratio except for the t-Gal residues were now present in amounts of 2 of the other components. It was found to be in fold, suggesting that PCho residues substituted Gal sugars.

OS의 정확한 위치 및 연결 패턴을 밝히기 위해, 가장 분석적이고 균일한 스펙트럼을 보이는 OS 분획에 대해 NMR 연구를 실시하였다. OS 샘플의 ¹H 공명의 지정은 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70 및 관련종 만헤이미아 헤몰리티카 및 악티노바실러스 플루로뉴모니애로부터 얻은 구조적으로 관련이 있는 코어 OS를 참고하여 COSY 및 TOCSY 실험에 의해 완수하였다(실시예 4 표 2). 내부 코어 잔기들(Hep IV(f/f')까지) 은 최근 공개된 파스튜렐라 멀토시다 균주 Pm70로부터 얻은 내부 코어에 동일하게 연결되어 있으며, 실시예 4 표 2에 열거된 지정과 일치하였다. 그러나, VP161 코어 OS 내 Hep II(b)의 3-위치에 PEtn 잔기는 존재하지 않았다. 흥미롭게도, 코어 OS 샘플의 경우, Hep I(a)에서의 Glc II 잔기(e)의 존재 또는 부재가 나머지 내부 코어 잔기들에 대한 두 세트의 신호를 확인할 수 있게 해주었다(도 29). 4.64(d) 및 4.51(d')에서 Glc I에 대한 두개 신호는 앞서 기재한 바와 같이 Hep I(a)의 4- 및 6-위치에 대한 NOE 접촉에 의해 확인되었다. 그러나, 4.51 ppm에서 Glc II(e) 및 Glc I 잔기(d')의 아노머 양자 공명들 간의 내부-NOE 접촉이 없는 것으로 인해 Glc II가 없을 때 이 Glc I 잔기(d')에 대한 스핀 시스템을 확인하였다. 반대로, 4.64 ppm에서 Glc II(e) 및 Glc I 잔기(d')의 아노머 양자 공명들 간의 내부-NOE 접촉이 있음으로 인해 Glc II가 존재할 때 이 Glc I 잔기(d)에 대한 스핀 시스템을 확인하였으며(도 29), 이 내부-아노머 NOE 접촉은 앞서 Pm70 및 관련 종 만헤이미아 헤몰리티카 및 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 LPS에서 관찰된 바 있다. 이러한 방법으로, Glc II(e)의 존재 또는 부재에 근거하여 나머지 내부 코어 잔기들을 지정할 수 있다. Hep IV(f/f'에서 6탄당 잔기의 위치 설정 및 확인에 대한 설명이 남아 있다. MS 분석에 따르면, 6탄당 잔기들은 모두 PCho 잔기들로 치환되어 있으며, 모두 Hep IV(f/f'를 치환하고 있는 것으로 나타났다. HF 처리 후 메틸화 분석에서 확인된 t-Gal의 증가된 량은 이와 일치하며, PCho를 갖고 있는 6탄당 잔기가 모두 Gal 당임을 시사한다. 두개의 β-배열 Gal 잔기들, Gal I 및 Gal II를 커플링 상수 및 H-4에 대한 특징적인 스핀 시스템의 도움을 받아 각각 4.70(g) 및 4.66(h) ppm에서 코어 OS 샘플 내에서 확인하였다. Hep IV(f/f'에서 Gal I(g) 및 Gal II(h)의 연결 위치는 NOESY 실험로부터 유추하였는데, Gal I 잔기(g) 가 Hep IV(f)의 4-위치에 연결되어 있고, Gal II 잔기가 Hep IV(f/f'의 6-위치에 연결되어 있다(도 29). 이러한 추론은 ¹³C-¹H-HMBC 실험으로부터 확인되었으며, 또한 코어 OS 내 다른 연결이 확인되었다(도 30). 두개의 PCho 잔기들의 위치를 확인하기 위해, ³¹P-¹H-HSQC 및 ³¹P-¹H-HSQC-TOCSY 실험을 수행하여 각각의 PCho 잔기가 부착된 지점으로 앞서 지정한 각각의 Gal 당의 3-위치를 확인하였다(도 31). 이는 ¹³C-¹H-HMQC 실험에 의해 확인되었는데, 포스포릴화와 일치하는 로우필드 값(-78ppm)에서 각각의 Gal 잔기의 C-3 원자에 의하 화학 시프트가 발견되었다. In order to elucidate the exact location and linking pattern of the OS, NMR studies were conducted on OS fractions showing the most analytical and uniform spectrum. Designation of ¹ H resonances of the sample OS file stew Pasteurella far Toshio the Pm70 strains and related species only Hay Mia Hemolytica and Actinobacillus Note the fluorene structural core OS that is relevant to the obtained from the pneumoniae was accomplished by a by COSY and TOCSY experiments (Example 4 in Table 2). Internal core residues (up to Hep IV (f / f ')) are identically linked to the internal core obtained from the recently published Pasteurella multocida strain Pm70, consistent with the designations listed in Example 4 Table 2. . However, there was no PEtn residue at the 3-position of Hep II (b) in the VP161 core OS. Interestingly, for core OS samples, the presence or absence of Glc II residues (e) in Hep I (a) allowed us to identify two sets of signals for the remaining internal core residues (FIG. 29). Two signals for Glc I at 4.64 (d) and 4.51 (d ') were identified by NOE contact for the 4- and 6-positions of Hep I (a) as described above. However, the spin system for this Glc I residue (d ') in the absence of Glc II due to the absence of internal-NOE contact between the anomer quantum resonances of Glc II (e) and Glc I residue (d') at 4.51 ppm It was confirmed. In contrast, the spin system for this Glc I residue (d) when Glc II is present due to the internal-NOE contact between the anomer quantum resonances of the Glc II (e) and Glc I residue (d ') at 4.64 ppm It was confirmed (Fig. 29), the inner-anomeric NOE contacts previously only Pm70 and related species Hay Mia Hemolytica and Actinobacillus It has been observed in LPS of Pluronyumonia. In this way, the remaining internal core residues can be designated based on the presence or absence of Glc II (e). Hex IV (f / f 'remains a description of the positioning and identification of hexasaccharide residues. According to MS analysis, hexasaccharide residues are all substituted with PCho residues, all Hep IV (f / f') The increased amount of t-Gal identified in the methylation analysis after HF treatment is consistent with this, suggesting that all hexose residues with PCho are Gal sugars. Gal I and Gal II were identified in the core OS samples at 4.70 (g) and 4.66 (h) ppm, respectively, with the help of coupling constants and the characteristic spin system for H-4 Hep IV (f / f '). The ligation positions of Gal I (g) and Gal II (h) at were inferred from NOESY experiments, where the Gal I residue (g) is linked to the 4-position of Hep IV (f) and the Gal II residue is Hep IV ( connected to the 6-position of f / f '(FIG. 29) This inference was confirmed from ¹³ C- ¹ H-HMBC experiments, and other connections in the core OS were also found. (FIG. 30) To determine the location of the two PCho residues, ³¹ P- ¹ H-HSQC and ³¹ P- ¹ H-HSQC-TOCSY experiments were performed to specify the point where each PCho residue was attached earlier. The 3-position of each Gal sugar was identified (FIG. 31) This was confirmed by ¹³ C- ¹ H-HMQC experiments, where the C- of each Gal residue was at low field value (-78 ppm) consistent with phosphorylation. A chemical shift was found by three atoms.

분자 내 Kdo 영역의 신규한 배열을 더 조사하기 위해, 탈아실화 샘플을 KOH 처리 후 검사하였다. 한 개 및 두개의 Kdo 잔기를 갖는 완전히 탈아실화한 LPS 분획들을 분리할 수 있었다(도 32a & b). 한 개 및 두개의 Kdo 잔기를 함유한 단백당형이 존재하는 것은 도 32에 명확히 예시되어 있으며, 도 32b의 수평축 및 축 방 향 양자들에 대한 두 세트의 신호들(z_3e 및 z_3a, 및 z'_3e 및 z'_3a)과 비교했을 때 오직 하나의 수평축 및 하나의 축 신호 만이 도 32a의 Kdo H-3 양자들에 대해 확인할 수 있다(z_3e 및 z_3a). 하나의 Kdo 함유 샘플에 대한 완전한 지정만이 가능하였고 부분적인 지정은 소량의 단백당형이 유효하기 때문에 Kdo 잔기 함유 샘플에 대해서만 가능하여, 덜 강한 스펙트럼을 얻었다. 그러나, 두 스펙트럼의 아노머 영역들을 기본적으로 검사하였을 때, 도 32a에서는 Glc II 잔기에 대한 신호가 존재하였으며, 도 32b(두개의 Kdo 잔기가 존재)에서는 이러한 신호가 존재하지 않았다. 코어 OS 데이터에 나타난 바와 같이, Glc II 잔기의 존재 또는 부재는 몇몇 다른 아노머 양자 공명들, 특히 Hep I(a), Hep II(b) 및 Glc I(d) 신호의 화학 시프트에 영향을 미치며, 이는 내부 코어 분자의 배좌에도 영향을 미친다. 하나의 Kdo 잔기를 함유한 단백당형에 대한 지정이 실시예 4 표 2에 상세히 기재되어 있으며, 이는 코어 OS 샘플에 기초한 지정을 확인하고, 하나의 Kdo 함유 단백당형에 대한 Kdo-지질 A 영역을 포함하도록 확장된다. To further investigate the novel arrangement of the intramolecular Kdo region, deacylated samples were examined after KOH treatment. Fully deacylated LPS fractions with one and two Kdo residues could be isolated (FIGS. 32A & b). The presence of protein glycoforms containing one and two Kdo residues is clearly illustrated in FIG. 32, with two sets of signals (z _3e and z _3a , and z for the horizontal and axial quantum quantum of FIG. 32b). _'3e and z' as compared to _3a) can only check for one of the horizontal axis and a-axis signal, only Kdo H-3 proton of Figure 32a (z z _3e and _3a). Only complete assignment of one Kdo containing sample was possible and partial designation was only possible for Kdo residue containing samples because a small amount of protein glycoform was effective, resulting in a less intense spectrum. However, when basically examining the annomeric regions of both spectra, there was a signal for Glc II residues in FIG. 32A and no such signal in FIG. 32B (two Kdo residues present). As shown in the core OS data, the presence or absence of Glc II residues affects chemical shifts of several other anomer quantum resonances, in particular Hep I (a), Hep II (b) and Glc I (d) signals. This also affects the coordination of internal core molecules. Designations for protein glycoforms containing one Kdo residue are detailed in Example 4 Table 2, which identifies the designations based on the core OS samples and includes the Kdo-lipid A region for one Kdo-containing protein glycoform. To expand.

파스튜렐라 멀토시다(Pm)의 VP 161 균주의 올리고당을 구조 분석한 결과, Pm의 게놈 균주 Pm70 및 관련 종 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mh), 악티노바실러스 플루로뉴모니애(App)에 대해 앞서 결정한 LPS 코어 올리고당 구조들과 유사하거나 다른 구조를 보였다. 각각의 경우, 코어 OS는 Kdo 잔기에 부착된 동일하게 연결되 트리-헵토실 단위를 갖고 있다. Pm70에서는 흥미롭게, HepII 잔기의 3-위치가 대부분의 경우 PEtn 잔기로 치환되어 있는 반면, 균주 VP161 및 관련 종 App 및 Mh에서는 어떠한 내부 코어 PEtn 잔기도 관찰되지 않았다. PEtn으로 Hep II가 치환된 변동만 제외하면, Pm 균주들과 관련된 수의학적 종 Mh 및 App는 비교적 보존된 보존된 내부 코어 구조를 공유하고 있다. Pm의 내부 코어 구조에 있어서 유일한 차이점은 App 및 Mh 에서 발견되는 D-글리세로-D-만노 배열 헵토스 잔기에 비교했을 때 Hep I의 Glc I 잔기로부터 연장된 부분에서 L-글리세로-D-만노 배열 헵토스 잔기가 발견된 것과, Pm 내핵에 Glc II 잔기가 가변적으로 존재하는 것인데, 이는 분자의 Kdo 영역의 가변성 때문이다. 이 Glc II 잔기는 App 및 Mh의 내부 코어 LPS에서 화학량론적으로 발견되었다. 이 보존된 내부 코어 영역 이외에서의 다른 연장부가 균주 VP161에서 관찰되었으며, 이로써 Hep IV 잔기는 4- 및 6-위치에서 두개의 PCho-Gal 부분들로 이치환되었다. 본 출원인이 알고 있는 바에 따르면, 이러한 구조 배열은 이전에는 관찰된 바 없다. 동일한 LPS 분자에서 두개의 PCho 잔기가 발견되는 것은 드문 일로, 유형을 결정할 수 없는 Hi 캐리지 균주 11 및 16가 이러한 배열의 예로 유일하게 보고되어 있다. PCho 잔기들의 존재는 Pm 생물의 독성에 연루되었을 수 있으며, 호흡관 내 점착 및 콜로니 형성에서 PCho의 역할이 보고된 바 있다. 또한, 두개의 PCho 잔기가 부족한 말단이 절단된 LPS 구조를 갖는 균주 VP 161의 돌연변이는 쥐 모델과 닭에서 약독화되었다. 다른 저자에 의한 이전 연구에서, Pm의 galE 돌연변이 혈청형 D 균주의 독성 저하가 관찰되었는데, 이는 LPS 구조의 변화에 따른 것일 수 있다. 그러나, VP 161 LPS 구조의 가장 흥미로운 것은 Kdo 영역에서 관찰된 가변성으로, 하나의 Kdo를 함유한 단백당형과 두개의 Kdo를 함유한 단백당형이 모두 발견된 것이다. 또한, Kdo 영역의 변이에 의해 초래되는 내부 코어 구조에 대한 충격, 즉, Hep I에서의 Glc II의 존재 또는 부재가 흥미롭다. Glc II의 Hep I 잔기로의 이동에 관여하는 α-1,6 글리코실트랜스퍼라제는 알려져 있지 않다. 흥미롭게도, Kdo 트랜스퍼라제들에 대해 오직 하나의 동족체 만이 균주 Pm70의 Pm 게놈에서 확인되었으며, 그의 LPS는 또한 Kdo 한 개 및 Kdo 두개를 함유하는 종의 군체를 갖고 있다는 사실을 알았다. Pm 트랜스퍼라제의 이관능성 본질에 영향을 미칠 수 있는 임의의 서열 차이를 조사하거나 또는 다른 제한 인자가 이 변이에 관여했는지 조사하기 위해 Pm , App 및 Mh 로부터 얻은 Kdo 트랜스퍼라제 유전자들의 서열을 비교한 것이 또한 흥미로웠다. 이 연구로 제2 Pm 균주의 LPS 구조를 확인하였고, 균주들 모두가 유사한 내부 코어 구조를 공유하지만 가변성 외부 코어 장식을 가지며, 둘 다 분자의 Kdo 영역에서 흥미로운 변이를 보였고, 그 의미에 대해서는 추후 더 조사될 것이다. As a result of structural analysis of oligosaccharide of VP 161 strain of Pasteurella multocida (Pm), Pm genome of the strain and related species Pm70 but hey Mia Molly H. Tikka (Mh), similar to a bad flu Tino Bacillus pneumoniae (App) previously determined LPS core oligosaccharide structures on or had a different structure. In each case, the core OS has identically linked tri-heptosyl units attached to Kdo residues. Interestingly in Pm70, the 3-position of the HepII residue was in most cases replaced by a PEtn residue, whereas no internal core PEtn residue was observed in strain VP161 and related species App and Mh . Except for the variation where Hep II is substituted by PEtn, Veterinary species Mh and App associated with Pm strains share a relatively conserved conserved internal core structure. The only difference in the internal core structure of Pm is L-glycero-D at the portion extending from the Glc I residue of Hep I as compared to the D-glycero-D-manno sequence heptose residue found in App and Mh . A manno sequence heptose residue was found, The variable presence of Glc II residues in the Pm inner nucleus is due to the variability of the Kdo region of the molecule. This Glc II residue was found stoichiometrically in the inner core LPS of App and Mh . Extensions other than this conserved inner core region were observed in strain VP161, whereby Hep IV residues were disubstituted into two PCho-Gal moieties at the 4- and 6-positions. As known to the applicant, this structural arrangement has not been observed before. It is rare for two PCho residues to be found in the same LPS molecule, and Hi carriage strains 11 and 16, which cannot be typed, are the only reported examples of this arrangement. The presence of PCho residues It may have been implicated in the toxicity of Pm organisms and the role of PCho in adhesion and colony formation in the respiratory tract has been reported. In addition, mutations in strain VP 161 with truncated LPS structures lacking two PCho residues were attenuated in mouse models and chickens. In previous studies by other authors, Decreased toxicity of the galE mutant serotype D strain of Pm was observed, which may be due to changes in LPS structure. However, the most interesting of the VP 161 LPS structure is the variability observed in the Kdo region, in which both Kd-containing protein glycoforms and Kd-containing protein glycoforms were found. Also of interest is the impact on the internal core structure caused by the variation of the Kdo region, ie the presence or absence of Glc II in Hep I. Α-1,6 glycosyltransferases involved in the migration of Glc II to Hep I residues are not known. Interestingly, only one homologue for Kdo transferases was present in strain Pm70. It was identified in the Pm genome and found that its LPS also had a colony of species containing one Kdo and two Kdo. Comparing the sequences of Kdo transferase genes obtained from Pm , App and Mh to investigate any sequence differences that may affect the bifunctional nature of Pm transferase or to determine if other limiting factors were involved in this mutation. It was also interesting. 2nd by this study The LPS structure of the Pm strain was identified and all of the strains share a similar inner core structure but have a variable outer core decoration, both showing interesting variations in the Kdo region of the molecule, and their meaning will be investigated further.

실시예Example 5 5

이 실시예는 문헌 [Carbohydrate Research 340, 1253(2005)]에 공개된 것을 토대로 구성되었다. 파스튜렐라 멀토시다 균주 X73로부터 코어 올리고당의 구조 분석.This example was constructed based on what is disclosed in Carbohydrate Research 340, 1253 (2005). Structural analysis of core oligosaccharides from Pasteurella multocida strain X73.

이 실시예에서는 파스튜렐라 멀토시다 균주 X73로부터 얻은 코어 올리고당 영역의 구조에 대해 설명하였다. 지질다당류를 여러가지 분해 과정에 적용하였다. 정제된 올리고당의 구조는 단당류 및 메틸화 분석, NMR 스펙트럼 분석 및 질량 스펙트럼 분석에 의해 결정하였다. 하기 구조는 다른 P. 멀토시다 균주 VP 161로부터 최근 확인된 올리고당과 유사한 구조를 나타내지만 말단 갈락토스 잔기들에 포스포에탄올아민 부분들이 추가로 대칭적으로 치환되어 있다. ,In this example, the structure of the core oligosaccharide region obtained from Pasteurella multocida strain X73 has been described. Lipopolysaccharides have been subjected to various degradation processes. The structure of the purified oligosaccharides was determined by monosaccharide and methylation analysis, NMR spectral analysis and mass spectral analysis. The structure below shows a structure similar to the oligosaccharides recently identified from other P. multocida strain VP 161, with the phosphoethanolamine moieties further symmetrically substituted at the terminal galactose residues. ,

상기에서, NMR 데이터에 기초하여, 모든 당들은 피라노스 고리 형태로 발견되었으며, Kdo는 2-케토-3-데옥시-옥툴로손산이고, L,D-α-Hep은 L-글리세로-D-만노-헵토스이고, PEtn는 포스포에탄올아민이며, PCho는 포스포콜린이다. In the above, based on the NMR data, all sugars were found in the form of pyranose rings, Kdo is 2-keto-3-deoxy-octulonic acid, and L, D-α-Hep is L-glycero-D -Manno-heptose, PEtn is phosphoethanolamine and PCho is phosphocholine.

파스튜렐라 멀토시다(Pm)는 그램-음성 박테리아이며, 식용 동물 및 인간에서 심각한 질병을 초래하는 다종 병원균이다. 게놈 균주 Pm70 및 독성 혈청형 A:1 균주 VP 161로부터 얻은 지질다당류(LPS)의 구조 분석에서 가변성 외부 코어 OS구조를 갖는 보존된 내부 코어 올리고당(OS) 구조가 발견되었다. 이 연구는 다른 독성 혈청형 A 균주 X73에 대해 수행하였으며, 정제된 LPS 생성물의 구조 분석에서는 균주 VP 161와 유사하지만, 외부 코어 OS에 대해 추가의 대칭성 포스포릴화 패턴을 갖는 OS 구조가 나타났다. 균주 X73로부터 얻은 정제된 LPS 및 8K 펠릿 물질의 당 분석은 당 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal) 및 L-글리세로-O-만노-헵토스(LD-Hep)를 대략 2:1:4의 비율로 함유하는 균주 VP 161와 유사한 프로필을 보였다. O-탈아실화 LPS(LPS-OH)를 발효기에서 생장시킨 세포들로부터 제조하고, CE-MS에 의해 분석하였다(실시예 5 표 1). 균주 VP161에 대해 관찰된 것과 유사한 질량 프로필이 관칠되었으나 주요 종들은 m/z 1081.0의 3가 이온이었으며, 이들은 VP161 LPS-OH로부터 얻은 가장 우세한 종(m/z 999.0)과 비교했을 때 두개의 추가 PEtn 잔기들에 대응하였다. MS/MS 분석에서는 모든 지질 A 분자들이 N-아실화(3-OH C 14:0) 글루코사민 잔기들의 이탄당으로 이루어진 기본종인 것으로 밝혀졌으며, 각각의 잔기는 m/z 475.5 및 951.5의 2가 및 1가 이온에 의해 알 수 있는 바와 같이 분자량이 952 amu인 포스페이트 분자로 치환되었다. 따라서, MS/MS 분석에서 균주 X73 내 추가 PEtn 잔기들은 LPS 분자의 코어 OS 영역에 존재하는 것으로 나타났으며, 코어 OS 분자의 예상되는 질량은 실시예 5 표 1에 기재되어 있다. Pasteurella multocida ( Pm ) is a gram-negative bacterium and a multi-pathogen causing serious disease in food animals and humans. Structural analysis of lipopolysaccharide (LPS) from genomic strain Pm70 and toxic serotype A: 1 strain VP 161 found conserved internal core oligosaccharide (OS) structures with variable outer core OS structures. This study was performed on another virulent serotype A strain X73, and the structural analysis of the purified LPS product revealed an OS structure similar to strain VP 161 but with an additional symmetric phosphorylation pattern for the external core OS. Sugar analysis of purified LPS and 8K pellet material from strain X73 revealed sugar glucose (Glc), galactose (Gal) and L-glycero-O-manno-heptose (LD-Hep) of approximately 2: 1: 4. It showed a profile similar to strain VP 161 containing in proportion. O-deacylated LPS (LPS-OH) was prepared from cells grown in the fermentor and analyzed by CE-MS (Example 5 Table 1). Mass profiles similar to those observed for strain VP161 were observed, but the main species were trivalent ions of m / z 1081.0, which were two additional PEtn compared to the most predominant species ( m / z 999.0) obtained from VP161 LPS-OH. Corresponding residues. MS / MS analysis revealed that all lipid A molecules are base species consisting of peat sugars of N-acylated (3-OH C 14: 0) glucosamine residues, each residue having a divalent and a bivalent of m / z 475.5 and 951.5. As can be seen by the monovalent ions, it was substituted with a phosphate molecule having a molecular weight of 952 amu. Thus, MS / MS analysis showed that additional PEtn residues in strain X73 are present in the core OS region of the LPS molecule, and the expected mass of the core OS molecule is described in Example 5 Table 1.

코어 올리고당 단독에 대한 MS 분석에서, LPS-OH 데이터로부터 추론된 조성물들과 일치하는 일련의 이온들이 확인되었으며, 이들은 균주 VP 161에 비교했을 때 PEtn 잔기들이 존재함을 나타냈다. PEtn 잔기들의 위치는 양이온 모드의 MS/MS 실험들로부터 결정하였다. 가장 큰 단백당형에 해당하는 m/z 1108의 2가 이온의 분열로 m/z 183.5⁺(PCho), 450.5⁺(PCho-Hex-PEtn), 547.52⁺(2PCho, 2PEtn, 2Hex, Hep) 및 916.5²⁺(M-Kdo-Hex) 비롯한 몇몇 생성물 이온들을 얻었다. m/z 547.5²⁺ 에서의 2가 이온은 균주 VP 161에서 m/z 424²⁺에서 관찰되는 2가 이온과 비교할 때 특히 더 흥미로운데, 이는 질량이 246 amu 보다 큰 단백당형이 두개의 PEtn 잔기들을 가짐을 나타낸다. m/z 916.5²⁺의 2가 이온에 대한 MS/MS/MS 분석 결과 도 33a에 도시된 생성물 이온 스펙트럼을 얻었다. 도 33a에 제시된 프레그먼트화 패턴으로 PEtn 잔기들을 Hep 잔기 상의 말단 Hex-PCho 부분들에 배치할 수 있으며, 이온 m/z 450.5을 프레그먼트화하는 후속 MS/MS/MS 실험(도 33b) 은 이 이온이 처음 추측한 바와 같이 PCho-Hex-PEtn 부분에 해당함을 확인하였다.In MS analysis of the core oligosaccharide alone, a series of ions were identified that matched the compositions inferred from the LPS-OH data, indicating the presence of PEtn residues when compared to strain VP 161. The location of the PEtn residues was determined from MS / MS experiments in cationic mode. Cleavage of divalent ions of m / z 1108 corresponding to the largest protein glycoside, m / z 183.5 ⁺ (PCho), 450.5 ⁺ (PCho-Hex-PEtn), 547.52 ⁺ (2PCho, 2PEtn, 2Hex, Hep) and 916.5 Several product ions were obtained, including ²⁺ (M-Kdo-Hex). The divalent ions at m / z 547.5 ²⁺ are particularly interesting when compared to the divalent ions observed at m / z 424 ²⁺ in strain VP 161, which are two PEtn residues with protein glycosides of mass greater than 246 amu. Indicates that they have m / z 916.5 ²⁺ MS / MS / MS analysis of divalent ions gave the product ion spectrum shown in FIG. 33A. The fragmentation pattern shown in FIG. 33A allows PEtn residues to be placed in the terminal Hex-PCho moieties on the Hep residue and subsequent MS / MS / MS experiments to fragment ion m / z 450.5 (FIG. 33B). It was confirmed that this ion corresponds to the PCho-Hex-PEtn part as initially estimated.

이러한 추론을 확인하고 확대하기 위해, PEtn 잔기들 모두를 갖는 분류된 코어 OS 샘플에 대한 NMR 실험을 수행하였다(MS 의해 결정-데이터 도시 안됨). 두개의 말단 갈락토스 잔기들과 별개로, 모든 지정은 균주 VP 161로부터 얻은 코어 OS와 동일하였다. 갈락토스 잔기들의 H-1 및 H-2 공명에 대한 화학 시프트는 VP 161 샘플에서 관찰된 바와 같지만, H-3 및 H-4 공명들은 4.17 및 4.12에서 4.21 및 4.17 ppm으로 약간 다운 필드로 이동하였다. H-5 잔기에 대한 내부-NOE 접촉이 균주 VP161의 3.80 및 3.76 ppm에 대립되게 3.94 ppm에서 관찰됨에도 불구하고 갈락토스 잔기들로부터의 내부-NOE 접촉은 앞서 관찰된 바와 같다(실시예 5 표 2). 두개의 PEtn 잔기들의 위치를 확인하기 위해, ³¹P-¹H-HSQC 실험을 수행하여 각각의 PEtn 잔기의 부착 지점으로 4.07 ppm에서 공명을 확인하였고, 뒤이은 ³¹P-¹H-HSQC-TOCSY 실험에서는 3.94 ppm에서 갈락토스 잔기의 H-5 공명을 확인하였다(도 34). 갈락토스 잔기의 H-6 공명로 4.07 ppm을 지정한 것이 -CH₂ 부분의 특징적인 양성 피 크로 확인한 ¹³C-¹H-HMQC 실험에서 입증되었으며, 로우 필드 값(-65 ppm)에서 각 Gal 잔기의 C-6 원자의 다운 필드 화학 시프트는 포스포릴화와 일치하였다. 마지막으로, ¹³C-¹H-HMQC-TOCSY 실험에 의해, C-6 및 H-5 공명들 간의 및 그 반대의 크로스 피크를 확인하였으며, 두개의 갈락토스 잔기의 6-위치를 균주 X73 코어 OS에서 발견된 추가 두개의 PEtn 부분의 부착 지점으로 확인하였다. (도 35). To confirm and expand this reasoning, NMR experiments were performed on sorted core OS samples with both PEtn residues (determined by MS-data not shown). Apart from the two terminal galactose residues, all assignments were identical to the core OS obtained from strain VP 161. Chemical shifts for H-1 and H-2 resonances of galactose residues were observed in the VP 161 samples, while H-3 and H-4 resonances shifted slightly downfield from 4.17 and 4.12 to 4.21 and 4.17 ppm. Internal-NOE contact from galactose residues was as previously observed, although internal-NOE contact for H-5 residues was observed at 3.94 ppm as opposed to 3.80 and 3.76 ppm of strain VP161 (Example 5 Table 2) . To confirm the location of the two PEtn residues, a ³¹ P- ¹ H-HSQC experiment was performed to confirm resonance at 4.07 ppm to the point of attachment of each PEtn residue, followed by the ³¹ P- ¹ H-HSQC-TOCSY experiment. EH confirmed the H-5 resonance of the galactose residue at 3.94 ppm (Fig. 34). The designation of 4.07 ppm by H-6 resonance of galactose residues was demonstrated in ¹³ C- ¹ H-HMQC experiments identified as characteristic positive peaks of the -CH ₂ moiety, and the C of each Gal residue at low field values (-65 ppm). Downfield chemical shift of -6 atoms was consistent with phosphorylation. Finally, ¹³ C- ¹ H-HMQC-TOCSY experiments confirmed cross peaks between C-6 and H-5 resonances and vice versa, and the 6-position of the two galactose residues was determined in strain X73 core OS. The attachment point of the two additional PEtn parts found was identified. (Figure 35).

따라서, 이 연구에서는 제2의 혈청형 A 균주의 LPS로부터 얻은 유사한 코어 OS 구조를 확인하였다. 추가 연구는 이 신규한 말단 구조가 다른 혈청형들에 존재하는지 검사하기 위해 다른 혈청형들에 대한 LPS 구조 분석으로 확대될 것이다. 6탄당의 6-위치에서 PEtn을 확인한 것은 다소 보기 드문 일이다. PEtn은 통상적으로 수막구균 및 헤모필루스 인플루엔자에서 헵토스 잔기의 6-위치에서 발견된다. 본 출원인의 실험실에서 이루어진 최근의 연구에서 몇몇 헤모필루스 인플루엔자 균주들의 말단 GalNAc 잔기의 6-위치에서 PEtn을 확인한 바 있으며, 최근의 포스터 또한 사이트로박터 종(Citrobacter sp)에서 3-연결 갈락토스 분자의 6-위치에서 PEtn 잔기를 확인하였다. 유사한 화학 시프트를 갖는 PCM1443(혈청형 039) 가 여기서 관찰되었다. Thus, this study identified similar core OS structures from LPS of the second serotype A strain. Further studies will be extended to LPS structure analysis for other serotypes to examine whether this new terminal structure is present in other serotypes. It is rather unusual to identify PEtn at the 6-position of hexasaccharide. PEtn is commonly found at the 6-position of the heptose residue in meningococcal and Haemophilus influenzae. Recent studies in our laboratory have identified PEtn at the 6-position of the terminal GalNAc residue of several Haemophilus influenza strains, and recent posters have also identified 6- of the 3-linked galactose molecule in Citrobacter sp. The PEtn residue was identified at the position. PCM1443 (serum type 039) with a similar chemical shift was observed here.

1. 실험 1. Experiment

1.1 박테리아의 생장, LPS의 분리 및 분류 1.1 Growth of bacteria, isolation and classification of LPS

P. 멀토시다 균주 X73(NRCC#6235)를 생장시키고 분류하였다. 간단히 설명하면, P. 멀토시다 세포들(-210 g wet wt.)을 동결건조시켜 약 56 g을 얻었다. 동결 건조시킨 세포들을 유기 용매들(1 x 에탄올, 2 x 아세톤, 2 x 경유 에테르)로 세척하여 지질 및 다른 친지질 성분들을 제거하고 LPS 추출 효율을 향상시켰다. 세척한 세포들(10 g -42 g)을 고온 페놀/물 방법으로 추출하고, 수성상을 합친 뒤 48 시간 동안 물을 흘려보내며 투석하였다. 회수물을 동결 건조시켜 약 0.57 g을 얻고, 이를 물에 2% 용액으로 만들어 DNase 및 RNase로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리한 후 단백질가수분해 효소 K로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 작은 펩티드를 투석에 의해 제거하였다. 동결 건조시킨 후, 회수물(약 0.42 g)을 물에 용해하여 2 % 용액으로 만들고, 8,000 g에서 15 분 동안 원심분리한 후(8K 펠릿 약 265 ㎎), 상층액을 100,000 g에서 5 시간 동안 추가로 원심분리하였다. 정제된 LPS를 함유한 펠릿을 재용해시키고, 동결건조시켰다(약 3 ㎎). P. multocida strain X73 (NRCC # 6235) was grown and sorted. Briefly, P. multocida cells (-210 g wet wt.) Were lyophilized to yield about 56 g. Lyophilized cells were washed with organic solvents (1 x ethanol, 2 x acetone, 2 x light ether) to remove lipids and other lipophilic components and to improve LPS extraction efficiency. The washed cells (10 g-42 g) were extracted by hot phenol / water method and the aqueous phases combined and dialyzed with running water for 48 hours. The recovered product was freeze-dried to obtain about 0.57 g, which was made into a 2% solution in water, treated with DNase and RNase for 4 hours at 37 ℃, and then treated with proteolytic enzyme K at 37 ℃ for 4 hours. Small peptides were removed by dialysis. After freeze drying, the recovered product (about 0.42 g) was dissolved in water to form a 2% solution, centrifuged at 8,000 g for 15 minutes (8K pellets about 265 mg), and the supernatant was then used at 100,000 g for 5 hours. Further centrifugation. Pellets containing purified LPS were redissolved and lyophilized (about 3 mg).

8K 펠릿 물질(약 15 ㎎) 및 LPS(약 3 ㎎)을 37 ℃에서 1 시간 동안 무수 히드라진으로 교반하며 처리하여 LPS-OH 를 8K 제제로부터 약 10 ㎎ 및 LPS로부터 약 1 ㎎을 얻었다. 8K 펠릿 물질(약 115 ㎎)를 1% 아세트산(10 ㎎/㎖, 100 ℃, 1.5 시간) 으로 처리하여 코어 올리고당(OS)을 분리한 후, 불용성 지질 A를 원심분리(5,000 x g)에 의해 제거하였다. 이어서, 동결건조시킨 상층액을 Bio-Gel P-2 컬럼 상에서 추가로 정제하고 분리된 분획들을 따로 동결건조시켰다(약 40 ㎎).8K pellet material (about 15 mg) and LPS (about 3 mg) were treated with anhydrous hydrazine for 1 hour at 37 ° C. to obtain LPS-OH about 10 mg from 8K formulation and about 1 mg from LPS. 8K pellet material (about 115 mg) was treated with 1% acetic acid (10 mg / ml, 100 ° C., 1.5 hours) to separate core oligosaccharides (OS), and then insoluble lipid A was removed by centrifugation (5,000 × g). It was. The lyophilized supernatant was then further purified on a Bio-Gel P-2 column and the separated fractions were lyophilized separately (about 40 mg).

1.2 분석 방법1.2 Analytical Methods

당은 GLC-MS에 의해 알디톨 아세테이트 유도체로 분석하였다. 메틸화 분석은 NaOH / DMSO /요오드화 메틸 방법으로 수행하고 GLC-MS에 의해 분석하였다. Sugars were analyzed by GLC-MS as alditol acetate derivatives. Methylation analysis was performed by NaOH / DMSO / methyl iodide method and analyzed by GLC-MS.

1.3 질량 스펙트럼 분석 및 NMR 스펙트럼 분석1.3 Mass Spectrum Analysis and NMR Spectrum Analysis

모든 질량 스펙트럼 분석 및 NMR 실험은 상기 서술한 바와 같이 수행하였다. All mass spectral analysis and NMR experiments were performed as described above.

실시예Example 6 6

이 실시예는 문헌 [Infect. Immun. 72: 3436(2004)]에 공개된 것을 토대로 구성되었다. 파스튜렐라 멀토시다의 헵토실트랜스퍼라제 돌연변이는 말단이 절단된 지질다당류 구조를 생성하였으며, 그의 독성은 약독화되었다. This example is described in Infect. Immun. 72: 3436 (2004). The heptosyltransferase mutation of Pasteurella multocida produced a truncated lipopolysaccharide structure, the toxicity of which was attenuated.

P. 멀토시다 VP 161 야생형 LPS를 분석한 결과, "러프(rough)" LPS가 확인되었다. 이는 H. 인플루엔자, H. 듀크레이, 뇌수막염균(N. meningitidis) 및 임균(N. gonorrhoeae)으로부터 분리된 LPS 또는 지질올리고당와 유사하였으며, 오직 짧은 비반복 다당류 단위가 코어에 부착되어 있었다. P. 멀토시다 LPS의 내부 코어 구조는 H. 인플루엔자, M. 헤몰리티카 및 H. 듀크레이에 대해 서술한 것과 유사하며, 트리-헵토스 단위가 Kdo 잔기에 의해 지질 A에 부착되어 있다(도 30). AL251 돌연변이체에서, waaQ _PM 를 불활성화하면, 내부 코어 영역 내에 제3의 헵토스 분자(Hep III)가 결핍된 심하게 말단이 절단된 LPS가 발현되었다. 돌연변이 내에서 가장 많은 LPS 단백당형은 또한 제1 헵토스의 말단에 있는 모든 당이 결핍되었는데, 이는 waaQ _PM 의 불활성화가 추가 당의 첨가를 억제함을 시사한다. 따라서, 제 3의 헵토스 부족으로 인한 LPS 중간체에서의 배좌 변화는 후속 트랜스퍼라제의 작용을 대부분 방지할 수 있을 것이다. Analysis of the P. multocida VP 161 wild-type LPS revealed "rough" LPS. This was H. influenza, H. Duke ray, meningitis bacteria (N. meningitidis) and Neisseria gonorrhoeae was similar to the LPS or lipid isolated from olrigodangwa (N. gonorrhoeae), only a short non-polysaccharide repeating units attached to the core. P. far Toshio the inner core of the LPS structure is similar to that H. influenza, M. H. Molina urticae and described for H. Ray Duke, tri-heptyl monohydrate unit is attached to lipid A by the Kdo moiety ( 30). In AL251 mutant, waaQ _PM inactivation resulted in severely truncated LPS lacking a third heptose molecule (Hep III) in the inner core region. The largest LPS protein glycoform in the mutation also lacked all sugars at the ends of the first heptose , suggesting that inactivation of waaQ _PM inhibits the addition of additional sugars. Thus, the change in coordination in the LPS intermediate due to the lack of a third heptose will largely prevent the action of subsequent transferases.

재료 및 방법Materials and methods

박테리아 균주, 플라스미드, 배지 및 생장 조건. Bacterial strains, plasmids, media and growth conditions.

이 연구에 사용된 박테리아 균주들 및 플라스미드들이 실시예 6 표 1에 기재되어 있다. 대장균(Escherichia coli; E. coli)을 Luria-Bertani 액체 배지에서 관례에 따라 생장시켰다. P. 멀토시다 균주들은 효모 추출물(3%)이 보강된 뇌-심장 침출(BHI) 배지 또는 효모 추출물(3%)이 보강된 영양 액체 배지(NB)(Oxoid, Basingstoke, United Kingdom)에서 생장시켰다. 고체 배지를 얻고 1.5% 한천을 첨가하였다. 필요하다면, 배지를 테트라시클린 2.5 ㎍/㎖로 보강하였다. 구조 연구를 위해, P. 멀토시다 균주 VP161 및 AL251를 28L 발효기의 BHI 액체 배지 24L에서 18 시간 동안 37 ℃ 및 20% DO 포화도로 생장시켰다. 페놀을 2% 첨가하여 세포를 희생시키고, 페놀처리 3 시간 후 히알루론산 분해 효소(Roche Chemicals) 1 g을 첨가하고 1시간 교반한 후 Sharples 연속 흐름 원심분리에 의해 세포를 수거하였다.The bacterial strains and plasmids used in this study are described in Example 6 Table 1. Escherichia coli coli ; E. coli ) were grown according to convention in Luria-Bertani liquid medium. P. multocida strains were grown in brain-heart leaching (BHI) medium supplemented with yeast extract (3%) or nutrient liquid medium (NB) supplemented with yeast extract (3%) (Oxoid, Basingstoke, United Kingdom). I was. Solid medium was obtained and 1.5% agar was added. If necessary, the medium was supplemented with 2.5 μg / ml of tetracycline. For structural studies, P. multocida strains VP161 and AL251 were grown at 37 ° C. and 20% DO saturation for 18 hours in 24 L of BHI liquid medium in a 28 L fermentor. Cells were sacrificed by adding 2% phenol, and after 3 hours of phenol treatment, 1 g of hyaluronic acid degrading enzyme (Roche Chemicals) was added and stirred for 1 hour, and the cells were harvested by Sharples continuous flow centrifugation.

트랜스포손 안정성 연구Transposon Stability Study

P. 멀토시다 AL251을 37 ℃에서 진탕하며 NB 10 ㎖내에서 생장시켰다. 대략 10, 34 및 58 세대 후, 배양액 샘플들을 취해 적절히 희석하고 NB 한천상에 플레이팅하였다. 밤새 인큐베이션시킨 후, 콜로니 100개를 테트라시클린과 함께 NB 상에 덮고 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 트랜스포손 유실은 테트라시클린 민감성 콜로니의 백분율로 표시하였다. P. multocida AL251 was grown in 10 ml of NB with shaking at 37 ° C. After approximately 10, 34 and 58 generations, the culture samples were taken, properly diluted and plated on NB agar. After incubation overnight, 100 colonies were covered on NB with tetracycline and incubated overnight at 37 ° C. Transposon loss is expressed as percentage of tetracycline sensitive colonies.

SDS-PAGE 및 은 염색. SDS-PAGE and silver staining.

문헌 [Laemmli, Nature 227, 680(1970)]에 공개된 SDS-PAGE를 사용하는 Bio-Rad mini 단백질 겔 장치에서 LPS 를 수행하였다. 이어서, LPS를 은 염색으로 가시화하였다. LPS was performed on a Bio-Rad mini protein gel apparatus using SDS-PAGE published in Laemmli, Nature 227, 680 (1970). LPS was then visualized by silver staining.

DNA 조작DNA manipulation

제한 소화, 결찰 및 폴리머라제 반응 등을 NEB(Beverley, MA) 또는 Roche Diagnostics GmbH(Mannheim, Germany)로부터 얻은 효소를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 알칼리 용해를 이용하여 플라스미드 DNA를 제조하고 Qiagen 컬럼(QIAGEN GmbH, Germany)을 사용하거나 또는 PEG 침전법(Ausubel, 1995)으로 정제하였다. CTAB 방법을 이용하여 게놈 DNA을 제조하였다. Taq DNA 폴리머라제 또는 Exp및 고 충실도 PCR 시스템(Roche Diagnostics)을 사용하여 DNA의 PCR 증폭 을 수행하고 Qiagen PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 이 연구에 사용된 올리고누클레오티드들을 실시예 6, 표 1에 기재하였다. 모델 373A DNA 서열화 시스템(Applied Biosystems) 상에서 DNA 서열을 결정하고 Sequencher Version 3.1.1(GenCodes, Ann Arbor, MI)로 분석하였다. Restriction digestion, ligation and polymerase reactions were carried out according to the manufacturer's instructions using enzymes obtained from NEB (Beverley, MA) or Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany). Plasmid DNA was prepared using alkaline lysis and purified using a Qiagen column (QIAGEN GmbH, Germany) or by PEG precipitation (Ausubel, 1995). Genomic DNA was prepared using the CTAB method. PCR amplification of DNA was performed using Taq DNA polymerase or Exp and High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics) and purified using Qiagen PCR Purification Kit. Oligonucleotides used in this study are listed in Example 6, Table 1. DNA sequences were determined on a Model 373A DNA Sequencing System (Applied Biosystems) and analyzed with Sequencher Version 3.1.1 (GenCodes, Ann Arbor, MI).

waaQ _PM 의 트랜스 보강 waaQ _PM transformer reinforcement

올리고누클레오티드 BAP2146 및 BAP2147를 사용하여 완전한 waaQ _PM 유전자를 P. 멀토시다 VP 161로부터 증폭시켰다(실시예 6, 표 1). 증폭시킨 1.1 kb DNA 프레그먼트를 SalI 및 BamHI 소화 벡터 pAL99에 결찰시켜(실시예 6, 표 1), P. 멀토시다 tpiA 프로모터에 의해 전사를 유도하였다. E. coli 형질전화체를 정확한 플라스미드 및 pAL170이 존재하는지 스크리닝하고 P. 멀토시다 AL251을 형질전화시키는데 사용하여 균주 AL298를 제조하였다. 대조군으로는 벡터 pAL99를 따로 AL251에 형질전화시켜 균주 AL438 를 제조하였다(실시예 6, 표 1). The oligonucleotides BAP2146 and BAP2147 were used to amplify the complete waaQ _PM gene from P. multocida VP 161 (Example 6, Table 1). Amplified 1.1 kb DNA fragment was ligated to SalI and BamHI digest vector pAL99 (Example 6, Table 1) to induce transcription by the P. multocida tpiA promoter. E. coli transformants were screened for the presence of the correct plasmid and pAL170 and used to transform P. multocida AL251 to prepare strain AL298. As a control, strain AL438 was prepared by separately transducing vector pAL99 to AL251 (Example 6, Table 1).

경쟁적 생장 분석 Competitive Growth Analysis

Harper(2003)에 기재된 방법을 이용하여 경쟁적 생장 분석을 수행하고, P. 멀토시다 LPS 돌연변이 AL251 및 보강 돌연변이 AL298의 상대적 생장율을 정량분석하는데 사용하였다. 경쟁지수(competitive index; CI)는 배출 배양액(시험관내 또는 생체내)으로부터 얻은 테트라시클린 내성 콜로니의 백분율을 유입 배양액으로부터 얻은 테트라시클린 콜로니의 백분율로 나누어 결정하였다. 생체내에서 생장된 것과 시험관 내에서 생장된 것의 차이를 측정한 상대적인 경쟁 지수(relative competitive index; rCI)는 생체내 CI 를 시험관내 CI로 나누어 결정하였다. 돌연변이체들은 일면 z-검사를 이용하여 통계학적으로 분석하여 결정했을 때 rCI 값이 1.0 보다 현저히 작으면 약독화된것으로 확인하였다. Competitive growth assays were performed using the method described in Harper (2003) and used to quantify the relative growth rates of P. multocida LPS mutations AL251 and augmentation mutations AL298. The competitive index (CI) was determined by dividing the percentage of tetracycline resistant colonies obtained from the discharge culture (in vitro or in vivo) by the percentage of tetracycline colonies obtained from the inflow culture. The relative competitive index (rCI), which measures the difference between in vivo growth and in vitro growth, was determined by dividing the in vivo CI by the in vitro CI. Mutants were attenuated when the rCI value was significantly less than 1.0 when determined by statistical analysis using one-side z-test.

독성 실험 Toxicity Experiment

시판되는 12주령의 레그혼-크로스 닭 100군을 가슴 근육으로의 주입을 통해(두가지 투여량) P. 멀토시다 VP 161 또는 AL251에 감염시켰다. AL251로 감염시킨 후 여러 시점에서 혈액 샘플을 얻었으며, 생존 불가능할 것으로 보이는 닭들은 동물 윤리 요구조건에 따라 안락사시켰다. 혈액 샘플들을 헤파린을 함유한 BHI 내에 두배 희석하고 BHI 플레이트에 플레이팅하였다. 혈액으로부터 분리된 P. 멀토시다 콜로니를 NB 한천 및 테트라시클린을 함유한 NB 한천 배지에 덮었다. Commercially available 100 week old Leghorn-Cross chickens were infected with P. multocida VP 161 or AL251 via infusion into the pectoral muscles (two doses). Blood samples were obtained at various time points after infection with AL251, and chickens that were not viable were euthanized according to animal ethical requirements. Blood samples were diluted twice in BHI containing heparin and plated on BHI plates. P. multocida colonies isolated from blood were covered in NB agar medium containing NB agar and tetracycline.

혈청 민감성 분석 Serum Sensitivity Analysis

신선한 닭 혈청에 대한 P. 멀토시다 및 E. coli의 민감성을 문헌 [Chung 등 Infect. Immun. 69, 2487(2001)]에 기재된 바와 같이 결정하였다.The sensitivity of P. multocida and E. coli to fresh chicken serum is described by Chung et al. Infect. Immun. 69, 2487 (2001).

LPS 정제 LPS Tablet

P. 멀토시다 세포들(210g,VP161; AL251 254g)을 동결건조시켜 AL251의 VP161 56g및 AL251 52g을 얻었다. 동결건조시킨 세포들을 유기 용매로 세척하여 지질 및 기타 친지질 성분들을 제거하여 LPS 추출 효율을 증강시켰다. 세척한 세포들(42g, VP161; 5Og, AL251)을 고온-페놀/물 방법으로 추출하고, 수성상을 합하고 48 시간 동안 흐르는 물로 투석하였다. 회수물을 동결건조시키고, 물에 용해하여2% 용액(중량/부피)을 얻고, DNase 및 RNase 로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리한 후, 단백질 가수분해 효소 K 로 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 작은 펩티드들은 투석에 의해 제거하였다. 동결 건조 후, 회수물을 물에 용해하여 2 % 용액으로 만들고 8,000 g에서 15 분 동안 원심분리한 후 상층액을 100,000 g에서 5 시간 동안 추가 원심분리하였다. 정제된 LPS를 함유한 펠릿을 재용해하고 동결건조시켰다. 정제된 LPS를 1 % 아세트산(10 ㎎/㎖, 100 ℃, 1.5 시간)으로 처리한 후 원심분리(5,000 x g)에 의해 불용성 지질을 제거함으로써 코어 올리고당(OS)를 분리하였다. P. multocida cells (210 g, VP161; AL251 254 g) were lyophilized to obtain 56 g of VP161 and 52 g of AL251. Lyophilized cells were washed with organic solvent to remove lipid and other lipophilic components to enhance LPS extraction efficiency. Washed cells (42 g, VP161; 50 g, AL251) were extracted by hot-phenol / water method, the aqueous phases combined and dialyzed with running water for 48 hours. The recovered product was lyophilized, dissolved in water to obtain a 2% solution (weight / volume), treated with DNase and RNase for 4 hours at 37 ° C., followed by proteolytic enzyme K for 4 hours at 37 ° C. . Small peptides were removed by dialysis. After lyophilization, the recovery was dissolved in water to make a 2% solution, centrifuged at 8,000 g for 15 minutes and the supernatant was further centrifuged at 100,000 g for 5 hours. Pellets containing purified LPS were redissolved and lyophilized. The core oligosaccharide (OS) was isolated by treating purified LPS with 1% acetic acid (10 mg / ml, 100 ° C., 1.5 hours) and then removing insoluble lipids by centrifugation (5,000 × g).

분석 방법 Analytical Method

당을 GLC-MS에 의해 알디톨 아세테이트 유도체로 결정하였다. LPS를 4 M 트리플루오로 아세트산을 사용하여 100 ℃에서 4 시간 동안 가수분해한 후, H₂O 중의 NaBD₄에서 밤새 환원시키고, 촉매로 잔류 아세트산 나트륨을 이용하여 100 ℃에서 2 시간 동안 무수 아세트산으로 아세틸화하였다. GLC-MS에는 30 M DB-17 모세관 컬럼(180 ℃ - 260 ℃, 3.5 ℃/min)이 장착되어 있었으며, MS는 Varian Saturn II 질량 분광기의 전자 충격 모드에서 수행하였다. NaOH / DMSO /요오드화 메틸 방법으로 메틸화 분석을 수행하고, 상기와 같이 GLC-MS에 의해 분석하였다. Sugars were determined by GLC-MS as alditol acetate derivatives. The LPS was hydrolyzed at 100 ° C. for 4 hours with 4 M trifluoro acetic acid and then reduced in NaBD ₄ in H ₂ O overnight, followed by acetic anhydride at 100 ° C. for 2 hours with residual sodium acetate as catalyst. Acetylated. GLC-MS was equipped with a 30 M DB-17 capillary column (180 ° C.-260 ° C., 3.5 ° C./min) and MS was performed in the electron impact mode of a Varian Saturn II mass spectrometer. Methylation analysis was performed by NaOH / DMSO / methyl iodide method and analyzed by GLC-MS as above.

MS 분석 MS analysis

미세분사 계면을 통해 API 3000 질량 분광기(Perkin-Elmer/Sciex)에 결합시킨 크리스탈 모델 310 모세관 전기영동(CE) 장치(AYI Unicam) 상에서 모세관 전기영동(CE)-ESI-MS을 수행하였다. 외장 용액(이소프로판올-메탄올, 2:1)을 유속 1 ㎕/분으로 낮은 정체 부피 탑관(250 ㎛ i.d., Chromatographic Specialties)에 옮겼다. 모든 분취 용액을 사용하기 전 0.45-㎛ 필터(Millipore) 를 통해 여과하였다. Capillary electrophoresis (CE) -ESI-MS was performed on a Crystal Model 310 capillary electrophoresis (CE) device (AYI Unicam) coupled to an API 3000 mass spectrometer (Perkin-Elmer / Sciex) via a microspray interface. The external solution (isopropanol-methanol, 2: 1) was transferred to a low stagnation volume column (250 μm i.d., Chromatographic Specialties) at a flow rate of 1 μl / min. All aliquots were filtered through a 0.45-μm filter (Millipore) before use.

핵자기 공명 Nuclear magnetic resonance

3 mm 트리플 공명(¹H, ¹³C, ³¹P) 탐침을 사용하여 Varian Inova 500 MHz 분광기 상에서 NMR 스펙트럼을 얻었다. 동결건조시킨 당 샘플을 99% D₂O 140 ㎕(3mm)에 용해시켰다. 실험은 25 ℃에서 수행하였으며, HOD(중수소 H₂O) 신호 억제는 4.78 ppm이었다. 아세톤의 메틸 공명을 내부 또는 외부 참조치로 사용하였으며 ¹H 스펙트럼의 경우는 2.225 ppm을 ¹³C 스펙트럼의 경우에는 31.07 ppm이었다. Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³C-¹H HSQC, ¹³C-¹H HSQC-TOCSY 및 ¹³C-¹H HMBC로부터 얻은 표준 동종핵 및 이종핵 관련 2D 펄스 서열을 일반적인 지정에 사용하였다. NMR spectra were acquired on a Varian Inova 500 MHz spectrometer using a 3 mm triple resonance ( ¹ H, ¹³ C, ³¹ P) probe. Lyophilized sugar samples were dissolved in 140 μl (3 mm) of 99% D ₂ O. The experiment was performed at 25 ° C., and HOD (deuterium H ₂ O) signal inhibition was 4.78 ppm. The methyl resonance of acetone was used as an internal or external reference, with 2.225 ppm for the ¹ H spectrum and 31.07 ppm for the ¹³ C spectrum. Standard homonuclear and heteronuclear related 2D pulse sequences obtained from Varian, COSY, TOCSY, NOESY, ¹³ C- ¹ H HSQC, ¹³ C- ¹ H HSQC-TOCSY and ¹³ C- ¹ H HMBC were used for general designation.

결과result

약독화 P. 멀토시다 STM 돌연변이는 기능성 waaQ _PM 유전자의 보강으로 전장 LPS로 복귀된 말단이 절단된 LPS 를 생성한다. Attenuation P. Multosi STM mutant produces the terminal returns to the full-length LPS as reinforcement of the functional gene waaQ _PM cutting LPS.

시그내쳐-표지 돌연변이 유도(signature-tagged mutagenesis; STM)를 이용하여 쥐 및 닭에서의 생장을 위해 약독화된 돌연변이체들을 확인하였다. 이러한 앞선 분석 중에, 한 돌연변이체가 쥐 및 닭 모두에서 약독화 된것으로 확인되었 다(AL251로 지정). 이 돌연변이를 서열 분석한 결과, 헵토스를 LPS에 첨가하는데 참여하는 글리코실트랜스퍼라제인 추정 헵토실 트랜스퍼라제를 암호화 하는것으로 예상되는 유전자 waaQ _PM 내에 단일 트랜스포손 삽입이 나타났다. Signature-tagged mutagenesis (STM) was used to identify attenuated mutants for growth in mice and chickens. During this previous analysis, one mutant was found to be attenuated in both rats and chickens (designated AL251). Sequencing this mutation revealed a single transposon insertion within the gene waaQ _PM , which is expected to encode a putative heptosyl transferase, a glycosyltransferase involved in adding heptose to LPS .

본 출원인들은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법 및 은 염색을 이용하여 AL251의 LPS 프로필을 야생형 모체 VP 161 및 보강 돌연변이 AL298의 LPS 프로필과 비교하였다. AL251로부터 얻은 LPS는 야생형 LPS에 비교했을 때 겔 내에서 추가 이동이 있었으며, 이는 돌연변이 유도에 의해 생성된 LPS가 현저하게 말단이 절단되었음을 의미한다(도 36a). 더욱이, 보강 돌연변이 AL298의 LPS 프로필은 야생형에서 관찰되는 것과 동일하였는데, 이는 돌연변이 AL251을 완전한 waaQ _PM 유전자로 보강함으로써 야생형 LPS의 합성을 복구할 수 있었음을 의미한다(도 36a). Applicants used polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining to compare the LPS profile of AL251 with the wild type parent VP 161 and the LPS profile of augmented mutant AL298. LPS obtained from AL251 had further migration in the gel compared to wild type LPS, indicating that LPS produced by mutation induction was markedly truncated (FIG. 36A). Moreover, the LPS profile of the augmented mutant AL298 was identical to that observed in the wild type, indicating that the synthesis of the wild type LPS could be restored by augmenting the mutant AL251 with the complete waaQ _PM gene (FIG. 36A).

AL251 을 waaQ _PM 로 보강하는 것은 또한 생체내 생장률을 야생형 수준으로 복귀시킨다. Enhancing AL251 with waaQ _PM also returns in vivo growth rate to wild-type levels .

AL251을 waaQ _PM 로 보강함으로써 야생형 LPS의 생성이 복구됨에 따라, 본 출원인들은 불완전한 waaQ _PM 을 이용한 보강 역시 돌연변이 AL251을 야생형 수준의 생장률로 생체내에서 복구할 수 있는지를 알아보고자 하였다. 보강 돌연변이 AL298를 이용한 초기 연구에서는, 일단 플라스미드에 대한 항생제 선택이 제거되면(6 시간 후 44% 보유)보강 플라스미드 pAL170이 현저히 유실되는 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 앞선 연구에서 쥐로부터 박테리아를 수확하는데 걸리는 감염 시간이 닭에서 감염을 위해 12시간이 걸리는 것과 비교할 때 6 시간 밖에 안되기 때문에, 경쟁적 생장 분석을 위해 닭 대신 쥐를 선택하였다. 3마리의 쥐에게 VP161 및 보강 균주 AL298를 동일하게 혼합하여 주입하였다. 대조군으로, 2마리의 쥐에게 야생형 VP 161 및 대조군 균주 AL438(벡터 pAL99를 갖는 AL251)를 동일하게 혼합하여 주입하였다. 보강 돌연변이 AL298는 평균 rCI 값이 1.0인 야생형 VP 161과 동등하게 경쟁할 수 있는 반면, 대조군 균주 AL438는 0.57의 평균 rCI 값(p = 0.03)을 갖는데, 이는 앞서 쥐에서 AL251에 대해 보고한 것과 유사하다. 이러한 결과는 전장 LPS의 새성과 감염중의 정상적인 생장을 위해 waaQ _PM 이 필요함을 입증한다. As the production of wild-type LPS was restored by augmenting AL251 with waaQ _PM , Applicants sought to determine whether enrichment with incomplete waaQ _PM could also recover mutant AL251 in vivo at wild-type growth rates. Initial studies with augmented mutant AL298 showed a significant loss of the augmented plasmid pAL170 once antibiotic selection for the plasmid was removed (44% retention after 6 hours). For this reason, mice were selected instead of chicken for competitive growth analysis because the previous study took only six hours to infect bacteria from mice, compared to 12 hours for infection in chickens. Three mice were injected with the same mixture of VP161 and enrichment strain AL298. As a control, two mice were injected with the same mixture of wild type VP 161 and control strain AL438 (AL251 with vector pAL99). The augmentation mutant AL298 can compete equally with wild type VP 161 with an average rCI value of 1.0, whereas the control strain AL438 has an average rCI value of 0.57 (p = 0.03), similar to that previously reported for AL251 in mice. Do. These results demonstrate that waaQ _PM is required for the development of full-length LPS and normal growth during infection.

P. 멀토시다 waaQ _PM 돌연변이는 닭에서 질병을 유발할 수 없다. P. Multosi waaQ _PM mutations cannot cause disease in chickens .

균주 AL251는 닭에서 현저히 줄어든 생장률을 보였다. 돌연변이가 이들 숙주 내에서 여전히 질병을 유발할 수 있는지를 결정하고자 하였다. 닭을 두개의 다른 투여량을 이용하여 VP161 또는 AL251로 공격하였다(실시예 6, 표 2). 야생형 VP 161로 공격한 모든 닭이 20 시간 안에 죽었다. 반면에, AL251로 공격한 대부분의 닭들은 처음 20 시간 동안은 잘 지냈지만, 투여량에 상관 없이 AL251을 접종한 모든 닭이 4일 내에 조류 콜레라에 감염되 죽었다. 질병의 후기 또는 사망 단계에서 AL251에 감염된 닭의 혈액으로부터 P. 멀토시다를 분리하였으며, 분리된 P. 멀토시다 콜로니 모두가 테트라시클린 민감성을 보임을 확인하였는데, 이는 박테리아 내에 트랜스포손이 더 이상 존재하지 않음을 의미한다. 회수한 콜로니로부터 얻은 waaQ _PM 을 서열 분석한 결과, 모든 경우에서, 트랜스포손이 절제되었으며, 따라서, 기능성 waaQ _PM 유전자가 재구성된 것으로 나타났다. 흥미로운 것은, 대부분의 분리물의 서열 분석에서 트랜스포손 절단 지점에서 누클레오티드 치환이 이루어진 것이 waaQ _PM 내에 두개의 아미노산 변화를 초래하는 것으로 나타났다(아미노산 88,89; Ser에서 Leu, 및 Asp에서 Cys). 이러한 아미노산 변화는 waaQ _PM 의 기능에 영향을 주지 않는데, 이는 AL251로 공격한 닭들에서 얻은 P. 멀토시다 분리물의 LPS 프로필이 야생형과 모두 동일하기 때문이다(도 36b). 모든 것을 고려하면, 이러한 결과는 AL 251로 접종한 닭들에서 관찰되는 조류 콜레라의 발병이 지연된 것은 순전히 AL251의 야생형 복귀돌연변이체 때문이며, 따라서, 불활성화된 waaQ _PM 유전자를 갖는 균주들은 질병을 초래할 수 없음을 나타내었다. Strain AL251 showed significantly reduced growth rate in chickens. We wanted to determine if mutations could still cause disease in these hosts. Chickens were attacked with VP161 or AL251 using two different doses (Example 6, Table 2). All chickens attacked with wild type VP 161 died within 20 hours. On the other hand, most chickens attacked with AL251 performed well for the first 20 hours, but all chickens given AL251, regardless of dose, died of bird cholera infection within 4 days. P. multocida was isolated from the blood of AL251 infected chickens at the later stages of disease or death and confirmed that all of the isolated P. multocida colonies exhibited tetracycline sensitivity, indicating that more transposons were present in the bacteria. It means no longer exists. The waaQ _PM obtained from a number of colonies Sequence analysis revealed that in all cases the transposons were excised and therefore the functional waaQ _PM gene was reconstituted. Interestingly, sequencing of most isolates showed that nucleotide substitutions at the transposon cleavage point resulted in two amino acid changes in waaQ _PM (amino acids 88,89; Leu in Ser, and Cys in Asp). This amino acid change does not affect the function of waaQ _PM , since the LPS profile of P. multocida isolates obtained from chickens challenged with AL251 is the same as the wild type (FIG. 36B). All things considered, these results indicate that the delay in the onset of avian cholera observed in chickens inoculated with AL 251 is purely due to the wild-type reverted variant of AL251, so that strains with inactivated waaQ _PM genes cannot cause disease. Indicated.

닭에서 waaQ _PM 돌연변이의 약독화는 닭 혈청에 대한 민감성이 증가하기 때문이 아니다. 보체-매개 치사에 대한 야생형 P. 멀토시다 균주 VP 161 및 LPS 돌연변이 AL251의 상대적 민감성을 알아보기 위해, 각각의 균주와 균주 및 대조군 균주, E. coli DH5α 중간 대수 증식기 세포들을 정상 또는 가열 처리 닭 혈청 내에서 3 시간 동안 인큐베이션시켰다. 야생형 P. 멀토시다, 균주 VP 161는 가열된 혈청이나 가열되지 않은 혈청에서 동일한 생장률로 생장할 수 있었으며, 이는 다른 P. 멀토시다 혈청형 A 균주들에 대해 앞서 보고된 바와 같이 완전한 혈청 내성을 갖고 있음을 의미한다. 닭 혈청의 살균 활성은 가열처리한 혈청에서 19 배 증식시킨 E. coli 대조군 균주를 이용하여 확인하였으며, 무처리 혈청의 경우에는, 생존 력이 대략 9배 감소하였다. 흥미로운 것은, 돌연변이 AL251의 경우, 가열처리한 혈청과 정상 혈청간에 관찰된 생장에 있어서 차이가 없다는 것인데, 얼처리한 혈청에서는 생장률이 대략 160 배 증가하였고, 정상 혈청에서는 동일한 생장률을 보였다. 이들 결과로 닭에서 LPS 돌연변이에 대해 관찰되는 약독화는 보체에 대한 민감성이 증가한 것 때문이 아님을 알 수 있다. Attenuation of the waaQ _PM mutant in chickens is not due to increased sensitivity to chicken serum. To determine the relative susceptibility of wild type P. multocida strain VP 161 and LPS mutation AL251 to complement-mediated lethality, each strain, strain and control strain, E. coli DH5α intermediate logarithmic proliferative cells were treated with normal or heat-treated chickens. Incubate for 3 hours in serum. Wild type P. multocida , strain VP 161, was able to grow at the same growth rate in heated or unheated serum, which was completely seroresistant as previously reported for other P. multocida serotype A strains. Means that you have The bactericidal activity of the chicken serum was confirmed using E. coli control strains grown 19-fold in the heat-treated serum. In the case of untreated serum, viability was reduced approximately 9-fold. Interestingly, for mutant AL251, there was no difference in growth observed between heated and normal serum, with growth rates approximately 160-fold higher in frozen serum and the same growth rate in normal serum. These results indicate that the attenuation observed for LPS mutations in chickens is not due to increased sensitivity to complement.

P. P. 멀토시다Multocida VP161VP161 및  And AL251AL251 로부터 얻은 Obtained from LPSLPS 의 구조 분석Structural analysis

모체 균주 VP 161로부터 얻은 LPS의 당 분석에서 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal), N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 및 L-글리세로-D-만노-헵토스(LD-Hep)가 각각 2:1:1:3의 비율로 나타났다. 반면에, 돌연변이 균주 AL251로부터 얻은 LPS의 당 분석에서는, Glc 및 LD-Hep 만이 1:3의 비율로 나타났으며, 미량의 Gal 및 GlcNAc이 존재하였다. GlcNAc의 존재는 각각의 LPS 분자의 지질 A 영역 내 예상된 두개 잔기들 외에 이 혈청군에 알려진 히알루론산 협막의 잔류량으로부터 기인했을 수 있다. 모체 VP161 LPS로부터 유도된 코어 OS 샘플의 CE-ES-MS 분석에서 질량 1805 및 1967 Da을 갖는 두개 단백당형에 해당하는 간단한 질량 스펙트럼(도 37a)이 나타났으며, 그중 작은 단백당형은 2PCho, 3Hex, 4Hep, Kdo의 조성을 가졌다(상기에서, Kdo는 독특한 LPS 당으로 2-케토-3-데옥시-옥툴로손산이고, PCho는 포스페이트 부분으로 포스포콜린이다). 그중 큰 단백당형은 추가 6탄당 종이었다(실시예 6, 표 3 및 도 37a). 돌연변이 AL251 LPS의 SDS-PAGE 분석과 일치하게, 돌연변이 AL251 LPS로부터 유도된 코어 OS 샘플의 CE-ES-MS 분석에서는 질량 605 Da인 심하게 말단이 절단된 분자의 간단한 질량 스펙트럼이 나타났다(실시예 6, 표 3, 도 37b). 이 질량은 2Hep, Kdo 조성에 해당한다. 추가 6탄당 잔기가 존재하는 큰 단백당형이 관찰되었다(767 Da). 1448 Da 인 보다 연장된 단백당형(PCho, 3Hep, 3Hex, Kdo)이 미량 관찰되었으며 4 Hep 잔기들의 모든 모체 보체를 갖는 단백당형들은 관찰되지 않았다(실시예 6, 표 3). 돌연변이 균주의 코어 OS 내에서의 말단 절제 특성을 완벽하게 조사하기 위해, 코어 OS로부터 유도된 모체 및 돌연변이에 대해 ¹H-NMR 실험을 수행하였다. MS 데이터에서 Hep 잔기가 돌연변이 OS에 없는 것으로 나타났고, 아미노산 동족체 비교에서는 WaaQ_PM가 헵토실트랜스퍼라제로 나타났기 때문에 분자의 헵토스 잔기들로부터 얻은 공명을 주의깊게 관찰하였다. ¹H-NMR 스펙트럼을 검사한 결과, 코어 OS를 얻기 위해 적용되는 산성 가수분해 조건 하에서 Kdo 잔기의 재배치로 인해 코어 올리고당에 대해 종종 관찰되는 Kdo에 가장 가까운 헵토스 잔기에 대해 약간의 이종성이 나타났다(도 38). 모체 균주로부터 유도된 코어 OS의 경우, Hep II 아노머 양자에 대한 화학 시프트가 약 5.7 ppm에서 확인되었으며, 이 잔기가 2-치환되었음을 나타냈다(도 38a). 그러나, AL251 돌연변이 OS ¹H-NMR 스펙트럼(도 38b)에서, Hep II 잔기에 대한 아노머 공명은 업필드로 약 0.5 ppm 이동하였으며, 이는 이 잔기가 더 이상 2-치환되지 않았음을 나타낸다. 이제, Hep II 잔기는 앞서 H. 솜누스(H. somnus) 균주에서 관찰된 바와 같이 말단 부분이며, H-4 공명로의 화학 시프트는 이 지정과 일치하였다. 돌연변이의 구조 본성에 대한 결정적인 증거는 2D NOESY 실험으로부터 얻었다(도 39). 특징적인 NOE가 Hep III 및 Hep II 아노머 양자들 사이의 VP161 코어 OS에서 관찰되었는데, 이들은 Hep III 및 Hep II 잔기들 사이의 α-1-2 연결의 특징이다(도 39). AL251 돌연변이 코어 OS의 NOESY 스펙트럼으로, 상기 서술한 특징적인 NOE가 없기 때문에 Hep II의 2-치환이 결핍되었음을 확인하였으며, Hep III 잔기 또한 더 이상 돌연변이 OS 내에 존재하지 않음을 확인하였다. 모체 OS의 Hep II 및 Hep III 잔기 및 돌연변이 OS의 Hep II 잔기에 대한 화학 시프트 및 NOE 데이터가 실시예 6, 표 4에 요약되어 있다. 따라서, 구조 기법으로, 돌연변이 유전자 waaQ _PM 의 LPS 구조에 대한 효과가 Hep III to Hep II의 첨가를 불가능하게 한다는 사실이 입증되었으며(도 40), 이러한 기능은 공지된 헵토실트랜스퍼라제에 대한 암호화 단백질의 강한 유사성과 일치한다. Glucose (Glc), galactose (Gal), N-acetyl glucosamine (GlcNAc) and L-glycero-D-manno-heptose (LD-Hep) in sugar assays of LPS from parent strain VP 161 were 2: 1, respectively. The ratio was 1: 1. On the other hand, in the sugar analysis of LPS obtained from the mutant strain AL251, only Glc and LD-Hep were present in a ratio of 1: 3, and traces of Gal and GlcNAc were present. The presence of GlcNAc may be due to the residual amount of hyaluronic acid capillaries known to this serogroup, in addition to the two residues expected in the lipid A region of each LPS molecule. CE-ES-MS analysis of core OS samples derived from the parent VP161 LPS showed a simple mass spectrum (FIG. 37A) corresponding to two protein glycoforms with masses 1805 and 1967 Da, of which the small protein glycoform was 2 P Cho. , 3Hex, 4Hep, Kdo (wherein Kdo is 2-keto-3-deoxy-octulonic acid with unique LPS sugar and P Cho is phosphocholine as phosphate moiety). Among them, the large protein glycoform was an additional hexose sugar species (Example 6, Table 3 and FIG. 37A). Consistent with SDS-PAGE analysis of mutant AL251 LPS, CE-ES-MS analysis of core OS samples derived from mutant AL251 LPS showed a simple mass spectrum of severely truncated molecules with a mass of 605 Da (Example 6, Table 3, FIG. 37B). This mass corresponds to 2Hep, Kdo composition. Large protein glycoforms with additional hexasaccharide residues were observed (767 Da). Smaller amounts of extended protein glycoforms ( P Cho, 3Hep, 3Hex, Kdo) than 1448 Da were observed and protein glycoforms with all parent complements of 4 Hep residues were not observed (Example 6, Table 3). In order to fully investigate the terminal excision properties in the core OS of the mutant strain, ¹ H-NMR experiments were performed on the parent and the mutations derived from the core OS. The MS data showed that Hep residues were not present in the mutant OS, and since the WaaQ _PM was shown as heptosyltransferase in amino acid homolog comparisons, the resonance obtained from the heptose residues of the molecule was carefully observed. Examination of the ¹ H-NMR spectra showed some heterogeneity for the heptose residues closest to Kdo which are often observed for core oligosaccharides due to rearrangement of Kdo residues under acidic hydrolysis conditions applied to obtain core OS ( 38). For core OS derived from the parent strain, chemical shifts for both Hep II anomers were found at about 5.7 ppm, indicating that this residue was 2-substituted (FIG. 38A). However, in the AL251 mutant OS ¹ H-NMR spectrum (FIG. 38B), the anomeric resonance for Hep II residues shifted about 0.5 ppm upfield, indicating that this residue is no longer 2-substituted. Now, Hep II residues prior H. Cotton Taunus (H. somnus) is an end portion, as observed in the strain, the chemical shift of H-4 to a resonance consistent with this specification. Crucial evidence for the structural nature of the mutations was obtained from 2D NOESY experiments (FIG. 39). Characteristic NOE was observed in VP161 core OS between Hep III and Hep II anomer quantum, which is characteristic of α-1-2 linkage between Hep III and Hep II residues (FIG. 39). The NOESY spectrum of the AL251 mutant core OS confirmed that the 2-substitution of Hep II was deficient because there was no characteristic NOE described above, and that the Hep III residue was no longer present in the mutant OS. Chemical shift and NOE data for Hep II and Hep III residues of the parent OS and Hep II residues of the mutant OS are summarized in Example 6, Table 4. Thus, structural techniques have demonstrated that the effect of the mutant gene waaQ _{PM on} the LPS structure renders it impossible to add Hep III to Hep II (FIG. 40), which function is a coding protein for known heptosyltransferases. Is in line with the strong similarity.

논의Argument

쥐 및 닭에서 STM을 이용하여 처음으로 확인된 P. 멀토시다 LPS 돌연변이 AL251는 예측된 헵토실트랜스퍼라제 유전자 waaQ _PM 에 트랜스포손이 삽입된 것으로 나타났으며, 닭 및 쥐에서 상당한 약독화가 이루어져 있었다. 야생형 VP 161 및 AL251로부터 얻은 세포 용해질의 은염색 폴리아크릴아미드 겔은 돌연변이로부터 얻은 LPS가 말단이 많이 절단되어 있으며(도 36A), 이는 waaQ _PM 가 LPS 구조의 코어 영역에서 헵토스 분자의 첨가를 주관하는 헵토실트랜스퍼라제를 암호화함을 나타낸다. The P. multocida LPS mutant AL251, first identified using STM in rats and chickens, was found to have a transposon insertion into the predicted heptosyltransferase gene waaQ _PM , with significant attenuation in chickens and mice. . Silver-stained polyacrylamide gels of cell lysates obtained from wild-type VP 161 and AL251 had a truncated LPS resulting from mutations (FIG. 36A), indicating that waaQ _PM predominantly added heptose molecules in the core region of the LPS structure. To encode heptosyltransferase.

P. 멀토시다 Pm70 게놈의 분석에서 유전자 waaQ _PM 가 아마도 독립적으로 전사 되며 따라서, 말단이 절단된 LPS 구조 및 닭과 쥐에서의 감소된 생체내 성장률은 다운스트림 유전자 상의 극성 효과 때문이 아닌 waaQ _PM 의 불활성화에 따른 것으로 나타났다. 이러한 사실은 보체 첨가 실험에서 확인되었는데, 야생형 waaQ _PM 유전자를 트랜스로 삽입하면 LPS 구조(도 36A) 및 쥐에서의 생장률의 야생형 수준을 회복하였다. In the analysis of the P. multocida Pm70 genome, the gene waaQ _PM is probably transcribed independently, so that the truncated LPS structure and reduced in vivo growth rate in chickens and rats are not due to the polar effect on downstream genes, but waaQ _PM. It appeared to be due to inactivation of. This was confirmed in the complement addition experiments where wild-type waaQ _PM genes were inserted into trans to restore wild-type levels of LPS structure (FIG. 36A) and growth rate in mice.

LPS 돌연변이 AL251를 이용한 닭에서의 독성 실험은 조류 콜레라 증상의 발병을 지연시켰으며(실시예 6, 표 2) 및 질병의 증상들을 보이는 닭으로부터 분리된 P. 멀토시다는 테트라시클린 민감성을 보였는데, 이는 이들이 더 이상 트랜스포손을 갖고 있지 않음을 의미한다. 감염된 조류들로부터 분리된 P. 멀토시다 DNA의 누클레오티드 서열 데이터로 유전자 waaQ _PM 이 완전하며, 대부분의 경우, 트랜스포손이 전에 삽입되었던 지점에서 누클레오티드 염기가 변화되어 두개의 아미노산이 변화되었음을 확인하였다. AL251의 공격을 받은 닭으로부터 회수한 P. 멀토시다 분리물들은 야생형 LPS를 생성하였음을 나타냈으며, waaQ _PM 유전자가 아미노산 변화에도 불구하고 작용할 수 있음을 확인하였다(도 36B). 모든 것을 고려할 때, 이들 데이터는 AL251로 접종한 닭에서 관찰되는 감염증은 트랜스포손 삽입을 유실한 복귀돌연변이 균주들로 인한것임을 나타낸다. 야생형 P. 멀토시다 균주 VP 161은 매우 독성이 강한 균으로, 50 미만의 박테리아가 닭에서 조류 콜레라를 유발한다. 본 출원인들이 관찰한 결과, 첫번째 10 세대(시험관 내에서 밤새 생장) 후 AL251 세포들의 트랜스포손 절단율이 1%인 것이 58 세대 후 4%로 증가한 것으로 측정되었 다(데이터 도시안됨). 이러한 절단율은 실험 중에 치명적인 조류 콜레라 감염을 유발하는데 충분한 비율로 닭에서의 야생형 복귀돌연변이체의 발생 및 선택을 가능케하였다. 따라서, waaQ _{PM 의} 안정한 불활성화는 조류 콜레라를 유발할 수 없는 P. 멀토시다 균주를 생성한다. 그러나, P. 멀토시다에서 정의된 돌연변이를 제조하는 신뢰할 수 있는 방법이 아직 확립되지 못하였다. Toxicity experiments in chickens with LPS mutant AL251 delayed the onset of avian cholera symptoms (Example 6, Table 2) and showed tetracycline sensitivity to P. multocida isolated from chickens showing disease symptoms. This means that they no longer have transposons. Nucleotide sequence data of P. multocida DNA isolated from infected birds confirmed that the gene waaQ _PM was complete and, in most cases, the nucleotide base was changed at the point where the transposon was previously inserted to change two amino acids. P. multocida isolates recovered from chickens challenged with AL251 showed wild-type LPS production and confirmed that the waaQ _PM gene could function despite amino acid changes (FIG. 36B). All things considered, these data indicate that the infection observed in chickens inoculated with AL251 is due to reverse mutation strains that lost transposon insertion. Wild type P. multocida strain VP 161 is a highly toxic bacterium, with less than 50 bacteria causing avian cholera in chickens. Applicants observed that a 1% transposon cleavage rate of AL251 cells after the first 10 generations (growing in vitro overnight) increased to 4% after 58 generations (data not shown). This cleavage rate allowed the development and selection of wild-type return mutants in chickens at a rate sufficient to cause lethal avian cholera infection during the experiment. Thus, stable inactivation _of waaQ _PM produces a P. multocida strain that cannot induce algal cholera. However, no reliable method of producing the mutations defined in P. multocida has yet been established.

P. 멀토시다 VP 161 야생형 LPS 분석에서, "러프(rough)" LPS이 확인되었다. 이는 H. 인플루엔자, H. 듀크레이, 뇌수막염균(N. meningitidis) 및 임균(N. gonorrhoeae)로부터 분리된 LPS 또는 지질올리고당(LOS)와 유사하며, 오직 짧은 비반복 다당류 단위가 코어에 부착되어 있다. P. 멀토시다 LPS의 내부 코어 구조는 H. 인플루엔자, M. 헤몰리티카 및 H. 듀크레이에 대해 서술한 것과 유사하며, 트리-헵토스 단위가 Kdo 잔기에 의해 지질 A에 부착되어 있다(도 39). AL251 돌연변이체에서, waaQ _PM 를 불활성화하면, 내부 코어 영역 내에 제3의 헵토스 분자(Hep III)가 결핍된 심하게 말단이 절단된 LPS가 발현되었다(도 37b). 돌연변이 내에서 가장 많은 LPS 단백당형은 또한 제1 헵토스의 말단에 있는 모든 당이 결핍되었는데, 이는 waaQ _PM 의 불활성화가 추가 당의 첨가를 억제함을 시사한다(실시예 6, 표 3). 따라서, 대부분 제 3의 헵토스 부족으로 인한 LPS 중간체에서의 배좌 변화는 후속 트랜스퍼라제의 작용을 방지할 수 있다. In P. multocida VP 161 wild-type LPS analysis, "rough" LPS was identified. It is similar to LPS or lipid oligosaccharides (LOS) isolated from H. influenza , H. duchy , N. meningitidis and N. gonorrhoeae, with only short non-repeat polysaccharide units attached to the core. . P. far Toshio the inner core of the LPS structure is similar to that H. influenza, M. H. Molina urticae and described for H. Ray Duke, tri-heptyl monohydrate unit is attached to lipid A by the Kdo moiety ( 39). In the AL251 mutant, waaQ _PM inactivation resulted in severely truncated LPS lacking a third heptose molecule (Hep III) in the inner core region (FIG. 37B). The most LPS protein glycoform in the mutation also lacked all sugars at the ends of the first heptose , suggesting that inactivation of waaQ _PM inhibited the addition of additional sugars (Example 6, Table 3). Thus, coordination changes in LPS intermediates, mostly due to the lack of a third heptose, can prevent the action of subsequent transferases.

전장 LPS 분자가 유실되는 것은 돌연변이 AL251가 쥐에서 생장하고 닭에서 질병을 일으키는 능력에 영향을 미치는 것이 분명하다. 이러한 약독화의 구체적 인 원인은 명확하지 않다. 그러나, 야생형 P. 멀토시다 VP161 LPS에서 두개의 PCho 기가 확인되었으며, 돌연변이 AL251는 극소량의 단백당형 내에 하나의 PCho 기를 가지고 있었다(실시예 6, 표 3). VP161 LPS 내에 하나 이상의 PCho 잔기가 존재하는 것은 보기 드문일이며, LPS 구조에 부착된 위치가 변할 수는 있지만, PCho-부착 LPS를 갖는 박테리아는 오직 하나의 잔기가 부착되어 있다. 유형을 결정할 수 없는 H. 인플루엔자만이 LPS에 부착된 두개의 PCho 잔기를 갖는 것으로 알려져 있다. 흥미롭게도, 혈청형 A 칠면조 분리물인 PM70의 LPS 상에는 PCho 기가 존재하지 않았으며, 이 균주는 닭에 대한 독성이 없었다. The loss of the full-length LPS molecule is obviously affecting the ability of mutant AL251 to grow in mice and to cause disease in chickens. The specific cause of this attenuation is not clear. However, two PCho groups were identified in wild type P. multocida VP161 LPS, and mutant AL251 had one PCho group in a very small amount of protein glycoform (Example 6, Table 3). It is unusual for the presence of one or more PCho residues in VP161 LPS, and although the position attached to the LPS structure may change, bacteria with PCho-attached LPS have only one residue attached. Only H. influenza, whose type cannot be determined, is known to have two PCho residues attached to LPS. Interestingly, there was no PCho group on the LPS of the serotype A turkey isolate, PM70, and the strain was not toxic to chickens.

PCho 기는 주로 H. 인플루엔자, 악티노바실루스 악티노미세템코미턴스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 스트렙토코쿠스 뉴모니에( Streptococcus pneumoniae) 및 나이세리아 종( Neisseria spp)과 같은 점성 병원균의 여러 박테리아 구조에 부착되어 있으며, 혈소판 활성화 수용체(platelet-activating receptor, PAF)에 결합하여 상피 및 내피 숙주 세포들의 접착 및 침입에 있어서 중요한 역할을 한다. LPS의 PCho 양성 단백당형을 갖는 유형을 결정할 수 없는 H. 인플루엔자는 일련의 신호를 통해 인간 기관지의 상패 세포에 부착되고 침투될 수 있다. 그러나, H. 인플루엔자 및 나이세리아종에서, LPS 상의 PCho 발현이 인간 상피 세포의 부착 및 침투를 위해 필요하다 해도 이들의 존재는 몇몇 숙주의 적소에서의 생존율을 저하시키는데 이는 PCho를 발현시키는 균주들이 C-반응성 단백질의 결합 및 보체 시스템의 후속 활성화에 의해 매개되어 혈청에 보다 민감하기 때문이다. 흥미로운 것은, 본 연구에서 LPS 돌연변이 AL251은 닭 혈청에서 보체의 살균 작용에 대해 여전히 내성을 보이는 것으로 나타난 것인데, 이는 박테리아들이 전체 혈청 내성을 갖는데 완전한 야생형 LPS 구조가 필요하지 않음을 의미한다. P. 멀토시다 혈청형 A 균주들의 협막이 혈청 내성을 제공하는 것은 그리 놀라운 사실이 아니었다. PCho group mainly H. influenza, Bacillus bad bad Martino Martino micro system Cormier capacitance (Actinobacillus actinomycetemcomitans), streptococcus pneumoniae in (Streptococcus pneumoniae), and Neisseria species (Neisseria It is attached to various bacterial structures of viscous pathogens such as spp ) and binds to platelet-activating receptors (PAFs) and plays an important role in adhesion and invasion of epithelial and endothelial host cells. H. influenza, which cannot determine the type with PCho positive protein glycotype of LPS, can attach and infiltrate the plaque cells of the human bronchus through a series of signals. However, in H. influenza and Neisseria species, although PCho expression on LPS is required for adhesion and invasion of human epithelial cells, their presence decreases the survival rate in places of some hosts, which means that the strains expressing PCho -More sensitive to serum, mediated by the binding of reactive proteins and subsequent activation of the complement system. Interestingly, the LPS mutant AL251 in this study was shown to be still resistant to the bactericidal action of complement in chicken serum, indicating that bacteria do not need a complete wild-type LPS structure to have total serum resistance. It was not surprising that the capillaries of P. multocida serotype A strains provided serum resistance.

결론적으로, 발현되 P. 멀토시다 waaQ _PM 돌연변이는 심하게 말단이 절단된 LPS였다. 또한, 야생형 P. 멀토시다 LPS 분자 및 waaQ _PM 돌연변이 분자의 내부 코어 구조를 결정하였으며, 제3의 헵토스 잔기를 LPS의 내부 코어에 초가하기 위해서는 기능성 waaQ _PM 유전자가 필요함이 입증되었다. 따라서, waaQ _PM 가 헵토실트랜스퍼라제 III로 확인되었으며, 독성 실험을 통해, 그의 활성은 P. 멀토시다 균주의 선천적인 숙주인 닭에서 박테리아 독성에 필요한 것이 확인되었다. waaQ _PM 를 불활성화하면, 내부 코어 내 제3의 헵토스가 완전히 사라지며, 그 결과 야생형 단백당형 모두 또한 사라진다. 돌연변이 LPS로부터 확인되는 대부분의 단백당형들은 그램 음성 점성 병원균들에서 박테리아 독성에 매우 중요한 역할을 하는 PCho 잔기가 결핍되었다. In conclusion, the expressed P. multocida waaQ _PM mutation was a severely truncated LPS. In addition, the internal core structure of the wild type P. multocida LPS molecule and the waaQ _PM mutant molecule was determined, demonstrating the need for a functional waaQ _PM gene to add a third heptose residue to the inner core of the LPS. Thus, waaQ _PM was identified as heptosyltransferase III, and toxicology experiments confirmed that its activity is required for bacterial toxicity in chickens, which are the native host of the P. multocida strain. Inactivating waaQ _PM completely eliminates the third heptose in the inner core, resulting in the loss of both wild type protein glycoform. Most protein glycoforms identified from mutant LPS lack PCho residues that play a very important role in bacterial toxicity in Gram negative viscous pathogens.

실시예 6, 표 1. 본 연구에 이용된 박테리아 균주, 플라즈미드, 올리고뉴클레오티드(올리고).Example 6, Table 1. Bacteria strains, plasmids, oligonucleotides (oligo) used in this study.

실시예 6, 표 2. 10개의 닭 그룹에서 VP161 및 AL251의 악성. Example 6, Table 2. Malignants of VP161 and AL251 in 10 chicken groups.

(CFU=Colony Forming Units, h=hours, N.D=Not Determined)(CFU = Colony Forming Units, h = hours, N.D = Not Determined)

실시예 7. 수의학적 병원균 특이 보존된 LPS 구조를 나타내는 만헤이미아 헤몰리티카의 B-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제 돌연변이의 생성 및 이 LPS 구조에 대한 항체들의 전개 및 교차 반응성. Example 7 Hay only lost veterinary pathogens, showing a specific structure preserved LPS H. Molina -D- glycero of a B- urticae manno-heptyl tosyl generation of transferase mutations and development of antibodies to the LPS structure and cross-reactivity.

수의학적 병원균인 만헤이미아 헤몰리티카 , 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다로부터 얻은 지질다당류들에 대한 앞선 연구에서, 조사된 모든 균주 내 존재하는 보존된 내부 코어 올리고당 구조가 확인되었다. 백신으로서 이 내부 코어 구조의 가능성을 시험하기 위해, 돌연변이 유도 방법을 적용하여 만헤이미아 헤몰리티카의 D-글리세로-O-만노-헵토실트랜스퍼라제 유전자(losB)에 개입하였다. 이 유전자는 보존된 내핵 밖의 첫번째 잔기인 O-글리세로-D-만노-헵토스 잔기의 첨가를 주관하는 효소를 암호화하며, 이의 불활성화는 돌연변이 LPS 분자에 대한 말단 단위로서 보존된 내부 코어 구조를 노출시킨다. 후속 분석으로 다음과 같은 돌연변이 LPS의 구조를 결정하고, losB의 트랜스 보강으로 losB 유전자가 α-1, 6-D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제를 암호화하는 것을 확인하였다. Veterinary pathogen million hey Mia Hemolytica , Actinobacillus Previous studies of lipopolysaccharides obtained from Pluronomymonia and Pasteurella multocida have identified conserved internal core oligosaccharide structures present in all strains investigated. For a vaccine to test the potential of the internal core structure, only by applying the mutation induction method H. Hey Mia as -O- D- glycero Morley manno urticae it was involved in heptane tosyl transferase gene (losB). This gene encodes an enzyme that governs the addition of an O-glycero-D-manno-heptos residue, the first residue outside the conserved inner nucleus, the inactivation of which results in a conserved internal core structure as a terminal unit for the mutant LPS molecule. Expose Subsequent analysis determined the structure of the following mutant LPS and confirmed that the losB gene encodes α-1, 6-D-glycero-D- manno- heptosyltransferase by trans reinforcement of losB .

폴리클론 및 모노클로날 항체들을 쥐에서 이 LPS 구조로 생장시키고, 만헤이미아 헤몰리티카 , 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다, 3종 모두의 LPS 및 전세포를 인식함을 확인하였다. Polyclonal and monoclonal antibodies are grown in this LPS structure in mice, Manhemia Hemolytica , Actinobacillus It was confirmed that all three species recognize LPS and whole cells, Pluronyumoniae and Pasteurella multocida .

세균 백신 또는 정제 없이 변성시킨 생 균주는 실제 관행적으로 사용되어온 백신이지만 여러 시험 및 실험 연구에서 여러 번 세균 백신이 효과가 없거나 실제로 종종 부작용을 초래하는 것으로 나타났다. 이 실시예는 효과적이고 정의된 하위 단위 백신의 필요성을 처리하기 위한 것이다. 백신 후보로 고려될 만한 항원은 백신 항원에 대한 백신 반응이 이후 살아있는 생물체를 표적으로 하기 위해 거의 대부분 자연 상태에서 박테리아 표면에 나타난다. Bacterial vaccines or live strains denatured without purification are vaccines that have been used in practice, but several trials and experimental studies have shown that bacterial vaccines are ineffective or often have side effects. This example is to address the need for an effective and defined subunit vaccine. Antigens that may be considered candidates for vaccines appear on the bacterial surface in almost all natural states, where the vaccine response to the vaccine antigen is then targeted to living organisms.

이러한 정황으로 볼 때, 수의학적 생물체는 백신 후보로 사용될 수 있는 표면 노출 탄수화물 부분들을 함유한다. 탄수화물 부분들은 지질다당류(LPS) 및 협막 다당류이다. 협막 다당류는 박테리아 표면에 직접 연결된 몇몇 탄수화물 잔기의 반복 단위이며, LPS는 LPS 분자를 지방산 잔기에 의해 박테리아 표면에 연결시키는 지질 A 영역, 지질 A 영역을 제 3의 영역에 연결시키는 비교적 보존된 코어 올리고당 영역, 및 가변성 다당류 항원(O-항원)의 3 영역으로 이루어져 있다. 협막 및 O-항원 다당류들의 균주 이종성은 동족 균주 또는 동일한 구조를 생성하는 균주들만을 포함하는 능력 때문에 경제적으로 경쟁력 있는 백신 후보로서 이들 구조들을 배제시킨다. 대신에, 보존된 코어 LPS 구조를 확인할 수 있다면, 이는 모든 균주들에 대해 넓은 적용 범위를 제공하는 백신 후보로서의 유용성을 가질 것이다. In this context, veterinary organisms contain surface exposed carbohydrate moieties that can be used as vaccine candidates. Carbohydrate moieties are lipopolysaccharide (LPS) and capsular polysaccharides. Capsular polysaccharides are repeating units of several carbohydrate moieties directly linked to the bacterial surface, and LPS is a relatively conserved core oligosaccharide linking the lipid A region, the lipid A region, to the third region, which links the LPS molecule to the bacterial surface by fatty acid residues. Region, and three regions of variable polysaccharide antigen (O-antigen). Strain heterogeneity of the capsular and O-antigen polysaccharides excludes these structures as economically competitive vaccine candidates because of their ability to include only cognate strains or strains that produce the same structure. Instead, if one can identify the conserved core LPS structure, it will have utility as a vaccine candidate providing a wide range of coverage for all strains.

이들 3종의 LPS 구조에 대해 이미 진행되거나 진행 중인 구조분석에서 이제껏 조사된 App , Pm 및 Mh 균주들의 보존된 내부 코어 LPS 구조가 확인되었다. 이러한 보존된 내부 코어 단위의 검사하기 위해 돌연변이 유도 전략을 적용하여 말단 잔기로 이 구조를 노출시켜야만 하는데, 이때 외부 코어 생합성에 책임이 있는 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자(들)은 파괴된다. 이러한 돌연변이 유도 결과로, 보존된 내부 코어 구조가 노출되었다. Conserved internal core LPS structures of the App , Pm and Mh strains examined so far have been identified in the ongoing or ongoing structural analysis of these three LPS structures. To examine this conserved inner core unit, a mutation induction strategy must be applied to expose this structure to the terminal residues, at which time the gene (s) encoding the glycosyltransferase responsible for outer core biosynthesis is destroyed. As a result of this mutation induction, a conserved internal core structure was exposed.

이 연구는 외부 코어 장식의 제1 생합성 단계를 책임지는 만헤이미아 헤몰리티카로부터 얻은 헵토실트랜스퍼라제 유전자의 확인, 클로닝 및 돌연변이 유도에 대해 서술한다. 돌연변이 균주로부터 얻은 LPS의 서열 구조 분석으로 LPS가 적절 히 끝이 절단된 것으로 확인되었다. 이어서, 돌연변이 균주를 사용하여 보존된 LPS 구조에 대한 항체들을 생성하였으며, 이들 항체들을 3개의 표적 종들의 균주들에 대한 교차 반응성을 검사하였다. This study describes the identification, cloning and mutagenesis of the heptosyltransferase gene obtained from Manhemia haemolytica responsible for the first biosynthesis step of the outer core decoration. Sequence structure analysis of the LPS obtained from the mutant strains confirmed that the LPS was properly truncated. Mutant strains were then used to generate antibodies against conserved LPS structures, and these antibodies were examined for cross reactivity against strains of three target species.

실험Experiment

박테리아 균주 및 성장 조건Bacterial Strains and Growth Conditions

Mh 균주들 A1 Sh1217(S. Highlander, Baylor College of Medicine, Houston Texas) 및 A1 균주 O1 A ADRI(Perry Fleming, IBS)를 37 ℃의 BHI 플레이트 또는 BHI 액체 배지에서 관례적으로 배양하였다. E. coli DH10B(Invitrogen, Carlsbad California)을 재조합 플라스미드들의 클로닝과 번식에 사용하였으며, 적절한 항생제(암피실린 100 ㎍/ml, 클로르암페니콜 25㎍/ml)로 보충된 LB 배지에서 생장시켰다. 필요하다면, M. 헤몰리티카 균주를 암피실린(50㎍/ml) 및 클로람페티콜(5㎍/㎖)이 보충된 BHI 배지에서 배양하였다. Mh strains A1 Sh1217 (S. Highlander, Baylor College of Medicine, Houston Texas) and A1 strain O1 A ADRI (Perry Fleming, IBS) were customarily cultured in BHI plates or BHI liquid medium at 37 ° C. E. coli DH10B (Invitrogen, Carlsbad California) was used for cloning and propagation of recombinant plasmids and grown in LB medium supplemented with appropriate antibiotics (100 μg / ml ampicillin, 25 μg / ml chloramphenicol). If necessary, M. haemolytica strains were incubated in BHI medium supplemented with ampicillin (50 μg / ml) and chlorampeticol (5 μg / ml).

losBlosB 유전자에 삽입된 재조합 플라스미드의 구성 Construction of Recombinant Plasmids Inserted into Genes

근접지역 프라이머(flanking primer)를 사용하여 균주 O1A의 염색체 DNA로부터 losB 유전자를 PCR에 의해 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 losB-kpn 5' ATATGGTACCTATCAGCGGTAGAGATTCTAAC 및 losB-xba 5'TGCTC TAGACCGAACCTGCACCAAAAAGATTTAACGC이었다. 이들 프라이머는 2Kb 프레그먼트 증폭하였으며, 이어서 Kpn/Xba 제한효소 소화 후 pBluescript로 클로닝된 후 E. coli DH10B로 전기천공하였다. 이어서, 이 플라스미드를 주형으로 사용한 역 PCR을 losB 구조 유전자 내 서열에 대응하는 하기 프라이머 5 'CCGCTGCGAGAGATAAGTGGATACTTTATC-3' 및 5'GACATTGGGATCTTTATTTAGATTTCAAACCGAC-3'와 함께 수행하고, 생성물을 아가로스 겔로부터 절단하고 Qiagen 겔 추출 키트를 사용하여 정제하였다. 변성된 클로르암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(Cat) 카셋트를(plpCat)를 pNFplpcat로부터 PCR에 의해 증폭시켰으며, 생성물은 상기 PCR 생성물에 뭉툭한 말단이 결찰되어 pSK losB::cat을 생성하였다. 재조합 플라스미드의 제한 효소 맵핑 및 서열분석으로 Cat 카세트가 losB 유전자와 동일한 배위의 losB 구조 유전자에 삽입되어 있음을 확인하였다. The losB gene was amplified by PCR from the chromosomal DNA of strain O1A using a flanking primer. Primers used were losB-kpn 5 'ATATGGTACCTATCAGCGGTAGAGATTCTAAC and losB-xba 5'TGCTC TAGACCGAACCTGCACCAAAAAGATTTAACGC. These primers were amplified by 2Kb fragments and then cloned into pBluescript after Kpn / Xba restriction enzyme digestion and then electroporated with E. coli DH10B. The reverse PCR using this plasmid as a template was then performed with the following primers 5 'CCGCTGCGAGAGATAAGTGGATACTTTATC-3' and 5'GACATTGGGATCTTTATTTAGATTTCAAACCGAC-3 'corresponding to the sequences in the losB structural gene, and the product was cleaved from the agarose gel and Qiagen gel extraction Purification using the kit. The denatured chloramphenicol acetyl transferase (Cat) cassette (plpCat) was amplified by PCR from pNFplpcat, and the product was blunted at the PCR product to generate pSK losB :: cat. Restriction enzyme mapping and sequencing of the recombinant plasmids confirmed that the Cat cassette was inserted into the losB structural gene in the same configuration as the losB gene.

losBlosB 균주의 선택 Selection of strain

플라스미드 pSK losB::cat를 전기천공에 의해 Mh 세포들에 혼입하였다. 간단히 서술하면, 전기 천공 후, 세포들을 즉히 미리 데운 BHI 액체 배지 1 ㎖에 옮기고 37 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 형질전환체를 5 ㎎/㎖ 클로람페니콜을 함유한 BHI 한천 배지에 플레이팅하여 선택하였다. 형질전화체가 더 이상 pSK losB::cat 플라스미드를 갖고 있지 않은 것을 확인하기 위해, 콜로니들을 BHI/ Amp 플레이트에 플레이팅하고 암피실린 민감성 콜로니 PCR에 의해 검사하였다. 이중 재조합 후 losB 유전자의 삽입 불활성화를 PCR에 의해 확인하였다. 초기 클로닝 실험에 사용되었던 losB-Kpn 및 losB-Xba의 서열 업스트림 및 다운스트림에 특이적인 프라이머로 Cat 카셋트가 losB 유전자의 염색체 복제에 삽입되었음을 확인하였다. Plasmid pSK losB :: cat was incorporated into Mh cells by electroporation. Briefly, after electroporation, cells were immediately transferred to 1 ml of preheated BHI liquid medium and incubated at 37 ° C. for 1.5 hours. Transformants were selected by plating on BHI agar medium containing 5 mg / ml chloramphenicol. To confirm that the transfectants no longer have the pSK losB :: cat plasmid, colonies were plated on BHI / Amp plates and examined by ampicillin sensitive colony PCR. Insertion inactivation of the losB gene after double recombination was confirmed by PCR. The primers specific for the upstream and downstream sequences of losB-Kpn and losB-Xba that were used in the initial cloning experiments confirmed that the Cat cassette was inserted into the chromosomal replication of the losB gene.

losBlosB 유전자에 의한  By gene losBlosB 트랜스 돌연변이의 보강 Enhancement of Trans Mutants

pSK losB(상기 참조)로부터 얻은 losB 유전자의 야생형 복제물을 Xba 및 Kpn 를 사용하는 제한 효소 소화에 의해 절단하고 셔틀 플라스미드 pNF2176에 클로닝하여 pNF2176AalosB를 생성하였다. 이어서, 이 플라스미드를 Mh losB 돌연변이체에 전기 천공하고 형질전환체를 Amp/Cat에서 선택하였다. pSK losB to the wild-type copy of a gene obtained from losB (see above) cut by a restriction enzyme digestion using the Kpn and Xba and cloned into the shuttle plasmid, generating the pNF2176 pNF2176AalosB. This plasmid was then electroporated into Mh losB mutants and the transformants were selected at Amp / Cat.

돌연변이 Mutation LPSLPS 의 특성 분석Characteristic Analysis of

표준 기법으로 희생시컨 세포들로부터 LPS를 분리하였다. 부분적으로 메틸화한 알디톨 아세테이트를 앞서 기재한 바와 같이 제조하였다. 코어 OS 및 O-탈아실화 LPS(LPS-OH) 를 정제하였다. 완전히 탈아실화한 LPS를 정제하였다. 질량 스펙트럼 분석 및 핵자기 공명 스펙트럼 분석을 수행하였다. LPS was isolated from sacrificial cells by standard techniques. Partially methylated alditol acetate was prepared as described previously. Core OS and O-deacylated LPS (LPS-OH) were purified. Fully deacylated LPS was purified. Mass spectral analysis and nuclear magnetic resonance spectral analysis were performed.

항체 생성Antibody Production

암컷 BALB/c 쥐 5 마리를 0, 14 및 35일(D)에 포르말린으로 희생시키고, PBS로 세척한 Mh losB 의 108 개 세포(0.5 ㎖)로 복강내(ip) 면역화하였다. D42에 소량의 혈액을 각각의 쥐의 안면에서 제거하여 실험 채혈을 수행하고 유도된 혈청을 Mh losB 및 Mh wt LPS에 대한 교차반응성에 대해 ELISA를 수행하여 검사하였다. D54에 각각의 쥐에게 다시한번 복강내 면역화를 실시하였으며, 쥐 # 2는 정맥 내로(iv) 4x10⁷개 세포(0.2 ㎖)를 주입받았다. D57에 이 쥐의 췌장을 제거하고 골수종 세포선에 융합시켰다. 이 융합에 대한 초기 스크리닝 항원들은 Mh losB 및 Mh wt로부터 얻은 정제된 LPS였다. 쥐 # 3 및 # 5 모두를 D90에 Mh losB 전세포(약 108)의 복강내 면역화로 면역 증대하였다. 쥐 # 3은 D131에 Mh losB 세포들로 복강내 및 정맥내로 주입하여 면역증대시키고 D134에 췌장 세포 융합을 준비하였으 며, 쥐 # 5는 D152에 Pm 균주 VP161로부터 얻은 포르말린 희생시킨 전세포를 복강내 및 저맥내로 주입하여 면역증대시키고 췌장 세포들을 D155에 융합시켰다. 쥐 # 3 및 # 5 융합에 대한 초기 스크리닝 항원은 App 혈청형 5a 및 Pm 균주 VP161로부터 얻은 정제된 LPS였다. 모노클로날 항체의 복수액을 준비하였다. A five female BALB / c mice 0, and 14 were immunized 35 days (D) were sacrificed on the formaldehyde, my (ip) with 108 cells intraperitoneally (0.5 ㎖) of Mh losB washed with PBS. A small amount of blood was removed from each rat's face at D42 to perform experimental blood collection and the induced serum was examined by ELISA for cross-reactivity to Mh losB and Mh wt LPS. Each rat was once again intraperitoneally immunized at D54, and rat # 2 received 4 × 10 ⁷ cells (0.2 ml) intravenously (iv). At D57, the rat pancreas was removed and fused to myeloma cell lines. Initial screening antigens for this fusion were purified LPS obtained from Mh losB and Mh wt. Both mice # 3 and # 5 were immune boosted by intraperitoneal immunization of Mh losB whole cells (about 108) at D90. Mice # 3 were intraperitoneally and intravenously injected with Mh losB cells at D131 for immunostimulation and pancreatic cell fusion at D134, and rat # 5 at D152. Formalin sacrificial whole cells obtained from Pm strain VP161 were injected intraperitoneally and intraperitoneally to immunize and pancreatic cells were fused to D155. Initial screening antigens for rat # 3 and # 5 fusions were determined by App serotype 5a and Purified LPS obtained from Pm strain VP161. Ascites liquid of monoclonal antibody was prepared.

LPSLPS ELISAELISA

정제되고 특성이 널리 알려진 야생형 및 돌연변이 LPS를 고체상 간접 ELISA에 사용하여 mAb의 결합 특이성을 알아보았다. Purified and well-known wild-type and mutant LPS were used for solid phase indirect ELISA to determine binding specificity of mAb.

전세포Whole cell ELISAELISA

페놀로 파괴한 세포를 사용하였다. Cells destroyed with phenol were used.

[결과][result]

후보 candidate 글리코실트랜스퍼라제의Of glycosyltransferases 확인 Confirm

본원의 미생물 3종(Mh, App 및 Pm)으로부터 얻은 LPS는 동일한 내부 코어 구조를 갖는다(실시예 7, 표 1). 이 보존된 내부 코어 구조가 유용한 백신 후보인지 그 가능성을 시험하기 위해 이 영역 밖의 외부 코어 장식을 제거해야만 한다. 이를 용이하게 하기 위해, 취해진 시도는 외부 코어 장식의 제1 글리코스 첨가에 관여하는 글리코실트랜스퍼라제 유전자를 확인하고 돌연변이를 유도하는 것이다. Mh이 돌연변이 유도 연구를 위해 선택되었는데, 이는 이 생물 내 존재하는 O-항원의 양이 App에 비해 적기 때문이며, 따라서, 후속 면역학 연구에 방해 되지 않기 때문이다. Pm 균주 Pm70 [24]에 대한 게놈 서열화가 완료되고 Pm (균주 P-3480), App (혈청형 1 및 5b) 및 Mh (Al 균주)에 대한 게놈 서열화가 진행중이다. 도 41에 도시된 바와 같이, 후보 글리코실트랜스퍼라제들은 App 혈청형 1 및 Mh 균주 A1 모두에서 확인되었다. Galarneau 일동은 미니-Tn10 트랜스포손 돌연변이 유도에 의한 코어 올리고당 생합성에 관련된 것으로 밝혀진 두개의 유전자들 사이에 위치한 App 의 lbgA 유전자를 확인하였다. 인접한 유전자 lbgB는 헤모필루스 듀크레이로부터 얻은 D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제에 대해 상당한 상동성을 보였다. App로부터 얻은 lbgB 유전자를 갖는 Mh 게놈 서열의 블라스트 분석에서(Baylor College, Houston) O-글리세로-O-만노-헵토실트랜스퍼라제에 인접한 동족체가 발견되었다. 확인된 최상의 lbgB 동족체는 첫번째 L-글리세로-O-만노-헵토스 잔기의 첨가를 주관하는 D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제인 것으로 확인되었으며, 본 출원인은 따라서 두번째 동족체(losB로 명명함)는 두번째 O-글리세로-D-만노-헵토스 잔기의 첨가를 주관하는 D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제로 결정하였다. LPS obtained from three microorganisms ( Mh , App and Pm ) of the present application have the same internal core structure (Example 7, Table 1). To test the possibility that this conserved inner core structure is a useful vaccine candidate, the outer core decoration outside this area must be removed. To facilitate this, the attempt taken is to identify the glycosyltransferase gene involved in the first glycos addition of the outer core ornament and to induce mutations. Mh was chosen for mutagenesis studies because the amount of O-antigens present in this organism was less than that of App and therefore would not interfere with subsequent immunological studies. Genome sequencing for Pm strain Pm70 [24] is complete and Genomic sequencing for Pm ( strain P-3480), App ( serotypes 1 and 5b) and Mh ( Al strain) is ongoing. As shown in FIG. 41, candidate glycosyltransferases were identified in both App serotype 1 and Mh strain A1. Galarneau identified the lbgA gene of App located between two genes found to be involved in core oligosaccharide biosynthesis by mini-Tn10 transposon mutation induction. The adjacent gene lbgB is Haemophilus Significant homology was shown for D-glycero-D-manno-heptosyltransferase obtained from Duke . In a blast analysis of the Mh genomic sequence with the lbgB gene from App (Baylor College, Houston) a homologue was found adjacent to O-glycero-O-manno-heptosyltransferase. The best lbgB homologue identified was found to be D-glycero-D-manno-heptosyltransferase, which prescribes the addition of the first L-glycero-O-manno-heptos residues, and we therefore found the second homologue ( losB Was determined as D-glycero-D-manno-heptosyltransferase, which governs the addition of a second O-glycero-D-manno-heptose residue.

MhMh 에서 in losBlosB 의 돌연변이 유도Induction of mutations in

플라스미드 pSK losB::cat는 Mh에서 복제물을 생성하지 못하며 자살 플라스미드로서의 기능 또한 그러하다. Mh로의 전기 천공(5ug 플라스미드 DNA) 후, 136 cat^R 형질전환체를 얻었으며, 그들 중 10⁴를 증폭하였다. 이들 중 두개를 이후 연구를 위해 무작위로 선택하였다. 두 돌연변이는 삽입 부위를 묶어주는 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 이중 크로스오버를 거치는 것이 확인되었다.(데이터 도시 안됨). LPS 구조(하기 참조)에서 관찰되는 효과가 losB 유전자의 불활성화에 따른 것임을 확실히 하기 위해, 본 출원인은 셔틀 벡터 pNF2176에 대한 losB 유전자의 야생형 복제물로 돌연변이 균주를 보완하였다. Plasmid pSK losB :: cat does not produce a replica at Mh and so also functions as a suicide plasmid. After electroporation to Mh (5 ug plasmid DNA), 136 cat ^R transformants were obtained and 10 ⁴ of them were amplified. Two of these were randomly selected for later studies. Both mutations were confirmed to undergo a double crossover by PCR using primers to bind the insertion site (data not shown). The effects observed in LPS structure (see below) to ensure that according to the inactivation of the gene losB, the present Applicants have supplemented the mutant strains with the wild-type copy of the gene for the shuttle vector losB pNF2176.

losBlosB 돌연면이로부터From sudden 얻은  Obtained LPSLPS 의 특성 조사Investigation of properties

LPS를 표준 방법들에 의해 분리하였다. 정제된 LPS의 당분석에서 글루코스(Glc), D-글리세로-D-만노-헵토스(DD-Hep), 및 L-글리세로-O-만노-헵토스(LD-Hep)가 대략 2:1:3으로 나타났으며, 미량의 N-아세틸-글루코사민(GlcNAc)이 또한 관찰되었다. 이 당 조성물은 돌연변이 LPS의 예측된 구조와 일치하였으며, 또한, 돌연변이 유도된 losB 유전자가 동족체 데이터로부터 예상한 바와 같이 특정 헵토실트랜스퍼라제이며 4개의 다른 헵토스 잔기들이 돌연변이 LPS에 남아있기 때문에 헵토스 생합성에 관련된 유전자는 아님을 암시한다. O-탈아실화 LPS(LPS-OH)를 표준 방법들에 의해 제조하고 CE-MS에 의해 분석하였다(실시예 7, 표 2). 간단한 MS 스펙트럼을 관찰하였으며(도 42a), 2가(1172.3²), 3가(781.3^3-) 및 4가(585.8^4-) 이온들이 Hex2, Hep4, Kdo-P, 지질 A-OH의 예측된 조성과 일치하는 것으로 나타났다. 음전하 이온들 2가(1065.3^2-), 3가(709.8^3-) 및 4가(532.3^4-)이 또한 관찰되었으며, 이들은 추가 Kdo 잔기의 존재에 대응하며 6탄당, 헵토스 및 포스페이트 부분들이 결핍되어 있었다. 이러한 양태는 전에 관련 수의학적 병원균 파스튜렐라 멀토시다에서 관찰된 바 있다. 코어 올리고당(OS)을 정제하고 CE-MS에 의해 유사하게 검사하여 (실시예 7, 표 2), 1가(1312^- ) 및 2가(655.6^2-) 이온들의 스펙트럼이 예상된 Hex4, Hep2, Kdo의 조성과 일치함을 알았다. 돌연변이 LPS의 연결 패턴이 돌연변 이 유도에 의해 변화되지 않음을 입증하기 위해, 코어 OS에 대한 메틸화 분석을 실시하였으며, 말단 Glc, 6-치환 Glc, 말단 LD-Hep, 말단 DD-Hep, 2-치환 LD-Hep 및 3,4,6-3치환 LD-Hep이 대략 같은 몰비로 존재하는 것이 확인되었으며, 다시한번 예측된 돌연변이 LPS 구조와 일치하였다. 완전 탈아실화 LPS에 대한 NMR 실험으로부터 돌연변이 LPS의 코어 OS 구조를 최종 확인하였으며, 야생형 LPS 스펙트럼(도 43)에 대한 비교를 통해, 말단 Gal-Hep 이탄당이 돌연변이 LPS에 존재하지 않음이 분명해졌다. 화학 시프트의 지정(실시예 7, 표 3)으로 보존된 코어 OS의 모든 연결들이 야생형 LPS에서 얻은 것들과 동일하며, 따라서 원하는 구조를 얻었음을 확인하였다. LPS-OH를 보강 돌연변이 균주로부터 얻었으며, CE-ES-MS 분석을 통해, 추가 Kdo 잔기를 갖는 소량의 단백당형으로 wt LPS 표현형을 확인하였다(실시예 7, 표 2, 도 42b). LPS was isolated by standard methods. Glucose (Glc), D-glycero-D-manno-heptose (DD-Hep), and L-glycero-O-manno-heptose (LD-Hep) were approximately 2: 2 in the sugar assay of purified LPS. 1: 3, traces of N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) were also observed. This sugar composition was consistent with the predicted structure of the mutant LPS, and also heptose because the mutagenesis losB gene is a specific heptosyltransferase as expected from homolog data and 4 other heptose residues remain in the mutant LPS. It does not imply that the gene involved in biosynthesis. O-deacylated LPS (LPS-OH) was prepared by standard methods and analyzed by CE-MS (Example 7, Table 2). A simple MS spectrum was observed (FIG. 42A) and divalent (1172.3 ² ), trivalent (781.3 ^3- ) and tetravalent (585.8 ^4- ) ions predicted Hex2, Hep4, Kdo-P, lipid A-OH It appeared to match the composition. Negative charge ions divalent (1065.3 ^2- ), trivalent (709.8 ^3- ) and tetravalent (532.3 ^4- ) were also observed, corresponding to the presence of additional Kdo residues and lacking hexasaccharide, heptose and phosphate moieties It was. This embodiment has been previously observed in the relevant veterinary pathogen Pasteurella multocida. Core oligosaccharides (OS) were purified and similarly examined by CE-MS (Example 7, Table 2), where Hex4, Hep2, which predicted spectra of monovalent (1312 ⁻ ) and divalent (655.6 ^2- ) ions It is found that the composition is consistent with Kdo. To demonstrate that the linkage pattern of the mutant LPS is not altered by mutagenesis induction, methylation analysis for the core OS was performed, and terminal Glc, 6-substituted Glc, terminal LD-Hep, terminal DD-Hep, 2- It was confirmed that the substituted LD-Hep and the 3,4,6-3 substituted LD-Hep were present in approximately the same molar ratio, which was again consistent with the predicted mutant LPS structure. NMR experiments for complete deacylated LPS confirmed the core OS structure of the mutant LPS, and by comparison to the wild-type LPS spectrum (FIG. 43), it became clear that the terminal Gal-Hep peat sugar was not present in the mutant LPS. It was confirmed that all connections of the core OS conserved by the assignment of chemical shifts (Example 7, Table 3) are identical to those obtained with wild-type LPS, thus obtaining the desired structure. LPS-OH was obtained from augmented mutant strains and, via CE-ES-MS analysis, the wt LPS phenotype was identified with a small protein glycotype with additional Kdo residues (Example 7, Table 2, FIG. 42B).

항체 생성 Antibody Production

5마리의 쥐로부터 얻은 혈청을 최초 및 증대 면역 후 Mh losB 및 Mh wt LPS를 인식하는 능력에 대해 검사하였다(도 44). 쥐 # 2가 wt 균주에 대해 가장 높은 IgG 역가를 보였기 때문에, 이 쥐를 mAb를 생성하는 제1차 융합 실험을 위해 선택하였다. Mh losB를 인식한 9개의 안정한 하이브리도마를 생성하고, Mh, App 및 Pm로부터 얻은 wt LPS와 교차 반응하는 능력을 검사하였다(도 45). 그러나, mAb는 모두 App 및 Pm LPS를 인식할 수 없었으며, 오직 4개의 mAb 만이 Mh wt LPS를 인식할 수 있었다. D42부터 폴리클론 혈청을 검사한 결과, 존재하는 항체들이 App 혈청형 5a, Pm 균주 VP161 및 X73으로부터 얻은 정제된 LPS는 인식할 수 있지만 App 혈청형 1 은 인식할 수 없는 것으로 나타났다(도 46). 따라서, 융합은 쥐 # 3에 대해 수행하였으나 App 혈청형 5a 및 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 정제된 LPS를 인식할 수 있는 어떠한 하이브리도마도 확인되지 않았다. 마지막으로, D 152에 폴리클로날 혈청에 대한 검사로서 Pm 균주 VP 161로부터 얻은 희생된 전세포들로 최종 면역증대시킨 후 쥐 #5에 대한 융합을 수행한 결과 Mh losB 및 wt, App 혈청형 1 및 5a 및 Pm 균주 VP161 및 X73 으로부터 얻은 LPS에 대한 교차 반응성을 보였다(도 47). 14개의 하이브리도마를 얻었으며, 11 개는 오직 Pm 균주 VP161만으로부터 얻은 정제된 LPS를 인식할 수 있었으며, 3개는 App혈청형 5a 및 Pm 균주 VP161로부터 얻은 정제된 LPS를 인식할 수 있었다. 이후, 이들 3개의 교차 반응성 하이브리도마는 App 혈청형 1, Pm 균주 X73 및 Mh losB 및 wt 균주들로부터 얻은 정제된 LPS를 인식할 수 있는 것으로 밝혀졌고, 11개의 하이브리도마를 인식하는 Pm VP 161는 단지 관련된 Pm 균주 X73만을 인식할 수 있었다(도 48, 실시예 7, 표 4). Sera from five mice were examined for their ability to recognize Mh losB and Mh wt LPS after initial and augmented immunity (FIG. 44). Since rat # 2 showed the highest IgG titer against the wt strain, these mice were selected for the first fusion experiment producing mAb. Nine stable hybridomas that recognized Mh losB were generated and tested for their ability to cross react with wt LPS obtained from Mh , App and Pm (FIG. 45). However, mAbs are both App and Pm LPS could not be recognized, and only 4 mAbs could recognize Mh wt LPS. Testing of polyclonal sera from D42 revealed that the antibodies present were App serotype 5a, Purified LPS obtained from Pm strains VP161 and X73 was able to recognize but not App serotype 1 (FIG. 46). Thus, fusion was performed on rat # 3 but with App serotypes 5a and No hybridomas were able to recognize purified LPS obtained from Pm strain VP 161. Finally, Mh losB and wt, App serotype 1 as a test for polyclonal sera in D 152 followed by final immunization with sacrificed whole cells from Pm strain VP 161 followed by fusion to mouse # 5. And 5a and Cross-reactivity was shown for LPS from Pm strains VP161 and X73 (FIG. 47). 14 hybridomas were obtained, 11 only Purified LPS from Pm strain VP161 alone could be recognized, three with App serotypes 5a and The purified LPS obtained from Pm strain VP161 could be recognized. Thereafter, these three cross reactive hybridomas were identified as App serotype 1, It has been found that it is possible to recognize purified LPS obtained from Pm strains X73 and Mh losB and wt strains and to recognize 11 hybridomas. Pm VP 161 is just related Only Pm strain X73 could be recognized (FIG. 48, Example 7, Table 4).

현재로는 수의학적 병원균 Mh, Pm 및 App에 의해 유발되는 질병과 싸우는 효과적인 백신이 존재하지 않는다. Mh에 의해 유발된 질병과 싸우기 위한 백신 접근법은 여전히 주로 세균 백신들과 약독화 생균주들에 기초하고 있다. 보다 최근의 생백신 버전은 뉴라미니다제, 백혈구 독소, 시알로글리코프로테아제, 외부 막 및 특성이 밝혀지지 않은 단백질들과 같은 분비되거나 추출된 Mh 항원들을 혼입하는 것이다. 무독성 백혈구 독소를 발현하는 돌연변이 균주를 이용한 면역화가 여전히 송아지 공격 모델에서 부분적으로 독성을 보이고, 협막 다당류와 조합된 백혈구 독소가 방어성 면역 반응을 생성할 수 없지만, 백혈구 독소는 관행상 주요 하위 단위 백신 후보이다. 반면에, LPS는 백혈구 용해 작용을 안정화하며, LPS에 기초한 결합 백신도 그러하며, 독성이 제거된 백혈구 독소는 가능성을 제공할 수 있다. At present there is no effective vaccine to combat diseases caused by veterinary pathogens Mh , Pm and App . Vaccine approaches to combat diseases caused by Mh are still mainly based on bacterial vaccines and attenuated live strains. A more recent live vaccine version is the incorporation of secreted or extracted Mh antigens such as neuraminidase, leukocyte toxin, sialoglycoprotease, outer membrane and uncharacterized proteins. Immunization with mutant strains expressing non-toxic leukocyte toxins is still partially toxic in calf challenge models, while leukocyte toxins combined with capsular polysaccharides cannot produce a protective immune response, whereas leukocyte toxins are conventionally a major subunit vaccine. It is a candidate. On the other hand, LPS stabilizes leukocyte lysis, and so is a binding vaccine based on LPS, and leukocyte toxins that have been detoxified may offer possibilities.

App에 의해 유도되는 질병과 싸우기 위한 백신 시도는 약독화 생균주들을 기초로 하는데, 이는 이들이 방어에 필요한 항체들을 중화시킬 수 있는 매우 불안정한 Apx 독소를 함유하기 때문이다. 이들 Apx 독소는 App에 대한 주요 하위 단위 백신을 위한 기초를 형성하지만 단지 부분적인 임상 방어만을 유도하는 것으로 보인다. LPS의 코어 OS 를 포함하는 부착소가 개선된 백신 후보로 제안된 바 있다. Vaccine attempts to combat disease induced by App are based on attenuated live strains because they contain very unstable Apx toxins that can neutralize the antibodies required for defense. These Apx toxins form the basis for the main subunit vaccine for App but appear to induce only partial clinical defenses. Adherents containing the core OS of LPS have been proposed as improved vaccine candidates.

돼지에서 Pm 질환을 방어하는 현재의 백신들은 캡슐과 같은 독소 및 체강 항원 및 외부 막 단백질들로 이루어져 있다. Pm은 닭에서 조류 콜레라를 유도하는 것으로 파스퇴르에 의해 처음 밝혀졌으며, 이 질환에 대한 현재의 방어 전략은 약독화된 Pm 균주를 사용하는 것이다. 그러나, 일반적으로, 이러한 전략은 면역 반응이 혈청형-제한적이고, 다른 혈청들에 대한 교차 방어능을 제공할 수 없기 때문에 상당한 제한이 있다. 그러나, Pm으로부터 얻은 LPS는 감염에 대한 면역성에서 부분적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. From pig Current vaccines that protect against Pm disease consist of toxin and celiac antigens such as capsules and outer membrane proteins. Pm was first discovered by Pasteur to induce avian cholera in chickens, and current defense strategies against this disease have been attenuated. Pm strain is used. In general, however, this strategy has significant limitations because the immune response is serotype-limiting and cannot provide cross-protection against other sera. But, LPS from Pm has been shown to play a partial role in immunity to infection.

최근들어 이들 생물 각각으로부터 얻은 LPS가 하위 단위 백신 설계에 유용한 후보가 될 수 있음을 입증하는 많은 증거가 축적되었다. LPS는 가시적인 동시에 Mh의 표면에서 주요 항원 결정자인 것으로 밝혀졌으며, A1 LPS로 생장된 mAb는 식균작용을 촉진하지만 시험관 내에서 보체 매개 사멸을 촉진하지 않는 것으로 나타났다. Recently, a great deal of evidence has been accumulated to demonstrate that LPS from each of these organisms can be a useful candidate for subunit vaccine design. LPS was found to be visible and at the same time the major antigenic determinant on the surface of Mh , and mAbs grown with A1 LPS promote phagocytosis but do not promote complement mediated killing in vitro.

Pm에서, 리보좀-LPS 백신들은 동종 Pm 균주들로 인한 조류 콜레라 질병으로 부터 닭을 보호하였다. 또한, LPS-단백질 복합체를 이용한 면역 유도로 동종 균주가 공격했을 때 쥐를 100% 보호할 수 있었지만, 분리된 경우에는 복합체의 개개의 성분이 어떠한 방어도 제공할 수 없었다. Pm의 LPS 로 생장시킨 mAb들은 쥐 모델에서 부분적인 방어만을 제공했으며, 식균작용을 함에도 불구하고 보체 존재하에서는 살균성을 보이지 않았다. 그러나, 다른 연구에서는, Pm LPS에 대한 mAb는 동종 공격에 대해 쥐를 완벽하게 보호하였으며, 살균성을 갖는 것으로 나타났다. 유형 A로부터 얻은 LPS를 모의하는 항-유전자형 백신은 동종 생물이 공격했을 때 쥐에 방어능을 보였다. At Pm, ribosomal-LPS vaccines are homologous Chickens were protected from avian cholera disease caused by Pm strains. In addition, immunization with the LPS-protein complex allowed 100% protection of mice when homologous strains attacked, but when isolated, individual components of the complex could not provide any protection. MAbs grown with LPS of Pm provided only partial protection in the rat model and, despite phagocytosis, did not show bactericidal activity in the presence of complement. However, in other studies, MAb against Pm LPS completely protected mice against allogeneic attack and was shown to be bactericidal. Anti-genic vaccines simulating LPS from type A showed protection in mice when allogeneic organisms attacked.

App에서, LPS 및 보다 구체적으로 LPS의 코어 영역은 박테리아의 접착 능력에 관련되어 있다. App 혈청형 1 LPS에 연결된 BSA의 결합 백신은 이종 공격은 안되고 동종 공경에 대해서만 쥐를 보호할 수 있으며 혈청형 5 및 1로부터 얻은 스무쓰 및 러프 App LPS의 결합체는 App의 세포벽의 탄수화물 부분이 돼지 면역 반응에서 중요한 역할을 함을 시사하였다. In App , LPS and more specifically the core region of LPS are related to the adhesion ability of bacteria. Binding vaccines of BSA linked to App serotype 1 LPS are not heterologous and can only protect mice against homologous pore and the combinations of smooth and rough App LPS obtained from serotypes 5 and 1 show that the carbohydrate portion of the cell wall of the app is swine Suggested an important role in the immune response.

결과적으로, 본 출원인은 이 연구를 수행하여 보존되고 끝이 절단된 코어 LPS를 생성하였으며, 이는 3종의 생물 모두에서 공통적이었다. LPS는 이들 수의학적 병원균 각각에 대한 면역성에 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 보존된 LPS 항원이 확인될 수 있다면, 동족 균주에 대한 방어 반응이 이종 균주들과 종들에게 까지 확대될 수 있다. 이러한 사실과 이들 수의학적 병원균들이 모두 공통되고 보존된 내부 코어 OS 구조를 공유하고 있음을 시사하는 구조 분석 데이터를 결합하여, LPS-기초 백신의 가능성을 탐구해보기로 결정하였다. 이 과정에서 제1 단계는 말단이 노출된 구조로서 보존되 내부 코어 OS 에피토프를 배타적으로 발현시키는 돌연변이 균주를 제작하는 것이다. As a result, Applicants conducted this study to produce preserved and truncated core LPS, which was common in all three organisms. LPS has been shown to be involved in immunity to each of these veterinary pathogens, and if conserved LPS antigens can be identified, the protective response to cognate strains can be extended to heterologous strains and species. Combining this fact with structural analysis data suggesting that these veterinary pathogens all share a common and conserved internal core OS structure, it was decided to explore the potential of LPS-based vaccines. The first step in this process is to construct a mutant strain that preserves the terminal exposed structure and exclusively expresses the internal core OS epitope.

이 연구에서는 말단이 노출된 부분으로 보존된 내부 코어 에피토프를 제시하기 위해 Mh 균주 A1으로부터 얻은 α-1,6-D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제 유전자에서 돌연변이체를 생성하였다. 돌연변이 유도 방법은 Mh에서의 철저한 방법과는 거리가 멀다. 제한된 수의 사전 연구들이 aroA 유전자, lpp 위치, 협막 nmaAB 위치, 및 백혈구 독소 lktCABD 유전자 클러스터에서 돌연변이체를 제작하였다. 유전자 이식법은 외부 DNA를 Mh 세포에 삽입하는 효과적인 방법으로 동족 재조합을 통한 외부 DNA의 염색체 결합은 어려우며 낮은 빈도로 발생하는데 단일 크로스 오버 발생이 우세하여 표적 유전자의 돌연변이 및 기능 복제가 존재하게 된다. Mh 내에서 불안정한 플라스미드들(자살 플라스미드들)은 몇몇 저자에 의해 사용된 바 있으며, 이러한 연구들에서 성공적으로 사용되었다. 돌연변이 균주로부터 얻은 LPS의 구조 분석으로 예상된 LPS 표현형을 확인하였고 보체 실험으로 관찰된 효과가 실제로 이 유전자의 불활성화로 인한 것임을 확인하였다. losB 유전자의 손상되지 않은 복제물을 다시 삽입하여 LPS 구조를 야생형의 구조로 되돌렸으며, losB 유전자가 α-1,6-D-글리세로-D-만노-헵토실트랜스퍼라제임을 확인하였다. 이들 수의학적 병원균의 균주들 범위에서 이 구조의 보존성 및 접근성 정도를 시험하기 위해 mAb 및 pAb를 끝이 절단된 LPS 구조로 생장시켰다. App, Pm 및 Mh 로부터 얻어지는 모든 균주와 교차 결합이 가능한 3종의 mAb를 얻었으며, 이로써 이들 3종의 유의한 수의학적 병원균들 사이에 공유된 보존된 교차반응성 LPS 에피토프의 가 능성을 확인하였다. In this study, mutants were generated in the α-1,6-D-glycero-D-manno-heptosyltransferase gene obtained from Mh strain A1 to present an internal core epitope that was preserved in the exposed end. Mutation induction is far from exhaustive in Mh . A limited number of prior studies have produced mutants in the aroA gene, lpp position, capsular nma AB position, and leukocyte toxin lkt CABD gene cluster. Gene transplantation is an effective method of inserting foreign DNA into Mh cells. Chromosomal binding of external DNA through cognate recombination is difficult and occurs at low frequency. A single crossover is predominant, resulting in mutation and functional replication of a target gene. Unstable plasmids (suicide plasmids) in Mh have been used by several authors and have been used successfully in these studies. Structural analysis of the LPS obtained from the mutant strain confirmed the expected LPS phenotype and confirmed that the effect observed in the complement experiment was actually due to inactivation of this gene. ryeoteumyeo return the LPS structure by inserting an intact copy of gene losB back to the wild-type structure, losB gene is α-1,6-D- glycero -D- manno to-heptane was confirmed tosyl transferase James. MAb and pAb were grown in truncated LPS structures to test the degree of conservability and accessibility of this structure in the range of strains of these veterinary pathogens. Three mAbs capable of crosslinking with all strains derived from App , Pm and Mh were obtained, confirming the possibility of conserved cross-reactive LPS epitopes shared between these three significant veterinary pathogens.

실시예 8. 수의학적 병원균인 만헤이미아 헤몰리티카 , 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다에 의해 유발되는 질병을 예방하기 위한 LPS-기초 당결합 백신의 후보 가능성: 쥐의 면역화 후 면역 반응의 결합 화학 및 조사 Example 8. veterinary pathogen million hey Mia Hemolytica , Actinobacillus Pneumoniae, and wave to the flu stew Relais Merle Tosh is the possibility of a vaccine candidate combines per LPS- basis for the prevention of disease caused by the after immunization of mice and investigate the chemical bonding of the immune response

복합당질을 제조하기 위해 LPS를 하기와 같이 유도하였다. 표적 구조를 나타내는 Mh losB 돌연변이 균주로부터 얻은 LPS(145 ㎎) 및 8K 물질(104.5 ㎎)을 4N KOH(약 10 ㎎/㎖.)에 용해하고, 125 ℃에서 30시간 동안 교반하여 탈아실화하였다. 용액을 실온으로 냉각하고, 무수 아세트산으로 중화하여, 이 과정에서 생성된 아미노기를 다시 N-아세틸화하였다. 침전된 염을 원심분리(9k, 15 분)하여 제거하고, 현탁액을 세파덱스 G-25 컬럼에 가하고 물을 용리액으로 하여 용출시켰다. 탄수화물-함유 분액을 모아 냉동건조시켜 KOH'd LPS(25 ㎎ 8K, 33.3 ㎎ LPS)를 얻었다(수율 약 20 - 25%). 결과물을 실온에서 0.1M NaOH(10 ㎎/㎖) 로 2시간 동안 처리하여 탈-O-아세틸화하고 세파덱스 G-25 컬럼 상에서 물로 정제하고, 동결건조시켜 KOH'd LPS(20 ㎎ 8K, 30 ㎎ LPS)를 얻었다(수율 약 20%). LPS was induced as follows to prepare the complex sugars. LPS (145 mg) and 8K material (104.5 mg) obtained from the Mh losB mutant strain showing the target structure were dissolved in 4N KOH (about 10 mg / ml.) And deacylated by stirring at 125 ° C. for 30 hours. The solution was cooled to room temperature, neutralized with acetic anhydride, and the amino group produced in the course was again N-acetylated. The precipitated salt was removed by centrifugation (9k, 15 min), the suspension was added to a Sephadex G-25 column and eluted with water as eluent. The carbohydrate-containing fractions were combined and lyophilized to give KOH'd LPS (25 mg 8K, 33.3 mg LPS) (yield about 20-25%). The result was treated with 0.1 M NaOH (10 mg / ml) at room temperature for 2 hours to de-O-acetylate, purified with water on a Sephadex G-25 column, and lyophilized to give KOH'd LPS (20 mg 8K, 30). Mg LPS) (yield about 20%).

¹H-NMR 스펙트럼 분석 및 ES-MS 분석에 의해 품질 제어를 수행하였다. MS 분석에서, 말단 헵토스 및 글루코스 잔기의 가변적 손실과 일치하는 KOH-처리 LPS 물질에서의 몇몇 이종성이 발견되었다(도 49). Quality control was performed by ¹ H-NMR spectral analysis and ES-MS analysis. In MS analysis, some heterogeneity was found in KOH-treated LPS material consistent with variable loss of terminal heptose and glucose residues (FIG. 49).

탈포스포릴화 Dephosphorylation

LPS 또는 8K 물질로부터 유도된 생성물을 합하고, 재조합 알칼리 인산염(Roche)(약140단위/단위 ㎎ alk.P / ㎎ KOH'd LPS) 와 함께 0.1M NH₄HCO₃ 버퍼(pH 8.0)에 용해하여(약 10 ㎎/㎖) 탈포스포릴화하고, 37 ℃에서 최대 4시간 교반하였다. 용액을 5분 동안 100 ℃로 가열하고 냉각시키고, 14K에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 냉동건조시켰다. The product derived from LPS or 8K material was combined and dissolved in 0.1M NH ₄ HCO ₃ buffer (pH 8.0) with recombinant alkali phosphate (Roche) (about 140 units / unit mg alk.P / mg KOH'd LPS) (About 10 mg / mL) dephosphorylated and stirred at 37 ° C. for up to 4 hours. The solution was heated to 100 ° C. for 5 minutes, cooled and centrifuged at 14K for 10 minutes. The supernatant was lyophilized.

생성물을 세파덱스 G-25 컬럼 상에서 물로 탈염하고, 동결건조시키켜 KOH'd alk. P'd LPS(48 ㎎, 수율 약 20%)을 얻었다. KOH 처리 LPS의 탈포스포릴화를 확인하는 ¹H-NMR 및 CE-ES-MS 분석을 수행하여 품질 제어를 수행하였다. The product was desalted with water on a Sephadex G-25 column and lyophilized to give KOH'd alk. P'd LPS (48 mg, yield about 20%) was obtained. Quality control was performed by performing ¹ H-NMR and CE-ES-MS analysis confirming dephosphorylation of KOH treated LPS.

아민화 Amination

건조시킨 탄수화물(48 ㎎)을 DMSO 600 ㎕에 용해하고, MeOH 중의 2M NH₄OAc 4800 ㎕ 및 MeOH 1200 ㎕ 중에 용해된 NaCNBH₃ 120 ㎎를 pH 8.3 및 50 ℃에서 72 시간 동안 첨가하여 아민화시켰다. N2 하에 MeOH를 증발시키고, 생성물을 동결건조시키고 세파덱스 G-25 컬럼 상에서 물로 정제하여 KOH'd 및 P'd 아민화 LPS(32 ㎎, 약 10%)를 얻었다. KOH 처리 LPS의 아민화를 확인하는 ¹H-NMR 분석을 수행하여 품질 제어를 수행하였다. Dried carbohydrates (48 mg) were dissolved in 600 μl DMSO, and 4800 μl 2M NH ₄ OAc in MeOH and 120 mg NaCNBH ₃ dissolved in 1200 μl MeOH were added and aminated for 72 hours at pH 8.3 and 50 ° C. MeOH was evaporated under N2 and the product was lyophilized and purified with water on a Sephadex G-25 column to give KOH'd and P'd aminated LPS (32 mg, about 10%). Quality control was performed by performing a ¹ H-NMR analysis confirming amination of KOH treated LPS.

연결 분자의 결합 Binding molecules

건조시킨 탄수화물(32 ㎎)을 H₂O 4000 ㎕에 용해하고 MeOH 4000 ㎕ 및 스쿠아레이트 100 ㎕를 pH 8.2(트리에틸아민(4 ㎕)으로 조정) 및 실온에서 2 시간 동안 첨가하여 연결 분자(스쿠아레이트)를 생성된 아미노기에 결합시키고, 15분 마다 pH를 관찰하였다. N₂ 하에 MeOH를 증발시키고, 생성물을 동결건조시키고 세파덱스 G-25 컬럼 상에서 물로 정제하고, 동결건조시켜 KOH'd 및 P'd 아민화 스쿠아레이트 결합 LPS(30 ㎎, 약 12%)를 얻었다. 스쿠아레이트 연결기의 결합을 확인하는 H- 및 C-H-NMR 및 CE-ES-MS 분석을 수행하여 품질 제어를 수행하였다. MS 분석에 의하면 50% 이하의 물질 만이 스쿠아레이트 연결기를 함유하고 있는 것으로 나타났다. The dried carbohydrate (32 mg) was dissolved in 4000 μl of H ₂ O, and 4000 μl of MeOH and 100 μl of squaraine were added at pH 8.2 (adjusted to triethylamine (4 μl)) and at room temperature for 2 hours to form a linking molecule ( Squarate) was bound to the resulting amino group and the pH was observed every 15 minutes. MeOH was evaporated under N ₂ , the product was lyophilized and purified with water on a Sephadex G-25 column and lyophilized to give KOH'd and P'd aminated squalate binding LPS (30 mg, about 12%). Got it. Quality control was performed by H- and CH-NMR and CE-ES-MS assays confirming binding of the squarate linker. MS analysis showed that less than 50% of the substances contained squaraine linkages.

단백질 담체에 결합시킨 결합 백신 Binding Vaccine Bound to Protein Carrier

HSA 약 20 ㎎을 0.02M 붕산나트륨 버퍼 1 ㎖ 중의 스쿠아레이트 연결 탄수화 물 25배 몰 과량(30 ㎎)과 함께 pH 9.2 실온에서 24 시간 동안 교반하여 연결시키고, 탄수화물을 반응 개시점과 6시간 후에 첨가하였다. 24 시간 후 분취액을 제거하고 탄수화물 특이 모노클로날 항체 G8을 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의한 MALDI-MS 및 SDS-PAGE에 의해 검사하였다(도 50). 최종 반응 혼합물을 세파로스 6B 컬럼에서 PBS(50 mM 인산 나트륨, 100 mM NaCl, 10 mM 시트르산 나트륨, pH 7.5) 로 정제하여 결합 탄수화물 없이 분리하였다. 생성물 피크에 해당하는 분액들을 Amicon ultra-15 10K 컷오프 스핀 컬럼 내에서 농축하였다. 결합체의 최종 부피는 BCA 분석에 의해 단백질 및 PhOH / H₂SO₄ 방법에 의해 탄수화물을 정량함으로써 탄수화물 대 단백질의 몰비가 4.5:1인 것으로 밝혀졌다. 최종 결합체를 또한 1% AcOH 중에서 나노 전자 분사 질량 스펙트럼 분석에 의해 담체 단백질 HAS에 비교하였으며, 그 결과, HAS에 대한 예상된 분자량(도 51a) 및 담체 단백질의 가변성 글리코실화와 일치하는 일련의 피크(도 51b) 가 관찰되었다. About 20 mg of HSA was connected by stirring with a 25-fold molar excess (30 mg) of squarate linked carbohydrate (1 mg) in 1 ml of 0.02 M sodium borate buffer for 24 hours at pH 9.2 room temperature, and the carbohydrate was reacted with the reaction starting point for 6 hours. It was added later. After 24 hours aliquots were removed and examined by MALDI-MS and SDS-PAGE by Western blotting using carbohydrate specific monoclonal antibody G8 (FIG. 50). The final reaction mixture was purified by PBS (50 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 10 mM sodium citrate, pH 7.5) on a Sepharose 6B column and separated without bound carbohydrates. Aliquots corresponding to the product peaks were concentrated in an Amicon ultra-15 10K cutoff spin column. The final volume of the conjugate was found to have a molar ratio of carbohydrate to protein of 4.5: 1 by quantifying carbohydrates by protein and PhOH / H ₂ SO ₄ method by BCA analysis. The final conjugate was also compared to the carrier protein HAS by nanoelectrospray mass spectrometry in 1% AcOH, resulting in a series of peaks consistent with the expected molecular weight for HAS (FIG. 51A) and variable glycosylation of the carrier protein. 51b) was observed.

제조된 결합 백신: Combined vaccine prepared:

- Mh losB -HSA(약4 CHO/CRM), 쥐에 투여 Mh losB - HSA (about 4 CHO / CRM), administered to rats

면역 유도 Immunity induction

6-8주령의 BALB/c 쥐 6마리를 결합체로 면역화하고 6-8주령의 암컷 BALB/c 쥐 3마리는 탄수화물 및 HAS를 혼합한 대조군으로 면역화하였다. 모든 결합 백신은 멸균 PBS 용액 상태였으며 Ribi 보조제 내 0.1 ml sc 주입 당 10 ㎍의 탄수화물을 투여하였다. Six 6-8 week old BALB / c mice were immunized with conjugates and three 6-8 week old female BALB / c mice were immunized with a control mixture of carbohydrate and HAS. All binding vaccines were in sterile PBS solution and received 10 μg carbohydrate per 0.1 ml sc injection in Ribi adjuvant.

마우스들을 하기 예정표에 따라 면역화하였다: Mice were immunized according to the following schedule:

D 0 예비 채혈 및 최초 주입 D 0 preliminary blood collection and initial infusion

D 14 1차 면역 증대 D 14 Primary Immunity Enhancement

D 23 실험 채혈 D 23 Experimental Blood Collection

D 35 2차 면역 증대 D 35 Secondary Immunity Enhancement

D 45 마우스 채혈D 45 mouse blood collection

D23에서의 실험 채혈 및 D45에서의 최종 채혈에서, #V2 쥐 한마리가 Mh losB LPS 대한 LPS ELISA에 의해 나타난 바와 같이(도 52 및 53) 탄수화물 항원에 대한 IgG 반응을 나타내었다. 세번에 걸쳐 면역화 후 # V2 쥐의 폴리클론 혈청을 본원의 3종 병원균과의 교차 반응성에 대해 검사하였다. Ap, Mh 및 Pm의 LPS 및 전세포는 상기 폴리클론 혈청에 의해 인식되었다(도 54 및 55). 수막구균 균주 L3galE 및 L2galE로부터 얻은 LPS 및 전세포 역시 각각 LPS 및 전세포 ELISA에서 인식되었다. 이러한 거동은 결합 백신의 제조를 위한 KOH 처리 중에 탄수화물 항원의 부분적인 분해에 기인한 것이며, 이는 말단 헵토스 및 6탄당 잔기의 가변적인 손실을 초래한다(도 49 참조). 이는 에피토프를 갖는 최종 결합 백신에서 탄수화물 항원 부분을 형성하는데, 폴리클론 혈청 V2를 검사하는데 사용되는 수막구균 LPS의 영역을 닮았으며, 교차 반응성을 유도한다. 결합 백신 혈청으로 면역화하여 생장시킨 혈청은 수의학적 병원균 Ap, Pm 및 Mh의 LPS 및 전세포 모두를 인식할 수 있었다. In experimental blood collection at D23 and final blood collection at D45, one # V2 rat showed an IgG response to carbohydrate antigens as shown by LPS ELISA for Mh losB LPS (FIGS. 52 and 53). After three immunizations, polyclonal sera of # V2 mice were tested for cross-reactivity with the three pathogens herein. LPS and whole cells of Ap , Mh and Pm were recognized by the polyclonal serum (FIGS. 54 and 55). LPS and whole cells from meningococcal strains L3 galE and L2 galE were also recognized in LPS and whole cell ELISA, respectively. This behavior is due to partial degradation of carbohydrate antigens during KOH treatment for the production of binding vaccines, which results in variable loss of terminal heptose and hexasaccharide residues (see FIG. 49). It forms a carbohydrate antigen moiety in the final binding vaccine with epitopes, resembling the region of meningococcal LPS used to test polyclonal serum V2 and inducing cross-reactivity. Serum immunized with bound vaccine sera could recognize both LPS and whole cells of veterinary pathogens Ap , Pm and Mh .

실시예 9 보존된 내부 코어 지질다당류에 특이적인 모노클로날 항체들의 살균력 분석 Example 9 Bactericidal Analysis of Monoclonal Antibodies Specific to Conserved Internal Core Lipopolysaccharides

Mh의 전세포를 인식하고(도 56) Mh 내부 코어 LPS에 특이적인 항체를 갖는(도 57) 쥐 #1 D140으로부터 얻은 폴리클론 혈청 및 mAb G3, G8, 3-5 및 3-16으로부터 얻은 복수액(도 58-61)을 대조군 복수액 L2-16와 함께 살균력 분석을 위한 혈청원으로 사용하였다. 문헌 [Sutherland A.D. 1988. Vet. Microbiol. 16: 263-271]의 방법에 따라 분석을 수행하였다. 간단히 서술하면, Mh 세포들을 100 ㎖ BHI 액체 배지에서 약 5 x 10³ cfu/㎖의 생장 수준으로 생장시켰다. 배양액 10 ㎖를 사용하였으며 세포들을 5000 x g, 4 ℃에서 펠렛으로 만들고, D-PBS(Ca 및 Mg 함유 [Gibco # 14040-133])로 2회 세척하였다. 최종 세포 펠렛을 10 ㎖ D-PBS에 재현탁시켰다. 검사 혈청 및 복수액 샘플들을 56 ℃에서 30분 동안 가열하여 불활성화하고 내인성 보체를 파괴하였다. 분석은 96-웰 조직 배양 등급의 바닥이 편평한 마이크로 역가 플레이트(NUNC)에서 3차 반복 실험으로 준비하였다. D-PBS 내 항혈청을 적절히 희석한 용액 20 ㎕를 첨가한 후 박테리아 현탁액(100 ㎕) 및 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 보체(80 ㎕, 새끼 토끼, #CL3441-S, Cedarlane)를 각웰에 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 뚜껑을 덮은채 인큐베이션시켰다. 플레이트를 얼음 위에 놓아 반응을 종결시키고, 각 웰로부터 3차 반복 샘플(50 ㎕)을 채취하여 BHI 한천 평판에 분배하고, 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 박테리아 현탁액만을 갖는 대조군 웰, 박테리아 현탁액과 보체를 갖는 대조군 웰 및 항체의 적정 희석액을 함유한 박테리아 현탁액을 갖는 대조군 웰을 각 실험에 포함시켰다. Ascites obtained from mAb G3, G8, 3-5 and 3-16 and polyclonal sera obtained from rat # 1 D140 that recognized whole cells of Mh (FIG. 56) and had antibodies specific for Mh inner core LPS (FIG. 57). The liquid (FIGS. 58-61) was used as a serum source for bactericidal analysis with the control ascites L2-16. Sutherland AD 1988. Vet. Microbiol. 16: 263-271]. Briefly, Mh cells were grown to a growth level of about 5 × 10 ³ cfu / ml in 100 ml BHI liquid medium. 10 ml of culture was used and the cells were pelleted at 5000 × g, 4 ° C. and washed twice with D-PBS (containing Ca and Mg [Gibco # 14040-133]). The final cell pellet was resuspended in 10 ml D-PBS. Test serum and ascites samples were inactivated by heating at 56 ° C. for 30 minutes and disrupted endogenous complement. Assays were prepared by a third replicate in a flat bottom microtiter plate (NUNC) of 96-well tissue culture grade. After addition of 20 μl of a properly diluted solution of antiserum in D-PBS, the bacterial suspension (100 μl) and the plate were incubated for 15 minutes at room temperature. Complement (80 [mu] l, rabbit, # CL3441-S, Cedarlane) was added to each well and incubated with a lid for 30 minutes at 37 ° C. The plates were placed on ice to terminate the reaction, and tertiary replicate samples (50 μl) were taken from each well and distributed to BHI agar plates and incubated at 37 ° C. overnight. Control wells with bacterial suspensions only, control wells with bacterial suspensions and complements, and control wells with bacterial suspensions containing the appropriate dilutions of antibodies were included in each experiment.

박테리아 성장을 개수하고 대조군 웰에 대한 사멸균의 백분율을 계산하였다. Bacteria growth was counted and the percentage of killing bacteria relative to the control wells was calculated.

하기 표와 도 62-64에서 알 수 있는 바와 같이, mAb G3 및 G8과 폴리클론 혈청은 모두 Mh A1 wt 세포의 보체-매개 세포 용해를 촉진하였다. mAb 3-5 및 3-16로부터 얻은 복수액의 실패는 이들 혈청의 역가가 너무 낮았기 때문이다(작업 희석율 l:10⁶ 대비 1:50). As can be seen in the table below and FIGS. 62-64, both mAb G3 and G8 and polyclonal serum promoted complement-mediated cell lysis of Mh A1 wt cells. The failure of ascites fluid from mAbs 3-5 and 3-16 was due to the low titers of these sera (working dilution ratio 1:50 relative to l: 10 ⁶ ).

실시예 9, 표 1. Mh A1 세포에서 mAB G3 및 G8의 살균 활성Example 9, Table 1. Bactericidal Activity of mAB G3 and G8 in Mh A1 Cells

실시예 9, 표 2. Mh A1 세포에서 폴리클론 혈청 Mh #1 D140의 살균 활성 Example 9, Table 2. Bactericidal Activity of Polyclonal Serum Mh # 1 D140 in Mh A1 Cells

mAb G3 및 G8 및 폴리클론 혈청에 의해 나타나는 살균 활성은 Mh에서 보존된 내부 코어 LPS 에피토프에 특이적인 항체들이 살아있는 Mh 전세포를 인식하고 그에 대해 기능상 활성을 보임을 나타낸다. mAb G3 and G8 and the fungicidal activity exhibited by the polyclonal serum antibodies to the inner core LPS epitope conservation in the Mh recognize the Mh living whole cell, and shows a visible or functional activity thereto.

실시예 10. 보존된 내부 코어 지질다당류에 특이적인 모노클로날 항체들을 사용한 능동적 방어 실험 Example 10 . Active defense experiments using monoclonal antibodies specific for conserved internal core lipopolysaccharides

이 실험은 [Lopez 등 1982. Can. J. Comp. Med. 46: 314-316]의 방법에 따라 수행하였으며 구체적인 방법 및 수정 사항은 이후 서술하는 바와 같다. This experiment is described by Lopez et al. 1982. Can. J. Comp. Med. 46: 314-316. The specific methods and modifications are as described below.

마우스 및 시약:Mouse and Reagents:

복수액으로부터 얻은 IgG를 단백질 A 컬럼 상에 정제하고 멸균 여과하여(도 65) 능동적 방어 실험에 사용하였다. IgG from ascites fluid was purified on a Protein A column and sterile filtered (FIG. 65) and used for active defense experiments.

실험군 mAb G3 및 G8: G8, IgG2b, 3.8 ㎎/㎖; G3, IgG2a, 4.7 ㎎/㎖. Experimental mAb G3 and G8: G8, IgG2b, 3.8 mg / ml; G3, IgG2a, 4.7 mg / ml.

대조군 mAb: L2-16, IgG2b, 1.9 ㎎/㎖.Control mAb: L2-16, IgG2b, 1.9 mg / ml.

Balb/c 마우스: 40 암컷, 6-8 주령, CRL. 5 마리/그룹.Balb / c mice: 40 females, 6-8 weeks of age, CRL. 5 horses / group.

M. 헤몰리티카 Al: 7.5 x 10⁷cfu /마우스. M. haemolytica Al: 7.5 x 10 ⁷ cfu / mouse.

실험 계획 및 그룹들:Experiment Design and Groups:

D-1D-1 mAb G3, G8 및 L2-16의 정제 및 정량Purification and Quantitation of mAbs G3, G8, and L2-16 D-1D-1 BHI 한천상에 Mh A1의 플레이트를 올려놓음Place plate of Mh A1 on BHI agar D0D0 Mh 로 BHI 배양액을 접종 접종에 대해 OD 약 1.2 이상에서 수거 생균수 측정에 의해 접종원을 확인 그룹 E-G 마우스에 IP mAb 투여 그룹 A 및 E-G 마우스에 약 10⁸Mh의 IN 투여 30분 동안 Mh로 mAb의 시험관내 배양 그룹 B-D 마우스에 약 10⁸의 사전 배양된 Mh의 IN 투여Inoculation of BHI cultures with Mh OD for inoculation. Inoculation was confirmed by viable cell count measurement at OD above 1.2. IP mAb administration in group EG mice IN 10 administration of about 10 ⁸ Mh in group A and EG mice IN administration of about 10 ⁸ precultured Mh to in vitro culture group BD mice D1D1 마우스를 매일 관찰하고, 실험종결까지 임상적 증후를 기록Mice were observed daily and clinical signs recorded until the end of the experiment. D3D3 실험의 종결 및 수집 * 전체 폐의 병상 연구 * 조직연구를 위해 폐를 제거Termination and Collection of Experiments * Study of the entire lung bed * Removal of the lung for tissue study

^ⅰ모든 마우스는 DPI2에서 다양한 정도의, 거친 외피(rough coat), 탈수, 이동의 꺼림과 같은 임상적 표징을 나타내었다. 그러나, 그룹 C와 D의 마우스는 일반적으로 건강하였고, 그룹 F 및 G의 마우스는 비록 거친 외피를 가졌지만 활동적인 상태였다. DPI3에서, 그룹 A와 B의 마우스는 심각하게 탈수되었고, 체중의 손실이 있었으며, 그룹 G의 마우스는 약간 아팠다. ^Ⅰ all mice exhibited clinical signs, such as the varying degrees of kkeorim, rough coat (rough coat), dried and move in DPI2. However, mice in groups C and D were generally healthy, and mice in groups F and G were active, although they had a rough skin. In DPI3, mice in groups A and B were severely dehydrated, there was a loss of weight, and mice in group G were slightly sick.

^ⅱ모든 마우스는 다양한 정도의 폐 경화를 보였으며, 관련영역을 정량화하는 시도는 없었다. ^Ii All mice showed varying degrees of lung stiffness and no attempt was made to quantify relevant areas.

^ⅲ그룹들간의 주요한 차이는, 그룹 A, B 및 E의 마우스 전체가 다른 그룹의 마우스보다 폐에 더 많은 중성구를 가지는 것으로 보였다는 점이다. 그러나, 치료에도 불구하고, 모든 마우스는 어느 정도의 폐렴을 나타냈다.The main difference between the ^ⅲ group, the mice all of the groups A, B and E appeared to have more neutrophils to the lungs than the mice of the different groups is that. However, despite the treatment, all mice showed some degree of pneumonia.

^ⅳ++++: 거친 외피, 중간에서 심각한 정도의 체중손실 및 탈수, 이동의 꺼림; +++: 거친 외피, 약간에서 중간 정도의 체중손실 및 탈수, 그러나 활동적임; ++: 거친 외피 및 약간의 체중손실; +: 약간의 거친 외피. ⁺⁺ ++++: coarse skin, moderate to severe weight loss and dehydration, reluctance to move; +++: rough skin, slight to moderate weight loss and dehydration, but active; ++: rough skin and slight weight loss; +: Slight rough skin.

^ⅴ+++: 중간 영역의 경화, ++: 작은 영역의 경화 ^Ⅴ +++: hardening of the middle area, ++: hardening of the small area

^ⅵ+++: 중간에서 많은 수의 중성구와, 혈관주변 및 기관지주변 영역으로의 림프구의 뚜렷한 침투와 함께, 중간정도의 기관지페렴. ++: 적은수의 중성구와, 혈관주변 및 기관지주변 영역으로의 림프구의 침투와 함께, 중간정도의 기관지페렴. +: 때때로 중성구가 존재하고, 혈관주변 및 기관지주변 영역으로의 림프구의 마일드한 침투와 함께, 중간정도의 기관지페렴. ^Ⅵ +++: Moderate bronchial pneumonia, with pronounced infiltration of lymphocytes into the medium to large numbers of neutrophils and perivascular and peribronchial areas. ++: Moderate bronchial pneumonia, with a small number of neutrophils and lymphocyte infiltration into the perivascular and peribronchial regions. +: Medium bronchial pneumonia, sometimes with neutrophils, with mild infiltration of lymphocytes into the perivascular and peribronchial regions.

^ⅶ임상적 증후를 보이는 마우스의 수 ^마우스 number of mice with clinical symptoms

이 파일롯 실험을 통해, M. 헤몰리티카의 사전 인큐베이션에 의한 mAb 처리는 감염된 쥐의 임상학적 증상 및 조직병리학에 대해 어느정도 효과를 보이는 것으로 나타났다. Through this pilot experiment, M. H. mAb treatment by pre-incubation of Molly Mathematica showed that looks somewhat effective against clinical symptoms, and histopathology of infected mice.

도 66는 발병 원인과 일치하는 대조군 쥐 B의 중간크기 기관지 관내 적정 수의 호중구가 존재하는 것을 도시하며, 도 61은 도 66에서와 같은 시기에 희생된 그룹 C 쥐의 폐를 도시하는데, 소수의 임파 세포가 특정 영역에 존재하는 기관지 폐 렴의 분석을 보여주고 있으며, Mh 세포와 mAB G3을 시험관에서 미리 혼합함으로써 유도되는 예방의 정도와 일치한다. FIG. 66 shows the presence of an appropriate number of neutrophils in the medium bronchus of control rat B, consistent with the cause of onset, and FIG. 61 shows the lungs of group C mice sacrificed at the same time as in FIG. Analysis of bronchial pneumonia in which lymphocytes are present in specific regions is consistent with the degree of prevention induced by premixing Mh cells with mAB G3 in vitro.

미beauty 생물 기탁Biological deposit

만헤이미아 헤몰리티카 균주 A1 losB를 2005년 5월 4일 IDAC에 기탁하였다. 기탁 번호는 IDAC 040505-01. Manhemia Molly H. Tikka was deposited strains A1 losB on May 04, 2005 IDAC. The accession number is IDAC 040505-01.

SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada <120> Conserved Inner Core Lipopolysaccharide Epitopes as Multi-Species Vaccine Candidates <130> PAT 2817W-90 <150> CA 2,467,329 <151> 2004-05-14 <150> US 60/571,489 <151> 2004-05-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for waaQPM amplification; has BamHI site for cloning. <400> 1 gagtaggatc ctgaaacatg ttccc 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for waaQPM amplification, has SalI site for cloning. <400> 2 ggttgggtcg accaagccac attactg 27 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> losB-kpn primer <400> 3 atatggtacc tatcagcggt agagattcta ac 32 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> losB-xba primer <400> 4 tgctctagac cgaacctgca ccaaaaagat ttaacgc 37 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer that corresponds to sequence within the losB structural gene <400> 5 ccgctgcgag agataagtgg atactttatc 30 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer that corresponds to sequence within the losB structural gene <400> 6 gacattggga tctttattta gatttcaaac cgac 34                              SEQUENCE LISTING <110> National Research Council of Canada   <120> Conserved Inner Core Lipopolysaccharide Epitopes as Multi-Species        Vaccine Candidates <130> PAT 2817W-90 <150> CA 2,467,329 <151> 2004-05-14 <150> US 60 / 571,489 <151> 2004-05-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Forward primer for waaQPM amplification; has BamHI site for        cloning. <400> 1 gagtaggatc ctgaaacatg ttccc 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for waaQPM amplification, has SalI site for        cloning. <400> 2 ggttgggtcg accaagccac attactg 27 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> losB-kpn primer <400> 3 atatggtacc tatcagcggt agagattcta ac 32 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> losB-xba primer <400> 4 tgctctagac cgaacctgca ccaaaaagat ttaacgc 37 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer that corresponds to sequence within the losB structural        gene <400> 5 ccgctgcgag agataagtgg atactttatc 30 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer that corresponds to sequence within the losB structural        gene <400> 6 gacattggga tctttattta gatttcaaac cgac 34  

Claims (33)

가변성 외부코어 올리고당 사슬 연장부가 없는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 단리된 지질다당류 부분.An isolated lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety lacking a variable outer core oligosaccharide chain extension. 하기 화학식 Ⅰ의 글루코실-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 단리된 지질다당류 부분: An isolated lipopolysaccharide moiety consisting essentially of the glucosyl-heptosyl inner core moiety of Formula I:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, Q¹은 수소 또는 α-Glc이고, Q²은 수소, Kdo 또는 -P-R(여기서, P는 포스페이트이며, R은 수소 또는 포스포에탄올아민)이고, Q³은 수소 또는 해독된 지질 A이고, Q⁴은 수소 또는 In the above, Glc is a glucose and, Hep heptane is a monohydrate, R is hydrogen or a phosphonate amine, R "'is pneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) hydrogen or evil Martino Bacillus flu O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, Q ¹ is hydrogen or α-Glc, Q ² is hydrogen, Kdo or -PR, where P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine), Q ³ is hydrogen or detoxified lipid A, Q ⁴ is hydrogen or

상기에서, R"'가 수소이고 Q²가 -P-R(여기서, R은 수소 또는 포스포에탄올아민)이고 Q¹이 α-Glc일 때, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이다. In the above, when R ″ ′ is hydrogen, Q ² is —PR where R is hydrogen or phosphoethanolamine and Q ¹ is α-Glc, R ′ and R ″ are each hydrogen or oligosaccharide extension. 하기 화학식 Ⅰa의 글루코실-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 단리된 지질다당류 부분:An isolated lipopolysaccharide moiety consisting essentially of the glucosyl-heptosyl inner core moiety of formula la:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, Q¹은 수소 또는 α-Glc이고, Q²은 수소, Kdo 또는 -P-R(여기서, P는 포스페이트이며, R은 수소 또는 포스포에탄올아민)이고, R"'은 수소이고 Q²은 -P-R(여기서, R은 수소 또는 포스포에탄올아민)이고 Q¹은 α-Glc일 때, 지질 A는 해독되었다.Wherein Glc is glucose, Hep is heptose, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, and R"' is hydrogen or actinobacillus flulognu Monia ( Actinobacillus pleuropneumoniae ) O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, Q ¹ is hydrogen or α-Glc, Q ² is hydrogen, Kdo or -PR, where P is phosphate, When R is hydrogen or phosphoethanolamine), R "'is hydrogen, Q ² is -PR (where R is hydrogen or phosphoethanolamine) and Q ¹ is α-Glc, lipid A was detoxified. 하기 구조식 Ⅰ을 갖는 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 단리된 지질다당류 부분:An isolated lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a di-glucosyl-tetra-heptosyl innercore moiety having Formula I:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, P는 포스페이트이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.In the above, Glc is glucose, Hep is heptose, P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, and R"' is hydrogen or bad Tino Bacillus flu in the pneumoniae (Actinobacillus pleuropneumoniae) O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, and lipid A was detoxified. 하기 구조식 Ⅱ을 갖는 글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 단리된 지질다당류 부분:An isolated lipopolysaccharide moiety consisting essentially of the glucosyl-tetra-heptosyl innercore moiety having structure II:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.Wherein Glc is glucose, Hep is heptose, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, and R"' is hydrogen orActinobacillus Pluronuemonia(Actinobacillus pleuropneumoniae)of O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, and lipid A was detoxified. 제 1 항 내지 제 5 항중의 어느 한 항에 있어서, O-연결 그룹이 내부코어 부분내의 어느 위치에서 치환된 지질다당류 부분.The lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 5, wherein the O-linked group is substituted at any position within the inner core moiety. 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 기재된 지질다당류 부분과 약제학적으로 허용가능한 담체를 함께 포함하여 구성되는 약제학적 조성물.A pharmaceutical composition comprising a lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 6 together with a pharmaceutically acceptable carrier. 제 7 항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 면역원성인 약제학적 조성물.8. The pharmaceutical composition of claim 7, wherein the pharmaceutically acceptable carrier is immunogenic. 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 기재된 지질다당류 부분내의 에피토프에 결합하고, 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mannheimia haemolytica ), 악티노바실러스 플루로뉴모니애( Actinobacillus pleuropneumoniae ) 및 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)에 대하여 교차-반응성인 기능성 항체.Binding to an epitope in the lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 6, Manheimia Hemolytica ( Mannheimia haemolytica), as Evil Tino Bacillus pneumoniae flu (Actinobacillus pleuropneumoniae) and wave stew Relais is far Toshi (cross against Pasteurella multocida) - reactive functional antibody. 다음의 단계를 포함하여 구성하는, 만헤이미아 헤몰리티카 , 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다에 대해 교차-반응성인 기능성 항체의 생산 및 수확방법: Manhemia , comprising the following steps Molly H. Utica, Ill pneumoniae by Tino Bacillus flu Methods for producing and harvesting functional antibodies that are cross-reactive to and Pasteurella multocida : (a) 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 기재된 지질다당류 부분에 대한 항체를 생성하는 단계,(a) generating an antibody against the lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 6, (b) 상기 단계 (a)에서 생성된 항체들을 다수의 만헤이미아 헤몰리티카, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다 균주들에 대해 검사하는 단계, 및 (b) only the plurality of the antibody generated in the above step (a) Hei Mia Hemolytica , Actinobacillus Pneumoniae, and wave to the flu stew checking for all strains of Pasteurella Merle Tosh, and (c) 만헤이미아 헤몰리티카, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 및 파스튜렐라 멀토시다 균주 모두에 대해 교차-반응성을 보이는 항체를 선택하는 단계.(c) Manhemia Hemolytica , Actinobacillus The flu pneumoniae, and wave stew Relais Merle Tosh the cross for all strains - selecting antibodies exhibit reactivity. 제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 조성물을, 이 보존된 내부코어 구조를 갖는 파스튜렐라시에 과( Pasteurellaceae family) 유래의 박테리아 감염에 의한 질병 치료용 의약의 조제에의 사용.Claim 7 or use of a composition according to claim 8, in which the wave stew Pasteurella when having the conserved inner-core structure and (Pasteurellaceae family) of a medicament for the treatment of diseases caused by bacterial infection of the resulting preparation. 제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 조성물을, 보존된 내부코어 구조를 갖는 만헤이미아, 악티노바실러스 또는 파스튜렐라 속(genus) 유래의 박테리아 감염에 의한 질병 치료용 의약의 조제에의 사용.Claim 7 or use of only a Hay Mia, Ill Martino Bacillus or wave stew Pasteurella genus (genus) preparation of a medicament for the treatment of diseases caused by bacterial infection of the stems having an inner core structure of the composition, preservation according to claim 8. 제 7 항 또는 제 8 항에 기재된 조성물을, 보존된 내부코어 구조를 갖는 만헤이미아 헤몰리티카, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 또는 파스튜렐라 멀토시다 종(species) 유래의 박테리아 감염에 의한 질병 치료용 의약의 조제에의 사용.Claim 7 or only Hay Mia having a composition as set forth in claim 8, wherein the internal core structure conserved Hemolytica , Actinobacillus The flu pneumoniae or stew par Relais Merle Tosh is used for the preparation of a medicament for the treatment of diseases caused by bacterial infection of the species (species) originated. 제 11 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 돼지 피브리노출혈성 괴사성 흉막폐렴, 조류가금류 콜레라, 소 출혈성 패혈증, 돼지 위축성 비염, 양소 파스튜렐라 폐렴(수송열) 및 양 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병인 사용.The disease according to any one of claims 11 to 13, wherein the disease is swine fibrin hemorrhagic necrotic pleural pneumonia, avian poultry cholera, bovine hemorrhagic sepsis, swine atrophic rhinitis, sheep pasteurella pneumonia (transport fever) and sheep sepsis. Use, which is a disease selected from the group consisting of: 만헤이미아 헤몰리티카 균주 A1 losB(IDAC 040505-01). Manhemia H. Molina urticae strain A1 losB (IDAC 040505-01). 악성 가능성이 없고, 보존된 내부코어 구조로부터의 지질다당류 에피토프를 나타내는 박테리아 균주인, 파스튜렐라시에 과 유래의 박테리아 균주를 포함하는 약독화된 백신. An attenuated vaccine comprising a bacterial strain from Pasteurellasi, which is a bacterial strain that is free of malignancy and exhibits a lipopolysaccharide epitope from a conserved inner core structure. 제 16 항에 있어서, 상기 박테리아 균주는 만헤이미아, 악티노바실러스 및 파스튜렐라 속으로부터 선택되는 것인 약독화된 백신.17. The method of claim 16 wherein the bacterial strain is only lost Hay, Ill Martino Bacillus And a Pasteurella genus. 백혈구 독소 유전자에 돌연변이를 갖는 만헤이미아 헤몰리티카 균주 A1 losB를 포함하는 약독화된 백신. Only with a mutant toxin genes in white blood cells Hey Mia H. Molina urticae attenuated vaccine comprising a strain A1 losB. (a) 말단 단위로서 지질다당류 부분을 제공하기 위하여 불활성화된 글리코실트랜스퍼라제 유전자를 갖는, 만헤이미아 헤몰리티카, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 또는 파스튜렐라 멀토시다 종 유래의 돌연변이 균주를 단리하는 단계,(a) to provide a lipopolysaccharide as a part of the terminal unit having the glycosyl transferase gene inactivated, but hey Mia Hemolytica , Actinobacillus Isolating mutant strains from Pluronyumoniae or Pasteurella multocida species, (b) 상기 단계 (a)에서 단리된 만헤이미아 헤몰리티카, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 또는 파스튜렐라 멀토시다 돌연변이 균주를, 지질다당류 부분의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, (b) the only Hay Mia was isolated in the above step (a) Hemolytica , Actinobacillus A pneumoniae, or Pasteurella wave stew far Toshio the mutant strain as the flu, culturing under conditions suitable for the expression of the lipopolysaccharide part, (c) 상기 단계 (b)에서 발현된 지질다당류 부분을 단리 및 특성조사하는 단계, 및 (c) isolating and characterizing the lipopolysaccharide moiety expressed in step (b), and (d) 상기 단계 (c)에서 단리된 지질다당류 부분의 지질 A 부위를 해독하는 단계를 포함하며, (d) deciphering the lipid A site of the lipopolysaccharide moiety isolated in step (c); 하기 구조식 Ⅰ을 갖는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 지질다당류 부분의 제조방법:A process for preparing a lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety having the structure:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, P는 포스페이트이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.In the above, Glc is glucose, Hep is heptose, P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, and R"' is hydrogen or bad Tino Bacillus Of Pluroninho O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, and lipid A was detoxified. (a) 불활성화된 losB 유전자를 갖는, 만헤이미아 헤몰리티카 종 유래의 돌연변이 균주를 단리하는 단계,(a) having a losB gene inactivated, but hey Mia Isolating a mutant strain derived from a hemolytica species, (b) 상기 단계 (a)에서 단리된 만헤이미아 헤몰리티카 돌연변이 균주를, 지질다당류 부분의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, (b) the only Hay Mia was isolated in the above step (a) Culturing the hemolytica mutant strain under conditions suitable for expression of the lipopolysaccharide moiety, (c) 상기 단계 (b)에서 발현된 지질다당류 부분을 단리 및 특성조사하는 단계, 및 (c) isolating and characterizing the lipopolysaccharide moiety expressed in step (b), and (d) 상기 단계 (c)에서 단리된 지질다당류 부분의 지질 A 부위를 해독하는 단계를 포함하며, (d) deciphering the lipid A site of the lipopolysaccharide moiety isolated in step (c); 하기 구조식 Ⅰ을 갖는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 지질다당류 부분의 제조방법:A process for preparing a lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety having the structure:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, P는 포스페이트이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.In the above, Glc is glucose, Hep is heptose, P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, R"' is hydrogen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid and lipid A was detoxified. (a) 불활성화된 lbgA 또는 rfbP 유전자를 갖는, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 종의 혈청형 1 균주 유래의 돌연변이 균주를 단리하는 단계,(a) having an inactivated or lbgA rfbP gene, Ill Martino Bacillus Isolating a mutant strain derived from serotype 1 strain of Pluronomymoniae species, (b) 상기 단계 (a)에서 단리된 악티노바실러스 플루로뉴모니애 돌연변이 균주를, 지질다당류 부분의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, (b) Actinobacillus isolated in step (a) Culturing the Pluronyumoniae mutant strain under conditions suitable for expression of the lipopolysaccharide moiety, (c) 상기 단계 (b)에서 발현된 지질다당류 부분을 단리 및 특성조사하는 단계, 및 (c) isolating and characterizing the lipopolysaccharide moiety expressed in step (b), and (d) 상기 단계 (c)에서 단리된 지질다당류 부분의 지질 A 부위를 해독하는 단계를 포함하며, (d) deciphering the lipid A site of the lipopolysaccharide moiety isolated in step (c); 하기 구조식 Ⅰ을 갖는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 지질다당류 부분의 제조방법:A process for preparing a lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety having the structure:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, P는 포스페이트이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 O-항원이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.In the above, Glc is glucose, Hep is heptose, P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, and R"' is hydrogen or bad Tino Bacillus Of Pluroninho O-antigen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid, and lipid A was detoxified. (a) 불활성화된 PM0223 또는 PM1143 유전자를 갖는, 파스튜렐라 멀토시다 종 균주 Pm70 유래의 돌연변이 균주를 단리하는 단계,(a) isolating a mutant strain derived from Pasteurella multocida species strain Pm70 having an inactivated PM0223 or PM1143 gene, (b) 상기 단계 (a)에서 단리된 파스튜렐라 멀토시다 돌연변이 균주를, 지질다당류 부분의 발현에 적합한 조건하에서 배양하는 단계, (b) culturing the Pasteurella multocida mutant strain isolated in step (a) under conditions suitable for expression of the lipopolysaccharide moiety, (c) 상기 단계 (b)에서 발현된 지질다당류 부분을 단리 및 동정하는 단계, 및 (c) isolating and identifying the lipopolysaccharide moiety expressed in step (b), and (d) 상기 단계 (c)에서 단리된 지질다당류 부분의 지질 A 부위를 해독하는 단계를 포함하며, (d) deciphering the lipid A site of the lipopolysaccharide moiety isolated in step (c); 하기 구조식 Ⅰ을 갖는 보존된 디-글루코실-테트라-헵토실 내부코어 부분을 필수적으로 포함하여 구성되는 지질다당류 부분의 제조방법:A process for preparing a lipopolysaccharide moiety consisting essentially of a conserved di-glucosyl-tetra-heptosyl inner core moiety having the structure:

상기에서, Glc는 글루코스이고, Hep는 헵토스이고, P는 포스페이트이고, R은 수소 또는 포스포에탄올아민이고, R' 및 R"는 각각 수소 또는 올리고당 연장부이고, R"'은 수소이고, Kdo는 3-데옥시-D-만노-2-옥툴로손산이고, 지질 A는 해독되었다.In the above, Glc is glucose, Hep is heptose, P is phosphate, R is hydrogen or phosphoethanolamine, R 'and R "are each hydrogen or oligosaccharide extension, R"' is hydrogen, Kdo is 3-deoxy-D-manno-2-octulonic acid and lipid A was detoxified. 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항에 기재된 지질다당류 부분내의 에피토프에 결합하는 모노클론 항체.A monoclonal antibody that binds to an epitope in the lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 6. 제 19 항 내지 제 22 항중의 어느 한 항에 있어서, 상기 내부코어 지질다당류내에 함유된 에피토프에 대해 특이적인 모노클론 항체와 지질다당류 부분을 접촉시키므로서, 지질다당류 부분을 동정하는 단계를 더 포함하는 제조방법.23. The method of any one of claims 19 to 22, further comprising the step of identifying the lipopolysaccharide moiety by contacting the lipopolysaccharide moiety with a monoclonal antibody specific for an epitope contained within the innercore lipopolysaccharide. Manufacturing method. 제 24 항에 있어서, 상기 모노클론 항체는 제 23 항에 기재된 것인 제조방법.The method of claim 24, wherein the monoclonal antibody is described in claim 23. 면역원성 담체에 연결된 제 1 항 내지 제 6 항중의 어느 한 항 기재의 지질다당류 부분을 포함하는 복합당질.A multisaccharide comprising a lipopolysaccharide moiety according to any one of claims 1 to 6 linked to an immunogenic carrier. 제 26 항에 있어서, 상기 지질다당류 부분 및 면역원성 담체는 연결 분자를 통하여 연결된 것인 복합당질.27. The complex saccharide of claim 26, wherein said lipopolysaccharide portion and immunogenic carrier are linked via a linking molecule. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 연결 분자는 스쿠아레이트, 시스타민, 아디핀산디하이드라지드, ε-아미노헥사노익산, 클로로헥산올디메틸아세탈, D-글루쿠로노락톤 및 p-니트로페닐아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 복합당질.28. The method of claim 26 or 27, wherein the linking molecule is selected from the group consisting of squarate, cystamine, adipic acid dihydrazide, ε-aminohexanoic acid, chlorohexanoldimethylacetal, D-glucuronolactone and p. -A complex sugar selected from the group consisting of nitrophenylamine. 제 26 항 내지 제 28 항중의 어느 한 항에 있어서, 상기 담체는 해독된 P. 에루기노사(P.aeruginosa) 독소 A, 콜레라 독소/톡소이드, 백일해(pertussis) 독소/톡소이드, 클로스트리듐 퍼프린젠(Clostridium perfringens) 외독소/톡소이드, B형 간염 표면 항원, B형 간염 코어 항원, 로타바이러스 VP7 단백질, 호흡기 합포 체(respiratory syncytial) 바이러스 F 및 G 단백질, 디프테리아 독소 CRM₁₉₇, 테타누스 독소 TT, 인간혈청알부민(HSA), 만헤이미아 헤몰리티카 백혈구 독소 톡소이드, 만헤이미아 헤몰리티카 PlpE 지질단백질, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 OmlA, 만헤이미아 헤몰리티카 또는 악티노바실러스 플루로뉴모니애 TbpA & B(트랜스퍼 결합단백질), 만헤이미아 헤몰리티카 시알로글리코프로테아제, Apx Ⅰ 내지 Ⅳ로 이루어지는 군으로부터 선택되는 악티노바실러스 플루로뉴모니애 Apx 외톡소이드, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 또는 파스튜렐라 멀토시다 Plp-40 지질단백질, 파스튜렐라 멀토시다 Omp28 메이저 외막단백질, 파스튜렐라 멀토시다 39kDa 캡슐 단백질 및 파스튜렐라 멀토시다 PlpB(39kDa 교차보호성 지질단백질)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복합당질.29. The method of any one of claims 26-28, wherein the carrier is detoxified P. aeruginosa toxin A, cholera toxin / toxoid, pertussis toxin / toxoid, clostridial perfringen. ( Clostridium perfringens ) exotoxin / toxoid, hepatitis B surface antigen, hepatitis B core antigen, rotavirus VP7 protein, respiratory syncytial virus F and G proteins, diphtheria toxin CRM ₁₉₇ , tetanus toxin TT, human serum albumin ( HSA), Manhemia Hemortica Leukocyte toxin toxoid, but hey, Molly Mia H. Tikka PlpE Lipoprotein, Actinobacillus Pluronyumonia OmlA, but hey Mia Hemolytica or Actinobacillus Pluronyumonia TbpA & B (transfer-binding protein), but hey Mia Hemortica Actinobacillus selected from the group consisting of sialoglycoprotease, Apx I-IV Pluronyumonia Apx Otoxoid, Actinobacillus Pluronyumonia or Pasteurella multocida Plp-40 Lipoprotein, Pasteurella multocida Omp28 Major outer membrane protein, Pasteurella multocida 39kDa protein and capsules wave stew the Pasteurella far Toshima Complex saccharide selected from the group consisting of PlpB (39kDa cross-protective lipoprotein). 제 26 항 내지 제 29 항중의 어느 한 항에 기재된 복합당질 및 보조제(adjuvant)를 포함하여 구성되는 백신 조성물.30. A vaccine composition comprising the complex sugar and the adjuvant according to any one of claims 26 to 29. 제 30 항에 있어서, 상기 백신은 리포좀, 아케오좀의 형태로서 또는 아케오지질로부터 조제되는 백신 조성물.33. The vaccine composition of claim 30, wherein the vaccine is formulated in the form of liposomes, akeosomes or from akeogels. 제 30 항 또는 제 31 항에 있어서, 파스튜렐라시에 과 유래의 박테리아 전체 세포에 대해 교차 반응성의 항혈청을 유도하여 포유류를 예방접종하는 백신 조성 물.The vaccine composition according to claim 30 or 31, wherein the vaccine composition is immunized by inducing cross-reactive antiserum against whole cells of bacteria from Pasteurellasi family. 제 26 항 내지 제 29 항중의 어느 한 항에 기재된 복합당질과 보조제의 혼합물을 포함하여 구성되는 다가 백신 조성물.A multivalent vaccine composition comprising a mixture of the complex sugars of any one of claims 26 to 29 and an adjuvant.

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