KR20070021132A - Lactic acid with high nisin-productivity and method of selecting the same - Google Patents

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KR20070021132A
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Abstract

유산균이 생산하는 박테리오신 또는 나이신 이외의 박테리오신에 대한 내성을 지표로 사용하여 박테리오신을 함유하는 합성 배지에서 생육하는 세균을 선발함으로써, 회분 배양에 의해서도, 액체 배지에서 증식시키는 경우 배지 상등액 1mL당 6,800IU 이상의 나이신 생산능을 갖는 유산균을 취득할 수 있으며, 당해 배양물을 식품 또는 사료에 사용하여 식품 또는 사료의 보존성을 향상시킬 수 있다. By selecting bacteria growing in synthetic medium containing bacteriocin, using resistance against bacteriocin other than bacteriocin or nisin produced by lactic acid bacteria, 6,800 IU per 1 mL of the culture supernatant when grown in liquid medium even by batch culture Lactic acid bacteria having the above-described nisin production ability can be obtained, and the culture can be used for food or feed to improve the preservation of food or feed.

나이신, 유산균, 락토코커스 락티스, 박테리오신, 나이신 생산능, 선발, 회분 배양Niacin, Lactobacillus, Lactococcus lactis, Bacteriocin, Nisin Production Capacity, Selection, Batch Culture

Description

나이신 고생산 유산균 및 이의 선발방법{Lactic acid with high nisin-productivity and method of selecting the same}Lactic acid with high nisin-productivity and method of selecting the same}

본 발명은 나이신을 생산하는 유산균 및 이의 선발방법 및 상기 유산균을 이용한 식품 또는 사료에 관한 것이다.The present invention relates to lactic acid bacteria that produce nisin and a selection method thereof, and a food or feed using the lactic acid bacteria.

유산균의 일종인 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)의 일부는 발효에 의해 당류로부터 유산 및 펩타이드성 항균물질 나이신을 생산하며, 이의 균체 및 배양액은 미생물에 대해 정균(靜菌) 및 살균효과가 있으며, 최근에는 특히 식품의 보존성 향상기능에 대한 관심이 높아지고 있다.A part of Lactococcus lactis , a kind of lactic acid bacteria, produces lactic acid and peptidic antimicrobial compounds from sugars by fermentation, and its cells and cultures have bacteriostatic and bactericidal effects against microorganisms. Recently, in particular, the interest in improving the preservation of food is increasing.

나이신은 34개의 아미노산으로 구성되어 있으며 분자내에 란티오닌, β-메틸란티오닌, 데하이드로알라닌 및 데하이드로부티린을 갖는 분자량 약 3.5kDa의 항균성 펩타이드이다. 현재까지, 나이신에는 천연의 아미노산 치환체로서 나이신 A, 나이신 Z, 나이신 Q가 보고되어 있다. 또한, 이의 항균 스펙트럼은 넓으며 그램 양성균 뿐만 아니라 그램 음성균에 대해서도 항균효과를 나타내는 것으로 공지되어 있다[참조: Gill A.O. et. al. Adv. Int J Food Microbiol. 2003, Vol. 80, p251- 9.]Nisin is an antimicrobial peptide of molecular weight about 3.5 kDa consisting of 34 amino acids and having lanthionine, β-methyllanthionine, dehydroalanine and dehydrobutyrin in the molecule. To date, Nisin has been reported to be a natural amino acid substituent, Nisin A, Nisin Z, and Nisin Q. In addition, its antimicrobial spectrum is broad and it is known to exhibit antimicrobial effect against gram positive bacteria as well as gram negative bacteria [Gill A.O. et. al. Adv. Int J Food Microbiol. 2003, Vol. 80, p251-9.]

또한, 나이신은 박테리오신 중에서 유일하게 미국 FDA에 GRAS 물질로서 인정되어 있으며 식품이나 사료, 의약품 등에 폭넓게 이용되고 있는 안전한 물질이다.In addition, nisin is the only bacteriocin that is recognized as a GRAS substance by the US FDA and is a safe substance widely used in food, feed, and medicine.

나이신을 생산하는 락토코커스 락티스 및 이의 배양물을 정균제로서의 이용한 예로서, 배양액의 식품 첨가제로서의 이용[일본 공개특허공보 제(평)5-268975호]이나, 생선 식품 또는 발효 식품에 락토코커스 락티스를 혼합하는 것에 의한 식품의 보존방법[일본 공개특허공보 제(평)5-211859호]를 들 수 있다.As an example of using lactococcus lactis and its culture as a bacteriostatic agent, which is used as a bacteriostatic agent (Japanese Laid-Open Patent Publication No. Hei 5-268975), lactococcus lacquer in fish or fermented foods The preservation method of the food by mixing teas (Unexamined-Japanese-Patent No. 5-211859) is mentioned.

또한, 식품 이외에서의 이용법으로서는 구강 세정제나 의약품으로서의 이용법[일본 공개특허공보 제(평)9-077681호] 등을 들 수 있다.Moreover, as a usage method other than food, the usage method as a mouthwash and a medicine (Unexamined-Japanese-Patent No. 9-077681) etc. are mentioned.

나이신을 생산하는 능력이 높은 균주로서 락토코커스 락티스에 속하는 유산균이 배양액 1mL당 6,750IU의 나이신을 생산한다는 보고가 있다(De Vuyst et. al.It is reported that lactic acid bacteria belonging to Lactococcus lactis as a high ability to produce nisin produce 6,750 IU of nisin per mL of culture (De Vuyst et. Al.

Blackie Academic and Professional, 1994, p151-221). 단, 구체적인 배양조건에 관한 개시는 없다. 또한, 락토코커스 락티스 UL719를 회분 배양할 때에 배양액 1mL당 4,100IU의 나이신을 생산한다는 보고가 있다[참조: Amialie et. al. Adv. World J. Microbiol. Biotecnoly, 1998, p887-894]. Blackie Academic and Professional, 1994, p151-221). However, there is no disclosure regarding specific culture conditions. In addition, it has been reported that in batch culture of Lactococcus lactis UL719, 4,100 IU of nisin is produced per mL of culture. See, for example, Amialie et. al. Adv. World J. Microbiol. Biotecnoly, 1998, p887-894].

나이신을 생산하는 능력이 높은 균주의 선발방법으로서, 에리스로마이신 내성을 지표로 사용하여 선발된 균주는 5000IU/mL의 나이신에 대하여 내성을 가지며, 모 균주로서 이용한 락토코커스 락티스 N8 균주에 대해 균수당의 최고 나이신 생산능이 10배라는 보고가 있다[참조: Qiao et. al. Adv. Biotechnol. Let., 1997, p199-202]. 단, 최고치는 2.8×10-5IU/cfu로 기재되어 있지만, 배양액당 세균 수가 기재되어 있지 않으며 구체적인 나이신 생산능, 즉 배양액 1mL당 몇IU의 나이신을 생산하는지는 나타내고 있지 않다. 퀴아오(Qiao) 등의 문헌 이외에 나이신을 생산하는 능력이 높은 균주의 선발방법에 관한 보고는 없으며 나이신 내성을 지표로 사용한, 나이신을 생산하는 능력이 높은 균주의 선발방법에 관한 보고도 없다.As a selection method of strains having high ability to produce niacin, strains selected using erythromycin resistance as an indicator are resistant to 5000 IU / mL of nisin and to Lactococcus lactis N8 strain used as a parent strain. It is reported that the highest nisin production capacity of the allowance is 10 times [Qiao et. al. Adv. Biotechnol. Let., 1997, p 199-202]. However, the maximum value is described as 2.8 × 10 −5 IU / cfu, but the number of bacteria per culture is not described, and it does not indicate the specific production capacity of nisin, i.e., how many IUs per 1 mL of culture are produced. In addition to Qiao et al., There are no reports on the selection method of strains having high ability to produce nisin, and there are no reports on the selection method of strains having high ability to produce nisin using Nisin resistance as an indicator.

나이신을 고농도로 취득하는 방법으로서, 나이신 생산능이 낮은 유산균의 배양액을 막 농축하는 방법 또는 연속배양 등에 의해 나이신을 배지중에 축적하는 방법(일본 공개특허공보 2002-85083호) 등을 들 수 있지만, 연속배양에서는 복잡하고 비싼 장치가 필요하며, 농축법에서는 나이신 활성이 저하된다는 점에서 반드시 효율적인 방법이라고는 할 수 없다.As a method of acquiring high concentration of nisin, a method of membrane concentration of lactic acid bacteria having low nisin production capacity or a method of accumulating nisin in a medium by continuous culture or the like (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-85083), etc. may be mentioned. The continuous culture requires a complicated and expensive device, and the concentration method is not necessarily an efficient method in that nisin activity is lowered.

또한, 나이신 생산 유산균 배양물의 미생물에 대한 정균효과는 유산 균체를 포함하는 편이 높다는 보고도 있으며(미국 특허 제5,965,178호), 실제로 된장의 제조법(일본 공개특허공보 2001-224359호) 또는 콩자반의 제조법(일본 공개특허공보 2003-116477호)에서는 균체와 나이신 용액 둘다를 병용하여 정균효과를 증가시킬 수 있다.In addition, the bacteriostatic effect on the microorganisms of the nisin-producing lactic acid bacteria culture is reported to include lactic acid bacteria (US Patent No. 5,965,178), and in fact, the method of preparing soybean paste (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-224359) or the method of preparing soybean paste. In Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2003-116477, the bacteriostatic effect can be increased by using both cells and a nisin solution together.

한편, 상기한 농축 또는 연속배양에 의한 고농도의 나이신 용액의 조제법에서는 균체가 제거된다는 문제가 있기 때문에, 회분 배양과 같은 간편한 방법으로 고농도 나이신 및 유산 균체를 함유하는 배양액을 조제하는 것이 요망된다. 이를 위해 나이신을 고생산하는 유산균을 육종 및 선발하는 방법을 개발하여, 나이신 생산능이 높은 유산균을 개발하는 것이 효과적이며, 나이신 생산능이 높은 유산균이 개발되면, 이의 배양물을 음식물이나 사료에 이용함으로써 이들 음식물이나 사료의 보존성을 효율적으로 향상시킬 수 있다.On the other hand, there is a problem that the cells are removed in the method of preparing a high concentration of niacin solution by the above-mentioned concentrated or continuous culture. Therefore, it is desirable to prepare a culture solution containing a high concentration of niacin and lactic acid cells by a simple method such as batch culture. . To this end, it is effective to develop a method for breeding and selecting lactic acid bacteria that produce high nisin, and to develop lactic acid bacteria having high nisin production ability, and when the lactic acid bacteria having high nisin production capacity are developed, its culture is used for food or feed. By doing so, the shelf life of these foods and feeds can be improved efficiently.

본 발명은 간편한 회분 배양에 의해서도 고농도의 나이신을 배양액 중에서 생산할 수 있는 유산균 및 이의 배양액을 제공하고 나이신 생산능이 높은 유산균을 간편하게 선발하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.It is an object of the present invention to provide a lactic acid bacterium capable of producing high concentrations of nisin in a culture medium by a simple batch culture, and a method for easily selecting a lactic acid bacterium having high nisin production capacity.

본 발명자등은 상기 과제를 해결하기 위해, 유산균이 생산하는 박테리오신, 특히 엔테로신 또는 나이신에 대한 내성을 지표로 하여 유산균이 생산하는 박테리오신을 함유하는 합성 배지에서 생육하는 세균을 선발함으로써 지금까지 보고된 것보다 높은 나이신 생산능을 갖는 유산균을 회분 배양에 의해서도 취득할 수 있음을 밝혀냈다. 즉, 본 발명은 하기와 같다.In order to solve the above problems, the present inventors have reported so far by selecting bacteria grown in a synthetic medium containing bacteriocin produced by lactic acid bacteria, with resistance to bacteriocin produced by lactic acid bacteria, in particular, enterocine or nisin. It was found that lactic acid bacteria having higher nisin production capacity could be obtained by batch culture. That is, the present invention is as follows.

(1) 액체 배지에 의한 회분 배양에서 배지의 상등액 1mL당 6,800IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는 유산균. (1) Lactic acid bacteria which produce 6,800 IU or more of nisin in the medium in 1 mL of the supernatant of the medium in the batch culture by the liquid medium.

(2) 상등액 1mL당 8,100IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는, (1)에 기재된 유산균. (2) The lactic acid bacterium according to (1), which produces 8,100 IU or more of nisin per 1 mL of the supernatant in the medium.

(3) 상등액 1mL당 10,125IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는, (1)에 기재된 유산균. (3) The lactic acid bacterium according to (1), which produces 10,125 IU or more of nisin per 1 mL of the supernatant in the medium.

(4) 액체 배지가 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘을 함유하는 액체 배지인, (1)에 기재된 유산균. (4) The lactic acid bacterium according to (1), wherein the liquid medium is a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 1.5% calcium carbonate.

(5) 생산되는 나이신이 나이신 A 또는 나이신 Z인, (1)에 기재된 유산균. (5) The lactic acid bacterium according to (1), wherein the produced nisin is Nisin A or Nisin Z.

(6) 락토코커스속에 속하는 (1)에 기재된 유산균. (6) The lactic acid bacteria according to (1), belonging to the genus Lactococcus.

(7) 락토코커스 락티스 AJ110212(FERM BP-8552)인 (6)에 기재된 유산균. (7) The lactic acid bacterium according to (6), which is Lactococcus lactis AJ110212 (FERM BP-8552).

(8) 유산균이 생산하는 박테리오신을 함유하는 합성 배지에서 생육하는 세균을 선발함을 특징으로 하는, 나이신 생산 유산균의 선발방법. (8) A method for selecting a nisin-producing lactic acid bacterium, characterized by selecting bacteria that grow on a synthetic medium containing bacteriocin produced by the lactic acid bacterium.

(9) 박테리오신이 엔테로신 또는 나이신인, (8)에 기재된 나이신 생산 유산균의 선발방법. (9) The method for selecting the nisin-producing lactic acid bacterium according to (8), wherein the bacteriocin is enterosine or nisin.

(10) 박테리오신이 배지 1mL당 11,000 내지 90,000IU 양의 나이신인, (8)에 기재된 나이신 생산 유산균의 선발방법. (10) A method for selecting a nisin-producing lactic acid bacterium according to (8), wherein the bacteriocin is nisin in an amount of 11,000 to 90,000 IU per mL of medium.

(11) 박테리오신이 배지 1mL당 20,000 내지 80,000IU 양의 나이신인, (8)에 기재된 나이신 생산 유산균의 선발방법. (11) A method for selecting a nisin-producing lactic acid bacterium according to (8), wherein the bacteriocin is nisin in an amount of 20,000 to 80,000 IU per mL of medium.

(12) (1) 내지 (7)에 기재된 유산균을 배지속에서 배양함으로써 수득되는 유산균을 함유하는 배양액, 당해 유산균을 함유하는 배양액의 건조물, 당해 유산균이 제거된 배양액 상등액 또는 당해 배양액 상등액의 건조물. (12) A culture solution containing a lactic acid bacterium obtained by culturing the lactic acid bacteria described in (1) to (7) in a medium, a dried product of the culture solution containing the lactic acid bacteria, a culture supernatant liquid from which the lactic acid bacteria have been removed, or a dried product of the culture solution supernatant.

(13) (12)에 기재된 유산균을 함유하는 배양액 또는 당해 유산균을 함유하는 배양액의 건조물 또는 당해 유산균을 제거한 배양액 상등액 또는 당해 배양액 상등액의 건조물을 함유하는 보존성이 향상된 음식물 또는 사료. (13) A food or feed having improved shelf life, which contains a culture medium containing the lactic acid bacterium according to (12) or a dried product of the culture solution containing the lactic acid bacterium or a culture supernatant from which the lactic acid bacteria have been removed, or a dried product of the culture supernatant.

본 발명의 유산균은 유산균이 생산하는 박테리오신에 대한 내성을 가지며 또한 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘을 함유하는 액체 배지에 의한 회분 배양에서 배지의 상등액 1mL당 6,800IU 이상의 나이신을 생산하는 균주이다.The lactic acid bacterium of the present invention is resistant to the bacteriocin produced by the lactic acid bacteria and is also 6,800 IU per 1 mL of the supernatant of the medium in a batch culture with a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 1.5% calcium carbonate. It is a strain that produces more than niacin.

유산균 배양물의 취득방법은 다음과 같다.The acquisition method of the lactic acid bacteria culture is as follows.

사용하는 액체 배지는 기본적으로는 나이신을 생산하는 유산균을 증식할 수 있는 것이 요규되며, 일반적으로 당원, 질소원, 무기염류 등의 수용액으로 구성되는 합성 배지이다. 이러한 합성 배지에는 당원으로서는 포도당, 갈락토스 등의 단당류, 락토스, 슈크로스 중의 하나 이상이 함유되어 있으며 질소원으로서는 단백질 분해물, 펩톤, 효모 추출물, 어육 추출물, 카사미노산, 맥아즙 등 중의 하나 이상이 포함되어 있다. 무기염류로서는 염화나트륨, 탄산칼슘 등을 함유하고 있다. 바람직하게는 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘을 함유하는 액체 배지이며, 배지의 pH는 6.0 내지 7.0으로 조정하여, 살균후 냉각하여 사용된다. 배양중의 pH를 6.0 내지 7.0으로 조정하는 것은 나이신의 생산에 중요하며, 탄산칼슘은 이러한 pH 조정의 목적으로 첨가한다.The liquid medium to be used is basically required to be able to proliferate lactic acid bacteria that produce nisin, and is generally a synthetic medium composed of aqueous solutions such as sugar sources, nitrogen sources, and inorganic salts. The synthetic medium contains one or more of monosaccharides such as glucose and galactose, lactose and sucrose as a sugar source, and one or more of protein degradation products, peptone, yeast extract, fish extract, casamino acid, wort, etc. as a nitrogen source. . As inorganic salts, sodium chloride, calcium carbonate, etc. are contained. Preferably it is a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 1.5% calcium carbonate, the pH of the medium is adjusted to 6.0 to 7.0, and used after cooling after sterilization. Adjusting the pH in culture to 6.0 to 7.0 is important for the production of nisin, and calcium carbonate is added for the purpose of this pH adjustment.

조제한 배지에 나이신을 생산하는 유산균을 105 내지 109개/mL가 되도록 접종하고, 25℃ 내지 35℃, 바람직하게는 27.5℃ 내지 32.5℃에서 pH를 5.0 내지 6.5, 바람직하게는 5.5로 조정하면서, 0(정치) 내지 150rpm의 저속으로 교반하여, 15 내지 35시간 동안 배양을 실시한다. 나이신을 생산하는 유산균은 락토코커스 락티스 아종 락티스(Lactococcus lactis ssp. lactis)에 속하며, JCM 7638, ATCC 11454, NCD O497, IFO 12007 등을 예시할 수 있다.The prepared medium was inoculated with lactic acid producing lactic acid to be 10 5 to 10 9 / mL, and the pH was adjusted to 5.0 to 6.5, preferably 5.5 at 25 ° C to 35 ° C, preferably 27.5 ° C to 32.5 ° C. The mixture is stirred at a low speed of 0 (politics) to 150 rpm and cultured for 15 to 35 hours. Lactobacillus that produces nicin belongs to Lactococcus lactis ssp.lactis, and examples thereof include JCM 7638, ATCC 11454, NCD O497, IFO 12007, and the like.

배양액의 나이신 활성 측정법은 이시자키 등의 방법에 따른다[참조: Adv. J. Fac. Agr., Kyushu Univ., 40, p73-85]. 즉, 취득한 배양액을 HPLC로 측정한다. 표준물로서는 나이신 A 제제(시그마사)를 이용한다. 이때, 나이신 양 1㎍당의 활성치는 국제단위로 정해지고 있는 40IU/㎍으로 한다.Determination of the nisin activity of the culture medium follows the method of Ishizaki et al. [Adv. J. Fac. Agr., Kyushu Univ., 40, p73-85]. That is, the obtained culture solution is measured by HPLC. Nisin A preparation (Sigma) is used as a standard. At this time, the activity value per 1 µg of nisin is set to 40 IU / µg determined in international units.

나이신 활성 측정용의 샘플 조제할 때에는 샘플링한 배양액에 최종 농도가 0.1%가 되도록 Tween-20을 가하여 잘 혼합한 후, 원심분리 또는 0.22㎛의 필터 처리를 통해 유산 균체를 제거한다.When preparing a sample for measuring niacin activity, Tween-20 was added to the sampled culture solution so that the final concentration was 0.1%, followed by mixing well, followed by centrifugation or 0.22 μm filter treatment to remove the lactic acid cells.

다음에 나이신 고생산 유산균의 취득법에 관해서 기재하지만, 균주의 돌연변이를 이용한다. 우선, 유산균을 증식시킬 수 있는 합성 액체 배지에서 유산균을 배양한 다음, 프란탈리신 S, 헬베티신 J, 페디오신 PA-1, 엔테로신 등의 박테리오신을 첨가한 액체 배지, 바람직하게는 프란탈리신 S, 헬베티신 J, 페디오신 PA-1, 엔테로신 등의 유산균이 생산하는 박테리오신을 첨가한 액체 배지중, 보다 바람직하게는 락티신 481, 락토신 S, 나이신 등의 란티비오틱스(lantibiotics; 유산균이 생산하는 박테리오신의 1분류) 또는 페디오신 PA-1, 엔테로신 등의 II형 박테리오신(유산균이 생산하는 박테리오신의 1분류)를 첨가한 액체 배지중, 더욱 바람직하게는 란티비오틱스로 분류되는 나이신 또는 II형 박테리오신으로 분류되는 엔테로신을 첨가한 액체 배지, 특히 바람직하게는 모 균주가 생산하는 양 이상의 나이신을 첨가한 액체 배지중에 유산균 배양액의 일부를 접종하여 30℃에서 증식시켜 자연변이 또는 돌연변이 유발제, 자외선 등으로 변이를 유도한다. 돌연변이 유발제의 예로서는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)이나 에틸메탄설폰산(EMS), 4-디메틸아미노벤젠디아조설폰산나트륨(DAPA) 등을 들 수 있다.Next, a method for obtaining high-yield lactic acid bacteria is described, but mutation of the strain is used. First, the lactic acid bacteria are cultivated in a synthetic liquid medium capable of propagating lactic acid bacteria, and then a liquid medium to which bacteriocins such as plantalisine S, helveticin J, pediosin PA-1, and enterosine is added, preferably plantalis Among liquid mediums to which bacteriocins produced by lactic acid bacteria such as cine S, helveticin J, pediosin PA-1, and enterocine are added, more preferably lantibiotics such as lactisin 481, lactocin S, and nisin (lantibiotics; 1 class of bacteriocin produced by lactic acid bacteria) or type II bacteriocin (1 class of bacteriocin produced by lactic acid bacteria) such as pediosin PA-1 and enterosine, more preferably lantibio A portion of the lactic acid bacteria culture medium was added to a liquid medium containing nisin or tetrocines classified as tics, particularly preferably a liquid medium containing more than the amount of nisin produced by the parent strain. Inoculation is carried out at 30 ℃ to induce mutations by natural or mutagens, ultraviolet light and the like. Examples of the mutagenizer include N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS), 4-dimethylaminobenzenediazosulfonate (DAPA), and the like.

돌연변이가 유발된 균주를 나이신 등의 박테리오신을 함유하는 합성 한천배지에 도말한다. 이때의 합성 한천배지를 나이신 농도는 11,000 내지 90,000IU/mL, 바람직하게는 20,000 내지 80,000IU/mL이다. 나이신 이외의 박테리오신으로서는, 나이신 이외의 란티비오틱스 또는 II형 박테리오신을 도포한다. 도포량은 모 균주의 생육을 억제할 수 있는 양 이상, 바람직하게는 2 내지 200배량, 보다 바람직하게는 5 내지 200배량이다. 예를 들면, 엔테로신의 경우, 양은 모 균주에 따라서도 상이하지만, 후지타 등의 보고 결과(2004년도 일본유산균학회 발표 「Bacteriocin produced by Enterococcus faecium TUA 1344L」)로부터 고찰하여, 일반적으로 0.5㎍/mL 이상, 1 내지 100㎍/mL, 2.5 내지 100㎍/mL, 10 내지 100㎍/mL로 예시할 수 있다. 배지에 접종하는 유산균의 수는 형성된 콜로니가 서로 접촉되지 않도록 하는 수인 것이 바람직하며, 구체적으로는 1개 플레이트당 100 내지 300개 콜로니가 바람직하다. 나이신 생산능이 향상된 돌연변이종을 효율적으로 선발하기 위해 상기 배지에서 생육된 균주 중에서 모 균주보다 생육이 양호한 균주를 선발한다. 이러한 생육의 양호 악화는 육안으로 관찰한다.Mutant-induced strains are plated in synthetic agar medium containing bacteriocins such as nisin. At this time, the synthetic agar medium has a nisin concentration of 11,000 to 90,000 IU / mL, preferably 20,000 to 80,000 IU / mL. As bacteriocin other than nisin, lantibiotics or type II bacteriocin other than nisin are applied. The application amount is at least an amount capable of inhibiting the growth of the parent strain, preferably 2 to 200 times, more preferably 5 to 200 times. For example, in the case of enterosin, the amount varies depending on the parent strain, but it is generally considered to be 0.5 µg / mL or more from Fujita et al.'S report result (Bacteriocin produced by Enterococcus faecium TUA 1344L, 2004). , 1 to 100 µg / mL, 2.5 to 100 µg / mL, and 10 to 100 µg / mL. The number of lactic acid bacteria inoculated into the medium is preferably such that the colonies formed do not come into contact with each other, and specifically, 100 to 300 colonies per plate are preferred. In order to efficiently select mutant species having improved nisin production capacity, strains having better growth than parent strains are selected among the strains grown in the medium. Good deterioration of growth is visually observed.

선발된 균주를 상기한 유산균 배양액의 취득법에 따라 배양한다. 상기 배양액을 사용하여 마이크로플레이트 검정법을 실시하여, 지표균에 대한 항균 활성이 모 균주 이상인 균주를 선발한다. 마이크로플레이트 검정법은 하기에서 설명한다. 우선, 마이크로플레이트의 웰 각각에 균체를 제거한 각 유산균주의 배양액을 단계 희석한 액 및 나이신에 감수성인 그램 양성균의 배양액을 지표 균액으로서 균체수가 102 내지 105개/mL가 되도록 가하여 희석한다. 이때 사용하는 지표균의 예로서, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JCM1465T, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) JCM1157T 등을 들 수 있다. 다음에, 이러한 마이크로플레이트를 37℃에서 4 내지 24시간, 바람직하게는 12 내지 21시간 동안 항온처리하여, 지표균의 생육 정도의 측면에서 항균 활성, 즉 배양액 중의 나이신 활성을 측정한다. 생육 정도는 웰중의 탁도(Abs= 595nm)의 고저로서 판단한다. 배양액 중의 나이신 활성이 높아서 지표균의 생육이 억제되면, 웰의 탁도는 상승되지 않는다. 웰의 탁도가 상승된 배양액 상등액의 최대 희석율에 대해 모 균주와 변이주를 비교하여, 이러한 희석율이 모 균주 이상인 균주는 모 균주 이상의 나이신을 생산하고 있을 가능성이 있다고 추정하여 선발한다.The selected strains are cultured according to the method of obtaining the lactic acid bacteria culture medium described above. The microplate assay is performed using the culture solution to select strains whose antibacterial activity against the indicator bacteria is higher than the parent strain. Microplate assays are described below. First, dilute the culture solution of each lactic acid strain from which the cells were removed from each well of the microplate by diluting the solution and the culture solution of Gram-positive bacteria susceptible to nisin so that the number of cells was 10 2 to 10 5 cells / mL as indicator bacteria. Examples of the indicator bacteria used at this time include Bacillus subtilis JCM1465T, Lactobacillus sakei JCM1157T, and the like. This microplate is then incubated at 37 ° C. for 4 to 24 hours, preferably 12 to 21 hours, to measure antimicrobial activity, ie, nisin activity in culture, in terms of the extent of growth of the indicator bacteria. The extent of growth is judged as the height of turbidity (Abs = 595 nm) in the well. If the growth of the indicator bacteria is suppressed due to high nisin activity in the culture, the turbidity of the well does not rise. By comparing the parent strain and the mutant strain against the maximum dilution rate of the culture supernatant with increased turbidity of the wells, a strain having a dilution rate of at least the parent strain is estimated and selected.

마지막으로, 상기에서 선발된 균주를 배양하여, 배양액 중의 나이신 양을 HPLC에서 정량함으로써 배양액 중의 나이신 활성, 즉 유산균의 나이신 생산능이 상승한 것을 확인한다.Finally, by culturing the strain selected above, it is confirmed that the niacin activity in the culture, that is, the niacin production capacity of the lactic acid bacteria is increased by quantifying the amount of nisin in the culture solution by HPLC.

상기한 방법에 따라 회분 배양에서도 충분하게 고농도의 나이신을 배양액 중에 생산할 수 있는 유산균을 효율적으로 취득할 수 있다. 지금까지의 보고 중에서 최고 나이신 생산량은 6,750IU/mL(De Vuyst et. al.)이지만, 0.54% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스 및 1.5% 탄산칼슘으로 이루어진 액체 배지에서 최적의 조건하에 pH를 유지하면서 배양함으로써 공지된 것 중에서 최고 나이신 생산능을 갖는 유산균보다 높은 나이신 생산능을 갖는 유산균, 즉 상등액 1mL당 6,800IU 이상의 나이신 생산능을 갖는 유산균을 취득할 수 있다. 구체적으로는, 공지된 것 중에서 최고 나이신 생산능을 갖는 유산균보다 1.1배 높은 나이신 생산능인 상등액 1mL당 7,425IU/mL 이상의 나이신을 생산하는 유산균, 공지된 것 중에서 최고 나이신 생산능을 갖는 유산균의 1.2배의 나이신 생산능인 상등액 1mL당 8,100IU/mL 이상의 나이신을 생산하는 유산균, 공지된 것 중에서 최고 나이신 생산능을 갖는 유산균의 1.5배의 나이신 생산능인 상등액 1mL당 10,125IU/mL 이상의 나이신을 생산하는 유산균, 공지된 것 중에서 최고 나이신 생산능을 갖는 유산균의 1.8배의 나이신 생산능인 상등액 1mL당 12,150IU/mL 이상의 나이신을 생산하는 유산균을 수득할 수 있다. 또한, 나이신 생산능을 갖는 유산균을, 예를 들면, 세린, 시스테인이 첨가된 배지 등의 보다 적당한 배지에서 배양함으로써 상등액 1mL당 최고 20,000IU의 나이신을 수득할 수 있다고 사료된다.According to the method described above, lactic acid bacteria capable of producing a sufficiently high concentration of niacin in the culture medium can be efficiently obtained even in the batch culture. The highest nisin production reported so far is 6,750 IU / mL (De Vuyst et. Al.), But under optimum conditions in a liquid medium consisting of 0.54% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose and 1.5% calcium carbonate. By culturing while maintaining pH, lactic acid bacteria having higher nisin production capacity than those known to have the highest nisin production capacity, that is, lactic acid bacteria having 6,800 IU or more of nisin production capacity per mL of supernatant can be obtained. Specifically, lactic acid bacteria producing at least 7,425 IU / mL of nisin per mL of supernatant having a production capacity of 1.1 times higher than lactic acid bacteria having the highest nisin production capacity among the known ones, lactic acid bacteria having the highest nisin production capacity among the known ones. Lactobacillus producing more than 8,100 IU / mL per 1 mL of supernatant with 1.2 times niacin production capacity, 10,125 IU / mL per mL of supernatant with 1.5 times niacin production capacity Lactobacillus producing nisin, lactic acid bacteria producing at least 12,150 IU / mL per 1 mL of the supernatant, which is 1.8 times higher than the lactic acid bacterium having the highest nisin production capacity, can be obtained. In addition, it is considered that lactic acid bacteria having a nisin production capacity can be obtained by culturing in a more suitable medium such as, for example, a serine or cysteine-added medium, up to 20,000 IU of nisin per mL of the supernatant.

또한, 상기한 방법에 따라 취득한 나이신 생산능이 높은 유산균을 YDCS 배지(0.54% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스, 0.67mg/㎗의 세린, 0.67mg/㎗의 시스테인, 1.5% 탄산칼슘과 같은 유산균이 생육되기 쉬운 배지에서 회분 배양함으로써 나이신 생산능이 높은 유산균 및 이러한 유산균을 함유하는 배양액을 효율적으로 제조할 수 있다. 당해 유산균을 함유하는 배양액을, 예를 들면, 분무 건조 또는 드럼 건조함으로써 유산균을 함유하는 배양액의 건조물을 제조할 수 있다. 또한, 유산균을 함유하는 배양액을 예를 들면, 필터 처리 또는 경사분리하여 유산균이 제거된 배양액 상등액을 제조할 수 있으며 이러한 배양액 상등액을 예를 들면, 분무 건조 또는 드럼 건조함으로써 배양액 상등액의 건조물을 제조할 수 있다. 상기한 방법에 따라 수득된 배양물은 음식물이나 사료에 0.01 내지 10%의 양으로 첨가함으로써 보존성을 높일 수 있다. 이때 배양물이란, 배양액 그 자체이거나 살균한 배양액, 균체가 제거된 배양액, 이들의 농축물 또는 건조물의 어느 것이라도 상관없다. 또한, 음식물로서는 쥬스, 유제품, 육류제품, 김치 또는 된장이나 간장 등의 발효식품 조미료 등을 들 수 있다. 또한, 사료로서는 사일리지(silage) 등이 있다. 예를 들면, 된장, 간장 제조에서 누룩 제조공정에서 당해 나이신 생산 유산균 및 고농도의 나이신을 함유하는 배양액을 살수함으로써 바실러스 속 세균 등의 바람직하지 않은 미생물의 오염을 지금까지보다 효과적으로 억제할 수 있게 되므로 관능면에서 우수하며, 미생물 오염이 적은 제품을 만드는 것이 용이해진다. 또한, 상기와 같은 배양액을 누룩에 사용함으로써 누룩의 미생물 오염을 억제할 수 있으며 누룩을 무염(無鹽) 분해하며, 단백질을 고도로 분해함으로써 신규한 조미료를 제조할 수 있게 된다.In addition, lactic acid bacteria having high nisin production capacity obtained according to the above-described method were treated with YDCS medium (0.54% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 0.67 mg / dl serine, 0.67 mg / dl cysteine, 1.5% calcium carbonate). By batch culturing in a medium in which the same lactic acid bacteria are likely to grow, lactic acid bacteria having high nisin production ability and a culture medium containing such lactic acid bacteria can be efficiently produced.The culture medium containing the lactic acid bacteria, for example, by spray drying or drum drying In addition, a culture supernatant containing lactic acid bacteria can be prepared by filtering or decanting the culture medium containing lactic acid bacteria, for example, by filtering or decanting the culture medium containing the lactic acid bacteria. The dried product of the culture supernatant can be prepared by spray drying or drum drying. The preservation can be enhanced by adding silver to the food or feed in an amount of 0.01 to 10%, wherein the culture may be either the culture medium itself or the sterilized culture medium, the culture medium from which the cells are removed, or the concentrate or dried product thereof. In addition, food and drink include juice, dairy products, meat products, kimchi, or fermented food seasonings such as soybean paste or soy sauce, etc. In addition, silage is used as a feed. By sprinkling the culture solution containing the nisin-producing lactic acid bacterium and high concentration of nisin in the yeast manufacturing process, it is possible to more effectively suppress the contamination of undesirable microorganisms such as bacteria of Bacillus. It is easy to make a small product, and yeast by using the above culture medium for yeast Can inhibit microbial contamination and degradation salt-free (無 鹽) and the leaven, it is possible to manufacture a novel seasoning by decomposition of proteins highly.

나이신을 함유하는 배양액을 식품용 정균제로서 이용하는 경우, 배지 성분의 관능이 사용되는 식품에 악영향을 미치는 것도 고려되지만, 당해 나이신 생산 유산균을 사용하는 고농도의 나이신을 함유하는 배양액을 이용함으로써, 배양액의 첨가량이 소량이 되어 이러한 배지 성분에 의한 관능상의 악영향이 제거된다. 또한, 치즈의 제조에서는 치즈에 다공(多孔)을 형성하는 클로스트리듐속 세균의 증식을 억제하기 위해 나이신 생산 유산균을 스타터(starter)로서 접종하는 예가 있지만, 당해 나이신 고생산 유산균을 사용하는 경우, 당연히 이의 정균효과는 높아지므로 보다 확실하게 목적하는 치즈를 제조할 수 있게 된다.When a culture solution containing nisin is used as a bacteriostatic agent for food, it is also considered that the functionalities of the media components adversely affect the food used, but by using a culture solution containing a high concentration of nisin using the nisin-producing lactic acid bacteria, A small amount of the additive is added to eliminate the adverse effects on the sensory effect of these media components. In addition, in the manufacture of cheese, there is an example of inoculating nisin-producing lactic acid bacteria as a starter in order to suppress proliferation of Clostridium spp. Bacteria that form pores in the cheese. In this case, of course, its bacteriostatic effect is increased, so that the desired cheese can be produced more reliably.

이하, 실시예에 따라 본 발명을 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 한정되는 것이 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. Of course, the technical scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1 Example 1

우선, 자연계에서 분리한 나이신 Z 생산균(표 3에 기재된 모 균주)를 나이신 농도 1,000, 2,000, 5,000 또는 10,000IU/mL가 되도록 조제한 M17 배지(Difco제)에 도말하여 30℃에서 2일 동안 배양한다. 본 균주는 나이신 농도 1,000 또는 2,000IU/mL의 M17 배지에서는 생육하지만, 5,000 또는 10,000IU/mL의 M17 배지에서는 생육하지 않았다. 이러한 결과로부터 본 균주의 나이신에 대한 최소 생육 저지농도(MIC)는 5,000IU/mL임이 확인되었다.First, Naisin Z-producing bacteria (parent strains shown in Table 3) isolated from nature were plated on M17 medium (manufactured by Difco) prepared to have a niacin concentration of 1,000, 2,000, 5,000 or 10,000 IU / mL. Incubate for a while. This strain was grown in M17 medium at a nisin concentration of 1,000 or 2,000 IU / mL, but not in M17 medium at 5,000 or 10,000 IU / mL. From these results, it was confirmed that the minimum growth inhibition concentration (MIC) for the nisin of the present strain was 5,000 IU / mL.

이러한 자연계에서 분리한 나이신 Z 생산 유산균을 M17 배지에서 예비 배양하고, 생육된 세균을 500㎍/mL의 NTG에서 처리하여 돌연변이를 유발하였다.Naisin Z-producing lactic acid bacteria isolated from this natural system were pre-cultured in M17 medium, and the grown bacteria were treated in 500 µg / mL of NTG to induce mutations.

상기한 변이처리된 균주를 나이신 농도가 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 10,000, 20,000, 40,000, 80,000 또는 100,000IU/mL가 되도록 조제한 M17 배지에 도말하여 30℃에서 1 내지 3일 동안 항온처리한다.The above mutated strains are incubated at 30 ° C. for 1 to 3 days by smearing in M17 medium prepared so that the nisin concentration is 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 10,000, 20,000, 40,000, 80,000 or 100,000 IU / mL. .

그 결과, 각 나이신 농도의 배지에서 생육한 균체의 수를 표 1에 기재한다.As a result, the number of cells grown in the medium of each nisin concentration is shown in Table 1.

나이신 함유 배지에서 나이신 Z 생산 유산균 생육주 수Number of Nisin Z Producing Lactic Acid Bacteria Growing in Nisin 나이신 농도 (IU/ml)Nisin concentration (IU / ml) 0 0 1,0001,000 2,0002,000 4,0004,000 8,0008,000 10,00010,000 20,00020,000 40,00040,000 80,00080,000 100,000100,000 생육주 수 (균체/ml)Number of growers (cells / ml) 1.20E+091.20E + 09 1.20E+091.20E + 09 1.20E+091.20E + 09 1.20E+091.20E + 09 7.00E+087.00E + 08 1.14E+081.14E + 08 3.21E+073.21E + 07 9.35E+059.35E + 05 1.16E+031.16E + 03 4.76E+024.76E + 02

표 1과 같이, 나이신 농도 8,000IU/mL 이상에서 플레이트에서 생육할 수 있는 세균의 수가 감소되기 시작한다. 따라서, 8,000IU/mL 내지 100,000IU/mL의 나이신을 함유하는 합성 배지에서, 나이신을 고농도로 생산하는 유산균을 선발할 수 있다고 사료되며, 각 플레이트로부터 300개의 균주씩 선발하여 마이크로플레이트 검정법에 의해 모 균주보다 나이신 생산능이 향상된 균주를 선발하였다.As shown in Table 1, the number of bacteria that can grow on the plate begins to decrease at a concentration of 8,000 IU / mL or higher. Therefore, in synthetic medium containing 8,000 IU / mL to 100,000 IU / mL, it is considered that lactic acid bacteria producing high concentration of nisin can be selected, and 300 strains are selected from each plate and collected by microplate assay. Strains with improved nisin production were selected.

선발된 유산균을 각각 글루코스 비함유 티오글리콜레이트(Tioglycolate without glucose) 배지(Difco제)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 이의 배양액을 50mL의 YD 배지(0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3.0%글루코스, 1.5% 탄산칼슘 pH 7.0, 경사구 플라스크)에 씨딩하여 100rpm에서 진탕하고, 회분 배양을 실시한다.The selected lactic acid bacteria were incubated for 24 hours at 37 ° C. in a glucose-free thioglycolate without glucose medium (manufactured by Difco), and the culture medium thereof was 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.0%). Glucose, 1.5% calcium carbonate pH 7.0, gradient bulb flasks), shake at 100 rpm, and batch culture.

각 균주가 생산하는 나이신 양을 HPLC에서 측정한 결과, 배지 1mL당 6,800IU 이상의 나이신을 생산하는 균주의 수를 표 2에 기재하고, 각각의 플레이트에서 수득된 변이주의 나이신 활성을 표 3에 기재한다.As a result of measuring the amount of nisin produced by each strain by HPLC, the number of strains producing at least 6,800 IU of nisin per mL of the medium is shown in Table 2, and the nisin activity of the mutant strain obtained in each plate is shown in Table 3. List it.

취득된 고나이신 생산주 수Number of Konaishin Producers Acquired 배지의 나이신 농도(ImL)Nisin concentration in the medium (ImL) 8,0008,000 10,00010,000 20,00020,000 40,00040,000 80,00080,000 100,000100,000 6,800 IU/mL 이상의 나이신을 생산하는 돌연변이주 수Number of mutant strains producing more than 6,800 IU / mL of nisin 00 00 22 1919 55 00

그 결과로서, 20,000IU/mL 내지 80,000IU/mL의 나이신을 함유하는 배지에서 나이신 생산량이 6,800IU/mL 이상인 균주를 효율적으로 선발할 수 있는 것으로 판명되었다. As a result, it has been found that strains having a yield of 6,800 IU / mL or more can be efficiently selected in a medium containing 20,000 IU / mL to 80,000 IU / mL of nisin.

40,000IU/mL의 나이신 함유 플레이트에서 선발된 균주로부터 나이신 생산능이 가장 높은 엘. 락티스 AJ110212 균주를 수득하였다. 엘. 락티스 AJ110212 균주는 모 균주의 약 3.0배, 일반적인 나이신 Z주인 엘. 락티스 JCM7638 균주의 약 3.4배의 나이신 생산능을 갖는 것으로 판명되었다. 또한, 지금까지 보고된 것 중에서 최고 나이신 생산량인 문헌[참조: De Vuyst et. al.]에 기재된 6,750IU/mL과 비교해도 약 1.8배의 나이신을 생산하는 능력을 갖는 것으로 판명되었다. 또한, 엘. 락티스 AJ110212 균주는 2003년 11월 19일에 독립행정법인 산업 기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-8552의 수탁번호로 기탁되어 있다.L. had the highest nisin production capacity from strains selected from 40,000 IU / mL Nisin containing plates. Lactis AJ110212 strain was obtained. L. The Lactis AJ110212 strain is approximately 3.0 times that of the parent strain, L. common strain Z. It was found to have about 3.4 times the capacity for nisin production of the Lactis JCM7638 strain. In addition, De Vuyst et. It was found to have about 1.8 times the ability to produce niacin, compared to 6,750 IU / mL described in al.]. Also, L. The Lactis AJ110212 strain was deposited on November 19, 2003 under the accession number of FERM BP-8552 to the Institute of Patented Biotechnology of the Korea Institute of Industrial Technology.

실시예 2 Example 2

엔테로신 함유 용액을 다음과 같이 하여 조정한다. 엔테로신 생산균인 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) JCM 5804를 MRS 배지(Difco제)에서 37℃에서 22시간 동안 진탕 배양한다. 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 필터 여과(ADVANTEC제 Disposable Syringe Filter Unit, Dismic-25cs, Cellulose Acetate 0.45㎛)한다. 한외여과막을 사용하여 상기한 상등액의 조정제(粗精製)를 실시한다. 즉, 원심분리를 실시하여, 한외여과(탈염)을 실시하여 상등액 분획을 채취한다. 본 공정에 따라 배양액 중의 엔테로신을 농축시켜 엔테로신 200㎍/mL를 함유하는 용액을 조제한다. 농축 전후의 항균 활성은 실시예 1에서 사용한 자연계로부터 분리된 나이신 Z 생산 유산균을 사용하여, 스포트-온-론(spot-on-lawn) 방법에 의해 확인하였다.The enterosin containing solution is adjusted as follows. Enterococcus faecium ( Enterococcus faecium ) JCM 5804, which is an enterocin-producing bacterium, is shaken for 22 hours at 37 ° C. in MRS medium (manufactured by Difco). After centrifugation of the culture, the supernatant is filtered by a filter (Disposable Syringe Filter Unit, Dismic-25cs, Cellulose Acetate 0.45 µm). The supernatant is adjusted using an ultrafiltration membrane. That is, centrifugation is performed, ultrafiltration (desalting) is performed, and a supernatant fraction is collected. According to this step, enterosine in the culture solution is concentrated to prepare a solution containing 200 μg / mL of enterosine. The antimicrobial activity before and after concentration was confirmed by the spot-on-lawn method, using Nisin Z-producing lactic acid bacteria isolated from the natural system used in Example 1.

자연계에서 분리한 나이신 Z 생산 유산균(표 3에 기재된 모 균주)를 M17 배지(Difco제)에서 예비 배양하고, 생육된 세균을 500㎍/mL의 NTG에서 처리하여 돌연변이를 유발하였다.Naisin Z-producing lactic acid bacteria (parent strains described in Table 3) isolated from nature were pre-cultured in M17 medium (manufactured by Difco), and the grown bacteria were treated in 500 μg / mL of NTG to induce mutations.

상기한 변이처리된 균주를 M17 배지 또는 엔테로신 함유 농도가 약 20㎍/mL가 되도록 조제한 M17 배지에 도말하여 30℃에서 1 내지 3일 동안 항온처리한다. 플레이트에서 생육된 콜로니 수는 엔테로신을 함유하는 M17 배지에서 M17 배지와 비교하여 1/100이었다. 따라서, 나이신 함유 M17 배지에서의 결과로부터 고찰하여, 본 농도에서 엔테로신 함유 M17 배지에서 나이신을 고농도로 생산하는 유산균을 분리해낼 수 있다고 사료되어, 108개의 균주를 선발하고 마이크로플레이트 검정법에서 모 균주보다 나이신 생산능이 향상된 균주를 선발하였다.The mutated strains are plated in M17 medium or M17 medium prepared so that the concentration of enterosine is about 20 μg / mL and incubated for 1 to 3 days at 30 ° C. The number of colonies grown on the plate was 1/100 compared to M17 medium in M17 medium containing enterosine. Therefore, from the results in the nisin-containing M17 medium, it is thought that the lactic acid bacterium producing high concentration of the nisin can be isolated from the enterocin-containing M17 medium at this concentration, and 108 strains were selected and the parent strain in the microplate assay. Strains with improved nisin production were selected.

선발된 유산균을 각각 글루코스 비함유 티오글리콜레이트 배지(Difco제)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 이의 배양액을 50mL의 YD 배지(0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3.0% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘 pH 7.0, 경사구 플라스크)에 씨딩하여 100rpm에서 진탕하고, 회분 배양을 실시하였다.Each of the selected lactic acid bacteria was incubated for 24 hours at 37 ° C. in glucose-free thioglycolate medium (manufactured by Difco), and the culture was cultured in 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.0% glucose, 1.5% carbonic acid). Ca pH 7.0, gradient bulb flasks) were seeded and shaken at 100 rpm, and the batch culture was performed.

각 균주가 생산하는 나이신 양을 HPLC에서 측정한 결과, 배지 1mL당 6,800IU 이상의 나이신을 생산하는 균주 24개를 취득하였다. As a result of measuring the amount of nisin produced by each strain by HPLC, 24 strains producing at least 6,800 IU or more nisin per mL were obtained.

이와 같이 엔테로신 함유 플레이트에서 선발된 균주로부터 나이신 생산능이 가장 높은 엘. 락티스 AJ110376 균주(나이신 활성 10,802IU/mL)를 수득하였다. 엘. 락티스 AJl10376 균주는 모 균주의 약 2.7배, 일반적인 나이신 Z주인 엘. 락티스 JCM7638 균주의 약 3.4배의 나이신 생산능을 갖는 것으로 판명되었다. 또한, 지금까지 보고된 것 중에서 최고 나이신 생산량인 문헌[참조: De Vuyst et. al.]에 기재된 6,750IU/mL와 비교해서도 약 1.6배의 나이신을 생산하는 능력을 갖는 것으로 판명되었다.As such, L. had the highest ability to produce nisin from the strain selected from the enterocin containing plate. Lactis AJ110376 strain (10,802 IU / mL of nisin activity) was obtained. L. The Lactis AJl10376 strain is about 2.7 times that of the parent strain, L. common strain Z. It was found to have about 3.4 times the capacity for nisin production of the Lactis JCM7638 strain. In addition, De Vuyst et. It was found to have about 1.6 times the ability to produce niacin, compared to 6,750 IU / mL described in al.].

비교예 1 Comparative Example 1

실시예 1에 기재된 엘. 락티스 #N43을 에리스로마이신 농도 0.01 내지 0.2㎍/mL가 되도록 조제한 M17 배지에 도말하고, 30℃에서 1 내지 3일 동안 항온처리한다. 그 다음, 생육하고 있는 유산균을 각각 글루코스 비함유 티오글리콜레이트 배지(Difco제)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 이의 배양액을 50mL의 YD 배지(0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3.0% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘 pH 7.0, 경사구 플라스크)에 씨딩하여 100rpm에서 진탕 배양을 실시한다. 각 균주가 배지 상등액 중에 생산하는 나이신 양을 HPLC로 측정한 결과를 표 4에 기재한다.L as described in Example 1. Lactis # N43 is plated in M17 medium prepared to an erythromycin concentration of 0.01 to 0.2 μg / mL and incubated for 1 to 3 days at 30 ° C. The growing lactic acid bacteria were then incubated for 24 hours at 37 ° C. in glucose-free thioglycolate medium (manufactured by Difco), and their cultures were 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.0% glucose). , 1.5% calcium carbonate pH 7.0, gradient flask) and the shaking culture at 100rpm. Table 4 shows the results of HPLC measurement of the amount of nisin produced by each strain in the culture supernatant.

Figure 112006059836180-PCT00002
Figure 112006059836180-PCT00002

표 4와 같이, 모 균주보다 나이신 생산능이 향상된 균주는 수득되지 않았으며, 문헌[참조: Qiao et. al.]에 기재된 바와 같은 에리스로마이신 내성을 지표로 사용한 선발에 의해 나이신 생산능을 향상시킬 수 없었다. 따라서, 에리스로마이신 내성을 지표로 사용한 선발방법과 비교하여, 나이신을 지표로 사용한 선발방법이 더욱 효율적이라고 사료된다.As shown in Table 4, no strains with improved nisin production were obtained, and Qiao et. Selection by using erythromycin resistance as an index as described in al.] could not improve niacin production. Therefore, compared with the selection method using erythromycin resistance as an index, the selection method using niacin as an index is considered to be more efficient.

비교예 2 Comparative Example 2

실시예 1에 기재된 자연계에서 분리된 나이신 Z 생산 유산균(표 3의 모 균주)를 M17 배지(Difco제)에서 예비 배양하고, 생육된 세균을 500㎍/mL의 NTG에서 처리하여 돌연변이를 유발하였다.Naisin Z-producing lactic acid bacteria (parent strains in Table 3) isolated from nature described in Example 1 were pre-cultured in M17 medium (manufactured by Difco), and the grown bacteria were treated at 500 μg / mL of NTG to induce mutations. .

상기한 변이처리된 균주를 에리스로마이신 농도 0.2㎍/mL가 되도록 조제한 M17 배지에 도말하여 30℃에서 1 내지 3일 동안 항온처리하였다. 그 다음, 생육하고 있는 유산균으로부터 무작위적으로 20개의 균주를 선발하였다. 각각 글루코스 비함유 티오글리콜레이트 배지(Difco제)에서 37℃에서 24시간 동안 배양하고, 이의 배양액을 50mL의 YD 배지(0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3.0% 글루코스, 1.5% 탄산칼슘 pH 7.0, 경사구 플라스크)에 씨딩하여 100rpm에서 진탕 배양을 실시한다. 각 균주가 배지 상등액 중에서 생산한 나이신 양을 HPLC에서 측정한 결과, 모 균주 이상의 나이신 활성을 갖는 균주를 취득할 수 없었다.The mutated strains were plated in M17 medium prepared to an erythromycin concentration of 0.2 μg / mL and incubated for 1 to 3 days at 30 ° C. Then, 20 strains were randomly selected from the growing lactic acid bacteria. Each was incubated for 24 hours at 37 ° C. in a glucose-free thioglycolate medium (manufactured by Difco), and the culture thereof was 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.0% glucose, 1.5% calcium carbonate pH 7.0, Seed in a gradient flask) and shake culture at 100 rpm. As a result of measuring the amount of nisin produced by each strain in the culture supernatant, it was not possible to obtain strains having more than the parent strain.

이와 같이 모 균주보다 나이신 생산능이 향상된 균주는 수득되지 않았으며 퀴아오 등의 문헌에 있는 바와 같은 에리스로마이신 내성을 지표로 하는 선발에 의해 나이신 생산능을 향상시킬 수 없었다. 따라서 에리스로마이신 내성을 지표로 하는 선발방법과 비교하여, 나이신이나 나이신 이외의 박테리오신을 지표로 하는 선발방법이 훨씬 효율적이라고 사료된다.As such, a strain with improved nisin production was not obtained, and the nisin production ability could not be improved by selection based on erythromycin resistance as described in Qiao et al. Therefore, compared with the selection method using erythromycin resistance as an index, the selection method using bacteriocin other than nisin or nisin is considered to be more efficient.

본 발명의 유산균의 선발방법에 따라 나이신 생산능이 높은 유산균을 수득할 수 있으며 본 발명의 유산균은 나이신을 고농도로 생산할 수 있으므로 간편한 회분 배양에서도 나이신 활성이 높은 배양액을 수득할 수 있다. 이러한 배양액은 다양한 음식물 및 사료에 사용되며, 음식물, 사료의 보존성을 향상시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 공업상, 특히 식품분야 및 사료분야에서 매우 유용하다. According to the lactic acid bacterium selection method of the present invention, lactic acid bacteria having high nisin production capacity can be obtained, and the lactic acid bacteria of the present invention can produce high concentration of nisin, so that even a simple batch culture can obtain a high nisin activity culture. These cultures are used in a variety of food and feed, it can improve the preservation of food, feed. Therefore, the present invention is very useful in industry, especially in the food and feed fields.

Claims (13)

액체 배지에 의한 회분 배양에서 배지의 상등액 1mL당 6,800IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는 유산균. A lactic acid bacterium that produces 6,800 IU or more of nisin in the medium in 1 mL of the supernatant of the medium in a batch culture with a liquid medium. 제1항에 있어서, 상등액 1mL당 8,100IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는 유산균. The lactic acid bacterium according to claim 1, wherein at least 8,100 IU of nisin is produced in the medium per mL of the supernatant. 제1항에 있어서, 상등액 1mL당 10,125IU 이상의 나이신을 배지중에 생산하는 유산균. The lactic acid bacterium of claim 1, wherein at least 10,125 IU of nisin is produced in the medium per mL of the supernatant. 제1항에 있어서, 액체 배지가 0.5% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 3% 글루코스 및 1.5% 탄산칼슘을 함유하는 액체 배지인 유산균. The lactic acid bacterium of claim 1, wherein the liquid medium is a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose and 1.5% calcium carbonate. 제1항에 있어서, 생산되는 나이신이 나이신 A 또는 나이신 Z인 유산균. The lactic acid bacterium according to claim 1, wherein the produced nisin is Nisin A or Nisin Z. 제1항에 있어서, 락토코커스(Lactococcus) 속에 속하는 것인 유산균. The lactic acid bacteria of claim 1 belonging to the genus Lactococcus . 제6항에 있어서, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) AJ110212(FERM BP-8552)인 유산균. The lactic acid bacterium according to claim 6, which is Lactococcus lactis AJ110212 (FERM BP-8552). 유산균이 생산하는 박테리오신을 함유하는 합성 배지에서 생육하는 세균을 선발함을 특징으로 하는, 나이신 생산 유산균의 선발방법. A method for selecting a nisin-producing lactic acid bacterium, characterized by selecting bacteria that grow in a synthetic medium containing bacteriocin produced by the lactic acid bacterium. 제8항에 있어서, 박테리오신이 엔테로신 또는 나이신인, 나이신 생산 유산균의 선발방법. The method of selecting a nisin-producing lactic acid bacterium according to claim 8, wherein the bacteriocin is enterosine or nisin. 제8항에 있어서, 박테리오신이 배지 1mL당 11,000 내지 90,000IU 양의 나이신인, 나이신 생산 유산균의 선발방법. The method of claim 8, wherein the bacteriocin is 11,000 to 90,000 IU of nisin per mL of medium. 제8항에 있어서, 박테리오신이 배지 1mL당 20,000 내지 80,000IU 양의 나이신인, 나이신 생산 유산균의 선발방법. The method according to claim 8, wherein the bacteriocin is 20,000 to 80,000 IU of nisin per mL of medium. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따른 유산균을 배지에서 배양함으로써 수득되는 유산균을 함유하는 배양액, 당해 유산균을 함유하는 배양액의 건조물, 당해 유산균이 제거된 배양액 상등액 또는 당해 배양액 상등액의 건조물. A culture solution containing the lactic acid bacteria obtained by culturing the lactic acid bacteria according to any one of claims 1 to 7, a dried product of the culture solution containing the lactic acid bacteria, a culture solution supernatant from which the lactic acid bacteria have been removed, or a dried product of the culture solution supernatant. 제12항에 따른 유산균을 함유하는 배양액, 당해 유산균을 함유하는 배양액의 건조물, 당해 유산균이 제거된 배양액 상등액 또는 당해 배양액 상등액의 건조물을 함유하는 보존성이 향상된 음식물 또는 사료. A food or feed having improved shelf life, comprising a culture solution containing the lactic acid bacteria according to claim 12, a dried product of the culture solution containing the lactic acid bacteria, a culture supernatant from which the lactic acid bacteria have been removed, or a dried product of the culture solution supernatant.
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KR102326124B1 (en) * 2020-07-24 2021-11-12 장석재 Microbial agent of gel formulation for decomposing food waste and uses thereof

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