KR20070018501A - Silica-coated Magnetite Having Amino Substituents Capable of Seperating and Purifying DNA in a High Purity and Large Scale and a Process for Preparing the Same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고순도 및 고용량으로 DNA를 분리 정제할 수 있는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 DNA에 특이적으로 결합할 수 있도록 실리카 코팅된 자성나노입자에 모노아민기 또는 다이아민기가 치환되어 DNA를 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있는 기능성 자성나노입자에 관한 것이다.The present invention relates to a silica coated magnetic nanoparticle having an amino substituent capable of separating and purifying DNA with high purity and high capacity, and a method of preparing the same, and more particularly, to a silica coated magnetic nanoparticle so as to specifically bind to DNA. The present invention relates to a functional magnetic nanoparticle in which a monoamine group or a diamine group is substituted to separate and purify DNA with high purity and high capacity.
본 발명에 따른 아미노기가 치환된 자성나노입자는 종래의 자성입자 보다 다양한 크기로 제조될 수 있어서 크기별로는 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, PCR 등에 다양하게 적용할 수 있다. 또한, 종래의 자성입자 보다 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득율이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 많이 확보할 수 있으며, 목적 분자의 특성에 따라 자성나노입자를 가공하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 획기적으로 개선할 수 있다.Magnetic nanoparticles substituted with an amino group according to the present invention can be prepared in a variety of sizes than conventional magnetic particles can be applied to a variety of sizes, such as plasmid DNA, genomic DNA, PCR. In addition, since the binding to the target DNA and the yield of DNA is higher than the conventional magnetic particles, it is possible to secure a large amount of sample DNA required per unit time, and by processing the magnetic nanoparticles according to the characteristics of the target molecule, the DNA can be purified with high purity. Therefore, the speed of time-consuming biochemical methods such as HPLC, FPLC, electrophoresis, etc. can be dramatically improved.
자성나노입자, DNA 분리정제, 실리카 코팅 자성나노입자 Magnetic Nanoparticles, DNA Separation Purification, Silica Coated Magnetic Nanoparticles
Description
도 1은 본 발명에 따라 제조된 크기 제어형 자성나노입자(Magnetite)의 전자주사현미경(SEM) 사진이다.1 is an electron scanning microscope (SEM) photograph of a size controlled magnetic nanoparticle (Magnetite) prepared according to the present invention.
도 2는 분산제인 폴리비닐피롤리돈의 첨가에 따른 자성나노입자의 SEM 사진으로, 도 2A는 폴리비닐피롤리돈이 첨가된 경우이고 도 2B는 폴리비닐피롤리돈이 첨가되지 않은 경우이다.FIG. 2 is a SEM photograph of magnetic nanoparticles according to the addition of polyvinylpyrrolidone as a dispersant. FIG. 2A is a case where polyvinylpyrrolidone is added and FIG. 2B is a case where polyvinylpyrrolidone is not added.
도 3은 본 발명의 방법으로 제조된 자성나노입자(A)와 실리카 코팅된 자성나노입자(B)의 EDS(Energy Dispersive Spectrometry) 패턴을 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the EDS (Energy Dispersive Spectrometry) pattern of the magnetic nanoparticles (A) and silica coated magnetic nanoparticles (B) prepared by the method of the present invention.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자인 마그네타이트(A)와 실리카 코팅된 크기 제어형 자성나노입자(Magnetite)(B, C, D, E, F)의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.Figure 4 is a transmission electron microscope (TEM) of the magnetic nanoparticles prepared in accordance with the present invention magnetite (A) and silica coated size controlled magnetic nanoparticles (Magnetite) (B, C, D, E, F).
도 5는 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자인 마그네타이트의 XRD 패턴을 나타낸 그래프로, 도 5A는 이 자성나노입자의 XRD 패턴을 나타낸 그래프이고 도 5B 는 자성나노입자와 실리카 코팅한 후의 자성나노입자의 XRD 패턴을 비교한 그래프이다.Figure 5 is a graph showing the XRD pattern of the magnetic nanoparticles magnetite prepared according to the present invention, Figure 5A is a graph showing the XRD pattern of the magnetic nanoparticles and Figure 5B is a magnetic nanoparticles after the magnetic nanoparticles and silica coating This is a graph comparing the XRD pattern of.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅 전후의 자성나노입자의 기공구조에 대한 비표면적 패턴을 나타낸 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the specific surface area pattern for the pore structure of the magnetic nanoparticles before and after the silica coating prepared according to the present invention.
도 7은 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅된 자성나노입자인 마그네타이트와 코팅되지 않은 마그네타이트의 FT-IR을 비교한 그래프이다.7 is a graph comparing FT-IR of magnetite, which is silica coated magnetic nanoparticles prepared according to the present invention, with magnetite that is not coated.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 자성나노입자인 마그네타이트의 실리카 코팅 전후의 자화율 변화를 보여주는 VSM(Vibrational Sample Magnetometer) 분석을 나타낸 그래프이다.8 is a graph showing a VSM (Vibrational Sample Magnetometer) analysis showing the change in the magnetization rate before and after silica coating of magnetite, the magnetic nanoparticles prepared according to the present invention.
도 9는 E. coli 및 E. coli DNA의 전기영동사진(A)과 본 발명에 따라 제조된 실리카 코팅 전후의 자성나노입자(1, 2), 모노아민기가 치환된 자성나노입자(5), 다이아민기가 치환된 자성나노입자(6, 7, 8)와 모노아민기와 다이아민기가 동시에 치환된 자성나노입자(9, 10, 11)를 이용하여 인간 DNA 흡착 실험을 실시한 후의 전기영동사진(B)이다.9 is E. coli And electrophoresis (A) of E. coli DNA and magnetic nanoparticles (1, 2) before and after silica coating prepared according to the present invention, magnetic nanoparticles (5) substituted with a monoamine group, and magnetics substituted with a diamine group. Electrophoresis (B) after human DNA adsorption experiments were carried out using magnetic nanoparticles (9, 10, 11) in which nanoparticles (6, 7, 8) and monoamine groups and diamine groups were simultaneously substituted.
본 발명은 고순도 및 고용량으로 DNA를 분리 정제할 수 있는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자와 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하 게는 DNA에 특이적으로 결합할 수 있도록 실리카 코팅된 자성나노입자에 모노아민기 또는 다이아민기가 치환되어 DNA를 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있는 기능성 자성나노입자에 관한 것이다.The present invention relates to a silica coated magnetic nanoparticle having an amino substituent capable of separating and purifying DNA with high purity and high capacity, and a method of preparing the same, and more particularly, to a silica coated magnetic nanoparticle capable of specifically binding to DNA. The present invention relates to a functional magnetic nanoparticle in which a monoamine group or a diamine group is substituted with particles to separate and purify DNA with high purity and high capacity.
나노 구조물은 생체 분자인 단백질과 비슷한 크기로서 탄수화물, 지질, 중합체 등으로 제작될 수 있기 때문에 기능적, 물리적으로 매우 다양한 특징을 가질 수 있다. 이러한 미세 단위의 구조적 다양성으로 인하여 전통기술로 접근하기 어려웠던 초미세 세계를 열어 새로운 산업적 적용의 길이 마련되고 신기능의 인조구조물을 개발할 수 있게 되었다.Nanostructures can be made of carbohydrates, lipids, polymers, and the like, similar in size to proteins, which are biomolecules, and thus can have a wide variety of functional and physical characteristics. Due to the structural diversity of these fine units, it was possible to open an ultra-fine world that was difficult to access with traditional technology, thus paving the way for new industrial applications and developing artificial structures with new functions.
생명체의 유전정보를 담고 있는 유전물질인 DNA는 A, G, C, T의 네 가지 염기를 포함하는 뉴클레오티드로 구성된 고분자 복합체로서 음전하를 띠고 있는 생체 고분자 물질이다. 따라서 유전자의 구성, 내용, 성질 등을 분석하기 위해서는 1차적으로 고순도의 DNA가 먼저 분리되어야 한다.DNA, a genetic material that contains genetic information of living organisms, is a polymer complex composed of nucleotides containing four bases of A, G, C, and T. It is a biopolymer having a negative charge. Therefore, in order to analyze the composition, content, and properties of genes, high-purity DNA should be separated first.
금속산화물 나노입자를 이용한 새로운 DNA 정제기술은 출발물질인 세포막을 분해하는 과정부터 DNA를 분리하는 과정이 기존의 방법보다 혁신적으로 간편하게 할 수 있다는 점에서 현재 새로운 학문 영역으로 평가되고 있는 게노믹스 연구에 혁신적으로 응용 가능하다.The new DNA purification technology using metal oxide nanoparticles is innovative in the research of genomics, which is currently being evaluated as a new field of study in that the process of decomposing the cell membrane, which is the starting material, and separating the DNA can be made easier than the conventional method. Applicable as
이처럼 자성나노입자 기술은 생명과학 전반에 필수적으로 필요한 생체 내 핵산 고분자 분리를 위한 차세대 기술로 평가되고 있다. 또한 기능유전학 즉, 유전정보의 발현 단계인 단백질의 기능 규명 시 필요한 고순도 단백질 정제에도 응용 및 적용이 가능하여 향후 생체 고분자 분리를 위한 대표적 기술로서 각광을 받으며 큰 부가가치를 창출할 것으로 예상된다.As such, magnetic nanoparticle technology is being evaluated as a next-generation technology for separating nucleic acid polymers in vivo, which is essential for life science. In addition, it can be applied and applied to the purification of high purity proteins required for functional genetics, that is, the function of protein, which is the expression stage of genetic information, and is expected to create great added value as it is attracting attention as a representative technology for biopolymer separation in the future.
대한민국 특허출원 제10-2003-0010279호는 γ-Fe2O3 및 테트라에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]을 사용하여 제조되는 실리카가 코팅된 상자성 나노입자의 제조방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 단백질을 분리 정제하기 위한 것으로서 DNA를 선택적으로 분리하기 위한 것은 아니다. Korean Patent Application No. 10-2003-0010279 discloses γ-Fe 2 O 3 and tetraethoxysilane [TEOS; Disclosed is a method for preparing silica-coated paramagnetic nanoparticles prepared using Si (OC 2 H 4 ) 4 ], which is used for separating and purifying proteins and not for selectively separating DNA.
미국 특허 제5,945,525호는 초상자성 산화철 Fe2O3 또는 γ-Fe2O3와 테트라 에톡시실란[TEOS; Si(OC2H4)4]으로 제조된 실리카가 코팅된 자성입자를 사용하여 핵산을 분리하는 방법에 대하여 개시하고 있는데, 이는 핵산을 분리 정제하기 위한 것으로서 여기서 사용되는 약 0.5 내지 15 ㎛ 정도의 직경을 갖는 초상자성 산화철로는 DNA를 선택적으로 분리할 수 없는 단점이 있다. US Pat. No. 5,945,525 discloses superparamagnetic iron oxide Fe 2 O 3 or γ-Fe 2 O 3 and tetra ethoxysilane [TEOS; Disclosed is a method for separating nucleic acids using silica-coated magnetic particles made of Si (OC 2 H 4 ) 4 ], which is used to separate and purify nucleic acids. The superparamagnetic iron oxide having a diameter has a disadvantage in that the DNA cannot be selectively separated.
또한 미국 특허 제6,027,945호는 실리카 자성입자를 이용한 핵산, DNA, RNA와 같은 생물학적 목적물을 분리하기 위한 방법에 대하여 개시하고 있는데, 여기서 사용되는 실리카 자성입자의 크기는 1 내지 15 ㎛ 정도로서 나노입자를 사용하는 경우에 비하여 선택적인 분리 정제를 하는데 있어서 수율이 떨어진다.In addition, US Patent No. 6,027,945 discloses a method for separating biological objects such as nucleic acid, DNA, RNA using magnetic silica particles, wherein the size of the magnetic silica particles used is about 1 to 15 ㎛ nanoparticles Yield is poor in the selective separation and purification compared to the case.
이러한 종래 기술의 문제점으로 인하여, 핵산, DNA, RNA 등을 선택적으로 분리할 수 있고 종래기술에 비하여 고순도 정제가 가능하며 수득률을 높일 수 있는 기술이 요구되고 있다.Due to the problems of the prior art, there is a demand for a technology capable of selectively separating nucleic acids, DNA, RNA, and the like, and capable of purifying high purity and increasing yields as compared with the prior art.
본 발명에서는 상기한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 분자 단위 구조제어의 장점을 갖고 있는 금속산화물 나노입자를 합성한 후, 분자들을 분자레벨에서 자기 조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)을 형성시켜 선택적으로 DNA를 분리할 수 있는 고기능성의 자성나노입자 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.In the present invention, in order to solve the problems of the prior art as described above, after synthesizing the metal oxide nanoparticles having the advantages of molecular unit structure control, the molecules are self-assembled monolayer (SAM) at the molecular level The present invention provides a highly functional magnetic nanoparticle capable of selectively separating DNA and a method of preparing the same.
본 발명의 목적은 실리카 코팅된 자성나노입자에 아미노기가 치환된 기능성 자성나노입자 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a functional magnetic nanoparticles having an amino group substituted in the silica coated magnetic nanoparticles and a method of manufacturing the same.
또한, 본 발명의 목적은 상기한 아미노기가 치환된 기능성 자성나노입자를 이용하여 DNA를 고순도 및 고용량으로 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide a method for separating and purifying DNA with high purity and high capacity using functional magnetic nanoparticles in which the amino group is substituted.
하나의 양태로서, 본 발명은In one aspect, the present invention
분산제가 첨가된 자성나노입자 용액을 원심분리한 후 세척하는 단계;Centrifuging and washing the magnetic nanoparticle solution to which the dispersant is added;
10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트를 첨가하고, 교반 하에 염기 용액으로 pH를 12 내지 5로 유지하면서 100 내지 120 ℃에서 환류시킨 후 건조하여 실리카 코팅 자성나노입자를 제조하는 단계; Preparing silica-coated magnetic nanoparticles by adding 10-50 mM tetraethyl orthosilicate and refluxing at 100-120 ° C. while maintaining a pH of 12-5 with a base solution under stirring;
상기 실리카 코팅된 자성나노입자를 소수성 유기 용매 중에 분산시킨 후, 분산된 용액에 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 110 내지 130 ℃로 승온하고 급속 교반 하에 6 내지 8 시간 동안 환류시켜 반응시키는 단계:After dispersing the silica coated magnetic nanoparticles in a hydrophobic organic solvent, 3-aminopropyltriethoxysilane, N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine or a mixture thereof is added to the dispersed solution. Adding and heating to 110-130 ° C. and refluxing under rapid stirring for 6-8 hours to react:
생성된 반응물을 세척 건조하여 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅 자성나노입자의 제조방법을 제공한다.It provides a method for producing silica coated magnetic nanoparticles having an amino substituent, characterized in that it comprises the step of obtaining the resulting reactant by washing and drying.
본 발명에 있어서, "자성나노입자"란 입자 자체가 자기장을 가지고 있지는 않지만 자기장에 노출되었을 때는 자기쌍극자를 형성하는 물질을 의미한다. 상기에서 "자성"이란 상자성체 또는 초상자성체 물질을 의미한다.In the present invention, "magnetic nanoparticle" means a substance which does not have a magnetic field but forms a magnetic dipole when exposed to a magnetic field. As used herein, "magnetic" refers to a paramagnetic or superparamagnetic material.
바람직한 양태로서, 상기 자성나노입자는 마그네타이트(magnetite) 나노입자, 헤마타이트(hematite) 나노입자 및 마그헤마이트(maghemite) 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.In a preferred embodiment, the magnetic nanoparticles may be selected from the group consisting of magnetite nanoparticles, hematite nanoparticles, and maghemite nanoparticles.
상기 마그네타이트(Magnetite) 나노입자는 여러 가지 방법으로 합성할 수 있으며, 이들 중에서 습식법을 이용하여 합성할 수 있다: 습식법에 따르면, 먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 용해하여 수용액을 만들고 FeCl2 용액과 FeCl3 용액을 함께 혼합한다. 혼합된 용액을 교반하면서 NH4OH 용액을 한 방울씩 적가한다. 반응이 진행되면서 점점 검정색으로 변하게 되는데 수득되는 생성물을 원심분리한다. 원심분리 후 물과 에탄올로 세척하고 건조시켜 마그네타이트를 제조한다.The magnetite nanoparticles can be synthesized by various methods, among them, by the wet method: According to the wet method, FeCl 2 and FeCl 3 are first dissolved in water to form an aqueous solution, and the FeCl 2 solution and Mix FeCl 3 solution together. NH 4 OH solution is added dropwise while stirring the mixed solution. As the reaction proceeds, the color becomes black gradually. The product obtained is centrifuged. After centrifugation, the mixture was washed with water and ethanol and dried to prepare magnetite.
이외에, 헤마타이트 나노입자의 제조는 Fe(NO3)3·9H2O을 에탄올에 용해시키고, 용해된 Fe(NO3)3 용액에 아세트산 무수물을 가한다. 서서히 열을 가한 후 반응 용액을 냉각시키고, 얻어진 침전물을 여과하여 진공 건조시킨다. 건조된 생성물은 열처리를 통하여 α-Fe2O3를 제조한다.In addition, hematite nanoparticles are prepared by dissolving Fe (NO 3 ) 3 .9H 2 O in ethanol and adding acetic anhydride to the dissolved Fe (NO 3 ) 3 solution. After slowly applying heat, the reaction solution is cooled, and the obtained precipitate is filtered and dried in vacuo. The dried product produces α-Fe 2 O 3 through heat treatment.
마그헤마이트 나노입자의 제조는 옥틸에테르와 올레산을 혼합시키고, 이 혼합물에 Fe(CO)5를 넣고 환류시키면서 반응시킨다. 이 반응이 개시되는 동안 색깔은 오랜지색에서 검정색으로 변화된다. 반응 후의 용액을 실온에서 냉각시킨 다음 (CH3)3NO를 첨가한다. (CH3)3NO가 첨가된 혼합물을 아르곤 가스 분위기 하에 에이징(aging)한다. 이 때 혼합물의 색은 갈색으로 변한다. 반응 온도를 서서히 올려주면서 환류시킨다. 혼합물의 색은 다시 갈색에서 검정색으로 변하게 되며, 반응이 끝난 용액은 실온에서 냉각시킨 후 원심분리한다. 원심분리된 검은 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조하여 마그헤마이트를 제조한다. 얻어진 침전물은 헥산이나 옥탄, 그리고 톨루엔 등의 탄화수소 용매에 쉽게 분산된다.In the preparation of maghemite nanoparticles, octyl ether and oleic acid are mixed, and Fe (CO) 5 is added to the mixture and reacted under reflux. During this reaction the color changes from orange to black. The solution after the reaction is cooled at room temperature and then (CH 3 ) 3 NO is added. The mixture to which (CH 3 ) 3 NO is added is aged under argon gas atmosphere. At this time, the color of the mixture turns brown. The reaction temperature is slowly raised to reflux. The color of the mixture changes from brown to black again, and the reaction solution is cooled at room temperature and then centrifuged. The centrifuged black precipitate is washed and dried using ethanol to produce maghemite. The precipitate obtained is easily dispersed in hydrocarbon solvents such as hexane, octane and toluene.
본 발명에 따르면 자성나노입자는 다음과 같은 방법으로 실리콘 코팅 처리된다 : 상기한 방법으로 얻어진 자성나노입자를 에탄올에 초음파 분산기(ultrasonification)를 이용하여 분산시키고 폴리비닐피롤리돈을 첨가하여 실온에서 교반한다. 분산된 용액에 10 내지 50 mM의 테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS, tetraethyl orthosilicate)를 첨가하고 교반한다. 교반 상태에서 염기 용액, 예를 들면 NaOH, KOH, NH4OH 용액을 이용하여 pH를 5 내지 12, 바람직하게는 11로 유지하면서 20 내지 24시간, 바람직하게는 24시간 동안 100 내지 120 ℃에서 환류시킨다. 반응이 끝난 후, 원심분리하여 얻어진 침전물은 에탄올을 이용하여 세척 건조시켜 실리카 코팅된 자성나노입자를 제조한다.According to the present invention, the magnetic nanoparticles are silicon-coated in the following manner: The magnetic nanoparticles obtained by the above method are dispersed in ethanol using an ultrasonic disperser, and polyvinylpyrrolidone is added and stirred at room temperature. do. To the dispersed solution, 10-50 mM tetraethyl orthosilicate (TEOS) is added and stirred. Reflux at 100 to 120 ° C. for 20 to 24 hours, preferably 24 hours, while maintaining the pH at 5 to 12, preferably 11, using a base solution such as NaOH, KOH, NH 4 OH solution under stirring. Let's do it. After the reaction, the precipitate obtained by centrifugation is washed and dried using ethanol to prepare silica coated magnetic nanoparticles.
본 발명에 있어서, "실리카 코팅된 자성나노입자"란 실리카겔, 실리카옥사이 드, 고체 실리카 또는 이들의 혼합물로 코팅된 자성나노입자를 의미한다.In the present invention, "silica coated magnetic nanoparticles" means magnetic nanoparticles coated with silica gel, silica oxide, solid silica or a mixture thereof.
도 1의 전자주사현미경 이미지는 TEOS 농도에 따른 실리카 코팅된 자성나노입자의 크기를 나타낸 것으로, TEOS의 농도가 증가할수록 각각 크기가 상대적으로 커지는 것을 확인할 수 있다. TEOS의 농도가 적을수록 코팅막의 두께는 얇고 농도가 진할수록 코팅막의 두께가 증가하여 전체 입자의 크기도 증가한다.The electron scanning microscope image of FIG. 1 shows the size of the silica coated magnetic nanoparticles according to the TEOS concentration. As the concentration of the TEOS increases, the size increases relatively. As the concentration of TEOS decreases, the thickness of the coating film is thinner. As the concentration of TEOS increases, the thickness of the coating film increases, so that the size of the whole particle increases.
본 발명에서는 TEOS 코팅 전에 자성나노입자의 에탄올 분산 용액에 분산제를 첨가한다. 분산제로는 통상적으로 사용되고 있는 것이면 특별한 제한이 없으며, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴, 크산탄 검(xanthan gum) 또는 구아검(guar gum) 등을 들 수 있다. 바람직하기로는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 첨가된다. PVP의 첨가 유무에 따라 TEOS 코팅 분산 정도가 달라지는데, 하나하나씩 코팅되는 경우와 크게 덩어리져서 코팅되는 경우가 있다. 분산제는 용액 중의 입자들을 안정화하고 분산 효과를 강화하여 TEOS의 코팅이 균일하게 이루어지도록 하는 작용을 한다. 도 2는 분산제 PVP의 첨가 유무에 따른 전자주사현미경 사진이다.In the present invention, a dispersant is added to the ethanol dispersion solution of the magnetic nanoparticles before TEOS coating. The dispersant is not particularly limited as long as it is conventionally used, and polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, gelatin, xanthan gum ) Or guar gum. Preferably polyvinylpyrrolidone (PVP) is added. The degree of dispersion of TEOS coating varies depending on the presence or absence of PVP, which may be coated one by one and largely agglomerated. The dispersant acts to stabilize the particles in solution and enhance the dispersing effect so that the coating of TEOS is uniform. Figure 2 is an electron scanning microscope photograph with or without the addition of dispersant PVP.
자성나노입자의 실리카 코팅 여부를 확인하기 위하여 EDS 분석을 실시하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. EDS 분석에서는 Fe와 Si, O 등의 원소들이 검출되었는데, 실리카 코팅되지 않은 마그네타이트의 EDS 결과(도 3A)는 Fe는 82%, O는 18 %의 조성비로 Fe와 O만 검출되었으며, TEOS와의 반응 후 EDS 결과(도 3B)에서는 Si는 63 %, O는 37 %의 조성비를 나타내었다. 도 3B에서 Fe가 검출되지 않은 이유 는 실리카층이 마그네타이트 입자를 전부 감싸고 있다는 것을 입증하는 것이다.EDS analysis was performed to confirm whether the magnetic nanoparticles were coated with silica, and the results are shown in FIG. 3. In the EDS analysis, elements such as Fe, Si, and O were detected. In the EDS results of magnetite not coated with silica (FIG. 3A), only Fe and O were detected at a composition ratio of 82% Fe and 18% O, and reaction with TEOS. Post EDS results (FIG. 3B) showed a composition ratio of 63% for Si and 37% for O. The reason why Fe was not detected in FIG. 3B is to prove that the silica layer completely covered the magnetite particles.
도 4는 본 발명의 방법에 따른 실리카 코팅층 형성을 확인하고 실리카층에 의한 자성나노입자 두께의 변화를 나타낸 투과전자현미경 사진들로, 왼쪽 사진은 20만 배율, 오른쪽 사진은 50만 배율의 사진이다. 이 사진들의 분석 결과에 따르면, 자성나노입자와 실리카 코팅된 자성나노입자의 크기는 TEOS 10 mM 당 약 2 nm씩 두께가 증가되었음을 확인하였다.4 is a transmission electron micrograph showing the formation of the silica coating layer according to the method of the present invention and showing the change in the thickness of the magnetic nanoparticles by the silica layer, the left picture is 200,000 magnification, the right picture is a picture of 500,000 magnification. . According to the analysis results of the photos, it was confirmed that the magnetic nanoparticles and silica coated magnetic nanoparticles were increased in thickness by about 2 nm per 10 mM of TEOS.
따라서 본 발명의 방법에 따르면 실리카 코팅 자성나노입자의 크기를 제어할 수 있다.Therefore, according to the method of the present invention, it is possible to control the size of the silica coated magnetic nanoparticles.
자성나노입자의 실리카 코팅에서 중요한 점은 코팅에 의한 자성나노입자의 구조적 변화이다. 즉, 자성나노입자의 고유한 XRD 패턴의 변화는 자성나노입자가 가진 고유의 결정상의 변화를 의미하며 이는 자성의 세기에도 영향을 미치게 되어 DNA, RNA, 단백질 등의 분리 정제시 흡ㆍ탈착 효과에 매우 큰 영향을 미치게 된다. 도 5에서 보이는 바와 같이 본 발명에 따른 실리카 코팅 자성나노입자의 XRD 패턴은 코팅 전 자성나노입자 고유의 XRD 패턴을 그대로 유지하고 있어 구조적 변화가 없음을 나타낸다.An important point in silica coating of magnetic nanoparticles is the structural change of magnetic nanoparticles by coating. In other words, the change in the XRD pattern of the magnetic nanoparticles means the change of the intrinsic crystal phase of the magnetic nanoparticles, which also affects the strength of the magnetic nanoparticles and thus affects the adsorption / desorption effect of the separation and purification of DNA, RNA, and protein. It will have a very big impact. As shown in FIG. 5, the XRD pattern of the silica coated magnetic nanoparticles according to the present invention maintains the XRD pattern unique to the magnetic nanoparticles before coating, indicating no structural change.
본 발명에 있어서, 실리카 코팅된 자성나노입자는 도 6의 BET (Bruner-Emmet-Teller)의 비표면적[m2/g]에 의해서도 코팅층의 형성을 확인할 수 있다. 실리카 코팅 자성나노입자는 실리카 공급원에 의해 자성나노입자 표면의 -OH기가 결합되면서 실리카 코팅층을 형성하고, 이로 인하여 자성나노입자 자체의 -OH기보다 코팅층을 형성한 입자의 -OH기가 감소하게 된다. 그 결과, 자성나노입자의 비표면적이 65 m2/g인데 비하여 실리카로 코팅된 후에는 55 내지 20 m2/g의 비표면적으로 감소한다. 이러한 비표면적의 감소는 실리카 코팅층 형성에 대한 직접적 증거로서 반응을 통한 1차적 코팅효과를 나타낸다 In the present invention, the silica-coated magnetic nanoparticles can also confirm the formation of the coating layer by the specific surface area [m 2 / g] of the BET (Bruner-Emmet-Teller) of FIG. 6. Silica-coated magnetic nanoparticles are bonded to -OH groups on the surface of magnetic nanoparticles by a silica source to form a silica coating layer, thereby reducing -OH groups of particles forming a coating layer rather than -OH groups of magnetic nanoparticles themselves. As a result, the specific surface area of the magnetic nanoparticles is 65 m 2 / g, whereas after coating with silica decreases the specific surface area of 55 to 20 m 2 / g. This reduction in specific surface area represents the primary coating effect through the reaction as direct evidence of the silica coating layer formation.
FT-IR 분석은 실리카 코팅을 확인하는 또다른 방법으로, 실리카 코팅된 마그네타이트와 코팅되지 않은 마그네타이트의 FT-IR을 나타낸 도 7에서 1050 cm-1 근처에서 실리카 고유의 피크를 확인할 수 있다.FT-IR analysis is another way to identify silica coatings, which can identify the inherent peaks of silica near 1050 cm −1 in FIG. 7 showing the FT-IR of silica coated magnetite and uncoated magnetite.
도 8은 실리카 코팅되지 않은 마그네타이트와 실리카 코팅된 자성 나노입자의 VSM(Vibrational Sample Magnetometer) 분석을 나타낸 것이다. 초상자성인 마그네타이트는 외부 자성의 힘에 의해 반응을 하는 입자로써 이는 자화율을 통해 알 수 있으며 자화율은 VSM을 이용하여 측정된다.FIG. 8 shows VSM (Vibrational Sample Magnetometer) analysis of uncoated magnetite and silica coated magnetic nanoparticles. The superparamagnetic magnetite is a particle that is reacted by an external magnetic force, which can be known from the susceptibility, and the susceptibility is measured using VSM.
도 8에서 ⓐ는 자성나노입자의 자화율 및 자화곡선을 보여주며, ⓑ, ⓒ, ⓓ, ⓔ, ⓕ는 실리카가 코팅된 자성나노입자의 자화곡선을 나타내고 있다. 또한 실리카 코팅 전후의 자화율 변화를 살펴보면, Ms(magnetic moment)의 값이 63.73 > 61.42 > 52.83 > 45.48 ＞ 37.91 > 33.87 emu/g 의 크기를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 코팅되지 않은 자성나노입자의 고유 자화율이 실리카 코팅층이 형성되면서 감소하는 것으로 해석되며, 전체적으로 값이 작은 이유는 크기가 나노화되면서 갖는 현상이다.In Figure 8, ⓐ shows the magnetization rate and magnetization curve of the magnetic nanoparticles, ⓑ, ⓒ, ⓓ, ⓔ, ⓕ shows the magnetization curve of the magnetic nanoparticles coated with silica. In addition, the magnetic susceptibility changes before and after the silica coating showed that the Ms (magnetic moment) value was 63.73>61.42>52.83>45.48>37.91> 33.87 emu / g . This result is interpreted that the intrinsic susceptibility of the uncoated magnetic nanoparticles decreases as the silica coating layer is formed.
본 발명에 따르면, 상기한 방법으로 실리카 코팅된 자성나노입자에 기능성을 제공하기 위해 아미노 작용기가 치환된다. 아미노 작용기를 치환하기 위하여 실리카 코팅 자성나노입자를 에탄올, 메탄올, 이소프로판올, 자일렌, 테트라히드로퓨란, 톨루엔 등의 소수성 유기 용매, 바람직하게는 톨루엔에 분산시킨 후, 분산된 용액에 3-아미노프로필트라이에톡시 실란(3-Aminopropyltriethoxy silane), N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 (N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylene diamine) 또는 이들의 혼합물을 첨가하여 온도를 110 내지 130 ℃, 바람직하게는 130 ℃로 승온한다. 급속 교반 하에 혼합물을 6 내지 8 시간 동안, 바람직하게는 7 시간 동안 환류시킨다. 반응이 끝나면 원심분리하고 물과 에탄올을 이용하여 3 내지 4번 세척한 후, 얻어진 분말은 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켜서 아미노기가 치환된 실리카 코팅 자성나노입자를 제조한다.According to the present invention, amino functional groups are substituted to provide functionality to the silica coated magnetic nanoparticles by the above-described method. Silica-coated magnetic nanoparticles are dispersed in a hydrophobic organic solvent such as ethanol, methanol, isopropanol, xylene, tetrahydrofuran and toluene, preferably toluene, in order to substitute amino functional groups, and then 3 -aminopropyltri in the dispersed solution. to silane (3-Aminopropyltriethoxy silane), N- [3 - ( trimethoxy silyl) propyl] ethylene diamine (N- [3- (trimethoxysilyl) propyl ] ethylene diamine) , or temperature by the addition of a mixture thereof 110 To 130 ° C, preferably 130 ° C. The mixture is refluxed for 6-8 hours, preferably 7 hours under rapid stirring. After the reaction was centrifuged and washed 3 to 4 times with water and ethanol, the powder obtained was dried in a vacuum oven for 24 hours to prepare silica-coated magnetic nanoparticles substituted with amino groups.
본 발명에서 사용되는 아미노 기능성 실란(amino functional silane)은 결합제(coupling agent)로서 활성화 물질의 고정에 사용된다. 실리카 표면에 형성된 수산기는 Si-O-Si와 같은 공유결합 형식에 의해 적당히 여러 실란 기들 중 하나와 결합한다. 실란화(silanization) 반응은 두가지 단계로 나타난다. 첫째로, 실란 결합제(silane coupling agent)는 실란 고분자로 응축된다. 둘째, 이러한 고분자들은 실리카 코팅 자성 나노입자의 표면의 Si-OH와 연결되는데, 탈수반응을 통해서 표면의 OH기와 공유결합을 형성한다. 실란 고분자들은 실리카로 코팅된 마그네타이트에 흡착 또는 공유결합할 수 있고, 또한 탈수화 반응에 의해 공유결합을 형성할 수도 있다.The amino functional silane used in the present invention is used for fixing the activating material as a coupling agent. The hydroxyl groups formed on the silica surface are suitably bonded with one of several silane groups by a covalent bond type such as Si-O-Si. The silanization reaction occurs in two stages. First, a silane coupling agent is condensed into the silane polymer. Second, these polymers are connected to Si-OH on the surface of the silica-coated magnetic nanoparticles, and form a covalent bond with the OH groups on the surface through dehydration. Silane polymers may adsorb or covalently bond to silicate coated magnetites, and may also form covalent bonds by dehydration reactions.
본 발명에 따른 실리카 코팅된 자성나노입자와 3-아미노프로필트라이에톡시실란과 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민과의 치환반응을 하기 반응식 1과 2에 나타내었다 : Substitution reactions of the silica coated magnetic nanoparticles according to the present invention with 3-aminopropyltriethoxysilane and N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine are shown in
바람직한 양태에서, 본 발명은In a preferred embodiment, the present invention
DNA를 함유하는 용액과 본 발명에 따라 제조된 아미노기가 치환된 실리카 코 팅 자성나노입자의 용액을 반응시키고, 자성 분리기를 이용하여 반응 용액으로부터 DNA와 자성나노입자를 분리하는 것을 특징으로 하는 DNA의 분리정제방법을 제공한다.Reacting the solution containing the DNA and the solution of the silica-coated magnetic nanoparticles substituted with the amino group prepared according to the present invention, and separating the DNA and the magnetic nanoparticles from the reaction solution using a magnetic separator Provide a separate purification method.
본 발명에 따라 제조된 상기한 바와 같이 아미노 치환기를 가지는 실리카 코팅된 자성나노입자는 A, G, C, T의 네 가지 염기를 포함하며 음전하를 띠고 있는 DNA와 선택적으로 결합할 수 있다.As described above, the silica coated magnetic nanoparticles having amino substituents may be selectively bound to negatively charged DNA containing four bases of A, G, C, and T.
세포 또는 균주를 통상적인 방법에 의해 분쇄하여 용액으로 제조한 후 원심분리하여 얻어진 상층액에 본 발명에 따른 자성나노입자를 첨가한다. 이렇게 얻어진 DNA와 결합된 형태의 자성나노입자를 선별하고 자성분리기 등에 의해 자성나노입자만을 분리하므로써 고순도의 DNA를 대량으로 정제할 수 있다.The magnetic nanoparticles according to the present invention are added to the supernatant obtained by pulverizing the cells or strains by a conventional method to prepare a solution and then centrifuging. The high purity DNA can be purified in large quantities by selecting the magnetic nanoparticles bound to the DNA thus obtained and separating only the magnetic nanoparticles by a magnetic separator.
도 9에서 (A)는 E.coli와 E.coli로부터 추출한 DNA를 전기영동한 사진이다. 추출된 DNA는 분광광도계(GeneQuant pro)를 이용하여 농도와 순도를 측정하였다. A260/A280 비율은 1.8 내지 1.9 사이였으며 DNA 농도는 242 ng/uL 임을 확인하였다.In Figure 9 (A) is a photoelectrophoresis of the DNA extracted from E. coli and E. coli . The extracted DNA was measured for concentration and purity using a spectrophotometer (GeneQuant pro). The A 260 / A 280 ratio was between 1.8 and 1.9 and the DNA concentration was found to be 242 ng / uL.
도 9의 전기영동사진 상에 나타나는 밴드로부터 각각의 자성나노입자와 추출된 DNA 간의 결합력을 비교할 수 있다. 도 9의 (B)에서 보이는 바와 같이 실리카 코팅 전후의 자성나노입자를 사용한 레인에서는 대조군과 비교하여 밴드가 크게 소실되지 않았으나 모노아민, 다이아민 및 모노아민과 다이아민의 혼합물의 경우에는 특히 농도가 진할수록 DNA 밴드가 거의 확인되지 않았다. 따라서 모노아민과 다이아민의 농도가 진할수록 DNA가 더욱 흡착이 잘되는 것을 알 수 있다.The binding force between the respective magnetic nanoparticles and the extracted DNA from the bands shown on the electrophoresis image of FIG. 9 can be compared. As shown in (B) of FIG. 9, in the lane using the magnetic nanoparticles before and after the silica coating, the band did not disappear significantly compared to the control, but in the case of the monoamine, the diamine, and the mixture of the monoamine and the diamine, the higher the concentration, Almost no DNA bands were identified. Therefore, the higher the concentration of monoamine and diamine, the better the DNA is adsorbed.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely to aid the understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
실시예Example 1 One 자성나노입자의 합성Synthesis of Magnetic Nanoparticles
먼저 FeCl2와 FeCl3를 물에 녹여 2M과 1M의 수용액을 제조하였다. 2M의 FeCl2 용액 60 ml와 1M의 FeCl3 용액 320 ml를 함께 혼합하였다. 혼합된 용액에 준비된 0.7 M의 NH4OH 용액 400 ml를 교반하면서 한 방울씩 적가하였다. 이 때 반응이 일어나면서 색깔은 서서히 갈색에서 검정색으로 변하였고, NH4OH를 완전히 적가한 다음 5 분 정도 반응 후에 생긴 생성물을 원심분리하였다. 원심분리한 후 2 내지 3회 물로 세척하고 마지막으로 에탄올을 이용하여 2 내지 3회 세척하고 진공오븐에서 24시간 동안 건조시켜 자성나노입자를 제조하였다.First, FeCl 2 and FeCl 3 was dissolved in water to prepare an aqueous solution of 2M and 1M. 60 ml of 2M FeCl 2 solution and 320 ml of 1M FeCl 3 solution were mixed together. 400 ml of 0.7 M NH 4 OH solution prepared to the mixed solution was added dropwise while stirring. At this time, as the reaction occurred, the color gradually changed from brown to black, NH 4 OH was completely added dropwise, and then the product generated after the reaction was centrifuged for about 5 minutes. After centrifugation, washing with water two to three times, and finally washing with ethanol two to three times, and dried in a vacuum oven for 24 hours to prepare magnetic nanoparticles.
실시예 2Example 2 자성나노입자의 실리카 코팅Silica Coating of Magnetic Nanoparticles
실시예 1에서 제조된 3 g의 마그네타이트를 초음파 분산기를 이용하여 분산(3 g/150 ml 수용액)시킨 후, 폴리비닐피롤리돈(Mw 55,000, 25.6 g/L 수용액) 6 ml를 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 다음으로, 아세톤 수용액(H20/아 세톤=1/10, v/v)을 첨가하여 원심분리하여 상층액은 버리고 에탄올로 2 내지 3회 세척하였다. 다시 에탄올 300 ml에 분산시킨 다음, 분산된 용액에 10 내지 50 mM의 TEOS(tetraethyl orthosilicate)를 첨가하여 교반하였다. 교반 상태에서 0.7 M NH4OH 용액을 이용하여 pH를 11로 유지하면서 24시간 동안 100 ℃에서 환류시켰다. 반응이 끝난 후, 에탄올로 2 내지 3회 세척하고 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켜 실리카가 코팅된 자성나노입자를 제조하였다.3 g of the magnetite prepared in Example 1 was dispersed using an ultrasonic disperser (3 g / 150 ml aqueous solution), and then 6 ml of polyvinylpyrrolidone (Mw 55,000, 25.6 g / L aqueous solution) was added thereto at room temperature. Stir for 24 hours. Next, an aqueous acetone solution (H 2 O / acetone = 1/10, v / v) was added and centrifuged to discard the supernatant and washed with ethanol two to three times. Again dispersed in 300 ml of ethanol, 10-50 mM of tetraethyl orthosilicate (TEOS) was added to the dispersed solution and stirred. The mixture was refluxed at 100 ° C. for 24 hours while maintaining the pH at 11 using 0.7 M NH 4 OH solution under stirring. After the reaction was completed, washed 2 to 3 times with ethanol and dried for 24 hours in a vacuum oven to prepare a magnetic nano-coated silica.
상기에서 얻어진 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 및 50 mM의 TEOS를 사용한 각각의 자성나노입자의 전자주사현미경(SEM) 이미지를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 보이는 바와 같이 SEM 이미지는 TEOS 농도에 따라 입자의 크기가 상대적으로 커지는 것을 알 수 있다. TEOS의 농도가 적을 수록 코팅막의 두께가 작아졌으며, 농도가 클수록 코팅막의 두께가 증가하여 전체 입자의 크기가 증가하였다.Electron scanning microscope (SEM) images of the respective magnetic nanoparticles using the 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM and 50 mM TEOS obtained above are shown in FIG. 1. As shown in FIG. 1, it can be seen that the SEM image has a relatively large particle size according to the TEOS concentration. The smaller the concentration of TEOS, the smaller the thickness of the coating layer. The higher the concentration, the larger the thickness of the coating layer, and the total particle size.
실시예 3 기능성 자성나노입자의 제조Example 3 Preparation of Functional Magnetic Nanoparticles
실시예 2에서 제조된 실리카로 코팅된 자성나노입자를 0.3 g씩 9개를 취하고 톨루엔에 분산된 상태에서 0.03 g, 0.06 g, 0.09 g의 3-아미노프로필트라이에톡시실란과 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 각각을 첨가하였다. 나머지 3개에는 0.015g + 0.015g, 0.03g + 0.03g, 및 0.045g + 0.045g의 3-아미노프로필트라이에톡시실란 + N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민을 함께 첨가하여 전체 샘플의 온도를 130 ℃로 승온하였다. 이 때 빠른 교반과 함께 혼합물 을 7 시간 동안 환류시켰다. 반응이 끝나면 원심분리한 후, 톨루엔을 이용하여 3 내지 4회 세척한 후, 원심분리하여 얻어진 분말을 진공오븐에서 24 시간 동안 건조시켰다.Nine [3] silica nanoparticles coated with silica prepared in Example 2, each of 0.3 g each, were 0.03 g, 0.06 g, and 0.09 g of 3-aminopropyltriethoxysilane and N- [3- as dispersed in toluene. Each of (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine was added. The remaining three together contain 0.015g + 0.015g, 0.03g + 0.03g, and 0.045g + 0.045g of 3-aminopropyltriethoxysilane + N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine It added and heated the temperature of the whole sample to 130 degreeC. At this time, the mixture was refluxed for 7 hours with rapid stirring. After the reaction was centrifuged, washed three to four times with toluene, and then the powder obtained by centrifugation was dried in a vacuum oven for 24 hours.
실시예 4 입자 크기별 나노입자 제조Example 4 Preparation of Nanoparticles by Particle Size
다양한 크기를 가지는 나노입자를 제조하기 위해 마그네타이트를 크기별로 제조하였다. 마그네타이트 나노입자는 습식법에 의해 제 1철(ferrous)과 제 2철(ferric) 이온 용액으로부터 2 : 1의 몰비율에 의해 제조되었다. 마그네타이트 나노입자는 습식법으로 제조했을때 수용상에서 침전시키며, 침전물의 표면에 많은 수산기가 존재한다.Magnetites were prepared by size to prepare nanoparticles having various sizes. Magnetite nanoparticles were prepared by a wet method at a molar ratio of 2: 1 from ferrous and ferric ion solutions. The magnetite nanoparticles are precipitated in the aqueous phase when prepared by the wet method, and there are many hydroxyl groups on the surface of the precipitate.
자성나노입자의 제조에 있어서 Fe3O4의 스피넬(spinel) 구조를 가지고 있는지를 확인하기 위해 XRD 패턴을 분석하였다. 도 4에 보이는 바와 같이 (210), (311), (400), (422), (511), (440)의 총 6개의 회절 피크를 가지고 있었다.XRD patterns were analyzed to determine whether they have a spinel structure of Fe 3 O 4 in the preparation of magnetic nanoparticles. As shown in FIG. 4, there were six diffraction peaks of (210), (311), (400), (422), (511) and (440).
실시예 5 자성나노입자의 제타 포텐셜(Zeta Potential) 측정Example 5 Zeta Potential Measurement of Magnetic Nanoparticles
제타 포텐셜 분석기(Zeta potential analyzer)에 의한 분석시 알 수 있는 결과는 표면의 변형을 통한 치환기 중 -NH2기, -(NH2)2 가 존재하는 전자쌍에 의해 전하의 크기가 커지거나 작아짐을 알 수 있다.The result of analysis by Zeta potential analyzer shows that the charge increases or decreases due to the pair of electrons in which -NH 2 and-(NH 2 ) 2 are present in the substituents through surface modification. Can be.
표 1은 제타 포텐셜에 의한 전하의 변화를 나타낸 것이다: (a) 자성나노입자 (17.92 mV), (b) 실리카 코팅된 마그네타이트(-42.82 mV), (c), (d), (e)는 3-아미노프로필트라이에톡시실란의 일정량을 각각에 첨가하였고 (f), (g), (h)는 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 일정량을 각각에 첨가하였으며 (i), (j), (k)는 3-아미노프로필트라이에톡시실란과 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 일정량을 혼합하여 반응시켰다. 위의 결과를 보면 Si의 경우는 비공유 전자쌍에 의해 음의 값을 띄어 -42.82 mV의 수치를 갖게 되는 반면, -NH2는 질소원자가 가진 비공유 전자쌍보다 수소원자가 많으므로 양의 값을 띄게 되어 약 +40 mV의 수치를 갖게 된다. 용매로는 에탄올이 사용되었다.Table 1 shows the change in charge due to the zeta potential: (a) magnetic nanoparticles (17.92 mV), (b) silica coated magnetite (-42.82 mV), (c), (d), (e) An amount of 3-aminopropyltriethoxysilane was added to each and (f), (g) and (h) were added to each of an amount of N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine ( i), (j) and (k) reacted by mixing a certain amount of 3-aminopropyltriethoxysilane and N- [3- (trimethoxysilyl) propyl] ethylene diamine. According to the above results, Si has a negative value due to the unshared electron pair and has a value of -42.82 mV, whereas -NH 2 has a positive value because there are more hydrogen atoms than the unshared electron pair having a nitrogen atom, and thus the + It will have a value of 40 mV. Ethanol was used as the solvent.
실시예 6 사람 DNA에 대한 흡착 정량적 평가Example 6 Quantitative Adsorption of Human DNA
1) DNA 추출1) DNA extraction
DNA와 자성나노입자의 결합력을 비교하기 위하여 먼저 박테리아(E.coli)로부터 하기한 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다 : 먼저 멸균한 LB 배지에 균주를 접종한 후 37 ℃, 200 rpm에서 하루 동안 배양하고, 충분히 배양된 균주 1 ml를 취하여 1.5 ml 마이크로 튜브로 옮긴 후 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 상등액을 버린 다음, 여기에 세포 용해 완충액 300 ㎕를 첨가하고 피펫으로 침전된 펠릿을 고르게 현탁하였다. 또한 세포를 완전히 분해하기 위하여 80 ℃에서 5분 동안 반응시켰다.In order to compare the binding force between the DNA and the magnetic nanoparticles, genomic DNA was first extracted from the bacteria ( E. coli ) by the following method: First, the strain was inoculated into sterile LB medium, and then cultured at 37 ° C. and 200 rpm for one day. Take 1 ml of the well cultured strain, transfer it to 1.5 ml microtube, and centrifuge for 1 minute at 12,000 rpm. After the supernatant was discarded, 300 µl of cell lysis buffer was added thereto, and the pellet pellet precipitated was evenly suspended. In addition, the cells were reacted at 80 ° C. for 5 minutes to completely degrade the cells.
5분 후 용액을 실온에서 냉각하고 용액 속의 RNA를 제거하기 위하여 3 ㎕의 RNase A (5 mg/mL)를 첨가하여 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 100 ㎕의 PPT 용액을 첨가하고 20초 동안 고르게 섞이도록 교반하였으며 교반 후 빙냉 하에 5분 동안 정치하였다. 반응이 끝난 튜브를 다시 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.After 5 minutes, the solution was cooled to room temperature, and 3 μl of RNase A (5 mg / mL) was added to react the RNA in the solution and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. After completion of the reaction, 100 μl of PPT solution was added and stirred to mix evenly for 20 seconds, and left to stand for 5 minutes under ice cooling after stirring. The reaction tube was again centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes.
원심분리 후 펠릿을 제외한 상층액을 조심스럽게 취하여 새로운 1.5 ml 마이크로 튜브에 옮기고 600 ㎕의 DNA 결합용 완충액을 첨가하여 고르게 교반하였다. 미리 준비된 스핀 컬럼을 수집 용기에 넣고 DNA 결합 완충액이 혼합된 샘플 650 ㎕를 취하여 스핀 컬럼의 중앙부에 조심스럽게 첨가한 후 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. 이때 용액은 스핀 컬럼의 멤브레인을 통과하게 되고 용액 속의 DNA는 필터 멤브레인에 결합하게 된다.After centrifugation, the supernatant except the pellets was carefully taken up and transferred to a new 1.5 ml microtube, and 600 μl of DNA binding buffer was added and stirred evenly. The prepared spin column was placed in a collection vessel, 650 μl of the sample mixed with the DNA binding buffer was carefully added to the center of the spin column, and centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes. The solution then passes through the membrane of the spin column and the DNA in the solution binds to the filter membrane.
원심분리가 끝난 후 수집 용기에 담긴 용액을 제거하고 스핀 컬럼을 다시 장착한 다음 준비된 세척용액 600 ㎕를 넣은 후 동일하게 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 멤브레인에 존재하는 염을 제거하였으며 이를 2회 반복하였다.After the centrifugation was completed, the solution contained in the collection vessel was removed, the spin column was remounted, and 600 μl of the prepared washing solution was added thereto. Repeated.
세척이 끝난 스핀 컬럼을 새로운 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣은 후 100 ㎕의 멸균 증류수 또는 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 멤브레인의 중앙에 조심스럽게 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 멤브레인에 결합된 DNA를 용출하였다. 얻어진 DNA는 다음 실험까지 4 ℃에 보관하였다.The washed spin column is placed in a new 1.5 ml microtube, then 100 μl of sterile distilled water or TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) is carefully placed in the center of the membrane and centrifuged for 1 minute at 12,000 rpm. The DNA bound to the membrane was eluted. The obtained DNA was stored at 4 ° C. until the next experiment.
2) 자성나노입자와 DNA의 결합2) binding of magnetic nanoparticles to DNA
하기 표 2에 기재된 조성의 자성나노입자 50 mg을 정확하게 취하여 각각 1.5 ml 마이크로 튜브에 투여하고 멸균 증류수 500 ㎕를 첨가하여 자성나노입자 용액을 준비하였다.50 mg of magnetic nanoparticles having the composition shown in Table 2 were accurately taken, respectively, administered to 1.5 ml microtubes, and 500 µl of sterile distilled water was added to prepare a magnetic nanoparticle solution.
상기한 1)의 방법으로 미리 준비된 DNA 용액을 96 웰 플레이트에 일정량을 각각 첨가하고 피펫으로 자성나노입자 용액을 위하여 각 웰에 접종하였다. 자성나노입자와 DNA와의 접촉성을 높이기 위하여 1분간 고르게 교반하였으며 충분한 반응을 위하여 교반 후 5분간 정치하였다. 이때 DNA 및 자성나노입자의 농도에 따른 결합력을 비교하기 위하여 DNA 농도는 100 ng/㎕가 되게 하였으며 자성나노입자의 농도는 5 ㎕를 첨가하였다.A predetermined amount of the DNA solution prepared in advance by the method of 1) was added to each 96 well plate and pipette was inoculated into each well for the magnetic nanoparticle solution. In order to increase the contact between the magnetic nanoparticles and the DNA was stirred evenly for 1 minute and allowed to stand for 5 minutes after stirring for sufficient reaction. At this time, in order to compare the binding force according to the concentration of DNA and magnetic nanoparticles, the DNA concentration was 100 ng / μl and the concentration of the magnetic nanoparticles was 5 μl.
자성나노입자를 용액으로부터 분리하기 위하여 자성 분리기에 96 웰 플레이트를 올려 놓은 후 자성나노입자가 완전히 자석에 고정될 수 있도록 약 5분 동안 정치하였다. 자성나노입자가 완전히 분리된 후 피펫으로 96 웰 플레이트로부터 용액만 조심스럽게 취하여 새로운 마이크로 튜브에 분주하였다.In order to separate the magnetic nanoparticles from the solution, a 96-well plate was placed on the magnetic separator and allowed to stand for about 5 minutes so that the magnetic nanoparticles could be completely fixed to the magnet. After the magnetic nanoparticles were completely separated, only the solution was carefully taken from the 96 well plate with a pipette and dispensed into a new microtube.
모아진 용액은 자성나노입자와 DNA와의 결합력을 확인하기 위하여 1 % 아가로스 겔에서 전기영동하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.The collected solution was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm the binding force between the magnetic nanoparticles and the DNA, and the results are shown in FIG. 9.
도 9A는 E. coli와 E. coli DNA의 전기영동사진이고, 도 9B는 상기 표 2의 자성나노입자와 DNA를 반응시킨 후의 전기영동사진이다. 도 9B에서 C는 DNA 대조군이며 밴드가 진할 수록 DNA와의 결합력이 약한 것을 나타낸다.Figure 9A is an electrophoresis picture of E. coli and E. coli DNA, Figure 9B is an electrophoresis picture after the reaction of the DNA with the magnetic nanoparticles of Table 2. In FIG. 9B, C is a DNA control group, and the darker the band, the weaker the binding force to the DNA.
도 9B에서 보이는 바와 같이, 모노아민 또는 다이아민 치환된 본 발명에 따른 자성나노입자는 DNA와 흡착하여 밴드가 거의 나타나지 않았다.As shown in FIG. 9B, the magnetic nanoparticles according to the present invention, which were substituted with monoamines or diamines, showed little bands due to adsorption with DNA.
본 발명에 따른 아미노기가 치환된 자성나노입자는 종래의 자성입자 보다 다양한 크기로 제조될 수 있어서 크기별로는 플라스미드 DNA, 게놈 DNA, PCR 등에 다양하게 적용할 수 있다. 또한, 종래의 자성입자 보다 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA의 수득률이 높아 단위 시간당 필요한 시료 DNA를 많이 확보할 수 있으며, 목적 분자의 특성에 따라 자성나노입자를 가공하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 획기적으로 개선할 수 있다.Magnetic nanoparticles substituted with an amino group according to the present invention can be prepared in a variety of sizes than conventional magnetic particles can be applied to a variety of sizes, such as plasmid DNA, genomic DNA, PCR. In addition, since the binding to the target DNA and the yield of DNA is higher than the conventional magnetic particles, it is possible to secure a large amount of sample DNA required per unit time, and by processing the magnetic nanoparticles according to the characteristics of the target molecule, the DNA can be purified with high purity. Therefore, the speed of time-consuming biochemical methods such as HPLC, FPLC, electrophoresis, etc. can be dramatically improved.
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