KR20070022710A - 클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치료 동안 환자에서 자살 또는 자기파괴 행동의 가능성을 예측하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 도파민 수송체 유전자 (SLC6A3)의 3'-UTR에서 VNTR 다형성 검출을 이용한다. 9개 이하의 반복 서열을 갖는 환자는 클로자핀에 대한 저반응군으로 간주된다. SLC6A3 유전자에서 9개 이하의 반복 서열은 SLC6A3 유전자의 불량한 발현과 상호 관련되었다. 또한 상기 다형성 또는 그의 대리 마커의 존재 또는 부재에 기초한 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트를 또한 제공한다.

클로자핀, 정신분열병, 분열정동, 자살, 생물학적 마커, 예측 방법, 치료 방법, 키트

Description

클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 바이오마커 {BIOMARKERS FOR THE PREDICTION OF RESPONSIVENESS TO CLOZAPINE TREATMENT}

본 발명은 일반적으로 생물학적 샘플의 시험관내 분석, 보다 특히 클로자핀 투여에 대한 반응성 바이오마커 (biomaker)에 대한 환자 샘플의 분석에 관한 것이다.

정신분열병은 뇌의 다수 영역에 걸친 정신 장애를 특징으로 하는 가장 심각한 정신 질환 중 하나이다 [Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003)]. 자살 또는 자살 시도는 일반적인 인구집단보다 정신분열병 집단에서 유의하게 더 큰 비율로 발생하고, 이들 환자의 사망 원인의 약 10％에 해당한다. 정신분열병에서 자살에 대한 위험 인자는 유전 및 환경 인자를 포함하여 복합적이다. 유전 인자와 환경 인자 사이의 상호작용이 또한 보고되었다 [Caspi A et al., Science 301(5631): 386-9 (2003)]. 많은 연구에서 유전 성분이 위험의 약 70％의 원인일 수 있음을 제안하였다 [Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003)]. 그러나, 정신분열병은 단일유전자성인 것으로 보이지 않고, 병에 대한 연계가 복제되는 많은 염색체 좌위가 존재한다. 세로토닌 수용체 및 도파민 수송체 (transporter)와 같은 유전자에서 몇몇 단일-뉴클레오티드 다형성이 정신분열병 에 대한 감수성 증가와 연관되었다. 흥미롭게도, 이들 다형성은 또한 약물 반응에 영향을 미치는 것으로 보였다.

최근 임상 연구에서는 비전형 항정신병약 클로자핀 (클로자릴 (CLOZARIL)(등록상표) 또는 레포넥스 (LEPONEX)(등록상표), 노바티스 파마슈티칼 코포레이션 (Novartis Pharmaceutical Corporation), 미국 뉴저지주 이스트 하노버)이 정신분열병 및 관련 정신 질환 분열정동장애 환자에서 자살률을 극적으로 감소시킬 수 있음을 보여주었다 [Meltzer et al., Arch. Gen. Psychiatry, 60: 82-91 (2003); PCT 특허 출원 공개 WO 2004/074513]. 2년간의 국제적인 다기관 무작위배정 연구에서 자살 위험이 큰 것으로 고려되는 환자에서 클로자핀 대 올란자핀으로 치료받은 환자에서 자살 행동에 대한 위험을 비교하였다 [Meltzer HY, J. Clin. Psychiatry 60 Suppl 12: 47-50 (1999)); Meltzer HY et al., Arch. Gen. Psychiatry 60(1): 82-91 (2003); Potkin SG et al., Biol. Psychiatry 54(4):444-52 (2003); Vandenbergh DJ et al., Genomics 14(4):1104 (1992); Grunhage F et al., Mol. Psychiatry 5(3): 275 (2000)]. 상기 연구에서는 자살 행동, 예를 들어 자살 시도, 자살 생각으로 인한 입원, 구조 개입에 대한 필요, 항우울제, 항불안약 또는 수면제를 사용하는 동시 치료의 요구가 모두 클로자핀으로 치료된 환자에서 유의하게 더 적은 것으로 결론지었다.

자살경향성을 감소시키는 가장 가능한 메카니즘은 클로자핀의 뛰어난 항정신병 효능 및 고유한 항우울 활성이다. 2002년 12월에, 미식품의약국 (U.S. Food and Drug Administration (FDA))에서는 클로자핀 (클로자릴(등록상표))을 만성 위 험이 있는 정신분열병 또는 분열정동장애 환자에서 반복 자살 행동의 치료를 위해 승인하였다. 클로자릴(등록상표)은 상기 용도로 승인된 최초 의약품이다. 더욱이, 클로자릴(등록상표)/레포넥스(등록상표)는 인지 기능을 개선할 수 있는 것으로 나타났다.

그러나, 주어진 환자에서 자살 행동의 가능성을 정확하게 예측하는 것이 어렵고 종종 착오를 일으키는 경향이 있다. 클로자핀 치료에 대한 반응에서 개체간 변동은 유의하다. 모든 환자에게 클로자핀이 유익한 것은 아니다. 일부는 치료에 불리하게 반응하는 한편, 다른 일부는 적절하게 반응하지 못한다. 광범위한 상이한 약물 클래스의 이용가능성에도 불구하고, 약 30 내지 50％의 환자가 표준 정신 의약의 초기 선택에 무관하게 급성 치료에 충분하게 반응하지 않았다 [Freedman R, N. Engl. J. Med. 349(18): 1738-49 (2003); Meltzer HY, Ann. N.Y. Acad. Sci. 932: 44-58; discussion 58-60; (2001)]. 또한, 과거에는 상기 행동의 예측을 도울 수 있는 객관적인 시험이 존재하지 않았다. 현재 이들 병이 심한 환자에서 자살 위험을 감소시키는데 보다 효과적인 것으로 증명된 의약을 보유하여, 의사가 자살 또는 자기파괴 행동 가능성을 예측하기 위한 객관적이고 신뢰성있는 수단을 갖는 것이 훨씬 더 중요하게 되었다. 약물 반응의 기초가 되는 유전 인자의 확인은 분자 의약품 연구에서 가장 유망한 영역 중 하나이다. 따라서, 임상의가 이러한 어렵고 중요한 결정을 하는 것을 돕기 위한 객관적인 시험이 필요하다.

<발명의 개요>

본 발명은 정신분열병을 포함한 정신 질환에 걸린 또는 감수성이 있을 수 있 는 개인에서 자살 행동의 위험을 예측하기 위한 바이오마커 및 방법을 제공함으로써 상기 요구를 충족시키고자 한 것이다. 본 발명은 (1) 유용한 질병 마커이고; (2) 질병 병인을 보다 잘 이해하기 위해 사용될 수 있고; (3) 환자 집단에서 클로자핀 반응군을 클로자핀 비-반응군으로부터 구별할 수 있는 바이오마커를 제공한다.

한 실시태양에서, 본 발명은 개체의 도파민 수송체 1 유전자 (DAT1 유전자; SLC6A3 유전자)의 3'-비번역 구역 (UTR)에 존재하는 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성의 형태를 결정하는 것을 포함한다. SLC6A3 유전자는 염색체 5p15.3 상에 존재한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 개체에 존재하는 SLC6A3 유전자 (DAT1 유전자)의 2 카피에 대해 엑손 9 상의 다형성 부위 59 A→G에서 뉴클레오티드쌍의 정체를 결정하는 것을 포함한다. 다형성 59 A→G는 GenBank 서열 수탁 참조 번호 AF119117.1에서 위치 41370 (서열 2)에 존재한다. (서열 1은 GenBank 서열 수탁 참조 번호 AF119117.1의 위치 41341 - 41401로부터의 서열을 제공한다).

이들 뉴클레오티드 변이는 도파민 수송체의 비정상 발현을 일으켜, 그의 기능에 영향을 미칠 수 있다. SLC6A3 유전자에서 9개 이하의 반복 서열은 유전자의 불량한 발현과 상호관련된다. 59 A→G 다형성 (서열 2)은 엑손 9의 비정상 스플라이싱을 일으키고 따라서 비정상적인 검출가능한 RNA를 생성시킨다. 유전자의 폴리펩티드 생성물은 다형성을 갖는 환자에서 변경될 수 있고, 이는 상기 다형성에 대한 혈액 시험을 위한 기초를 형성하고, 이에 의해 환자에서 자살 가능성의 추정을 제공한다.

따라서, 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 SLC6A3 자리에서 환자의 유전자형을 결정하고, 자살 또는 자기파괴 행동 위험이 있거나 있을 수 있는 환자에서 자살 또는 자기파괴 행동 위험을 예측하는 방법에 상기 정보를 사용하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 타입 1 사건 (Type 1 event)의 발생 위험이 있거나 있을 수 있는 환자의 치료 동안 발생하는 타입 1 사건의 가능성을 예측하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 체액 또는 다른 조직의 샘플을 얻고, (b) 환자의 혈액 또는 조직에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피에 대해 VNTR 다형성의 수를 결정하는 것을 포함하는 SLC6A3 유전자의 3'-UTR에서 환자의 유전자형을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 (c) 환자의 혈액 또는 조직에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피에 대해, GenBank 서열 수탁 참조 번호 AF119117.1의 위치 41370에서 SLC6A3 엑손 9 A59G (rs6347)의 다형성 부위에서 뉴클레오티드쌍의 정체를 결정하는 것을 포함하는, SLC6A3 엑손 9 자리에서 환자의 유전자형을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 (i) 두 뉴클레오티드쌍이 AT이면, 환자는 AA로서 분류되고; (ii) 하나의 뉴클레오티드쌍이 AT이고 다른 하나가 GC이면, 환자는 GA로서 분류되고; (iii) 두 뉴클레오티드쌍이 GC이면, 환자는 GG로서 분류된다. 다른 실시태양에서, 유전자형 결정은 상기 설명한 바와 같이 이루어질 수 있고, 여기서 (a) 상기 환자가 AA로서 분류되면, 이들은 위험 카테고리 (Category) I에 있는 것으로 간주될 것이고, (b) 상기 환자가 GA로서 분류되면, 이들은 위험 카테고리 II에 있는 것으로 간주될 것이고, (c) 상기 환자가 GG로서 분류되면, 이들은 위험 카테고리 III에 있는 것으로 간주될 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 SLC6A3 다형성에 대한 대리 마커 (surrogate marker)를 이용하여 상기한 결정을 수행하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 타입 1 사건의 발생 위험이 있거나 있을 수 있는 환자의 치료 동안 발생하는 타입 1 사건의 가능성을 예측하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 바이오마커는 SLC6A3 유전자의 3'-UTR에서 VNTR 다형성의 수의 존재에 대한 대리자이다 (9개 이하의 반복 서열이든 10개 이상의 반복 서열이든). 다른 실시태양에서, 본 발명은 SLC6A3 엑손 9 A59G 다형성에 대한 대리 마커가 상기 환자에서 존재하는지 아닌지 결정하는 것을 포함하고, 여기서 (a) 상기 대리 마커가, 상기 환자가 AA로서 분류되어야 하는 것으로 표시하면, 이들은 위험 카테고리 I에 있는 것으로 간주될 것이고, (b) 상기 대리 마커가, 상기 환자가 GA로서 분류되어야 하는 것으로 표시하면, 이들은 위험 카테고리 II에 있는 것으로 간주될 것이고, (c) 상기 대리 마커가, 상기 환자가 GG로서 분류되어야 하는 것으로 표시하면, 이들은 위험 카테고리 III에 있는 것으로 간주될 것이다.

따라서, 다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 치료될 환자의 SLCA3 유전자의 다형성에 대한 지식을 기초로 한 치료의 결정 방법을 제공한다. 상기 정보에 기초하여, 개인은 선택된 의약 및 환자 안전을 보장하기 위해 필요한 관찰 정도 모두에 관하여 가장 적절한 방식으로 치료될 수 있다. 예를 들어, 중간 위험 및 고위험 카테고리의 환자는 입원 및 외래환자로서 모두 향상된 수준으로 관찰된다 [Modestin J et al., J. Clin. Psychiatry 66(4):534-8 (April 2005)].

다른 실시태양에서, 본 발명은 (a) 환자의 체액 또는 조직에서 SLC6A3 유전 자 발현 생성물의 존재에 대해 분석하는 것을 포함하는, 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 (i) SLC6A3 유전자 발현 생성물이 고위험 또는 적어도 중간 위험 유전자형을 나타내는 농도로 발견되면, 환자는 임의의 다른 유사한 의약 대신 클로자핀으로 치료되고, 치료 동안 개인을 입원시키거나 자살 예방 수단을 제공하기 위해 보다 심각하게 고려되고; (ii) SLC6A3 유전자 발현 생성물의 농도가, 개인이 저위험 카테고리에 있는 것으로 간주될 것을 나타내면, 상기 환자에 대해 환자 감독은 그렇게 개입될 필요가 없다.

바람직한 실시태양에서 상기 결정은 도파민 수송체 결합능 (DATBP)의 측정을 통한 SLC6A3 유전자 (도파민 수송체 1 [DAT1])의 유전자 발현 생성물의 이용가능성 및 친화도 또는 농도에 대해 시험함으로써 수행될 것이다. 이는 도파민 수송체에 대해 고도로 선택적인 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 영상화 방사성 리간드인 [¹¹C]RTI-32의 사용을 수반할 것이다 [Wilson, DaSilva & Houle, J. Label. Comp. Radiopharm., 34: 759-765 (1994); 및 Wilson, DaSilva & Houle, Nucl. Med. Biol., 23(2): 141-146 (1996)].

다른 실시태양에서, 상기 결정은 DATBP를 결정하기 위한 대안적인 수단으로서 [¹²³I]-β-CIT 단일 양전자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 기술의 사용에 의존할 것이다 [Neumeister et al., Psychol. Med. 31(8): 1467-1473 (2001)].

추가 실시태양에서, 본 발명은 (a) SLC6A3 유전자에 대응하는 mRNA 발현 수 준을 검출하고; (b) 저위험 환자로부터 SLC6A3 유전자의 변이체에 대응하는 mRNA 발현 수준을 검출하고; (c) 상기 (a) 및 (b)에서 검출된 mRNA 수준을 비교하는 것을 포함하는, 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 (i) (a)가 존재하면, 환자는 중간 위험 또는 고위험 카테고리에 있는 것으로 간주되고, 적절한 예방조치가 취해질 것이고, 이들 예방조치는 관찰 수준 증가, 예를 들어 입원 및 유사한 종류의 다른 의약에 우선한 클로자핀의 사용을 포함하고 이로 제한되지 않고; (ii) (a)가 검출되고 (b)가 존재하지 않으면, 환자는 고위험 카테고리에 있는 것으로 간주되고, 상기 설명한 종류의 훨씬 더 엄격한 예방조치가 치료 동안 취해진다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 개인에 존재하는 SLC6A3 유전자를 결정하는 것을 포함하는, 자살, 항우울제 또는 항정신병 의약의 연구를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임상 연구에 포함시키기 위한 대상을 선택하는 방법을 제공하고, 여기서 개인은 나타낸 위험 카테고리를 기초로 연구에 포함되거나 배제된다.

본 발명의 다른 실시태양은 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인에 대한 치료 전략을 결정하는데 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 SLC6A3 유전자 발현 생성물의 수준을 측정하기 위해 요구되는 물질을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 키트는 DATBP의 측정을 통한 SLC6A3 유전자 (DAT1)의 유전자 발현 생성물의 이용가능성 및 친화도 또는 농도를 시험하기 위해 요구되는 물질을 포함할 것이다. 이는 도파민 수송체에 대해 고도로 선택적인 PET 영상화 방사성 리간드인 [¹¹C]RTI-32의 사용을 수반할 것이다 [Wilson, DaSilva & Houle (1994), 상기 문헌; 및 Wilson, DaSilva & Houle (1996), 상기 문헌].

또한, 키트는 DATBP 수준이 결정될 수 있는, 요구되는 물질 및 상기 개인으로부터의 체액 샘플을 담기 위해 적합한 용기를 포함할 것이고, 또한 키트 사용에 대한 지시서를 포함한다. 이들 지시서는 키트의 적절한 사용과 결과를 해석하는 적절한 방식 및 키트를 사용하여 시험된 개인의 특질에 따른 환자 관리에 대한 제안을 포함할 것이다.

다른 실시태양에서, 상기 키트는 DATBP를 결정하기 위한 대안적인 수단으로서 [¹²³I]-β-CIT SPECT 기술의 사용에 의존할 것이다 [Neumeister et al. (2001), 상기 문헌].

본 발명의 추가 실시태양은 (a) SLC6A3 유전자의 mRNA 발현 생성물을 인지하고 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드; (b) 존재할 경우 SLC6A3 mRNA에 접촉할 수 있는 상기 폴리뉴클레오티드 및 상기 개인으로부터 체액 샘플을 담기에 적합한 용기; (c) 상기 폴리뉴클레오티드와 SLC6A3 mRNA의 조합물을 검출하기 위한 수단; (d) mRNA가 저위험, 중간 위험 또는 고위험 개인의 게놈으로부터 유래한 것인지 결정하기 위한 수단; 및 (e) 키트의 사용에 대한 지시서를 포함하는, 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인에 대한 치료 전략을 결정하는데 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

추가 실시태양에서, 본 발명은 (a) 개인에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피 에 대해, 상기 나타낸 바와 같은 개인이 저위험, 중간 위험 또는 고위험 개인인지 표시하는 SLC6A3 유전자의 다형성과 연쇄 비평형 (linkage disequilibrium; LD)으로 존재하는 SLC6A3 유전자의 다형성을 결정하고; (b) 표시성의 다형성과 LD로 존재하는 SLC6A3 유전자의 영역을 기초로 개인을 위험군에 배정하는 것을 포함하는, 클로자핀, 비제한적인 예를 들어 클로자릴(등록상표)을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 의약을 사용한 치료에 대한, 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인의 반응성을 결정하기 위한 방법을 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 SLC6A3 유전자의 VNTR 자리 다형성 부위에서 환자의 다형성 패턴 확인용 키트를 제공하고, 상기 키트는 SLC6A3 유전자의 VNTR 자리 다형성 부위에서 유전적 다형성 패턴을 결정하기 위한 수단을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 엑손 9 A59G에서 SLC6A3 다형성 부위에서 환자의 다형성 패턴 확인용 키트를 제공하고, 상기 키트는 엑손 9 A59G에서 SLC6A3 다형성 부위에서 유전적 다형성 패턴을 결정하기 위한 수단을 포함한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 DNA 샘플 수집 수단을 추가로 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 실시태양은 SLC6A3 유전자의 mRNA 발현 확인용 키트에 관한 것이고, 상기 키트는 SLC6A3 유전자의 mRNA 생성물을 결정하기 위한 수단을 포함한다.

본 발명의 추가의 실시태양은 SLC6A3 유전자의 mRNA 생성물을 결정하기 위한 수단이 SLC6A3 유전자의 mRNA 발현 생성물에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트에 관한 것이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 G 변이체와 A 기원 유전자형 사이를 구별하는 방식으로 SLC6A3 유전자의 폴리펩티드 발현 생성물의 농도를 검출하기 위한 수단을 포함하는, 환자의 SLC6A3 유전자 발현 생성물 농도 또는 수준 확인용 키트를 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 체액 샘플을 수집하는 수단을 추가로 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가 실시태양은 치료를 필요로 하는 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인을 치료하는 방법, 의약의 임상 연구에 포함시킬 대상을 선택하는 방법, 또는 치료 동안 환자에서 자살 또는 자기파괴 행동의 가능성을 결정하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 생체 외에서 수행된다.

본 발명의 다른 추가의 실시태양에서, SLC6A3 다형성에 대한 대리 마커를 검출하는 것 외에는 상기 설명한 임의의 키트와 같은 키트를 제공한다. 상기 대리 마커는 임의의 상기 방법에 의해, 예를 들어 대리 마커 게놈의 mRNA의 검출과 같은 수단에 의해 또는 대리 마커의 폴리펩티드 유전자 발현 생성물의 검출에 의해 검출될 수 있다. 이어서 대리 마커의 존재 또는 부재는 대리 마커와 관심있는 SLC6A3 다형성 사이의 공지의 상관성 (association)을 기초로 상기 결정을 하기 위해 이용될 것이다.

도 1은 실시예 1에서 클로자핀 치료군에서 백인에 대한 로그 랭크 (log rank) 시험 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2는 실시예 1에서 클로자핀 치료군에서 전체 인구집단에 대한 로그 랭크 시험 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 올란자핀 치료군에서 백인에 대한 로그 랭크 시험 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 올란자핀 치료군에서 전체 인구집단에 대한 로그 랭크 시험 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5는 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 백인을 클로자핀 치료군에서 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 백인과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 6은 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 모든 대상을 클로자핀 치료군에서 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 모든 대상과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 백인을 올란자핀 치료군에서 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 백인과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 모든 대상을 올란자핀 치료군에서 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 모든 대상과 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

본 명세서에서 사용되는 특정 용어의 정의를 아래 제공한다. 다른 용어의 정의는 미국 에너지성 과학국 인간 게놈 프로젝트 (U.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project)에서 제공되는 용어집 (http: //www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/glossary/)에서 찾을 수 있다. 본 발명을 실시하는데 있어서, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA에서 많은 통상적인 기술이 사용된다. 이들 기술은 공지되어 있고 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymol. (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller and Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987); 및 Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds.]에 각각 설명되어 있다. 본원에 인용된 모든 특허 출원, 특허 및 참고 문헌은 그 전문을 본원에 참고로 포함시킨다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 자살 또는 자기파괴 행동의 위험이 있거나 있을 수 있는 개인이 치료 동안 자살 행동을 나타낼 가능성을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 도파민 수송 유전자 DAT1 (SLC6A3)의 유전자형 또는 단상형 (haplotype), 구체적으로 환자에서 SLC6A3 다형성의 존재 또는 부재를 결정하는 것을 포함한다.

다형성이 존재하지 않고 두 대립유전자가 A를 함유하면, 환자는 환자가 치료 동안 자살할 위험이 비교적 더 낮은 것을 특징으로 하는 카테고리 I로 분류된다. 상기 카테고리는 환자에 대해 당시 환자의 정신 상태, 과거 병력, 가족력, 환자의 병의 성질과 병력 및 자살에 대한 공지의 위험 인자, 예를 들어 약물 남용의 존재 등의 검사를 기초로 당업계의 숙련인이 추정하는 자살 또는 자기 파괴 행동의 위험 정도를 나타내도록 의도된다.

다형성이 하나의 대립유전자 상에 존재하지만 다른 대립유전자에는 존재하지 않아, 환자가 AG의 유전자형을 가지면, 환자는 환자가 치료시 자살할 위험이 상대적으로 더 큰 것을 특징으로 하는 카테고리 II로서 분류된다. 환자가 유전자형 GG를 갖는 다형성에 동종접합성이면, 환자는 카테고리 내에서 환자가 치료 동안 자살할 상대적 위험이 가장 큰 것을 특징으로 하는 카테고리 III에 배치된다.

본원에서 사용되는 용어 "카테고리 I", "카테고리 II" 및 "카테고리 III"은 개인이 치료 동안 자살하거나 자기파괴 방식으로 행동할, 즉, 타입 1 사건이 일어날 상대적 위험 수준을 나타낸다. 이들 카테고리는 위험이 카테고리 I에서 카테고리 II로 증가하고 카테고리 III에서 더욱 더 증가하는 것을 특징으로 한다.

당업계의 숙련인이 쉽게 이해할 바와 같이, 개인이 자살 또는 자기파괴 행동을 할 위험의 예측 또는 평가는 상당한 불확정성에 의존한다. 본원에 사용되는 위험 카테고리는 기저선 위험에 비해 상대적 위험 수준의 증가를 반영하도록 의도된다. 상기 기저선 위험은 환자에 대해 당시 환자의 정신 상태, 과거 병력, 가족력, 환자의 병의 성질과 병력 및 자살에 대한 공지의 위험 인자, 예를 들어 동반이환 약물 남용의 존재 등의 검사를 기초로 당업계의 숙련인이 추정할 위험일 것이다. 상기 기저선 위험은 "카테고리 I" 위험 평가를 구성할 것이다. 카테고리 II 위험군 내의 환자는 주어진 시간 동안 타입 1 사건의 위험이 비교적 더 큰 것으로 예상될 것이다. 증가된 위험은 카테고리 I 내의 환자의 위험의 1.5, 2.0, 3.0 또는 4.0배일 수 있다. 카테고리 III 내의 환자는 타입 1 사건에 대한 최고 위험에 있을 것이고, 상기 증가된 위험은 카테고리 I 내의 환자에 비해 3.0, 4.0, 5.0배 이상의 위험일 것이다. 상기 증가된 위험은 환자가 주어진 시간 동안 타입 1 사건을 경험하거나 자살 또는 자기 파괴 행동을 할 가능성이 보다 큰 것으로 반영될 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "자살 시도"는 고의적인 의지를 갖거나 자신을 높은 사망 위험에 빠뜨리는 착란적 사고 또는 내적 강박에 대한 반응으로 개인이 행하는 행동을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "타입 1 사건"은 자살 모니터링 위원회 (Suicide Monitoring Board)에 의해 확인되고 증가된 감시 수준을 포함하지만 이로 제한되지 않는 유의한 자살 시도 또는 절박한 자살 위험으로 인한 입원의 발생으로 정의된다.

본원에서 사용되는 용어 "과다 자살/자기파괴 행동 예방조치"는 개인이 자해하거나 자살할 수 있는 가능성을 감소시킬 의도로 보호자 또는 다른 사람이 행하는 임의의 행동을 의미한다. 이는 병원 내외에서 다음 중 임의의 또는 모든 증가된 관찰 빈도, 즉, 증가된 내원 빈도 또는 개인을 주시하는 가족 또는 친구의 경고 (병원 내에서 이는 증가된 관찰 빈도, 즉, 15-분 체크 대신 5-분 체크를 포함할 수 있다) 또는 환자를 상시 (constant) 관찰 (눈 마주침)에 두거나 상시 관찰에 의해 가까이 (일정 거리에서 눈 마주침) 두거나 환자를 그들의 방 또는 관찰실 (구속실)에 구속하거나 날카롭거나 위험한 물체를 환자 도달범위로부터 제거하거나 극심한 경우에 환자를 구속장치에 가두는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "클로자핀"은 의약 클로자핀 (8-클로로-11-(4-메틸-1-피페라지닐)-5H-디벤조[be][1,4]디아제핀) 및 임의의 그의 염 또는 에스테르를 나타낼 것이고, 브랜드명 의약품 클로자릴(등록상표) 또는 레포넥스(등록상표) (노바티스 파마슈티칼 코퍼레이션)을 포함하지만 이로 제한되지 않을 것이다.

상기 다형성의 검출은 주어진 환자가 치료 동안 자살할 가능성을 결정하거나 예측하기 위해 이용될 수 있다. 상기 다형성은 직접적으로 또는 다형성 변이체 유전자의 특징적 mRNA의 검출에 의해 또는 체액 또는 조직 내의 유전자의 폴리펩티드 (단백질) 발현 생성물의 존재 또는 농도의 검출에 의해 검출될 수 있다. 폴리펩티드 발현 생성물의 상대적 수준은 정상 대조군, 즉, 다형성을 갖지 않는 것으로 알려진 개인과의 비교에 의해 환자가 다형성에 대해 이종접합성인지 동종접합성인지 결정하기 위해 사용될 수 있다.

SLC6A3 유전자 발현 생성물의 수준은 개인의 기존의 생리학적 상태, 환경, 의약, 상류 인자, 및 또한 프로모터, 인핸서, 리보좀 결합 부위, 스플라이스 (splice) 부위 및 엑손의 스플라이싱 인핸서 부위의 기능에 영향을 미치는 다형성과 같은 고유한 유전 인자를 포함하는 많은 인자에 의존한다.

그러나, SLC6A3 유전자 발현 생성물의 수준을 측정하는 것은 가능하다. SLC6A3 유전자 (DAT1)의 유전자 발현 생성물의 이용가능성 및 친화도 또는 농도를 시험하기 위한 공개된 한 방법은 DATBP의 측정을 통한 것이다. 보다 낮은 DATBP는 보다 높은 수준의 우울증 및 자살경향성과 연관될 수 있다. [¹¹C]RTI-32는 도파민 수송체에 대해 고도로 선택적인 PET 영상화 방사성 리간드이다 [Wilson, DaSilva & Houle (1994), 상기 문헌; 및 Wilson, DaSilva & Houle (1996), 상기 문헌; Seeman, Receptor Tables, Vol. 2, "Drug Dissociation Constants For Neuroreceptors and Transporters", Schizophrenia Research (Toronto, 1993); Guttman et al., Neurology, 48(6): 1578-1583 (1997); 및 Carroll et al., J. Med. Chem., 38(2): 379-388 (1995)].

상기 PET 영상화 방사성 리간드, 즉, [¹¹C]RTI-32 PET는 DATBP를 검출하기 위해 사용될 수 있다 [Meyer et al., Neuroreport, 12(18): 4121-4125 (2001)].

별도의 실시태양에서, DATBP는 또한 [¹²³I]-β-CIT SPECT 기술을 통해 결정될 수 있다 [Neumeister et al. (2001), 상기 문헌].

일단 평균 "정상" 수준이 각각의 유전자형군에 대해 결정되면, 각각의 유전자형군에 대한 SLC6A3 유전자 생성물의 수준에서 평균 및 표준 편차를 결정해야 한다.

이들 수준은 표준 대조군 역할을 할 것이다. 도파민 수송체의 수준은 PET 기술 또는 SPECT 기술을 사용하여 주어진 환자에서 측정되어야 한다.

이어서 이렇게 상이한 대조군에서 결정된 SLC6A3 유전자 발현 생성물의 표준 대조군 수준은 주어진 환자에서 SLC6A3 유전자 발현 생성물의 측정된 수준과 비교될 것이다. 상기 유전자 발현 생성물은 그 특정 유전자형군 또는 그 유전자형군의 폴리펩티드 유전자 발현 생성물과 연관된 특징적 mRNA일 수 있다. 이어서 환자는 측정된 수준이 주어진 군에 대한 대조군 수준에 비해 얼마나 유사한지를 기초로 하여 특정 유전자형군에 분류되거나 배정될 수 있다.

당업계의 숙련인이 이해할 바와 같이, 상기 결정을 하는데 관여되는 특정 정도의 불확정성이 존재할 것이다. 따라서, 대조군 수준의 표준 편차가 확률적 결정을 하기 위해 사용될 것이고, 본 발명의 방법은 유전자형군 결정에 기초한 광범위한 확률에 걸쳐 적용가능할 것이다. 따라서, 비제한적인 예를 들어 한 실시태양에서, SLC6A3 유전자 발현 생성물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 2.5 표준 편차 내에 있으면, 그 개인은 그 유전자형군에 배정될 수 있다. 다른 실시태양에서, SLC6A3 유전자 발현 생성물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 2.0 표준 편차 내에 있으면, 그 개인은 그 유전자형군에 배정될 수 있다. 또다른 실시태양에서, SLC6A3 유전자 발현 생성물의 측정된 수준이 임의의 대조군의 평균의 1.5 표준 편차 내에 있으면, 그 개인은 그 유전자형군에 배정될 수 있다. 또다른 실시태양에서, SLC6A3 유전자 발현 생성물의 측정된 수준이 임의의 대조군 수준의 평균의 1.0 이하 표준 편차 내에 있으면, 그 개인은 그 유전자형군에 배정될 수 있다.

따라서, 상기 방법은 다양한 정도의 확률로 특정한 환자가 분류될 군을 결정할 수 있도록 할 것이고, 이어서 상기 유전자형군에 대한 배정은 개인이 분류될 위험 카테고리를 결정할 것이다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 치료 동안 개인이 자살할 가능성을 결정하는 방법을 제공한다. 이들 방법은

(a) SLC6A3 유전자의 유전자형 또는 단상형을 결정하고;

(b) SLC6A3 유전자에서 하나 이상의 다형성 변이체의 존재 또는 부재를 기초로 위험 카테고리를 결정하는 것을 포함한다.

SLC6A3 유전자는 염색체 5p15.3 상에 위치한다.

상기 다형성의 검출은 개인이 치료 동안 자살 또는 자기파괴 행동을 경험할 가능성을 결정하거나 예측하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 다형성은 직접적으로 또는 보다 일반적인 SLC6A3 유전자형과는 반대로 다형성 변이체 유전자의 특징적 mRNA를 검출함으로써 또는 개인 체조직 또는 체액 내에 SLC6A3 유전자의 폴리펩티드 발현 생성물의 농도를 검출함으로써 검출될 수 있다.

mRNA 수준 및 폴리펩티드 유전자 발현 생성물의 수준을 검출하고 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 뉴클레오티드 마이크로어레이의 사용, 및 질량 분광법 및(또는) 항체 검출 및 정량화 기술을 포함하는 폴리펩티드 검출 방법을 포함한다 [Human Molecular Genetics, 2^nd Edition. Tom Strachan & Andrew Read. (John Wiley and Sons, Inc. Publication, NY, 1999)].

추가로, 체액 또는 조직 내 SLC6A3 유전자의 폴리펩티드 (단백질) 발현 생성물의 농도 검출은 다형성의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 이용될 수 있고, 폴리펩티드 발현 생성물의 상대적 수준은 다형성이 동종접합 또는 이종접합 상태로 존재하는지 및 따라서 개인의 위험 카테고리를 결정하기 위해 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시태양은 SLC6A3 유전자의 단백질 발현 생성물의 존재 및 농도를 확인함으로써 환자에서 다형성의 존재 또는 부재를 결정하는 방법에 관한 것이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 치료 동안 자살 또는 자기파괴 행동에 대한 개인의 위험 카테고리를 결정하고 적절한 치료 전략을 개발하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 SLC6A3 유전자의 보다 일반적인 변이체 (즉, 부위 59에 A) 대 A 대신 G를 갖는 보다 덜 일반적인 다형성 변이체에 대응하는 mRNA의 양 및 비를 측정하는 것을 포함한다. 본 실시태양에서, 2가지 mRNA의 비는 환자의 체액 또는 체조직 샘플에서 결정된다. 모든 mRNA가 A 변이체로부터 유래하면, 환자는 치료 동안 자살 행동을 할 가능성이 작을 것이다 (위험 카테고리 I). 모든 mRNA가 G 변이체로부터 유래하면, 환자는 치료 동안 자살 행동을 할 가능성이 더 클 것이다 (위험 카테고리 III). 그러나, 두 종류의 mRNA이 발견되면, 환자는 다형성에 대해 이종접합성이고 자살 행동 가능성이 중간 정도인 것으로 예상될 것이다 (위험 카테고리 II).

당업계의 숙련인은 본원에 개시된 구체적인 다형성에 추가하여, 상기 다형성과 연쇄 비평형 (LD)으로 존재하는 임의의 다형성이 또한 그가 LD로 존재하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 그러한 것과 같이 동일한 약물 또는 요법에 대한 반응성을 표시하는 대리 마커로서 역할을 할 수 있음을 쉽게 알 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 SNP와 LD로 존재하는 임의의 SNP가 사용될 수 있고 본 발명의 방법에 포함되는 것으로 의도된다.

클로자핀이 비교 항정신병약보다 자살경향성을 감소시키는데 더 효과적인지 결정하기 위해, 자살 위험이 큰 것으로 알려진 정신분열 및 분열정동 환자에서 올란자핀 (자이프렉사 (ZYPREXIA)™)을 사용한 치료에 비교하여 클로자핀을 사용한 치료 동안 자살경향성에 대한 위험을 평가하기 위해 전향적 무작위배정 평행-군 연구를 수행한다.

유전적 변이와 자살경향성 또는 약물 반응 사이의 잠재적인 상관성을 밝히기 위해, IV상 임상 시험에서 약리유전학적 연구를 수행하였다. 연구는 약물 표적, 연관 효소 또는 수송체를 코딩하는 유전자, 및 뇌 기능에 관여하거나 정신분열병와 연관된 것으로 생각되는 유전자 내의 다형성이 임상 시험 과정에서 연구된 임의의 임상 효능 파라미터와 연관되었는지 조사하였다. 타입 1 사건의 발생 및 타입 1 사건의 발생까지의 시간을 구체적으로 연구하였다.

치료 반응 또는 임상 시험 결과와 연관될 수 있는 유전 인자를 확인하기 위한 노력으로 약물 표적에 관련되거나 정신분열병과 연관된 것으로 생각되는 유전자 내의 다형성을 검사하였다. 상기 설명한 바와 같이, 도파민 수송체 1 유전자 (SLC6A3 또는 DAT1)의 엑손 9 상의 다형성과 타입 1 사건 사이에 고도로 유의한 상관성 (p=0.0001)이 관찰되었다.

상기 IV상 시험의 일차 목표는

1) 증가된 감시 수준을 포함하여 제1의 유의한 자살 시도 또는 절박한 자살 위험으로 인한 입원까지의 기저선으로부터의 시간; 또는

2) Clinical Global Impression of Severity of Suicidality의 기저선으로부터의 변화에 의해 측정할 때, 클로자핀 (클로자릴(등록상표)/레포넥스(등록상표)) 대 올란자핀 (자이프렉사™)으로 치료받은 정신분열 환자 사이의 자살에 대한 위험을 비교하기 위한 것이다:

2차 목표는

1) 자이프렉사™-치료된 환자에 비해 클로자핀 치료된 환자에서 자살에 대한 생각의 강도 감소를 증명하기 위해; 및

2) 자이프렉사™에 비해 클로자핀-치료된 환자에서 자살을 예방하기 위해 요구되는 구조 개입의 수 감소를 증명하기 위해 자살과 관련되었다.

상기 임상 시험으로부터 402명의 개인이 지역 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따른 약리유전학적 연구에 동의하였다. 15 mL의 혈액을 환자로부터 시험 위치에서 수집하였다. DNA는 코방스 (Covance, 미국 인디애나폴리스)에서 제조자의 권장에 따라 PUREGENE™ DNA 단리 키트 (D50K)를 사용하여 추출하였다 [http://www.gentra.com/purification_chemistries/puregene_protocols.asp?pid=1 참고].

유전자형 분석. 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)은 2가지 구분되는 방법으로 확인하였다. 써드 웨이브 테크놀로지스, 인크. (Third Wave Technologies, Inc., 미국 위스콘신주 매디슨)에서 SNP의 한 수집물을 개발하였고, 다른 세트는 공공 데이타베이스로부터 개발하였다. 공공 데이타베이스, 예를 들어 PubMed, OMIM, SNP Consortium, Locus Link, dbSNP 및 일본 SNP 데이타베이스를 이용하였다. SNP에 대한 정보를 개발하였다. 후보 유전자는 약물 표적과 관련되거나 질병의 병인에 관련되는 것으로 생각되는 유전자이다.

유전자형 분석을 위한 프로브 세트는 써드 웨이브 테크놀로지스, 인크.에서 설계하고 합성하였다. 유전자형 분석은 60 ng의 게놈 DNA에서 제조자의 권장에 따라 INVADER(등록상표) 분석 (써드 웨이브 테크놀로지스, 인크.)을 이용하여 실험실에서 수행하였다 [Lyamichev et al., Nat. Biotechnol., 17(3): 292-296 (1999); 및 Ryan et al., Mol. Diagn., 4(2): 135-144 (1999)].

통계학적 분석. 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 등식 (HWE)으로부터 편차. 총 400명의 환자로부터의 데이타를 본 연구에 사용하였다. 데이타를 정확 검증 (exact test)을 이용하여 HWE로부터 가능한 편차에 대해 평가하였다. 하디-와인버그 법칙은 대립유전자 빈도가 무작위 교배를 하는 큰 집단에서 세대마다 변하지 않음을 설명한다. HWE로부터의 편차는 2가지 가능성 중 하나를 제안한다:

1) 유전자형 분석 오차; 또는

2) 다형성과 연구되는 집단 사이의 상관성.

제2 경우에, 특정 다형성이 어떻게든 질병 병인에 관여되면 특정 다형성은 예상될 것보다 더 빈번하게 관찰될 수 있다.

유전자형과 임상 표현형 사이의 상관관계. 분석된 각각의 SNP에 대해, 상이한 유전자형 클래스 사이에 임상 결과에서 유의한 차이가 있는지 결정하기 위해 설명적인 변수로서 유전자형 클래스를 사용하는 로그 랭크 시험을 이용하였다. 작은 대립유전자 빈도≥5％를 갖는 SNP만을 분석에서 사용하였다. 주어진 SNP에 대해, 동종접합성 유전자형이 연구된 집단에서 빈도≤10％로 발견되면, 드문 동종접합성 개인을 분석을 위해 이종접합성 개인과 함께 모았다.

유의한 결과의 존재 하에, 유전자형 클래스의 위험도 (hazard ratio)를 추정하기 위해 Cox 비례 위험 모델을 사용하였다. 다중 시험에 대해 조정하기 위해 본페로니 보정 (Bonferroni Correction)을 사용하였다. 통계학적 분석은 통계학 프로그램 SAS Version 8.2 (에스에이에스 (SAS), 노쓰 캐롤라이나 캐리)를 사용하여 수행하였다. LD 분석은 GOLD™ 패키지를 사용하여 수행하였다 [Abecasis & Cookson, Bioinformatics, 16(2): 182-183 (2000)]. 환자 대조군 연구를 위해 피셔 (Fisher)의 정확 검증을 이용하였다.

유전자형 분석된 집단의 대표적인 성질. 유전자형 분석된 집단이 전체 임상 시험 집단을 대표하는 정도를 결정하기 위해, 유전자형 분석된 및 비-유전자형 분석된 집단 사이의 인구통계 및 타입 1 사건의 발생을 비교하였다.

유전적 변이와 타입 1 사건 사이의 상관성 연구. 치료군에서 개인의 분포를 표 1에 나타낸다. 약리유전학적 연구에서 한정된 참여 또는 유전자형 결과의 부재 때문에 각 유전자형에 대해 사용된 샘플의 실제 수는 더 작을 수 있다.

유전자형 분석된 군 및 전체 연구군 중의 치료군에서 환자수의 분포

약물/용량	연구에서 개인의 수	유전자형 분석된 개인의 수
클로자릴	490	197
자이프렉사	490	203

22개의 후보 유전자 사이에서 분류된 43개의 다형성을 초기에 유전자형 분석하였다. 이들 중에, 23개의 다형성은 연구 집단에서 드문 대립유전자 빈도 ≥ 5％를 보였고 분석을 위해 사용하였다. 연구된 각각의 다형성에 대해, 생존 분석을 수행하였다. 상이한 유전자형 클래스 중에서 타입 1 사건까지의 시간의 차이를 검사하기 위해 설명적인 변수로서 유전자형 클래스를 사용하는 로그 랭크 시험을 이용하였다. 상기 설명한 바와 같이, 타입 1 사건까지의 시간과 도파민 수송체 SLC6A3 유전자 (DAT1로도 알려짐)의 엑손 9 내의 동의 (synonymous) 다형성 (엑손 9 A59G) 사이의 유의한 상관성이 발견되었다 (p=0.0001). 다중 시험에 대한 본페로니 보정 후, 조정된 p-값은 0.0041이었다. 엑손 9에서 확인된 코딩 서열 변이체는 A→G 치환에 대응한다. 상기 연구에서, GA 및 GG 유전자형을 갖는 개인이 AA 유전자형을 갖는 개인에 비해 타입 1 사건의 발생률이 더 높았다. GG 유전자형을 갖는 개인이 특히 타입 1 사건을 경험하기 더 쉬운 것으로 보였다. 표 2는 상이한 유전자형군에 대해 타입 1 사건을 경험하는 개인의 수를 나열한다.

상이한 유전자형군에서 타입 1 사건 빈도의 비교

사건	AA	GA	GG
타입 1 사건 없음	175	95	29
타입 1 사건	31	35	20

3가지 유전자형군 사이의 차이를 정량하기 위해, 실험적 변수로서 엑손 9 A59G 다형성 및 치료를 사용하여 Cox 비례 위험 시험을 수행하였고, 후자는 층화 변수로서 처리하였다 (표 3 참조). 유의한 치료-유전자형 상호작용이 관찰되지 않았다 (p=0.6044).

타입 1 사건에 대한 엑손 9 A59G 다형성의 효과의 생존 분석의 결과 요약

SLC6A3 엑손 9 G → A 다형성	위험도	95％ 신뢰 간격
AG 대 AA	1.84	1.132 - 2.989
GG 대 AA	3.167	1.804 - 5.562

본 발명의 방법에 의해 치료가능한 병. 본 발명의 방법 또는 화합물을 이용하여 자살 행동 또는 자기파괴 행동의 위험을 평가할 수 있는 병리적 심리학적 (정신과적) 병의 예는 충분한 임상 설명 및 진단 기준과 함께 이들 질환의 구체적인 정의에 대해서 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4^th Ed. (American Psychiatric Association (APA), Washington, DC, 1994) (DSM-IV™)을 참조하지만 이로 제한되지 않는다.

정신분열 질환

·정신분열병, 긴장형, 아만성 (295.21)	·정신분열병, 긴장형, 만성 (295.22)
·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 긴장형, 아만성 (295.23)	·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 긴장형, 만성 (295.24)
·정신분열병, 긴장형, 관해상태 (295.55)	·정신분열병, 긴장형, 상세불명 (295.20)
·정신분열병, 해체성, 아만성 (295.11)	·정신분열병, 해체성, 만성 (295.12)
·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 해체성, 아만성 (295.13)	·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 해체성, 만성 (295.14)
·정신분열병, 해체성, 관해상태 (295.15)	·정신분열병, 해체성, 상세불명 (295.10)
·정신분열병, 편집성, 아만성 (295.31)	·정신분열병, 편집성, 만성 (295.32)
·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 편집성, 아만성 (295.33)	·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 편집성, 만성 (295.34)
·정신분열병, 편집성, 관해상태 (295.35)	·정신분열병, 편집성, 상세불명 (295.30)
·정신분열병, 미분화형, 아만성 (295.91)	·정신분열병, 미분화형, 만성 (295.92)
·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 미분화형, 아만성 (295.93)	·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 미분화형, 아만성 (295.94)
·정신분열병, 미분화형, 관해상태 (295.95)	·정신분열병, 미분화형, 상세불명 (295.90)
·정신분열병, 잔류형, 아만성 (295.61)	·정신분열병, 잔류형, 만성 (295.62)
·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 잔류형, 아만성 (295.63)	·급성 악화를 동반하는 정신분열병, 잔류형, 만성 (295.64)
·정신분열병, 잔류형, 관해상태 (295.65)	·정신분열병, 잔류형, 상세불명 (295.60)
·망상성 (편집성) 장애 (297.10)	·단기 반응성 정신병 (298.80)
·정신분열병형 장애 (295.40)	·분열정동장애 (295.70)
·유발성 정신병적 장애 (297.30)	·정신병적 장애 NOS (비전형 정신병) (298.90)

정동 장애

·주요 우울 장애, 정신병적 특징을 동반하는 중증 (296.33)	·기분부전 장애 (300.4)
·우울 장애 NOS (311)	·양극성 I 장애, 단일 조병 에피소드, 정신병적 특징을 동반하는 중증 (296.23)
·양극성 I 장애, 가장 최근 경조병 에피소드 (296.43)	·양극성 I 장애, 가장 최근 조병 에피소드, 정신병적 특징을 동반하는 중증(296.43)
·양극성 I 장애, 가장 최근 혼합 에피소드, 정신병적 특징을 동반하는 중증 (296.63)	·양극성 I 장애 가장 최근 울병 에피소드, 정신병적 특징을 동반하는 중증 (296.53)
·양극성 I 장애, 가장 최근 상세불명 에피소드 (296.89)	·양극성 II 장애 (296.89)
·순환성 기분 장애 (301.13)	·양극성 장애 NOS (366)
·일반적 병으로 인한 기분 장애 (293.83)	·기분 장애 NOS (296.90)
·행동 장애, 단독 공격형 (312.00)	·행동 장애, 미분화형 (312.90)
·투렛 (Tourette) 장애 (307.23)	·만성 근육 또는 음성 틱 장애 (307.22)
·일과성 틱 장애 (307.21)	·틱 장애 NOS (307.20)

정신활성 물질 사용 장애

·알콜 금단 섬망 (291.00)	·알콜 환각증 (291.30)
·알콜중독과 연관된 알콜 치매 (291.20)	·암페타민 또는 유사하게 작용하는 교감신경흥분제 중독 (305.70)
·암페타민 또는 유사하게 작용하는 교감신경흥분제 섬망 (292.81)	·암페타민 또는 유사하게 작용하는 교감신경흥분제 망상 장애 (292.11)
·대마 망상 장애 (292.11)	·코카인 중독 (305.60)
·코카인 섬망 (292.81)	·코카인 망상 장애 (292.11)
·환각제 환각증 (305.30)	·환각제 망상 장애 (292.11)
·환각제 기분 장애 (292.84)	·환각제 환각제후 인지 장애 (292.89)
·펜시클리딘 (PCP) 또는 유사하게 작용하는 아릴시클로헥실아민 중독 (305.90)	·펜시클리딘 (PCP) 또는 유사하게 작용하는 아릴시클로헥실아민 섬망 (292.81)

정신활성 물질 사용 장애 (계속)

·펜시클리딘 (PCP) 또는 유사하게 작용하는 아릴시클로헥실아민 망상성 장애 (292.11)	·펜시클리딘 (PCP) 또는 유사하게 작용하는 아릴시클로헥실아민 기분 장애 (292.84)
·펜시클리딘 (PCP) 또는 유사하게 작용하는 아릴시클로헥실아민 기질적 정신 장애 NOS (292.90)	·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 중독 (305.90)
·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 섬망 (292.81)	·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 치매 (292.82)
·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 망상 장애 (292.11)	·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 환각증 (292.12)
·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 기분 장애 (292.84)	·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 불안 장애 (292.89)
·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 인격 장애 (292.89)	·다른 또는 상세불명의 정신활성 물질 기질적 정신 장애 NOS (292.90)
·기질적 장애	·섬망 (293.00)
·치매 (294.10)	·기질적 망상 장애 (293.81)
·기질적 환각증 (293.82)	·기질적 기분 장애 (293.83)
·기질적 불안 장애 (294.80)	·기질적 인격 장애 (310.10)
·기질적 정신 장애 (294.80)	·강박 장애 (300.30)
·외상후 스트레스 장애 (309.89)	·전반 불안 장애 (300.02)
·불안 장애 NOS (300.00)	·신체 불구성 장애 (300.70)
·하이포콘드리아증 또는 하이포콘드리아성 신경증 (300.70)	·신체화 장애 (300.81)
·미분화형 신체형 장애 (300.70)	·신체형 장애 NOS (300.70)
·간헐성 폭발성 장애 (312.34)	·절도광 (312.32)
·병적 도박 (312.31)	·방화광 (312.33)
·발모벽 (312.39)	·충독 제어 장애 NOS (312.39)

인격 장애

·편집성 (301.00)	·정신분열성 (301.20)
·분열형 (301.22)	·반사회성 (301.70)
·경계성 (301.83)

본 명세서에서 용어 "정신병"은 모든 형태의 정신병, 예를 들어 기질적 정신병, 약물-유발 정신병, 알츠하이머 관련 정신병 및 다른 정신 장애와 연관된 정신병 또는 관련 병, 예를 들어 편집성 인격 장애 등을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "정신분열병" 및 "정신분열병형" 질병은 모든 종류의 상기 장애, 예를 들어 긴장형, 해체성, 편집성, 미분화형 및 잔류형 정신분열병, 및 상기 질병과 연관된 모든 병, 예를 들어 그의 양성 및 음성 증상을 포함한다.

SNP의 확인 및 특성화. SNP를 확인하고 특성화하기 위해 많은 상이한 기술, 예를 들어 단쇄 배위 다형성 분석, 변성 고성능 액체 크로마토그래피 (DHPLC)에 의한 헤테로듀플렉스 분석, 직접 DNA 서열결정 및 컴퓨터화 방법이 사용될 수 있다 [Shi, Clin. Chem., 47: 164-172 (2001)]. 공공 데이타베이스 내의 수많은 서열 정보 덕분에, 주어진 유전자에 대해 독립적으로 기탁된 서열 (cDNA 또는 게놈 서열)을 정렬시킴으로써 인 실리코 (in silico)로 SNP를 확인하기 위해 컴퓨터화 도구를 사용할 수 있다. 실험적으로 및 인 실리코 방법에 의해 얻은 SNP의 비교는 SNPFinder (http://Ipgws.nci.nih.gov:82/perl/snp/snp_cgi.pl)에 의해 발견된 후보 SNP의 55％가 또한 실험적으로 밝견된 것을 보여주었다 [Cox, Boillot & Canzian, Hum. Mutal., 17(2): 141-150 (2001)]. 그러나, 이들 인 실리코 방법은 실제 SNP의 27％만 발견할 수 있다.

대부분의 일반적인 SNP 타이핑 방법은 현재 혼성화, 프라이머 연장 및 절단 방법을 포함한다. 이들 방법은 각각 적절한 검출 시스템에 연결되어야 한다. 검출 기술은 형광 편광법 [Chen, Levine and Kwok, Genome Res., 9(5): 492-499 (1999)], 피로포스페이트 방출의 발광계 검출 (파이로시퀀싱 (pyrosequencing)) [Ahmadiian et al., Anal. Biochem., 280(1) 103-110 (2000)], 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기초 절단 분석, DHPLC 및 질량 분광법 [Shi (2001), 상기 문헌; 및 미국 특허 6,300,076 B1]을 포함한다. SNP를 검출하고 특성화하는 다른 방법은 미국 특허 6,297,018 B1 및 6,300,063 B1에 개시되어 있다. 상기 문헌의 개시내용은 그 전문을 본원에서 참고로 포함시킨다.

특히 바람직한 실시태양에서, 다형성의 검출은 소위 INVADER™ 기술 (써드 웨이브 테크놀로지스, 인크로부터 입수가능함)에 의해 달성할 수 있다. 본 분석에서, 특이적 상류 "인베이더 (invader)" 올리고뉴클레오티드 및 부분적으로 겹치는 하류 프로브는 함께 상보성 DNA 템플레이트에 결합될 때 특이적 구조를 형성한다. 상기 구조는 클리바제 (Cleavase) 효소에 의해 특이적 부위에서 인식되어 절단되고, 이는 프로브 올리고뉴클레오티드의 5' 플랩의 방출을 일으킨다. 이어서 상기 단편은 반응 혼합물 내에 함유된 합성 2차 표적 및 2차 형광-표지된 시그날 프로브에 관하여 "인베이더" 올리고뉴클레오티드로서 역할을 한다. 이는 클리바제 효소에 의한 2차 시그날 프로브의 특이적 절단을 일으킨다. 형광 공명 에너지를 전달할 수 있는 염료 분자로 표지된 상기 2차 프로브가 절단될 때 형광 시그날이 생성된다. 클리바제는 겹치는 DNA 서열 또는 플랩에 의해 형성된 구조에 비해 엄격한 요건을 갖고, 따라서 하류 DNA 스트랜드 상의 절단 부위의 바로 상류의 단일 염기쌍 미스매치를 특이적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다 ([Ryan et al. (1999), 상기 문헌; 및 Lyamichev et al. (1999), 상기 문헌, 또한 미국 특허 5,846,717 및 6,001,567] 참조, 이들의 전문은 본원에 참고로 포함시킨다).

몇몇 실시태양에서, 조성물은 2개 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 정체를 동시에 프로빙하기 위한 2가지 이상의 상이하게 표지된 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 프라이머 조성물이 다형성 부위를 함유하는 2개 이상의 구역의 동시 표적화 및 증폭을 허용하는 2 이상의 세트의 대립유전자-특이적 프라이머쌍을 함유할 수 있음이 또한 고려된다.

본 발명의 SLC6A3 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드는 또한 고체 표면, 예를 들어 마이크로칩, 비드 또는 유리 슬라이드 상에 고정되거나 합성될 수 있다 (예를 들어 WO 98/20020 및 WO 98/20019 참조). 상기 고정된 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드는 프로브 혼성화 및 폴리머라제 연장 분석을 포함하지만 이로 제한되지 않는 다양한 다형성 검출 분석에서 사용될 수 있다. 본 발명의 고정된 SLC6A3 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드는 동시에 다수 유전자에서 다형성에 대해 DNA 샘플을 신속하게 스크리닝하도록 고안된 올리고뉴클레오티드의 정돈된 어레이를 포함할 수 있다.

본 발명의 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프라이머는 3' 말단 뉴클레오티드, 또는 바람직하게는 특정 SNP의 하나의 뉴클레오티드에만 상보적인, 3' 말단으로부터 두번째의 뉴클레오티드를 가져서, 그 뉴클레오티드를 함유하는 대립유전자가 존재하는 경우에만 폴리머라제-매개 연장을 위한 프라이머로서 작용한다. 코딩 또는 비-코딩 스트랜드에 혼성화하는 ASO 프라이머가 본 발명에서 고려된다. SLC6A3 유전자 다형성을 검출하기 위한 ASO 프라이머는 당업계의 숙련인에게 공지된 기술을 이용하여 개발될 수 있다.

본 발명의 다른 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드는 본원에서 확인된 신규한 다형성 부위의 하나의 하류에서 몇몇 뉴클레오티드에 위치하는 표적 구역에 혼성화한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 본원에 설명된 신규한 다형성의 하나를 검출하기 위한 폴리머라제-매개 프라이머 연장 방법에 유용하고, 따라서 상기 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드는 본원에서 "프라이머-연장 올리고뉴클레오티드"로서 칭한다. 바람직한 실시태양에서, 프라이머-연장 올리고뉴클레오티드의 3'-말단은 다형성 부위에 바로 인접하게 위치하는 뉴클레오티드에 상보적인 데옥시뉴클레오티드이다.

다른 실시태양에서, 본 발명에서는 별개의 용기에 포장된 적어도 2가지 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 또한 별개의 용기에 포장된 다른 성분, 예를 들어 혼성화 버퍼 (올리고뉴클레오티드가 프로브로서 사용되어야 하는 경우)를 함유할 수 있다. 별법으로, 올리고뉴클레오티드가 표적 구역을 증폭시키기 위해 사용되어야 하는 경우에, 키트는 별개의 용기에 포장된 폴리머라제, 및 폴리머라제에 의해 매개된 프라이머 연장, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 최적화된 반응 버퍼를 함유할 수 있다.

상기 설명한 올리고뉴클레오티드 조성물 및 키트는 개인에서 SLC6A3 유전자를 유전자형 분석하고(하거나) 단상형 분석하기 위한 방법에 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "SLC6A3 유전자형" 및 "SLC6A3 단상형"은 각각 하나 이상의 본원에 설명된 신규한 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드쌍 또는 뉴클레오티드를 함유하는 유전자형 또는 단상형을 의미하고, 임의로 SLC6A3 유전자에서 하나 이상의 추가의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드쌍 또는 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 추가의 다형성 부위는 현재 공지된 다형성 부위 또는 이후에 발견될 부위일 수 있다.

유전자형 분석 방법의 한 실시태양은 개인으로부터 개인에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피 또는 그의 단편을 포함하는 핵산 혼합물을 단리하고, SLC6A3 유전자형을 개인에 배정하기 위해 2 카피에서 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드쌍의 정체를 결정하는 것을 포함한다. 당업자가 쉽게 이해할 바와 같이, 개인에서 유전자의 2 "카피"는 동일한 대립유전자일 수 있거나 상이한 대립유전자일 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 유전자형 분석 방법은 각각의 다형성 부위에서 뉴클레오티드쌍의 정체를 결정하는 것을 포함한다.

일반적으로, 핵산 혼합물 또는 단백질은 개인으로부터 취한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈액 샘플 또는 조직 샘플로부터 단리된다. 적합한 조직 샘플은 전혈, 정액, 타액, 눈물, 소변, 배설 물질, 땀, 구강협부 도말물, 피부, 및 특이적 장기 조직, 예를 들어 근육 또는 신경 조직의 생검 및 모발을 포함한다. 핵산 혼합물은 게놈 DNA, mRNA 또는 cDNA를 포함할 수 있고, 후자의 2가지 경우에, 생물학적 샘플은 SLC6A3 유전자가 발현되는 장기로부터 얻어야 한다. 추가로, mRNA 또는 cDNA 제제는 인트론에 또는 5' 및 3' 비전사 구역에 위치하는 다형성을 검출하기 위해 사용되지 않을 것임이 당업자에게 이해될 것이다. SLC6A3 유전자 단편이 단리되는 경우, 이는 유전자형 분석될 다형성 부위(들)을 함유해야 한다.

단상형 분석 방법의 한 실시태양은 개인으로부터 개인에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피 중 하나 또는 그의 단편만을 함유하는 핵산 분자를 단리하고, 그 카피 내에서 SLC6A3 단상형을 개인에게 배정하기 위해 그 카피 내의 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 정체를 결정하는 것을 포함한다. 핵산은 SLC6A3 동종유전자 (isogene)를 제조하기 위해 상기 설명한 방법 중 하나를 포함하지만 이로 제한되지 않는, SLC6A3 유전자의 2 카피 또는 단편을 분리할 수 있는 임의의 방법을 이용하여 단리될 수 있고, 표적화된 생체내 클로닝이 바람직한 방법이다.

당업계의 숙련인이 쉽게 이해할 바와 같이, 임의의 개인 클론은 개인에 존재하는 2개의 SLC6A3 유전자 카피 중 하나 상의 단상형 정보만을 제공할 것이다. 개인의 다른 카피에 대한 단상형 정보가 요망되면, 추가의 SLC6A3 유전자가 검사될 필요가 있을 것이다. 일반적으로, 개인에서 SLC6A3 유전자의 두 카피를 단상형 분석하는 90％ 초과의 확률을 갖기 위해 적어도 5개의 클론이 검사되어야 한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 각각의 다형성 부위에서 뉴클레오티드가 확인된다.

바람직한 실시태양에서, 개인에 존재하는 SLC6A3 유전자 각각의 카피 내의 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 상관된 (phased) 서열을 확인함으로써 SLC6A3 단상형쌍이 개인에 대해 결정된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 단상형 분석 방법은 SLC6A3 유전자의 각 카피 내의 각 다형성 부위에서 뉴클레오티드의 상관된 서열을 확인하는 것을 포함한다. 유전자의 두 카피를 단상형 분석할 때, 바람직하게는 확인 단계는 별개의 용기에 담긴 각각의 카피의 유전자를 사용하여 수행된다. 그러나, 2 카피가 상이한 태그로 표지되거나 달리 별도로 구분가능하거나 확인가능한 경우, 몇몇 경우에 동일한 용기 내에서 방법을 수행하는 것이 가능할 수 있음이 또한 계획된다. 예를 들어, 유전자의 제1 및 제2 카피가 각각 상이한 제1 및 제2 형광 염료로 표지되고, 다형성 부위(들)을 분석하기 위해 제3의 상이한 형광 염료로 표지된 ASO가 사용되면, 제1 및 제3 염료의 조합물을 검출하는 것은 제1 유전자 카피에서 다형성을 확인하는 반면에, 제2 및 제3 염료의 조합물을 검출하는 것은 제2 유전자 카피에서 다형성을 확인할 것이다.

유전자형 분석 및 단상형 분석 방법 모두에서, 다형성 부위(들)에서 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드쌍)의 정체는 SLC6A3 유전자의 하나 또는 두 카피, 또는 그의 단편으로부터 다형성 부위(들)을 함유하는 표적 구역(들)을 증폭시키고, 증폭된 구역(들)의 서열을 통상적인 방법에 의해 확인함으로써 결정될 수 있다. 그 부위에서 동종접합성인 개인의 다형성 부위에서 단지 하나의 뉴클레오티드가 검출될 것인 반면, 개인이 그 부위에서 이종접합성이면 2개의 상이한 뉴클레오티드가 검출될 것임을 당업자는 쉽게 알 것이다. 다형성은 직접적으로 (포지티브형 확인으로 공지된) 또는 네가티브형 확인으로 불리는 추론에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, SNP가 참조 집단에서 구아닌 및 시토신인 것으로 알려진 경우, 부위는 그 부위에서 동종접합성인 모든 개인에 대해 구아닌 또는 시토신인 것으로 포지티브로 결정될 수 있거나, 개인이 그 부위에서 이종접합성이면 모두 구아닌 및 시토신인 것으로 결정될 수 있다. 별법으로, 부위는 구아닌이 아니거나 (따라서 시토신/시토신이거나) 또는 시토신이 아닌 (따라서 구아닌/구아닌인) 것으로 네가티브로 결정될 수 있다.

또한, 본원에 설명된 임의의 신규한 다형성 부위에서 대립유전자(들)의 정체는 관심있는 다형성 부위와 LD로 존재하는, 본원에 개시되지 않은 다형성 부위를 유전자형 분석함으로써 간접적으로 결정될 수 있다. 2개의 부위는 한 부위에서의 특정 변이체의 존재가 제2 부위에서의 다른 변이체의 예측가능성을 향상시키면 LD로 존재하는 것으로 말해진다 [Stevens, Mol. Diag., 4: 309-317 (1999)]. 현재 개시된 다형성 부위와 연쇄 비평형인 다형성 부위는 본원에서 검사되지 않은 유전자의 구역 또는 다른 게놈 구역에 위치할 수 있다. 본원에 설명된 신규한 다형성 부위와 LD인 다형성 부위의 유전자형 분석은 비제한적으로 다형성 부위에서 대립유전자의 정체를 검출하기 위한 임의의 상기 언급된 방법에 의해 수행될 수 있다.

표적 구역(들)은 임의의 올리고뉴클레오티드-지정 증폭 방법, 비제한적인 예를 들어 PCR (미국 특허 4,965,188 참조), 리가제 연쇄 반응 (LCR) ([Barany et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(1): 189-193 (1991)] 및 WO 90/01069 참조) 및 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석 (OLA) ([Landegren et al., Science, 241: 1077-1080 (1988)] 참조)을 이용하여 증폭될 수 있다. 상기 방법에서 프라이머 또는 프로브로서 유용한 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위를 함유하거나 그에 인접한 핵산의 구역에 특이적으로 혼성화해야 한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 10-35개의 뉴클레오티드 길이이고, 바람직하게는 15-30개의 뉴클레오티드 길이이다. 가장 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 20-25개의 뉴클레오티드 길이이다. 올리고뉴클레오티드의 정확한 길이는 당업자가 통상 고려하고 실시하는 많은 인자에 따를 것이다.

다른 공지의 핵산 증폭 절차, 예를 들어 전사 기초 증폭 시스템 (미국 특허 5,130,238; EP 329,822; 미국 특허 5,169,766 및 PCT 특허 출원 WO 89/06700 참조) 및 등온 방법 [Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(1): 392-396 (1992)]이 표적 구역을 증폭하기 위해 사용될 수 있다.

표적 구역에서 다형성은 또한 당업계에 공지된 몇몇 혼성화 기초 방법 중 하나를 이용하는 증폭 전후에 분석될 수 있다. 일반적으로, ASO가 상기 방법을 수행하는데 이용된다. ASO는 상이하게 표지된 프로브쌍으로서 사용될 수 있고, 상기 프로브쌍의 한 구성원은 표적 서열의 하나의 변이체에 완벽한 매치를 보이고 다른 구성원은 상이한 변이체에 완벽한 매치를 보인다. 몇몇 실시태양에서, 하나 초과의 다형성 부위가 ASO 세트 또는 올리고뉴클레오티드쌍을 이용하여 동시에 검출될 수 있다. 바람직하게는, 세트의 구성원은 검출되는 각각의 다형성 부위에 대한 혼성화될 때 서로의 5℃ 이내, 보다 바람직하게는 2℃ 이내의 융점을 갖는다.

ASO의 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 혼성화는 두 성분이 용액으로 수행될 수 있거나, 상기 혼성화는 올리고뉴클레오티드 또는 표적 폴리뉴클레오티드가 고체 지지체에 공유 또는 비공유 고정될 때 수행될 수 있다. 부착은 예를 들어 항체-항원 상호작용, 폴리-L-Lys, 스트렙타비딘 또는 아비딘-비오틴, 염 브릿지, 소수성 상호작용, 화학적 연결기, UV 가교결합 소성 등에 의해 매개될 수 있다. ASO는 고체 지지체 상에 직접 합성되거나 합성 후 고체 지지체에 부착될 수 있다. 본 발명의 검출 방법에서 사용하기에 적합한 고체 지지체는 예를 들어 웰 (96-웰 플레이트에서와 같이), 슬라이드, 시트, 멤브레인, 섬유, 칩, 디쉬 및 비드로 형성될 수 있는 실리콘, 유리, 플라스틱, 종이 등으로 이루어진 물질을 포함한다. 고체 지지체는 ASO 또는 표적 핵산의 고정을 용이하게 하도록 처리되거나 코팅되거나 유도체화될 수 있다.

개인의 SLC6A3 유전자에 대한 유전자형 또는 단상형은 또한 WO 95/11995에 기재된 바와 같이 유전자의 하나 또는 두 카피를 함유하는 핵산 샘플을 핵산 어레이 및 서브어레이에 혼성화하여 결정될 수 있다. 어레이는 유전자형 또는 단상형 내에 포함될 각각의 다형성 부위를 나타내는 일군의 ASO를 함유할 것이다.

다형성의 정체는 또한 미스매치 검출 기술, 비제한적인 예를 들어 리보프로브 ([Winter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7575 (1985); 및 Meyers et al., Science, 230: 1242 (1985)] 참조) 및 뉴클레오티드 미스매치를 인식하는 단백질, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) mutS 단백질 [Modrich, Ann. Rev. Genet., 25: 229-253 (1991)]을 사용하는 보호 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 별법으로, 변이체 대립유전자는 단일 스트랜드 구조 다형성 (SSCP) 분석 (Orita et al., Genomics, 5: 874-879 (1989); Humphries et al., Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Elles, Ed., pp. 321-340 (1996)) 또는 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE)에 의해 확인될 수 있다 [Wartell, Hosseini & Moran Jr., Nucl. Acids Res., 18(9): 2699-2706 (1990); 및 Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 232-236 (1989)].

폴리머라제-매개 프라이머 연장 방법이 또한 다형성(들)을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 그러한 방법은 특허 및 학술 문헌에 설명되었고 "유전적 비트 분석 (Genetic Bit Analysis)" 방법 (WO 92/15712 참조) 및 리가제-/폴리머라제-매개 유전적 비트 분석 (미국 특허 5,679,524 참조)을 포함한다. 관련 방법은 WO 91/02087, WO 90/09455, WO 95/17676, 미국 특허 5,302,509 및 5,945,283에 개시되어 있다. 다형성을 함유하는 연장된 프라이머는 미국 특허 5,605,798에 설명된 바와 같이 질량 분광법에 의해 검출될 수 있다. 다른 프라이머 연장 방법은 대립유전자-특이적 PCR이다 [Ruano & Kidd, Nucl. Acids Res., 17: 8392 (1989); Ruano et al., Nucl. Acids Res., 19(24): 6877-6882 (1991); PCT 특허 출원 공개 WO 93/22456; 및 Turki et al., J. Clin. Invest., 95: 1635-1641 (1995)]. 또한, 월레스 (Wallace) 등의 PCT 특허 출원 공개 WO 89/10414에 설명된 바와 같이 대립유전자-특이적 프라이머의 세트를 사용하여 핵산의 다중 구역을 동시에 증폭시킴으로써 다중 다형성 부위를 조사할 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 각각의 민족지리학 군에 대한 단상형 빈도 데이타를 HWE와 일치하는지 결정하기 위해 검사한다. HWE (Hartl et al., Principles of Population Genomics, 3^rd Edition (Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1997) 참조)에서는 단상형쌍 H₁/H₂의 발견 빈도가 H₁ ≠ H₂인 경우 P_H-W (H₁/H₂) = 2p(H₁)p(H₂)와 동일하고 H₁ = H₂인 경우 P_H-W (H₁/H₂) = p(H₁)p(H₂)와 동일한 것으로 가정한다. 관찰 및 예상 단상형 빈도 사이의 통계학상 유의한 차이는 집단군 내의 유의한 근친교배, 유전자 상의 강한 선택 압력, 유전자형 분석 과정에서 샘플링 편향 및(또는) 오차를 포함하는 하나 이상의 인자로 인한 것일 수 있다. 민족지리학군에서 HWE로부터 큰 편차가 관찰되면, 편차가 샘플링 편향으로 인한 것인지 확인하기 위해 군 내의 개인 수는 증가될 수 있다. 보다 큰 샘플 크기가 관찰 및 예상 단상형쌍 빈도 사이의 차이를 감소시키지 않으면, 직접 단상형 분석 방법, 예를 들어 CLASPER System™ 기술 (미국 특허 5,866,404 참조) 또는 대립유전자-특이적 광범 (long-range) PCR [Michalotos-Beloin et al., Nucl. Acids Res. 24(23): 4841-4843 (1996)]을 이용하여 개인에 대해 단상형 분석을 실시하는 것을 고려하기를 바랄 수 있다.

SLC6A3 단상형쌍을 예측하기 위한 본 방법의 한 실시태양에서, 배정 단계는 다음 분석을 수행하는 것을 포함한다. 먼저, 각각의 가능한 단상형쌍을 참조 집단 내의 단상형쌍에 비교한다. 일반적으로, 참조 집단 내의 단상형쌍 중 하나만이 가능한 단상형쌍에 매치되고, 그 쌍이 개인에 배정된다. 때때로, 참조 단상형쌍에서 표현되는 단지 하나의 단상형이 개인에 대해 가능한 단상형쌍과 일치하고, 이 경우 개인에게 상기 공지의 단상형 및 공지의 단상형을 가능한 단상형쌍으로부터 공제하여 유도된 새로운 단상형을 함유하는 단상형쌍이 배정된다. 드문 경우에, 참조 집단 내의 단상형이 가능한 단상형쌍과 전혀 일치하지 않거나, 별법으로, 다중의 참조 단상형쌍이 가능한 단상형쌍과 일치한다. 이 경우에, 개인은 바람직하게는 직접 분자 단상형 분석 방법, 예를 들어 CLASPER System™ 기술 (미국 특허 5,866,404 참조), SMD 또는 대립유전자-특이적 광범 PCR [Michalotos-Beloin et al. (1996), 상기 문헌]을 이용하여 단상형 분석된다.

본 발명은 또한 집단 내의 SLC6A3 유전자형 또는 SLC6A3 단상형의 빈도를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 집단의 각 구성원에 존재하는 SLC6A3 유전자에 대해 유전자형 또는 단상형쌍을 결정하고 (여기서 유전자형 또는 단상형은 FS63 TER 다형성을 포함하지만 이로 제한되지 않는 SLC6A3 유전자 내의 하나 이상의 다형성 부위에서 검출된 뉴클레오티드쌍 또는 뉴클레오티드를 포함한다); 임의의 특정 유전자형 또는 단상형이 집단 내에서 발견되는 빈도를 계산하는 것을 포함한다. 집단은 참조 집단, 가족 집단, 동성 집단, 집단군, 형질 (trait) 집단, 예를 들어 의료 상태 또는 치료 처치에 대한 반응과 같은 관심있는 형질을 나타내는 개인의 군일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 참조 집단에서 발견되는 SLC6A3 유전자형 및(또는) 단상형에 대한 빈도 데이타는 형질과 SLC6A3 유전자형 또는 SLC6A3 단상형 사이의 상관성을 확인하기 위한 방법에서 이용된다. 형질은 질병에 대한 감수성 또는 치료에 대한 반응을 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 검출가능한 표현형일 수 있다. 상기 방법은 참조 집단, 및 형질을 나타내는 집단에서 관심있는 유전자형(들) 또는 단상형(들)의 빈도에 대한 데이타를 얻는 것을 포함한다. 참조 및 형질 집단 중 하나 또는 둘 모두에 대한 빈도 데이타는 상기 설명된 방법 중 하나를 이용하여 집단 내의 각각의 개인을 유전자형 분석 또는 단상형 분석함으로써 얻을 수 있다. 형질 집단에 대한 단상형은 직접적으로, 또는 별법으로 상기 설명된 단상형 방법에 대한 예측 유전자형에 의해 결정될 수 있다.

다른 실시태양에서, 참조 및(또는) 형질 집단에 대한 빈도 데이타는 기록 형태 또는 전자적 형태일 수 있는 앞서 결정된 빈도 데이타를 사용하여 얻어진다. 예를 들어, 빈도 데이타는 컴퓨터에 의해 사용가능한 데이타베이스 내에 존재할 수 있다. 빈도 데이타가 얻어지면, 참조 및 형질 집단 내의 관심있는 전형(들) 또는 단상형(들)의 빈도를 비교한다. 바람직한 실시태양에서, 집단에서 관찰된 모든 유전자형 및(또는) 단상형의 빈도가 비교된다. SLC6A3 유전자에 대한 특정 유전자형 또는 단상형이 참조 집단에서보다 형질 집단에서 통계학상 유의한 양으로 더 빈번하면, 형질은 그 SLC6A3 유전자형 또는 단상형과 연관된 것으로 예측된다.

바람직한 실시태양에서, 통계학적 분석은 본페로니 보정을 사용하는 표준 분산 분석 (ANOVA) 시험 및(또는) 유전자형 표현형 상관관계를 여러번 모의하고 유의성 값을 계산하는 부트스트랩핑 (bootstrapping) 방법을 이용하여 수행한다. 많은 다형성이 분석되는 경우, 우연히 발견될 수 있는 유의한 상관성에 대해 교정하기 위해 인자에 대한 교정이 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 통계학 방법에 대해서는 문헌 [Statistical Methods in Biology, Third Edition, Bailey, ed., Cambridge Univ. Press (1997); Introduction to Computational Biology, Waterman, ed., CRC Press (2000); 및 Bioinformatics, Baxevanis and Ouellette, eds., John Wiley & Sons, Inc. (2001)]을 참조한다.

방법의 바람직한 실시태양에서, 관심있는 형질은 일부 치료 처치에 대해 환자가 나타내는 임상 반응, 예를 들어 SLC6A3을 표적화하는 약물에 대한 반응 또는 의료 상태에 대한 치료 처치에 대한 반응이다 .

본원에서 사용되는 용어 "연쇄 비평형" (LD)은 유전 마커들의 일부 조합이 게놈 내의 그들의 거리를 기초로 예상되거나 단독으로 우연히 발생하는 것보다 집단 내에서 함께 다소 빈번하게 발생하는 상황을 의미한다. 이는 게놈의 상기 영역 내의 감소된 재조합으로 인해, 또는 마커의 하나가 집단 내로 도입되었으므로 평형에 도달하기 위한 시간이 불충분한 파운더 (founder) 효과로 인해 발생할 수 있다.

마커들이 이들이 발생하여야 하는 것보다 더 빈번하게 발생할 때, 이는 또한 마커들이 게놈 상에 함께 가까이 있고 따라서 동등하게 유전되는 경향이 있음을 의미할 수 있다. 두 경우에, 하나의 마커의 존재는 다른 마커가 또한 특정 환자에 존재할 것으로 만든다. 상기 상황에서, 환자의 게놈 내에 이들 마커 중 하나의 존재는 다른 것의 대리 마커로서 사용될 수 있다. 하나의 마커가 다른 것보다 더 쉽게 검출될 수 있으면, 관심있는 특이적인 마커 대신에 보다 쉽게 검출되는 마커에 대해 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 연쇄 비평형으로 존재하는 마커들은 서로 임의의 기능적 관계를 갖거나 갖지 않을 수 있다. 함께 유전되는 마커의 경향은 자리 사이의 재조합 비율에 의해 측정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "대리 마커"는 우연히 예상되는 것보다 더 종종 관심있는 SLC6A3 유전적 마커와 함께 발생하는 경향이 있는 유전 마커, 예를 들어 SNP 또는 특이적 유전자형 또는 단상형을 의미한다. 따라서, 상기 대리 마커의 검출은 본 발명의 방법에서 관심있는 마커가 우연히 예상되는 것보다 존재할 가능성이 더 큰 것을 또한 나타내는 것으로 사용될 수 있다. 상기 상관성이 충분히 유의하면, 대리 마커의 검출이 관심있는 마커의 존재를 나타내도록 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 방법에서는 관심있는 SLC6A3 유전자형 또는 단상형과 상관성으로 발생하는 것으로 나타난 대리 마커를 이용할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시태양에서, 관심있는 SLC6A3 유전자형 또는 단상형과 LD로 존재하는 검출가능한 유전자형 또는 단상형은 대리 마커로서 사용될 수 있다. SLC6A3 유전자형과 LD로 존재하는 유전자형은 SLC6A3 유전자에 대한 특정 유전자형 또는 단상형이 참조 집단에서보다 통계학상 유의한 비율 또는 양으로 잠재적인 대리 마커 유전자형을 또한 보이는 집단 내에서 더 빈번한지 결정함으로써 발견될 수 있다. 상기한 경우, 상기 마커 유전자형은 SLC6A3 유전자형 또는 단상형과 관련되는 것으로 예측되고, 따라서 SLC6A3 유전자형 대신 대리 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 대리 마커가 관심있는 마커와 함께 발생할 가능성이 50％ 초과, 바람직하게는 60％ 초과, 보다 바람직하게는 70％ 초과, 훨씬 더 바람직하게는 80％ 초과, 또는 훨씬 더 바람직한 실시태양에서 90％ 초과, 또는 보다 바람직한 실시태양에서 95％ 초과인 경우 대리 마커는 상기한 방식으로 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "의료 상태"는 치료가 요망되는 하나 이상의 신체적 및(또는) 심리적 증상으로 나타난 임의의 병 또는 질환을 포함하지만 이로 제한되지 않고, 앞서 및 새로 확인된 질병 및 다른 질환을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "다형성"은 집단 내에 >1％의 빈도로 존재하는 임의의 서열 변이체를 의미할 것이다. 서열 변이체는 1％보다 유의하게 더 큰, 예를 들어 5％ 또는 10％ 이상의 빈도로 존재할 수 있다. 또한, 상기 용어는 다형성 부위에서 개인에서 관찰된 서열 변이를 나타내도록 사용될 수 있다. 다형성은 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결손 및 마이크로새틀라이트 (microsatellite)을 포함하고, 유전자 발현 또는 단백질 기능에서 검출가능한 차이를 생성시킬 수 있지만 그래야 할 필요는 없다.

본원에서 사용되는 용어 "임상 반응"은 임의의 또는 모든 반응, 반응 없음 및 이상 반응, 즉, 부작용의 정량적 측정치를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "대립유전자"는 특이적 염색체 위치 (자리)에서 유전자 또는 DNA 서열의 특정 형태를 의미할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자형"은 개인에서 상동 염색체쌍 상의 자리에서 하나 이상의 다형성 부위에서 뉴클레오티드쌍(들)의 비상관된 5' 내지 3' 서열을 의미할 것이다. 본원에서 사용되는 유전자형은 완전-유전자형 및(또는) 서브-유전자형을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 임의의 RNA 또는 DNA를 의미할 것이고, 이는 비변형 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일- 및 이중-스트랜드 DNA, 단일- 및 이중-스트랜드 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-스트랜드 RNA, 및 단일- 및 이중-스트랜드 구역의 혼합물인 RNA, 및 단일-스트랜드 또는 보다 일반적으로 이중-스트랜드일 수 있거나 단일- 및 이중-스트랜드 구역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 모두 포함하는 삼중-스트랜드 구역을 나타낸다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 주쇄를 갖는 DNA 또는 RNA를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)"은 집단 내에서 게놈 내의 단일 뉴클레오티드 위치에서 뉴클레오티드 가변성의 발생을 의미할 것이다. SNP는 유전자 내에서 또는 게놈의 유전자간 구역 내에서 발생할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자"는 프로모터, 엑손, 인트론, 및 발현을 제어하는 다른 비번역 구역을 포함하는, RNA 생성물의 조절된 생합성에 대한 모든 정보를 함유하는 DNA의 절편을 의미할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합 또는 변형 펩티드 결합, 즉 펩티드 동배체 (isostere)에 의해 서로 연결된 2 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 폴리펩티드를 의미할 것이다. 폴리펩티드는 흔히 펩티드, 당펩티드 또는 올리고머로 불리는 짧은 사슬, 및 일반적으로 단백질로 불리는 보다 긴 사슬을 모두 의미한다. 폴리펩티드는 20개의 유전자에 의해 코딩된 아미노산 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 자연적 과정, 예를 들어 번역후 프로세싱에 의해, 또는 당업계에 공지된 화학 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 변형은 기초 문헌 및 보다 상세한 각론과 또한 방대한 연구 문헌에 잘 설명되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "다형성 부위"는 그의 최고 빈도가 99％ 이하의 빈도를 갖는 적어도 2개의 대체 서열이 집단에서 발견되는 자리 내의 위치를 의미할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드쌍"은 개인으로부터 염색체의 2 카피 상의 다형성 부위에서 발견된 뉴클레오티드를 의미할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "상관된"은 자리 내의 2 이상의 다형성 부위에 대해 뉴클레오티드쌍의 서열에 적용될 때, 상기 자리의 단일 카피 상의 상기 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 조합이 공지된 것을 의미한다.

치료에 대한 임상 반응과 SLC6A3 유전자형 또는 단상형 사이의 상관관계를 추론하기 위해, 이하 "임상 집단"으로 부르는 치료를 받은 개인들의 집단이 나타낸 임상 반응에 대한 데이타를 얻는 것이 필요하다. 상기 임상 데이타는 이미 실행된 임상 시험의 결과를 분석함으로써 얻을 수 있고(있거나) 임상 데이타는 하나 이상의 새로운 임상 시험을 설계하고 수행함으로써 얻을 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "임상 시험"은 특정 치료에 대한 반응의 임상 데이타를 수집하기 위해 설계된 임의의 연구를 의미하고, I상, II상 및 III상 임상 시험을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 표준 방법이 환자 집단을 규정하고 대상을 등록하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "자리"는 유전자 또는 신체적 또는 표현형 특징에 대응하는 염색체 또는 DNA 분자 상의 위치를 의미할 것이다.

임상 집단에 포함된 개인은 관심있는 의료 상태의 존재에 대해 등급을 매겨지는 것이 바람직하다. 이는 환자가 나타내는 증상(들)이 하나를 초과하는 근원적인 병에 의해 유발될 수 있는 경우 및 근원적인 병의 치료가 동일하지 않은 경우에 중요하다. 상기한 경우의 예는 환자가 천식 또는 호흡기 감염으로 인한 호흡 곤란을 경험하는 경우일 것이다. 두 세트 모두 천식 의약품으로 치료되면, 실제로 천식을 갖지 않은 명백한 비-반응군의 가짜 군이 존재할 것이다. 이들은 단상형과 치료 결과 사이의 임의의 상관관계를 검출할 수 있는 능력에 영향을 미칠 것이다. 이러한 잠재적인 환자를 등급 매기는 것은 표준 신체 검사 또는 하나 이상의 실험실 시험을 이용할 수 있다. 별법으로, 환자를 등급 매기는 것은 단상형쌍과 질병 감수성 또는 심도 사이에 강한 상관관계가 있는 상황에 대해 단상형 분석을 이용할 수 있다.

관심있는 치료 처치제는 시험 집단에서 각 개인에게 투여되고, 처치에 대한 각 개인의 반응은 하나 이상의 소정의 기준을 이용하여 측정된다. 많은 경우에 시험 집단은 넓은 범위의 반응을 나타낼 것이고, 조사자는 다양한 반응에 의해 형성된 반응군, 예를 들어 저, 중간 및 고반응군의 수를 선택할 것으로 생각된다. 또한, 시험 집단 내의 각각의 개인에 대한 SLC6A3 유전자는 유전자형 분석되고(되거나) 단상형 분석되고, 이는 처치제의 투여 전후에 수행될 수 있다.

임상 및 다형성 데이타가 얻어진 후, 개인 반응과 SLC6A3 유전자형 또는 단상형 함량 사이의 상관관계가 생성된다. 상관관계는 여러 방식으로 생성될 수 있다. 한 방법에서, 개인은 그들의 SLC6A3 유전자형 또는 단상형 (또는 단상형쌍)에 의해 그룹핑하고 (또한 다형성 군으로도 칭함), 각각의 다형성 군의 구성원이 나타내는 임상 반응의 평균 및 표준 편차를 계산한다.

이어서 이들 결과는 다형성 군들 사이의 임상 반응에서 임의의 관찰된 변동이 통계학상 유의한지 결정하기 위해 분석된다. 사용될 수 있는 통계학적 분석 방법은 문헌 [Fisher & vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, NY, 1993)]에 기재되어 있다. 상기 분석은 또한 그의 SLC6A3 유전자 내의 다형성 부위가 표현형의 차이에 가장 유의하게 기여하는 회귀 계산을 포함할 수 있다.

SLC6A3 단상형 함량과 임상 반응 사이의 상관관계를 발견하기 위한 제2 방법은 오차-최소화 최적화 알고리즘에 기초하는 예측 모델을 사용한다. 많은 가능한 최적화 알고리즘 중 하나가 유전적 알고리즘이다 [Judson, "Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry", Reviews in Computational Chemistry, Lipkowitz & Boyd, Eds., Vol.10, pp.1-73 (VCH Publishers, NY, 1997)]. 시뮬레이티드 어닐링 (Press et al., Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing, Ch. 10 (Cambridge University Press, Cambridge, 1992) 참조), 신경망 (Rich and Knight, Artificial Intelligence, Second Edition., Ch.18 (McGraw-Hill, New York, 1991) 참조), 표준 구배 강하 (descent) 방법 (Press et al. (1992), 상기 문헌 참조) 또는 다른 전반적 또는 국소적 최적화 방법 (Judson (1997), 상기 문헌의 논의 참조)이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상관관계는 PCT 출원 (2000년 6월 26일자 출원, 발명의 명칭 "Methods for Obtaining and Using Haplotype Data")에 설명된 바와 같은 유전적 알고리즘 방법을 이용하여 발견된다.

상관관계는 또한 임상 데이타에서 어느 정도의 변동이 SLC6A3 유전자 내의 다형성 부위의 상이한 서브세트에 의해 설명되는지 결정하기 위해 ANOVA 기술을 이용하여 분석될 수 있다. PCT 출원 (2000년 6월 26일자 출원, 발명의 명칭 "Methods for Obtaining and Using Haplotype Data")에 설명된 바와 같이, ANOVA는 반응 변수가 측정될 수 있는 하나 이상의 형질 또는 변수에 의해 유발되거나 상호관련되는지에 대한 가설을 시험하기 위해 사용된다 [Fisher & vanBelle (1993), 상기 문헌].

상기 설명된 분석으로부터, 당업자는 SLC6A3 유전자형 또는 단상형 함량의 함수로서 임상 반응을 예측하는 수학적 모델을 쉽게 제작할 수 있다. 바람직하게는, 모델은 모델을 시험하기 위해 설계된 하나 이상의 추적 임상 시험에서 확인된다.

임상 반응과 SLC6A3 유전자에 대한 유전자형 또는 단상형 (또는 단상형쌍) 사이의 상관성의 확인은 치료에 반응하거나 반응하지 않을, 또는 별법으로 보다 낮은 수준에서 반응하고, 따라서 보다 많은 치료, 즉, 보다 많은 용량의 약물을 요구할 수 있는 개인을 결정하기 위한 진단 방법을 설계하기 위한 기초가 될 수 있다. 진단 방법은 몇가지 형태, 예를 들어 직접 DNA 시험, 즉, SLC6A3 유전자 내의 하나 이상의 다형성 부위를 유전자형 분석 또는 단상형 분석하는 시험; 혈청학 시험; 또는 신체 검사 측정 중 하나를 취할 것이다. 유일한 요건은 진단 시험 결과와, 임상 반응과 상호관련되는 근원적인 SLC6A3 유전자형 또는 단상형 사이의 우수한 상관관계가 있는 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 진단 방법은 상기 설명된 예측 단상형 분석 방법을 이용한다.

컴퓨터는 본 발명의 방법을 실시하는데 관여된 임의의 또는 모든 분석적 및 수학적 작업을 충족시킬 수 있다. 또한, 컴퓨터는 디스플레이 장치 상에 표시된 뷰 (view) (또는 스크린)을 생성시키고 그를 이용하여 사용자가 SLC6A3 유전자 및 그의 게놈 변이, 예를 들어 염색체 위치, 유전자 구조 및 유전자 패밀리, 유전자 발현 데이타, 다형성 데이타, 유전 서열 데이타 및 임상 데이타 집단 데이타, 예를 들어 민족지리학 기원 상의 데이타, 임상 반응, 하나 이상의 집단에 대한 유전자형 및 단상형에 관한 다량의 정보를 보고 분석하기 위해 상호작용할 수 있는 프로그램을 실행할 수 있다. 본원에 설명된 SLC6A3 다형성 데이타는 관계 데이타베이스, 예를 들어 Oracle 데이타베이스 또는 ASCII 플랫 파일의 세트의 일부로서 저장될 수 있다. 이들 다형성 데이타는 컴퓨터의 하드 드라이브 상에 저장될 수 있거나, 예를 들어 CD-ROM 또는 컴퓨터로 이용가능한 하나 이상의 다른 저장 장치 상에 저장될 수 있다. 예를 들어, 데이타는 네트워크를 통해 컴퓨터와 통신하는 하나 이상의 데이타베이스 상에 저장될 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 개인의 SLC6A3 유전자를 단상형 분석하고(하거나) 유전자형을 분석하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공한다. 조성물은 다형성 부위를 포함하거나 그에 인접한 하나 이상의 표적 구역에 특이적으로 혼성화하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브 및 프라이머를 포함한다. 본원에 설명된 신규한 다형성 부위에서 개인의 유전자형 또는 단상형을 확립하기 위한 방법 및 조성물은 SLC6A3 단백질 발현 및 기능 또는 그의 결핍에 의해 영향을 받는 질병의 병인에서 다형성의 영향을 연구하고, SLC6A3을 표적화하는 약물의 효능을 연구하고, SLC6A3 단백질의 발현 및 기능에 의해 영향을 받는 질병에 대한 개인의 감수성을 예측하고, SLC6A3를 표적화하는 약물에 대한 개인의 반응성을 예측하기 위해 유용하다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 유전자형 또는 단상형과 형질 사이의 상관성을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 형질은 질병에 대한 감수성, 질병의 심도, 질병의 단계 결정 또는 약물에 대한 반응이다. 상기 방법은 효능 측정, 약물운동학 측정 및 부작용 측정을 포함하는 유전자형과 치료 결과 사이의 상관성에 대한 가능성이 존재하는 모든 약리유전학 용도에 대한 진단 시험 및 치료 처치를 개발하는데 적용성을 갖는다.

본 발명은 또한 SLC6A3 유전자에 대해 결정된 다형성 데이타를 저장하고 표시하기 위한 컴퓨터 시스템을 제공한다. 컴퓨터 시스템은 컴퓨터 프로세싱 유닛; 디스플레이; 및 다형성 데이타를 포함하는 데이타베이스를 포함한다. 다형성 데이타는 다형성, 참조 집단에서 SLC6A3 유전자에 대해 확인된 유전자형 및 단상형을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 컴퓨터 시스템은 그들의 진화 관계에 따라 조직된 SLC6A3 단상형을 보여주는 디스플레이를 생성시킬 수 있다.

본원에서 확인된 다형성 부위를 설명하는데 있어서, 편의상 유전자의 센스 스트랜드에 대해 언급한다. 그러나, 당업자가 인정하는 바와 같이, SLC6A3 유전자를 함유하는 핵산 분자는 상보성 이중 스트랜드 분자일 수 있고, 따라서 센스 스트랜드 상의 특정 부위를 언급하면 상보성 안티센스 스트랜드의 상응하는 부위를 또한 언급하는 것이다. 따라서, 양 스트랜드 상의 동일한 다형성 부위를 언급할 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 다형성 부위를 포함하는 표적 구역에서 양 스트랜드에 특이적으로 혼성화하도록 설계될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 설명된 SLC6A3 게놈 변이체의 센스 스트랜드에 상보성인 단일-스트랜드 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본원에서 확인된 다형성의 SLC6A3의 발현에 대한 효과(들)은 SLC6A3 유전자의 다형성 변이체를 포함하는 재조합 세포 및(또는) 유기체, 바람직하게는 재조합 동물을 제조함으로써 조사할 수 있다. 본원에서 사용되는 "발현"은 유전자의 전구체 mRNA로의 전사; 성숙 mRNA를 생산하기 위한 전구체 mRNA의 스플라이싱 및 다른 프로세싱; mRNA 안정성; 성숙 mRNA의 SLC6A3 단백질로의 번역, 예를 들어 코돈 사용량 및 tRNA 이용가능성; 및 적절한 발현 및 기능을 위해 요구되는 경우 번역 생성물의 글리코실화 및(또는) 다른 변형 중 하나 이상을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 세포를 제조하기 위해, 목적하는 SLC6A3 동종유전자는 동종유전자가 염색체 외에 남아있도록 벡터 내에서 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 상황에서, 유전자는 염색체외 위치로부터 세포에 의해 발현될 것이다. 바람직한 실시태양에서, SLC6A3 동종유전자는 세포 내에 존재하는 내인성 SLC6A3 유전자와 재조합되도록 하는 방식으로 세포 내로 도입된다. 상기 재조합은 이중 재조합 사건의 발생을 필요로 하여, 목적하는 SLC6A3 유전자 다형성을 생성시킨다. 재조합 및 염색체외 유지 모두를 위한 유전자의 도입을 위한 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 임의의 적합한 벡터 또는 벡터 구성물이 본 발명에서 사용될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입하기 위한 방법, 예를 들어 전기천공, 입자 폭격, 인산칼슘 공침 및 바이러스 형질도입은 당업계에 공지되어 있고, 따라서, 방법의 선택은 당업계의 숙련인의 능력과 선호도에 따라 결정될 수 있다.

SLC6A3 동종유전자가 도입될 수 있는 세포의 예는 연속 배양 세포, 예를 들어 COS, NIH/3T3, 및 관련 조직형의 일차 또는 배양 세포 (즉, 이들은 SLC6A3 동종유전자를 발현한다)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 재조합 세포는 상이한 단백질 변이체의 생물학적 활성을 비교하기 위해 사용될 수 있다.

변이체 유전자를 발현하는 재조합 유기체, 즉 트랜스제닉 동물은 당업계에 공지된 표준 과정을 이용하여 제조된다. 바람직하게는, 변이체 유전자를 포함하는 구성물은 비-인간 동물 또는 동물의 선조 내로 배아 단계, 즉, 1-세포 단계, 또는 일반적으로 약 8-세포 단계 이전에 도입된다. 본 발명의 구성물을 보유하는 트랜스제닉 동물은 당업계의 숙련인에게 공지된 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 방법은 하나 이상의 절연 요소, 목적하는 유전자(들), 및 절연된 유전자를 트랜스젠으로서 정박시키는 완전한 셔틀 벡터를 제공하기 위해 당업계의 숙련인에게 공지된 다른 성분을 포함하도록 제작된 레트로바이러스를 배아 내로 형질감염시키는 것을 포함한다 (미국 특허 5,610,053 참조). 다른 방법은 트랜스젠을 배아 내에 직접 주사하는 것을 포함한다. 제3 방법은 배아 줄기 세포를 사용하는 것을 포함한다.

SLC6A3 동종유전자가 도입될 수 있는 동물의 예는 마우스, 래트, 다른 설치류 및 비-인간 영장류를 포함하지만 이로 제한되지 않는다 ["The Introduction of Foreign Genes into Mice" 및 여기에 인용된 참조문, In: Recombinant DNA, Watson, Gilman, Witkowski & Zoller, eds. (W.H. Freeman & Company, NY) pp. 254-272]. 인간 SLC6A3 동종유전자를 안정하게 발현하고 인간 SLC6A3 단백질을 생산하는 트랜스제닉 동물은 비정상적인 SLC6A3 발현 및(또는) 활성과 관련된 질병을 연구하고, 이들 질병의 증상 또는 영향을 감소시키기 위해 다양한 후보 약물, 화합물 및 치료 방법을 스크리닝하고 분석하기 위한 생물학적 모델로서 사용될 수 있다.

TAQMAN ™ 기반 mRNA 수준 분석. RT-PCR (실시간 정량 PCR) 분석은 mRNA 스트랜드를 포함하는 RNA 스트랜드로부터 DNA 스트랜드의 합성을 촉매하기 위해 RNA 역전사효소를 이용한다. 생성되는 DNA는 특이적으로 검출되고 정량될 수 있고, 상기 방법은 mRNA의 특이적 종의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이를 수행하기 위한 한 방법은 상표 TAQMAN (피이 어플라이드 바이오시스템즈 (PE Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로 공지되어 있고, PCR 반응 동안 프로브의 특이적 형태를 절단하기 위해 AMPLI TAQ GOLD™ DNA 폴리머라제의 5' 뉴클레아제 활성을 이용한다. 이는 TAQMAN™ 프로브로 불린다 [Luthra et al., "Novel 5' Exonuclease-Based Real-Time PCR Assay For the Detection of t(14;18)(q32;q21) in Patients With Follicular Lymphoma", Am. J. Pathol., 153: 63-68 (1998)]. 프로브는 5'-리포터 염료 및 3'-켄쳐 염료를 갖는 올리고뉴클레오티드 (보통 ≒ 20mer)로 이루어진다. 형광 리포터 염료, 예를 들어 FAM (6-카르복시플루오레신)은 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 공유 연결된다. 리포터는 3' 말단에 위치한 링커를 통해 부착된 TAMRA (6-카르복시-N,N,N',N'-테트라메틸로다민)에 의해 켄칭된다 (Kuimelis et al., "Structural Analogues of TaqMan Probes for Real-Time Quantitative PCR", Nucl. Acids Symp. Ser., 37: 255-256 (1997); 및 Mullah et al., "Efficient Synthesis of Double Dye-Labelled Oligodeoxyribonucleotide Probes and Their Application in a Real Time PCR Assay", Nucl. Acids Res., 26(4):1026-1031 (1998) 참조). 반응 동안, 프로브의 절단은 리포터 염료 및 켄쳐 염료를 분리시키고, 이에 의해 리포터의 형광이 증가한다.

PCR 생성물의 누적은 리포터 염료의 형광 증가를 모니터링함으로써 직접 검출된다 [Heid et al., "Real Time Quantitative PCR", Genome Res., 6(6): 986-994 (1996)]. 반응은 고정된 수의 사이클 후 누적된 PCR 생성물의 양보다 PCR 생성물의 증폭이 먼저 검출되는 사이클 동안의 시점을 특징으로 한다. 핵산 표적의 출발 카피 수가 더 많을수록, 형광의 유의한 증가가 보다 빨리 관찰된다 [Gibson, Heid & Williams et al., "A Novel Method For Real Time Quantitative RT-PCR", Genome Res., 6: 995-1001 (1996)].

프로브가 무손상일 때, 켄처 염료에 대한 리포터 염료의 접근은 주로 푀스터 (Foerster)형 에너지 전달에 의해 리포터 형광의 억제를 일으킨다 [Lakowicz et al., "Oxygen Quenching and Fluorescence Depolarization of Tyrosine Residues in Proteins", J. Biol. Chem., 258: 4794-4801 (1983)]. PCR 동안, 관심있는 표적이 존재하는 경우, 프로브는 전방향 및 역방향 프라이머 부위 사이에 특이적으로 어닐링한다. AMPLITAQ GOLD™ DNA 폴리머라제의 5'-3' 핵산분해 활성은 프로브가 표적에 혼성화하는 경우에만 리포터와 켄처 사이에서 프로브를 절단한다. 이어서 프로브 단편이 표적으로부터 치환되고, 스트랜드의 중합이 계속된다. 상기 과정은 매 사이클에서 발생하고, 생성물의 기하급수적 누적을 저해하지 않는다. PCR 동안 프로브 연장을 방지하기 위해 프로브의 3' 말단은 차단된다.

수동 대조물은 TAQMAN™ 버퍼 내에 포함된 염료이고, 5' 뉴클레아제 분석에 참여하지 않는다. 수동 대조물은 그에 대해 리포터 염료 시그널이 데이타 분석 동안 표준화될 수 있는 내부 대조물을 제공한다. 표준화는 농도 또는 부피 변화로 인한 형광 변동에 대해 교정하기 위해 필요하다.

표준화는 주어진 반응 튜브에 대해 R_n (표준화된 리포터)으로 정의된 비율을 얻기 위해 리포터 염료의 발광 강도를 수동 대조물의 발광 강도로 나누어 달성된다.

역치 사이클 또는 C_t값은 ΔR_n에서 통계학상 유의한 증가가 처음 검출된 사이클이다. R_n 대 사이클 수의 그래프에서, 역치 사이클은 서열 검출기가 PCR 생성물의 기하급수적 성장과 연관된 시그널의 증가를 검출하기 시작할 때 발생한다.

정량적 측정을 수행하기 위해, 정확하고 신속한 mRNA 정량에 필요한 표준 곡선을 작성하기 위해 cRNA의 계열 희석액 (표준품)을 각각의 실험에 포함시킨다. 기술의 재현성을 추정하기 위해, 동일한 cRNA의 증폭을 단순히 여러번 수행할 수 있다.

세포의 전사 상태를 측정하기 위한 다른 기술, 예를 들어 이중 제한 효소 소화를 페이싱 (phasing) 프라이머와 결합시키는 방법 (예를 들어 EP 0 534 858 A1 (1992년 9월 24일자 출원, Zabeau 등) 참조), 또는 규정된 mRNA 말단에 가장 가까운 부위를 갖는 제한 단편을 선택하는 방법 (예를 들어 문헌 [Prashar & Weissman, "Analysis of Differential Gene Expression by Display of 3' End Restriction Fragments of cDNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(2): 659-663 (1996)] 참조)은 전기영동 분석에 대한 복잡성이 제한된 제한 단편 풀을 생성한다.

다른 방법은 예를 들어 각각의 cDNA를 확인하기 위해 다수의 cDNA 각각에서 충분한 염기, 예를 들어 20-50개의 염기를 서열분석함으로써, 또는 규정된 mRNA 말단 경로 패턴에 대해 공지된 위치에서 생성되는 짧은 태그, 예를 들어 9-10개의 염기를 서열분석함으로써 (예를 들어 문헌 [Velculescu, Science, 270: 484-487 (1995)] 참조) cDNA 풀을 통계학적으로 샘플링한다.

다른 측면의 측정. 본 발명의 상이한 실시태양에서, 전사 상태 외의 생물학적 상태의 측면, 예를 들어 번역 상태, 활성 상태 또는 이들의 혼합 측면이 약물 및 경로 반응을 얻기 위해 측정될 수 있다. 이들 실시태양에 대한 상세한 내용을 본 섹션에서 설명한다.

번역 상태 측정. 유전자(들)에 의해 코딩된 단백질의 발현은 검출가능하게 표지되거나 후속적으로 표지될 수 있는 프로브에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, 프로브는 발현된 단백질을 인식하는 항체이다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화 또는 키메릭 항체, 및 항체 단편이 단백질에 결합하는데 충분한 생물학적 기능성의 항체 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

본원에 개시된 유전자 중 하나에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 생산하기 위해, 다양한 숙주 동물을 폴리펩티드 또는 그의 일부를 주사하여 면역화시킬 수 있다. 상기 숙주 동물은 일부 예를 들어 토끼, 마우스 및 래트를 포함할 수 있고 이로 제한되지 않는다. 면역 반응을 증가시키기 위해 숙주 종에 따라 다양한 항원보강제, 비제한적인 예를 들어 프로인트 (Freund) (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄; 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 디니트로페놀; 및 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제, 예를 들어 BCG (bacille Camette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)을 사용할 수 있다.

폴리클로날 항체는 항원, 예를 들어 표적 유전자 생성물, 또는 그의 항원 기능 유도체로 면역화시킨 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 집단이다. 폴리클로날 항체를 생산하기 위해, 상기 설명한 바와 같은 숙주 동물을 또한 상기 설명한 바와 같은 항원보강제로 보충한 코딩된 단백질 또는 그의 일부를 주사하여 면역화시킬 수 있다.

특정 항원에 대한 항체의 동종 집단인 모노클로날 항체 (mAb)는 배양물 내 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술에 의해 얻을 수 있다. 이는 하이브리도마 기술 [Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975) 및 미국 특허 4,376,110], 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kosbor et al., Immunol. Today, 4: 72 (1983); Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030 (1983)]; 및 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., 1985) pp. 77-96]을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 항체는 임의의 면역글로불린 클래스, 예를 들어 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 임의의 서브클래스의 것일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 고역가 mAb를 생체 내에서 생산하는 것이 현재 바람직한 생산 방법이다.

또한, 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 스플라이싱함으로써 "키메릭 항체"를 생산하기 위해 개발된 기술 (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984); 및 Takeda et al., Nature, 314: 452-454 (1985) 참조)이 사용될 수 있다. 키메릭 항체는 상이한 부분이 상이한 동물종으로부터 유래하는 분자, 예를 들어 쥐 mAb로부터 유래된 가변 또는 초가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 구역을 갖는 것이다.

별법으로, 단쇄 항체 생산을 위해 설명된 기술 (미국 특허 4,946,778; Bird, Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Ward et al., Nature, 334: 544-546 (1989))이 상이하게 발현된 유전자 단쇄 항체를 생산하기 위해 채용될 수 있다. 단쇄 항체는 Fv 구역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 브릿지를 통해 연결시켜 단쇄 항체 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다.

보다 바람직하게는, "인간화 항체" 생산에 유용한 기술을 단백질에 대한 항체, 단편 또는 그의 유도체 생산에 채용할 수 있다. 상기 기술은 미국 특허 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,661,016 및 5,770,429에 개시되어 있다.

특이적 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편 및 F(ab')₂ 단편의 디술피드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 별법으로, 요구되는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 위해 Fab 발현 라이브러리를 제조할 수 있다 (Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989) 참조).

이어서, 공지의 단백질이 샘플에서 발현되는 정도를 상기한 항체를 이용하는 면역분석 방법으로 결정한다. 상기 면역분석 방법은 도트 (dot) 블로팅, 웨스턴 블로팅, 경쟁적 및 비-경쟁적 단백질 결합 분석, 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA), 면역조직화학, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 및 통상적으로 사용되고 과학 및 특허 문헌에 널리 기재되고 상업적으로 사용되는 다른 기술을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.

검출의 용이함을 위해, 샌드위치 ELISA가 특히 바람직하고, 그의 많은 변형이 존재하고, 이들은 모두 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 전형적인 전방 (forward) 분석에서, 비표지된 항체가 고체 기재 상에 고정되고, 시험될 샘플은 항체-항원 2성분 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 적합한 인큐베이션 기간 후에 결합된 분자와 접촉된다. 이 시점에서, 이어서 검출가능한 시그날을 유발할 수 있는 리포터 분자로 표지된 제2 항체를 첨가하고 항체-항원-표지된 항체의 3성분 복합체 형성을 위해 충분한 시간 동안 인큐베이팅한다. 임의의 미반응 물질을 세척 제거하고, 항원의 존재를 시그날의 관찰에 의해 결정하거나, 공지량의 항원을 함유하는 대조 샘플과 비교함으로써 정량할 수 있다. 전방 분석에 대한 변동은 결합된 항체에 샘플 및 항체 모두가 동시에 첨가되는 동시 분석, 또는 표지된 항체 및 시험될 샘플이 먼저 혼합되고 인큐베이팅된 후, 비표지된 표면 결합된 항체에 첨가되는 역방 분석을 포함한다. 이들 기술은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있고, 근소한 변동 가능성은 쉽게 명백해질 것이다. 본원에서 사용되는 "샌드위치 분석"은 기본적인 2-부위 기술에 대한 모든 변동을 포함하도록 의도된다. 본 발명의 면역분석에 대해, 유일한 제한 인자는 표지된 항체가 관심있는 유전자에 의해 발현된 단백질에 특이적인 항체이어야 한다는 점이다.

상기 종류의 분석에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단- 또는 방사성핵종-함유 분자이다. 효소 면역분석 (EIA)의 경우, 효소는 보통 글루타르알데히드 또는 페리오데이트에 의해 제2 항체에 컨쥬게이팅된다. 그러나, 쉽게 인식되는 바와 같이, 당업자에게 공지된 매우 광범위한 상이한 라이게이션 기술이 존재한다. 일반적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, β-갈락토시다제 및 알칼린 포스파타제를 포함한다. 특이적인 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 대응하는 효소에 의한 가수분해시 검출가능한 색상 변화의 생성을 위해 선택된다. 예를 들어, p-니트로페닐 포스페이트가 알칼린 포스파타제 컨쥬게이트와 함께 사용하기에 적합하고; 퍼옥시다제 컨쥬게이트에 대해 1,2-페닐렌디아민 또는 톨루이딘이 통상 사용된다. 상기한 발색 기질보다는 형광 생성물을 생성시키는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 이어서 적절한 기질을 함유하는 용액을 3성분 복합체에 첨가한다. 기질은 제2 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 시각적 시그날을 제공하고, 이는 혈청 샘플 내에 존재하는 단백질 양의 평가를 제공하도록 보통 분광학적으로 추가로 정량될 수 있다.

별법으로, 형광 화합물, 예를 들어 플루오레신 및 로다민이 그들의 결합 능력를 변경시키지 않으면서 항체에 화학 결합될 수 있다. 특정 파장의 광을 조사하여 활성화될 때, 플루오로크롬-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여, 분자 내에 여기 상태를 유발한 후 특징적인 보다 긴 파장에서 광을 방출한다. 방출은 광학 현미경으로 시각적으로 검출가능한 특징적인 색상으로서 나타난다. 면역형광 및 EIA 기술은 모두 당업계에 잘 확립되어 있고, 본 발명의 방법에 특히 바람직하다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생물발광 분자가 또한 사용될 수 있다. 요구되는 용도에 적합하도록 과정을 변경하는 방법은 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.

번역 상태의 측정은 또한 몇몇 추가의 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 즉 "프로테옴 (proteome)"의 전체 게놈 모니터링 [Goffeau et al., 상기 문헌]을 결합 부위가 세포 게놈에 의해 코딩된 복수의 단백질종에 특이적인, 고정된, 바람직하게는 모노클로날 항체를 포함하는 마이크로어레이를 제작함으로써 수행할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 코딩된 단백질의 실질적인 분획, 또는 적어도 관심있는 생물학적 네트워크 모델을 시험하고 확인하기 위해 관련 단백질에 대해 제공된다. 모노클로날 항체를 제조하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어 그 전부가 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratoiy Manual (Cold Spring Harbor, NY, 1988)] 참조). 한 바람직한 실시태양에서, 모노클로날 항체는 세포의 게놈 서열을 기초로 설계된 합성 펩티드 단편에 대해 생성된다. 상기 항체 어레이를 사용하여, 세포로부터 단백질은 어레이에 접촉되고 그들의 결합은 당업계에 공지된 분석으로 분석된다.

별법으로, 단백질은 2차원 겔 전기영동 시스템에 의해 분리될 수 있다. 2차원 겔 전기영동은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 1차 치수를 따라 등전 포커싱에 이어 2차 치수를 따라 SDS-PAGE 전기영동을 포함한다 (예를 들어 문헌 [Hames et al., "Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach" (IRL Press, NY, 1990); Shevchenko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14440-14445 (1996); Sagliocco et al., Yeast, 12: 1519-1533 (1996); 및 Lander, Science, 274: 536-539 (1996)] 참조). 생성되는 전기영동도는 수많은 기술, 예를 들어 질량 분광법 기술, 웨스턴 블로팅 및 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 사용하는 면역블롯 분석, 및 내부 및 N-말단 마이크로서열결정에 의해 분석할 수 있다. 이들 기술을 이용하여, 주어진 생리학적 조건 하에, 예를 들어 약물에 노출된 세포, 예를 들어 효모 내에서, 또는 예를 들어 특이적 유전자의 결손 또는 과발현에 의해 변형된 세포 내에서 생산된 모든 단백질의 실질적인 분획을 확인하는 것이 가능하다.

생물학적 상태의 다른 측면에 기초한 실시태양. mRNA 풍부도 이외의 다른 세포 구성물을 모니터링하는 것은 현재 mRNA를 모니터링하는데 있어서 겪지 않는 특정한 기술적 난점을 제시하지만, 본 발명의 방법을 사용하여 세포 기능의 특성화에 관련된 단백질 활성이 측정될 수 있음이 당업계의 숙련인에게 명백해질 것이고, 본 발명의 실시태양은 상기 측정에 기초할 수 있다. 활성 측정은 특성화되는 특정 활성에 적절한 임의의 기능적, 생화학적 또는 물리적 수단에 의해 수행할 수 있다. 활성이 화학적 형질전환을 포함하는 경우, 세포성 단백질은 천연 기질과 접촉될 수 있고, 형질전환의 속도가 측정된다. 활성이 다량체성 단위의 상관성, 예를 들어 활성화된 DNA 결합 복합체의 DNA와의 상관성을 포함하는 경우, 상관된 단백질의 양, 또는 상관성의 2차적 결과, 예를 들어 전사된 mRNA의 양이 측정될 수 있다. 또한, 예를 들어 세포 사이클 제어에서와 같이 기능적 활성만이 공지된 경우, 기능의 수행이 관찰될 수 있다. 그러나, 공지되고 측정된 단백질 활성의 변화는 본 발명의 상기한 방법에 의해 분석된 반응 데이타를 형성한다.

별도의 비제한적인 실시태양에서, 세포의 생물학적 상태의 혼합 측면의 반응 데이타가 형성될 수 있다. 반응 데이타는 예를 들어 특정 mRNA 풍부도의 변화, 특정 단백질 풍부도의 변화 및 특정 단백질 활성의 변화로부터 작성될 수 있다.

마커로서의 핵산 및 단백질의 검출. 특정 실시태양에서, 마커에 대응하는 mRNA의 수준은 생물학적 샘플 내에서 당업계에 공지된 방법을 이용하여 계내 (in situ) 또는 시험관내 포맷에 의해 결정될 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"은 대상으로부터 단리된 조직, 세포, 생물학적 유체 및 그의 단리물과 대상 내에 존재하는 조직, 세포 및 유체를 포함하도록 의도된다. 많은 발현 검출 방법에서는 단리된 RNA를 이용한다. 시험관내 방법에서, mRNA의 단리에 대해 선택하지 않는 임의의 RNA 단리 기술이 세포로부터 RNA의 정제를 위해 이용될 수 있다 (예를 들어 Ausubel et al., Ed., Curr. Prot. Mol. Biol., John Wiley & Sons, NY (1987-1999) 참조). 추가로, 다수의 조직 샘플이 당업계의 숙련인에게 공지된 기술, 예를 들어 1단계 RNA 단리 공정 (콤진스키 (Chomczynski)의 미국 특허 4,843,155 (1989))을 사용하여 쉽게 처리될 수 있다.

단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, PCR 분석 및 프로브 어레이를 포함하여 이로 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 검출을 위한 한 바람직한 진단 방법은 단리된 mRNA를, 검출되는 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 포함한다. 핵산 프로브는 예를 들어 전체 길이 cDNA 또는 그의 일부, 예를 들어 엄격한 조건 하에 mRNA 또는 본 발명의 마커를 코딩하는 게놈 DNA에 특이적으로 혼성화하기에 충분한, 적어도 7, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 진단 분석에 사용하기 위한 다른 적합한 프로브를 본원에 기재한다. mRNA의 프로브와 혼성화는 해당 마커가 발현되는 것을 나타낸다.

한 포맷에서, mRNA는 예를 들어 단리된 mRNA를 아가로스 겔 상에서 진행시키고 mRNA를 겔로부터 멤브레인, 예를 들어 니트로셀룰로스로 전달시킴으로써 고체 표면 상에 고정시키고 프로브와 접촉시킨다. 별도의 포맷에서, 프로브(들)은 고체 표면 상에 고정되고, mRNA는 예를 들어 Affymetrix 유전자 칩 어레이에서 프로브(들)과 접촉된다. 당업계의 숙련인은 본 발명의 마커에 의해 코딩되는 mRNA 수준을 검출하는데 사용하기 위해 공지의 mRNA 검출 방법을 쉽게 채택할 수 있다.

샘플 내에서 본 발명의 마커에 대응하는 mRNA의 수준을 검출하기 위한 별도의 방법은 핵산 증폭 방법, 예를 들어 RT-PCR (실험 실시태양은 뮬리스 (Mullis)의 미국 특허 4,683,202 (1987)에 설명됨); 리가제 연쇄 반응 [Barany (1991), 상기 문헌]; 자기 부양 (self-sustained) 서열 복제 [Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874-1878 (1990)]; 전사 증폭 시스템 [Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173-1177 (1989)]; Q-베타 레플리카제 [Lizardi et al., Biol. Technology, 6: 1197 (1988)]; 회전 원 (rolling circle) 복제 [Lizardi et al., 미국 특허 5,854,033 (1988)]; 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어 당업계의 숙련인에게 공지된 기술을 이용하는 증폭된 분자의 검출을 포함한다. 이들 검출 방식은 상기 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다. 본원에서 사용되는 증폭 프라이머는 유전자의 5' 또는 3' 구역 (각각 + 및 - 스트랜드 또는 그 반대)에 어닐링할 수 있고 그들 사이에 짧은 영역을 포함하는 핵산 분자의 쌍인 것으로 정의된다. 일반적으로, 증폭 프라이머는 약 10-30개의 뉴클레오티드 길이이고 약 50-200개의 뉴클레오티드 길이의 영역에 인접한다. 적절한 조건 하에 적절한 시약을 사용하여, 상기 프라이머는 프라이머에 인접된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 증폭을 허용한다.

계내 방법에 대해, mRNA는 검출에 앞서 세포로부터 단리될 필요가 없다. 상기 방법에서, 세포 또는 조직 샘플은 공지의 조직학적 방법을 사용하여 제조/처리된다. 이어서, 샘플은 지지체, 일반적으로 유리 슬라이드 상에 고정된 후, 마커를 코딩하는 mRNA에 혼성화할 수 있는 프로브와 접촉한다.

마커의 절대 발현 수준을 기초로 한 다른 결정 방법으로서, 마커의 표준화된 발현 수준을 기초로 하여 결정할 수 있다. 발현 수준은 마커의 발현을 마커가 아닌 유전자, 예를 들어 구성적으로 발현되는 필수 (housekeeping) 유전자의 발현과 비교하여 마커의 절대 발현 수준을 보정함으로써 표준화된다. 표준화에 적합한 유전자는 필수 유전자, 예를 들어 액틴 유전자 또는 상피세포-특이적 유전자를 포함한다. 상기 표준화는 한 샘플, 예를 들어 환자 샘플의 발현 수준을 다른 샘플과 비교하거나 상이한 공급원으로부터의 샘플 사이의 발현 수준을 비교하는 것을 가능하게 한다.

별법으로, 발현 수준은 상대 발현 수준으로서 제공될 수 있다. 마커의 상대 발현 수준을 결정하기 위해서, 마커의 발현 수준은 조사되는 샘플의 발현 수준 결정 전에 10개 이상, 바람직하게는 50개 이상의 정상 대 질병 생물학적 샘플에 대해 결정된다. 보다 많은 샘플에서 분석되는 각각의 유전자의 평균 발현 수준이 결정되고, 이를 마커에 대한 기저선 발현 수준으로 사용한다. 이어서, 시험 샘플에 대해 결정되는 마커의 발현 수준 (절대 발현 수준)을 그 마커에 대해 얻은 평균 발현값으로 나눈다. 이것은 상대 발현 수준을 제공한다.

바람직하게는, 기저선 결정에 사용되는 샘플은 다형성을 갖지 않는 환자로부터 채취될 것이다. 세포 공급원의 선택은 상대 발현 수준의 용도에 따라 결정된다. 평균 발현 스코어로서 정상 조직에서 발견된 발현을 사용하면 분석되는 마커가 특이적인지 (정상 세포에 대비하여) 평가하는 것을 도울 수 있다. 또한, 많은 데이타가 축적되면, 평균 발현값을 수정하여 축적된 데이타를 기초로 하여 개선된 상대 발현값을 제공할 수 있다.

폴리펩티드의 검출. 본 발명의 다른 실시태양에서, 마커에 대응하는 폴리펩티드가 검출된다. 본 발명의 폴리펩티드 검출에 바람직한 물질은 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체, 바람직하게는 검출가능한 라벨을 갖는 항체이다. 항체는 폴리클로날이거나, 보다 바람직하게는 모노클로날일 수 있다. 무손상 항체, 또는 그의 단편, 예를 들어 Fab 또는 F(ab')₂가 사용될 수 있다. 프로브 또는 항체에 대해 용어 "표지된"은 검출가능한 물질의 프로브 또는 항체에 대한 커플링, 즉 물리적 연결에 의한 프로브 또는 항체의 직접 표지 및 직접 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 프로브 또는 항체의 간접 표지를 포함하는 의미이다. 간접 표지의 예는 형광-표지된 2차 항체를 사용한 1차 항체의 검출 및 형광 표지된 스트렙타비딘을 사용하여 검출될 수 있도록 비오틴을 사용한 DNA 프로브의 최종 표지화를 포함한다.

개체로부터의 단백질은 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 사용되는 단백질 단리 방법은 예를 들어 문헌 [Harlow and Lane (1988), 상기 문헌]에 기재된 것일 수 있다.

샘플이 주어진 항체에 결합하는 단백질을 함유하는지 결정하기 위해 다양한 포맷이 사용될 수 있다. 상기 포맷의 예는 EIA, 방사성 면역분석 (RIA), 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 당업계의 숙련인은 세포가 본 발명의 마커를 발현하는지 여부 및 혈액 또는 다른 체조직에서 특정 폴리펩티드 발현 생성물의 상대 농도를 결정할 때 사용하기 위해 공지의 단백질/항체 검출 방법을 쉽게 적용할 수 있다.

한 포맷에서, 항체 또는 항체 단편은 발현된 단백질을 검출하기 위해 웨스턴 블롯 또는 면역형광 기술과 같은 방법에서 사용될 수 있다. 상기 용도에서, 항체 또는 단백질을 고체 지지체 상에 고정시키는 것이 일반적으로 바람직하다. 적합한 고체상 지지체 또는 캐리어는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 임의의 지지체를 포함한다. 공지된 지지체 또는 캐리어는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자철광을 포함한다.

당업계의 숙련인은 항체 또는 항원에 결합하기 위한 다른 많은 적합한 캐리어를 알 것이고, 본 발명에서 사용하기 위해 상기 지지체를 채용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 환자 세포로부터 단리된 단백질은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 상에서 진행되고 고체상 지지체, 예를 들어 니트로셀룰로스 상에 고정될 수 있다. 이어서 지지체를 적합한 버퍼로 세척할 수 있고 이어서 검출가능하게 표지된 항체로 처리한다. 이어서 고체상 지지체를 버퍼로 2회 세척하여 비결합된 항체를 제거할 수 있다. 이어서, 고체 지지체 상의 결합된 표지의 양을 통상적인 수단으로 검출할 수 있고, 이 측정치는 혈액 또는 다른 체조직 내의 단백질 수준 또는 농도로 번역된다.

본 발명은 또한 생물학적 샘플, 예를 들어 혈청, 혈장, 림프액, 낭액, 소변, 대변, csf, 복수액 또는 혈액을 포함하고 이로 제한되지 않는 임의의 체액 및 체조직의 생검 샘플에서 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드 또는 핵산의 존재를 검출하기 위한 키트를 포함한다. 예를 들어, 키트는 생물학적 샘플 내에서 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA를 검출할 수 있는 표지된 화합물 또는 약제, 및 샘플 내 폴리펩티드 또는 mRNA의 양을 결정하기 위한 수단, 예를 들어 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있다. 키트는 또한 키트를 사용하여 얻어진 결과를 해석하기 위한 지시서를 포함할 수 있다.

항체계 키트에서, 키트는 예를 들어

1) 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드에 결합하는, 예를 들어 고체 지지체에 부착된 제1 항체; 및 임의로

2) 폴리펩티드 또는 제1 항체에 결합하고 검출가능한 표지에 컨쥬게이팅된 상이한 제2 항체를 포함할 수 있다.

올리고뉴클레오티드계 키트에서, 키트는 예를 들어

1) 본 발명의 마커에 대응하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 검출가능하게 표지된 올리고뉴클레오티드; 또는

2) 본 발명의 마커에 대응하는 핵산 분자를 증폭시키기 위해 유용한 한쌍의 프라이머를 포함할 수 있다.

키트는 또한 예를 들어 완충제, 보존제 또는 단백질-안정화제를 포함할 수 있다. 키트는 추가로 검출가능한 표지, 예를 들어 효소 또는 기질을 검출하기 위해 필요한 성분을 포함할 수 있다. 키트는 또한 분석되어 시험 샘플에 비교될 수 있는 대조 샘플 또는 일련의 대조 샘플을 함유할 수 있다. 키트의 각각의 성분은 개별 용기 내에 담길 수 있고, 상이한 용기는 모두 키트를 사용하여 수행된 분석 결과를 해석하기 위한 지시서와 함께 단일 패키지 내에 존재할 수 있다.

항체의 세포 내로의 도입. 세포내 단백질 및 그의 농도에 대한 특성화를 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체는 예를 들어 항체의 세포 내로의 미세주사 (Morgan et al., Immunol. Today, 9: 84-86 (1988) 참조) 또는 요구되는 항체를 코딩하는 하이브리도마 mRNA의 세포 내로의 형질전환 (Burke et al., Cell, 36: 847-858 (1984) 참조)을 포함한 많은 방식으로 세포 내로 도입될 수 있다. 추가 기술에서, 재조합 항체는 표적 단백질에 결합하고 표적 단백질 활성을 차단하도록 공학처리되고 매우 다양한 비-림프 세포형에서 이소성으로 발현될 수 있다 [Biocca et al., Trends Cell Biol., 5: 248-252 (1995)]. 항체 발현은 바람직하게는 조절가능 프로모터, 예를 들어 Tet 프로모터, 또는 포화 교란 (perturbation)을 생산하기 위해 구성적 활성 프로모터의 제어 하에 놓인다. 제1 단계는 표적 단백질 (아래 참조)에 적절한 특이성을 갖는 특정 모노클로날 항체의 선택이다. 이어서, 선택된 항체의 가변 영역을 코딩하는 서열을 다양한 공학처리된 항체 포맷, 예를 들어 전체 항체, Fab 단편, Fv 단편, 단쇄 Fv 단편 (펩티드 링커에 의해 연합된 V_H 및 V_L 영역) ("ScFv" 단편), 디아바디 (상이한 특이성의 2개의 연합된 ScFv 단편) 등 내로 클로닝할 수 있다 [Hayden, Gilliland & Ledbetter, Curr. Opin. Immunol., 9(2): 201-212 (1997)]. 상이한 포맷의 세포내 발현된 항체는 이들을 다양한 공지의 세포내 리더 (leader) 서열과 융합체로서 발현시킴으로써 세포 컴파트먼트, 예를 들어 세포질, 핵, 미토콘드리아 등 내로 표적화될 수 있다 [Bradbury et al., Antibody Engineerinq, Borrebaeck, Ed. Vol. 2, pp. 295-361 (IRL Press, 1995)]. 특히, ScFv 포맷은 세포질 표적화에 특히 적합한 것으로 보인다.

다양한 유용한 항체 종류. 항체 종류는 폴리클로날, 모노클로날, 키메릭, 단쇄 항체, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 표적 단백질에 대한 폴리클로날 항체 생산을 위해 당업계에 공지된 다양한 과정을 이용할 수 있다. 항체 생산을 위해, 다양한 숙주 동물을 표적 단백질을 주사하여 면역화시킬 수 있고, 상기 숙주 동물은 토끼, 마우스, 래트 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 면역 반응을 증가시키기 위해 숙주 종에 따라 항원보강제, 비제한적인 예를 들어 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 겔, 예를 들어 수산화알루미늄; 표면 활성 물질, 예를 들어 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼 및 디니트로페놀; 및 잠재적으로 유용한 인간 항원보강제, 예를 들어 BCG 및 코리네박테리움 파르붐을 사용할 수 있다.

모노클로날 항체. 표적 단백질에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 제조를 위해, 배양물 내 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생산을 제공하는 임의의 기술을 사용할 수 있다. 상기 기술은 원래 코흘러 (Kohler) 및 밀스타인 (Milstein) [(1975), 상기 문헌]에 의해 개발된 하이브리도마 기술; 트리오마 (trioma) 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kozbor et al., Immunol. Today, 4: 72 (1983)]; 및 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 EBV 하이브리도마 기술 [Cole et al. (1985), 상기 문헌]을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 추가의 실시태양에서, 모노클로날 항체는 최신 기술을 이용하여 무균 동물에서 생산할 수 있다 (PCT 특허 출원 PCT/US90/02545). 본 발명에 따라, 인간 항체가 사용될 수 있고, 인간 하이브리도마를 사용함으로써 [Cole et al. (1983), 상기 문헌], 또는 인간 B세포를 시험관 내에서 EBV 바이러스로 형질감염시킴으로써 [Cole et al. (1985), 상기 문헌] 얻을 수 있다. 실제로, 본 발명에 따라, 표적 단백질에 특이적인 마우스 항체 분자로부터 유전자를 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터 마우스와 함께 스플라이싱함으로써 "키메릭 항체" 생산을 위해 개발된 기술 (Morrison et al. (1984), 상기 문헌; Neuberger et al. (1984), 상기 문헌; Takeda et al. (1985), 상기 문헌)이 사용될 수 있고; 상기 항체는 본 발명의 범위 내에 있다.

추가로, 모노클로날 항체가 유리한 경우에, 별법으로 파지 디스플레이 기술을 사용하여 큰 항체 라이브러리로부터 이들을 선택할 수 있다 [Marks et al., J. Biol.Chein., 267(3):16007-16010 (1992)]. 상기 기술을 사용하여, 10-12개까지의 상이한 항체의 라이브러리가 fd 필라멘트상 파지의 표면 상에서 발현되어, 모노클로날 항체의 선택에 이용가능한 항체의 "단일 포트 (single pot)" 시험관내 면역계를 형성하였다 [Griffiths et al., EMBO J., 13(14): 3245-3260 (1994) 참조]. 상기 라이브러리로부터 항체의 선택은 파지를 고정된 표적 단백질에 접촉시키고, 표적에 결합된 파지를 선택하고 클로닝시키고, 항체 가변 영역을 코딩하는 서열을 요구되는 항체 포맷을 발현하는 적절한 벡터 내로 서브클로닝시키는 것을 포함하는, 당업계에 공지된 기술에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 따라, 단쇄 항체 생산을 위해 설명된 기술 (미국 특허 4,946,778)이 표적 단백질에 특이적인 단쇄 항체를 생산하기 위해 채택될 수 있다. 본 발명의 추가의 실시태양은 표적 단백질에 대한 요구되는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 허용하도록 Fab 발현 라이브러리 제작에 대해 설명된 기술 (Huse et al. (1989), 상기 문헌 참조)을 이용한다.

표적 단백질의 개별특이형을 함유하는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상기 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편; F(ab')₂ 단편의 디술피드 브릿지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab' 단편, 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성될 수 있는 Fab 단편, 및 Fv 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는다.

항체 생산에서, 목적하는 항체에 대한 스크리닝은 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 ELISA에 의해 달성할 수 있다. 표적 단백질에 특이적인 항체를 선택하기 위해서, 표적 단백질에 결합하는 항체에 대해 파지 디스플레이 항체 라이브러리 또는 생성된 하이브리도마를 분석할 수 있다.

치료제의 투여. 본 발명에 개시되는 질환 치료에 사용되는 약물의 투여량은 의사가 환자를 치료하는 것과는 다른 질병을 포함하여 약물에 대한 지식, 임상 시험에서 결정된 조합 약물의 특성 및 환자의 특성을 사용하여 환자 주치의에 의해 최종 분석에서 정해져야 한다. 투여량의 전반적인 개요 및 몇몇 바람직한 투여량은 본원에서 제공될 수 있고, 제공될 것이다. 예를 들어, 일로페리돈은 1일당 1 내지 50 mg 1회, 가장 바람직하게는 12 내지 16 mg 1회; 올란자핀은 1일당 약 0.25 내지 50 mg 1회; 바람직하게는 1일당 1 내지 30 mg 1회; 가장 바람직하게는 1일당 1 내지 25 mg 1회; 클로자핀은 1일당 약 12.5 내지 900 mg; 바람직하게는 1일당 약 150 내지 450 mg; 리스페리돈은 1일당 약 0.25 내지 16 mg; 바람직하게는 1일당 약 2 내지 8 mg; 세르틴돌은 1일당 약 0.0001 내지 1.0 mg/kg; 퀘티아핀은 1일당 약 1.0 내지 40 mg/kg을 1회 또는 분할 투여; 지프라시돈은 1일당 약 5 내지 500 mg; 바람직하게는 1일당 약 50 내지 100 mg; 할돌은 1일당 0.5 내지 40 mg을 1회 또는 2회 투여한다.

관련된 모든 화합물은 경구로 이용가능하고, 통상 경구로 투여되고, 보조 조합물의 경구 투여가 바람직하다. 이들 화합물은 단일 투여 형태로 함께 투여될 수 있거나, 별개로 투여될 수 있다. 그러나, 경구 투여가 유일한 투여 경로는 아니며, 단지 바람직한 경로일 뿐이다. 예를 들어, 경구 의약 투여에 대해 잊거나 거북해 하는 환자에게 경피 투여가 매우 바람직할 수 있다. 한 약물은 한 경로, 예를 들어 경구로 투여될 수 있고, 다른 약물은 특정 환경에서 경피, 피부통과, 정맥내, 근육내, 비강내 또는 직장내 경로로 투여될 수 있다. 투여 경로는 약물의 물리적 특성 및 환자 및 보호자의 편의성에 의해 제한되는 임의의 방식으로 변경될 수 있다.

실시예 1

DAT1 유전자의 3' UTR 구역 내의 VNTR 다형성과 클로자핀 반응 사이의 상관성

본 실시예의 목적은 도파민 수송체 1 유전자 (SLC6A3; DAT1)의 3' UTR 구역 내의 VNTR 다형성과 클로자핀으로 치료한 정신분열병 또는 분열정동장애 환자의 약물 반응 사이의 잠재적인 상관성을 평가하는 것이다.

DAT1 유전자의 3' UTR 구역 내의 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성과 클로자핀으로 치료한 정신분열병 또는 분열정동장애 환자의 약물 반응 사이의 잠재적인 상관성을 평가하기 위해 후향 (retrospective) 약리유전학적 분석을 수행하였다.

클로자핀 대 올란자핀으로 치료한 환자에서 자살 행동에 대한 위험을 비교하는 2년간의 다기관 무작위배정 연구가 정신분열병 또는 분열정동장애의 환자에서 이미 수행되었다 (상기 참조). 도파민 수송체 유전자 (SLC6A3)의 엑손 9 상의 동의 다형성과 타입 1 사건까지의 시간 사이의 유의한 상관성이 클로자핀군에서 관찰되었다. GG 유전자형을 갖는 대상은 연구 종료시에 최악의 자살 행동을 보였기 때문에 저반응군으로 판명되었다. 연구 결과는 또한 클로자핀이 자살 시도를 예방하는데 있어서 올란자핀보다 더 효과적이었음을 보였다 [PCT 특허 출원 공개 WO 2004/074513].

유전자형 분석. InterSePT 연구 (상기 참조)에 등록된 환자로부터 402개의 샘플을 수집하여 VNTR 다형성에 대해 유전자형을 분석하였다. InterSePT 연구에 등록된 총 402명의 대상은 지방 윤리 위원회에서 승인한 프로토콜에 따른 약리유전학적 연구에 동의하였다. 15 ml의 혈액을 시험 부위에서 환자로부터 채혈하였다. PUREGENE™ DNA 분리 키트 (D50K)를 제조자의 권장에 따라 사용하여 DNA를 Covance (Indianapolis, USA)에서 추출하였다. VNTR 유전자형 분석은 Kidd (Kidd Laboratory, http://info.med.yale.edu/genetics/kkidd/SLC6A3_-3VNTR.html)에 의해 기재된 바와 같은 PCR 방법을 사용하여 수행하였다. 센스 및 안티센스 PCR 프라이머는 각각 5'-GGT GTA GGG AAC GGC CTG AGA G-3' (서열 3) 및 5'-CTT CCT GGA GGT CAC GGC TCA AGG-3' (서열 4)이었다. 약 100 - 200 ng의 게놈 DNA가 각 분석에 필요하였다. 30 싸이클의 PCR을 94℃ (30"), 62℃ (30") 및 72℃ (30")의 조건으로 수행하였다. PCR 생성물은 2％ 아가로스 겔을 사용하여 분석하였다.

임상 평가. 1차 효능 변수를 위해 두가지 기준, 즉 (a) 유의한 자살 시도; 및 (b) 절박한 자살 위험에 의한 입원 중의 하나를 충족시키는 시간 (무작위 배정후 일수)을 결정하였다. 타입 1 사건은 상기 두 항목의 조합으로 규정된다. 2차 효능 변수를 위해, (a) 유의한 자살 시도를 행한 대상의 비율; (b) 절박한 자살 위험에 의해 입원한 대상의 비율; (c) 양성 및 음성 증후군 척도 (PANSS)의 총 스코어의 기저선으로부터의 변화; (d) PANSS의 양성 소계의 기저선으로부터의 변화 ; 및 (e) PANSS의 음성 소계의 기저선으로부터의 변화를 결정하였다.

통계적 분석. 통계적 분석을 위해 윈도우 패키지용 SAS 버전 8.2를 이용하였다. 유전자형군 사이의 인구학적 차이의 연속적 및 이분형 변수는 각각 비모수 (non-parametric) ANOVA 및 Fisher의 정확 검증을 사용하여 비교하였다. 타입 1 사건까지의 시간에 대한 유전자형의 상이한 효과는 로그 랭크 시험을 사용하여 평가하였다. 연령, 성, 약물 남용 및 생애중 자살 시도는 Cox 비례 위험 모델을 사용하는 추가의 분석에서 조정되었다.

로그 랭크 시험은 연구 동안 타입 1 사건의 위험에 의해 측정된 VNTR 다형성과 자살 행동 사이의 유의한 상관성을 확인하였다. 추가로, 상기 상관성은 클로자핀 치료군에만 존재하였다. 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상은 타입 1 사건의 유의하게 더 높은 비율을 보였다 (P = 0.004). 또한, 동일한 대상은 유의하게 더 큰 생애중 자살 시도를 보였다 (P = 0.01). VNTR 다형성과 타입 1 사건의 위험 사이의 관계의 잠재적인 혼동을 조정하기 위해서, Cox 비례 위험 모델을 만들었다. 다변수 모델은 공변량인 연령, 성, 약물 남용 및 생애중 자살 시도 이외에 VNTR 다형성으로 이루어졌다. VNTR 다형성과 타입 1 사건의 위험 사이의 상관성은 유의한 수준으로 유지되었다 (P = 0.0085). 이들 결과는 VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상이 자살 행동에 대해서 클로자핀 치료에 저반응군임을 보여주었다. 또한, 양성 및 음성 증후군 척도 (PANSS)를 포함한 정신병 평가에 의해 측정된 클로자핀 치료에 대한 반응시에 유전자형군 사이에 유의한 차이는 존재하지 않았다.

DAT1 유전자의 VNTR 다형성과 클로자핀 반응의 상관성. 본 실시예의 약리유전학적 분석에서, 상기 두 치료군에서 약물 반응에 대한 유전적 효과를 비교하였다. 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 대다수의 대상은 백인이었다. 연령과 진단에서 유전자형군 사이에 유의한 차이는 존재하지 않았다. 10개 이상의 반복 대립유전자를 갖는 대상은 연령이 비교적 더 젊은 경향이 있지만, 그 차이는 통계학상 유의하지 않았다.

hDAT1 유전자의 VNTR 다형성에 따라 분류한 InterSePT 연구에 등록한 대상의 인구학적 특성

변수	9≥/9≥	10≤/9≥	10≤/10≤	P값
대상의 수	35	145	199
성별, 여성％	51.43 (18)	47.59 (69)	36.68 (73)	0.0626+
인종, 백인％	74.29	77.24 38.11	79.9 36.93	0.6719+
연령	34.00 (8.58)	(10.62)	(10.98)	0.1741*
정신분열병 진단％	51.43	56.55	61.31	0.4582*
값은 평균 (SD)이다. +Fisher의 정확 검증을 이용하였다. *ANOVA를 이용하였다. 9≥: 9개 이하의 반복 서열; 10≤: 10개 이상의 반복 서열

로그 랭크 시험에서, VNTR 다형성과 타입 1 사건까지의 시간 사이의 유의한 상관성이 클로자핀 치료군에서 관찰되었지만 (백인 하위집단: P = 0.0165, 전체 인구집단: P = 0.0252), 올란자핀 치료군에서는 관찰되지 않았다 (백인 하위집단: P = 0.4058, 전체 인구집단: P = 0.7495) (도 1 및 도 2). 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상은 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 대상에 비해 타입 1 사건의 유의하게 더 높은 비율을 보였고, 이것은 9개 이하의 반복 대립유전자가 열성 방식으로 불량한 클로자핀 반응에 상호 관련될 수 있음을 시사한다. 그러나, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 상기 상관성은 올란자핀 치료군에서 검출될 수 없었다 (백인 하위집단: P = 0.4058, 전체 인구집단: P = 0.7495).

10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 대상은 타입 1 사건의 위험에 대해 유사하게 거동하였다. 따라서, 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상과 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 대상의 비교를 수행하였다. 상관성의 개선된 유의성이 관찰되었다 (백인 하위집단: P = 0.0042, 전체 인구집단: P = 0.0082) (도 5 및 도 6). 또한, 올란자핀 치료군에 대해 유사한 분석을 수행하였다. 다시, 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, 어떠한 상관성도 올란자핀 치료군에서 검출될 수 없었다 (백인 하위집단: P = 0.2486, 전체 인구집단: P = 0.7959).

VNTR 다형성과 타입 1 사건의 위험 사이의 관계의 잠재적인 혼동을 조정하기 위해서, Cox 비례 위험 모델을 만들었다. 다변수 모델은 공변량인 연령, 성, 약물 남용 및 생애중 자살 시도 이외에 VNTR 다형성으로 이루어졌다. 표 5에 나타낸 바와 같이, VNTR 다형성과 타입 1 사건의 위험 사이의 상관성은 클로자핀 치료군에서 유의하게 유지되었다 (백인 하위집단: P = 0.0085, 전체 인구집단: P = 0.0396). 이와 유사하게, 올란자핀 치료군에서는 어떠한 상관성도 검출될 수 없었다 (백인 하위집단: P = 0.2647, 전체 인구집단: P = 0.6902).

VNTR 다형성과 타입 1 사건 사이의 상관성에 대한 Cox 비례 위험 모델 분석 결과

군	비조정된 위험 비율		조정된 위험 비율*
	(95％ CI)	P	(95％ CI)	P
백인에서 클로자핀	0.307 (0.130 - 0.723)	0.0069	0.296 (0.120 - 0.733)	0.0085
백인에서 올라자핀	0.548 (0.194 - 1.547)	0.2557	0.542 (0.185 - 1.590)	0.2647
전체 집단에서 클로자핀	0.342 (0.148 - 0.788)	0.0118	0.396 (0.167 - 0.936)	0.0396
전체 집단에서 올라자핀	0.886 (0.353 - 2.225)	0.796	0.824 (0.317 - 2.138)	0.6902
값은 평균 (SD)이다. 연령, 성별, 약물 남용 및 생애중 자살 시도는 조정되었다.

연구 종료시에 각각의 유전자형군에서 타입 1 사건을 갖는 대상의 비율을 또한 계산하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 44％의 백인이 타입 1 사건을 보였다. 이와 대조적으로, 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 백인의 단지 약 16％만이 타입 1 사건을 보였다. 전체 인구집단에서, 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상의 39％가 타입 1 사건을 보였고, 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 대상의 약 16％가 타입 1 사건을 보였다. 이들 결과는 로그 랭크 시험 및 Cox 비례 위험 모델에 의해 검출된 상관성과 일치하였다.

hDAT1 유전자의 VNTR 다형성에 따라 분류된 연구의 종료시의 타입 1 사건

처리군	인종군	종료시 타입 1 사건	9≥/9≥	10≤/9≥	10≤/10≤
클로자핀	전체	발생	7 (39％)	10 (14％)	18 (18％)
		미발생	11 (61％)	60 (86％)	83 (82％)
	백인	발생	7 (44％)	8 (15％)	14 (17％)
		미발생	9 (56％)	45 (85％)	67 (83％)
올라자핀	전체	발생	5 (29％)	21 (28％)	26 (27％)
		미발생	12 (71％)	54 (72％)	72 (73％)
	백인	발생	4 (40％)	14 (24％)	19 (24％)
		미발생	6 (60％)	45 (76％)	59 (76％)
클로자핀 및 올라자핀	전체	발생	12 (34％)	31 (21％)	44 (22％)
		미발생	23 (66％)	114 (79％)	155 (78％)
	백인	발생	11 (42％)	22 (20％)	33 (21％)
		미발생	15 (58％)	90 (80％)	126 (79％)
값은 대상의 수 (％)이다.

또한, 양성 및 음성 증후군 척도 (PANSS)를 포함하여 정신병 판단에 의해 결정된 클로자핀 치료에 반응한 유전자형군 사이에 유의한 차이가 존재하지 않았다.

DAT1 유전자의 VNTR 다형성과 생애중 자살 시도의 상관성. 기저선 질병 심도에 대한 DAT1 유전자의 VNTR 다형성의 잠재적인 영향을 검사하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 생애중 자살 시도 또는 과거 36개월 동안 자살 시도에서 유전자형군 사이에 유의한 차이가 존재하였다. VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상은 10개 이상의 반복 대립유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 대상에 비해 유의하게 더 높은 자살 시도를 보였다. 생애중 자살 시도와의 상관성은 질병 심도 변경에서 상기 다형성의 가능한 역할을 제시하였다.

hDAT1 유전자의 VNTR 다형성에 따라 분류된 기저선 특성

	9≥/9≥	10≤/9≥	10≤/10≤	P값
모든 인종 +
대상의 수	35	145	199
발현시 연령	23.86 (7.03)	27.28 (9.20)	25.00 (9.10)	0.6467*
망상/환각, ％	37.14 (13)	44.14 (64)	39.20 (78)	0.5728+
과거 36개월 내 자살 시도	1.34 (1.63)	0.80 (1.96)	0.72 (1.46)	0.0532*
생애중 자살 시도	3.97 (3.53)	2.50 (3.35)	2.65 (3.18)	0.0136*
자살경향성의 심도	2.29 (1.18)	2.23 (1.04)	2.15 (0.99)	0.7435*
캘거리 (calgary) 우울증의 총 점수	8.63 (5.46)	9.94 (5.65)	10.00 (5.92)	0.1675*
covi 불안증의 총 점수	3.60 (2.29)	3.92 (2.70)	3.86 (2.55)	0.4546*
PANSS의 총 점수	79.06 (22.23)	83.50 (20.46)	81.22 (21.00)	0.3527*
PANSS 양성 서브스케일의 총 점수	18.03 (5.37)	17.81 (6.10)	17.69 (5.91)	0.8475*
PANSS 음성 서브스케일의 총 점수	20.66 (8.02)	22.83 (7.47)	21.93 (7.81)	0.2310*
ESRS의 총 점수	18.42 (24.39)	17.29 (18.17)	14.67 (15.11)	0.1798*
기능 스케일의 총 점수	41.71 (8.13)	40.83 (8.19)	41.47 (7.78)	0.9513*
백인 ++
대상의 수	26	112	159
발현시 연령	25.65 (6.86)	28.73 (9.23)	25.70 (9.43)	0.7659
망상/환각, ％	34.62 (9)	41.96 (47)	37.11 (59)	0.6471
과거 36개월 내 자살 시도	1.50 (1.73)	0.63 (1.96)	0.64 (1.45)	0.0123
생애중 자살 시도	4.23 (4.00)	2.29 (3.29)	2.70 (3.38)	0.0116
자살경향성의 심도	2.35 (1.16)	2.30 (1.06)	2.21 (0.97)	0.8096
캘거리 우울증의 총 점수	9.46 (5.53)	10.58 (5.61)	10.57 (5.74)	0.3206
covi 불안증의 총 점수	4.04 (2.22)	4.07 (2.70)	4.04 (2.48)	0.8958
PANSS의 총 점수	82.81 (19.07)	81.91 (19.50)	81.25 (21.36)	0.8343
PANSS 양성 서브스케일	18.31 (4.61)	17.17 (5.63)	17.64 (5.75)	0.4776
PANSS 음성 서브스케일	22.42 (6.95)	22.49 (6.98)	21.67 (8.09)	0.8446
ESRS의 총 점수	19.21 (27.32)	17.69 (18.05)	14.06 (14.81)	0.1777
기능 스케일의 총 점수	40.65 (8.38)	40.46 (7.95)	41.65 (7.69)	0.6211
값은 평균 (SD)이다.
*유전자형군 사이의 차이는 ANCOVA를 사용하여 비교하였다. 연령 및 성별이 조정되었다.
+Fisher의 정확 검증을 이용하였다.

논의. DAT1 자리에서 이미 설명된 몇몇 다형성 중에, 40 bp VNTR 다형성이 인간 질병과의 상관성 연구에서 광범하게 조사되었다. 상기 VNTR 다형성은 외상후 스트레스 증후군 (Segman RH et al., Mol. Psychiatry 7 (8): 903-7 (2002)), 주의력 결핍 과다 행동 장애 (ADHD) (Smith KM et al., Am. JMed. Genet. 119B(1):77-85 (2003); Chen CK et al. Mol. Psychiatry 8 (4):393-6 (2003)), 지속성 메탐페타민 정신병 (Ujike H et al., Pharmacogenomics J. 3 (4):242-7 (2003)), 아동의 외현적 행동 문제 (Young SE et al., Am. J. Med. Genet. 114(2):144-9 (2002)) 및 폭식 행동을 갖는 섭식 장애 (Shinohara M et al., J.Psychiatry Neurosci. 29(2):134-7 (2004))와 관련이 있을 수 있는 것으로 보였다. 흥미롭게도, ADHD 환자에서 상기 VNTR 다형성과 메틸페니데이트 반응 사이의 상관성이 관찰되었다 [Kirley A et al., Am. J. Med. Genet. 121B(1): 50-4 (2003)].

도파민 수송체는 방출된 도파민을 시냅스전부 (presynaptic) 말단 내로 다시 흡수함으로써 시냅스 내의 도파민의 활성 조절에서 중요한 역할을 수행한다. 이들이 널리 사용되는 항우울제 및 정신활성 약물의 작용 부위이기 때문에 수송체에 의해 보조되는 세로토닌 및 도파민의 흡수는 인간 행동 또는 정신 상태의 활성의 원인이 된다. DAT1 유전자의 3' UTR 내의 VNTR 다형성은 뇌에서 유전자 발현에 영향을 주고, 이에 의해 변경된 뉴런 전달을 야기할 가능성이 있다 [Mill J et al., Am. J. Med. Genet. 114 (8): 975-9 (2002); Fuke S et al., Pharmacogenomics J. 1(2):152-6 (2001)]. 따라서, 상기 다형성은 약리유전학적 분석을 위한 우수한 마커를 나타낸다.

본 실시예에서, 본 발명자들은 클로자핀으로 치료된 정신분열병 또는 분열정동장애 환자에서 VNTR 다형성과 타입 1 사건의 위험 사이의 유의한 상관성을 관찰하였다. 상기 상관성은 클로자핀 치료군에만 존재하고, 올란자핀 치료군에는 존재하지 않았고, 이것은 VNTR 다형성과 클로자핀 반응 사이의 직접적인 관계를 제시하였다.

생애중 자살 시도와의 상관성은 상기 다형성의 질병 심도 조정 기능을 나타낸다. 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 대상은 보다 높은 타입 1 사건 위험을 갖고 클로자핀 치료에 대한 보다 낮은 반응을 보이는 경향이 있었다.

요약. 클로자핀은 정신분열병의 증상 치료를 위해 현재 이용가능한 임상적으로 가장 효능있는 약물의 하나이다. 클로자핀으로부터 효과를 볼 가능성이 가장 큰 대상이 치료 전에 확인되면, 이들 환자의 임상 치료 효과를 크게 개선시킨다.

도파민 수송체 유전자 (SLC6A3)의 2가지 다형성 (3'-UTR의 VNTR 및 엑손 9 상의 다형성)과 타입 1 사건 (자살 시도)까지의 시간 사이의 상관성이 클로자릴(등록상표)로 치료된 환자에서 밝혀졌다. 이러한 결과는 SLC6A3 유전자형이 자살경향에 대한 치료에서 클로자핀 반응을 예측하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 상관성의 유의성은 두 위험 인자를 조합할 때 약간 개선되었다. 두 위험 인자를 갖는 하위집단에서 약 40％의 환자가 연구 종료시에 타입 1 사건을 경험하였고, 두 위험 인자가 없는 하위집단에서 단지 15％ 환자만이 타입 1 사건을 보였다. 유전자형에 따라, 약 10％의 환자가 저반응군으로 계산된다. 따라서, 클로자핀 반응률은 SLC6A3 유전자형을 기초로 한 치료로부터 잠재적인 저반응군을 배제할 수 있다면 유의하게 개선될 수 있다.

실시예 2

클로자핀 반응에 대한 유전적 충격에 대해 정신분열병과 분열정동장애 사이의 차이가 있는지 결정하기 위한 노력으로, 질병 기반 하위집단 분석을 수행하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, DAT1 유전자의 VNTR 다형성과 타입 1 사건으로 측정된 클로자핀 반응 사이의 상관성은 정신분열병을 갖는 대상에서만 존재하였고, 분열정동장애를 갖는 대상에서는 존재하지 않았다. 또한, 정신분열병 또는 분열정동장애를 갖는 대상에서 올란자핀 치료에 대한 반응에서 유전자형군 사이에 차이가 없었다. 이들 결과는 자살 행동에 대한 유전적 충격에 대한 정신분열병과 분열정동장애 사이에 유의한 차이가 있음을 보여준다. DAT1 유전자의 3' UTR VNTR 다형성은 정신분열병 환자에서 클로자핀 반응을 예측하기 위한 유전 마커이다.

hDAT1 유전자에서 VNTR 다형성에 따라 분류된 연구 종료시의 타입 1 사건

질병 집단	치료	타입 1 사건+	유전자형
			S/S	S/L	L/L	P값++	P값+++
정신분열병을 갖는 전체	클로자핀	있음	4 (50％)	5 (13％)	8 (13％)	0.0034	0.0008
		없음	4 (50％)	35 (87％)	53 (87％)
	올란자핀	있음	2 (20％)	10 (24％)	11 (18％)	0.7936	0.8834
		없음	8 (80％)	32 (76％)	50 (82％)
정신분열병을 갖는 백인	클로자핀	있음	4 (67％)	4 (15％)	5 (11％)	0.0004	<0.0001
		없음	2 (33％)	23 (85％)	39 (89％)
	올란자핀	있음	1 (25％)	7 (23％)	8 (18％)	0.8004	0.9345
		없음	3 (75％)	24 (77％)	37 (82％)
분열정동장애를 갖는 전체	클로자핀	있음	3 (30％)	5 (17％)	10 (25％)	0.7081	0.5375
		없음	7 (70％)	25 (83％)	30 (75％)
	올란자핀	있음	3 (43％)	11 (33％)	15 (40％)	0.8842	0.6359
		없음	4 (57％)	22 (67％)	22 (60％)
분열정동장애를 갖는 백인	클로자핀	있음	3 (30％)	4 (15％)	9 (24％)	0.6691	0.4808
		없음	7 (70％)	22 (85％)	28 (76％)
	올란자핀	있음	3 (50％)	7 (25％)	11 (33％)	0.4075	0.1897
		없음	3 (50％)	21 (75％)	22 (67％)
값은 대상의 수 (％)이다. +연구 종료시 타입 1 사건 S/S = 9≥/9≥; S/L = 10≤/9≥; L/L = 10≤/10≤. ++유전자형군 사이의 타입 1 사건까지의 시간의 전체 차이를 비교하기 위해 로그 랭크 시험을 사용하였다 +++S/S 및 S/L 및 L/L 사이의 타입 1 사건까지의 시간의 차이를 비교하기 위해 로그 랭크 시험을 사용하였다

언급된 참고 문헌

본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 공개 또는 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 그 전부가 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것처럼 동일한 정도로 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 참고문헌에 대한 논의는 그 저자들의 주장을 단지 요약하고자 한 것으로서, 어떠한 참고문헌도 선행 기술을 구성하는 것으로 인정하는 것은 아니다. 본 출원인은 인용된 참고문헌의 정확성 및 관련성에 대해 이의를 제기한 권리를 계속 갖는다. 또한, 본원에서 언급된 모든 GenBank 기탁 번호, 유니진 클러스터 (Unigene Cluster) 번호 및 단백질 기탁 번호는 각각의 상기 번호가 구체적으로 및 개별적으로 그 전부가 모든 목적을 위해 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것처럼 동일한 정도로 그 전부가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

본 발명은 본 발명의 개개의 측면의 한 예시로서 의도되는 본원에서 설명되는 특정 실시태양의 측면으로 제한되지 않는다. 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하고, 이는 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다. 본원에서 열거된 것 이외에, 본 발명의 범위 내에 포함되는 기능적으로 동등한 방법 및 장치를 당업계의 숙련인은 상기 상세한 설명 및 첨부하는 도면을 통해 분명하게 알 것이다. 상기 변형 및 변경은 첨부하는 청구의 범위 내에 포함되는 것이다. 본 발명은 첨부하는 청구의 범위 및 청구의 범위의 균등물의 전체 범위의 측면에서만 제한될 것이다.

<110> Novartis AG He, Yungsheng Leroy, Elisabeth Marie <120> BIOMARKERS FOR THE PREDICTION OF RESPONSIVENESS TO CLOZAPINE TREATMENT <130> DV/4-33840A/USN <150> 60/577,131 <151> 2004-06-04 <160> 4 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> allele <222> (1)...(60) <223> Homo sapiens dopamine transporter (SLC6A3) gene, positions 41341 to 41401 <400> 1 gaagccatcg ccacgctccc tctgtcctca gcctgggccg tggtcttctt catcatgctg 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (1)...(60) <223> Homo sapiens dopamine transporter (SLC6A3) gene, positions 41341 to 41401, polymorphism 59 A->G is at position 41370 <400> 2 gaagccatcg ccacgctccc tctgtcctcg gcctgggccg tggtcttctt catcatgctg 60 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> primer_bind <222> (1)...(22) <223> PCR primer sense <400> 3 ggtgtaggga acggcctgag ag 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> protein_bind <222> (1)...(24) <223> PCR primer antisense <400> 4 cttcctggag gtcacggctc aagg 24

Claims (14)

1. 클로자핀에 대한 반응성을 표시하는 환자 샘플 내에 존재하는 바이오마커를 기초로 선택되는, 선택된 환자 집단에서 정신분열병 치료용 의약품의 제조에 있어서의 클로자핀의 용도.
2. 제1항에 있어서, 바이오마커가 도파민 수송체 1 (SLC6A3; DAT1) 유전자의 3'-비번역 구역 (UTR) 내에 위치하는 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성인 용도.
3. 제2항에 있어서, 바이오마커가 GenBank 서열 수탁 참조 번호 AF119117.1의 위치 41370에서 SLC6A3 엑손 9 A59G의 다형성 부위를 추가로 포함하는 것인 용도.
4. (a) 환자로부터 체액 또는 다른 조직의 샘플을 얻고,

   (b) 환자의 체액 또는 조직 내에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피에 대해, SLC6A3 유전자 (hDAT1 유전자)의 3' UTR 구역에 존재하는 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성의 정체를 결정하는 것을 포함하고,

   여기서 (i) SLC6A3 유전자의 두 카피 모두가 VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립유전자를 가질 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 저반응군으로 예측되고;

   (ii) SLC6A3 유전자의 하나의 카피가 VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립 유전자를 갖고 다른 카피가 VNTR 다형성에서 10개 이상의 반복 대립유전자를 가질 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 고반응군으로 예측되고;

   (iii) SLC6A3 유전자의 두 카피 모두가 VNTR 다형성에서 10개 이상의 반복 대립유전자를 가질 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 고반응군으로 예측되는 것인, 클로자핀 치료에 대한 환자의 반응성을 예측하는 방법.
5. 제4항에 있어서, (c) 환자의 체액 또는 조직에 존재하는 SLC6A3 유전자의 2 카피에 대해, GenBank 서열 수탁 참조 번호 AF119117.1의 위치 41370에서 SLC6A3 엑손 9 A59G의 다형성 부위에서 뉴클레오티드쌍의 정체를 결정하는 것을 추가로 포함하고, 여기서

   (i) 두 뉴클레오티드쌍이 AT이면, 환자는 AA로서 분류되고 상기 환자는 위험 카테고리 I로 간주되고;

   (ii) 하나의 뉴클레오티드쌍이 AT이고 다른 하나가 GC이면, 환자는 GA로서 분류되고 상기 환자는 위험 카테고리 II로 간주되고;

   (iii) 두 뉴클레오티드쌍이 GC이면, 환자는 GG로서 분류되고 상기 환자는 위험 카테고리 III으로 간주되는 것인 방법.
6. 제5항에 있어서, (d) 환자가 위험 카테고리 II 또는 III으로 분류될 경우, 치료 동안 과다 자살/자기파괴 행동 예방조치를 취하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 체액이 혈액인 방법.
8. 대리 마커가 환자의 SLC6A3 유전자의 3' UTR 구역에 존재하는 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성의 동정에 대한 것인지를 결정하는 것을 포함하고, 여기서

   (i) 대리 마커가 VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 SLC6A3 유전자의 두 카피 모두에 대한 것일 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 저반응군으로 예측되고;

   (ii) 대리 마커가, VNTR 다형성에서 9개 이하의 반복 대립유전자를 갖는 SLC6A3 유전자의 하나의 카피 및 VNTR 다형성에서 10개 이상의 반복 대립유전자를 갖는 다른 카피에 대한 것일 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 고반응군으로 예측되고;

   (iii) 대리 마커가 VNTR 다형성에서 10개 이상의 반복 대립유전자를 갖는 SLC6A3 유전자의 두 카피 모두에 대한 것일 경우, 환자는 자살 행동에 대한 클로자핀 치료의 고반응군으로 예측되는 것인, 클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하는 방법
9. (a) SLC6A3 유전자의 3' UTR 구역에 존재하는 가변 반복 서열 (VNTR) 다형성을 결정하기 위한 수단; 및

   (b) 엑손 9 A59G 다형성 부위에서 SLC6A3 다형성 부위의 유전적 다형성 패턴 을 결정하기 위한 수단

   을 포함하는, 클로자핀 치료에 대한 반응성을 예측하기 위한 키트.
10. 제9항에 있어서, DNA 샘플 수집 수단을 추가로 포함하는 키트.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, SLC6A3 다형성 부위의 유전적 다형성 패턴을 결정하기 위한 수단이 SLC6A3 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
12. 제11항에 있어서, SLC6A3 유전자형 분석 프라이머 조성물이 적어도 2세트의 대립유전자 특이적 프라이머쌍을 포함하는 것인 키트.
13. 제11항 또는 제12항에 있어서, SLC6A3 유전자형 분석 올리고뉴클레오티드가 별개의 용기에 포장되는 것인 키트.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 체액 샘플을 수집하기 위한 수단을 추가로 포함하는 키트.

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