KR20070030855A - Method of stabilizing proteins - Google Patents

Abstract

모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액을 제조하는 방법이 기술되어 있으며, 이 방법은 완충액에 모노머릭 단백질을 제공하는 단계 및 상기 벌크 용액에 부형제를 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 부형제는 정균제, 표면활성제, 등장제, 아미노산, 항산화제 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 모노머릭 단백질은 IFN-베타이다.A method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein is described, the method comprising providing monomeric protein to a buffer and adding an excipient to the bulk solution, wherein the excipient is bacteriostatic, surface Active agents, isotonic agents, amino acids, antioxidants, and combinations thereof. Preferred monomeric proteins are IFN-beta.

안정화된 벌크 용액, 모노머릭 단백질, IFN-베타, 인간 재조합 단백질 Stabilized bulk solution, monomeric protein, IFN-beta, human recombinant protein

Description

단백질을 안정화하는 방법{Method of stabilizing proteins}Method of stabilizing proteins

본 발명은 일반적으로 완충용액에 모노머릭 단백질(monomeric protein) 벌크(bulk)를 넣고 상기 벌크 용액에 특정 부형제(excipient)를 첨가여 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액를 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention generally relates to a method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein by adding a monomeric protein bulk to a buffer and adding a specific excipient to the bulk solution.

인터페론은 사이토킨, 즉 세포들 사이에서 메세지를 전달하고 감염을 일으키는 미생물을 파괴하는 것을 돕고 발생된 상처를 치유함으로서 면역계에서 중요한 역할을 하는 용해성 단백질이다. 인터페론은 감염된 세포들에 의해 자연적으로 분비되며 1957년에 처음 발견되었다. 그들의 이름은 그들이 바이러스 복제와 생성에 "관여(interfere)"한다는 사실에서 유래한다. Interferon is a cytokine, a soluble protein that plays an important role in the immune system by delivering messages between cells, helping to destroy infectious microorganisms and healing wounds that have occurred. Interferon is naturally secreted by infected cells and was first discovered in 1957. Their name derives from the fact that they "interfere" to virus replication and production.

인터페론은 항바이러스(antiviral) 및 항증식성(antiproliferative) 활성을 나타낸다. 생화학적 그리고 면역학적 성질을 기초로, 자연 발생하는 인간 인터페론을 세 가지로 크게 분류하였다: 인터페론-알파(백혈구: leukocyte), 인터페론-베타(섬유모세포: fibroblast) 및 인터페론-감마(면역: immune). 알파-인터페론은 현재 미국 및 다른 나라에서 유모세포백혈병(hairy cell leukemia), 성병성 사마귀(venereal warts), 카포시육종(Kaposi's Sarcoma))(에이즈로 고통받는 환자들을 공통적으로 괴롭히는 암), 만성 비A-, 비B- 간염(chronic non-A, non-B hepatitis) 의 치료용으로 승인되었다.Interferon exhibits antiviral and antiproliferative activity. On the basis of biochemical and immunological properties, naturally occurring human interferons are classified into three major categories: interferon-alpha (leukocyte: leukocyte), interferon-beta (fibroblast) and interferon-gamma (immune: immune). . Alpha-interferon is currently used in the US and other countries for hairy cell leukemia, venereal warts, Kaposi's Sarcoma) (a cancer that commonly plagues patients suffering from AIDS), chronic non-A -Approved for the treatment of chronic non-A (non-B hepatitis).

게다가 인터페론(interferons: IFNs)는 바이러스 감염에 반응하는 신체에 의해 생성된 글리코단백질(glycoprotein)이다. 이들은 보호된 세포들에서 바이러스의 증식을 저해한다. 저분자량 단백질로 구성되는 IFNs는 그들의 작용이 매우 비특이적이다. 즉 한 바이러스에 의해 유도된 IFN은 넓은 범위의 다른 바이러스에 대해서도 효과적이다. 그러나 그들은 종-특이적이다. 즉 한 종에 의해 유도된 IFN은 단지 동일 또는 매우 관련된 종의 세포에서만 항바이러스성 활성을 자극한다. IFN은 그들의 잠재적 항-종양 및 항바이러스성 활성에 이용되는 시토카인(cytokine)의 제1 집단이었다. In addition, interferons (IFNs) are glycoproteins produced by the body in response to viral infections. They inhibit the growth of the virus in protected cells. IFNs composed of low molecular weight proteins are very nonspecific in their action. In other words, IFN induced by one virus is effective against a wide range of other viruses. But they are species-specific. That is, IFN induced by one species stimulates antiviral activity only in cells of the same or highly related species. IFNs were the first population of cytokines used for their potential anti-tumor and antiviral activity.

상기 주요 IFNs는 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ로 나타낸다. 그러한 주요 종류의 IFN은 초기에 그들의 세포 기원에 따라 분류되었었다(백혈구, 섬유모세포 또는 T 세포). 그러나 여러가지 종류들이 한 세포에서 생성될 수 있다는 것이 분명해졌다. 그러므로 백혈구 IFN은 현재 IFN-α, 섬유모세포 IFN은 IFN-β 그리고 T 세포 IFN은 IFN-γ이다. 네번째 타입의 IFN이 존재하는데, 림포블라스토이드(lymphoblastoid) IFN은 "나말와(Namalwa)" 세포주[버킷림프종(Burkitt's lymphoma)에서 유래]에서 생성되며, 백혈구와 섬유모세포 IFN의 혼합물을 생성하는 것으로 보인다. The major IFNs are represented by IFN-α, IFN-β and IFN-γ. Such major types of IFNs were initially classified according to their cellular origin (white blood cells, fibroblasts or T cells). However, it became clear that different kinds could be produced in one cell. Therefore, leukocyte IFN is currently IFN-α, fibroblast IFN is IFN-β and T cell IFN is IFN-γ. There is a fourth type of IFN, which is produced in the "Namalwa" cell line (from Burkitt's lymphoma) and produces a mixture of leukocytes and fibroblast IFN. see.

상기 인터페론용 국제 단위 또는 인터페론 단위(U 또는 IU, 국제 단위)는 바이러스 손상에 대한 세포 50% 보호를 위해 필요한 양으로 규정된 IFN 활성 측정값으로 보고되어 왔다. 대생물작용(bioactivity)을 측정하기 위하여 사용될 수 있는 측정법은 기술된 것처럼 세포병변효과(cytopathic effect) 저해 측정법이다(Rubinstein, et al. 1981; Familetti, P.C. et al., 1981). 인터페론에 대한 항바이르스성 측정법에서 인터페론 약 1 unit/ml는 50%의 세포병변효과를 주기에 필요한 양이다. 상기 단위는 국립보건기구(National Institutes of Health)(Pestka S. 1986)에 의해 제공된 Hu-IFN-베타에 대한 국제 대조군 기준(international reference standard)에 관하여 결정된다(Pestka S. 1986).The international unit or interferon unit (U or IU, international unit) for interferon has been reported as a measure of IFN activity defined in the amount necessary for 50% protection of cells against viral damage. Assays that can be used to measure bioactivity are assays for inhibiting cytopathic effects as described (Rubinstein, et al. 1981; Familetti, P. C. et al., 1981). In the antiviral assay for interferon, about 1 unit / ml of interferon is the amount necessary to give a cytopathic effect of 50%. The unit is determined in terms of the international reference standard for Hu-IFN-beta provided by the National Institutes of Health (Pestka S. 1986) (Pestka S. 1986).

IFN의 모든 류들은 몇 가지 분명한 타입들을 포함한다. IFN-β 및 IFN-γ은 각각 단일 유전자 산물이다. All classes of IFNs contain several distinct types. IFN-β and IFN-γ are each a single gene product.

IFN-α로서 분류된 단백질들은 가장 다양한 집단이며, 약 15가지 타입을 포함한다. 적어도 23개의 구성원들을 포함하며, 그중 15개는 활성적이며 전사되고 염색체 9 상의 IFN-α 유전자들의 군집(cluster)이다. 성숙한 IFN-α는 글리코실화되지 않는다. Proteins classified as IFN-α are the most diverse population and include about 15 types. At least 23 members, 15 of which are active, transcribed, and a cluster of IFN-α genes on chromosome 9. Mature IFN-α is not glycosylated.

IFN-α 및 IFN-β은 모두 유사한 생물학적 활성을 갖는 동일한 길이(165 또는 166 아미노산)이다. IFN-γ는 146 아미노산 길이이며, α 및 β 류에 덜 밀접하게 닮았다. 단지 IFN-γ는 대식세포(macrophage)를 활성화시키거나 또는 살해 T 세포(killer T cell)의 성숙을 유도한다. 이들 새로운 타입의 치료제들은 때때로 생체반응조절물질(biologic response modifiers: BRMs)로 불린다. 왜냐하면 그들은 면역제어(immunomodulation)를 통해 인지(recognition)에 영향을 미쳐, 종양에 대한 유기물의 반응에 영향을 주기 때문이다.  IFN-α and IFN-β are both the same length (165 or 166 amino acids) with similar biological activity. IFN-γ is 146 amino acids long and resembles less closely to the α and β classes. Only IFN- [gamma] activates macrophage or induces maturation of killer T cells. These new types of therapies are sometimes called biologic response modifiers (BRMs). Because they influence cognition through immunomodulation, they affect the response of organisms to tumors.

인간 섬유모세포 인터페론(IFN-β)는 항바이러스성 활성을 가지며 또한 종양 세포(neoplastic cell)에 대하여 자연 살해세포를 자극할 수 있다. 이것은 바이러스에 의해 유도된 약 20,000Da의 폴리펩티드이고 두가닥 RNA(double-stranded RNA)이다. 재조합 DNA 기술(Derynk et al. 1980)에 의해, 클론된 섬유모세포 인터페론용 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스로부터 상기 단백질의 아미노산 시퀀스가 유도되었다. 이것은 166 아미노산 길이를 갖는다.Human fibroblast interferon (IFN-β) has antiviral activity and can also stimulate natural killer cells against neoplastic cells. This is about 20,000 Da of polypeptides induced by the virus and is double-stranded RNA. By recombinant DNA technology (Derynk et al. 1980), the amino acid sequence of the protein was derived from the nucleotide sequence of the cloned fibroblast interferon gene. It is 166 amino acids long.

쉐퍼드(Shepard) 등(1981)은 염기 842에 돌연변이(141 위치에서 Cys -> Tyr)하여 항바이러스성 활성을 없앤 돌연변이와, 뉴클레오티드 1119-1121의 결실을 갖는 여러 클론(clone)을 기술하였다. Shepard et al. (1981) described several clones with mutations at base 842 (Cys-> Tyr at position 141) that eliminated antiviral activity and deletions of nucleotides 1119-1121.

마크(Mark) 등(1984)은 염기 469(T)를 (A)로 치환하여 17번 위치에서 아미노산을 Cys -> Ser로 바꾸어 인공 돌연변이를 삽입하였다. 얻어진 IFN-β는 '자연 IFN-β' 만큼 활성적인 것으로 보고되었으며, 장기 저장(-70℃) 동안 안정한 것으로 보고되었다. Mark et al. (1984) substituted an artificial mutation by replacing base 469 (T) with (A) and replacing the amino acid at position 17 with Cys-> Ser. The resulting IFN-β was reported to be as active as 'natural IFN-β' and reported to be stable during long term storage (-70 ° C).

레비프^®(Rebif^®)(Serono-재조합 인간 인터페론-β)는, 다발경화증(multiple sclerosis:MS) 치료용 인터페론 치료법으로 최근 개발된 것으로 포유류 세포주로부터 생성된 인터페론(IFN)-베타-1a이다. 권장 국제 일반명(International Non-proprietary Name:INN)은 "인터페론-베타-1a"이다. Levy profiles ^® (Rebif ^®) (Serono- recombinant human Interferon -β) is multiple sclerosis (multiple sclerosis: MS) interferon (IFN) generated by the recent development in interferon therapy for treatment from a mammalian cell line - a beta -1a. The recommended International Non-proprietary Name (INN) is "Interferon-beta-1a".

모든 단백질계 제약에서와 같이, 치료제로서 IFN-베타를 사용하는데 있어서 극복해야하는 큰 장애는 약제학적 유용성의 손실, 즉 약제학적 제제에서의 불안정성으로 인한 손실이다. As with all protein-based pharmaceuticals, the major obstacle to overcome in using IFN-beta as a therapeutic agent is the loss of pharmaceutical utility, i.e. loss due to instability in pharmaceutical formulations.

약제학적 제제에서 폴리펩티드 활성과 효능을 위협하는 물리적 불안정성은 용해성 및 불용해성 응집체(aggregate)의 변성 및 형성인 반면에, 화학적 불안정성은 가수분해, 이미드(imide) 형성, 산화, 라세미화(racemization), 및 탈아민화(deamidation)이다. 이들 변화의 몇 가지는 중요한 단백질의 약제학적 활성의 손실 또는 감소를 일으키는 것으로 알려져 있다. 다른 경우에서, 이들 변화들의 정확한 효과는 알려진바 없으나, 얻어진 저품질 산물은 여전히 바람직하지 못한 부작용에 대한 잠재성으로 인하여 약제학적으로 허용될 수 없는 것으로 생각된다. Physical instability threatening polypeptide activity and efficacy in pharmaceutical formulations is the denaturation and formation of soluble and insoluble aggregates, while chemical instability is hydrolysis, imide formation, oxidation, racemization , And deamidation. Some of these changes are known to cause loss or reduction in the pharmaceutical activity of important proteins. In other cases, the exact effect of these changes is unknown, but the low quality product obtained is still considered to be pharmaceutically unacceptable due to the potential for undesirable side effects.

약제학적 조성물에서 폴리펩티드의 안정화는 여전히 시행 착오가 중요한 역활을 하는 분야로 남아있다(reviewed by Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang and Hanson(1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26). 안정성을 증가시키기 위하여 폴리펩티드 약제학적 제제에 첨가되는 부형제는 완충액, 당, 표면활성제, 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리머를 포함하나, 이들 화학적 첨가제들의 안정화 효과는 단백질의 종류에 따라 다양하다. Stabilization of polypeptides in pharmaceutical compositions remains an area where trial and error play an important role (reviewed by Wang (1999) Int. J. Pharm. 185: 129-188; Wang and Hanson (1988) J. Parenteral Sci. Tech. 42: S3-S26). Excipients added to polypeptide pharmaceutical formulations to increase stability include buffers, sugars, surfactants, amino acids, polyethylene glycols, and polymers, but the stabilizing effects of these chemical additives vary with the type of protein.

현재 단백질 제제는 단백질의 최종 약제(preparation)에 부형제를 사용하는 것을 채택하고 있다. 그러나 이러한 제제는 불안정한 부분이 남아있다. 게다가, 모노머로서 생물학적으로 활성인 단백질, 즉 모노머릭 단백질은 스트레스를 받을 때(예를 들어 온도 스트레스) 중합하여 응집체를 형성하는 경향이 있다.Protein preparations now employ the use of excipients in the final preparation of proteins. However, these formulations remain unstable. In addition, proteins that are biologically active as monomers, ie monomeric proteins, tend to polymerize to form aggregates when under stress (eg, temperature stress).

결과적으로, 단백질의 용해성을 개선하고 응집 및 올리고머화(oligomerization)하는 것에 대하여 특히 모노머릭 단백질의 안정화를 증가시켜 그들의 약제학적 이용성을 증가시키는 방법이 필요하다. As a result, there is a need for a method of improving the solubility of proteins and increasing their pharmaceutical availability by increasing the stabilization of monomeric proteins, especially for aggregation and oligomerization.

제1 양태에서, 본 발명은 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:In a first aspect, the invention provides a method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein, the method comprising the following steps:

a) 완충용액에 벌크의 모노머릭 단백질을 넣고, 및a) adding bulk monomeric protein in a buffer, and

b)상기 벌크에 부형제를 첨가하는 단계, 여기서 상기 부형제는 다음 군으로부터 선택된다:b) adding an excipient to the bulk, wherein the excipient is selected from the following group:

i) 정균제(bacteriostatic agent),i) bacteriostatic agents,

ii) 표면활성제ii) surfactants

iii) 등장제(isotonicity agent)iii) isotonicity agent

iv) 아미노산iv) amino acids

v) 항산화제v) antioxidants

vi) 등장제와 항산화제vi) isotonic and antioxidant

vii) 등장제, 항산화제 및 아미노산vii) isotonic agents, antioxidants and amino acids

viii)아미노산 및 항산화제viii) amino acids and antioxidants

ix) 아미노산, 항산화제 및 표면활성제ix) amino acids, antioxidants and surfactants

x) 정균제 및 항산화제, 및x) bacteriostatic and antioxidant agents, and

xi) 정균제, 항산화제 및 표면활성제.xi) bacteriostatics, antioxidants and surfactants.

또한, 벌크 단백질은 본 발명의 제1 양태에 따른 방법 전 또는 후에 특정 온도에서 배양될 수 있다.In addition, the bulk protein may be cultured at a specific temperature before or after the method according to the first aspect of the invention.

제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1양태에 따른 방법에 의해 얻어진 사전-제형화된 벌크 단백질(pre-formulated bulk protein)을 제공한다.In a second aspect, the present invention provides a pre-formulated bulk protein obtained by the method according to the first aspect of the present invention.

제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 벌크 단백질의 사전-제형화된 방법을 포함하는 모노머릭 단백질의 안정성을 증가 및/또는 유지시키는 방법을 제공한다. In a third aspect, the present invention provides a method of increasing and / or maintaining the stability of a monomeric protein comprising a pre-formulated method of bulk protein according to the first aspect of the invention.

도 1- 열 해리 작은 실험실 규모 절차(thermal dissociation small lab scale procedure)1- thermal dissociation small lab scale procedure

도 1은 벌크-인터페론 안정화에 대한 배양 온도 및 배양 시간의 효과 에 관련된 실시예 1a의 작은 실험실 규모 절차의 열 해리를 나타낸다. 도 1은 표 4에 대응한다. 1 shows the thermal dissociation of the small laboratory scale procedure of Example 1a related to the effect of incubation temperature and incubation time on bulk-interferon stabilization. 1 corresponds to Table 4.

4F/T 이후 0.9ml 벌크 샘플의 SE-HPLC 결과SE-HPLC results of 0.9 ml bulk samples after 4 F / T

도 2는 실시예 1b의 4F/T 사이클 후 29℃에서의 실험실 규모의 열 해리(Lab2 is a lab scale thermal dissociation at 29 ° C. after the 4F / T cycle of Example 1b (Lab

Scal Thermal Dissociation) 결과를 나타낸다. 상기 Y 축은 면 적 퍼센트를 나타낸다. 상기 X-축은 r-h IFN-베타 1a의 검출된 형태, 즉 응집체(aggregate), 다이머(dimer), 또는 모노머(monomer)등을 나 타낸다. 각각 검출된 형태의 제1 컬럼은 대조군이며 2 시간 동안 실 온에서 해동되고 -4℃에서 저장된 사전 제형화된 벌크(bulk pre- formulation)에 대응된다. 각각 검출된 형태의 제2 컬럼은 2시간 동안 실온에서 해동되고 이후 3시간 동안 29℃에서 배양된 사전제형화된 벌 크에 대응한다. 각 검출된 형태의 제3 컬럼은 실온에서 2시간 동안 해동되고 15시간 동안 29℃에서 배양된 사전제형화된 벌크에 대응된 다. 각 검출된 형태의 마지막 또는 제4 컬럼은 욕조에서 해동된 후 15 시간 동안 29℃에서 배양된 사전제형된 벌크에 대응한다. 도 2는 표 11에 대응한다. Scal Thermal Dissociation) results are shown. The Y axis represents area percentage. The X-axis represents the detected form of r-h IFN-beta 1a, ie aggregates, dimers, or monomers. The first column in each detected form corresponds to a bulk pre-formulation that is a control and thawed at room temperature for 2 hours and stored at -4 ° C. The second column of each detected form corresponds to the preformulated bulk thawed at room temperature for 2 hours and then incubated at 29 ° C. for 3 hours. The third column of each detected form corresponds to preformulated bulk thawed at room temperature for 2 hours and incubated at 29 ° C. for 15 hours. The last or fourth column of each detected form corresponds to the preformed bulk incubated at 29 ° C. for 15 hours after thawing in the bath. 2 corresponds to Table 11.

도 3 - 2F/T 후 200ml 벌크 샘플의 SE-HPLC 결과Figure 3-SE-HPLC results of 200 ml bulk samples after 2F / T

도 3은 실시예 1b의 2 F/T 사이클 후 29℃에서 실험실 규모의 열해리 결과를 나타낸다. 상기 Y 축은 면적 퍼센트를 나타낸다. X축은 r-h IFN-베타 1a의 검출된 형태, 즉 응집체(aggregate), 다이머(dimer), 또는 모노 머(monomer)등을 나타낸다. 각각 검출된 형태의 제1 컬럼은 대조군이 며 7 시간 동안 실온에서 해동되고 -4℃에서 저장된 사전제형화된 벌 크(bulk pre-formulation)에 대응된다. 각각 검출된 형태의 제2 컬럼 은 7시간 동안 실온에서 해동되고 이후 15시간 동안 29℃에서 배양된 사전제형화된 벌크에 대응한다. 도 3은 표 12에 대응한다. 3 shows the results of lab scale thermal dissociation at 29 ° C. after the 2 F / T cycles of Example 1b. The Y axis represents area percent. The X-axis represents the detected form of r-h IFN-beta 1a, namely aggregates, dimers, monomers and the like. The first column of each detected form is a control and corresponds to a preformed bulk that is thawed at room temperature for 7 hours and stored at -4 ° C. The second column of each detected form corresponds to the preformulated bulk thawed at room temperature for 7 hours and then incubated at 29 ° C. for 15 hours. 3 corresponds to Table 12.

도 4 - 실험실 규모 F/TX1에서 열해리의 동력학(Kinetics of thermal dissociation at labscale F/TX1). 시간에 따른 모노머 퍼센트FIG. 4-Kinetics of thermal dissociation at labscale F / TX1. Monomer Percent Over Time

도 4는 29℃에서 배양되고 1F/T 사이클을 따른 때 시간에 따른 r-h IFN-베타 1a의 모노머 퍼센트를 나타낸다. Y축은 면적 퍼센트를 나타 낸다. X축은 시간(hours)을 나타낸다. 도 4의 결과는 표 14와 대응한 다. 4 shows the monomer percentage of r-h IFN-beta 1a over time when incubated at 29 ° C. and following the 1F / T cycle. The Y axis represents the area percentage. The X axis represents hours. The results in FIG. 4 correspond to Table 14.

도 5 - 실험실 규모 F/TX1에서 열해리의 동력학(Kinetics of thermal dissociation at labscale F/TX1). 시간에 따른 다이머 퍼센트FIG. 5-Kinetics of thermal dissociation at labscale F / TX1. Dimer Percent Over Time

도 5는 29℃에서 배양되고 1F/T 사이클을 따른 때 시간에 따른 r-h IFN-베타 1a의 다이머 퍼센트를 나타낸다. Y축은 면적 퍼센트를 나타 낸다. X축은 시간(hours)을 나타낸다. 도 5의 결과는 표 14와 대응한 다. 5 shows the percent dimer of r-h IFN-beta 1a over time when incubated at 29 ° C. and following the 1F / T cycle. The Y axis represents the area percentage. The X axis represents hours. The results in FIG. 5 correspond to Table 14.

도 6 - 실험실 규모 F/TX1에서 열해리의 동력학. 시간에 따른 응집체 퍼센트6-Kinetics of thermal dissociation at laboratory scale F / TX1. Percent Aggregates Over Time

도 6는 29℃에서 배양되고 1F/T 사이클을 따른 때 시간에 따른 r-h IFN-베타 1a의 응집체 퍼센트를 나타낸다. Y축은 면적 퍼센트를 나타 낸다. X축은 시간(hours)을 나타낸다. 도 6의 결과는 표 14와 대응한 다. 6 shows percent aggregates of r-h IFN-beta 1a over time when incubated at 29 ° C. and following 1F / T cycles. The Y axis represents the area percentage. The X axis represents hours. The results in FIG. 6 correspond to Table 14.

도 7 - 실시예 2에 대한 사전제형화 연구의 도식7-Schematic of a preformulation study for Example 2

도 7은 안정화된 벌크 인터페론-베타를 제공하기 위하여 SEC-EL 분획 으로부터 최종 복용 형태(final dosage form: FDF) 저장까지 제조공정 단계 동안에 r-h IFN-베타 1a가 올리고머화하는 것을 최소화하는 데 촛점이 맞추어진 실시예 2의 연구 도식을 나타낸다. 상기 도식은 또한 실시예 2의 6.2 단락 하에 기술되어 있다. FIG. 7 focuses on minimizing oligomerization of rh IFN-beta 1a during the manufacturing process step from SEC-EL fraction to final dosage form (FDF) storage to provide stabilized bulk interferon-beta. The study schematic of Gene Example 2 is shown. The scheme is also described under section 6.2 of Example 2.

도 8 - 실시예 3에 대한 사전제형화 연구의 도식8-Schematic of a preformulation study for Example 3

도 8은 r-h IFN-베타 1a의 올리고머화를 최소화하는 데 중점을 둔 실 시예 3의 도식을 나타내며, 벌크 IFN-베타의 안정화후에 r-h IFN-베타 1a 모노머 준위를 측정하기 위하여, 두 개의 다른 방법들, 속도 초원 심분리법(velocity ultracentrifugation) 및 SE-HPLC을 사용하였다. 상기 도식은 실시예 3의 6.1 및 6.2 단락에 기술되어 있다. FIG. 8 shows a schematic of Example 3 focused on minimizing oligomerization of rh IFN-beta 1a, two different methods for measuring rh IFN-beta 1a monomer levels after stabilization of bulk IFN-beta. , Velocity ultracentrifugation and SE-HPLC were used. The scheme is described in paragraphs 6.1 and 6.2 of Example 3.

본 발명은 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액을 제조하는 방법과 관련이 있으며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:The present invention relates to a method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein, the method comprising the following steps:

a) 완충용액에 벌크 모노머릭 단백질을 넣고, 및a) placing the bulk monomeric protein in a buffer, and

b) 상기 벌크 용액에 부형제를 첨가하는 단계, 여기서 상기 부형제는 다음 군으로부터 선택된다:b) adding an excipient to the bulk solution, wherein the excipient is selected from the following group:

i) 정균제(bacteriostatic agent),i) bacteriostatic agents,

ii) 표면활성제ii) surfactants

iii) 등장제(isotonicity agent)iii) isotonicity agent

iv) 아미노산iv) amino acids

v) 항산화제v) antioxidants

vi) 등장제와 항산화제vi) isotonic and antioxidant

vii) 등장제, 항산화제 및 아미노산vii) isotonic agents, antioxidants and amino acids

viii) 아미노산 및 항산화제viii) amino acids and antioxidants

ix) 아미노산, 항산화제 및 표면활성제ix) amino acids, antioxidants and surfactants

x) 정균제 및 항산화제, 및x) bacteriostatic and antioxidant agents, and

xi) 정균제, 항산화제 및 표면활성제.xi) bacteriostatics, antioxidants and surfactants.

만약 안정화가 본 출원에서 상세히 기술된 하나 이상의 부형제를 벌크 단백질에 첨가하는 것에 의해 이루어진다면, 안정성은 하나 이상의 부형제를 벌크 단백질에 첨가하는 순간부터 상기 단백질을 포함하는 제제의 최종 사용, 즉 환자에 의해 최종 흡입될 때까지로 보증된다는 것을 본 출원인이 발견하였다. 그러므로 안정화는 단순히 저장단계에서뿐만 아니라 단백질이 그것이 사용되는 때까지의 수명동안 만나게 될 수 있는 여러 단계, 즉 저장 전, 동안 및 후를 통해서 일어난다. 본 발명의 방법은 그러므로 단백질 또는 단백질 제제가 그의 수명 동안 겪게되는 여러가지 스트레스와 상호작용할 수 있다. 그러므로 안정화는 제조시뿐 아니라 운송, 저장 및 전달 과정에서도 일어난다. If stabilization is achieved by adding one or more excipients described in detail herein to the bulk protein, stability is achieved by the end use of the formulation comprising the protein, i.e. by the patient, from the moment of adding the one or more excipients to the bulk protein. Applicants have found that until the last inhalation is warranted. Therefore stabilization takes place not only in the storage phase but also through the various stages in which the protein can be encountered during its lifetime until it is used, ie before, during and after storage. The method of the present invention can therefore interact with the various stresses that a protein or protein preparation undergoes during its lifetime. Therefore, stabilization takes place not only in manufacturing but also in transport, storage and delivery.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 얻어진 안정화된 벌크, 또한 사전제형화된 벌크라 불리는 것을 포함한다. The present invention also includes stabilized bulks obtained according to the process of the invention, also called preformulated bulk.

상기 용어 "사전제형화(pre-formulation)"은 이후 벌크 모노머릭 단백질을 포함하는 제제를 의미한다. 이들 사전-제형화된 제제의 안정성은 단순히 응집체 및 올리고머화를 낮추는 것뿐만 아니라 산화, 탈아민화(deamidation) 등과 같은 해로운 형태들을 포함한다. 그러한 것처럼, 본 발명은 또한 이들 과정이 모노머릭 단백질의 안정성에 영향을 주는 한 다른 모든 형태의 과정을 포함한다. The term "pre-formulation" refers to a formulation which then comprises a bulk monomeric protein. The stability of these pre-formulated formulations includes not only lowering aggregates and oligomerization, but also harmful forms such as oxidation, deamidation and the like. As such, the invention also encompasses all other forms of processes as long as these processes affect the stability of the monomeric protein.

상기 용어 "저장 동안"은 한번 제조되면 바로 환자에게 투여되지 않는 제제 또는 조성물을 의미한다. 오히려, 제조후, 액상 또는 환자에게 투여하기에 적당한 형태로 저장용으로 포장된다. The term "during storage" refers to an agent or composition that, once prepared, is not administered directly to a patient. Rather, after manufacture, they are packaged for storage in liquid or suitable form for administration to a patient.

"건조 형태(dried form)"는 냉동 건조, 스프레이 건조, 또는 공기 건조에 의해 건조된 제제 또는 조성물을 의도한다. 모노머릭 단백질 또는 약제학적 제제의 다른 구성성분들에 의한 응집체 또는 올리고머 형성은 모노머릭 단백질의 생물학적 활성에 나쁜 영향을 미칠 수 있어, 약제학적 제제의 치료적 효능을 손실하는 결과를 가져온다. 게다가, 응집체 또는 올리고머 형성은, 모노머릭 단백질 함유 약제학적 조성물을 주입 시스템(infusion system)을 사용하여 투여할 때 튜빙(tubing), 막 또는 펌프의 고정과 같은 다른 문제들을 일으킬 수 있다. "Dried form" is intended for a formulation or composition dried by freeze drying, spray drying, or air drying. Aggregation or oligomer formation by the monomeric protein or other components of the pharmaceutical formulation can adversely affect the biological activity of the monomeric protein, resulting in loss of the therapeutic efficacy of the pharmaceutical formulation. In addition, aggregate or oligomer formation can cause other problems such as tubing, fixation of the membrane or pump when the monomeric protein containing pharmaceutical composition is administered using an infusion system.

상기 용어 "안정성"은 항바이러스 활성 및/또는 단백질 구조와 같은 단백질 활성의 상대적 일시적 항상성(relative temporal constancy)을 의미하며 필연적인 기능적 정의를 갖는다. 상기 용어 "안정성"은 또한 본 발명의 인터페론의 사전제형화된 제제의 물리적, 화학적 및 구조적 안정성을 의미한다(생물학적 효능의 유지를 포함). 사전-제형화된 단백질의 불안정성은 상기 단백질 분자의 화학적 분해 또는 응집에 의해 야기되어 더 높은 차수의 폴리머, 탈당화(deglycosylation), 글리코실화의 변형, 산화 또는 다른 구조적 변형을 일으켜서 본 발명에 포함된 모노머릭 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성을 감소시킨다. The term "stability" refers to the relative temporal constancy of protein activity, such as antiviral activity and / or protein structure, and has a consequent functional definition. The term "stability" also refers to the physical, chemical and structural stability of the preformulated formulation of interferon of the invention (including maintenance of biological efficacy). Instability of pre-formulated proteins is caused by chemical degradation or agglomeration of the protein molecules resulting in higher order polymers, deglycosylation, modification of glycosylation, oxidation or other structural modifications that are included in the present invention. Reduce at least one biological activity of the monomeric protein.

"안정한" 사전제형화된 제제는 그 안의 단백질의 분해, 변형, 응집, 생물학적 활성의 손실 등의 정도가 허용가능하게 제어되어 시간에 따라 허용불가능하게 증가하지 않는다는 것이다. A “stable” preformulated formulation is that the degree of degradation, modification, aggregation, loss of biological activity, etc., of the protein therein is unacceptably increased over time so that it is unacceptably controlled.

상기 용어 "안정화된"은, 모노머릭 단백질을 포함하는 제제 또는 벌크 모노머릭 단백질에 첨가된, 여기에 개시된 부형제가 존재하지 않은 때 제조된 모노머릭 단백질 또는 제제에 비하여, 상대적으로 증가 및/또는 유지된 안정성을 나타내는 본 발명의 모노머릭 단백질을 포함하는 제제 또는 모노머릭 단백질을 의미한다. The term “stabilized” is relatively increased and / or maintained relative to monomeric proteins or formulations prepared when no excipients disclosed herein are added to the formulation or bulk monomeric protein comprising monomeric proteins. By a monomeric protein or a monomeric protein of the present invention exhibiting a stable stability.

여기에 사용된 것처럼, 상기 용어 "안정화"는 "단백질 응집체를 감소 및/또는 예방" 및/또는 "단백질 올리고머화를 감소 및/또는 예방" 및/또는 "응집체 형성을 감소 및/또는 예방" 및/또는 "중합반응을 감소 및/또는 예방" 및/또는 "산화를 감소 및/또는 예방" 및/또는 "마이셀(micelle) 형성을 감소 및/또는 예방" 및/또는 "탈아민화를 감소 및/또는 예방" 및/또는 "모노머릭 단백질을 포함하는 제제 또는 모노머릭 단백질 가공시 여러 가지 나쁜 영향을 감소 및/또는 예방" 과 사용교환적으로 사용된다. As used herein, the term "stabilization" refers to "reducing and / or preventing protein aggregates" and / or "reducing and / or preventing protein oligomerization" and / or "reducing and / or preventing aggregate formation" and And / or "reduce and / or prevent polymerization" and / or "reduce and / or prevent oxidation" and / or "reduce and / or prevent micelle formation" and / or "reduce deamination and / or Or prophylactic "and / or" reducing and / or preventing various adverse effects in the preparation or preparation of monomeric proteins comprising monomeric proteins ".

상기 용어 "모노머" 또는 "모노머릭(monomeric)"은 단일 펩티드 사슬을 갖는 분자를 의미한다. The term "monomer" or "monomeric" refers to a molecule having a single peptide chain.

상기 용어 "벌크 단백질" 또는 "단백질의 벌크" 또는 "벌크 모노머릭 단백질" 또는 "모노머릭 단백질의 벌크"는 여기서 제조과정, 그렇지만 아직 최종단계는 아닌 것으로 정제 단계를 이미 거친 모노머릭 단백질 또는 단백질 상태를 의미하며, 최종적으로 포장되어 판매를 위해 배포되는 것으로서 "최종 복용형태(FDF)" 또는 "약제학적 조성물"로 제조할 수 있는 것이다. 그러므로 재조합 단백질의 벌크는 여기서 정제 과정의 마지막 단계, 그러나 최종 제형화 단계 거치기 전에 얻어지는 생산물로 생각될 수 있다. 즉 다시 말해서, 본 발명의 방법은 사전-제형화 단계를 포함하는 것으로 생각될 수 있으며, 사전-제형화된 벌크를 얻고, 추가 부형제를 첨가하여 최종 복용형태 또는 약제학적 조성물을 제조할 것이다. 통상, 사전-제형화 된 또는 비-제형화된 벌크가 최종 제제가 제조되기 전에 저장될 수 있으나 꼭 필요한 것은 아니다. 만약 냉동된 상태에서 저장된다면, 상기 벌크 단백질은 통상 해동, 여과 및 최종 제형화 단계를 거치나, 반드시 필요한 것은 아니다. The term "bulk protein" or "bulk of protein" or "bulk monomeric protein" or "bulk of monomeric protein" is herein a monomeric protein or protein state that has already been purified, but not yet finalized. Which is finally packaged and distributed for sale, which may be prepared in a "final dosage form (FDF)" or "pharmaceutical composition". The bulk of the recombinant protein can therefore be considered as the product obtained here after the final stage of the purification process, but before the final formulation stage. In other words, the method of the present invention may be considered to comprise a pre-formulation step, to obtain a pre-formulated bulk and to add additional excipients to prepare the final dosage form or pharmaceutical composition. Typically, pre-formulated or non-formulated bulk may be stored before the final formulation is prepared but is not necessary. If stored in the frozen state, the bulk protein usually undergoes thawing, filtration and final formulation steps, but is not necessary.

상기 단백질이 제조합-인간 인터페론-베타 1a(r-hIFN-베타 1a)인 경우 본 발명의 특정 실시예에 따라 안정화 부형제를, 여과 단계전 또는 여과 단계 바로 직후 최종 크로마토그래피 단계, 예를 들어 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC), 이하 "SEC-EL" 또는 "SEC-EL2"의 용출물(eluate)에 첨가한다(실시예 참조). 이러한 경우에, 상기 SEC는 정제 과정에서 최종 단계를 나타낸다. 다른 정제과정에서, 다른 크로마토그래피 기술 또는 분리 방법이 최종 단계에 사용되거나, 최종 정제 단계로서 분리 방법이 아닌 다른 정제 방법이 사용될 수 있다; 이것은 결코 용어 "벌크 단백질"에 의해 규정된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다. 안정화 부형제가 정제 과정후에 첨가되는 한, 정제 방법이 무엇이든지 간에 본 발명에 포함된다. 게다가, 본 발명에 언급된 안정화 부형제는 또한 최종 제제(FDF)에 더 첨가될 수 있다. 그러므로, FDF에 포함된 부형제들은 제형화전 벌크에 첨가된 것들과 대응할 수 있으나 반드시 필요한 것은 아니다. If the protein is presynthetic-human interferon-beta 1a (r-hIFN-beta 1a), the stabilizing excipient, according to certain embodiments of the invention, is subjected to a final chromatography step, e.g., size, before or immediately after the filtration step. Exclusion chromatography (SEC), hereafter added to the eluate of "SEC-EL" or "SEC-EL2" (see Examples). In this case, the SEC represents the final step in the purification process. In other purification procedures, other chromatography techniques or separation methods may be used in the final step, or other purification methods other than the separation method may be used as the final purification step; This in no way limits the scope of the invention as defined by the term "bulk protein". As long as stabilizing excipients are added after the purification process, whatever the purification method is included in the present invention. In addition, the stabilizing excipients mentioned in the present invention may also be further added to the final formulation (FDF). Therefore, excipients included in the FDF may correspond to, but are not necessary to, those added to the bulk prior to formulation.

여기에 사용된 "올리고머릭 단백질" 또는 "올리고머"는 두 개 이상의 폴리펩티드 사슬을 갖는 멀티서브유니트 단백질을 의미한다. "올리고머릭 단백질"은 때때로 그의 유니트중 두 개 이상이 동일한 폴리펩티드 사슬인 단백질을 의미한다. As used herein, "oligomeric protein" or "oligomer" refers to a multisubunit protein having two or more polypeptide chains. An "oligomeric protein" sometimes means a protein in which two or more of its units are the same polypeptide chain.

올리고머의 세 가지 타입들이 적어도 구별될 수 있다:Three types of oligomers can be distinguished at least:

. 빠르게-가역가능한 비-공유성 작은 올리고머(다이머, 트라이 머(trimer), 테트라머, 등). Fast-reversible non-covalent small oligomers (dimers, trimers, tetramers, etc.)

. 비가역적 비-공유성 올리고머. Irreversible non-covalent oligomers

. 공유성 올리고머(예를 들어 디설파이드). Covalent oligomers (eg disulfide)

"멀티머릭 단백질(multimeric protein)"은 몇 가지 서브유니트들로 구성된 단백질의 설명이다. "서브유니트"는 멀티머릭 단백질을 제조하는 동일하거나 동일하지 않은 단백질 분자중 하나이다. "Multimeric protein" is a description of a protein consisting of several subunits. A "subunit" is one of the same or unequal protein molecules that produces a multimeric protein.

"올리고머화(oligomerization)"는 크거나 작은 분자로부터 올리고머를 제조하는 화학적 과정을 의미한다. "올리고머화"는 또한 모노머 또는 모노머의 혼합물을 올리고머로 전환하는 과정을 의미한다. 상기 "올리고머화"는 또한 비공유적 또는 공유적 상호작용을 통한 개별적 단백질 분자들의 멀티머 형성을 의미한다. 올리고머화는 가역 또는 비가역적일 수 있다. "Oligomerization" means a chemical process for preparing oligomers from large or small molecules. "Oligomerization" also refers to the process of converting a monomer or mixture of monomers into an oligomer. The term "oligomerization" also means multimer formation of individual protein molecules through non-covalent or covalent interactions. Oligomerization can be reversible or irreversible.

상기 용어 "중합반응(polymerisation)"은 모노머 또는 모노머의 혼합물을 폴리머로 전화시키는 과정 또는 모노머를 반복적으로 결합시켜 길거나 큰 분자로 만들어서 폴리머를 제조하는 화학적 반응을 설명한다. The term "polymerisation" describes the process of converting a monomer or mixture of monomers into a polymer or a chemical reaction that produces a polymer by repeatedly combining monomers into long or large molecules.

상기 용어 "응집(aggregation)"는 더 작은 종들의 비공유성 접착으로 인해 주로 더 큰-고분자량 종을 형성하는 것을 의미한다. 특히 단백질에 대하여, 응집은이차구조의 비극성 표면(non-polar surface), 예를 들어 정상적으로 분자내 상호작용을 형성하고 단백질 내부에 묻히는α-헬릭스(-helices) 및 β-시트(sheets)의 것들은 분자간 상호작용하여 때때로 불용성인 다분자 형태를 형성하는 변성의 형태(form of denaturation)이다. 상기 용어 "불용성" 대 "용해성"은 가끔 "비가역 적" 대 "가역적"으로 각각 의미된다. 응집체(aggregates)는 또한 커다란 올리고머릭 단백질 연합(예를 들어 10-mer 이상)으로 정의될 수 있다. "응집체"는 만약 비공유적이라면 가역적일 수 있다. The term "aggregation" means to form larger-molecular weight species mainly due to the noncovalent adhesion of smaller species. Particularly for proteins, aggregation is the non-polar surface of secondary structures, for example those of α-helices and β-sheets that normally form intramolecular interactions and are buried inside the protein. A form of denaturation that intermolecular interactions to form insoluble multimolecular forms. The terms "insoluble" vs. "soluble" are sometimes meant to be "irreversible" versus "reversible," respectively. Aggregates can also be defined as large oligomeric protein associations (eg 10-mer or more). "Agglomerates" can be reversible if they are not shared.

본 발명은 상기 정의가 무엇이든지 "응집(aggregation)", "응집체(aggregate)", "올리고머(oligomer)", "멀티머(multimer)", "올리고머화(oligomerization)", "멀티머화(multimerisation)", "멀티머릭(multimeric)", "올리고머릭(oligomer)", "중합반응(polymerization)"에 의해 한정되지 않는다. 그러므로 본원발명의 범위는 이들 용어나 이를 둘러싼 어떠한 원리에 의해서도 제한되지 않는다. 가장 중요한 문제는 "응집체" 및 "올리고머"가 검출방법(예를 들어, SE-HPLC)에 의해 다른 것과 구별될 수 있으며, 통상 분리된 구별가능한 표시, 예를 들어 분리된 피크에 의해 구별될 수 있다; 응집체 또는 올리고머에 대응하는 피크 각각. 마찬가지로, 단백질의 모노머릭 형태는 정확하고 독특한 결정 피크에 대응한다. In the present invention, the term "aggregation", "aggregate", "oligomer", "multimer", "oligomerization", "multimerization" ) "," Multimeric "," oligomer "," polymerization "is not limited. Therefore, the scope of the present invention is not limited by these terms or any principles surrounding them. The most important problem is that "aggregates" and "oligomers" can be distinguished from others by detection methods (e.g. SE-HPLC) and can usually be distinguished by separate distinguishable indications, e.g. separated peaks. have; Each peak corresponding to an aggregate or oligomer. Likewise, the monomeric form of the protein corresponds to an accurate and unique crystal peak.

상기 용어 "완충액" 또는 "생리학적으로 허용가능한 완충액"은 제제내에서 생리학적 또는 수의학적 용도로 안정한 것으로 알려지고 제제에 필요한 pH 범위내에서 제제의 pH를 유지하거나 조절하는 효과를 갖는 화합물의 용액을 의미한다. 중등도 산성 pH(moderately acidic pH)를 중등도 염기 pH로 제어하기 위하여 허용가능한 완충액은 이에 한정되지는 않지만, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트(citrate), 아르기닌, TRIS, 및 히스티딘과 같은 화합물을 포함한다. "TRIS"는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올을 의미하며 그의 약리학적으로 허용가능 한 염을 의미한다. 바람직한 완충액은 식염수(saline) 또는 허용가능한 염의 아세테이트 완충액이다.The term "buffer" or "physiologically acceptable buffer" is a solution of a compound which is known to be stable for physiological or veterinary use in the formulation and has the effect of maintaining or adjusting the pH of the formulation within the pH range required for the formulation. Means. Acceptable buffers for controlling moderately acidic pH to moderate base pH include, but are not limited to, compounds such as phosphate, acetate, citrate, arginine, TRIS, and histidine. "TRIS" means 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol and its pharmacologically acceptable salts. Preferred buffers are acetate buffers of saline or acceptable salts.

"등장제(isotonicity agent)"는 생리학적으로 견디는 화합물로 제제에 적당한 긴장성(tonicity)을 주어 제제와 접촉하는 세포막을 가르는 물의 순흐름을 방지한다. 글리세린과 같은 화합물들은 알려진 농도에서 그러한 목적에 공통적으로 사용된다. 다른 적당한 등장제는 이에 한정되지 않지만 아미노산 또는 단백질(예를 들어 글리신 또는 알부민), 염(예를 들어 소듐 클로라이드), 및 당(예를 들어, 덱스트로스, 만니톨(mannitol), 수크로오스 및 락토오스)를 포함한다. 바람직하게는 등장제는 만니톨이다. An "isotonicity agent" is a physiologically tolerable compound that gives the formulation a suitable tonicity to prevent the net flow of water across the cell membrane in contact with the formulation. Compounds such as glycerin are commonly used for such purposes at known concentrations. Other suitable isotonic agents include, but are not limited to, amino acids or proteins (eg glycine or albumin), salts (eg sodium chloride), and sugars (eg dextrose, mannitol, sucrose and lactose). Include. Preferably the isotonic agent is mannitol.

상기 용어 "항산화제"는 다른 물질과 상호작용으로부터 산소 또는 산소-유래 유리 라디칼을 방지하는 화합물을 의미한다. 항산화제는 물리적 및 화학적 안정성을 증가시키기 위하여 약제학적 시스템에 공통적으로 첨가되는 수 많은 부형제들 중의 하나이다. 항산화제는 산소에 노출 또는 유리 라디칼의 존재시 몇 가지 약물 또는 부형제와 함께 발생하는 산화적 과정을 최소화하거나 지연시키기 위해 첨가된다. 이들 과정은 빛, 온도, 수소 집중, 금속 흔적의 존재 또는 과산화물의 존재로 인해 촉매될 수 있다. 설파이트(sulfite), 비스설파이트(bisufite), 티오우레아, 메티오닌, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA)의 염, 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene: BHT), 및 부틸화된 히드록시 아니솔(Butylated hydroxy anisole:BHA)는 종종 약물에서 항산화제로 사용된다. 소듐 EDTA는, 킬레이트화하지 않으면 산화반응을 촉매화할 금속 이온을 킬레 이트하여 항산화제의 활성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 가장 바람직한 항산화제는 메티오닌이다. 항산화제는 여기서 또한 안정화제로 의미된다. The term "antioxidant" means a compound that prevents oxygen or oxygen-derived free radicals from interacting with other materials. Antioxidants are one of many excipients commonly added to pharmaceutical systems to increase physical and chemical stability. Antioxidants are added to minimize or delay the oxidative processes that occur with some drugs or excipients upon exposure to oxygen or the presence of free radicals. These processes can be catalyzed due to light, temperature, hydrogen concentration, the presence of metal traces or the presence of peroxides. Sulfite, bissulphite, thiourea, methionine, salts of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), butylated hydroxytoluene (BHT), and butylated hydroxy Anisole (Butylated hydroxy anisole: BHA) is often used as an antioxidant in drugs. Sodium EDTA has been found to increase the activity of antioxidants by chelating metal ions that would otherwise catalyze oxidation if not chelated. Most preferred antioxidant is methionine. Antioxidants are also meant here as stabilizers.

메티오닌은 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염의 형태로 존재할 수 있다. 메티오닌의 스테레오아이소머(즉, L, D, 또는 DL 아이소머)는, 메티오닌이 유리 염기형태 또는 그의 염의 형태로 존재하는 한 본 발명의 방법 또는 제제에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 L-스테레오아이소머가 사용된다. 메티오닌 유사물은 본 발명의 제제에 사용될 수 있다. 상기 용어 "메티오닌 유사물"은 자연 발생하는 메티오닌의 유도체를 의미한다. 상기 메티오닌 유사물은 또한 그의 유리 염기형태 또는 그의 염의 형태로 본 제제에 사용될 수 있다.Methionine may be present in its free base form or in the form of a salt thereof. Stereoisomers of methionine (ie, L, D, or DL isomers) can be used in the methods or formulations of the present invention as long as methionine is in free base form or in the form of a salt thereof. Preferably, the L-stereoisomer is used. Methionine analogs can be used in the formulations of the invention. The term "methionine analogue" refers to a derivative of methionine which occurs naturally. The methionine analogs can also be used in the formulations in their free base form or in the form of their salts.

항산화제(예를 들어 메티오닌)의 첨가로 증가 및/또는 유지된 안정성은 농도 연관적 방법으로 발생한다. 즉, 인터페론-베타를 함유하는 제제가 항산화제가 존재하지 않을 때에는 정상적으로 산화 또는 응집체/올리고머 형성을 나타낼 때, 항산화제의 농도 증가로 본 발명의 인터페론-베타를 함유하는 제제의 안정성이 증가 및/또는 유지되게 된다. 산화 또는 올리고머/응집체 형성을 줄이기 위한, 본 발명의 제제에서 사용되는 항산화제(예를 들어 메티오닌)의 함량은 당업자에게 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 과도한 실험없이 용이하게 결정될 수 있다. Increased and / or maintained stability with the addition of antioxidants (eg methionine) occurs in a concentration-related manner. That is, when an agent containing interferon-beta normally exhibits oxidation or aggregate / oligomer formation when no antioxidant is present, increasing the concentration of the antioxidant increases the stability of the agent containing the interferon-beta of the present invention and / or Will be maintained. The content of antioxidants (eg methionine) used in the formulations of the present invention to reduce oxidation or oligomer / aggregate formation can be readily determined without undue experimentation using methods generally known to those skilled in the art.

상기 용어 "정균제"는 항균제로서 작용하도록 제제에 첨가되는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 본 발명의 보존된 인터페론-함유 제제는 보존적 효과가 상업적으로 판매가능한 멀티도즈 제품이 되도록 하는 법적 또는 관리규약(statutory or regulatory guideline)을 만족시키는 것이 바람직하다. 정균제로는 예를 들어 페 놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질알콜, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤즈알코늄(benzalkonium) 클로라이드, 벤즈에토늄(benzethonium) 클로라이드, 소듐 데하이드로아세테이트(sodium dehydroacetate) 및 티메로살(thimerosal)을 포함한다. 바람직하게는 상기 정균제는 벤질알콜이다. 벤질알콜은 또한 여기서 안정화제를 의미한다.The term "bacteriostatic agent" means a compound or composition added to a formulation to act as an antimicrobial agent. Preserved interferon-containing formulations of the present invention preferably satisfy a statutory or regulatory guideline such that the conservative effect is a commercially available multi-dose product. As bactericides, for example, phenol, m -cresol, p -cresol, o -cresol, chlorocresol, benzyl alcohol, alkyl parabens (methyl, ethyl, propyl, butyl, etc.), benzalkonium chloride, benz Benzethonium chloride, sodium dehydroacetate and thimerosal. Preferably the bacteriostatic agent is benzyl alcohol. Benzyl alcohol also means stabilizer here.

상기 용어 "표면활성제"는 액체의 표면 장력을 감소시키거나 두 개의 액체들 사이, 또는 액체와 고체들 사이의 계면 장력을 감소시키는 용해성 화합물을 의미하며, 상기 표면 장력은 액체의 표면에 작용하는 힘이며 표면적을 최소화하려는 경향이 있다. 표면활성제는, 약물의 흡수도 또는 목적 조직으로의 약물의 전달을 변경하기 위하여, 저분자량 집단 약물 및 폴리펩티드의 전달을 포함하며, 약제학적 제제에 때때로 사용되어 왔다. 바람직하게 상기 표면활성제는 트윈 20(Tween 20) 또는 폴록사머(poloxamer)이다. 더욱 바람직하게는, 상기 표면활성제는 폴록사머 188이다. 더욱더 바람직하게는 상기 표면활성제는 트윈^TM 20이다. The term "surfactant" means a soluble compound that reduces the surface tension of a liquid or reduces the interfacial tension between two liquids, or between a liquid and a solid, wherein the surface tension is a force acting on the surface of the liquid. And tend to minimize surface area. Surfactants include the delivery of low molecular weight population drugs and polypeptides to alter the absorbency of the drug or delivery of the drug to the tissue of interest, and have sometimes been used in pharmaceutical formulations. Preferably the surfactant is Tween 20 or poloxamer. More preferably, the surfactant is poloxamer 188. Even more preferably the surfactant is Tween ^TM 20.

상기 용어 "아미노산"은, 아미노산 또는 아미노산들의 조합을 의미하며, 여기서 주어진 아미노산은 그의 유리 염기형태 또는 그의 염 형태로 존재한다. 아미노산 조합들이 사용될 때, 모든 아미노산들은 유리 염기 형태로 존재할 수 있으며, 모든 아미노산들은 그의 염의 형태로 존재할 수 있으며, 어떤 것은 유리 염기 형태로 존재하는 동안 다른 것들은 그의 염형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 방법 또는 제제에 사용되기에 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐 산등과 같은 "하전된 곁사슬 아미노산(charged side chain amino acid)" 을 수반한다. 바람직하게는 상기 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다. 더욱 바람직하게는 상기 아미노산은 리신이다. 특정 아미노산의 스테레오아이소머(즉, L, D 또는 DL 아이소머), 또는 이들 스테레오아이소머들의 조합들은, 특정 아미노산이 그의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로 존재하는 한 본 발명의 방법 또는 제제에 사용될 수 있다. 바람직하게는, L-스테레오아이소머가 사용된다. 이들 바람직한 아미노산의 유사물들은 또한 본 발명 방법 또는 제제에 사용될 수 있다. 상기 용어 "아미노산 유사물"은 자연 발생적 아미노산의 유도체를 의미한다. 적당한 아르기닌 유사물은 예를 들어 아미노구아니딘 및 N-모노에틸 L-아르기닌을 포함한다. 바람직한 아미노산에서와 같이, 아미노산 유사물은 그들의 유리 염기 형태 또는 그의 염 형태로서 본 제제에 사용된다. 아미노산은 여기서 또한 안정화제로서 간주된다. The term "amino acid" means an amino acid or a combination of amino acids, wherein a given amino acid is present in its free base form or in its salt form. When amino acid combinations are used, all amino acids may exist in free base form, all amino acids may exist in form of their salts, while others may exist in free base form while others may exist in their salt form. Preferred amino acids for use in the methods or formulations of the present invention involve "charged side chain amino acids" such as arginine, lysine, aspartic acid, glutamic acid and the like. Preferably the amino acid is lysine or arginine. More preferably the amino acid is lysine. Stereoisomers of a particular amino acid (ie, L, D or DL isomer), or combinations of these stereoisomers, may be used in the methods or formulations of the invention as long as the particular amino acid is in its free base form or in its salt form. Can be. Preferably, L-stereoisomer is used. Analogs of these preferred amino acids can also be used in the methods or formulations of the invention. The term "amino acid analogue" refers to a derivative of a naturally occurring amino acid. Suitable arginine analogs include, for example, aminoguanidine and N-monoethyl L-arginine. As with preferred amino acids, amino acid analogs are used in the present formulations in their free base form or in their salt form. Amino acids are also considered as stabilizers here.

본 방법 또는 본 발명의 제제에서 사용된 아미노산은 여러가지 스트레스에 대하여 치료학적으로 활성인 폴리펩티드를 보호하여, 모노머릭 단백질의 수명동안(저장전, 동안 및 후) 모노머릭 단백질을 포함하는 제제 또는 모노머릭 단백질을 증가 또는/및 유지시킨다. 여기서 상기 용어 "스트레스"는 이에 한정되지 않지만, 열, 냉동, pH, 빛, 진동, 산화, 탈수, 외관(surface), 전단(shear), 냉각/해동, 압력, 중금속, 페놀성 화합물, 분해제등을 포함한다. 상기 용어 스트레스는, (모노머릭)단백질 또는 (모노머릭) 단백질을 포함하는 제제의 안정성을 조절(즉, 감소, 유지 또는 증가)하는 인자라면 다 포함한다. 아미노산 첨가로 인한 증가 및/또는 유지된 안정성은 농도 연관 방식으로 일어난다. 즉, 모노머릭 단백질 또는 모노머 릭 단백질을 포함하는 제제가 정상적으로는 아미노산 부재시 응집체 또는 올리고머 형성을 나타낼 때, 아미노산의 농도를 증가시키면 본 발명의 모노머릭 단백질을 포함하는 제제 또는 모노머릭 단백질의 안정성을 증가 및/또는 유지시키게 된다. 올리고머 또는 응집체의 형성을 감소시켜 모노머릭 단백질의 안정성을 증가시키고, 상기 모노머릭 단백질의 전체 수명동안 제제의 안정성을 증가시키고자 하는 본 방법 또는 본 발명의 제제에 사용된 특정 아미노산의 함량은 당업자에게 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 과도한 실험없이 용이하게 결정될 수 있다. The amino acids used in the methods or formulations of the present invention protect therapeutically active polypeptides against various stresses such that they comprise monomeric proteins or monomeric proteins during the lifetime of the monomeric protein (before, during and after storage). Increase or / or maintain protein. The term “stress” herein is not limited to heat, freezing, pH, light, vibration, oxidation, dehydration, surface, shear, cooling / thawing, pressure, heavy metals, phenolic compounds, disintegrants And the like. The term stress includes any factor that modulates (ie, reduces, maintains or increases) the stability of an agent comprising a (monomeric) protein or a (monomeric) protein. Increased and / or maintained stability due to amino acid addition occurs in a concentration-related manner. That is, when a monomeric protein or a preparation comprising a monomeric protein normally exhibits aggregate or oligomer formation in the absence of amino acids, increasing the concentration of amino acids increases the stability of the preparation or monomeric protein comprising the monomeric protein of the present invention. And / or maintain. The content of specific amino acids used in the present method or formulations of the present invention to reduce the formation of oligomers or aggregates to increase the stability of the monomeric protein and to increase the stability of the formulation over the entire lifetime of the monomeric protein is known to those skilled in the art. Generally known methods can be readily determined without undue experimentation.

"냉동 저장(frozen storage)"은 0℃ 이하, 바람직하게는 -20℃ 이하, 더욱 바람직하게는 -70℃에서 사전에 수용성 모노머릭 단백질 약제를 냉동 및 유지하는 것을 의미한다. "Frozen storage" means freezing and maintaining the water-soluble monomeric protein medicament in advance at 0 ° C or below, preferably below -20 ° C and more preferably at -70 ° C.

"냉동/해동 사이클(Freeze/Thaw cycle)" 또는 "냉동/해동 조작(freeze/thaw manipulaition)"은 냉동저장으로 단백질 샘플을 사용하기 위한 공지 기술을 의미하며, 여기서 상기 샘플의 온도는, 램피(Rampie) 사용을 할 수 있도록 충분한 시간동안 그의 수용액 상태를 부활시킬 수 있는 정도로 온도를 올리고, 0℃ 이하의 온도로 냉동시킨 후, 다시 냉동 저장, 바람직하게는 -20℃ 이하, 더욱 바람직하게는 -70℃의 냉동 저장으로 되돌리는 것이다. "Freeze / Thaw cycle" or "freeze / thaw manipulaition" means a known technique for using protein samples for freezing storage, where the temperature of the sample is Rampie, Rampie) raise the temperature to the extent that the aqueous solution can be revived for a sufficient time for use, freeze it to a temperature of 0 ° C or lower, and then freeze storage, preferably -20 ° C or lower, more preferably- Return to freezing storage at 70 ℃.

본 발명의 목적은 상기 모노머릭 단백질뿐만 아니라, 본 발명에 따라 벌크 단백질에 또한 첨가되는 다른 시약(agent), 성분(ingredient) 또는 화합물들의 적어도 두 개의 응집 및 올리고머화 과정(본 발명은 이들 과정에 한정되지 않음)과정을 방해하는 것이다. 그러므로 본 발명은, 본 발명에 따라 벌크 용액에 첨가되어 발행시 상기 단백질의 최종 복용형태 또는 약제학적 조성물에 포함될, 모든 화합물들, 시약(예를 들어 정균제, 등장제), 단백질, 표면활성제, 부형제에 안정성(예를 들어 올리고머뿐 아니라 응집체의 형성을 감소 및/저해)을 부여할 수 있다. 즉, 안정화는 상기 (모노머릭) 단백질뿐만 아니라 상기 (모노머릭) 단백질을 포함하는 '전체' 제제에 부여된다. 응집은 생물학적 활성을 위협할 뿐만 아니라 중화항체(neutralizing antibodies: NAbs)의 발달을 통해 주사부위 반응 및 면역원성(imunogenecity)을 일으킨다. The object of the present invention is not only the monomeric protein but also at least two agglomeration and oligomerization processes of other agents, ingredients or compounds which are also added to the bulk protein according to the present invention (the present invention is directed to these processes Not limited). The present invention therefore encompasses all compounds, reagents (e.g. bacteriostatic agents, isotonic agents), proteins, surfactants, excipients, which are added to the bulk solution according to the present invention and will be included in the final dosage form or pharmaceutical composition of the protein upon publication. Stability can be imparted to (eg, reducing and / or inhibiting the formation of aggregates as well as oligomers). In other words, stabilization is imparted to the 'total' formulation comprising the (monomeric) protein as well as the (monomeric) protein. Aggregation not only threatens biological activity but also causes injection site reactions and immunogenicity through the development of neutralizing antibodies (NAbs).

본 발명의 실시예는 벌크 모노머릭 단백질 제제에 특정 부형제를 첨가하는 것이 냉동 저장 또는/및 반복적 냉동/해동 사이클 동안 폴리펩티드 응집체 또는 올리고머의 형성을 방지 및/또는 저해하여 모노머릭 단백질 제제의 안정성 및 용해성을 매우 크게 증가시킬 수 있다는 것을 분명히 보여준다. Embodiments of the present invention provide that the addition of certain excipients to the bulk monomeric protein preparation prevents and / or inhibits the formation of polypeptide aggregates or oligomers during freezing storage and / or repeated freezing / thawing cycles, thereby ensuring stability and solubility of the monomeric protein preparation. It is clearly shown that we can increase this significantly.

상기 용어 "열해리"는 여기서 온도 작용(예를 들어 단백질의 다이머는 특정 온도에서 모노머로 전환됨)에 의해 감소된 멀티머릭(multimeric) 형태 또는 모노머릭 형태로 전환 또는 해리되는 멀티머(mulitimer) 형태인 단백질에 의한 과정을 의미한다. 본 제제의 단백질은 다중 멀티머 형태(다이머릭, 트리머릭 등)로 존재한다. 열 해리는 그러므로 감소된 멀티머 형태 또는 모노머 형태로 모든 멀티머릭 형태를 전화 또는 해리시키는데 효과가 있다. 본 발명은 온도와 멀티머의 해리 사이에 상관관계가 있는 것을 보여준다. 열 해리를 적용할 때, 제제는 덜 멀티머릭 형태를 포함하며 열해리를 적용시키지 않은 것에 비하여 모노머릭 형태를 증가시킨다. 바람직하게는, 열 해리는 모든 멀티머릭 형태를 모노머릭 형태로 전환 한다. 상기 온도는 고정된 온도로 바로 설정되거나 특정 온도가 얻어질 때까지 점차 증가되도록 할 수 있다. 게다가, 본 발명은 열해리의 기간에 상기 (모노머릭) 단백질을 포함하는 제제 또는 (모노머릭) 단백질을 안정화시키는 데 효과가 있는 것을 나타낸다. 본 발명은 열 해리 기간과 상기-머(-mer)의 해리 사이에 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 실시예들은 열해리가 열해리의 제1 시간, 기간이 비효과적이 되는 특정 지점에 도달할 때까지 대부분 효과적인 것을 나타낸다. 열해리는 단백질 특이적이다. 온도와 같은 정확한 파라미터의 설정 및 특정 단백질이 최적의 열적 해리에 도달하는 기간은 종래기술을 사용하여 당업자가 용이하게 수행할 수 있다. The term "thermal dissociation" herein refers to a multimeric form or a multimer form that is converted or dissociated into monomeric form reduced by temperature action (e.g., the dimer of the protein is converted to monomer at a certain temperature). Means a process by protein. Proteins of this formulation exist in multiple multimeric forms (dimeric, trimeric, etc.). Thermal dissociation is therefore effective for inverting or dissociating all multimeric forms in reduced multimeric or monomeric form. The present invention shows that there is a correlation between temperature and dissociation of the multimer. When applying thermal dissociation, the formulations contain less multimeric forms and increase the monomeric form compared to no thermal dissociation. Preferably, thermal dissociation converts all multimeric forms to monomeric forms. The temperature may be set directly to a fixed temperature or allowed to increase gradually until a specific temperature is obtained. In addition, the present invention shows that it is effective in stabilizing an agent or a (monomeric) protein comprising the (monomeric) protein in the period of thermal dissociation. The present invention shows that there is a correlation between the thermal dissociation period and dissociation of the -mer. The examples indicate that thermal dissociation is most effective until the first time, period of thermal dissociation reaches a particular point at which it becomes ineffective. Thermal dissociation is protein specific. The setting of accurate parameters such as temperature and the period during which a particular protein reaches optimal thermal dissociation can be readily performed by one skilled in the art using the prior art.

응집, 산화, 탈아민화, 분열(cleavage), 표면 흡착(surface adsorption), 표면 변성(surface denaturation), 사이클적 이미드(cyclic imide) 형성, 절단등과 같은 분해 생산물을 결정하는 수많은 분석 방법들이 당업자에게 알려져 있다. 안정성-지시 방법은 이에 한정되지 않지만, 고성능 액상 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography: HPLLC), 크기배재 HPLC(SEC)[SDS, 구아니디니움(guanidinium) HCl, 또는 샘플내 또는 이동상내 유기 용매와 같은 분해제를 포함하거나 포함하지 않음], 역상(RP) HPLC, 이온-교환 HPLC, 전기이동(electrophoresis), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography: HIC), 친화크로마토그래피(affinity chromatography), SDS-PAGE, 환원제를 사용한 디설파이드 환원, 네티브 겔 전기이동(native gel electrophoresis), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), 분석적 초원심분 리기, 광산란(light scattering), 혼탁도(turbidity) 분석 및 단백질 농도 분석을 포함한다. 구조-안정성 연구는 원형 광이색성(circular dichroism), 형광(내재적 그리고 소수성 탐침 결합: intrinsic and hydrophobic probe binding), UV, FTIR, 및/또는 차 주사열량측정(differential scanning calorimetry)으로 수행될 수 있다. 그러므로 모노머릭 단백질 응집 또는 올리고머화에 대한 특정 부형제의 효과는 예를 들어 시간에 따른 용액내 용해성 모노머릭 단백질의 변화에 의해 결정될 수 있다. Numerous analytical methods for determining degradation products such as agglomeration, oxidation, deamination, cleavage, surface adsorption, surface denaturation, cyclic imide formation, cleavage, etc. Known to Stability-directed methods include, but are not limited to, High Performance Liquid Chromatography (HPLLC), Size Exclusion HPLC (SEC) [SDS, guanidinium HCl, or organic solvents in samples or in mobile phases. With or without the same disintegrant], reverse phase (RP) HPLC, ion-exchange HPLC, electrophoresis, hydrophobic interaction chromatography (HIC), affinity chromatography, SDS PAGE, disulfide reduction with reducing agent, native gel electrophoresis, capillary electrophoresis, analytical ultracentrifuge, light scattering, turbidity analysis and protein concentration analysis It includes. Structural-stability studies can be performed with circular dichroism, fluorescence (intrinsic and hydrophobic probe binding), UV, FTIR, and / or differential scanning calorimetry. . Therefore, the effect of certain excipients on monomeric protein aggregation or oligomerization can be determined, for example, by the change of soluble monomeric protein in solution over time.

겔 여과 크로마토그래피 또는 분자체 크로마토그래피(molecular sieving chromatography)로 또한 알려진 크기 배재 HPLC 또는 SEC에서, 컬럼들은 큰 분자들이 배재되는 동안 다공 크기보다 더 작은 분자들을 보유하는 다공성 매트릭스를 갖도록 고안되어 조기 용출한다. 동용매 구배(isocratic gradient)가 대부분의 응용에서 사용된다. In size exclusion HPLC or SEC, also known as gel filtration chromatography or molecular sieving chromatography, the columns are designed to have a porous matrix that retains molecules smaller than the pore size while large molecules are excreted and elutes early. . Isocratic gradients are used in most applications.

지금부터 본 발명은 차이점 면에서 기술될 것이다.The present invention will now be described in terms of differences.

제1 양태에서, 본 발명은 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:In a first aspect, the invention provides a method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein, the method comprising the following steps:

a) 완충용액내에 벌크 모노머릭 단백질을 넣고, 그리고a) placing the bulk monomeric protein in a buffer solution, and

b) 상기 벌크 용액에 부형제를 첨가하는 단계, 여기서 상기 부형제는 다음 군으로부터 선택된다:b) adding an excipient to the bulk solution, wherein the excipient is selected from the following group:

i) 정균제(bacteriostatic agent),i) bacteriostatic agents,

ii) 표면활성제ii) surfactants

iii) 등장제(isotonicity agent)iii) isotonicity agent

iv) 아미노산iv) amino acids

v) 항산화제v) antioxidants

vi) 등장제와 항산화제vi) isotonic and antioxidant

vii) 등장제, 항산화제 및 아미노산vii) isotonic agents, antioxidants and amino acids

viii) 아미노산 및 항산화제viii) amino acids and antioxidants

ix) 아미노산, 항산화제 및 표면활성제ix) amino acids, antioxidants and surfactants

x) 정균제 및 항산화제, 및x) bacteriostatic and antioxidant agents, and

xi) 정균제, 항산화제 및 표면활성제.xi) bacteriostatics, antioxidants and surfactants.

상기 부형제 또는 그의 조합들은, 벌크 모노머릭 단백질뿐만 아니라, 최종 제제에 더 첨가될 수 있다. 즉, 상기 부형제는 벌크 모노머릭 단백질의 어려 단계에서 첨가될 수 있으며 또한 제조공정에서 최종 제형화 단계에서 첨가될 수 있으나 적어도 한번은 벌크 모노머릭 단백질에 첨가된다. 바람직하게는, 상기 모노머릭 단백질은 인터페론이다. 더욱 바람직하게는, 상기 인터페론은 IFN-베타이다. 더욱 바람직하게는 상기 IFN-베타는 인간 재조합 IFN-베타이다. Such excipients or combinations thereof may be added to the final formulation as well as to the bulk monomeric protein. In other words, the excipient may be added at a young stage of the bulk monomeric protein and may also be added at the final formulation stage in the manufacturing process but at least once is added to the bulk monomeric protein. Preferably, the monomeric protein is interferon. More preferably, the interferon is IFN-beta. More preferably the IFN-beta is human recombinant IFN-beta.

바람직하게는, 상기 단백질은 응집 또는 올리고머화에 대하여 안정화된다. Preferably, the protein is stabilized against aggregation or oligomerization.

바람직하게는 상기 정균제는 벤질알콜이며, 상기 표면활성제는 트윈 20, 상기 등장제는 만니톨, 상기 아미노산은 리신 또는 아르기닌으로부터 선택되며 상기 항산화제는 메티오닌이다. 상기 부형제들의 바람직한 조합은 다음과 같다:Preferably the bacteriostatic agent is benzyl alcohol, the surfactant is tween 20, the isotonic agent is selected from mannitol, the amino acid is lysine or arginine and the antioxidant is methionine. Preferred combinations of the above excipients are as follows:

1. 등장제가 만니톨이고 항산화제가 메티오닌.1. Isotonic agent is mannitol and antioxidant is methionine.

2. 등장제가 만니톨이고, 항산화제가 메티오닌이며 아미노산이 리신2. Isotonic agent is mannitol, antioxidant is methionine and amino acid is lysine

3. 아미노산이 리신이고 항산화제가 메티오닌3. The amino acid is lysine and the antioxidant is methionine

4. 아미노산이 리신이고, 항산화제가 메티오닌이고 표면활성제가 트윈 20,4. The amino acid is lysine, the antioxidant is methionine and the surfactant is tween 20,

5. 정균제가 벤질알콜이고 항산화제가 메티오닌, 또는5. The bacteriostatic agent is benzyl alcohol and the antioxidant is methionine, or

6. 정균제가 벤질알콜이고, 항산화제가 메티오닌 및 표면활성제가 트윈 20.6. The bacteriostatic agent is benzyl alcohol, the antioxidant is methionine and the surfactant is Tween 20.

게다가, 상기 벌크 단백질은 벌크 모노머릭 단백질의 열해리를 좋게하기 위하여 특정 온도에서 배양될 수 있다. 바람직하게는 상기 온도 범위는 27~31℃이다. 가장 바람직하게는 상기 온도는 29℃로 설정된다. 선택적으로 상기 온도는 점차 증가시켜 상기 언급된 특정 온도까지 이르도록 한다. 바람직하게는, 상기 배양은 적어도 3시간 이상 또는 6~40시간 동안 수행된다. 더욱 바람직하게는 배양은 15~30시간 또는 10시간, 16시간, 18.5시간 또는 24시간 동안 수행된다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 24시간 동안 수행된다. 상기 배양은, 이에 한정되지 않지만, 본 발명의 제1 양태에 따라 사전제형화 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다. 본 발명의 제1 양태에 따라 안정화된 모노머릭 단백질은 제조공정의 어떠한 단계에서라도, 예를 들어 최종 제형화단계에서 배양될 수 있다. In addition, the bulk protein may be incubated at a specific temperature to improve thermal dissociation of the bulk monomeric protein. Preferably the said temperature range is 27-31 degreeC. Most preferably the temperature is set at 29 ° C. Optionally the temperature is gradually increased to reach the above-mentioned specific temperature. Preferably, the incubation is carried out for at least 3 hours or 6-40 hours. More preferably the culturing is carried out for 15-30 hours or 10 hours, 16 hours, 18.5 hours or 24 hours. More preferably, the incubation is carried out for 24 hours. The culturing may be performed before or after the preformulation step according to, but not limited to, the first aspect of the present invention. Monomeric proteins stabilized according to the first aspect of the invention can be cultured at any stage of the manufacturing process, for example at the final formulation stage.

제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1양태에 따른 방법에 의해 얻어진 사전제형화된 벌크 단백질을 제공한다. In a second aspect, the present invention provides a preformulated bulk protein obtained by the method according to the first aspect of the present invention.

제3 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따라 벌크 단백질의 사전제 형화 방법을 포함하는 모노머릭 단백질의 안정성을 증가 및/또는 유지시키는 방법을 제공한다. In a third aspect, the present invention provides a method for increasing and / or maintaining the stability of a monomeric protein, including a method for preforming a bulk protein, according to the first aspect of the invention.

본 발명은 지금부터 특정 모노머릭 단백질, 인터페론, 및 더욱 바람직하게는 IFN-베타의 관점에서 바람직한 실시예에 따라 기술될 것이다. The present invention will now be described according to preferred embodiments in view of certain monomeric proteins, interferons, and more preferably IFN-beta.

여기 사용된 "인터페론" 또는 "IFN"은, 상기 단락 "배경기술"에 기술된 IFN의 어떠한 형태도 포함하는, 문헌내에 그러한 것으로 정의된 어떠한 분자도 포함하고자 한다. 특히, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ는 상기 정의에 포함된다. IFN-β 는 본 발명에 따른 바람직한 IFN이다. 본 발명에 적당한 IFN-β는 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어 레비프^®(Serono), 아보넥스^®(Avonex: Biogen) 또는 베테페론^®(Betaferon: Schering)를 이용할 수 있다. 인간 기원 인터페론의 사용 또한 본 발명에 따라 바람직하다. 여기 사용된 인터페론 용어는 염, 기능적 유도체, 변이체, 유사물 및 그의 활성 분획을 포함한다.As used herein, "interferon" or "IFN" is intended to include any molecule defined as such in the literature, including any form of IFN described in paragraph "Background" above. In particular, IFN-α, IFN-β and IFN-γ are included in the above definitions. IFN-β is a preferred IFN according to the present invention. IFN-β suitable in the present invention are commercially available as, and for example, Levy program ^® (Serono), AVONEX ^® can be used:: (Schering Betaferon) (Avonex Biogen) or bete Peron ^®. The use of human origin interferon is also preferred according to the invention. As used herein, the term interferon includes salts, functional derivatives, variants, analogs and active fractions thereof.

여기 사용된 상기 용어 "인터페론-베타(IFN-베타 또는 IFN-β)"는 생물학적 유동액으로부터 분리하여 얻어지거나 진핵 또는 원핵 숙주 세포로부터 DNA 재조합 기술로 얻어진, 특히 인간 기원의 섬유모세포 인터페론뿐만 아니라, 그의 염, 기능성 유도체, 변이체(variants), 유사물 및 활성 분획물을 포함하는 것을 의미한다. 바람직한 IFN-베타는 인터페론 베타-1a를 의미하고자 한다.As used herein, the term “interferon-beta (IFN-beta or IFN-β)” is obtained in isolation from biological fluids or by DNA recombination techniques from eukaryotic or prokaryotic host cells, in particular fibroblast interferon of human origin, It is meant to include salts, functional derivatives, variants, analogs and active fractions thereof. Preferred IFN-beta is intended to mean interferon beta-1a.

여기 사용된 용어 "뮤테인"은 자연 IFN의 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 IFN의 자연 시퀀스에 추가된 것으로, 야생형 IFN에 비하여 얻어진 산물의 활성이 크게 변하지 않은 IFN의 유사물을 의미한다. 이들 뮤테인은 공지의 합성법 및/또는 부위연관 돌연변이(site-directed mutagenesis) 기술, 또는 다른 공지의 적당한 기술에 의해 제조된다. 바람직한 뮤테인은 예를 들어 쉐파드등(1981) 또는 마크등(1984)에 의해 기술된 것들을 포함한다. As used herein, the term "mutein" refers to the substitution of one or more amino acid residues of a natural IFN with another amino acid residue or deletion, or the addition of one or more amino acid residues to the natural sequence of an IFN, resulting in greater activity of the resulting product compared to wild type IFN Means analogs of unchanged IFNs. These muteins are prepared by known synthesis and / or site-directed mutagenesis techniques, or by other known suitable techniques. Preferred muteins include, for example, those described by Shepard et al. (1981) or Mark et al. (1984).

그러한 뮤테인은 IFN에 대하여 실질적으로 유사하거나 더 나은 활성을 갖도록 IFN의 시퀀스를 충분히 복사가능한 아미노산 시퀀스를 갖는다. 인터페론의 생물학적 기능은 당업자에게 잘 알려져 있으며 생물학적 기준은 국립생물의약품표준화연구소(National Institute for Biological Standards and Control: http://immunology.org/links/NIBSC)에서 확립하였고 이로부터 이용가능하다. Such muteins have an amino acid sequence capable of sufficiently replicating a sequence of IFNs to have substantially similar or better activity against IFNs. The biological function of interferon is well known to those skilled in the art and biological standards have been established and available from the National Institute for Biological Standards and Control (http://immunology.org/links/NIBSC).

INF 활성을 결정하기 위한 생물학적 분석법이 기술되어 왔다. IFN 분석법(assay)은 예를 들어 루비스텐(Rubinstein et al.:1981)에 의해 기술되었다. 그러므로 이것은 일반적인 실험방법에 의해 주어진 뮤테인이 실질적으로 IFN의 활성과 유사 또는 더 나은 활성을 갖는지 여부를 결정할 수 있다. Biological assays for determining INF activity have been described. IFN assays have been described, for example, by Rubinstein et al. (1981). Therefore, this can determine whether a given mutein has a similar or better activity substantially to that of IFN by the general experimental method.

본 발명에 따라 사용될 수 있는, IFN의 뮤테인, 또는 그를 암호화하는 핵산은 과도한 실험없이 여기 제시된 기술과 정보를 기초로, 당업자가 일상적으로 얻을 수 있는 치환 펩티드(substitution peptide) 또는 폴리뉴클레오티드로서 유한 세트(finite set)의 실질적으로 대응하는 시퀀스를 포함한다. The muteins of IFNs, or nucleic acids encoding them, which can be used in accordance with the present invention are based on the techniques and information presented herein without undue experimentation, and are a finite set as substitution peptides or polynucleotides that one skilled in the art can routinely obtain. (finite set) includes a substantially corresponding sequence.

본 발명에 따른 뮤테인의 바람직한 변화는 "보존성" 치환(conservative substitution)으로 알려진 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질의 보존성 아 미노산 치환체들은, 집단내 구성원들 사이의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존하는 충분히 유사한 물리화학적 성질을 갖는 집단 내의 동의 아미노산(synonymous amino acid)을 포함한다. 아미노산의 삽입과 결실이 그들의 기능 변경없이, 특히 만약 삽입이나 결실이 단지 몇몇 아미노산, 예를 들어 30 이하, 바람직하게는 10 이하로 이루어지고 기능 형성에 중요한 아미노산(예를 들어 시스테인 잔기)의 제거나 교체가 없다면, 상기-정의된 시퀀스 내에서 이루어질 수 있다는 것이 분명하다. 그러한 결실 및/또는 삽입에 의해 제조된 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범위 내에 속한다.A preferred change of the mutein according to the invention is what is known as a "conservative substitution". Conservative amino acid substituents of a polypeptide or protein of the invention include synonymous amino acids in a population that have sufficiently similar physicochemical properties that substitutions between members of the population preserve the biological function of the molecule. The insertion and deletion of amino acids is without altering their function, in particular if the insertion or deletion consists of only a few amino acids, for example 30 or less, preferably 10 or less, and the removal of amino acids (for example cysteine residues) If there is no replacement, it is clear that it can be made within the above-defined sequence. Proteins and muteins produced by such deletions and / or insertions are within the scope of the present invention.

바람직하게는, 상기 동의 아미노산 집단은 표 1에 정의되어 있다. 더욱 바람직하게는 상기 동의 아미노산 집단은 표 2에 정의되어 있다; 그리고 가장 바람직한 동의 아미노산 집단은 표 3에 정의되어 있다. Preferably, said amino acid populations are defined in Table 1. More preferably the amino acid population is defined in Table 2; And the most preferred synonymous amino acid populations are defined in Table 3.

바람직한 동의 아미노산 군Preferred Motion Amino Acid Group 아미노산amino acid 동의 아미노산       Motion amino acids SerSer Ser, Thr, Gly, Asn       Ser, Thr, Gly, Asn ArgArg Arg, Gln, Lys, Glu, His       Arg, Gln, Lys, Glu, His LeuLeu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu       Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu ProPro Gly, Ala, Thr, Pro       Gly, Ala, Thr, Pro ThrThr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr       Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr AlaAla Gly, Thr, Pro, Ala       Gly, Thr, Pro, Ala ValVal Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val       Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val GlyGly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly        Ala, Thr, Pro, Ser, Gly IleIle Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile       Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile PhePhe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe       Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe TyrTyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr       Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr CysCys Ser, Thr, Cys       Ser, Thr, Cys HisHis Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His       Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His GlnGln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln       Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln AsnAsn Gln, Asp, Ser, Asn       Gln, Asp, Ser, Asn LysLys Glu, Gln, His, Arg, Lys       Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Asp Glu, Asn, Asp       Glu, Asn, Asp GluGlu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu       Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu MetMet Phe, Ile, Val, Leu, Met       Phe, Ile, Val, Leu, Met TrpTrp Trp       Trp

더욱 바람직한 동의 아미노산 군More preferred group of amino acids 아미노산 amino acid 동의 아미노산       Motion amino acids SerSer Ser       Ser ArgArg His, Lys, Arg       His, Lys, Arg LeuLeu Leu, Ile, Phe, Met       Leu, Ile, Phe, Met ProPro Ala, Pro       Ala, Pro ThrThr Thr       Thr AlaAla Pro, Ala       Pro, Ala ValVal Val, Met, Ile       Val, Met, Ile GlyGly Gly       Gly IleIle Ile, Met, Phe, Val, Leu       Ile, Met, Phe, Val, Leu PhePhe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe       Met, Tyr, Ile, Leu, Phe TyrTyr Phe, Tyr       Phe, Tyr CysCys Cys, Ser       Cys, Ser HisHis His, Gln, Arg       His, Gln, Arg GlnGln Glu, Gln, His       Glu, Gln, His AsnAsn Asp, Asn       Asp, Asn LysLys Lys, Arg       Lys, Arg AspAsp Asp, Asn       Asp, Asn GluGlu Glu, Gln       Glu, Gln MetMet Met, Phe, Ile, Val, Leu       Met, Phe, Ile, Val, Leu TrpTrp Trp       Trp

가장 바람직한 동의 아미노산 군Most preferred group of amino acids 아미노산amino acid 동의 아미노산Motion amino acids SerSer SerSer ArgArg ArgArg LeuLeu Leu, Ile, MetLeu, Ile, Met ProPro ProPro ThrThr ThrThr AlaAla AlaAla ValVal ValVal GlyGly GlyGly IleIle Ile, Met, LeuIle, Met, Leu PhePhe PhePhe TyrTyr TyrTyr CysCys Cys, SerCys, Ser HisHis HisHis GlnGln GlnGln AsnAsn AsnAsn LysLys LysLys AspAsp AspAsp GluGlu GluGlu MetMet Met, Ile, LeuMet, Ile, Leu TrpTrp MetMet

본 발명에 사용되는 IFN의 뮤테인을 얻기 위해 사용될 수 있는 단백질 내 아미노산 치환체들의 생성물들의 예로는 마크등의 미국 특허 제4,959,314호, 제4,588,585호 및 제4,737,462호; 코스(Koths et al:)등의 제5,116,943호, 나멘(Namen et al)의 제4,965,195호; 종(Chong et al)의 제4,879,111호; 및 리(Lee et al)의 제5,017,691호; 에 제시된 방법들을 포함하며, 그리고 미국 특허 제4,904,584호(Shaw et al)에 제시된 리신 치환된 단백질을 포함한다. INF-베타의 특정 뮤테인은 예를 들면 마크(1984)등에 의해 기술되었다. Examples of products of amino acid substituents in proteins that can be used to obtain muteins of IFNs for use in the present invention include US Pat. Nos. 4,959,314, 4,588,585 and 4,737,462 to Mark et al .; No. 5,116,943 to Koths et al: et al., 4,965,195 to Namen et al; 4,879,111 to Chong et al; And Lee et al. 5,017,691; And the lysine substituted proteins set forth in US Pat. No. 4,904,584 to Shaw et al. Specific muteins of INF-beta have been described, for example, by Mark (1984) and the like.

상기 용어 "융합 단백질(fused protein)"은, 다른 단백질, 예를 들어 혈액에서 연장된 잔류시간을 갖는 다른 단백질에 융합된, IFN, 또는 그의 뮤테인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. IFN은 그러므로 다른 단백질, 폴리펩티드 류, 예를 들어 면역글로블린 또는 그의 단편에 융합될 수 있다. The term "fused protein" refers to a polypeptide comprising IFN, or a mutein thereof, fused to another protein, eg, another protein having an extended residence time in the blood. IFNs can therefore be fused to other proteins, polypeptide classes such as immunoglobulins or fragments thereof.

여기 사용된 "기능적 유도체"는 IFN의 유도체, 그들의 뮤테인 및 융합된 단백질을 포함하며, 이들은 공지 기술로 N- 또는 C-말단기 또는 잔기 상의 곁사슬로서 발생하는 기능기로부터 제조될 수 있으며, 그들이 약제학적으로 허용가능, 즉 그들이 IFN 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 포함하는 조성물에 독성 성질을 부여하지 않는 한 본 발명에 포함된다. 이들 유도체들은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 곁사슬(side-chain)를 포함하며, 이들은 항원부위(antigenic site)를 가리고 혈액에서 IFN의 잔류를 연장시킨다. 다른 유도체들은 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 이차 아민과 반응하는 카르복실기의 아미드, 아실 모이어티(예를 들어 알카노일 도는 카르보시클릭 아로일기(carbocyclic aroyl group))로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 모이어티로 형성된 유리 히드록실기(예를 들어 세릴 또는 트레오닐 잔기의 것)의 O-아실 유도체를 포함한다. As used herein, “functional derivatives” include derivatives of IFN, their muteins and fused proteins, which can be prepared from functional groups which occur in the known art as N- or C-terminal groups or as side chains on residues, Pharmaceutically acceptable, ie included in the present invention, as long as they do not destroy the activity of proteins substantially similar to IFN activity and impart toxic properties to the composition comprising the same. These derivatives include, for example, polyethylene glycol side-chains, which mask antigenic sites and prolong the retention of IFN in the blood. Other derivatives of the free amino groups of amino acid residues formed with amides, acyl moieties (e.g. alkanoyl or carbocyclic aroyl groups) of carboxyl groups which react with aliphatic esters of carboxyl groups, ammonia or primary or secondary amines O-acyl derivatives of free hydroxyl groups (eg of seryl or threonyl residues) formed with N-acyl derivatives or acyl moieties.

IFN의 "활성 분획(active fraction)", 또는 뮤테인 및 융합된 단백질로서, 본 발명은 단백질 분자 단독 또는 여기에 연결된 관련 분자 또는 잔기, 예를 들어 당(sugar) 또는 포스페이트 잔기, 또는 그들의 단백질 분자 또는 당 잔기의 응집체, 모두의 폴리펩티드 사슬의 단편 또는 전구체(precursor)의 단편을 포함하며, 이는 상기 분획이 대응하는 IFN에 비하여 큰 활성 감소 없다는 조건을 만족해야 한다. As an "active fraction", or mutein and fused protein of IFN, the invention relates to protein molecules alone or related molecules or residues linked thereto, such as sugar or phosphate residues, or protein molecules thereof. Or aggregates of sugar residues, fragments of all polypeptide chains or fragments of precursors, which must satisfy the condition that the fractions do not have a significant decrease in activity relative to the corresponding IFN.

상기 용어 "염"은 카르복실기의 염 및 상술된 단백질의 아미노기의 산부가염 또는 그의 유사물을 의미한다. 카르복실기의 염은 공지기술로 형성될 수 있으며 무기염, 예를 들어, 소듐, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연염 등의 무기염, 및 예를 들어 트리에탄올아민, 알르기닌 또는 리신과 같은 아민, 피페리딘, 프로카인등으로 형성된 것으로서 유기염기의 염을 포함한다. 산부가염은, 예를 들어 염산 또는 황산과 같은 미네랄 산의 염 및 예를 들어 아세트산 또는 옥살산과 같은 유기산염을 포함한다. 물론, 그러한 염은 본 발명과 관련된 단백질(IFN)의 생물학적 활성, 즉 대응하는 수용체에 결합하여 수용체 신호전달을 시작하는 능력을 보유하여야만 한다. The term "salt" refers to salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the above-described proteins or analogs thereof. Salts of the carboxyl groups can be formed by known techniques and include inorganic salts, for example inorganic salts such as sodium, calcium, ammonium, iron or zinc salts, and amines such as triethanolamine, arginine or lysine, p It is formed from ferridine, procaine and the like and includes salts of organic bases. Acid addition salts include, for example, salts of mineral acids such as hydrochloric acid or sulfuric acid and organic acid salts such as, for example, acetic acid or oxalic acid. Of course, such salts must possess the biological activity of the proteins (IFNs) involved in the present invention, ie the ability to bind to the corresponding receptor and initiate receptor signaling.

본 발명에 따라서, 발명의 화합물과 재조합 인간 IFN-베타를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.According to the invention, it is more preferred to use the compounds of the invention and recombinant human IFN-beta.

특정 종류의 인터페론 변이체가 최근 기술되어 왔다. 소위 "공통 인터페론(consensus interferon)"은 IFN의 비자연발생적 변이체이다(미국 특허 제6,013,253호). 본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 본 발명의 화합물들은 공통 인터페론과 함께 사용된다. Certain types of interferon variants have been described recently. The so-called "consensus interferon" is a non-naturally occurring variant of IFN (US Pat. No. 6,013,253). According to a preferred embodiment of the invention, the compounds of the invention are used with a common interferon.

여기에 사용된 것처럼, 인간 인터페론 공통(human interferon consensus:IFN-con)은 비자연발생적 폴리펩티드로서, 자연발생적 인간 백혈구 인터페론 아형 시퀀스(naturally-ocurring human leukocyte interferon subtype sequence)의 대부분을 대표하는 IFN-알파의 아집단(subset)에 공통적인 아미노산 잔기들을 우세적으로 포함하고, 모든 아형에 공통적인 아미노산이 없는 적어도 하나 이상의 위치에서, 우세적으로 나타나는 아미노산을 포함하며, 그렇지 않은 경우에는 적어도 하나의 자연발생적 아형에서 그러한 위치에 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 비자연발생적 폴리펩티드를 의미한다. IFN-con은 이에 한정되지는 않지만, 미국특허 제4,695,623호, 제4,897,471호 및 제5,541,293호에 개시된 IFN-con1, IFN-con2 및 IFN-con3으로 나타낸 아미노산 시퀀스를 포함한다. IFN-con을 암호화하는 DNA 시퀀스는 상술된 특허에 기술된 바에 따라 또는 다른 표준 방법에 따라 제조될 수 있다.As used herein, human interferon consensus (IFN-con) is a non-naturally occurring polypeptide, representing IFN-alpha representing most of the naturally-ocurring human leukocyte interferon subtype sequence. Predominantly comprising amino acid residues common to a subset of, including at least one naturally occurring amino acid at at least one or more positions that do not have amino acids common to all subtypes, and otherwise at least one naturally occurring By non-naturally occurring polypeptides comprising amino acid residues that are not present at such positions in the subtype. IFN-cons include, but are not limited to, the amino acid sequences represented by IFN-con1, IFN-con2 and IFN-con3 as disclosed in US Pat. Nos. 4,695,623, 4,897,471 and 5,541,293. DNA sequences encoding IFN-cons can be prepared as described in the patents mentioned above or by other standard methods.

또 다른 실시예에서, 상기 융합 단백질은 Ig 융합(Ig fusion)을 포함한다. 상기 융합은 직접, 또는 1 내지 3 아미노산 길이 또는 예를 들어 13 아미노산 잔기 길이만큼 짧은 링커 펩티드(short linker peptide)를 통해 이루어질 수 있다. 상기 링커는 시퀀스 E-F-M(Glu-Phe-Met)의 트리펩티드, 예를 들어 IFN 시퀀스와 면역글로블린 시퀀스 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met를 포함하는 13-아미노산 링커 시퀀스일 수 있다. 상기 얻어진 융합 단백질은 혈액내에서 잔류시간의 연장(반감기), 특이적 활성 증가, 발현율 증가, 또는 융합 단백질 정제의 용이성과 같은 개선된 성질을 가질 수 있다.In another embodiment, the fusion protein comprises Ig fusion. The fusion can be done directly or via short linker peptides that are as short as 1 to 3 amino acids in length or for example 13 amino acid residues in length. The linker is a tripeptide of sequence EFM (Glu-Phe-Met), for example Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln introduced between an IFN sequence and an immunoglobulin sequence. It may be a 13-amino acid linker sequence comprising -Phe-Met. The resulting fusion protein may have improved properties such as prolongation of residence time (half life), increased specific activity, increased expression rate, or ease of purification of the fusion protein in the blood.

또 다른 바람직한 실시예에서, IFN은 Ig 분자의 불변부위(constant region)에 융합된다. 바람직하게는, 예를 들어 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역(domain)과 같은 무거운 사슬 부위에 융합된다. Ig 분자의 다른 아이소폼(isoform)은, 아이소폼 IgG_{2 ,} IgG₃ 또는 IgG₄, 또는 예를 들어 IgM 또는 IgA와 같은 다른 Ig류와 같은, 본 발명에 따른 융합 단백질의 생성에 또한 적당하다. 융합 단백질은 모노머릭(monomeric) 또는 멀티머릭(multimeric), 이종(hetero-) 또는 동종멀티머릭(homomultimeric)일 수 있다.In another preferred embodiment, the IFN is fused to the constant region of the Ig molecule. Preferably, they are fused to heavy chain sites such as, for example, the CH2 and CH3 domains of human IgG1. Other isoforms of Ig molecules are also suitable for the production of fusion proteins according to the invention, such as isoforms IgG _{2 ,} IgG ₃ or IgG ₄ , or other Ig classes such as for example IgM or IgA. Fusion proteins can be monomeric or multimeric, hetero- or homomultimeric.

또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 기능적 유도체는 하나 이상의 기능기에 부착된 적어도 하나의 모이어티를 포함하며, 이는 아미노산 잔기에 하나 이상의 곁사슬로서 발생한다. 바람직하게는, 상기 모이어티는 폴리에틸렌(PEG) 모이어티이다. PEG화는 예를 들어 국제공개공보 제WO99/55377호에 개시된 것과 같이 공지된 기술로서 수행할 수 있다. In another preferred embodiment, the functional derivative comprises at least one moiety attached to one or more functional groups, which occurs as one or more side chains at the amino acid residue. Preferably, the moiety is a polyethylene (PEG) moiety. PEGylation can be performed by known techniques, for example as disclosed in WO99 / 55377.

본 발명은 일반적으로 모든 종류의 인터페론, 상기 언급된 것뿐만 아니라 자연 인터페론, 재조합 DNA 기술로 제조된 인터페론, 화학적 합성 또는 변형으로 얻어진 인터페론에 적용될 수 있다. 인터페론에 의해, 섬유모세포, 백혈구, 또는 인간 또는 다른 적당한 종의 인터페론 함유 또는 생성 조직으로부터 조(crude), 반-정제 및 정제된 인터페론을 포함하는 것을 의미한다. 가장 바람직하게는 본 발명은 인간 섬유모세포 인터페론(인터페론-베타)에 적용가능하다.The present invention is generally applicable to all types of interferons, as well as those mentioned above, as well as natural interferons, interferons made by recombinant DNA technology, interferons obtained by chemical synthesis or modification. By interferon is meant to include crude, semi-purified and purified interferon from fibroblasts, leukocytes, or human or other suitable species of interferon containing or producing tissue. Most preferably the present invention is applicable to human fibroblast interferon (interferon-beta).

바람직하게 사전 제형화된 제제에서 IFN-베타의 농도는 약 10~2000㎍/ml, 더욱 바람직하게는 약 100~1000㎍/ml, 가장 바람직하게는 약 500~810㎍/ml이다. Preferably the concentration of IFN-beta in the preformulated formulation is about 10-2000 μg / ml, more preferably about 100-1000 μg / ml, most preferably about 500-810 μg / ml.

바람직하게, 상기 완충액은 특정 pH의 플러스 또는 마이너스 0.5 단위 내로 상기 조성물의 pH를 유지시기키에 충분한 함량으로 존재하며, 여기서 상기 특정 pH는 약 3.5~5.5이다. 더욱 바람직하게, 상기 pH는 3.8, 4.2 또는 4.7이다. 더욱 바람직하게는 pH는 4.7이다. 바람직하게, 상기 완충액은 약 5mM~500mM의 농도로 존재한다. 총 용액에서 완충액의 농도는 약 5mM, 9.5mM, 10mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 및 500mM에서 변화한다. 바람직하게 완충액 농도는 약 10mM 또는 약 50mM이다. 특히 바람직하게는 4.7pH를 갖는 아세테이트 이온 약 50mM의 완충액이다. 바람직하게는 상기 완충액은 소듐 또는 포타슘 이온인 바람직한 짝이온을 갖는 아세테이트 완충액이다. 아세테이트 식염수 완충액은 종래 기술에 잘 알려져 있다. Preferably, the buffer is present in an amount sufficient to maintain the pH of the composition within plus or minus 0.5 units of a specific pH, wherein the specific pH is about 3.5 to 5.5. More preferably, the pH is 3.8, 4.2 or 4.7. More preferably the pH is 4.7. Preferably, the buffer is present at a concentration of about 5 mM to 500 mM. The concentration of the buffer in the total solution varies at about 5 mM, 9.5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, and 500 mM. Preferably the buffer concentration is about 10 mM or about 50 mM. Particularly preferably a buffer of about 50 mM acetate ions having 4.7 pH. Preferably the buffer is an acetate buffer with the preferred counterions which are sodium or potassium ions. Acetate saline buffers are well known in the art.

바람직하게 등장제(예를 들어 만니톨)의 농도는 약 0.5~500mg/ml로 존재한다. 더욱 바람직하게, 상기 등장제의 농도는 55mg/ml이다. 더욱 더 바람직하게, 상기 등장제의 농도는 약 150mM, 또는 약 300mM 또는 약 600mM이다. Preferably the concentration of the tonicity agent (eg mannitol) is present at about 0.5-500 mg / ml. More preferably, the concentration of the tonicity agent is 55 mg / ml. Even more preferably, the concentration of the tonicity agent is about 150 mM, or about 300 mM or about 600 mM.

바람직하게 표면활성제(예를 들어 트윈 20)의 농도는 약 0.01~10mg/ml이다. 더욱 바람직하게는 상기 표면활성제 농도는 약 0.05mg/ml이다. Preferably the concentration of the surfactant (eg Tween 20) is about 0.01-10 mg / ml. More preferably, the surfactant concentration is about 0.05 mg / ml.

바람직하게는 항산화제(예를 들어 메티오닌)의 농도는 0.01mg/ml~5.0mg이다.바람직하게, 상기 항산화제의 농도는 약 0.01~5.0mg/ml로 존재한. Z다. 더욱 바람직하게는 상기 항산화제의 농도는 약 0.12mg/ml 또는 약 0.24mg/ml이다. Preferably the concentration of antioxidant (eg methionine) is 0.01 mg / ml-5.0 mg. Preferably, the concentration of antioxidant is present at about 0.01-5.0 mg / ml. Z. More preferably the concentration of antioxidant is about 0.12 mg / ml or about 0.24 mg / ml.

바람직하게 아미노산은 리신 또는 아르기닌이다. 더욱 바람직하게, 상기 아미노산은 리신이다. 바람직하게 상기 아미노산(예를 들어 리신 또는 아르기닌)의 농도는 약 20~200mg/ml이다. 바람직하게, 리신의 농도는 약 27mg/ml 또는 55mg/ml 또는 약 82mg/ml 또는 164mg/ml이다. 바람직하게, 아르기닌의 농도는 약 32mg/ml 또는 약 63mg/ml이다. Preferably the amino acid is lysine or arginine. More preferably, the amino acid is lysine. Preferably the concentration of said amino acid (eg lysine or arginine) is about 20-200 mg / ml. Preferably, the concentration of lysine is about 27 mg / ml or 55 mg / ml or about 82 mg / ml or 164 mg / ml. Preferably, the concentration of arginine is about 32 mg / ml or about 63 mg / ml.

바람직하게, 정균제(예를 들어 벤질 알콜)의 농도는 약 0.01mg/ml~200mg/ml이다. 더욱 바람직하게는 상기 정균제의 농도는 약 5mg/ml 또는 약 10mg/ml이다. Preferably, the concentration of bacteriostatic agent (eg benzyl alcohol) is between about 0.01 mg / ml and 200 mg / ml. More preferably the concentration of bacteriostatic agent is about 5 mg / ml or about 10 mg / ml.

여기 인용된 모든 참조문헌은 저널 논문 및 초록, 공개 또는 비공개 미국 또는 해외 특허출원, 특허된 미국 또는 해외 특허 또는 다른 참조문헌을 포함하여 모든 참조문헌은, 그 인용문헌안에 제시된 모든 데이타, 표, 그림 문장들을 포함하여 참조로서 본 발명에 통합되어 있다. 추가적으로 여기 인용된 참조문헌 내에 인용된 참조문헌의 전체 내용 역시 전체적으로 참조로서 통합되어 있다. All references cited herein are all references, including journal articles and abstracts, public or private US or foreign patent applications, patented US or foreign patents, or other references, all data, tables, and figures presented in that citation. It is incorporated into the present invention by reference, including sentences. In addition, the entire contents of the references cited in the references cited herein are also incorporated by reference in their entirety.

공지의 방법을 참고로 하여, 종래 방법단계, 알려진 방법 또는 종래 방법은 본발명의 어떠한 양태, 설명 또는 실시예도 개시, 교시 또는 제안된바 없다.With reference to known methods, no prior method steps, known methods or conventional methods have been disclosed, taught or suggested in any aspect, description or embodiment of the present invention.

특정 실시예의 상기 설명은 너무나 완전히 본 발명의 일반적인 성질을 밝힌 것이어서 과도한 실험없이, 본 발명의 일반적인 개념에 벗어나지 않고서도, 당업계의 기술범위내 지식을 사용하여 당업자가 용이하게 변경 및/또는 채택하여 여러 가지로 응용할 수 있다. 그러므로 그러한 변경 및 각색은 여기에 개시된 가르침 및 안내를 기초로 하여, 개시된 실시예의 등가범위 내에 속한다. 여기의 어법(phraseology) 또는 용어법(terminology)은 설명의 목적이며 그러한 용법 및 어법이 당업자에 의해 당업자의 지식과 함께 여기 제시된 가르침과 안내에 따라 해석될 수 있다. The foregoing description of specific embodiments has so far clarified the general nature of the invention that, without undue experimentation, without departing from the general concept of the invention, may be readily altered and / or adopted by those skilled in the art using the knowledge in the art. It can be applied in various ways. Therefore, such changes and adaptations are within the equivalent scope of the disclosed embodiments, based on the teachings and guidance disclosed herein. The phraseology or terminology herein is for the purpose of description and such usage and phraseology may be interpreted by those skilled in the art in accordance with the teachings and guidance presented herein with the knowledge of those skilled in the art.

실시예Example

다음 실시예에 사용된 분석 방법은 실시예 6에 기술되어 있다. The analytical method used in the following examples is described in Example 6.

실시예Example 1- 벌크 인터페론 안정화(열 해리)에 대한 배양 온도 및 배양 시간의 효과 Effect of incubation temperature and incubation time on 1-bulk interferon stabilization (thermal dissociation)

다음 실험들은 벌크 인터페론-베타의 안정화에 대한 해동 온도, 배양온도 및 배양시간(지속시간)의 효과를 평가하기 위해서 수행되었다. 상기 목적은 효과적이고 지속적으로 제조공정 동안 인터페론 올리고머의 형성 및/또는 인터페론 응집체의 형성을 감소시키고자 하는 것이다. 다음 실험은 일차적으로 냉동 저장 벌크 인터페론 약제(0℃ 이하에 저장된 약제, 예를 들어 -20℃ 또는 -70℃)의 적용되며, 이는 추가 제조과정동안 일차적으로 해동되고 나서 결국 배양되거나서 소정의 기간동안 소정의 온도에서 저장되는 것이다. 이들 실험으로부터 나타난 고려할 사항은 또한 0℃ 이상(예를 들어 2-8℃)에서 저장된 약제에도 적용될 수 있으며, 이는 해동단계 또는 온도 이동)가 아니라 다른 종류의 스트레스로 고통받는 것일 수 있다. 여기서 용어 "휴식(resting)"은 소정의 시간동안 소정의 온도에서 해동(예를 들어 인큐베이터, 욕조 또는 다른 장소에서)되고 나서 저장(예를 들어 인큐베이터, 욕조 또는 다른 장소에서)되는 냉동 약제를 의미한다; 상기 용어 "휴식 온도"는 해동온도 및 배양 온도 둘 다를 의미한다; 만약 냉동 약제가 직접적으로 인큐베이터네 놓여진다면, 상기 용어 "배양 온도" 또는 "휴식 온도"는 상호교환적으로 사용될 수 있다; 상기 용어 "휴식 시간"은 특정온도에서의 해동 지속기간 및 저장 지속기간(배양 기간)의 전체를 의미한다; 만약 냉동 약제를 직접 인큐베이터에 넣으면, 상기 용어 "배양시간" 또는 "휴식 시간"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.The following experiments were performed to evaluate the effects of thawing temperature, incubation temperature and incubation time (duration) on the stabilization of bulk interferon-beta. The aim is to effectively and continuously reduce the formation of interferon oligomers and / or the formation of interferon aggregates during the manufacturing process. The following experiments apply primarily to the frozen storage bulk interferon drug (drugs stored below 0 ° C., eg −20 ° C. or −70 ° C.), which are thawed first during further manufacturing and eventually cultured for a period of time. While being stored at a predetermined temperature. Considerations from these experiments may also apply to drugs stored above 0 ° C. (eg 2-8 ° C.), which may be suffering from other types of stress rather than thawing phases or temperature shifts. The term "resting" herein refers to a frozen agent that is thawed (eg in an incubator, bath or other place) for a predetermined time and then stored (eg in an incubator, bath or other place). do; The term "rest temperature" means both thawing temperature and incubation temperature; If the frozen medication is placed directly in the incubator, the terms "culture temperature" or "rest temperature" may be used interchangeably; The term "rest time" means the entirety of the thawing duration and storage duration (culture period) at a particular temperature; If the frozen medication is placed directly in the incubator, the terms "cultivation time" or "rest time" may be used interchangeably.

1.a. 여러 온도에서의 열 해리 작은 실험실 규모 실험1.a. Thermal Dissociation at Different Temperatures Small Laboratory Scale Experiment

제1 실험에서, 총 16시간 또는 24시간 동안 실온, 25℃, 27℃ 또는 29℃의 해동, 25℃, 27℃ 또는 29℃에서 배양의 효과를 시험하였다. 상기 실험은 온도 설정에 상관이 없어서, 전체 절차중에 안정하게 유지되는 방법으로 이루어졌다. 도 1뿐만 아니라 표 4는 상기 절차를 요약한 것이다. 인터페론 올리고머 및 인터페론 응집체의 정도를 새로운 SEC-HPLC 방법으로 측정하고, 여기서는 NEW SEC로 나타낸다. 상기 NEW SEC 방법은 비공유성 및 공유성 올리고머를 정량적으로 그리고 정성적으로 검출할 수 있다. In the first experiment, the effect of incubation at room temperature, 25 ° C., 27 ° C. or 29 ° C., 25 ° C., 27 ° C. or 29 ° C. was tested for a total of 16 or 24 hours. The experiments were done in a manner that was independent of the temperature setting and thus remained stable throughout the entire procedure. Table 4 as well as Figure 1 summarizes the above procedure. The degree of interferon oligomers and interferon aggregates is measured by a new SEC-HPLC method, here denoted by NEW SEC. The NEW SEC method can quantitatively and qualitatively detect non-covalent and covalent oligomers.

상기 목적은 다음 파라미터 또는 변수에 의해 약제품(손상 수리: damage repair) 제조 전에 최소화하여 올리고머화 및/또는 응집을 감소시키기 위하여, 벌크 인터페론의 열 해리(thermal dissociation: TD)를 최적화하는 것이다:The aim is to optimize the thermal dissociation (TD) of the bulk interferon in order to minimize oligomerization and / or aggregation by minimizing before the manufacture of the drug product (damage repair) by the following parameters or variables:

1) 열해리 효율에 대한 배양온도(25℃, 27℃ 및 29℃)의 효과 1) Effect of incubation temperature (25 ℃, 27 ℃ and 29 ℃) on thermal dissociation efficiency

2) 열해리 효율에 대한 배양기간의 효과,2) the effect of incubation period on thermal dissociation efficiency,

3) 인큐베이터내에서 해동에 의한 해동 기간의 단기화3) Shortening of the thawing period by thawing in the incubator

실험예 Experimental Example 설정 1 Setting 1 설정 2Setting 2 대조군Control 해동 온도 ℃ Thawing temperature ℃ 실온Room temperature 실온Room temperature 실온Room temperature 2525 2727 2929 실온Room temperature ^*배양 온도 ℃ ^* The culture temperature ℃ 2525 2727 2929 2525 2727 2929 실온Room temperature

* 총 해동 및 배양 시간은 16시간 또는 24시간이다.Total thawing and incubation time is 16 or 24 hours.

실온에서 대조근은 한번 수행되었고, 실험예 설정 1은 두 번 그리고 실험예 설정 2는 3 번 수행되었다. 각 조건에서 작은 규모의 모델(1.8ml "신선한" 벌크 인터페론으로 충진된 2l nunc tube, 상기 "inserted tube model")을 장착한 250ml 튜브가 사용되었다. 상기 인큐베이터는 물 피복(jacketed)되거나 공기 순환된 것이다. The control muscle was performed once at room temperature, Experimental setting 1 was performed twice and Experimental setting 2 was performed three times. For each condition a 250 ml tube with a small model (2 l nunc tubes filled with 1.8 ml "fresh" bulk interferon, the "inserted tube model") was used. The incubator is either water jacketed or air circulated.

용어풀이/약어Glossary / Abbreviation

Agg 응집체(aggregates)Agg aggregates

COA 분석 증명서(Certificate of analysis)Certificate of analysis

Dim 다이머Dim dimer

Deg 분해제(Degradant)Deg Degradant

FDF 최종 복용 형태FDF final dosage form

F/T 냉동 및 해동F / T freezing and thawing

r-h IFN-베타 1a CHO 세포로부터의 재조합 인간 인터페론-베타 1a(r-h IFN-베타 1a)r-h IFN-beta 1a recombinant human interferon-beta 1a from CHO cells (r-h IFN-beta 1a)

r-h IFN-베타 FDF r-h IFN-베타 1a 최종 복용 형태(r-h IFN-베타 FDF)r-h IFN-beta FDF r-h IFN-beta 1a final dosage form (r-h IFN-beta FDF)

SE-HPLC 크기 배제 고성능 액상 크로마토그래피SE-HPLC Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography

SAB 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8SAB 50mM Sodium Acetate pH 3.8

Temp. 온도Temp. Temperature

1. New SEC-1.New SEC- HPLCHPLC 방법의 장치 및 재료: Apparatus and Materials of the Method:

HPLC 시스템: 워터 얼라이언스(Water Alliance)HPLC System: Water Alliance

UV 검출기: 워터스 996 PDA 파장 214nmUV Detector: Waters 996 PDA Wavelength 214nm

자동 샘플러 온도 세팅: 4℃Auto sampler temperature setting: 4 ℃

컬럼column 토소하아스Tossohas (( TosoHaasTosohaas ) ) TSKTSK G2000G2000 SWSW _XLXL

컬럼온도: 실온Column temperature: room temperature

이동상: 50mM NaCl의 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8Mobile phase: 50 mM NaCl, 50 mM sodium acetate pH 3.8

2리터 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8 완충액에 5.84g NaCl을 해 리시켜 제조. 상기 아세테이트 완충액은 아세트산을 WFI에 첨가 하고 10M NaOH 용액으로 pH 3.8로 적정하여 멸균 용액으로 제 조된다. Prepared by dissociating 5.84 g NaCl in 2 liter 50 mM sodium acetate pH 3.8 buffer. The acetate buffer is prepared as a sterile solution by adding acetic acid to WFI and titrating to pH 3.8 with 10M NaOH solution.

흐름 속도: 0.5mL/minFlow rate: 0.5mL / min

주입 부피: 200㎕ r-h IFN-베타 1a 벌크 0.34-0.36mg/mLInjection volume: 200 μl r-h IFN-beta 1a bulk 0.34-0.36 mg / mL

시약:reagent:

아세트, Merck code K31358056Acet, Merck code K31358056

NaOH, Merck B197582NaOH, Merck B197582

NaOH 10M 용액NaOH 10M Solution

WFIWFI

NaCl, JT BAKER code 3627-07NaCl, JT BAKER code 3627-07

2. 절차- 본 절차는 도 1에 도시되어 있다.2. Procedure-This procedure is shown in FIG.

1) 1.8ml의 신선한 r-h IFN-베타 1a 벌크를 2ml nunc 튜브에 넣고 200ml 물을 포함하는 250ml 튜브 내에 -70℃에서 냉동시켰다.1) 1.8 ml of fresh r-h IFN-beta 1a bulk was placed in a 2 ml nunc tube and frozen at −70 ° C. in a 250 ml tube containing 200 ml water.

2) 각각 총 16시간 동안 3 개의 튜브들을 실온에서 해동시키고 유효한 인큐베이터(시간에 따라 고정된 온도에서 안정함)에서 25℃, 27℃ 및 29℃의 온도로 배양시켰다. 상기 튜브들은 해동후 그리고 16시간 후(해동 + 배양) NEW SEC에 의한 실험을 위해 샘플화한 것이다. 2) Three tubes each were thawed at room temperature for a total of 16 hours and incubated at 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C. in a valid incubator (stable at fixed temperature over time). The tubes were sampled for experiments by NEW SEC after thawing and 16 h (thaw + incubation).

3) 총 24시간 동안 3 개 튜브들을 실온에서 해동시키고 유효한 인큐베이터에서 25℃, 27℃ 및 29℃의 온도로 각각 배양시켰다. 상기 튜브들은 해동후 그리고 24시간 후(해동 + 배양) NEW SEC에 의한 실험을 위해 샘플화한 것이다. 3) Three tubes were thawed at room temperature for a total of 24 hours and incubated in effective incubators at temperatures of 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C., respectively. The tubes were sampled for experiment by NEW SEC after thawing and after 24 hours (thaw + incubation).

4) 총 16시간 동안 3개의 튜브들을 유효한 인큐베이터에서 25℃, 27℃ 및 29℃의 온도에서 해동 및 배양시켰다. 상기 튜브들은 해동후 그리고 16시간 후(해동 + 배양) NEW SEC에 의한 실험을 위해 샘플화한 것이다. 4) Three tubes were thawed and incubated at temperatures of 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C. in a valid incubator for a total of 16 hours. The tubes were sampled for experiments by NEW SEC after thawing and 16 h (thaw + incubation).

5) 총 16시간 동안 3 개의 튜브들을 유효한 인큐베이터에서 25℃, 27℃ 및 29℃의 온도에서 해동 및 배양시켰다. 상기 튜브들은 인큐베이터에서 해동후 아무것도 하지 않은 후 샘플링-16시간 후(해동 + 배양) NEW SEC에 의한 실험을 위해 샘플화한 것이다. 5) Three tubes were thawed and incubated at temperatures of 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C. in a valid incubator for a total of 16 hours. The tubes were sampled for experiment by NEW SEC after sampling-16 hours (thaw + incubation) after doing nothing after thawing in the incubator.

6) 총 24시간 3개의 튜브들을 유효한 인큐베이터에서 25℃, 27℃ 및 29℃의 온도에서 동안 해동 및 배양시켰다. 상기 튜브들은 해동후 그리고 아무것도 하지않은 샘플링-24시간 후(해동 + 배양) NEW SEC에 의한 실험을 위해 샘플화한 것이다. 6) Three tubes were thawed and incubated for 24 hours at a temperature of 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C. in a valid incubator. The tubes were sampled for experiments by NEW SEC after thawing and 24 hours after sampling (thaw + incubation).

7) 1 개의 튜브를 실온에서 16시간 그리고 2-8℃에서 72시간까지 저장하고-상기 튜브를 본 실험의 대조군으로 사용하고자 NEW-SEC에 대해 샘플화하였다. 7) One tube was stored for 16 hours at room temperature and 72 hours at 2-8 ° C.—the tube was sampled for NEW-SEC for use as a control for this experiment.

8) 상기 분자상의 효과를 평가하기 위하여, 상기 실험을 선택 조건에서 반복하였다. 배양된 샘플들을 NEW SEC, IEF, QUANT-HPLC, ES-MS, BIOASSAY, DEG/OX HPLC, CZE로 실험하였다. 결과를 실온에서 16시간 해동시키고 2-8℃에서 저장한 대조군과 비교하였다. 8) In order to evaluate the effect of the molecular phase, the experiment was repeated under optional conditions. Cultured samples were tested by NEW SEC, IEF, QUANT-HPLC, ES-MS, BIOASSAY, DEG / OX HPLC, CZE. Results were thawed for 16 hours at room temperature and compared to controls stored at 2-8 ° C.

3. 결과: % Mon 또는 % Monomer = r-h IFN-베타 1a 모노머의 %3. Results :% Mon or% Monomer =% of rh IFN-beta 1a monomer

% Agg= r-h IFN-베타 1a 응집체의 %% Agg =% of r-h IFN-beta 1a aggregates

. 총 16시간 동안 실온에서 해동 및 배양 . Thaw and incubate at room temperature for a total of 16 hours

인설트(insert)를 갖는 3 x 250ml 튜브를 -70℃의 온도에서 냉동시키고 총 16시간(해동 + 배양) 동안 실온에서 해동시킨 후, 상기 튜브들을 20번 부드럽게 꺼꾸로 하고, 샘플화한 후 바로 3 개의 인큐베이터(25℃, 27℃, 29℃)에 옮겨서 두었다. 샘플들을 2-8℃에서 NEW SEC-HPLC에 의한 분석까지 저장하였다. 결과를 표 5에 나타내었다.The 3 × 250 ml tubes with inserts were frozen at a temperature of −70 ° C. and thawed at room temperature for a total of 16 hours (thaw + incubation), then the tubes were gently inverted 20 times, immediately after sample 3 The two incubators (25 degreeC, 27 degreeC, 29 degreeC) were transferred. Samples were stored at 2-8 ° C. until analysis by NEW SEC-HPLC. The results are shown in Table 5.

** 배양시간-10시간** Incubation time-10 hours 조건 **Condition ** 모노머 %Monomer% 응집체 % Aggregate% 다이머 % Dimer% 해동 유지기간 Thawing retention period 25℃25 ℃ 88.0588.05 0.640.64 11.311.3 6시간 21-22.3℃ 6 hours 21-22.3 ℃ 27℃27 ℃ 92.5892.58 0.700.70 6.76.7 29℃29 ℃ 95.795.7 0.560.56 3.73.7

. 총 24시간 동안 실온에서 해동 및 배양. Thaw and incubate at room temperature for a total of 24 hours

인설트를 갖는 3x250ML 튜브들을 -70℃로 냉동시키고 실온에서 해동시켰으며, 상기 튜브를 부드럽게 20번 꺼꾸로 하고, 샘플화한 후 바로 3개의 인큐베이터(25℃, 27℃, 29℃)에 옮겨서 총 24시간(해동 + 배양) 동안 두었다. 샘플들을 2-8℃에서 NEW SEC-HPLC에 의한 분석까지 저장하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.3x250ML tubes with insults were frozen at -70 ° C and thawed at room temperature, the tubes were gently inverted 20 times, immediately sampled and transferred to three incubators (25 ° C, 27 ° C, 29 ° C) for a total of 24 Leave for time (thaw + incubation). Samples were stored at 2-8 ° C. until analysis by NEW SEC-HPLC. The results are shown in Table 6.

** 배양시간-18.5시간** Incubation time-18.5 hours 조건 **Condition ** 모노머 %Monomer% 응집체 % Aggregate% 다이머 % Dimer% 해동 유지기간 Thawing retention period 25℃25 ℃ 92.2592.25 0.580.58 7.17.1 5 시간 30분 21.6-22.2℃ 5 hours 30 minutes 21.6-22.2 ℃ 27℃27 ℃ 96.496.4 0.50.5 3.13.1 29℃29 ℃ 97.3197.31 0.440.44 2.22.2

총 16시간 동안 인큐베이터에서 해동 및 배양Thaw and incubate in incubator for a total of 16 hours

인설트를 갖는 3x250ml 튜브들을 -70℃로 냉동시키고 3개의 인큐베이터(25℃, 27℃, 29℃) 내에서 별도로 해동시켰으며, 총 16시간(해동 + 배양) 동안 해동후 상기 튜브를 부드럽게 20번 꺼꾸로 하고, 배양하였다. 샘플들을 2-8℃에서 NEW SEC-HPLC에 의한 분석까지 저장하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.3 × 250 ml tubes with insults were frozen at −70 ° C. and thawed separately in three incubators (25 ° C., 27 ° C., 29 ° C.) and gently thawed for 20 hours after thawing for a total of 16 hours (thawing + incubation). Inverted and incubated. Samples were stored at 2-8 ° C. until analysis by NEW SEC-HPLC. The results are shown in Table 7.

** 배양시간-16시간** Incubation time-16 hours 조건 **Condition ** 모노머 %Monomer% 응집체 % Aggregate% 다이머 % Dimer% 해동 유지기간 Thawing retention period 25℃ 공기 순환25 ℃ air circulation 90.2290.22 0.520.52 9.29.2 3시간 9분 3 hours 9 minutes 27℃ 워터 피복(Water Jacketed)27 ℃ Water Jacketed 93.5393.53 0.560.56 5.95.9 5시간5 hours 29℃ 워터피복29 ℃ water coating 95.9595.95 0.470.47 3.63.6 3시간 32분3 hours 32 minutes

총 24시간 동안 인큐베이터에서 해동 및 배양Thaw and incubate in incubator for a total of 24 hours

인설트를 갖는 3x250ml 튜브들을 -70℃로 냉동시키고 총 24시간(해동 + 배양)동안 3개의 인큐베이터(25℃, 27℃, 29℃) 내에서 별도로 해동시켰으며, 상기 튜브를 부드럽게 20번 꺼꾸로 하고, NEW SEC HPLC를 위해 샘플화하고 배양하였다. 샘플들을 2-8℃에서 NEW SEC-HPLC에 의한 분석까지 저장하였다. 상기 실험을 해동후 튜브를 샘플화하지 않고 다른 날에 반복하였다. 결과를 표 8a 및 8b에 나타내었다.3 × 250 ml tubes with insults were frozen at −70 ° C. and thawed separately in three incubators (25 ° C., 27 ° C., 29 ° C.) for a total of 24 hours (thawing + incubation), and the tubes were gently inverted 20 times. Sampled and cultured for NEW SEC HPLC. Samples were stored at 2-8 ° C. until analysis by NEW SEC-HPLC. The experiment was repeated another day without thawing the tube after thawing. The results are shown in Tables 8a and 8b.

** 배양시간-24시간** Incubation time-24 hours 조건 **Condition ** 모노머 %Monomer% 응집체 % Aggregate% 다이머 % Dimer% 해동 유지기간 Thawing retention period 25℃에서 해동후 바로Immediately after thawing at 25 ℃ 77.4877.48 1.631.63 20.8920.89 3시간 21분 3 hours 21 minutes 27℃에서 해동후 바로Immediately after thawing at 27 ℃ 77.277.2 1.731.73 21.0721.07 5시간5 hours 29℃에서 해동후 바로Immediately after thawing at 29 ℃ 78.5678.56 1.641.64 19.819.8 3시간 30분3 hours 30 minutes 실온에서 해동후 바로Immediately after thawing at room temperature 77.4277.42 1.651.65 20.9220.92 6시간6 hours

조건 **Condition ** 모노머 %Monomer% 응집체 % Aggregate% 다이머 % Dimer% 해동 유지기간 Thawing retention period 25℃-A25 ℃ -A 93.4293.42 0.420.42 6.16.1 3시간 8 3 hours 8 25℃-B25 ℃ -B 93.1593.15 0.510.51 6.36.3 27℃-A27 ℃ -A 96.3296.32 0.540.54 3.13.1 5시간 5 hours 27℃-B27 ℃ -B 96.2296.22 0.570.57 3.23.2 29℃-A29 ℃ -A 97.8597.85 0.530.53 1.61.6 3시간 30분 3 hours 30 minutes 29℃-B29 ℃ -B 97.5897.58 0.510.51 1.91.9

4. 결론4. Conclusion

다음 항목들이 상기 실험들로부터 나온 것들이다:The following items are from the above experiments:

. 인큐베이터 온도 및 기간을 증가시키면 열해리 효율이 증가한다.. Increasing the incubator temperature and duration increases the thermal dissociation efficiency.

. 해동기간은 실온에서 해동하는 것과 비교하여 인규베이터 내에서 해동하는 때에 감소하므로 모노머의 준위를 증가시킨다.. The thawing period decreases when thawing in an incubator compared to thawing at room temperature, thus increasing the level of monomer.

. 24시간 동안 25℃, 27℃ 및 29℃에서 해동 및 배양은 r-h IFN-베타 1a 분자상에 부정적 효과를 주지 않는다: Routine SEC HPLC, Deg/Ox HPLC, quant-HPLC, ES-MS, 생물학적 분석 및 CZE.. Thawing and incubation at 25 ° C., 27 ° C. and 29 ° C. for 24 hours did not have a negative effect on the rh IFN-beta 1a molecules: Routine SEC HPLC, Deg / Ox HPLC, quant-HPLC, ES-MS, biological analysis and CZE.

상기 실험들은 사전에 냉동 저장된 벌크 인터페론의 휴식 온도 및 휴식 시간을 조절함으로써 올리고머화를 낮춘다는 중요한 결과가 얻어진다는 것을 나타낸다. The experiments indicate that significant results are obtained that lower oligomerization by controlling the resting temperature and rest time of previously frozen bulk interferon.

어떻게 약제가 탈냉동(defrozen)(예를 들어 실온에서 해동 또는 인큐베이터에서 해동)되는가와 무관하게, 특정지점까지 휴식 온도를 증가시키면 인터페론 모노머 준위에 이로운 결과를 얻게된다. 그러므로, 휴식 온도와 단백질 모노머 준위 사이에 연관관계가 있다; 25℃에서 29℃까지 휴식 온도를 올리면 단백질 모노머 준위를 증가시킨다. 최상의 결과들은 벌크 용액을 29℃의 온도로 설정할 때 얻어진다. 바람직하게, 상기 벌크 용액은 29℃의 배양온도에서 인큐베이터에 넣는다. 상기 배양 온도를 비교하여 ~5-6% 모노머의 증가는 25~29℃에서 관찰된다. 바람직하게, 냉동 약제는 인큐베이터에 직접 넣고 배양전에 실온에서 해동되지 않는다(그러므로 해동이 인큐베이터 안에서 일어난다). 결과들은 또한 10시간 동안 탈냉동 벌크 인터페론을 배양하는 것이 95% 이상의 모노머 퍼센트를 생산한다는 것을 나타낸다. 만약 실온에서 탈냉동하면, 시험된 배양 기간은 10 또는 18.5시간이었다. 만약 탈냉동을 인큐베이터 내에서 한다면, 시험된 배양기간은 16 또는 24시간이었다. Regardless of how the drug is defrozen (e.g., thawing at room temperature or thawing in an incubator), increasing the resting temperature to a certain point has the benefit of interferon monomer levels. Therefore, there is a correlation between resting temperature and protein monomer levels; Increasing the resting temperature from 25 ° C to 29 ° C increases the protein monomer level. Best results are obtained when the bulk solution is set at a temperature of 29 ° C. Preferably, the bulk solution is placed in an incubator at a culture temperature of 29 ° C. An increase in ˜5-6% monomer was observed at 25-29 ° C. comparing the incubation temperature. Preferably, the frozen agent is placed directly in the incubator and does not thaw at room temperature prior to incubation (thus thawing occurs in the incubator). The results also indicate that incubating for 10 hours de-frozen bulk interferon yields greater than 95% monomer percentage. If defrosted at room temperature, the incubation period tested was 10 or 18.5 hours. If defreezing was done in an incubator, the incubation period tested was 16 or 24 hours.

유사하게, 휴식 시간은 올리고머화에 영향을 미치는 인자이다. 휴식 조건(예를 들어 실온에서 해동 그리고 나서 배양 또는 직접 배양)과 무관하게 휴식 시간과 모노머 준위 사이에 상관관계가 있다; 더 긴 휴식시간은 단백질 모노머의 준위를 증가시킨다. 최상의 결과는 휴식시간이 24시간일 때 얻어진다. 휴식시간을 비교하면 ~3% 모노머의 획득은 16~24 시간의 휴식시간동안 얻어진다. 바람직하게, 냉동 약제의 휴식시간은 24시간이다. 더욱 바람직하게 냉동 약제는 24시간의 배양시간(휴식시간) 동안 인큐베이터내에 직접 놓여진다(인큐베이터 안에서 해동이 일어난다).Similarly, resting time is a factor influencing oligomerization. There is a correlation between resting time and monomer level regardless of resting conditions (eg thawing at room temperature and then incubating or direct incubation); Longer breaks increase the level of protein monomers. Best results are obtained when the break is 24 hours. Comparing the breaks, the acquisition of ˜3% monomers is obtained during breaks of 16–24 hours. Preferably, the resting time of the frozen medication is 24 hours. More preferably, the frozen medication is placed directly in the incubator for 24 hours of incubation (rest time) (thaw occurs in the incubator).

두 개의 변수(휴식시간과 휴식온도)를 결합하여 ~9% 모노머의 증가를 얻을 수 있다. 결과는 이러한 조건이 없이 배양된 제제와 비교시 더욱 놀랍다. 77.48% Mon은 만약 약제를 해동후(배양되지 않고) 바로 분석한다면 얻어질 수 있는 반면에, 97.9% 모노머는 냉동 약제를 29℃의 배양온도에서 24시간의 배양 시간동안 바로 배양시킬 때 얻을 수 있다. 그러므로 모노머 준위의 20% 차이점은 두개의 변수들을 최적화하여 얻을 수 있다. 바람직하게, 벌크 인터페론은 24시간의 휴식기간 동안 29℃의 휴식 온도로 설정된다. 더욱 바람직하게는 상기 벌크 인터페론은 24시간의 배양 시간동안 29℃에서 직접 배양(인큐베이터에서 해동 발생)하는 것이다(최상의 결과는 97.9% Mon 생성). By combining two variables (rest time and rest temperature), an increase of ~ 9% monomer can be obtained. The results are more surprising when compared to formulations cultured without these conditions. 77.48% Mon can be obtained if the drug is analyzed immediately after thawing (not cultured), while 97.9% monomer can be obtained when the frozen drug is incubated directly for 24 hours at 29 ° C incubation time. . Therefore, a 20% difference in monomer levels can be obtained by optimizing the two variables. Preferably, the bulk interferon is set at a resting temperature of 29 ° C. for a 24 hour rest period. More preferably, the bulk interferon is incubated directly at 29 ° C. (thawed in an incubator) for a 24 hour incubation time (best results produce 97.9% Mon).

결론적으로, 휴식시간 및 휴식 온도 및 바람직한 배양 온도 및 배양 시간은 벌크 인터페론 사전제형화된 제제 또는 제제의 안정화를 유지 및/또는 증가시키는 데 큰 공헌을 하는 중요한 인자들이다.In conclusion, the resting time and resting temperature and the preferred incubation temperature and incubation time are important factors that make a significant contribution to maintaining and / or increasing the stabilization of the bulk interferon preformulated preparation or formulation.

1.b 1.b 여러가지Several F/T 사이클로 29℃에서 실험실 규모의 열 해리 실험 Laboratory scale thermal dissociation experiment at 29 ° C with F / T cycle

본 보고서는 r-h IFN-베타 1a 약품 물질내 다이머 및 응집체의 준위에 대한 29℃에서 배양하는 효과를 평가한 것이다. This report evaluates the effect of incubating at 29 ° C on the levels of dimers and aggregates in r-h IFN-beta 1a drug substance.

1. 절차:1. Procedure:

a. NEW-SEC 방법은 해동후 15시간 또는 3시간동안 29℃에서 배양된 r-h IFN-베타 1a 벌크 샘플을 분석하기 위해 사용되었으며 이는 표 9에 표시된 여러가지 F/T 사이클을 적용하였다. r-h IFN-베타 1a 벌크를 7개의 15ml 코닝튜브(corning tube)(각 튜브에 0.9ml)에 옮겼다. 상기 튜브들을 -70℃에서 냉동시켰다. IFN-베타-1a 벌크(사전에 냉동 및 해동됨)을 또한 두 개의 250ml 코닝 튜브(각 튜브에 200ml)에 이동시키고, 상기 튜브를 -70℃에서 냉동시켰다. a. The NEW-SEC method was used to analyze r-h IFN-beta 1a bulk samples incubated at 29 ° C. for 15 or 3 hours after thawing and applied the various F / T cycles shown in Table 9. The r-h IFN-beta 1a bulk was transferred to seven 15 ml corning tubes (0.9 ml in each tube). The tubes were frozen at -70 ° C. IFN-beta-1a bulk (pre-frozen and thawed) was also transferred to two 250 ml Corning tubes (200 ml in each tube) and the tubes were frozen at -70 ° C.

실험실 규모의 열 해리 실험을 위한 샘플 처리Sample Handling for Laboratory Scale Thermal Dissociation Experiments 샘플Sample F/T 사이클 F / T cycle 해동thaw SEC-HPLC에 의한 분석전 저장Pre-analysis storage by SEC-HPLC 1One 1One 실온-2시간Room temperature-2 hours 4℃에서 저장Storage at 4 ℃ 22 1One 실온-2시간Room temperature-2 hours 15시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 15 hours 33 1One 29℃에서 4분동안 물순환욕조에서In a water circulation bath for 4 minutes at 29 ℃ 15시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 15 hours 44 44 실온-2시간Room temperature-2 hours 4℃에서 저장Storage at 4 ℃ 55 44 실온-2시간Room temperature-2 hours 15시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 15 hours 66 44 실온-2시간Room temperature-2 hours 3시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 3 hours 77 44 29℃에서 4분동안 물순환욕조에서In a water circulation bath for 4 minutes at 29 ℃ 15시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 15 hours 8 (250ml 튜브)8 (250ml tube) 22 실온-7시간Room temperature-7 hours 15시간 동안 건식 인큐베이터에서 29℃29 ° C in dry incubator for 15 hours 9 (250ml 튜브)9 (250ml tube) 22 실온-7시간Room temperature-7 hours 4℃에서 저장Storage at 4 ℃

b. 상기 분자상에서 IFN-베타-1a 벌크를 배양하는 효과를 평가하기 위하여, 배양된 벌크(1F/T 후)를 다음 방법으로 실험하였다: Deg/Ox-HPLC, IEF, ES-MS, Quant-HPLC, CZEb. To assess the effect of culturing IFN-beta-1a bulk on the molecule, the cultured bulk (after 1F / T) was tested by the following methods: Deg / Ox-HPLC, IEF, ES-MS, Quant-HPLC, CZE

c. 게다가, 실험실 규모 F/TX 1에서 열해리의 동력학을 또한 수행하였다. F/TX1 후 250ml 튜브에서 r-h IFN-베타 1a 벌크로부터 일정부분을 15ml 튜브에 나누어 넣고 인큐베이터 내에서 29℃에서 배양하였다. c. In addition, the kinetics of thermal dissociation at the laboratory scale F / TX 1 was also performed. After F / TX1, a portion of the bulk from the r-h IFN-beta 1a bulk in a 250 ml tube was divided into 15 ml tubes and incubated at 29 ° C. in an incubator.

2. 결과2. Results

1) 실온에서 해동후 r-h IFN-베타 1a 벌크(1F/TX)의 배양은 모노머의 준위를 82.8%에서 97.57%로 증가시키며 응집체의 준위를 0.7%에서 0.2%로 감소시킨다(표 10 참조). 15시간 동안 29℃(인큐베이터)에서의 배양은 다이머(해리 2)에 대해 효과적이다. 욕조에서 해동 후 r-h IFN-베타 1a 벌크의 배양은 모노머의 준위를 82.8%에서 96.7%로 증가시키나 응집체의 준위를 0.7%에서 1.97%로 증가시킨다(표 10 참조).1) Incubation of r-h IFN-beta 1a bulk (1F / TX) after thawing at room temperature increases monomer levels from 82.8% to 97.57% and reduces aggregate levels from 0.7% to 0.2% (see Table 10). Incubation at 29 ° C. (incubator) for 15 hours is effective against dimer (dissociation 2). Incubation of r-h IFN-beta 1a bulk after thawing in the bath increases the level of monomers from 82.8% to 96.7%, but increases the level of aggregates from 0.7% to 1.97% (see Table 10).

1F/T 후 0.9ml 벌크 샘플의 SEC-HPLC 결과SEC-HPLC Results of 0.9ml Bulk Sample After 1F / T AGGRAGGR 다이머Dimer 모노머Monomer 샘플 이름Sample name 면적 % area % 면적 %area % 면적 % area % F/TX1 실온에서 2시간 해동, 4℃에서 저장-대조군 F / TX1 Thaw 2 hours at room temperature, store at 4 ° C-control 0.720.72 17.0117.01 82.2782.27 0.690.69 15.8815.88 83.4383.43 평균Average 0.700.70 16.416.4 82.8582.85 F/TX1 실온에서 2시간 해동, 29℃에서 배양-15시간 F / TX1 thaw at room temperature for 2 hours, incubation at 29 ° C-15 hours 0.230.23 2.32.3 97.4797.47 0.190.19 2.142.14 97.6797.67 평균Average 0.210.21 2.222.22 97.5797.57 F/TX1 욕조(29℃, 4분)에서 해동, 29℃에서 배양-15 시간Thaw in F / TX1 bath (29 ° C, 4 min), incubate at 29 ° C -15 h 1.971.97 1.431.43 96.696.6 1.971.97 1.181.18 96.8596.85 평균Average 1.971.97 1.301.30 96.7296.72

3) 실온에서 해동후 3시간 동안 r-h IFN-베타 1a 벌크(4FT)의 배양은, 다이머 준위의 감소로 인해 모노머의 준위를 82.3%에서 89.5%로 증가시켰다.(표 11 및 도면 2 참조)3) Incubation of r-h IFN-beta 1a bulk (4FT) for 3 hours after thawing at room temperature increased monomer levels from 82.3% to 89.5% due to the decrease in dimer level (see Table 11 and Figure 2).

4) 실온에서 해동후 15시간 동안 r-h IFN-베타 1a 벌크(4FT)의 배양은, 다이머 준위의 감소로 인해 모노머의 준위를 82.3%에서 93.7%(3 시간 배양과 비교됨)로 더 증가시켰다.(표 11 및 도면 2 참조)4) Incubation of rh IFN-beta 1a bulk (4FT) for 15 hours after thawing at room temperature further increased monomer levels from 82.3% to 93.7% (compared to 3-hour incubation) due to the decrease in dimer level. See Table 11 and Drawing 2)

5) 욕조에서 해동후 3시간 동안 r-h IFN-베타 1a 벌크의 배양은, 다이머 준위의 감소로 인해 모노머의 준위를 82.3%에서 94.7%로 증가시켰다.(표 11 및 도면 2 참조)5) Incubation of r-h IFN-beta 1a bulk for 3 hours after thawing in the bath increased monomer levels from 82.3% to 94.7% due to the decrease in dimer level (see Table 11 and Figure 2).

4F/T 후 0.9ml 벌크 샘플의 SEC-HPLC 결과SEC-HPLC Results of 0.9ml Bulk Sample After 4F / T AGGRAGGR 다이머Dimer 모노머Monomer 샘플 이름Sample name 면적 % area % 면적 %area % 면적 % area % F/TX4 실온에서 2시간 해동, 4℃에서 저장-대조군 F / TX4 Thaw 2 hours at room temperature, store at 4 ° C-control 2.892.89 14.1614.16 82.9582.95 3.033.03 15.2615.26 81.7181.71 평균Average 2.962.96 14.7114.71 82.3382.33 F/TX4 실온에서 2시간 해동, 29℃에서 배양-3시간 F / TX4 thaw at room temperature for 2 hours, incubation at 29 ° C-3 hours 2.982.98 7.667.66 89.3689.36 2.922.92 7.427.42 89.6689.66 평균Average 2.952.95 7.547.54 89.5189.51 F/TX4 실온에서 2시간 해동, 29℃에서 배양-15 시간F / TX4 thaw at room temperature for 2 hours, incubation at 29 ° C -15 hours 2.972.97 3.453.45 93.5893.58 2.912.91 3.273.27 93.8293.82 평균Average 2.942.94 3.363.36 93.793.7 F/TX4 욕조에서 해동, 29℃에서 배양-15 시간Thaw in F / TX4 bath, incubate at 29 ° C for 15 hours 2.892.89 2.382.38 94.7394.73 2.832.83 2.312.31 94.8694.86 평균Average 2.862.86 2.342.34 94.7994.79

6) 실온에서 해동후 200ml r-h IFN-베타 1a 벌크 샘플의 배양은 모노머의 준위를 73%에서 91.2%로 증가시키고 응집체의 준위를 3.9%에서 2.9%로 감소시켰다.(표 12 및 도면 3 참조)6) Incubation of 200 ml r-h IFN-beta 1a bulk samples after thawing at room temperature increased monomer levels from 73% to 91.2% and reduced aggregate levels from 3.9% to 2.9% (see Table 12 and Figure 3).

2F/T 후 200ml 벌크 샘플의 SEC-HPLC 결과SEC-HPLC Results of 200ml Bulk Samples After 2F / T AGGRAGGR 다이머Dimer 모노머Monomer 샘플 이름Sample name 면적 % area % 면적 %area % 면적 % area % 200ml 실온에서 7시간 해동, 4℃에서 저장-대조군200 ml thaw at room temperature for 7 hours, storage at 4 ° C.-control 4.064.06 23.323.3 72.6472.64 3.853.85 22.7122.71 73.4473.44 평균Average 3.93.9 23.023.0 73.0473.04 200ml 실온에서 7시간 해동, 29℃에서 배양-15시간Thaw 7 hours at 200 ml room temperature, incubate at 29 ° C for 15 hours 2.982.98 5.655.65 91.3791.37 2.952.95 6.056.05 9191 평균Average 2.92.9 5.85.8 91.1891.18

7) 배양된 r-h IFN-베타 1a 벌크 샘플(0.9ml, 1F/T)를 실온에서 해동되고 4℃에서 저장된 대조군 샘플과 함께 다음 실험으로 분석하였다(표 13 참조):7) Cultured r-h IFN-beta 1a bulk samples (0.9 ml, 1F / T) were thawed at room temperature and analyzed with the following experiment with control samples stored at 4 ° C. (see Table 13):

대조군 샘플(4℃에서 저장)에 비하여 배양된 샘플에서 Deg/Ox-HPLC- 산화준위의 증가가 나타나지 않았다.There was no increase in Deg / Ox-HPLC-oxidation levels in cultured samples compared to control samples (stored at 4 ° C).

ES-MS-대조군과 비교하여 배양된 샘플에서 탄수화물 준위의 차이는 나타나지 않았다. There was no difference in carbohydrate levels in the cultured samples compared to the ES-MS-control.

Quant-HPLC- 농도에서 큰 차이점은 없었다.There was no significant difference in the Quant-HPLC- concentration.

CZE-동일한 전기영동도(electropherogram) 프로파일이 얻어졌다.CZE-identical electropherogram profiles were obtained.

IEF- 물순환 욕조에서 해동된 r-h IFN-베타 1a F 벌크 샘플은 pI-7 근처에서 추가적인 밴드를 나타내었다. 실온에서 해동되고 15시간 동안 배양된 샘플 및 상기 대조군 샘플은 특성에 적합하다.The r-h IFN-beta 1a F bulk samples thawed in the IEF-water circulation bath showed additional bands near pI-7. Samples thawed at room temperature and incubated for 15 hours and the control sample are suitable for properties.

IFN상에서 열 해리의 효과Effect of thermal dissociation on IFN 샘플Sample Deg-OxDeg-ox ES-MSES-MS IEFIEF Q HPLCQ HPLC CZECZE %% MONMON MONOMONO DIDI TRITRI 8.9-98.9-9 8.58.5 7.9-8.07.9-8.0 ug/mlug / ml F/TX 1 해동 실온, 4℃F / TX 1 thawing RT, 4 ℃ 99.399.3 1One 1515 7272 1212 1919 5858 2323 334334 conf.conf. F/TX 1 해동 실온, 29℃ 15시간F / TX 1 thawing at room temperature, 29 ℃ for 15 hours 99.499.4 1One 1515 7171 1212 2020 5555 2424 338338 conf.conf. F/TX 1 해동 29℃, 29℃ 15시간F / TX 1 thawing 29 ℃, 29 ℃ 15 hours 99.499.4 22 1616 7070 1212 1515 5656 2828 363363 conf.conf.

실온에서 해동후 15시간은 Deg/ox HPLC, ES-MS, Quant-HPLC CZE 및 IEF에 의해 결정된 IFN-베타-1a의 파라미터에 영향을 미치지 않는다.15 hours after thawing at room temperature did not affect the parameters of IFN-beta-1a as determined by Deg / ox HPLC, ES-MS, Quant-HPLC CZE and IEF.

8) 표 14 및 도 4 내지 6에 F/TX 1에서 열 해리의 동력학의 결과를 나타내었다. 8) Table 14 and Figures 4-6 show the results of the kinetics of thermal dissociation in F / TX 1.

실험실 규모 F/TX 1에서 열해리의 동력학Kinetics of thermal dissociation at laboratory scale F / TX 1 시간 (hr.)Time (hr.) 모노머Monomer 다이머Dimer 응집체Aggregate 00 73.473.4 24.724.7 1.941.94 33 90.0490.04 8.548.54 1.421.42 66 94.1394.13 4.74.7 1.191.19 99 95.0995.09 3.793.79 1.121.12 1212 95.9295.92 3.093.09 0.990.99 1515 96.5696.56 2.542.54 0.910.91 2424 97.297.2 1.941.94 0.870.87

3. 결론:3. Conclusion:

1) 실온에서 해동후 15시간 동안 29℃에서 r-h IFN-베타 1a 샘플을 배양하는 것은 올리고머화(즉 다이머)의 준위를 매우 감소시켰다. 1) Incubating the r-h IFN-beta 1a sample at 29 ° C. for 15 hours after thawing at room temperature significantly reduced the level of oligomerization (ie dimer).

2) 29℃ 욕조에서 해동후 15시간 동안 29℃에서 r-h IFN-베타 1a 샘플을 배양하는 것은 올리고머화(즉 다이머)의 준위를 매우 감소시켰다. 2) Incubation of r-h IFN-beta 1a samples at 29 ° C. for 15 hours after thawing in a 29 ° C. bath significantly reduced the level of oligomerization (ie dimer).

3) 사용된 분석방법을 기초로, 실온에서 해동후 15시간 동안 29℃에서 r-h IFN-베타 1a 샘플을 배양하는 것은 Deg/ox HPLC, ES-MS, Quant-HPLC CZE 및 IEF에 의해 확인할 때 IFN-베타-1a 분자의 파라미터에 부정적 영향을 주지 않았다. 비 공유성 올리고머 해리에 효과적이지만, 모든 비공유성 올리고머가 해리되는 것은 아니다(4% 비공유성 올리고머가 250ml 튜브에서 해리되지 않음)에서 해리되지 않았다. 250ml 튜브에서 모노머 %는 94%에 도달(9시간 배양, 29℃)하고 작은 튜브에서 97.57%(15시간 배양, 29℃)에 도달하였다. 올리고머의 평형은 열 해리후 바로 도달하였다(표 및 도면 참조). 15ml 튜브내에서 29℃에서 열해리는 15 시간 후 완료된다. 요약하면, 본 실험(1.a 및 1.b)들은, 특정 온도 및 기간(즉 휴식 온도 및 휴식시간 또는 배양 시간 및 배양 온도)에 의해 실시된 열해리가 상기 (모노머릭) 단백질을 포함하는 제제 또는 (모노머릭) 단백질의 안정성을 유지 및/또는 증가시키는데 중요하다는 것을 나타낸다. 인터페론-베타에 대한 열해리 동력학은 1F/T 사이클에서의 열해리가 단지 3시간 후에 90% Mon을 산출하고, 6시간후 거의 완전히 완결되고 15시간에서 "정점(plateau)"에 도달한다는 것을 보여준다. 바람직하게, 열 해리는 적어도 3시간 동안 수행된다. 더욱 바람직하게는, 인터페론 베타의 열 해리의 기간(휴식 시간 또는 배양 시간)은 6 시간 내지 40시간의 범위로 설정된다. 더욱 바람직하게는 인터페론 베타의 열해리 기간은 15시간 내지 30 시간, 또는 10시간 동안, 16시간, 18.5시간 또는 24시간의 범위로 설정된다. 더욱 더 바람직하게는 인터페론-베타의 열해리의 기간은 24시간이다. 배양 또는 휴식 온도는 바람직하게는 27~31℃의 범위로 설정된다. 더욱 바람직하게는 상기 온도는 29℃이다. 열해리의 동력학에 대한 상기 결과들이 1F/T후에 수행되었지만, 당업자는 종래 기술을 사용하여 용이하게 많은 F/T 사이클(예를 들어 2F/T, 4F/T 또는 11 F/T; 또는 다른 종류의 스트레스) 후 또는 전체 제조공정에 대하여 또는 인터페론-베타의 어느 한부분(예를 들어 r-h 인터페론-베타 1a) 또는 어트 모노머릭 단백질에 대하여 열 해리의 동력학을 결정할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 특정 배양시간 또는 기간(또는 휴식 시간)에 한정되지 않는다. 유사하게 당업자는 종래기술을 사용하여 용이하게 하나 이상의 F/T 사이클(또는 다른 종류의 스트레스) 후 또는 전제 제조공정에 대하여 또는 어느 인터페론-베타의 어느 한 부분(예를 들어 r-h 인터페론-베타 1a) 또는 모노머릭 단백질에 대하여 가장 적당한 인터페론 온도(또는 휴식 온도)를 결정할 수 있다. 그러므로 본 발명은 특정 배양 온도(또는 휴식 온도)에 한정되지 않는다. 3) Based on the assay used, incubating the rh IFN-beta 1a samples at 29 ° C. for 15 hours after thawing at room temperature was confirmed by Deg / ox HPLC, ES-MS, Quant-HPLC CZE and IEF. There was no negative effect on the parameters of the beta-1a molecule. Although effective for non-covalent oligomer dissociation, not all non-covalent oligomers dissociated (4% non-covalent oligomers did not dissociate in 250 ml tubes). % Monomer in 250 ml tube reached 94% (9 h incubation, 29 ° C.) and 97.57% (15 h incubation, 29 ° C.) in small tubes. The equilibrium of oligomers reached immediately after thermal dissociation (see table and figures). Thermal dissociation at 29 ° C. in a 15 ml tube is completed after 15 hours. In summary, the present experiments (1.a and 1.b) are characterized in that the thermal dissociation conducted by a specific temperature and period of time (ie, resting temperature and resting time or incubation time and incubation temperature) comprises the (monomeric) protein. Or (monomeric) proteins are important for maintaining and / or increasing the stability of the protein. Thermal dissociation kinetics for interferon-beta show that thermal dissociation in the 1F / T cycle yields 90% Mon after only 3 hours, almost complete after 6 hours and reaches a "plateau" at 15 hours. Preferably, the thermal dissociation is performed for at least 3 hours. More preferably, the period of thermal dissociation of the interferon beta (rest time or incubation time) is set in the range of 6 hours to 40 hours. More preferably, the thermal dissociation period of the interferon beta is set in the range of 15 hours to 30 hours, or 10 hours, 16 hours, 18.5 hours or 24 hours. Even more preferably the period of thermal dissociation of interferon-beta is 24 hours. Incubation or resting temperature is preferably set in the range of 27 ~ 31 ℃. More preferably the temperature is 29 ° C. Although the above results for the kinetics of thermal dissociation have been performed after 1F / T, those skilled in the art can readily use many conventional F / T cycles (e.g., 2F / T, 4F / T or 11 F / T; or other types). The kinetics of thermal dissociation can be determined either after stress) or for the entire manufacturing process or for any portion of interferon-beta (eg rh interferon-beta 1a) or at monomeric protein. Therefore, the present invention is not limited to a specific incubation time or period (or rest time). Similarly, one of ordinary skill in the art can readily use the prior art after one or more F / T cycles (or other types of stress) or for prefabrication processes or any portion of any interferon-beta (eg rh interferon-beta 1a). Alternatively, the most suitable interferon temperature (or resting temperature) can be determined for the monomeric protein. Therefore, the present invention is not limited to a specific culture temperature (or resting temperature).

실시예Example 2: 벌크 인터페론에 부형제 첨가에 의한 인터페론-베타의 안정화 2: Stabilization of Interferon-Beta by Addition of Excipients to Bulk Interferon

본 실험들은 아미노산, 정균제, 표면활성제 및 등장제과 같은 몇 가지 부형제에 의해 나타난 벌크 r-h IFN-베타 1a에 대한 올리고머화 및 응집 면에서 보호적 효과를 입증하기 위하여 수행된 것이다. 다음 연구들은 인간 혈청 알부민(human serum albumin: HSA)을 벌크 r-h IFN-베타 1a 사전제형화된 제제에 첨가하지 않고 수행된 것이다. These experiments were performed to demonstrate a protective effect in terms of oligomerization and aggregation on bulk r-h IFN-beta 1a exhibited by several excipients such as amino acids, bacteriostatic agents, surfactants and isotonic agents. The following studies were performed without adding human serum albumin (HSA) to the bulk r-h IFN-beta 1a preformulated formulation.

1.0 용어풀이/약어 1.0 Glossary / Abbreviation

Agg 응집체(aggregates)Agg aggregates

COA 분석 증명서(Certificate of analysis)Certificate of analysis

Dim 다이머Dim dimer

Deg 분해제(Degradant)Deg Degradant

FDF 최종 복용 형태FDF final dosage form

F/T 냉동 및 해동F / T freezing and thawing

r-h IFN-베타 1a CHO 세포로부터의 재조합 인간 인터페론-베타 1a(r-h IFN-베타 1a)r-h IFN-beta 1a recombinant human interferon-beta 1a from CHO cells (r-h IFN-beta 1a)

r-h IFN-베타 FDF r-h IFN-베타 1a 최종 복용 형태(r-h IFN-베타 FDF)r-h IFN-beta FDF r-h IFN-beta 1a final dosage form (r-h IFN-beta FDF)

SE-HPLC 크기 배제 고성능 액상 크로마토그래피SE-HPLC Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography

SAB 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8SAB 50mM Sodium Acetate pH 3.8

Temp. 온도Temp. Temperature

2.0 소개(introduction) 2.0 introduction

연구는 안정화된 벌크 인터페론-베타를 제공하기 위하여 SEC-EL 분획으로부터 FDF 저장시까지 제조 단계동안 r-h IFN-베타 1a의 올리고머화를 최소화하는데 중점을 두었다. The study focused on minimizing oligomerization of r-h IFN-beta 1a during the preparation step from SEC-EL fraction to FDF storage to provide stabilized bulk interferon-beta.

스트레스(예를 들어 F/T)에 의해 얻어진 올리고머화를 최소화하는 것은 다음 방법으로 수행되었다:Minimizing oligomerization obtained by stress (eg F / T) was performed in the following way:

1. 부형제 및/또는 다른 안정화제와 HSA 없이 벌크를 사전제형화한다1. Preform the bulk without HSA with excipients and / or other stabilizers

2. 사전 제형화된 벌크에서 올리고머화에 대한 저장온도(-20℃, -70℃ 및 2-8℃)의 효과를 평가한다.2. Evaluate the effect of storage temperatures (-20 ° C., −70 ° C. and 2-8 ° C.) on oligomerization in preformulated bulk.

사전 제형화된 벌크 샘플을 SE-HPLC를 사용하여 분석하였다.Preformulated bulk samples were analyzed using SE-HPLC.

3.0 목적/범위 3.0 Purpose / Scope

벌크 공정중에 r-h IFN-베타 1a의 올리고머화를 최소화하는 것Minimizing oligomerization of r-h IFN-beta 1a during the bulk process

4.0 장치 및 재료 4.0 Devices and Materials

4.14.1 장치Device

0.2μ필터 장치 P/N MPGL025 밀리포어0.2μ filter unit P / N MPGL025 Millipore

밀렉스 주사기 (Millex syringe)로 작동된 0.2μ 필터 - P/N SLGV025LS 밀리포어0.2μ filter powered by Millex syringe-P / N SLGV025LS Millipore

250ml 원뿔 원심분리기 튜브-코닝(corning)250ml conical centrifuge tubes-corning

1.8ml 크리오튜브(cryotube)-Nunc1.8ml cryotube-Nunc

4.2 4.2 재료material

a. SEC el 2 분획(fraction)a. SEC el 2 fraction

b. D-만니톨 DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421(코드 1.05980, Merck)b. D-Mannitol DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (Code 1.05980, Merck)

c. 빙초산(glacial acetic acid) 100% (코드 1.00063, Merck)c. Glacial acetic acid 100% (Code 1.00063, Merck)

d. 소듐 하이드록사이드 10Md. Sodium hydroxide 10M

e. 플록사머 188(Lutrol F 68 DAC, USP/NF, Basf), 5163315e. Phloxamer 188 (Lutrol F 68 DAC, USP / NF, Basf), 5163315

f. L-메티오닌(1.05707, Merck)f. L-Methionine (1.05707, Merck)

g. 벤질알콜 Ph Eur, BP, NF(코드 1.00987, Merck)g. Benzyl Alcohol Ph Eur, BP, NF (Code 1.00987, Merck)

h. L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(코드 1.01544, Merck)h. L-arginine monohydrochloride (Code 1.01544, Merck)

i. 트윈^TM 20 Ph Eur, NF(코드 8.17072, Merck)i. Twin ^TM 20 Ph Eur, NF (Code 8.17072, Merck)

j. 리신(코드 1.05701, Merck)j. Lysine (Code 1.05701, Merck)

k. r-h IFN-베타 1a 0.48-0.5mg/ml 또는 0.088mg/mlk. r-h IFN-beta 1a 0.48-0.5 mg / ml or 0.088 mg / ml

l. 아세테이트 완충액 pH 3.8 50mM 또는 10mMl. Acetate buffer pH 3.8 50mM or 10mM

안정화제:Stabilizer:

아미노산:amino acid:

1. 아르기닌 31.6 mg/mlArginine 31.6 mg / ml

2. 리신 27.4mg/ml2. Lysine 27.4mg / ml

3. 메티오닌 0.12mg/ml(항산화제)3. Methionine 0.12mg / ml (Antioxidant)

표면활성제Surfactant

1. 트윈 20 0.05mg/ml1.Tween 20 0.05mg / ml

2. 플록사머 188(플루론산) 0.5mg/ml2. Fluxamer 188 (Fluronic Acid) 0.5mg / ml

정균제Bacteriostatic ::

1. 벤질알콜 5mg/mlBenzyl Alcohol 5mg / ml

등장제Appearance ::

1. 만니톨 54.6mg/ml1.Mannitol 54.6mg / ml

절차step

본 연구는 SEC-EL 2 분획들로 수행하였다. This study was conducted with SEC-EL 2 fractions.

본 연구의 대략적 도식은 도 7에 보여진다. A schematic of the study is shown in FIG.

다른 사전제형화 조건은 표 15 및 16에 나타낸다.Other preformulation conditions are shown in Tables 15 and 16.

실험 개요Experiment overview 4℃4 ℃ -20℃-20 ℃ -20℃-20 ℃ -70℃-70 ℃ -70℃-70 ℃ 안정화제Stabilizer 표면활성제Surfactant 항산화제Antioxidant 2ml 튜브2ml tube 250ml 튜브250ml tube 2ml 튜브2ml tube 250ml 튜브250ml tube 2ml 튜브2ml tube ++ -- -- ++ ++ ++ ++ ++ ++ -- L-메티오닌L-methionine ++ -- ++ -- ++ ++ 트윈 20Twin 20 L-메티오닌L-methionine ++ -- ++ -- ++ ++ 플록사머 188Ploxamer 188 L-메티오닌L-methionine ++ -- ++ -- ++ -- -- -- ++ ++ ++ ++ ++

안정화제: 벤질알콜/L-아르기닌/만니톨/리신Stabilizer: Benzyl alcohol / L-arginine / mannitol / lysine

조건Condition 아세테이트 pHAcetate pH 벤질알콜 mg/mlBenzyl Alcohol mg / ml L-아르기닌 HCl mg/mlL-arginine HCl mg / ml 만니톨 mg/mlMannitol mg / ml 리신 mg/mlLysine mg / ml 플록사머 188 mg/mlPhloxamer 188 mg / ml 트윈 20 mg/mlTween 20 mg / ml L-메티오닌 mg/mlL-Methionine mg / ml 튜브 수Number of tubes 1One 5mM pH-3.8 5 mM pH-3.8 55 -- -- -- -- -- -- 4x250ml 6x2ml4x250ml 6x2ml 22 55 -- -- -- -- -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 33 55 -- -- -- -- 0.050.05 0.120.12 6x2ml6x2ml 44 55 -- -- -- 0.50.5 -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 55 -- 31.631.6 -- -- -- -- 4x250ml 6x2ml4x250ml 6x2ml 66 -- 31.631.6 -- -- -- -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 77 -- 31.631.6 -- -- -- 0.050.05 0.120.12 6x2ml6x2ml 88 -- 31.631.6 -- -- 0.50.5 -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 99 -- -- 54.654.6 -- -- -- -- 4x250ml 6x2ml4x250ml 6x2ml 1010 -- -- 54.654.6 -- -- -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 1111 -- -- 54.654.6 -- -- 0.050.05 0.120.12 6x2ml6x2ml 1212 -- -- 54.654.6 -- 0.50.5 -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 13 대조군13 controls -- -- -- -- -- -- -- 2x250ml 6x2ml2x250ml 6x2ml 14 대조군14 control 10mM pH-3.810 mM pH-3.8 -- -- -- -- -- -- -- 6x2ml6x2ml 1515 5mM pH-3.8 5 mM pH-3.8 -- -- -- 27.427.4 -- -- -- 4x250ml 6x2ml4x250ml 6x2ml 1616 -- -- -- 27.427.4 -- -- 0.120.12 6x2ml6x2ml 1717 -- -- -- 27.427.4 -- 0.050.05 0.120.12 6x2ml6x2ml 1818 -- -- -- 27.427.4 0.50.5 -- 0.120.12 6x2ml6x2ml

6.1 용액의 제조 6.1 Preparation of Solution

6.1.1 1리터의 50 mM 소듐 아세테이트 pH 3.8( SAB )의 제조 6.1.1 Preparation of 1 liter of 50 mM sodium acetate pH 3.8 ( SAB )

1000ml WFI에, 3.003g의 빙초산을 첨가하고 5분 동안 혼합하였다. To 1000 ml WFI, 3.003 g glacial acetic acid was added and mixed for 5 minutes.

약 0.56ml 소듐 하이드록사이드 10M을 첨가하여 pH 3.8로 맞추고, 상기 용액을 5분동안 혼합한 후 전도도를 위해 샘플화하고 0.2μ 필터로 여과하였다. 플록사머 188(또는 플루로닉 F-68)을 0.1%(최저 미셀형성 농도: Critical Micellar Concentration)에서 사전제형화된 제제에 포함시켜 제조 공정동안 상기 용기 표면에 의한 약품 물질의 흡착을 방지하였다; 더 높은 농도는 제품의 안정성에 부정적 영향을 미친다(더 높은 산화); 더 낮은 농도는 흡착을 제한하는데 덜 효과적이다.About 0.56 ml sodium hydroxide 10M was added to adjust pH to 3.8, the solution was mixed for 5 minutes, then sampled for conductivity and filtered with a 0.2μ filter. Ploxamer 188 (or Pluronic F-68) was included in the preformulated formulation at 0.1% (Critical Micellar Concentration) to prevent adsorption of drug substance by the container surface during the manufacturing process; Higher concentrations adversely affect the stability of the product (higher oxidation); Lower concentrations are less effective at limiting adsorption.

6.1.2 다음 용액의 1 리터의 제조: 6.1.2 Preparation of 1 liter of the following solution:

1. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 10mg/ml 벤질 알콜 1.50 mM acetate pH-3.8, 10mg / ml benzyl alcohol

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 10g 벤질알콜을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 10 g benzyl alcohol before adding sodium hydroxide.

2. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 5mg/ml 벤질알콜 2. 50 mM acetate pH-3.8, 5mg / ml benzyl alcohol

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 5g의 벤질알콜을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 5 g of benzyl alcohol before adding sodium hydroxide.

3. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 63.2mg/ml 아르기닌 3. 50 mM acetate pH-3.8, 63.2 mg / ml arginine

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 63.2g의 아르기닌을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 63.2 g of arginine before the addition of sodium hydroxide.

4. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 31.6mg/ml 아르기닌 4. 50 mM acetate pH-3.8, 31.6 mg / ml arginine

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 31.6g의 아르기닌을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 31.6 g of arginine before adding sodium hydroxide.

5. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 54.8mg/ml 리신 5. 50 mM acetate pH-3.8, 54.8 mg / ml lysine

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 54.8g의 리신을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 54.8 g of lysine before the addition of sodium hydroxide.

6. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 27.4mg/ml 리신 6. 50 mM acetate pH-3.8, 27.4 mg / ml lysine

소듐 하이드록사이드를 첨가하기 전에 27.4g의 리신을 첨가하여 6.1.1과 동일하게 제조.Prepared in the same manner as in 6.1.1 by adding 27.4 g of lysine before adding sodium hydroxide.

7. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 600 mM 만니톨 7. 5 0 mM acetate pH-3.8, 600 mM Mannitol

0.926kg WFI에 3.003g의 빙초산을 첨가하고 5분 동안 상기 용액을 혼합하였다. 100.3g 만니톨을 상기 용액에 첨가하고 5 분동안 혼합하였다. 약 0.56ml 소듐하이록사이드 10M을 첨가하여 pH 3.8로 맞추고, 상기 용액을 5분동안 혼합한 후 전도도를 위해 샘플화하고 0.2μ막으로 여과하였다. 3.003 g of glacial acetic acid was added to 0.926 kg WFI and the solution was mixed for 5 minutes. 100.3 g mannitol was added to the solution and mixed for 5 minutes. Approximately 0.56 ml sodium hydroxide 10M was added to bring the pH to 3.8, the solution was mixed for 5 minutes, then sampled for conductivity and filtered through a 0.2 μm membrane.

8. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 300 mM 만니톨 8. 5 0 mM acetate pH-3.8, 300 mM Mannitol

0.966kg WFI에 3.003g의 빙초산을 첨가하고 5분 동안 상기 용액을 혼합하였다. 55.1g 만니톨을 상기 용액에 첨가하고 5 분동안 혼합하였다. 약 0.56ml 소듐하이록사이드 10M을 첨가하여 pH 3.8로 맞추고, 상기 용액을 5분동안 혼합한 후 전도도를 위해 샘플화하고 0.2μ필터로 여과하였다. 3.003 g of glacial acetic acid was added to 0.966 kg WFI and the solution was mixed for 5 minutes. 55.1 g mannitol was added to the solution and mixed for 5 minutes. About 0.56 ml sodium hydroxide 10M was added to adjust pH to 3.8, the solution was mixed for 5 minutes, then sampled for conductivity and filtered with a 0.2 μ filter.

6.1.3 다음 용액 1 리터를 제조하였다: 6.1.3 One liter of the following solution was prepared:

1. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 5g/ml 벤질 알콜, 12mg/ml 메티오닌 1.50 mM acetate pH-3.8, 5 g / ml benzyl alcohol, 12 mg / ml methionine

12g 메티오닌을 첨가하고 6.1.2와 동일하게 제조.12 g methionine was added and prepared as in 6.1.2.

2. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 5mg/ml 벤질알콜, 12mg/ml 메티오닌, 50mg/ml 플록사머 188 2. 50 mM acetate pH-3.8, 5 mg / ml benzyl alcohol, 12 mg / ml methionine, 50 mg / ml floxamer 188

12g 메티오닌과 50g 플록사머 188을 첨가하고 6.1.2와 동일하게 제조. 12 g methionine and 50 g floxamer 188 were added and prepared as in 6.1.2.

3. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 5mg/ml 벤질알콜 , 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20 3. 50 mM acetate pH-3.8, 5mg / ml Benzyl Alcohol, 12mg / ml Methionine, 5mg / ml Tween 20

12g 메티오닌과 5g 트윈 20을 첨가하고 6.1.2와 동일하게 제조.12 g methionine and 5 g Tween 20 were added and prepared as in 6.1.2.

4. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌 4. 50 mM acetate pH-3.8, 31.6mg / ml Arginine, 12mg / ml Methionine

12g 메티오닌을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조.12 g methionine was added and prepared as in 6.1.2.

5. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌, 50mg/ml 플록사머 188 5. 50 mM acetate pH-3.8, 31.6 mg / ml arginine, 12 mg / ml methionine, 50 mg / ml floxamer 188

12g 메티오닌과 50g 플록사머 188을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조.12 g methionine and 50 g floxamer 188 were added and prepared as in 6.1.2.

6. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20 6. 50 mM acetate pH-3.8, 31.6mg / ml Arginine, 12mg / ml Methionine, 5mg / ml Tween 20

12g 메티오닌과 5g 트윈 20을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조.12 g methionine and 5 g Tween 20 were added and prepared as in 6.1.2.

7. 50 mM 아세테이트 pH-3.8, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌 7. 5 0 mM acetate pH-3.8, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine

12g 메티오닌을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조. 12 g methionine was added and prepared as in 6.1.2.

8. 50mM 아세테이트 pH-3.8, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 플록사머 188 8. 50 mM acetate pH-3.8, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml floxamer 188

12g 메티오닌과 5g 플록사머 188을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조. 12 g methionine and 5 g floxamer 188 were added and prepared as in 6.1.2.

9. 50mM 아세테이트 pH-3.8, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20 9. 50 mM acetate pH-3.8, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml Tween 20

12g 메티오닌과 5g 트윈 20을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조. 12 g methionine and 5 g Tween 20 were added and prepared as in 6.1.2.

10. 50mM 아세테이트 pH-3.8, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌 10. 5 mM acetate pH-3.8, 27.4 mg / ml lysine, 12 mg / ml methionine

12g 메티오닌을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조.12 g methionine was added and prepared as in 6.1.2.

11. 50mM 아세테이트 pH-3.8, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 플록사머 188 11.50 mM acetate pH-3.8, 27.4 mg / ml lysine, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml phloxamer 188

12g 메티오닌과 5g 플록사머 188을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조. 12 g methionine and 5 g floxamer 188 were added and prepared as in 6.1.2.

12. 50mM 아세테이트 pH-3.8, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20 12.5 0mM Acetate pH-3.8, 27.4mg / ml Lysine, 12mg / ml Methionine, 5mg / ml Tween 20

12g 메티오닌과 5g 트윈 20을 첨가하고 6.1.2과 동일하게 제조. 12 g methionine and 5 g Tween 20 were added and prepared as in 6.1.2.

6.2 사전제형화된 벌크제제(bulk preformulation ) 6.2 the pre-formulated bulk preparation (bulk preformulation)

벌크 약제와 조성물의 개요는 도 7 및 표 15에 나타난다.An overview of the bulk agents and compositions is shown in FIG. 7 and Table 15.

제1 단계First step

6.2.1 197g SEC-EL을 SAB로 1:1 ww, 10mg/ml 벤질알콜로 희석하였다.6.2.1 197 g SEC-EL was diluted with SAB 1: 1 ww, 10 mg / ml benzyl alcohol.

6.2.2 197g SEC-EL을 SAB로 1:1 w/w, 63.2mg/ml 아르기닌으로 희석하였다.6.2.2 197 g SEC-EL was diluted with SAB 1: 1 w / w, 63.2 mg / ml arginine.

6.2.3 197g SEC-EL을 SAB로 1:1 w/w, 600mM 만니톨로 희석하였다.6.2.3 197 g SEC-EL was diluted with SAB 1: 1 w / w, 600 mM mannitol.

6.2.4 197g SEC-EL을 SAB로 1:1 w/w, 54.8mg/ml 리신로 희석하였다.6.2.4 197 g SEC-EL was diluted with SAB 1: 1 w / w, 54.8 mg / ml lysine.

6.2.5 92g SEC-EL을 208g SAB로 희석하여 0.5mg/ml r-h IFN-베타 1a를 포함하는 용액을 제조하였다. 여과후 상기 용액을 2 개의 250ml 튜브(130g 벌크 포함)과 6개의 2ml 튜브(0.5ml 벌크 포함)에 나누어 넣었다. 하나의 250ml 튜브와 2 개의 2ml 튜브를 냉동시키고 -70℃에서 저장하였다. 하나의 250ml 튜브 및 2개의 2ml 튜브를 -70℃에서 냉동시키고 나서 2차 냉동기로 옮겨서 -20℃에서 저장하였다. 2 개의 2ml 튜브를 2-8℃에서 저장하였다. SEC-EL을 물로 희석하고 10mM 아세테이트 pH 3.8의 r-h IFN-베타 1a 0.088mg/ml을 포함하는 용액 6ml를 제조하였다.6.2.5 A solution comprising 0.5 mg / ml r-h IFN-beta 1a was prepared by diluting 92 g SEC-EL with 208 g SAB. After filtration the solution was divided into two 250 ml tubes (including 130 g bulk) and six 2 ml tubes (including 0.5 ml bulk). One 250 ml tube and two 2 ml tubes were frozen and stored at -70 ° C. One 250 ml tube and two 2 ml tubes were frozen at −70 ° C. and then transferred to a secondary freezer and stored at −20 ° C. Two 2 ml tubes were stored at 2-8 ° C. SEC-EL was diluted with water and a 6 ml solution containing 0.088 mg / ml r-h IFN-beta 1a at 10 mM acetate pH 3.8 was prepared.

제2 단계2nd step

다음 용액을 0.5mg/ml의 r-h IFN-베타 1a 농도로 제조하였다.The following solution was prepared at a concentration of r-h IFN-beta 1a of 0.5 mg / ml.

6.2.6 6.2.1에서 제조한 용액을 SAB, 5mg/ml 벤질알콜로 희석하였다.6.2.6 The solution prepared in 6.2.1 was diluted with SAB, 5 mg / ml benzyl alcohol.

6.2.7 6.2.2에서 제조한 용액을 SAB, 31.6mg/ml 아르기닌으로 희석하였다.6.2.7 The solution prepared in 6.2.2 was diluted with SAB, 31.6 mg / ml arginine.

6.2.8 6.2.3에서 제조한 용액을 SAB, 300mM 만니톨로 희석하였다.6.2.8 The solution prepared in 6.2.3 was diluted with SAB, 300 mM mannitol.

6.2.9 6.2.4에서 제조한 용액을 SAB, 27.4mg/ml 리신으로 희석하였다.6.2.9 The solution prepared in 6.2.4 was diluted with SAB, 27.4 mg / ml lysine.

6.2.10 여과후 이들 4 용액들(6.2.6~6.2.9)을 4 개의 250ml 튜브(130g 벌크를 포함) 및 6개의 2ml 튜브(2ml 벌크 포함)에 나누어 넣었다. 총 14개 250ml 튜브와 18개 2ml 튜브.6.2.10 After filtration these four solutions (6.2.6-6.2.9) were divided into four 250 ml tubes (including 130 g bulk) and six 2 ml tubes (including 2 ml bulk). 14 total 250ml tubes and 18 2ml tubes.

이들 3개 용액의 남은 것들은 추가 공정을 수행하였다(제3 단계).The remainder of these three solutions carried out an additional process (third step).

6.2.11 각 용액의 2개 250ml 튜브와 2개 2ml 튜브를 냉동하고 -70℃에서 저장하였다. 6.2.11 Two 250 ml tubes and two 2 ml tubes of each solution were frozen and stored at -70 ° C.

각 용액의 2개의 250ml 튜브와 2개의 2ml 튜브를 -70℃에서 냉동하고 나서 2차 냉동기로 옮겨 -20℃에서 저장하였다. Two 250 ml tubes and two 2 ml tubes of each solution were frozen at −70 ° C. and then transferred to a secondary freezer and stored at −20 ° C.

각 용액의 2 개의 2ml 튜브를 2-8℃에서 저장하였다. Two 2 ml tubes of each solution were stored at 2-8 ° C.

제3 단계(희석 1:100)Third Stage (Dilution 1: 100)

6.2.12 6.2.6에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 5mg/ml 벤질알콜, 12mg/ml 메티오닌으로 희석하였다.6.2.12 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.6 were diluted with 0.3 ml SAB, 5 mg / ml benzyl alcohol, 12 mg / ml methionine.

6.2.13 6.2.6에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 5mg/ml 벤질알콜, 12mg/ml 메티오닌, 50mg/ml 플루로닉으로 희석하였다.6.2.13 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.6 were diluted with 0.3 ml SAB, 5 mg / ml benzyl alcohol, 12 mg / ml methionine, 50 mg / ml pluronic.

6.2.14 6.2.6에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 5mg/ml 벤질알콜, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20으로 희석하였다.6.2.14 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.6 were diluted with 0.3 ml SAB, 5 mg / ml benzyl alcohol, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml Tween 20.

6.2.15 6.2.7에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌으로 희석하였다.6.2.15 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.7 were diluted with 0.3 ml SAB, 31.6 mg / ml arginine, 12 mg / ml methionine.

6.2.16 6.2.7에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌, 50mg/ml 플루로닉으로 희석하였다.6.2.16 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.7 were diluted with 0.3 ml SAB, 31.6 mg / ml arginine, 12 mg / ml methionine, 50 mg / ml pluronic.

6.2.17 6.2.7에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 31.6mg/ml 아르기닌, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20으로 희석하였다.6.2.17 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.7 was diluted with 0.3 ml SAB, 31.6 mg / ml arginine, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml Tween 20.

6.2.18 6.2.8에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌으로 희석하였다.6.2.18 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.8 were diluted with 0.3 ml SAB, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine.

6.2.19 6.2.8에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 플루로닉으로 희석하였다.6.2.19 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.8 were diluted with 0.3 ml SAB, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml pluronic.

6.2.20 6.2.8에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 300mM 만니톨, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20으로 희석하였다.6.2.20 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.8 were diluted with 0.3 ml SAB, 300 mM mannitol, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml Tween 20.

6.2.21 6.2.9에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌으로 희석하였다.6.2.21 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.9 were diluted with 0.3 ml SAB, 27.4 mg / ml lysine, 12 mg / ml methionine.

6.2.22 6.2.9에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌, 50mg/ml 플루로닉으로 희석하였다.6.2.22 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.9 were diluted with 0.3 ml SAB, 27.4 mg / ml lysine, 12 mg / ml methionine, 50 mg / ml pluronic.

6.2.23 6.2.9에서 제조된 용액 29.7ml를 0.3ml SAB, 27.4mg/ml 리신, 12mg/ml 메티오닌, 5mg/ml 트윈 20으로 희석하였다.6.2.23 29.7 ml of the solution prepared in 6.2.9 were diluted with 0.3 ml SAB, 27.4 mg / ml lysine, 12 mg / ml methionine, 5 mg / ml Tween 20.

6.2.24 모든 용액들(6.2.12~6.2.23)을 밀렉스 주사기 구동된 2μ 필터로 별도로 여과하였다.6.2.24 All solutions (6.2.12-6.2.23) were filtered separately with a Millex syringe driven 2μ filter.

6.2.25 상기 용액을 2ml 튜브(각 용액에 대하여 적어도 6개 튜브)에 나누어 넣었다. 6.2.25 The solution was divided into 2 ml tubes (at least 6 tubes for each solution).

6.2.26 각 용액의 2개 2ml 튜브를 냉동하고 -70℃에서 저장하였다. 6.2.26 Two 2 ml tubes of each solution were frozen and stored at -70 ° C.

각 용액의 2개의 2ml 튜브를 -70℃에서 냉동하고 나서 2차 냉동기로 옮겨 -20℃에서 저장하였다. Two 2 ml tubes of each solution were frozen at −70 ° C. and then transferred to a secondary freezer and stored at −20 ° C.

2 개의 2ml 튜브를 2-8℃에서 저장하였다. Two 2 ml tubes were stored at 2-8 ° C.

6.3 벌크 분석 6.3 Bulk Analysis

각 사전제형화 조건으로부터 2-8℃, -70℃ 및 -20℃에서 저장된 하나의 2ml 튜브를 실온에서 2시간 동안 해동한 후 SE-HPLC로 분석하였다. -20℃에서 저장된 샘플들을 해동전에 4시간 동안 -70℃로 되돌렸다. 결과를 표 17에 나타내었다.One 2 ml tube stored at 2-8 ° C., −70 ° C. and −20 ° C. from each preformulation condition was thawed at room temperature for 2 hours and then analyzed by SE-HPLC. Samples stored at −20 ° C. were returned to −70 ° C. for 4 hours prior to thawing. The results are shown in Table 17.

조건 1, 5, 9, 13 및 15(표 1 참조)로부터 -70℃에 저장된 하나의 250ml 튜브를 실온에서 6시간 동안 해동시킨 후 SE-HPLC로 분석하였다. 결과를 표 18에 나타내었다.One 250 ml tube stored at −70 ° C. from conditions 1, 5, 9, 13 and 15 (see Table 1) was thawed for 6 hours at room temperature and analyzed by SE-HPLC. The results are shown in Table 18.

또한, 열해리 연구는 8시간 동안 29℃의 배양온도에서 1F/T 사이클 후 15ml 튜브의 샘플(F/TX1후 250ml 튜브로부터 1ml 샘플)에 대하여 수행하고 SE-HPLC로 분석하였다(결과를 표 19 참조).In addition, thermal dissociation studies were performed on samples of 15 ml tubes (1 ml samples from 250 ml tubes after F / TX1) after 1F / T cycles at a culture temperature of 29 ° C. for 8 hours and analyzed by SE-HPLC (see Table 19 for results). ).

7.0 결과 7.0 results

-70℃, -20℃ 및 2-8℃에서 저장된 Nunc 튜브(0.5ml)에 대한 사전제형화 결과Preformulation results for Nunc tubes (0.5 ml) stored at -70 ° C, -20 ° C and 2-8 ° C 조건Condition 저장 조건Storage condition 2-8℃* 2-8 ℃ * -20℃**-20 ℃ ** -70℃-70 ℃ 모노머 %Monomer% 응집체 %Aggregate% 모노머 %Monomer% 응집체 %Aggregate% 모노머 %Monomer% 응집체 %Aggregate% 1 BA1 BA 98.898.8 1.11.1 97.397.3 0.830.83 97.897.8 0.890.89 2 BA, MET2 BA, MET 9999 0.940.94 97.797.7 0.840.84 98.198.1 0.780.78 3 BA, MET, TW3 BA, MET, TW 98.798.7 0.140.14 98.998.9 0.850.85 99.199.1 0.840.84 4 BA, MET, POL4 BA, MET, POL 98.998.9 1.01.0 97.397.3 0.930.93 98.198.1 0.710.71 5 ARG5 ARG 99.199.1 0.530.53 83.483.4 7.17.1 98.998.9 0.580.58 6 ARG, MET6 ARG, MET 98.998.9 0.520.52 84.684.6 5.15.1 98.898.8 0.660.66 7 ARG, MET, TW7 ARG, MET, TW 98.698.6 0.80.8 97.597.5 2.52.5 9999 0.490.49 8 ARG, MET, POL8 ARG, MET, POL 98.998.9 0.70.7 76.676.6 12.112.1 98.998.9 0.430.43 9 MAN9 MAN 99.999.9 0.050.05 81.281.2 1.31.3 97.897.8 00 10 MAN, MET10 MAN, MET 100100 00 83.583.5 0.970.97 98.298.2 00 11 MAN, MET, TW11 MAN, MET, TW 100100 00 98.198.1 0.260.26 99.999.9 00 12 MAN, MET, POL12 MAN, MET, POL 100100 00 83.383.3 1.11.1 87.587.5 0.680.68 13 50mM 아세테이트 대조군13 50mM Acetate Control 100100 00 80.980.9 2.72.7 8484 0.750.75 14 10mM 아세테이트14 10mM Acetate 100100 00 8989 00 92.492.4 0.820.82 15 LYS15 LYS 99.699.6 00 97.497.4 00 99.699.6 0.080.08 16 LYS, MET16 LYS, MET 99.499.4 00 99.499.4 00 99.499.4 0.030.03 17 LYY, MET, TW17 LYY, MET, TW 99.199.1 0.180.18 99.499.4 0.230.23 99.699.6 0.130.13 18 LYS, MET, POL18 LYS, MET, POL 99.599.5 0.240.24 86.786.7 2.32.3 96.796.7 0.590.59 트윈 20만Twin 20 only -- -- -- -- 99.899.8 0.130.13

* 3주 동안 2-8℃에서 저장됨. ** -70℃에서 냉동 16일동안 -20℃에서 저장 다시 4시간 동안 -70℃로 되돌림. 결과는 두개의 평균값이다.Stored at 2-8 ° C. for 3 weeks. ** Frozen at -70 ° C. Stored at -20 ° C. for 16 days. The result is two mean values.

다른 조합으로 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8 + 부형제를 포함하는 벌크 완충액(BA-벤질알콜, MET-메티오닌, MAN-만니톨, TW-트윈 10, POL-플록사머)Bulk buffer containing 50 mM sodium acetate pH 3.8 + excipient (BA-benzyl alcohol, MET-methionine, MAN-mannitol, TW-twin 10, POL-floxamer) in another combination

8시간 동안 29℃에서 배양(+INC)하거나 하지않고 -70℃에서 저장된 250ml 튜브들에 대한 사전제형화 결과Preformulation results for 250 ml tubes stored at -70 ° C with or without incubation (+ INC) at 29 ° C for 8 hours 조건Condition 벤질 알콜Benzyl alcohol L-Arg HClL-Arg HCl 만니톨Mannitol 리신Lee Sin 플록사머 188Ploxamer 188 트윈 20Twin 20 L-MetL-Met 모노머 %Monomer% 응집체 %Aggregate% 다이머 %Dimer% 1-nunc1-nunc √√ -- -- -- -- -- -- 96.296.2 1.11.1 2.72.7 1-(250ml 튜브)1- (250ml tube) √√ -- -- -- -- -- -- 95.295.2 1.21.2 3.53.5 1-(250ml튜브)+INC1- (250ml tube) + INC √√ -- -- -- -- -- -- 97.697.6 1.081.08 1.31.3 5-nunc5-nunc -- √√ -- -- -- -- -- 98.298.2 0.810.81 1.01.0 5-(250ml 튜브)5- (250ml tube) -- √√ -- -- -- -- -- 98.598.5 0.410.41 1.11.1 5-(250ml 튜브)+INC5- (250ml tube) + INC -- √√ -- -- -- -- -- 99.4699.46 0.580.58 00 9-nunc9-nunc -- √√ -- -- -- -- 97.497.4 00 2.62.6 9-(250ml 튜브)9- (250ml tube) √√ -- -- -- -- 78.178.1 0.520.52 21.421.4 9-(250ml 튜브)+INC9- (250ml Tube) + INC √√ -- -- -- -- 95.195.1 00 4.94.9 13-nunc 대조군13-nunc control -- -- -- -- -- -- -- 82.182.1 1.21.2 16.616.6 13-nunc 대조군 -(250ml 튜브)13-nunc control-(250 ml tube) -- -- -- -- -- -- -- 73.273.2 2.22.2 24.524.5 13 대조군 -(250ml 튜브)+INC13 Control-(250ml Tube) + INC -- -- -- -- -- -- -- 95.195.1 1.121.12 3.83.8 15-nunc15-nunc -- -- -- √√ -- -- -- 99.699.6 0.020.02 0.420.42 15-(250ml 튜브)15- (250ml tube) -- -- -- √√ -- -- -- 99.499.4 0.030.03 0.610.61 15-(250ml 튜브)+INC15- (250ml Tube) + INC -- -- -- √√ -- -- -- 99.999.9 0.110.11 00 트윈 20 NuncTwin 20 Nunc -- -- -- -- -- √√ -- 98.198.1 00 1.841.84 트윈 20 Nunc+INCTwin 20 Nunc + INC -- -- -- -- -- √√ -- 99.899.8 0.040.04 0.130.13

결과는 2개의 평균값이다.The result is two mean values.

1F/T 사이클 후 15ml 튜브들에서의 열해리Thermal dissociation in 15 ml tubes after 1 F / T cycle 첨가제additive 조건Condition 모노머Monomer 다이머Dimer 응집체Aggregate 벤질 알콜 Benzyl alcohol 배양 전Before incubation 94.7694.76 4.084.08 1.171.17 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 97.5897.58 1.341.34 1.081.08 아르기닌 Arginine 배양전Before culture 98.0298.02 1.421.42 0.560.56 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 99.4399.43 00 0.580.58 만니톨 Mannitol 배양 전Before incubation 78.2978.29 21.7221.72 00 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 95.0895.08 4.934.93 00 리신 Lee Sin 배양 전Before incubation 99.399.3 0.620.62 0.090.09 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 99.8999.89 00 0.110.11 트윈 20 Twin 20 배양 전Before incubation 98.1598.15 1.841.84 00 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 99.8299.82 0.130.13 0.040.04 대조군 Control 배양 전Before incubation 73.473.4 24.6724.67 1.931.93 29℃에서 8시간 후After 8 hours at 29 ℃ 95.0995.09 3.793.79 1.121.12

8.0 관찰 8.0 observation

벌크 r-h 인터페론-베타 1a에 부형제를 첨가하는 것은 다이머 및 응집체의 퍼센트를 지속적으로 감소시킨다(그러므로 모노머의 퍼센트를 지속적으로 증가시킨다). 열해리 및 r-h 인터페론 베타에 대한 선택된 부형제의 효과를 비교하면, 약간 더 높은 모노머 준위(더 낮은 다이머 및 응집체 준위)는 부형제의 첨가로 얻을 수 있다. 게다가, 부형제에 의해 안정화된 사전제형화된 제제는 열해리를 더 받을 때(예를 들어 29℃에서 배양) 더 높은 모노머 준위를 나타낸다. Adding excipients to the bulk r-h interferon-beta 1a continually decreases the percentage of dimers and aggregates (and therefore continuously increases the percentage of monomers). Comparing the effects of selected excipients on thermal dissociation and r-h interferon beta, slightly higher monomer levels (lower dimer and aggregate levels) can be obtained with the addition of excipients. In addition, preformulated formulations stabilized by excipients exhibit higher monomer levels when subjected to more thermal dissociation (eg incubation at 29 ° C.).

1. 2ml 튜브1.2ml tube

. 4℃에서 . At 4 ℃

여러가지 조건에서 모노머의 %의 작은 차이들이 얻어지고(최고값 델타 1.3%), 만니톨을 포함하는 샘플들이 가장 높은 모노머 준위(100%)를 갖었다. Under various conditions small differences in% of monomers were obtained (maximum delta 1.3%), and samples containing mannitol had the highest monomer levels (100%).

. -70℃에서 . At -70 ℃

만니톨+트윈 20+메티오닌 조합이 리신보다 약간 더 나았다. The mannitol + twin 20 + methionine combination was slightly better than lysine.

여러 조합에서 모든 안정화제들은 모노머 % ≥ 99를 생산할 수 있다. In many combinations all stabilizers can produce monomer% ≧ 99.

. -70℃에서 그리고 -20℃에서 저장 . Storage at -70 ℃ and at -20 ℃

가장 높은 모노머 %는 리신+트윈 20+메티오닌의 조합으로 얻어졌다. The highest monomer% was obtained with the combination of lysine + twin 20 + methionine.

2. 250ml 튜브2. 250ml tube

. -70℃에서. At -70 ℃

시험된 다른 부형제와 비교하여 올리고머화 준위를 낮추는데 있어 리신에 분명한 장점이 있다. Lysine has a distinct advantage in lowering the oligomerization level compared to other excipients tested.

실시예Example 3: 속도  3: speed 초원심분리Ultracentrifugation , SEC 및 , SEC and DegDeg /Ox / Ox HPLCHPLC 으로 분석된, 벌크 인터페론에 부형제를 첨가함에 따른 인터페론-베타의 안정화Stabilization of Interferon-Beta by Addition of Excipients to Bulk Interferon

1.0 용어풀이/약어 1.0 Glossary / Abbreviation

Agg 응집체(aggregates)Agg aggregates

Dim 다이머Dim dimer

Deg 분해제(Degradant)Deg Degradant

FDF 최종 복용 형태FDF final dosage form

F/T 냉동 및 해동F / T freezing and thawing

r-h IFN-베타 1a CHO 세포로부터의 재조합 인간 인터페론-베타 1a(r-h IFN-베타 1a)r-h IFN-beta 1a recombinant human interferon-beta 1a from CHO cells (r-h IFN-beta 1a)

r-h IFN-베타 FDF r-h IFN-베타 1a 최종 복용 형태(r-h IFN-베타 FDF)r-h IFN-beta FDF r-h IFN-beta 1a final dosage form (r-h IFN-beta FDF)

SE-HPLC 크기 배제 고성능 액상 크로마토그래피SE-HPLC Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography

SAB 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8SAB 50mM Sodium Acetate pH 3.8

Temp. 온도Temp. Temperature

1.0 소개 1.0 Introduction

상기 연구는 안정화된 벌크 인터페론을 제조하기 위하여 SEC-EL 분획으로부터 FDF 저장까지의 제조공정동안 r-h IFN-베타 1a의 올리고머화를 최소화하는데 중점을 두었다. The study focused on minimizing oligomerization of r-h IFN-beta 1a during the manufacturing process from SEC-EL fraction to FDF storage to produce stabilized bulk interferon.

올리고머화의 최소화는 다음에 의해 행해졌다:Minimization of oligomerization was done by:

1) -70℃에서 냉동하기 전에 부형제 및/또는 다른 안정화제를 가지고 벌크를 사전제형화 함1) Preform the bulk with excipients and / or other stabilizers before freezing at -70 ° C.

2) 냉동하고 2-8℃에서 선적하지 않고 부형제 및/또는 다른 안정화제를 가지고 상기 벌크를 사전제형화함2) preform the bulk with excipients and / or other stabilizers without freezing and shipping at 2-8 ° C.

3) 사전제형화하지 않고 냉동되지 않은 r-h IFN 베타 1a 벌크를 2-8℃에서 선적.3) Ship the bulk of r-h IFN beta 1a without preformulation and frozen at 2-8 ° C.

상기 사전제형화된 벌크 샘프를을 SE-HPLC Deg/Ox HPLC와 속도 초원심분리법을 사용하여 분석하였다. SE-HPLC는 단순히 공유성 올리고머를 검출하는데 비해 속도 초원심분리법은 또한 비공유성 올리고머를 정량적 그리고 정성적으로 검출한다. The preformulated bulk samples were analyzed using SE-HPLC Deg / Ox HPLC and rate ultracentrifugation. SE-HPLC merely detects covalent oligomers, whereas rate ultracentrifugation also detects noncovalent oligomers quantitatively and qualitatively.

3.0 목적/범위 3.0 Purpose / Scope

벌크 공정동안 r-h 인터페론 1a의 올리고머화를 최소화하기 위함To minimize oligomerization of r-h interferon 1a during the bulk process

4.0 장치 및 재료 4.0 Devices and Materials

4.14.1 장치Device

0.2μ 필터 장치 P/N MPGL 025 밀리포어0.2μ filter unit P / N MPGL 025 Millipore

-70℃에서 Revco 냉동기Revco freezer at -70 ℃

연동 펌프(Peristaltic pump)Peristaltic pump

250ml 원뿔 원심분리 튜브-코닝250ml Conical Centrifuge Tubes-Corning

1.8ml 크리오튜브-Nunc1.8ml Cryotube-Nunc

4.24.2 재료material

SEL el 2 분획SEL el 2 fractions

D-만니톨 DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421(코드 1.05980, Merck)D-Mannitol DAB, Ph Eur, BP, USP, FCC, E421 (Code 1.05980, Merck)

빙초산 100%(코드 1.00063, Merck)100% glacial acetic acid (code 1.00063, Merck)

소듐 하이드록사이드 10MSodium hydroxide 10M

L-메티오닌(1.05707, Merck)L-Methionine (1.05707, Merck)

L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(코드 1.01544, Merck)L-arginine monohydrochloride (Code 1.01544, Merck)

리신 (코드 1.05701, Merck)Lysine (Code 1.05701, Merck)

5.0 절차 5.0 Procedure

상기 연구는 SEC-EL2 분획으로 수행하였다.The study was performed with SEC-EL2 fractions.

상기 연구의 개요는 도 8에 나타난다.An overview of the study is shown in FIG. 8.

다른 사전제형화 조건은 표 20에 나타난다.Other preformulation conditions are shown in Table 20.

사전제형화 조건Preformulation Conditions 조건Condition L-아르기닌 mg/mlL-arginine mg / ml 만니톨 mMMannitol mM 리신 mg/mlLysine mg / ml L-메티오닌 mg/mlL-Methionine mg / ml 튜브의 수Number of tubes 저장Save 최종 pHFinal pH mg/ml *mg / ml * 1 대조군 1 control -- - - - --- - - 1x 250ml 완전채움 1x 2ml 완전 채움 1x2ml 반 채움 1x 250ml full fill 1x 2ml full fill 1x2ml half fill 2-8℃2-8 ℃ 3.93.9 495 495 1x 250ml 2x 2ml1x 250ml 2x 2ml -70℃-70 ℃ 22 31.631.6 -- -- -- 1x250ml 4x2ml1x250ml 4x2ml -70℃-70 ℃ 3.833.83 420420 33 -- 300300 -- 0.120.12 2x250ml 완전 4x2ml2x250ml full 4x2ml 2-8℃2-8 ℃ 3.923.92 507507 44 -- -- 82.282.2 -- 2x250ml 4x2ml2x250ml 4x2ml -70℃-70 ℃ 3.953.95 437437

* quant HPLC로 실험* Experiment with quant HPLC

6.4 용액의 제조 6.4 Preparation of Solution

실시예 2에 따라 용액을 제조하였다.The solution was prepared according to Example 2.

1. 501. 50 mMmM 소듐 아세테이트 pH 3.8( Sodium acetate pH 3.8 ( SABSAB )의 제조Manufacturing

실시예 2 참조See Example 2

2. 0.5 리터 502. 0.5 liter 50 mMmM 아세테이트 pH 3.8, 63.2mg/ml 아르기닌의 제조 Preparation of acetate pH 3.8, 63.2 mg / ml arginine

a. 0.483kg WFI를 무게재었다.a. Weighed 0.483 kg WFI.

b. 31.6g 아르기닌을 첨가하였다.b. 31.6 g arginine was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 아르기닌을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve arginine.

d. 1.5g 아세트산을 첨가하였다.d. 1.5 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. pH를 측정하면서, 약 0.28ml NaOH 10M을 pH 3.8이 될때까지 첨가하였다.f. While measuring the pH, about 0.28 ml NaOH 10M was added until pH 3.8.

g. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.g. The solution was sampled for conductivity and pH.

h. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.h. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

3. 1 리터 50mM 아세테이트 pH 3.8, 31.6mg/ml 아르기닌의 제조3. Preparation of 1 Liter 50mM Acetate pH 3.8, 31.6mg / ml Arginine

a. 0.986kg WFI를 무게재었다. a. Weighed 0.986 kg WFI.

b. 31.6g 아르기닌을 첨가하였다.b. 31.6 g arginine was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 아르기닌을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve arginine.

d. 3.002g 아세트산을 첨가하였다.d. 3.002 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. pH를 측정하면서, 약 0.56ml NaOH 10M을 pH 3.8이 될때까지 첨가하였다.f. While measuring the pH, about 0.56 ml NaOH 10M was added until pH 3.8.

g. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.g. The solution was sampled for conductivity and pH.

h. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.h. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

4. 1 리터 50mM 아세테이트 pH 4.1, 164.4mg/ml 리신의 제조4. Preparation of 1 Liter 50mM Acetate pH 4.1, 164.4mg / ml Lysine

a. 0.835kg WFI를 무게재었다. a. Weighed 0.835 kg WFI.

b. 164.4g 리신을 첨가하였다.b. 164.4 g lysine was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 리신을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve lysine.

d. 3.002g 아세트산을 첨가하였다.d. 3.002 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. 약 0.56ml NaOH 10M을 pH 4.1이 될때까지 첨가하였다.f. About 0.56 ml NaOH 10M was added until pH 4.1.

g. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.g. The solution was sampled for conductivity and pH.

h. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.h. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

5. 1 리터 50mM 아세테이트 pH 4.0, 82.2mg/ml 리신의 제조 5 . Preparation of 1 Liter 50mM Acetate pH 4.0, 82.2mg / ml Lysine

a. 0.92kg WFI를 무게재었다. a. Weighed 0.92 kg WFI.

b. 82.2g 리신을 첨가하였다.b. 82.2 g lysine was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 리신을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve lysine.

d. 3.002g 아세트산을 첨가하였다.d. 3.002 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. 약 0.56ml NaOH 10M을 pH 4.0이 될때까지 첨가하였다.f. About 0.56 ml NaOH 10M was added until pH 4.0.

g. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.g. The solution was sampled for conductivity and pH.

h. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.h. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

6. 1 리터 50mM 아세테이트 pH 3.8, 600mM 만니톨, 0.24mg/ml 메티오닌의 제조6. Preparation of 1 Liter 50mM Acetate pH 3.8, 600mM Mannitol, 0.24mg / ml Methionine

a. 0.92kg WFI를 무게재었다. a. Weighed 0.92 kg WFI.

b. 110.28g 만니톨을 첨가하였다.b. 110.28 g mannitol was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 만니톨을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve the mannitol.

d. 3.002g 아세트산을 첨가하였다.d. 3.002 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. 0.24g 메티오닌을 첨가하였다.f. 0.24 g methionine was added.

g. 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. g. The solution was mixed for 5 minutes.

h. pH를 측정하면서, 약 0.56ml NaOH 10M을 pH 3.8이 될때까지 첨가하였다.h. While measuring the pH, about 0.56 ml NaOH 10M was added until pH 3.8.

i. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.i. The solution was sampled for conductivity and pH.

j. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.j. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

7. 2 리터 50mM 아세테이트 pH 3.8, 300mM 만니톨, 0.12mg/ml 메티오닌의 제조7. Preparation of 2 Liter 50mM Acetate pH 3.8, 300mM Mannitol, 0.12mg / ml Methionine

a. 1.93kg WFI를 무게재었다. a. Weighed 1.93 kg WFI.

b. 110.28g 만니톨을 첨가하였다.b. 110.28 g mannitol was added.

c. 5분동안 상기 용액을 혼합하여 만니톨을 용해시켰다.c. The solution was mixed for 5 minutes to dissolve the mannitol.

d. 6.006g 아세트산을 첨가하였다.d. 6.006 g acetic acid was added.

e. 상기 용액을 5분동안 혼합하였다.e. The solution was mixed for 5 minutes.

f. 0.24g 메티오닌을 첨가하였다.f. 0.24 g methionine was added.

g. 상기 용액을 5분 동안 혼합하였다. g. The solution was mixed for 5 minutes.

h. pH를 측정하면서, 약 1.12ml NaOH 10M을 pH 3.8이 될때까지 첨가하였다.h. While measuring the pH, about 1.12 ml NaOH 10M was added until pH 3.8.

i. 상기 용액을 전도도 및 pH를 위해 샘플화하였다.i. The solution was sampled for conductivity and pH.

j. 상기 용액을 0.2 마이크로 필터를 통해 여과하였다.j. The solution was filtered through a 0.2 micro filter.

6.1 벌크 사전제형화된 제제 6.1 Bulk Preformulated Formulations

상기 벌크 사전제형화된 제제 및 조성물의 개요는 도 8 및 표 20에 나타난다. 다음은 사전제형화된 제제의 상세한 설명이다. An overview of the bulk preformulated formulations and compositions is shown in FIG. 8 and Table 20. The following is a detailed description of the preformulated formulations.

상기 SEC-EL은 OD280으로 정량하고, 상기 농도는 13.1mg/ml이었다. The SEC-EL was quantified by OD280 and the concentration was 13.1 mg / ml.

제1 단계 (다른 First step (other 완충액으로With buffer 1:1w/w으로 SEC-EL 희석) Dilute SEC-EL to 1: 1w / w)

6.2.1 155g SEC-EL을 155g SAB로 1:1 w/w, 164.4 mg/ml 리신로 희석하였다.6.2.1 155 g SEC-EL was diluted with 155 g SAB 1: 1 w / w, 164.4 mg / ml lysine.

6.2.2 78g SEC-EL을 78g SAB로 1:1 w/w, 63.2mg/ml 아르기닌으로 희석하였다.6.2.2 78 g SEC-EL was diluted with 78 g SAB 1: 1 w / w, 63.2 mg / ml arginine.

6.2.3 220g SEC-EL을 220g SAB로 1:1 w/w, 600mM 만니톨, 0.24mg/ml 메티오닌으로 희석하였다. 6.2.3 220 g SEC-EL was diluted with 220 g SAB 1: 1 w / w, 600 mM mannitol, 0.24 mg / ml methionine.

6.2.4 189g SEC-EL을 306g SAB로 희석하여 0.50mg/ml r-h IFN-베타 1a를 포함하는 용액을 제조하였다. 여과후, 이 용액을 250ml 튜브 및 2ml nunc 튜브로 나누어 넣고 -70℃ 또는 2-8℃에서 저장하고 2-8℃에서 선적하기 위하여 250ml 튜브 를 캡까지 채웠다. 6.2.4 A solution comprising 0.50 mg / ml r-h IFN-beta 1a was prepared by diluting 189 g SEC-EL with 306 g SAB. After filtration, the solution was divided into 250 ml tubes and 2 ml nunc tubes and stored at −70 ° C. or 2-8 ° C. and 250 ml tubes filled up to the cap for shipping at 2-8 ° C.

제2 단계(0.50-0.58 mg/ml r-h 2nd step (0.50-0.58 mg / ml r-h IFNIFN -베타 1a로 최종 벌크 희석)Final bulk dilution with beta 1a)

다음 용액을 제조하였다(목적 농도는 0.5mg/ml r-h IFN-베타 1a)The following solutions were prepared (purpose concentration 0.5 mg / ml r-h IFN-beta 1a)

6.2.5 6.2.1에서 제조된 용액 310g을 90g SAB, 82.4mg/ml 리신으로 희석하였다. 6.2.5 310 g of the solution prepared in 6.2.1 were diluted with 90 g SAB, 82.4 mg / ml lysine.

6.2.6 6.2.2에서 제조된 용액 156g을 48g SAB, 31.6mg/ml 아르기닌으로 희석하였다. 6.2.6 156 g of the solution prepared in 6.2.2 were diluted with 48 g SAB, 31.6 mg / ml arginine.

6.2.7 6.2.3에서 제조된 용액 440g을 132g SAB, 300mM 만니톨, 0.12mg/ml 메티오닌으로 희석하였다. 6.2.7 440 g of the solution prepared in 6.2.3 was diluted with 132 g SAB, 300 mM mannitol, 0.12 mg / ml methionine.

6.2.8 여과후 이들 3개 용액들(6.2.5~6.2.7)을 250ml 튜브 그리고 2ml 튜브(2ml 벌크 포함)에 나누어 넣었다. 6.2.8 After filtration, these three solutions (6.2.5-6.2.7) were divided into 250 ml tubes and 2 ml tubes (including 2 ml bulk).

6.2.9 리신 및 아르기닌을 포함하는 용액의 250ml 튜브 및 2ml 튜브를 냉동하고 -70℃에서 저장하고, 만니톨과 메티오닌을 포함하는 용액을 2-8℃에서 저장하였다(상기 250ml 튜브를 캡까지 채웠다)6.2.9 250 ml tubes and 2 ml tubes of solution containing lysine and arginine were frozen and stored at −70 ° C., and solutions containing mannitol and methionine were stored at 2-8 ° C. (the 250 ml tubes were filled up to the cap)

6.3 사전제형화된 벌크 처리 6.3 Preformed Bulk Processing

-70℃와 2-8℃에서 저장된 샘플들을 속도 초원심 분리법, Deg/Ox HPLC 및 SE-HPLC로 시험하였다.Samples stored at −70 ° C. and 2-8 ° C. were tested by rate ultracentrifugation, Deg / Ox HPLC and SE-HPLC.

7.0 결과 7.0 results

조건Condition L-아르기닌 mg/mlL-arginine mg / ml 리신 mg/mlLysine mg / ml 만니톨 mMMannitol mM Met mg/mlMet mg / ml 저장Save pHpH 모노머 %Monomer% 응집체 %Aggregate% 다이머 %Dimer% DEG/OC HPLCDEG / OC HPLC 1 대조군 SEC- HPLC1 control SEC-HPLC -- -- -- -- -70℃ -70 ℃ 3.9 3.9 77.677.6 1.61.6 20.820.8 1.1 1.1 1 대조군 AUC1 control AUC -- -- -- -- 80.480.4 2.22.2 17.417.4 1 대조군 SEC- HPLC1 control SEC-HPLC -- -- -- -- 2-8℃2-8 ℃ 99.999.9 1.1 1.1 1 대조군 AUC1 control AUC -- -- -- -- 2-8℃2-8 ℃ 9595 2 SEC- HPLC2 SEC-HPLC 31.631.6 -- -- -- -70℃-70 ℃ 3.83 3.83 9999 00 1One 1 One 2 AUC2 AUC 31.631.6 -- -- -- -70℃-70 ℃ 96.696.6 0.70.7 2.72.7 3 SEC- HPLC3 SEC-HPLC -- -- 300300 0.120.12 2-8℃2-8 ℃ 3.92 3.92 99.899.8 0.20.2 00 1.1 1.1 3 AUC3 AUC -- -- 300300 0.120.12 2-8℃2-8 ℃ 9595 0.60.6 4.44.4 4 SEC- HPLC4 SEC-HPLC -- 82.282.2 300300 0.120.12 -70℃-70 ℃ 3.953.95 99.699.6 0.40.4 00 1.1 1.1 4 AUC4 AUC -- 82.282.2 300300 0.120.12 -70℃-70 ℃ 3.953.95 93.893.8 0.60.6 5.65.6

8.0 관찰 8.0 observation

실시예 2에서 얻어진 결과들을 속도 초원심분리법 및 SEC 방법 두가지로 본 연구에서 확인되었다(모노머 % 준위의 차이는 SEC에 의한 공유성 올리고머만을 유사 검출한 것으로 인한 것이다). 게다가 DEG/OX HPLC는 산화된 형태의 준위가 벌크 r-h 인터페론 베타 1a에 부형제를 첨가한 후에 안정하게 유지되는 것으로 나타내었다. The results obtained in Example 2 were confirmed in this study by the rate ultracentrifugation method and the SEC method (the difference in monomer% level was due to the similar detection of only covalent oligomers by SEC). In addition, DEG / OX HPLC showed that levels in oxidized form remained stable after addition of excipients to bulk r-h interferon beta 1a.

실시예Example 4: 부형제를 벌크 인터페론에 여과 전 또는 후의 단계에서 첨가하는 것에 의한 인터페론-베타의 안정화 4: Stabilization of Interferon-Beta by Addition of Excipients to Bulk Interferon in Pre- or Post-filtration Steps

1.0 용어풀이/약어 1.0 Glossary / Abbreviation

Agg 응집체(aggregates)Agg aggregates

COA 분석증COA Assay

Dim 다이머Dim dimer

Deg 분해제(Degradant)Deg Degradant

Deg/Ox-HPLC 분해제 및 산화된 형태에 대한 역상 고성능 액상Reverse phase high performance liquid phase for Deg / Ox-HPLC disintegrant and oxidized form

크로마토그래피Chromatography

F/T 냉동 및 해동F / T freezing and thawing

Quant-HPLC r-h IFN-베타 1a 벌크에서 r-IFNβ 정량 결정을 Quant-HPLC r-h quantitative determination of r-IFNβ in IFN-beta 1a bulk

위한 역상 고성능 액상 크로마토그래피Phase High Performance Liquid Chromatography

r-h IFN-베타 1a CHO 세포로부터의 재조합 인간 인터페론-베타 1a(r-h IFN-베타 1a)r-h IFN-beta 1a recombinant human interferon-beta 1a from CHO cells (r-h IFN-beta 1a)

r-h IFN-베타 FDF r-h IFN-베타 1a 최종 복용 형태(r-h IFN-베타 FDF)r-h IFN-beta FDF r-h IFN-beta 1a final dosage form (r-h IFN-beta FDF)

SE-HPLC 크기 배제 고성능 액상 크로마토그래피 SE-HPLC Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography

Temp. 온도Temp. Temperature

2.0 요약 2.0 Summary

SEC-HPLC 및 속도 초원심분리법 두 가지를 사용하면, 300mM 만니톨로 IFN-베타-1a 벌크를 사전제형(냉동전)화 하는 것은, 벌크 여과전 또는 후에 첨가되고 및 1F/T 및 4F/T 사이클을 따를 때 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화하는 것으로 발견되었다. Using both SEC-HPLC and velocity ultracentrifugation, preformulation (pre-freeze) of IFN-beta-1a bulk with 300 mM mannitol is added before or after bulk filtration and 1F / T and 4F / T cycles. It has been found to minimize covalent and noncovalent oligomers and aggregates when following.

여과 전에 300mM 만니톨 첨가 효과는 올리고머화 준위, 특히 250ml 튜브(r-h IFN-베타 1a 벌크의 일반적인 용기)내의 비공유성 올리고머 및 응집체의 준위를 낮추는데 더욱 크다.The effect of adding 300 mM mannitol prior to filtration is greater in lowering the oligomerization level, especially the levels of non-covalent oligomers and aggregates in 250 ml tubes (typical containers of r-h IFN-beta 1a bulk).

SE-HPLC 및 속도 초원심분리법 모두를 사용하면, 올리고머는 2-8℃에서 저장된 냉동되지않은 r-h IFN-베타 1a 벌크에는 형성되지 않지만 r-h IFN-베타 1a 벌크의 냉동 및 해동 동안에는 형성된다는 것이 밝혀졌다. Using both SE-HPLC and rate ultracentrifugation, it was found that oligomers do not form in unfrozen rh IFN-beta 1a bulk stored at 2-8 ° C., but during freezing and thawing of rh IFN-beta 1a bulk. .

3.0 소개 3.0 Introduction

냉동 해동 사이클 동안 r-h IFN-베타 1a의 올리고머화 및 응집체의 최소화는 원하는 목적이며, 이는 단백질 응집체가 중화항체(neutralizing antibodies)를 생성하도록 하는 면역원성 반응(immunogenic reaction)을 유도할 수 있다는 것으로 알려져 있기 때문이다.Oligomerization of rh IFN-beta 1a and minimization of aggregates during the freeze thaw cycle is a desired goal, which is known to induce an immunogenic reaction that allows protein aggregates to produce neutralizing antibodies. Because.

벌크내 모노머의 준위를 결정하기 위해 현재 사용된 분석방법은 SE-HPLC이다. 속도 초원심분리법을 사용한 예비 결과들은 SE-HPLC가 단지 공유성 올리고머를 검출하는데 비하여 속도 초원심분리법은 또한 비공유성 올리고머를 정량적 그리고 정성적으로 검출할 수 있다는 것을 나타내는 것처럼 보인다(실험 2 참조). 제안된 연구는 SE-HPLC 및 속도 초원심분석법을 분석 방법으로 사용하여 r-h IFN-베타 1a 올리고머화 및 응집면에서 제조 규모에서 만니톨을 가지고 벌크를 사전 제형화하는 효과를 결정하고자 하였다. The analytical method currently used to determine the level of monomers in bulk is SE-HPLC. Preliminary results using rate ultracentrifugation appear to indicate that SE-HPLC can only detect non-covalent oligomers, whereas rate ultracentrifugation can also quantitatively and qualitatively detect non-covalent oligomers (see Experiment 2). The proposed study attempted to determine the effect of pre-formulation of bulk with mannitol on the production scale in terms of r-h IFN-beta 1a oligomerization and aggregation using SE-HPLC and rate ultracentrifuge as analytical methods.

4.1 목적/범위 4.1 Purpose / Scope

4.1.1 만약 비공유성 응집이 SEC 분획에 존재하는지 결정(여과 전 및 냉동전)4.1.1 Determine if non-covalent aggregation exists in SEC fraction (pre-filtration and pre-freezing)

4.1.2 300mM 만니톨이 1F/T 및 4F/T 사이클에 이어서, 벌크 여과 전 또는 후에, 냉동 전에 첨가될 때 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화하는지 결정. 4.1.2 Determine if 300 mM mannitol minimizes covalent and non-covalent oligomers and aggregates when added after 1F / T and 4F / T cycles, before or after bulk filtration and before freezing.

4.1.3 150mM의 만니톨이 1F/T 및 4F/T 사이클에 이어서, 벌크 여과전, 냉동전에 첨가될 때 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화하는지 결정. 4.1.3 Determine if 150 mM mannitol minimizes covalent and non-covalent oligomers and aggregates when added after 1F / T and 4F / T cycles, before bulk filtration and before freezing.

4.1.4 1.8ml 시험 튜브내 비공유성 응집체의 준위가 F/T를 행하는 250ml 튜브의 것과 유사한지 결정4.1.4 Determine if the level of non-covalent aggregates in the 1.8 ml test tube is similar to that of a 250 ml tube doing F / T

5.0 장치 및 재료 5.0 Apparatus and Materials

5.15.1 장치Device

150-500ml Nalgene용 0.2μ 여과장치0.2μ filtration device for 150-500ml Nalgene

5.25.2 재료 material

SEC el 2 분획-800mlSEC el 2 fractions-800 ml

만니톨-Merck P/N 1.05980.9050Mannitol-Merck P / N 1.05980.9050

50mM 아세테이트 완충액 pH 3.8-IPL 코드 S88RD60050 mM acetate buffer pH 3.8-IPL code S88RD600

300mM 만니톨(54.6g 만니톨/liter)로 50mM 아세테이트 완충액 pH 3.850 mM acetate buffer pH 3.8 with 300 mM mannitol (54.6 g mannitol / liter)

600mM 만니톨(109.3g 만니톨/liter)로 50mM 아세테이트 완충액 pH 3.850 mM acetate buffer pH 3.8 with 600 mM mannitol (109.3 g mannitol / liter)

150mM 만니톨(27.3g 만니톨/liter)로 50mM 아세테이트 완충액 pH 3.850 mM acetate buffer pH 3.8 with 150 mM mannitol (27.3 g mannitol / liter)

250ml 원뿔 원심분리 튜브-코닝 P/N 430776250ml Conical Centrifuge Tubes-Corning P / N 430776

1.8ml 크리오튜브(crytube)-Nunc 튜브 P/N 3754181.8ml crytube-Nunc tube P / N 375418

6.0 절차 6.0 Procedure

상기 연구는 단일 SEC el 2 분획으로 수행하였다(OD 280에 따라 농도 1.81mg/ml)The study was performed in a single SEC el 2 fraction (concentration 1.81 mg / ml according to OD 280).

6.16.1 벌크 제조Bulk manufacturing

상기 벌크는 다음과 같이 제조되었다:The bulk was prepared as follows:

(1) SEC (1) SEC el2el2 분획 Fraction

1.8ml 튜브를 속도 초원심분리법을 위해 완전히 채우고 2-8℃에서 선적한다.1.8 ml tubes are fully filled for speed ultracentrifugation and shipped at 2-8 ° C.

(2) 대조군(2) control

180ml SEC el2 을 0.2㎛ 필터를 통해 여과하고 720ml 50mM 아세테이트, pH 3.8로 필터 세척하였다. 상기 벌크를 4개의 250ml 튜브(각 200ml)에 분배하고 -70℃에서 냉동시키기 전에 10개의 1.8ml 크리오튜브에 넣었다. 1.8ml 튜브중 2개는 냉동시키지 않았다. 이들 완전히 채워진 두 개의 튜브중 하나는 속도 초원심분리법 분석전에 2-8℃로 유지하였다.180 ml SEC el2 was filtered through a 0.2 μm filter and filtered washed with 720 ml 50 mM acetate, pH 3.8. The bulk was dispensed into four 250 ml tubes (200 ml each) and placed in ten 1.8 ml cryotubes before freezing at −70 ° C. Two of the 1.8 ml tubes were not frozen. One of these two fully filled tubes was kept at 2-8 ° C. before rate ultracentrifugation analysis.

상기 벌크 농도는 350㎍/ml이었다(quant-HPLC에 따름)The bulk concentration was 350 μg / ml (according to quant-HPLC)

(3) 여과 후 300(3) 300 after filtration mMmM 만니톨Mannitol 첨가 adding

180ml SEC el2를 0.2㎛ 필터를 통해 여과하고, 상기 필터를 180ml 50mM 아세테이트, 600mM 만니톨 pH 3.8 및 540ml의 50mM 아세테이트, 300mM 만니톨, pH-3.8로 세척하였다. 상기 벌크를 -70℃에서 냉동시키기 전에 4개의 250ml 튜브(각 200ml)에 그리고 10개의 1.8ml 크리오튜브에 분배하였다. 상기 1.8ml 튜브중 두개를 냉동시키지 않았다. 완전히 채워진 두 개의 튜브 중 하나를 속도 초원심분리법 분석을 위해 2-8℃로 유지시켰다. 최종 만니톨 농도는 300mM이었다. 상기 벌크 농도는 344㎍/ml이었다(quant-HPLC에 따름)180 ml SEC el2 was filtered through a 0.2 μm filter and the filter was washed with 180 ml 50 mM acetate, 600 mM mannitol pH 3.8 and 540 ml 50 mM acetate, 300 mM mannitol, pH-3.8. The bulk was dispensed into four 250 ml tubes (200 ml each) and ten 1.8 ml cryotubes before freezing at −70 ° C. Two of the 1.8 ml tubes were not frozen. One of the two fully filled tubes was kept at 2-8 ° C. for rate ultracentrifugation analysis. The final mannitol concentration was 300 mM. The bulk concentration was 344 μg / ml (according to quant-HPLC)

(4) (4) 여과전Before filtration 150 150 mMmM 만니톨Mannitol 첨가 adding

200ml SEC el2를 200ml 50mM 아세테이트, 300mM 만니톨과 혼합하고, 이들 혼합물 380ml를 0.2㎛ 필터를 통해 여과하고 상기 필터를 570ml의 50mM아세테이트, 150mM 만니톨, pH-3.8로 세척하였다. 상기 벌크를 -70℃에서 냉동시키기 전에 4개의 250ml 튜브(각 200ml) 그리고 10개의 1.8ml 크리오튜브에 분배하였다. 상기 1.8ml 튜브 중 2개는 냉동시키지 않았다. 이들 완전히 채운 두 개의 필터중 하나를 속도 초원심분리법 분석 전에 2-8℃로 유지시켰다. 최종 만니톨 농도는 150mM이었다. 상기 벌크 농도는 342㎍/ml이었다(quant-HPLC에 따름).200 ml SEC el2 was mixed with 200 ml 50 mM acetate, 300 mM mannitol, 380 ml of these mixtures were filtered through a 0.2 μm filter and the filter was washed with 570 ml of 50 mM acetate, 150 mM mannitol, pH-3.8. The bulk was dispensed into four 250 ml tubes (200 ml each) and ten 1.8 ml cryotubes before freezing at −70 ° C. Two of the 1.8 ml tubes were not frozen. One of these two fully filled filters was maintained at 2-8 ° C. prior to rate ultracentrifugation analysis. The final mannitol concentration was 150 mM. The bulk concentration was 342 μg / ml (according to quant-HPLC).

(5) 여과전 300mM 만니톨 첨가(5) Add 300mM mannitol before filtration

200ml SEC el2를 200ml 50mM 아세테이트, 600mM 만니톨과 혼합하고, 이들 혼합물 380ml를 0.2㎛ 필터를 통해 여과하고 상기 필터를 400ml의 50mM아세테이트, 300mM 만니톨로 세척하였다. 상기 벌크를 -70℃에서 냉동시키기 전에 4개의 250ml 튜브(각 200ml) 그리고 10개의 1.8ml 크리오튜브에 분배하였다. 상기 1.8ml 튜브 중 2개는 냉동시키지 않았다. 이들 완전히 채운 두 개의 필터중 하나를 속도 초원심분리법 분석전에 2-8℃로 유지시켰다. 최종 만니톨 농도는 300mM이었다. 상기 벌크 농도는 342㎍/ml이었다(quant-HPLC에 따름).200 ml SEC el2 was mixed with 200 ml 50 mM acetate, 600 mM mannitol, and 380 ml of these mixtures were filtered through a 0.2 μm filter and the filter was washed with 400 ml of 50 mM acetate, 300 mM mannitol. The bulk was dispensed into four 250 ml tubes (200 ml each) and ten 1.8 ml cryotubes before freezing at −70 ° C. Two of the 1.8 ml tubes were not frozen. One of these two fully filled filters was maintained at 2-8 ° C. prior to the rate ultracentrifuge analysis. The final mannitol concentration was 300 mM. The bulk concentration was 342 μg / ml (according to quant-HPLC).

주의: 상기 SEC 컬럼 용리액을 매 5분마다 교대로 열려진 4개의 전기적으로 제어된 밸브 시스템을 통해 평행하게 4개의 1 리터 유리 병에 수집하였다(LCC500 제어기에 의해 제어 됨). 만니톨을 여과전에 SEC-el 2 분획에 첨가한 경우에, 상기 SEC 분획 및 만니톨 용액(4) 또는 (5)를 SEC 컬럼을 통해 용리중에 유리병 온라인에 부드럽게 혼합하였다. 만니톨을 SEC 여과(3) 후에 첨가한 경우에, 상기 만니톨을 첨가하고 동일한 여과 장치를 통해 여과하였지만 SEC EL2 분획을 수행하지는 않았다. Note: The SEC column eluent was collected in four 1 liter glass bottles in parallel through four electrically controlled valve systems that were opened alternately every 5 minutes (controlled by the LCC500 controller). If mannitol was added to the SEC-el 2 fraction prior to filtration, the SEC fraction and mannitol solution (4) or (5) were gently mixed into the vial online during elution through the SEC column. When mannitol was added after SEC filtration (3), the mannitol was added and filtered through the same filtration apparatus but no SEC EL2 fraction was performed.

6.26.2 냉동 및 해동Freezing and thawing

250ml 튜브의 4F/T 사이클을 적어도 8시간 동안 냉동 그리고 실온에서 7시간 동안 해동하여 수행하였다. 상기 튜브들을 25번 반전(inversions)에 의해 각 해동 사이클 후 혼합하였다. 상기 1.8ml 튜브의 4F/T 사이클을 적어도 8시간 동안 냉동 그리고 2시간 해동을 하여 수행하였다. 상기 튜브는 다음 냉동 사이클전에 20번 반전에 의해 혼합하였다. 각 벌크조건(2-5)로부터, 상기 1F/T 및 4F/T 처리를 한 두개의 냉동된 250ml 튜브 및 두 개의 1.8ml 튜브를 속도 초원심분리법을 위해 유지시켰다. 각 벌크 조건에 대하여 250ml 및 1.8ml의 다른 두 개의 튜브를 해동시키고 SEC-HPLC로 시험하였다. 4F / T cycles of 250 ml tubes were performed by freezing for at least 8 hours and thawing for 7 hours at room temperature. The tubes were mixed after each thawing cycle by 25 inversions. The 4F / T cycle of the 1.8 ml tube was performed by freezing for at least 8 hours and thawing for 2 hours. The tubes were mixed by inversion 20 times before the next freezing cycle. From each bulk condition (2-5), two frozen 250 ml tubes and two 1.8 ml tubes with the 1F / T and 4F / T treatments were maintained for rate ultracentrifugation. For each bulk condition two different tubes of 250 ml and 1.8 ml were thawed and tested by SEC-HPLC.

상기 SE-HPLC 시험 및 속도 초원심분리법을 24시간+/-2 시간동안 해동된 샘플을 가지고 수행하였다. 일차로 만니톨을 해리시킨다.The SE-HPLC test and rate ultracentrifugation were performed with samples thawed for 24 hours +/- 2 hours. Primary dissociate mannitol.

SEC/벌크 배치 당 시험된 샘플의 리스트List of samples tested per SEC / bulk batch 샘플 설명Sample description 튜브내 샘플 부피Sample volume in the tube 시험exam SEC 2-8℃(1)SEC 2-8 ℃ (1) 1.8ml 내 1.8ml1.8ml within 1.8ml 속도 초원심분리법Velocity Ultracentrifugation 벌크 2-8℃(1)Bulk 2-8 ℃ (1) 1.8ml 내 1.8ml 1.8ml 내 0.5ml1.8ml in 1.8ml 0.5ml in 1.8ml 속도 초원심분리법 SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation SE-HPLC 벌크 1F/T(2)Bulk 1F / T (2) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 4F/T(2)Bulk 4F / T (2) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 0.5ml 내 1.8ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 0.5ml 1.8ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과후 첨가) 2-8℃(3)Bulk 300 mM mannitol (added after SEC filtration) 2-8 ° C (3) 1.8ml 내 1.8ml 1.8ml 내 0.5ml1.8ml in 1.8ml 0.5ml in 1.8ml 속도 초원심분리법 SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과후 첨가) 1F/T(3)Bulk 300 mM mannitol (added after SEC filtration) 1F / T (3) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과후 첨가) 4F/T(3)Bulk 300 mM mannitol (added after SEC filtration) 4F / T (3) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 150mM 만니톨(SEC 여과전 첨가) 2-8℃(4)Bulk 150 mM mannitol (added before SEC filtration) 2-8 ° C (4) 1.8ml 내 1.8ml 1.8ml 내 0.5ml1.8ml in 1.8ml 0.5ml in 1.8ml 속도 초원심분리법 SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation SE-HPLC 벌크 150mM 만니톨(SEC 여과전 첨가) 1F/T(4)Bulk 150 mM mannitol (added before SEC filtration) 1F / T (4) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLC QUANT HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC QUANT HPLC 벌크 150mM 만니톨(SEC 여과전 첨가) 4F/T(4)Bulk 150 mM mannitol (added before SEC filtration) 4F / T (4) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과전) 2-8℃(5)Bulk 300 mM mannitol (before SEC filtration) 2-8 ° C (5) 1.8ml 내 1.8ml 1.8ml 내 0.5ml1.8ml in 1.8ml 0.5ml in 1.8ml 속도 초원심분리법 SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과전 첨가) 1F/T(5)Bulk 300 mM mannitol (added before SEC filtration) 1F / T (5) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 300mM 만니톨(SEC 여과전 첨가) 4F/T(5)Bulk 300 mM mannitol (added before SEC filtration) 4F / T (5) 250ml 내 200ml 1.8ml 내 1.8ml 250ml 내 200ml 1.8ml 내 0.5ml250ml 200ml 1.8ml 1.8ml 250ml 250ml 200ml 1.8ml 0.5ml 속도 초원심분리법 속도 초원심분리법 SE-HPLC SE-HPLCVelocity Ultracentrifugation Velocity Ultracentrifugation SE-HPLC SE-HPLC 벌크 완충액(50mM 아세테이트 완충액)Bulk Buffer (50 mM Acetate Buffer) 250ml 내 250ml(5개튜브) 250ml 내 250ml(5개 튜브)250ml (5 tubes) in 250ml 250ml (5 tubes) in 250ml 캠스캔(Chemscan) 플레이트 방법Chemscan Plate Method

주의: 괄호안의 숫자들은 도식을 참조한다. Note: The numbers in parentheses refer to the diagram.

7.0 결과 7.0 results

7.1 SE-HPLC 방법을 사용하여, 1F/T 후에, 모든 세 가지 조건(3,4 및 5)에서 만니톨로 사전제형한 것은 1.8ml 및 250ml 튜브 둘 다의 올리고머화의 준위를 감소시키는데 약간의 영향을 주었다(대조군 샘플에 비하여 ~0.4% 더 높은 순도).7.1 Pre-formulation with mannitol in all three conditions (3, 4 and 5), after 1F / T using the SE-HPLC method, has a slight effect on reducing the level of oligomerization of both 1.8 ml and 250 ml tubes (~ 0.4% higher purity than control sample).

초원심분리방법을 사용하여 1F/T 후에, 모든 3 가지 조건들(3, 4 및 5)은 1.8ml 및 250ml 튜브 둘다의 올리고머화의 준위에 커다란 영향을 주었다. After 1F / T using the ultracentrifugation method, all three conditions (3, 4 and 5) had a significant effect on the level of oligomerization of both 1.8 ml and 250 ml tubes.

250ml 튜브들(표 25)에서, 여과전에 300mM 만니톨 첨가(조건 5)는 여과후에 300mM 만니톨 첨가(조건 3)에 비하여 올리고머화를 낮추는데 더 긍정적인 영향을 주었다. In 250 ml tubes (Table 25), addition of 300 mM mannitol before filtration (condition 5) had a more positive effect on lowering oligomerization compared to 300 mM mannitol addition after filtration (condition 3).

1.8ml 튜브(표 24)에서, 여과후 300mM 만니톨 첨가(조건 3)는 여과전 만니톨 첨가(조건 5)에 비하여 올리고머화를 낮추는더 더 긍정적인 영향을 주었다.In 1.8 ml tubes (Table 24), addition of 300 mM mannitol after filtration (condition 3) had a more positive effect of lowering oligomerization compared to mannitol addition before filtration (condition 5).

7.2 SE-HPLC 방법을 사용하여, 4F/T 사이클(표 26) 후에, 모든 3가지 조건들(3, 4 및 5)에서 만니톨은 1.8ML 튜브에서 올리고머화의 준위에 큰 영향을 주었다(300mM 만니톨로 사전제형할 때 대조군 샘플에 비하여 ~2.6% 더 높은 순도).7.2 Using the SE-HPLC method, after 4F / T cycle (Table 26), mannitol under all three conditions (3, 4 and 5) had a significant effect on the level of oligomerization in 1.8 ml tubes (300 mM mannitol) Pre-formulated with ~ 2.6% higher purity than the control sample).

초원심분리법을 사용하여, 4F/T 사이클후, 모든 3 가지 조건들(3, 4 및 5)에서 만니톨은 1.8ml 및 250ml 튜브 모두에서 올리고머화의 준위에 큰 영향을 주었다. 그러나 긍정적인 효과는 1.8ml 튜브에서 더 지배적이다.Using ultracentrifugation, after 4F / T cycle, mannitol had a significant effect on the level of oligomerization in both 1.8 ml and 250 ml tubes after all 3 conditions (3, 4 and 5). But the positive effect is more dominant in the 1.8 ml tube.

7.3 SE-HPLC 및 초원심분리법에 따라, 2-8℃에서 저장된(냉동되지 않음) 샘플에서 올리고머화는 발생하지 않았다.7.3 According to SE-HPLC and ultracentrifugation, no oligomerization occurred in samples stored at 2-8 ° C. (not frozen).

7.4 SE-HPLC 및 초원심분리법에 따라 올리고머화의 준위는 1.8ml 튜브에 비하여 250ml 튜브에서 더 큰 영향을 나타내었다.7.4 The level of oligomerization by SE-HPLC and ultracentrifugation showed greater effect in 250 ml tubes than in 1.8 ml tubes.

주의: 표 23 내지 표 27에서 괄호의 결과들은 응집체%에 관한 것이다. Note: The results in parentheses in Tables 23-27 relate to% aggregates.

2-8℃에서 저장된 1.8ml 튜브에서 벌크의 순도 %Purity% of bulk in 1.8 ml tubes stored at 2-8 ° C 시험  exam 조건Condition 22 44 33 55 만니톨 없음 대조군No mannitol control 여과전 150mM 만니톨첨가Add 150mM mannitol before filtration 여과후 300mM 만니톨 첨가300 mM mannitol added after filtration 여과전 300mM 만니톨 첨가Add 300mM mannitol before filtration SE-HPLCSE-HPLC 100100 100100 100100 100100 초원심분리법Ultracentrifugation NANA NANA NANA NANA

1F/T 후 1.8ml 튜브에서 벌크의 순도 %Purity of bulk in 1.8 ml tubes after 1F / T 시험  exam 조건Condition 22 44 33 55 만니톨 없음 대조군No mannitol control 여과전 150mM 만니톨첨가Add 150mM mannitol before filtration 여과후 300mM 만니톨 첨가300 mM mannitol added after filtration 여과전 300mM 만니톨 첨가Add 300mM mannitol before filtration SE-HPLCSE-HPLC 99.4(0.5)99.4 (0.5) 99.7(0.1)99.7 (0.1) 99.7(0)99.7 (0) 99.8(0.1)99.8 (0.1) 초원심분리법Ultracentrifugation 84.6(1.1)84.6 (1.1) 88.1(0.5)88.1 (0.5) 96.6(0.1)96.6 (0.1) 94(0.9)94 (0.9)

1F/T 후 250ml 튜브에서 벌크의 순도 %Purity of bulk in 250 ml tubes after 1F / T 시험  exam 조건Condition 22 44 33 55 만니톨 없음 대조군No mannitol control 여과전 150mM 만니톨첨가Add 150mM mannitol before filtration 여과후 300mM 만니톨 첨가300 mM mannitol added after filtration 여과전 300mM 만니톨 첨가Add 300mM mannitol before filtration SE-HPLC SE-HPLC 1*One* 98.5(0.1)98.5 (0.1) 98.6(0.1)98.6 (0.1) 99(0.1)99 (0.1) 98.8(0.1)98.8 (0.1) 2*2* 98.5(0.1)98.5 (0.1) 98.6(0.1)98.6 (0.1) 98.9(0.1)98.9 (0.1) 99(0.1)99 (0.1) 평균Average 98.5(0.1)98.5 (0.1) 98.6(0.1)98.6 (0.1) 98.95(0.1)98.95 (0.1) 98.9(0.15)98.9 (0.15) 초원심분리법Ultracentrifugation 75.8(2.35)75.8 (2.35) 78(2.22)78 (2.22) 80.7(1.05)80.7 (1.05) 86(0.35)86 (0.35)

* 동일한 250ml 튜브로부터 샘플화된 것* Sampled from the same 250 ml tube

4F/T 후 1.8ml 튜브에서 벌크의 순도 %Purity of bulk in 1.8 ml tube after 4F / T 시험  exam 조건Condition 22 44 33 55 만니톨 없음 대조군No mannitol control 여과전 150mM 만니톨첨가Add 150mM mannitol before filtration 여과후 300mM 만니톨 첨가300 mM mannitol added after filtration 여과전 300mM 만니톨 첨가Add 300mM mannitol before filtration SE-HPLC SE-HPLC 1*One* 96.3(1.4)96.3 (1.4) 98.3(0.4)98.3 (0.4) 99(0.3)99 (0.3) 99(0.3)99 (0.3) 2*2* 96.5(1.5)96.5 (1.5) 98.3(0.4)98.3 (0.4) 99.1(0.2)99.1 (0.2) 98.8(0.3)98.8 (0.3) 평균Average 96.4(1.45)96.4 (1.45) 98.3(0.4)98.3 (0.4) 99.05(0.25)99.05 (0.25) 98.9(0.3)98.9 (0.3) 초원심분리법Ultracentrifugation 77(6.8)77 (6.8) 92.7(0.9)92.7 (0.9) 84.6(1.5)84.6 (1.5) 86.1(0.7)86.1 (0.7)

* 별도의 1.8ml 튜브로부터 샘플화된 것* Sampled from a separate 1.8 ml tube

4F/T 후 250ml 튜브에서 벌크의 순도 %Purity of bulk in 250 ml tubes after 4F / T 시험  exam 조건Condition 22 44 33 55 만니톨 없음 대조군No mannitol control 여과전 150mM 만니톨첨가Add 150mM mannitol before filtration 여과후 300mM 만니톨 첨가300 mM mannitol added after filtration 여과전 300mM 만니톨 첨가Add 300mM mannitol before filtration SE-HPLC SE-HPLC 1*One* 94(2.1)94 (2.1) 93.8(0.9)93.8 (0.9) 94.3(1.5)94.3 (1.5) 93.8(1.4)93.8 (1.4) 2*2* 94(2.1)94 (2.1) 93.8(1.0)93.8 (1.0) 94.3(1.5)94.3 (1.5) 93.8(1.5)93.8 (1.5) 평균Average 94(2.1)94 (2.1) 93.8(0.95)93.8 (0.95) 94.3(1.5)94.3 (1.5) 93.8(1.45)93.8 (1.45) 초원심분리법Ultracentrifugation 72(6.29)72 (6.29) 74(4.48)74 (4.48) 76.4(3.63)76.4 (3.63) 76.6(4.01)76.6 (4.01)

* 단일 튜브로부터 샘플화된 것* Sampled from a single tube

8.0 결론 8.0 Conclusion

8.1 SE-HPLC 및 속도 초원심분리방법을 사용하여 300mM 만니톨(냉동전에)로 r-h IFN-베타 1a 벌크를 사전제형한 것은, 1F/T 및 4 F/T에 이어서 벌크 여과전 또는 후에 첨가될 때 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화한다. 그러나 여과전에 300mM 만니톨 첨가효과는 올리고머화의 준위, 특히 250ml 튜브(IFN-베타-1a 벌크의 일반적인 용기)내에서 비공유성 올리고머 및 응집체의 준위를 낮추는데 더욱 상당하다.8.1 Preformulation of rh IFN-beta 1a bulk with 300 mM mannitol (before freezing) using SE-HPLC and velocity ultracentrifugation method, when added before or after 1F / T and 4 F / T followed by bulk filtration Minimize covalent and noncovalent oligomers and aggregates. However, the effect of adding 300 mM mannitol prior to filtration is more significant in lowering the level of oligomerization, especially in non-covalent oligomers and aggregates in 250 ml tubes (typical containers of IFN-beta-1a bulk).

1.8ml 시험 튜브에서 F/T 사이클에 이어서 r-h IFN-베타 1a 올리고머화 및 응집체상에 대한 만티톨로 벌크를 사전제형화한 효과는 250ml 튜브의 것과 유사하다(SE-HPLC로 시험할 때 대조군 샘플에 비하여 약 0.4% 더 높은 순도 그리고 속도 초원심분석법으로 시험할 때 약 13% 더 높음).The effect of preforming the bulk with mantitol on the rh IFN-beta 1a oligomerization and aggregates on the rh IFN-beta 1a oligomerization and aggregates in a 1.8 ml test tube is similar to that of a 250 ml tube (control sample when tested with SE-HPLC). About 0.4% higher purity and rate about 13% higher when tested by ultracentrifuge).

8.2 150mM 농도에서 만니톨의 첨가는 1F/T 및 4F/T 사이클에 이어서 벌크 여과전, 냉동전에 첨가될 때 또한 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화하지만 그 효과는 300mM의 효과에 비할때 그리 크지않다.8.2 Addition of mannitol at a concentration of 150 mM minimizes covalent and non-covalent oligomers and aggregates when added before bulk filtration and freezing following 1F / T and 4F / T cycles, but the effect is not so great when compared to the effect of 300 mM not.

8.3 SE-HPLC 및 속도 초원심분리방법을 사용하면 올리고머는 2-8℃에서 저장된 냉동되지 않은 r-h IFN-베타 1a 벌크 및 SEC-EL에는 형성되지 않는다는 것을 보여준다. 8.3 Using SE-HPLC and rate ultracentrifugation methods, oligomers are not formed in unfrozen r-h IFN-beta 1a bulk and SEC-EL stored at 2-8 ° C.

8.4 속도 초원심분리법을 사용한 일차적인 결과는 SE-HPLC(NEW SEC에 비하여)가 단지 공유성 올리고머를 검출할 수 있는 반면에, 속도 초원심분리법은 또한 비공유성 올리고머를 정성적 그리고 정량적으로 검출할 수 있다는 것을 나타내는 것으로 보인다. 8.4 The primary outcome using rate ultracentrifugation is that SE-HPLC (compared to NEW SEC) can only detect covalent oligomers, while rate ultracentrifugation can also detect qualitatively and quantitatively noncovalent oligomers. Seems to indicate that it can.

F/T 사이클을 수행하지 않은 4℃(또는 2-8℃)에서 저장된 샘플들은 매우 안정하게 남아있다(모노머 % 함량의 형태로). 이러한 원리에 관련되지 않고서도, 냉동/해동 사이클과 같이 분자에 대한 스트레스 효과는 지속적으로 인터페론-베타 올리고머의 형성을 증가시킨다고 믿어진다. 4℃에서 저장된 샘플들에서, 최선의 결과들은 만니톨과 메티오닌의 조합 결국 벤질알콜 또는 트윈 20의 상보적 첨가에 의해 나타나며, 그러므로 2-8℃에서 저장된 샘플에서는 올리고머화가 나타나지 않는다. 바람직하게, 본 방법은 안정화제로서 만니톨과 메티오닌의 조합을 사용하며 벤질알콜과 트윈 20의 추가 첨가도 가능하다. 리신 단독 또는 어떤 조합도 또한 바람직한 부형제로 사용될 수 있다. 몇 몇 부형제들은 F/T 사이클에 의해 발생한 스트레스에 의하여 안정화 활성을 나타낸다. 즉 트윈 20, 벤질알콜 또는 리신(즉, 이들 부형제들은 냉동/해동 스트레스들을 방해하는 것으로 나타난다). 만약 제조과정이 냉동/해동 사이클을 겪는다면 트윈 20, 벤질 알콜 또는 리신과 같은 바람직한 부형제들은 상기 벌크 용액에 첨가되는 것이 바람직하다. 그러므로 F/T 사이클이 제조과정 중에 발생할 때 바람직한 부형제 및 그의 조합들은 또한 확인된다. 본 발명에서 -20℃에서 저장된 샘플들은 많은 F/T 사이클을 받는다(상기 튜브들은 일차로 -70℃에서 냉동되고 16일 동안 -20℃에서 저장하기 위하여 2차 냉동기로 옮긴다. 상기 샘플들은 이후 다시 해동전에 4시간 동안 -70℃로 낮춘다.) 상기에 따라, 트윈 20, 벤질알콜 및 리신은 F/T 사이클과 같은 스트레스가 발생할 때 바람직한 안정화제로 사용된다. 그러한 것처럼, 어떤 저장 온도(-70℃, -20℃ 또는 4℃) 그리고 F/T 사이클 스트레스의 존재에서 트윈 20, 리신 및 벤질알콜 단독 또는 조합들이 벌크 인터페론 용액에서 바람직한 부형제로 사용된다. Samples stored at 4 ° C. (or 2-8 ° C.) without F / T cycles remained very stable (in the form of% monomer content). Regardless of this principle, it is believed that stress effects on molecules, such as freeze / thaw cycles, continuously increase the formation of interferon-beta oligomers. In samples stored at 4 ° C., the best results are shown by the complementary addition of mannitol and methionine and eventually the benzyl alcohol or Tween 20, thus no oligomerization is seen in the sample stored at 2-8 ° C. Preferably, the process uses a combination of mannitol and methionine as stabilizers and further addition of benzyl alcohol and tween 20 is possible. Lysine alone or in any combination may also be used as the preferred excipient. Some excipients exhibit stabilizing activity due to stress caused by the F / T cycle. Ie tween 20, benzyl alcohol or lysine (ie, these excipients appear to interfere with freezing / thawing stress). If the manufacturing process undergoes a freeze / thaw cycle, preferred excipients such as Tween 20, benzyl alcohol or lysine are preferably added to the bulk solution. Therefore, preferred excipients and combinations thereof are also identified when the F / T cycle occurs during the manufacturing process. Samples stored at -20 ° C in the present invention undergo many F / T cycles (the tubes are first frozen at -70 ° C and transferred to a secondary freezer for storage at -20 ° C for 16 days. The samples are then again According to the above, Tween 20, benzyl alcohol and lysine are used as preferred stabilizers when stress such as F / T cycle occurs. As such, tween 20, lysine and benzyl alcohol alone or in combination at certain storage temperatures (−70 ° C., −20 ° C. or 4 ° C.) and in the presence of F / T cycle stress are used as preferred excipients in bulk interferon solutions.

다음 조합들은 특히 바람직하다:The following combinations are particularly preferred:

1. 리신 및 벤질알콜,1. Lysine and benzyl alcohol,

2. 리신 및 트윈 20,2. Lysine & Tween 20,

3. 리신 및 벤질알콜 및 트윈 20, 및3. Lysine & Benzyl Alcohol & Tween 20, and

4. 벤질알콜 및 트윈 20.4. Benzyl Alcohol and Tween 20.

하기 기술된 실시예들은 어떤 저장 온도(-70℃, -20℃ 또는 4℃) 및 F/T 사이클 스트레스의 존재시에 대한 가장 바람직한 것들이다. The examples described below are the most preferred for certain storage temperatures (−70 ° C., −20 ° C. or 4 ° C.) and in the presence of F / T cycle stress.

리신은 -20℃에서뿐만 아니라 4℃ 및 -70℃에서도 모노머% 및 응집체%면에서 매우 좋은 결과를 나타낸다. 리신은 또한 냉동/해동 사이클에 대하여 인터페론-베타를 안정화시킬 수 있는 시험된 아미노산일뿐이다. 그러므로 리신은 F/T 사이클에 대하여 가장 바람직한 부형제이며, F/T 스트레스에 대하여 안정화 활성을 나타내는 다른 두개의 부형제인, 정균제(예를 들어 벤질알콜) 또는 표면활성제(트윈 20)가 필요하지 않다. Lysine shows very good results in terms of monomer% and aggregate% at -20 ° C as well as at 4 ° C and -70 ° C. Lysine is also only a tested amino acid that can stabilize interferon-beta against freeze / thaw cycles. Lysine is therefore the most preferred excipient for the F / T cycle and does not require bacteriostatics (eg benzyl alcohol) or surfactants (Tween 20), two other excipients that exhibit stabilizing activity against F / T stress.

따라서, 사전제형화는 단지 리신 또는 리신과 항산화제(예를 들어 메티오닌)의 조합만을 포함하는 것으로 생각될 수 있다. -20℃에서 최선의 결과는 사실상 리신과 메티오닌의 조합에 의해 얻어진다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 리신과 메티오닌의 조합을 채택하는 것이다. 모노머 퍼센트의 높은 준위는 만니톨, 메티오닌 및 트윈 20(모노머 98.12%)의 조합으로 얻어진다. 벤질알콜 및 메티오닌의 조합은 높은 모노머 퍼센트를 나타낸다(~98%). 그러므로, 벤질알콜 및 메틴오닌의 조합이 바람직하다. 트윈 20이 상기 조합에 더 추가될 수 있으며, 더 높은 모노머 %(~99%)를 준다. 그러므로 벤질알콜, 메티오닌 및 트윈 20의 조합이 더욱 바람직하다. Thus, preformulation may be considered to include only lysine or a combination of lysine and an antioxidant (eg methionine). The best results at -20 ° C are in fact obtained by the combination of lysine and methionine. More preferably, the present invention employs a combination of lysine and methionine. Higher levels of monomer percentage are obtained with a combination of mannitol, methionine and tween 20 (98.12% monomer). Combinations of benzyl alcohol and methionine show high monomer percentages (~ 98%). Therefore, a combination of benzyl alcohol and methionine is preferred. Tween 20 can be further added to the combination, giving higher% monomer (~ 99%). Therefore, a combination of benzyl alcohol, methionine and tween 20 is more preferred.

실험은 제조공정 동안에 두 개의 특정 포인트에서 수행되었다. 여과 전 또는 후에 특정 부형제(예를 들어 만니톨)의 첨가는 올리고머 및 응집체의 형성을 낮춤 및/또는 감소시킨다. SE-HPLC 및 속도 초원심분리방법 두 개를 사용하여, (냉동전) 300mM 만니톨로 r-h IFN-베타 1a 벌크를 사전제형화한 것은, 1F/T 및 4 F/T에 이어서 벌크 여과전 또는 후에 첨가될 때 공유성 및 비공유성 올리고머 및 응집체를 최소화한다. 본 발명은 그러므로 벌크 단백질 제조공정의 특정 포인트에 한정되지만 그러나 사전제형화된 벌크 단백질의 제조 및/또는 저장에 필요한 모든 단계들을 포함한다(예를 들어 안정화 부형제는 벌크 공정 도중에 다른 다중 단계에서 첨가될 수 있다). 결과들은 올리고머화 및 응집의 면에서 큰 차이가 나타나지 않지만, 여과전에 만니톨의 첨가는 더 나은 결과, 특히 250ml 튜브의 비공유성 올리고머 및 응집체의 더 나은 결과를 만든다. 바람직하게는, 만니톨은 그러므로 여과 단계전에 첨가된다. Experiments were performed at two specific points during the manufacturing process. The addition of certain excipients (eg mannitol) before or after filtration lowers and / or reduces the formation of oligomers and aggregates. Pre-formulation of rh IFN-beta 1a bulk with 300 mM mannitol (pre-freeze) using SE-HPLC and two velocity ultracentrifugation methods, before or after bulk filtration followed by 1F / T and 4 F / T Minimize covalent and noncovalent oligomers and aggregates when added. The present invention is therefore limited to specific points in the bulk protein manufacturing process but includes all steps necessary for the preparation and / or storage of the preformulated bulk protein (eg stabilizing excipients may be added in other multiple stages during the bulk process). Can be). The results do not show much difference in terms of oligomerization and aggregation, but the addition of mannitol before filtration produces better results, in particular better results for noncovalent oligomers and aggregates in 250 ml tubes. Preferably, mannitol is therefore added before the filtration step.

마지막으로 상기 실험은 특정 부형제들의 조합 및 열해리가 별도로 수행될 때 얻어진 준위에 비하여 더 높은 모노머 퍼센트를 생성할 수 있다. 이 방법으로, 다이머 및 응집체 준위가 크게 감소하였다. 그러므로, 본 발명은 바람직하게는 부형제 첨가수단에 의한 안정화된 벌크 용액을 열해리와 조합하는 것이다. 열해리는 제조공정의 어떠한 단계에서도 수행될 수 있으며 결코 벌크 공정의 특정 포인트로 제한되어서는 안된다. Finally, the experiment can produce higher monomer percentages compared to the levels obtained when the combination and thermal dissociation of certain excipients are performed separately. In this way, the dimer and aggregate levels were greatly reduced. Therefore, the present invention preferably combines the stabilized bulk solution by means of excipient addition means with thermal dissociation. Thermal dissociation can be performed at any stage of the manufacturing process and should never be limited to any particular point in the bulk process.

실시예 5: pH 4.7에서의 사전제형화 연구Example 5: Preformulation Study at pH 4.7

올리고머화 및 응집체 형성에 대한 pH 영향을 평가하기 위하여, 사전제형화 연구를 pH 4.7에서 수행하였다.In order to assess the pH effect on oligomerization and aggregate formation, preformulation studies were conducted at pH 4.7.

(1) 절차:(1) Procedure:

1. 약 0.5mg/ml에서 첫번째 벌크는 1:1(SEC EL 2 분획 1 부피를 50mM 아세테이트 pH 7.2의 1 부피)로 혼합하여 pH 4.7로 사전제형화하였다. 1. The first bulk at about 0.5 mg / ml was preformulated to pH 4.7 by mixing 1: 1 (1 volume of SEC EL 2 fraction 1 volume of 50 mM acetate pH 7.2).

2. 두 번째 벌크는 1:1 혼합(SEC EL 2 분획 1 부피를 50mM 아세테이트 pH 7.2의 1 부피, NaOH로 적정된 164.4mg/ml의 리신 포함)에 의해 리신 82.2mg/ml을 가지고 pH 4.7에서 사전제형화하였다.2. The second bulk contains 82.2 mg / ml of lysine at pH 4.7 by 1: 1 mixing (1 volume of SEC EL 2 fraction 1 volume of 50 mM acetate pH 7.2, with 164.4 mg / ml lysine titrated with NaOH). Preformulated.

3. 이들 약제는 50mM 아세테이트 pH 3.8에서 0.5mg/ml의 대조군과 그리고 82.2mg/ml 리신을 포함하는 50mM 아세테이트 pH 3.8에서 0.5mg/ml의 사전제형화된 대조군과 비교되었다.3. These agents were compared with a control of 0.5 mg / ml at 50 mM acetate pH 3.8 and a 0.5 mg / ml preformulated control at 50 mM acetate pH 3.8 containing 82.2 mg / ml lysine.

4. 1.8ml 튜브내에서 냉동 해동의 1 사이클 후, 상기 샘플들을 새로운 SEC HPLC 방법으로 시험하였다. 4. After one cycle of freeze thawing in a 1.8 ml tube, the samples were tested by the new SEC HPLC method.

결과result

조건Condition 모노머 %Monomer% 다이머 %Dimer% 응집체 %Aggregate% pH 3.8pH 3.8 81.4181.41 17.9217.92 0.670.67 pH 4.7pH 4.7 99.199.1 0.90.9 00 pH 4.7pH 4.7 99.499.4 0.60.6 00 pH 4.7 + 리신 82.2mg/mlpH 4.7 + Lysine 82.2mg / ml 99.699.6 0.240.24 0.120.12 pH 3.9 + 리신 82.2mg/mlpH 3.9 + lysine 82.2 mg / ml 99.799.7 0.030.03 0.270.27

(2) 결론 (2) conclusion

.pH 4.7에서 사전제형화된 제제는 pH 3.8에서의 사전제형화된 제제에 비하여 응집체의 형성과 올리고머화를 지속적으로 감소시킨다(~81% 모노머에 비하여 ~99% 모노머 및 0% 응집체에 비하여 0.67% 응집체 각각). 그러므로 본 발명의 방법은 pH 4.7에서 수행되는 것이 바람직하다. Preformulated formulations at pH 4.7 continue to reduce aggregate formation and oligomerization compared to preformulated formulations at pH 3.8 (0.67 compared to ~ 99% monomers and 0% aggregates compared to ~ 81% monomers). % Aggregates respectively). Therefore, the method of the present invention is preferably carried out at pH 4.7.

. pH 3.8 또는 pH 4.7에서 리신으로 사전제형화된 제제는 올리고머화를 감소시킨다. pH 4.7에서, 리신의 첨가는 리신 없이 모노머 99.1%에 비하여 99.6%의 모너머를 생성한다. pH3.8에서, 리신의 첨가는 리신 없이 81.41%의 모노머에 비하여 99.7%의 모노머를 생성하여 올리고머화를 감소시키는데 놀라운 효과를 갖는다. 그러므로 리신은 본 발명의 방법에 첨가되는 바람직한 아미노산이다. . Formulations preformulated with lysine at pH 3.8 or pH 4.7 reduce oligomerization. At pH 4.7, the addition of lysine yields 99.6% of monomer compared to 99.1% of the monomer without lysine. At pH3.8, the addition of lysine has a surprising effect in reducing oligomerization by producing 99.7% of monomers compared to 81.41% of monomers without lysine. Lysine is therefore a preferred amino acid added to the method of the present invention.

. pH 4.7과 리신의 첨가로 사전제형화된 제제는 최선의 결과를 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 방법은 pH 4.7에서 부형제로서 리신을 첨가할 때 가장 바람직하다. 가장 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법은 그러므로 열 해리 하면서 pH 4.7에서 벌크 인터페론에 바람직한 부형제를 첨가하는 것이다. . Preformulated formulations with pH 4.7 and the addition of lysine give the best results. Therefore, the process of the present invention is most preferred when adding lysine as excipient at pH 4.7. In the most preferred embodiment, the method of the present invention is therefore the addition of preferred excipients to the bulk interferon at pH 4.7 with thermal dissociation.

실시예 6-분석 방법Example 6 Analytical Methods

본 실시예는 사용된 다른 분석방법을 설명한다. This example illustrates another analysis method used.

크기 배제(SE)-HPLC, New SE-HPLC는 여기서 이후 "new SE-HPLC" 또는 "NEW SEC"를 의미하며, 속도 초원심분리법(AUC)이 재조합 인간 인터페론-베타 1a(r-h IFN-베타 1a 또는 r-h IFNβ -1a)의 '응집체' 및 '올리고머'를 측정하기 위하여 사용되었다. 상기 NEW SE-HPLC 및 AUC 방법은 공유성 및 비공유성 올리고머뿐만 아니라 응집체를 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.Size exclusion (SE) -HPLC, New SE-HPLC, hereafter referred to as "new SE-HPLC" or "NEW SEC", where rate ultracentrifugation (AUC) is used for recombinant human interferon-beta 1a (rh IFN-beta 1a) Or 'aggregates' and 'oligomers' of rh IFNβ-1a). The NEW SE-HPLC and AUC methods can qualitatively and quantitatively detect aggregates as well as covalent and non-covalent oligomers.

a. SE-HPLC-순도 시험a. SE-HPLC-Purity Test

IFN-베타-1a 벌크에서 응집체의 양을 결정하기 위하여 SE-HPLC를 사용한다. SE-HPLC is used to determine the amount of aggregates in the IFN-beta-1a bulk.

절차step

실험할 IFN-β-1a 벌크와 대조군 샘플(PRB) 100㎕ 샘플을 분석하였다. The bulk of IFN-β-1a and 100 μl of control sample (PRB) were analyzed.

다음 용액을 제조한다: 30% ACN(아세토니트릴)/0.2% TFA(트리플루오로아세트산)/H₂OPrepare the following solution: 30% ACN (acetonitrile) /0.2% TFA (trifluoroacetic acid) / H ₂ O

컬럼(프로겔(Progel)-TSK G2000 또는 등가 장치)을 용리액에서, 0.5ml/min의 흐름 속도에서 적어도 1 시간동안 평형시킨다. 한번 안정된 기저선(baseline)이 얻어지면, 100㎕의 샘플들을 주사하고 동용매 구배(isocratic gradient)를 사용하여 0.5ml/min의 흐름속도로 용리한다. 상기 컬럼 프로파일을 214nm에서 UV 검출로 기록한다. 벌크 샘플의 IFN-베타-1a 모노머의 퍼센트를 단백질 피크 통합된 면적으로부터 결정한다. The column (Progel-TSK G2000 or equivalent device) is equilibrated in the eluent for at least 1 hour at a flow rate of 0.5 ml / min. Once a stable baseline is obtained, 100 μl of samples are injected and eluted at a flow rate of 0.5 ml / min using an isocratic gradient. The column profile is recorded by UV detection at 214 nm. The percentage of IFN-beta-1a monomer in the bulk sample is determined from the protein peak integrated area.

상세(specification)Specification

IFN-베타-1a 벌크 샘플의 주요 피크 면적(원래 분자에 대응)은 총 피크 면적의 95%보다 크며, 응집체 1%보다 작다. The major peak area (corresponding to the original molecule) of the IFN-beta-1a bulk sample is greater than 95% of the total peak area and less than 1% of aggregates.

SE-HPLC 시험에 대한 냉동/해동(F/T) 대조군 샘플의 절차Procedure of Freeze / thaw (F / T) Control Samples for SE-HPLC Test

1. -70℃ 냉동기로부터 r-h 인터페론-베타 1a 벌크/배치의 원하는 양을 꺼낸다.1. Remove the desired amount of r-h interferon-beta 1a bulk / batch from the -70 ° C freezer.

2. 커다란 튜브(~200ml)에 대해 6~9 시간, 또는 작은 튜브/앰플(1-15ml)에 대하여 2~4시간 동안 실온에서 해동. (냉동/해동의 제1 사이클)2. Thaw at room temperature for 6-9 hours for large tubes (~ 200 ml) or 2-4 hours for small tubes / ampoules (1-15 ml). (1st cycle of freezing / thawing)

3. 1ml 분량으로 상기 벌크의 원하는 양을 등분한다(큰 튜브의 경우)3. Divide the desired amount of the bulk into 1 ml portions (for large tubes)

4. 적어도 2 시간 동안 -70℃에서 상기 등분량을 냉동.4. Freeze the aliquots at −70 ° C. for at least 2 hours.

5. 단계 2와 4를 3번 이상 반복.5. Repeat steps 2 and 4 three more times.

6. 4번째 해동 사이클 후, 체크를 위해 대조군 샘플의 소량을 희석 완충액으로 0.25mg/ml으로 희석한다. 6. After the fourth thawing cycle, dilute a small amount of control sample to 0.25 mg / ml with dilution buffer for check.

7. 상기 등가분을 -70℃에서 저장하여야만 한다.7. The equivalent must be stored at -70 ° C.

8. SE-HPLC 시험에서 그것을 사용하기 전에 실온에서 2시간 동안 대조군 F/T 등분된 튜브를 해동.8. Thaw control F / T equalized tubes for 2 hours at room temperature before using it in the SE-HPLC test.

b. NEW SE-HPLCb. NEW SE-HPLC

총응집체 함량의 검출은 TSK G2000SWXL 컬럼(TosoHaas) 또는 BioSuite(Waters)에서 수행한다.: 상기 용리는 50mM 소듐 아세테이트 완충액, 50mM NaCl pH 3.8을 사용하여 0.5mL/min 속도로 동용매 모드로 수행한다; 파장은 215nm로 설정된다. 운전시간은 30분이다. r-h IFN-베타 1a 벌크 그 자체(0.35mg/ml)를 포화상으로 컬럼에 주사한다(주사 당 0.2ml)Detection of total aggregate content is carried out on TSK G2000SWXL column (TosoHaas) or BioSuite (Waters): The elution is carried out in cosolvent mode at 0.5 mL / min using 50 mM sodium acetate buffer, 50 mM NaCl pH 3.8; The wavelength is set to 215 nm. The driving time is 30 minutes. r-h IFN-beta 1a bulk itself (0.35 mg / ml) is injected into the column in saturated phase (0.2 ml per injection)

New SE-HPLC 방법의 장치 및 재료Apparatus and Materials of the New SE-HPLC Method

HPLC 시스템: 워터스 얼라이언스(Alliance)HPLC System: Waters Alliance

UV 검출기: 워터스 996 PDA 파장 214nmUV Detector: Waters 996 PDA Wavelength 214nm

자동 샘플러 온도 세팅: 4℃Auto sampler temperature setting: 4 ℃

컬럼 TosoHaas TSK G2000 SWColumn TosoHaas TSK G2000 SW _XLXL

컬럼온도: 실온Column temperature: room temperature

이동상: 50mM NaCl과 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8Mobile phase: 50 mM NaCl and 50 mM Sodium Acetate pH 3.8

2 리터의 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.8 완충액에 5.84g NaCl 해리시켜 제조. 상기 아세테이트 완충액을 아세트산을 WFI에 첨가하고 10M NaOH이 용액으로 pH 3.8까지 적정하여 멸균 용액 장치에서 제조하였다. Prepared by dissociating 5.84 g NaCl in 2 liters of 50 mM sodium acetate pH 3.8 buffer. The acetate buffer was prepared in a sterile solution apparatus by adding acetic acid to WFI and titrating to pH 3.8 with 10M NaOH solution.

흐름 속도: 0.5ml/minFlow rate: 0.5ml / min

용리액: 50mM CH₃COONa-50mM NaCl, pH 3.8Eluent: 50 mM CH ₃ COONa-50 mM NaCl, pH 3.8

활성화 용액: 50mM HCl-50mM NaClActivation solution: 50mM HCl-50mM NaCl

시약:reagent:

아세트, Merck 코드 K31358056Acetic, Merck Code K31358056

NaOH, Merck B197582NaOH, Merck B197582

NaOH 10M 용액NaOH 10M Solution

WFIWFI

NaCl, JT BAKER 코드 3627-07NaCl, JT BAKER Code 3627-07

c. 침강속도 분석법-AUCc. Sedimentation Rate Method-AUC

1. 방법 설명1. Method Description

12mm 광학 경로길이를 갖는 2-채널 활성탄-에폰 센터피스로 샘플을 세포에 부하한다. 상기 센터피스와 사파이어 윈도우(sapphire window)를 세제로 세정하고 물로 흡수시켜 가능한 가장 깨끗한 표면을 갖도록 노력한다. 대응하는 플라시보를 참조 채널(상기 장치는 이중빔 분광광도계와 같은 기능을 한다)에 넣는다. 약품이 부하된 세포들을 AN-50Ti 분석 로터에 넣고, 벡크만 옵티마 XL-I 분석 원심분리기에 넣고, 20℃로 맞추었다. 상기 로터를 3000rpm으로 하고 상기 샘플을 스캔하여(280nm에서, 흡광피크) 적절한 세포 부하를 확실히 하게 하였다. 상기 로터를 최종 운전속도 50000rpm에 맞추고 각 샘플에 대하여 50스캔을 하여 로터 속도에서 기록한다. Samples are loaded into cells with a 2-channel activated carbon-epon centerpiece with a 12 mm optical path length. The center piece and the sapphire window are cleaned with detergent and absorbed with water, trying to have the cleanest surface possible. The corresponding placebo is placed in a reference channel (the device functions like a double beam spectrophotometer). Drug loaded cells were placed in an AN-50Ti assay rotor, placed in a Beckman Optima XL-I assay centrifuge and set to 20 ° C. The rotor was set at 3000 rpm and the sample scanned (at 280 nm, absorbance peak) to ensure proper cell load. Set the rotor to the final running speed of 50000 rpm and make 50 scans for each sample and record at the rotor speed.

데이터를 N.I.H.에서 피터 Schuck가 개발한 (c) 방법을 사용하여 분석하고 분석 프로그램 SEDFIT(버젼 8.7; Schuck, P. (2000). Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophys. J. 78, 1606-1619)으로 수행한다.The data were analyzed and analyzed using NI (H) method developed by Peter Schuck at NIH (Section 8.7; Schuck, P. (2000) .Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modeling.Biophys. J. 78, 1606-1619).

이러한 연구에서, 많은 새로운 데이터들을, 분해능을 증가시키기 위하여 데이터상 대한 확산의 영향을 모형화하면서,침강계수의 분배를 유도하도록 직접적으로 맞추었다. 상기 방법은 확산 계수를, 모든 종들이 전체적으로 동일한 유체동력학 형상(hydrodynamic shape)(구의 것, f/f₀에 대한 마찰계수비로 정의된 형태를 갖음)을 갖는다는 가정을 기초로 침강계수 각각의 값에 대해 확산계수를 할당하는 것으로 이루어진다. 상기 f/f₀ 값들을 변형시켜 각 샘플에 대한 데이터들의 최선의 전체적합도(overall)를 찾는다. 상기 분포는 0.51 최대-에트로피 스므싱(-entropy smoothing)을 사용하여 계산한다.In this study, many new data were directly tailored to induce distribution of sedimentation coefficients, modeling the effect of diffusion on the data to increase resolution. The method calculates the value of each of the sedimentation coefficients based on the assumption that all species have the same hydrodynamic shape (a sphere, having a shape defined as the coefficient of friction to f / f ₀ ). It is to assign a diffusion coefficient to. F / f ₀ The values are modified to find the best overall fit of the data for each sample. The distribution is calculated using 0.51 maximum-entropy smoothing.

2. 분석 파라미터 2. Analysis Parameters

. 로터 타입 8-홀 로터. Rotor type 8-hole rotor

. 로터 속도 50k rpm. Rotor speed 50k rpm

. 센터피스 활성탄 에폰. Center Piece Activated Carbon Epon

. 채널 길이 12mm. Channel length 12mm

. AUC 운전동안 온도 20℃. Temperature 20 ℃ during AUC operation

. 검출 파장 280nm. Detection wavelength 280nm

. 샘플 부피 432 mcl. Sample volume 432 mcl

. 참조군 부피 442mcl. Reference group volume 442mcl

3. 장치 및 소프트웨어 3. Device and Software

분석적 초원심분리법 모델 XL-I(벡커맨 컬터)Analytical ultracentrifugation model XL-I (Beckman Culter)

SEDFIT 버젼 8.70b 소프트웨어(Peter Schuck-National Institues of Health)SEDFIT Version 8.70b Software (Peter Schuck-National Institues of Health)

오리진 버젼 6.03 소프트웨어(벡커만 컬터)Origin Version 6.03 Software (Beckman Culter)

프로테옴(Proteome) Lab XL-A/XL-I 버젼 5.0 소프트웨어(벡커만 컬터)Proteome Lab XL-A / XL-I Version 5.0 Software (Beckman Culter)

d. RP-HPLC-QUANT-HPLC에 의한 IFN-베타-1a 정량d. IFN-beta-1a Quantitation by RP-HPLC-QUANT-HPLC

하기 기술된 역상 방법은 벌크 샘플내 IFN-베타-1a의 정량화를 가능하게 한다..The reversed-phase method described below enables the quantification of IFN-beta-1a in bulk samples.

단백질의 정량화는 C4, Wide-Pore 부틸 5㎛ 컬럼(베이커, Baker)상에서 수행한다; 파장은 214nm로 설정하고 용리는 다음 이동상과 구배를 사용하여 1mL/min에서 수행한다:Quantification of the protein is carried out on a C4, Wide-Pore Butyl 5 μm column (Baker, Baker); The wavelength is set to 214 nm and elution is performed at 1 mL / min using the following mobile phase and gradient:

절차step

시험할 IFN-베타-1a 샘플을 50mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 3.8로 희석하여 50~150㎍의 범위의 농도로 맞춘다.The IFN-beta-1a sample to be tested is diluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 3.8, to a concentration in the range of 50-150 μg.

다음 용액을 제조한다:Prepare the following solution:

용리액 A: H₂O에서 0.1% TFA(물/트리플루오로아세트산 0.1%) Eluent A: 0.1% TFA in H ₂ O (water / trifluoroacetic acid 0.1%)

용리액 B: ACN에서 0.1% TFA(아세토니트릴/트리플루오로아세트산 0.1%) Eluent B: 0.1% TFA (0.1% acetonitrile / trifluoroacetic acid) in ACN

용리액 C: ACN(아세토니트릴) Eluent C: ACN (acetonitrile)

C4 RP-HPLC 컬럼을 일차적으로 용리액 C로 1.0ml/min의 흐름속도로 30분 동안 세척하고 이어서 50% H₂O 및 50% ACN으로 15분 동안 세척하였다. 상기 컬럼을 약 1.0 ml/min의 흐름 속도로 15분 동안 70% 용리액 A 및 30% 용리액 B에서 평형시켰다. The C4 RP-HPLC column was first washed with Eluent C for 30 minutes at a flow rate of 1.0 ml / min followed by 15 minutes with 50% H ₂ O and 50% ACN. The column was equilibrated in 70% Eluent A and 30% Eluent B for 15 minutes at a flow rate of about 1.0 ml / min.

한번 안정한 기저선이 얻어지면, IFN-베타-1a 벌크 샘플, 대조군 샘플 및 교정 곡선(calibration curve) 샘플(PRB, 1.24-19.8㎍)을 연속적으로 주입한다. 각 경우에, 100㎕를 주사하고 교정 커브 1.24㎍ 샘플에 대해서는 20㎕를 주사하였다. 다음 흐름 속도는 1.0ml/min으로 유지한다.Once a stable baseline is obtained, IFN-beta-1a bulk sample, control sample and calibration curve sample (PRB, 1.24-19.8 μg) are injected continuously. In each case, 100 μl was injected and 20 μl was injected for a 1.24 μg calibration curve sample. The next flow rate is kept at 1.0 ml / min.

다음 구배를 사용한다:Use the following gradient:

시간(분)Minutes 용리액 A %Eluent A% 용리액 B %Eluent B% 용리액 C %Eluent C% 00 7070 3030 00 5.05.0 7070 3030 00 6.06.0 5858 4242 00 15.015.0 5757 4343 00 30.030.0 4646 5454 00 35.035.0 4545 5555 00 40.040.0 4040 6060 00 40.140.1 2020 8080 00 45.045.0 2020 8080 00 45.145.1 00 00 100100 50.050.0 00 00 100100 50.150.1 7070 3030 00 65.065.0 7070 3030 00

운전시간 = 65분Operating time = 65 minutes

시험 샘플에서 IFN-베타-1a의 양은 교정 커브 면적의 지수 회귀(logarithmic reagression)로부터 계산한다. The amount of IFN-beta-1a in the test sample is calculated from logarithmic reagression of the calibration curve area.

상세Detail

IFN-베타-1a 벌크는 0.280~0.500mg IFN-베타-1a/ml을 포함한다.IFN-beta-1a bulk contains 0.280-0.500 mg IFN-beta-1a / ml.

e. 역상(RP)-HPLC-DEG/OX에 의한 순도e. Purity by reverse phase (RP) -HPLC-DEG / OX

하기 기술된 역상 방법은 원래 분자와 다르게 용리하는 IFN-베타-1a 산화된 형태의 검출을 가능하게 한다.The reversed-phase method described below enables the detection of IFN-beta-1a oxidized forms that elute differently from the original molecule.

상기 산화된 형태의 정량화는 4℃로 항온된 C4, Supelcosil LC-304 컬럼(Supelco)에서 수행되며; 파장은 208nm로 설정되고 용리액을 1mL/min에서 다음 이동상과 구배를 사용하여 수행한다:Quantification of the oxidized form is carried out on a C4, Supelcosil LC-304 column (Supelco) incubated at 4 ° C; The wavelength is set to 208 nm and the eluate is performed at 1 mL / min using the following mobile phase and gradient:

다음 용액을 제조한다: Prepare the following solution:

용리액 A: 60% H₂O/40%ACN/0.14%HFBA(물60%/아세토니트릴 40%/헵타플루오로부티르산 0.14%) Eluent A: 60% H ₂ O / 40% ACN / 0.14% HFBA (water 60% / acetonitrile 40% / heptafluorobutyric acid 0.14%)

용리액 B: 20% H₂O/80% ACN/0.14% HFBA(물 20%/아세토니트릴 80%/헵타플루오로부티르산 0.14%) Eluent B: 20% H ₂ O / 80% ACN / 0.14% HFBA (water 20% / acetonitrile 80% / heptafluorobutyric acid 0.14%)

용리액 C: 20% H₂O/80% ACN/0.1% TFA(물 20%/아세토니트릴 80%/트리플루오로아세트산 0.1%) Eluent C: 20% H ₂ O / 80% ACN / 0.1% TFA (water 20% / acetonitrile 80% / trifluoroacetic acid 0.1%)

C4 RP-HPLC 컬럼을 70% 용리액 A 그리고 30% 용리액 B로평형시키고, 1ml/min의 흐름속도로 적어도 15분 동안(안정한 기저선이 얻어질 때까지) 세척한다. 120㎕의 샘플들을 주사한다. 시험할 샘플들을 50mM 소듐 아세테이트, pH 3.8로 희석하여 0.250~0.280mg/ml 범위의 농도로 맞춘다.Equilibrate the C4 RP-HPLC column with 70% Eluent A and 30% Eluent B and wash for at least 15 minutes (until a stable baseline is obtained) at a flow rate of 1 ml / min. Inject 120 μL of samples. Samples to be tested are diluted with 50 mM sodium acetate, pH 3.8, to a concentration ranging from 0.250 to 0.280 mg / ml.

다음 구배를 사용한다:Use the following gradient:

시간 (분)Time (min) 용리액 A % Eluent A% 용리액 B %Eluent B% 용리액 C %Eluent C% 00 7070 3030 00 88 7070 3030 00 6161 6262 3838 00 6666 00 100100 00 7171 00 00 100100 7272 7070 3030 00

IFN-베타-1a 벌크 샘플의 퍼센트 순도를 단백질 피크 통합된 면적을 사용하여 계산한다. Percent purity of IFN-beta-1a bulk sample is calculated using protein peak integrated area.

상세Detail

IFN-베타-1a 벌크(원래 분자에 대응)의 주요 피크 면적은 총 피크 면적의 95%보다 크다.The major peak area of IFN-beta-1a bulk (corresponding to the original molecule) is greater than 95% of the total peak area.

f. 세포병변효과 저해 생물학적 분석(cytopathic effect inhibition bioassay-CPE)f. Cytopathic effect inhibition bioassay (CPE)

생물학적 효능(항바이러스 활성)Biological efficacy (antiviral activity)

IFN-베타-1a 벌크의 항바이러스 활성을 세포병변효과(CPE) 저해 생물학적 분석으로 측정한다.Antiviral activity of IFN-beta-1a bulk is determined by cytopathic effect (CPE) inhibition biological assay.

상기 생물학적 활성을 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus)의 세포병변 효과에 대한 세포(WISH 세포-인간 양수 조직 (amniotic tissue))의 IFN-베타 유도된 보호를 기초로한 항바이러스 분석에 의해 측정한다.The biological activity is determined by antiviral analysis based on IFN-beta induced protection of cells (WISH cell-amniotic tissue) against the cytopathic effect of the virus (Vesicular Stomatitis Virus).

인터페론에 대한 생물학적 분석의 원리는 수포성 구내염 바이러스(Vesicular Stomatitis Virus: VSV)와 같은 많은 바이러스가 세포 죽움을 일으켜서 바이탈 ㅅ스케닝(vital staining)에 의해 가시화될 수 있다는 사실을 근거로 한다. The principle of biological analysis for interferon is based on the fact that many viruses, such as Vesicular Stomatitis Virus (VSV), can cause cell death and can be visualized by vital staining.

세포병변효과는 인터페론에 의한 세포 보호를 정량하기 위해 사용될 수 있다. Cytopathic effects can be used to quantify cell protection by interferon.

상기 분석법은, 살아있는 세포들에 의해 포획된 염료 테트라졸륨 염 MTT(디메틸티오테트라졸륨)의 양에 의해 평가된, 세포 죽음의 간접적 측정에 의해 수행된다. 상기 방법은 보호된 세포의 퍼센트 및 적정량(titer)의 통계적 평가를 위한 3 포인트 평행선의 자동 분광광도적 결정(spectrophotometric determination)을 이용한다. The assay is performed by indirect measurement of cell death, assessed by the amount of dye tetrazolium salt MTT (dimethylthiotetrazolium) captured by living cells. The method utilizes an automatic spectrophotometric determination of three point parallels for statistical evaluation of the percentage and titer of protected cells.

절차step

상기 분석법은 마이크로티터(microtiter) 플레이트에서 수행한다. The assay is performed on microtiter plates.

a. 세포배양 배지(MEM/5% FBS) 50㎕를 각 웰에 첨가한다.a. 50 μl of cell culture medium (MEM / 5% FBS) is added to each well.

b. IFN-베타-1a 샘플 또는 표준 용액(60-100 IU hIFN-β/ml) 100㎕를 상기 웰에 첨가하고 플레이트의 열에서 열까지 3개의 1:1.5 단계 희석을 수행한다.b. Add 100 μl of IFN-beta-1a sample or standard solution (60-100 IU hIFN-β / ml) to the wells and perform three 1: 1.5 step dilutions from row to column of the plate.

c. WISH 세포(0.78-0.82 x 10⁶ 세포/ml)의 50㎕의 현탁액을 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 37℃에서 18-20시간 동안 5% CO₂ 습도조절된 인큐베이터에서 배양한다. c. 50 μl of a suspension of WISH cells (0.78-0.82 × 10 ⁶ cells / ml) is added to each well and the plates are incubated in a 5% CO ₂ humidified incubator at 37 ° C. for 18-20 hours.

d. VSV 현탁액을 세포 대조군 웰을 제외하고, MEM/2.5% FBS로 충진된 각 웰에 첨가한다.d. VSV suspension is added to each well filled with MEM / 2.5% FBS, except cell control wells.

e. 상기 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 5% CO₂ 습도조절된 인큐베이터에서 배양한다. e. The plates are incubated at 37 ° C. for 24 hours in a 5% CO ₂ humidified incubator.

f. 도립 현미경으로 다음:f. Inverted microscope then:

(1) 적어도 80%의 세포 손상이 VSV 대조군 열에서 얻어지고(1) at least 80% of cell damage was obtained in the VSV control row and

(2)IFN-β 표준액의 존재하에서 보호의 퍼센트 평균값이 비희석된 용액에 대해서 84%, 1:1.5 희석액에 대해서 45%, 1:3 희석액에 대해서 27%의 범위에 속한다는 것을 확인한 후, (2) After confirming that the percent average value of protection in the presence of IFN-β standard solution is in the range of 84% for undiluted solutions, 45% for 1: 1.5 dilutions, and 27% for 1: 3 dilutions,

상기 배양을 특정 염료 MTT로 염색한다. The culture is stained with the specific dye MTT.

g. 색채의 농도는 592nm에서 자동 분광광도 판독에 의해 결정한다.g. Color density is determined by automatic spectrophotometric reading at 592 nm.

h. IFN-베타-1a 활성을 정량하기 위하여, OD 판독을 컴퓨터 프로그램으로 분석한다(콜롬보 소프트웨어)h. To quantify IFN-beta-1a activity, OD readings are analyzed by computer program (colombo software)

상세Detail

상기 IFN-베타-1a 벌크는 50x10⁶ IU/ml보다 큰 것을 포함한다.The IFN-beta-1a bulk includes greater than 50 × 10 ⁶ IU / ml.

g. g. 전기분무 이온화 질량분석법(Electrospray ionization mass spectrometry electrosprayelectrospray ionisationionisation mass spectrometry-ES-MS)에 의한 탄수화물 지도 작성(Carbohydrate mapping) Carbohydrate mapping by mass spectrometry-ES-MS

Asn-80 잔기에 N-연결된 IFN-베타-1a의 탄수화물 모이어티는 사중극자 질량분광계(quadrupole mass spectrometer)를 사용하여 원래 분자의 ES-MS를 분석한다.The carbohydrate moiety of IFN-beta-1a N-linked to the Asn-80 residue is analyzed for ES-MS of the original molecule using a quadrupole mass spectrometer.

절차step

상기 시험 방법은 다음 단계로 이루어진다:The test method consists of the following steps:

1) IFN-베타-1a 벌크 샘플의 제염(desalting),1) desalting IFN-beta-1a bulk sample,

2) 사중극자 질량분광계를 사용하여 IFN-베타-1a의 원래의 단백당형(glycoform)의 ES-MS 세미-정량 분석(semi-quantitative analysis)2) ES-MS semi-quantitative analysis of the original glycoform of IFN-beta-1a using quadrupole mass spectrometry

원래의 단백당형은 그들의 예상 분자량(21-24kDa의 범위에서, 여기서 단백질 사슬 MW는 20kDa)에 따라 ES-MS 스펙트럼에으로 동정된다. The original protein glycoforms are identified in the ES-MS spectrum according to their expected molecular weight (in the range of 21-24 kDa, where the protein chain MW is 20 kDa).

그 후 상기 단백당형을 그들의 시알리레이션(sialylation)의 준위에 따라(비시알리레에션, 모노시알리레이션화, 디-시알리레이션화, 트리-시알리레이션화) 구릅화하고 그들의 상대적인 % 함량은 그들의 상대적인 피크 높이에 따라 결정한다.The protein glycoforms are then grouped according to the level of their sialylation (bisialialization, mono- sialization, de- sialization, tri- sialization) and their relative% The content is determined by their relative peak heights.

샘플 제염Sample decontamination

약 35㎍의 IFN-베타-1a 샘플(대조군 IFN-베타-1a 샘플 및 벌크 시험 샘플)을 실온에서 아세토니트릴/물/아세트산(40/60/1, v/v)에 대한 투석법(Microcon 10 device, Amicon, 또는 등가 장치)으로 제염한다(약 150㎍ IFN-베타-1a/ml 최종 농도).Approximately 35 μg of IFN-beta-1a sample (control IFN-beta-1a sample and bulk test sample) was dialyzed against acetonitrile / water / acetic acid (40/60/1, v / v) at room temperature (Microcon 10 device, Amicon, or equivalent device) (about 150 μg IFN-beta-1a / ml final concentration).

ESES -MS 분석법-MS method

약 6-10㎕/min으로 설정된 주입 펌프(infusion pump)로 제염된 샘플들을 직접 전기 분무 공급원으로 유입하여 마이크로매스 플랫폼(Micromass Platform) LCZ 단일 사중극자 질량분석기(또는 등가 방법)로 양성 이온화 ES-MS 분석법을 수행한다. Samples decontaminated with an infusion pump set at about 6-10 μl / min were introduced directly into the electrospray source and positively ionized with the Micromass Platform LCZ single quadrupole mass spectrometer (or equivalent method). Perform MS analysis.

상기 질량분석기는 600-2400 Da의 m/z 범위로 미요글로빈(myoglobin)으로 조절하고 다음 세팅을 사용하여 운전한다:The mass spectrometer was adjusted to myoglobin in the m / z range of 600-2400 Da and operated using the following settings:

모세관 전압: 2.5-4.0 KVCapillary Voltage: 2.5-4.0 KV

원뿔 전압(corn voltage): 36VCorn voltage: 36V

공급원 온도: 70-100℃Source temperature: 70-100 ℃

상기 질량 획득(mass acquisition)은 600Da로부터 2400 Da(미요글로빈)까지 그리고 1100에서 2400Da(IFN-베타-1a에 대하여)까지 약 10sec/scan의 전형적인 스캔 속도로 스캐닝하여 수행한다. 다중 하전된 이온들의 질량 스펙트럼 과정 및 탈합성(deconvolution)은 매스 리닉스 소프트웨어(Mass Lynx software 또는 등가 장치)로 수행한다.The mass acquisition is performed by scanning at a typical scan rate of about 10 sec / scan from 600 Da to 2400 Da (miyoglobin) and from 1100 to 2400 Da (for IFN-beta-1a). Mass spectral processes and deconvolution of multiple charged ions are performed with Mass Lynx software or equivalent device.

ESES -MS 결과 해석-MS interpretation of results

대표적인 탈합성된 ES-MS 스펙트럼은 MS 피크(A에서 F로 명명됨)가 하기 표 34에 나타난 것과 같이, 시알리레이션(sialyation)의 정도에 따라 4 개의 주된 단백당형 그룹으로 모아질 수 있는 구별되는 단백당형을 나타낸다.Representative desynthesized ES-MS spectra are distinguished where the MS peak (named A to F) can be grouped into four major protein glycogroup groups depending on the degree of sialyation, as shown in Table 34 below. Protein glycoforms.

IFN-베타-1a의 ES-MS 스펙트럼에서 관찰된 단백당형Protein glycosides observed in the ES-MS spectrum of IFN-beta-1a MS 피크MS peak 단백당형^* Protein sugar ^* 예상 MW (Da)Estimated MW (Da) 시알리레이션 준위Simulation Level FF 2A0S1F2A0S1F 2179321793 비-시알리레이션화Non-Sialization BB 2A1S1F2A1S1F 2208422084 모노-시알리레이션화Mono-Sialization AA 2A2S1F2A2S1F 2237522375 디-시알리레이션화De-Eialization CC 3A2S1F 및/또는 2A2S1F + 1 HexNacHex 반복3A2S1F and / or 2A2S1F + 1 HexNacHex Repeat 2273922739 디-시알리레이션화De-Eialization DD 3A3S1F3A3S1F 2303123031 트리-시알리레이션화Tree-simulation EE 4A3S1F 및/또는 3A3S1F + 1 HexNacHex 반복4A3S1F and / or 3A3S1F + 1 HexNacHex Repeat 2340023400 트리-시알리레이션화Tree-simulation

* 2A = 비안테나리(biantennary) 복합체 형태 올리고당류(oligosaccharide); 3A = 트리안테나리(triantennary) 복합체 형태 올리고당류; 4A = 테트라안테나리 복합체 형태 올리고당류; OS = 비시알리레이션화; 2S = 디-시알레이션화, 3S=트리-시알리레이션화, 1F=푸코실화(fucosylated)2A = biantennary complex form oligosaccharides; 3A = triantennary complex form oligosaccharides; 4A = tetraantennary complex form oligosaccharides; OS = desialization; 2S = de- sialization, 3S = tree-simulation, 1F = fucosylated

4개의 주요 단백당형 각각의 세미-정량적 평가를 다음과 같이 수행하였다:Semi-quantitative evaluation of each of the four major protein glycoforms was performed as follows:

. % 비시알리레이션화된 단백당형: 피크 F의 높이/총 피크의 높이 x 100. % Bisialized Protein Glycoside: Height of Peak F / Height of Total Peak x 100

. % 모노시알리레이션화된 단백당형: 피크 B의 높이/총 피크의 높이 x 100. % Monosialized protein glycoside: height of peak B / height of total peak x 100

. % 디시알리레이션화된 단백당형: 피크 (A+C)의 높이/총 피크의 높이 x 100. % Desialized protein glycoside: height of peak (A + C) / height of total peak x 100

. % 트리시알리레이션화된 단백당형: 피크 (D+E)의 높이/총 피크의 높이 x 100 총 피크의 높이는 피트 A 내지 F의 높이들의 합이다.. % Trisialated Protein Glycoside: Height of Peak (D + E) / Height of Total Peak x 100 The height of the total peak is the sum of the heights of feet A through F.

하나의 터미널 메티오닌이 부족한 N-터미털이 절단된 (2-166aa) 2A2S1F IFN-베타-1a에 대응하는, 약 22244Da(도 SPA-1)에서 표지되지 않은 MS 피크는, IFN-베타-1a의 디시알리레이션화된 단백당형 %의 계산에 고려하지 않으며, 이 불순물의 정도는 별도의 벌크 순도 방출 시험(N-터미털 절단, N-1: NMT 6%)에 의해 제어된다. The unlabeled MS peak at about 22244 Da (FIG. SPA-1), corresponding to (2-166aa) 2A2S1F IFN-beta-1a cleaved with one terminal methionine deficient, (2-166aa), is a dish of IFN-beta-1a. Not taken into account in the calculation of% aliphatic protein glycoform, the extent of this impurity is controlled by a separate bulk purity release test (N-terminal cut, N-1: NMT 6%).

상세Detail

스펙트럼으로 예상된 IFN-베타-1a 프로파일(% 피크 높이)을 확인한다:Confirm the spectrally predicted IFN-beta-1a profile (% peak height):

비-시알리레이션화된 단백당형: 5% 작다Non-Sialized Protein Glycoside: 5% Small

모노-시알리레이션화된 단백당형: 6-30%Mono-Sialylated Protein Glycoside: 6-30%

디-시알리레이션화된 단백당형: 56-81%De- sialized protein glycoside: 56-81%

트리-시알리레이션화된 단백당형: 8-16%Tri-Sialized Protein Glycosaccharide: 8-16%

h. 등전압초점맞추기(h. Equipotential Focusing isoelectricisoelectric focusing- focusing- IEFIEF ))

IFN-베타-1a 아이소폼을 등전압초점맞추기로 분리하고 쿠마시 블루 스테이닝(Coomassie blue staining)으로 가시화하였다. 상기 아이소폼의 pl을 PRB의 것과 비교한다. 상기 pl및 단백당형의 면적을 음영계측(densitotmetry)으로 측정한다.IFN-beta-1a isoforms were separated by isothermal focusing and visualized by Coomassie blue staining. Pl of the isoform is compared to that of PRB. The area of pl and protein glycoform is measured by densitotmetry.

절차step

샘플 제조:Sample manufacture:

IFN-베타-1a 샘플을 원심분리 마이크로센트레이터 장치(centrifugal microcentrator unit)를 사용하여 0.7-1.0mg/ml로 농축한다. IFN-beta-1a samples are concentrated to 0.7-1.0 mg / ml using a centrifugal microcentrator unit.

겔 제조 및 Gel preparation and 등전압촛점맞추기Equipotential Focusing

IEF 5% 아크릴아미드 겔을 제조하고 캐스팅(casting) 후 세척하여 모든 중합되지 않은 아크릴아미드를 제거한다. 상기 겔을 양성전해질(ampholytes)(2% 최종, pH 3-10 범위), 10mM 글루탐산, 10mM 리신 및 3% 글리세롤로 재구성하고, 수직 전기영동장치에 넣고 15℃로 냉각한다. An IEF 5% acrylamide gel is prepared and washed after casting to remove all unpolymerized acrylamide. The gel is reconstituted with ampholytes (2% final, pH 3-10 range), 10 mM glutamic acid, 10 mM lysine and 3% glycerol, placed in a vertical electrophoresis and cooled to 15 ° C.

상기 겔을 60분 동안 질소 기류하에서 이산화탄소 트랩(0.1M NaOH)의 존재하에서 1W 전력으로 사전촛점을 맞춘다. The gel is prefocused at 1 W power in the presence of a carbon dioxide trap (0.1 M NaOH) under a stream of nitrogen for 60 minutes.

약 3.5㎍의 벌크 IFN-베타-1a, 6㎍의 시토크롬 c(Cytochrome c) 및 적당한 pl 표준액을 상기 겔의 표면에 적하(5㎕)한다.About 3.5 μg of bulk IFN-beta-1a, 6 μg of Cytochrome c and the appropriate pl standard solution are added dropwise (5 μl) to the surface of the gel.

상기 IEF 겔을 10℃, 8000V-시간에서 촛점맞춘다.The IEF gel is focused at 10 ° C., 8000 V-hours.

상기 겔을 30-35분 동안 20%(w/v) TCA로 고정하고, 뉴호프(Neuhoff) 등(Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W., Improved staining of proteins in polyarylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Cooomassie Brilliant Blue G-250 and R-250, Electrophoresis, 1988:9:255-262)의 콜로이드성 절차를 사용하여 쿠마시 블루로 염색한다.The gel was fixed in 20% (w / v) TCA for 30-35 minutes and Neuhoff et al. (Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W., Improved staining of proteins in polyarylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Cooomassie Brilliant Blue G-250 and R-250, Electrophoresis, 1988: 9: 255-262.

IFN-베타-1a 아이소폼의 정량 및 pl 결정은 자동 음영계측기(Computing Densitometer, Molecular Dynamics, USA, supplied with an ImageQuant 3.3 program and other specialized softwares needed for integration/calculation of results; or equivalent equipment)를 사용하여 행한다.Quantification and pl determination of IFN-beta-1a isoforms was carried out using a Computing Densitometer, Molecular Dynamics, USA, supplied with an ImageQuant 3.3 program and other specialized softwares needed for integration / calculation of results; or equivalent equipment. Do it.

상세Detail

상기 시험 샘플로 얻어진 전기영동도는 참조 하우스 표준액으로 얻어진 것과 유사하다:The electrophoresis obtained with the test sample is similar to that obtained with reference house standards:

1. 얻어진 전기영동도는 3개의 주요 밴드 집단으로 이루어지며, 총 5-10 밴드(부하시 밴드는 제외)를 포함하고 상기 참조 표준액으로 얻어진 밴드 패턴을 확인한다.1. The resulting electrophoresis consists of three major band groups, including a total of 5-10 bands (except on load band) and confirming the band pattern obtained with the reference standard solution.

2. 음영계측기에 의해 분석된, 5개의 주된 밴드는 표 32에 나타난 그룹 한계 내에 속해야 한다. 2. The five major bands analyzed by the shader must fall within the group limits shown in Table 32.

아이소폼의 상세, 전기 촛점맞추기Isoform details, electric focusing 그룹 번호Group number plpl 총 면적 %Total area% 1One 8.8-9.28.8-9.2 8-278-27 22 8.4-8.78.4-8.7 47-7247-72 33 7.7-8.17.7-8.1 11-3411-34

참조문헌Reference

1. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547   1. Derynk R. et al., Nature 1980; 285, 542-547

2. Familletti, P.C., Rubinstein, S., and Pestka S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon", in Methods in Enzymology, Vol. 78(S.Pestka ed.), Academic Press, New York, 387-394;2. Familletti, P.C., Rubinstein, S., and Pestka S. 1981 "A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon", in Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka ed.), Academic Press, New York, 387-394;

3. Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81(18)5662-5666(1984).3. Mark D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81 (18) 5662-5666 (1984).

4. Pestka S.(1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka ed.), Academic Press, New York 119, 14-23.4. Pestka S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka ed.), Academic Press, New York 119, 14-23.

5. Rubinstein, S., Familletti, P.C., and Pestka S. Convenient Assay for Interferons J. Virol 1981; 37, 755-758.5. Rubinstein, S., Familletti, P.C., and Pestka S. Convenient Assay for Interferons J. Virol 1981; 37, 755-758.

6. Shepard H.M. et al., Nature 1981; 294, 563-5656. Shepard H.M. et al., Nature 1981; 294, 563-565

본 발명은 일반적으로 완충용액에 모노머릭 단백질(monomeric protein) 벌크(bulk)를 넣고 상기 벌크 용액에 특정 부형제(excipient)를 첨가여 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액를 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention generally relates to a method of preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein by adding a monomeric protein bulk to a buffer and adding a specific excipient to the bulk solution.

Claims (44)

모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액을 제조하는 방법에 있어서, In the method for preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein, 상기 방법이The above method a) 완충용액에 벌크의 모노머릭 단백질을 제공하는 단계, 및a) providing bulk monomeric protein in a buffer, and b) 상기 벌크 용액에 부형제를 첨가하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 부형제들이 다음 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법:b) adding an excipient to said bulk solution, wherein said excipients are selected from the following group: i) 정균제(bacteriostatic agent),i) bacteriostatic agents, ii) 표면활성제ii) surfactants iii) 등장제(isotonicity agent)iii) isotonicity agent iv) 아미노산iv) amino acids v) 항산화제v) antioxidants vi) 등장제와 항산화제vi) isotonic and antioxidant vii) 등장제, 항산화제 및 아미노산vii) isotonic agents, antioxidants and amino acids viii) 아미노산 및 항산화제viii) amino acids and antioxidants ix) 아미노산, 항산화제 및 표면활성제ix) amino acids, antioxidants and surfactants x) 정균제 및 항산화제, 및x) bacteriostatic and antioxidant agents, and xi) 정균제, 항산화제 및 표면활성제.xi) bacteriostatics, antioxidants and surfactants. 제1항에 있어서, 상기 모노머릭 단백질이 인터페론인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the monomeric protein is interferon. 제2항에 있어서, 상기 인터페론이 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 2, wherein the interferon is IFN-beta. 제3항에 있어서, 상기 IFN-베타가 재조합 인간 IFN-베타인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 3, wherein the IFN-beta is recombinant human IFN-beta. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 응집에 대하여 안정한 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the protein is stable against aggregation. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 올리고머화에 대하여 안정한 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the protein is stable against oligomerization. 제1항에 있어서, 상기 정균제가 벤질알콜인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the bacteriostatic agent is benzyl alcohol. 제1항에 있어서, 상기 표면활성제가 트윈 20인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the surfactant is Tween 20. 제1항에 있어서, 상기 등장제가 만니톨인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the isotonic agent is mannitol. 제1항에 있어서, 아미노산이 리신 또는 아르기닌인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method for preparing a stabilized bulk solution of monomeric protein according to claim 1, wherein the amino acid is lysine or arginine. 제1항에 있어서, 상기 항산화제가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the antioxidant is methionine. 제1항에 있어서, 상기 등장제가 만니톨이고 상기 항산화제가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the isotonic agent is mannitol and the antioxidant is methionine. 제1항에 있어서, 상기 등장제가 만니톨, 상기 항산화제가 메티오닌 및 상기 아미노산이 리신인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the isotonic agent is mannitol, the antioxidant is methionine, and the amino acid is lysine. 제1항에 있어서, 상기 아미노산이 리신이고 상기 항산화제가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the amino acid is lysine and the antioxidant is methionine. 제1항에 있어서, 상기 아미노산이 리신, 상기 항산화제가 메티오닌이고 상기 표면활성제가 트윈 20인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the amino acid is lysine, the antioxidant is methionine, and the surface active agent is Tween 20. 제1항에 있어서, 상기 정균제가 벤질알콜이고 상기 항산화제가 메티오닌인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the bacteriostatic agent is benzyl alcohol and the antioxidant is methionine. 제1항에 있어서, 상기 정균제가 벤질알콜, 상기 항산화제가 메티오닌 그리고 상기 표면활성제가 트윈 20인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the bacteriostatic agent is benzyl alcohol, the antioxidant is methionine, and the surface active agent is Tween 20. 제1항에 있어서 상기 벌크 단백질을 27~31℃의 온도범위에서 배양시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법 The method of claim 1, further comprising the step of culturing the bulk protein at a temperature range of 27 ~ 31 ℃. 제18항에 있어서, 상기 온도가 29℃인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 18, wherein the temperature is 29 ℃. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 배양이 제1항의 사전제형화 단계 후 또는 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제 조방법20. The method of claim 18 or 19, wherein said culturing is carried out after or before the preformulation step of claim 1. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양이 적어도 3시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법21. The method of claim 18, 19 or 20, wherein said culturing is carried out for at least 3 hours. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양이 6시간 내지 40시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법21. The method of claim 18, 19 or 20, wherein the culturing is carried out for 6 to 40 hours. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양이 15시간 내지 30시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.21. The method of claim 18, 19 or 20, wherein said culturing is carried out for 15 to 30 hours. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양이 16, 18.5 또는 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.21. The method of claim 18, 19 or 20, wherein said culturing is carried out for 16, 18.5 or 24 hours. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 배양이 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.21. The method of claim 18, 19 or 20, wherein said culturing is carried out for 24 hours. 제1항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서, 상기 IFN이 pH 3.0~6.0의 범위로 유지되는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법26. The method of claim 1, wherein said IFN is maintained in the range of pH 3.0-6.0. 제26항에 있어서, 상기 pH가 4.7인 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.27. The method of claim 26, wherein said pH is 4.7. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IFN이 약 10~2000㎍/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the IFN is present at a concentration of about 10-2000 μg / ml. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IFN이 500 또는 810㎍/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법The method of claim 1, wherein the IFN is present at a concentration of 500 or 810 μg / ml. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이 5mM 내지 500mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.30. The method of any one of claims 1 to 29, wherein said buffer is present at a concentration of 5 mM to 500 mM. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이 10mM 또는 50mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.31. The method of claim 1, wherein the buffer is present at a concentration of 10 mM or 50 mM. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등장제가 0.5mg/ml~500mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법32. The method of claim 1, wherein the isotonic agent is present at a concentration of 0.5 mg / ml to 500 mg / ml. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 등장제가 55mg/ml 또는 150mM 또는 300mM 또는 600mM의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법33. The method of claim 1, wherein the isotonic agent is present at a concentration of 55 mg / ml or 150 mM or 300 mM or 600 mM. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트윈 20이 0.01mg/ml~10mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.34. The method of any of claims 1 to 33, wherein the Tween 20 is present at a concentration of 0.01 mg / ml to 10 mg / ml. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트윈 20이 0.5mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.35. The method of any of claims 1 to 34, wherein the Tween 20 is present at a concentration of 0.5 mg / ml. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제가 0.01mg/ml~5.0mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.36. The method of any of claims 1 to 35, wherein the antioxidant is present at a concentration of 0.01 mg / ml to 5.0 mg / ml. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항산화제가 0.12mg/ml~0.24mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.37. The method of any of claims 1 to 36, wherein the antioxidant is present at a concentration of 0.12 mg / ml-0.24 mg / ml. 제1항 내지 37항중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산이 20mg/ml~200mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.38. The method of any of claims 1 to 37, wherein said amino acid is present at a concentration of 20 mg / ml to 200 mg / ml. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리신이 27mg/ml 또는 55mg/ml 또는 82mg/ml 또는 164mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.39. The stabilized bulk solution of monomeric protein according to any one of claims 1 to 38, wherein the lysine is present at a concentration of 27 mg / ml or 55 mg / ml or 82 mg / ml or 164 mg / ml. Manufacturing method. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아르기닌이 32mg/ml 또는 63mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.30. The method of any of claims 1 to 29, wherein the arginine is present at a concentration of 32 mg / ml or 63 mg / ml. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에서 있어서, 상기 정균제가 0.01mg/ml~200mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.41. The method according to any one of claims 1 to 40, wherein the bacteriostatic agent is present at a concentration of 0.01 mg / ml to 200 mg / ml. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정균제가 5mg/ml 또는 10mg/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 모노머릭 단백질의 안정화된 벌크 용액의 제조방법.42. The method according to any one of claims 1 to 41, wherein the bacteriostatic agent is present at a concentration of 5 mg / ml or 10 mg / ml. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 하는 사전제형화된 벌크 단백질.43. A preformulated bulk protein, obtained by the method of any one of claims 1-42. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 단백질 벌크의 사전제형화 방법을 포함하는 모노머릭 단백질의 안정성을 증가 및/또는 유지시키는 방법.43. A method of increasing and / or maintaining the stability of a monomeric protein comprising the method of preformulating the protein bulk of any one of claims 1-42.

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