KR20070016149A

KR20070016149A - Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method

Info

Publication number: KR20070016149A
Application number: KR1020067024463A
Authority: KR
Inventors: 패트릭 엘. 이버센; 드와이트 디. 웰러; 제드 엔. 핫싱어
Original assignee: 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드
Priority date: 2004-05-24
Filing date: 2005-05-24
Publication date: 2007-02-07

Abstract

치료적 올리고-펩티드 콘쥬게이트, 및 콘쥬게이트의 사용 방법이 개시된다. 콘쥬게이트는 (a) 화합물이 결합하고자 하는 표적 핵산 부위에 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 함유하는 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물 (b) 화합물에 결합된, 표적 세포로 화합물의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드를 포함한다. 화합물 내 염기의 스트링은 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하로 제한하기 위해 스트링 내 배치된 적어도 하나의 이노신 염기를 포함한다. 콘쥬게이트는 아르기닌-풍부 펩티드에 의해, 화합물 단독 보다 더 큰 세포 흡수를 가지며, 실질적으로 구아닌 치환을 위한 이노신이 부재하는 콘쥬게이트 보다 실질적으로 더 큰 안티센스 활성을 갖는다. Therapeutic oligo-peptide conjugates and methods of using the conjugates are disclosed. The conjugate is a target cell bound to (a) a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound (b) compound containing a string of bases complementary to at least four adjacent cytosine bases at the target nucleic acid site to which the compound is bound Arginine-rich peptides effective to enhance absorption of the compounds. The string of bases in the compound includes at least one inosine base disposed in the string to limit the number of adjacent guanine bases in the string to no more than three. The conjugate has, by arginine-rich peptides, greater cellular uptake than the compound alone and substantially greater antisense activity than conjugates lacking inosine for guanine substitution.

올리고뉴클레오티드, 아르기닌-풍부 펩티드, 콘쥬게이트. Oligonucleotides, arginine-rich peptides, conjugates.

Description

펩티드 결합된, 이노신-치환 안티센스 올리고머 화합물 및 방법{PEPTIDE CONJUGATED, INOSINE-SUBSTITUTED ANTISENSE OLIGOMER COMPOUND AND METHOD}Peptide bound, inosine-substituted antisense oligomeric compounds and methods {PEPTIDE CONJUGATED, INOSINE-SUBSTITUTED ANTISENSE OLIGOMER COMPOUND AND METHOD}

본 발명은 (i) 세포로 올리고머의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌 풍부-펩티드에 결합되고, (ii) G 염기의 스트링이 하나 이상의 이노신 염기에 의해 파괴된 안티센스 올리고머 화합물, 및 이러한 화합물을 사용하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides an antisense oligomeric compound that (i) binds to an arginine rich-peptide that is effective for enhancing the uptake of oligomers into cells, and (ii) a string of G bases is destroyed by one or more inosine bases, and using such compounds It is about a method.

참고 문헌references

Devi, G. R. (2002). "Prostate cancer: status of current treatments and emerging antisense-based therapies. " Curr Opin Mol Ther 4 (2): 138-48.Devi, GR (2002). "Prostate cancer: status of current treatments and emerging antisense-based therapies." Curr Opin Mol Ther 4 (2): 138-48.

Hudziak, R. M., E. Barofsky, et al. (1996). "Resistance of morpholino phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 (4): 267-72.Hudziak, RM, E. Barofsky, et al. (1996). "Resistance of morpholino phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6 (4): 267-72.

Iversen, P. L. (2001). Phosphoramidite Morpholino Oligomers. Antisense Drug Technology. S. T. Crooke. New York, Marcel Dekker, Inc. Iversen, PL (2001). Phosphoramidite Morpholino Oligomers. Antisense Drug Technology . ST Crooke. New York, Marcel Dekker, Inc.

Shafer, R. H. and I. Smirnov (2000). "Biological aspects of DNA/RNA quadruplexes. "Biopolymers 56 (3): 209-27. Shafer, RH and I. Smirnov (2000). "Biological aspects of DNA / RNA quadruplexes." Biopolymers 56 (3): 209-27.

Stein, D. A., D. E. Skilling, et al.(2001). "Inhibition of Vesivirus infections in mammalian tissue culture with antisense morpholino oligomers." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11(5): 317-25. Stein, DA, DE Skilling, et al. (2001). "Inhibition of Vesivirus infections in mammalian tissue culture with antisense morpholino oligomers." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11 (5): 317-25.

Summerton, J. and D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7 (3): 187-95. Summerton, J. and D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7 (3): 187-95.

Vanin, E. F. and T. H. Ji(1981). "Synthesis and application of cleavable photoactivable heterobifunctional reagents." Biochemistry 20 (24): 6754-60. Vanin, EF and TH Ji (1981). "Synthesis and application of cleavable photoactivable heterobifunctional reagents." Biochemistry 20 (24): 6754-60.

Dapic, V., V. Abdomerovic, et al. (2003). "Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides." Nucleic Acids Res 31(8): 2097-107. Dapic, V., V. Abdomerovic, et al. (2003). "Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides." Nucleic Acids Res 31 (8): 2097-107.

Kang, S. H., M. J. Cho, et al. (1998). "Up-regulation of luciferase gene expression with antisense oligonucleotides: implications and applications in functional assay development." Biochemistry 37 (18): 6235-9. Kang, SH, MJ Cho, et al. (1998). "Up-regulation of luciferase gene expression with antisense oligonucleotides: implications and applications in functional assay development." Biochemistry 37 (18): 6235-9.

Knapp, D. C., J. E. Mata,et al. (2003). "Resistance to chemotherapeutic drugs overcome by c-Myc inhibition in a Lewis lung carcinoma murine model." Anticancer Drugs 14(1): 39-47. Knapp, DC, JE Mata, et al. (2003). "Resistance to chemotherapeutic drugs overcome by c-Myc inhibition in a Lewis lung carcinoma murine model." Anticancer Drugs 14 (1): 39-47.

Shafer, R. H. and I. Smirnov (2000). "Biological aspects of DNA/RNA quadruplexes." Biopolymers 56(3): 209-27. Shafer, RH and I. Smirnov (2000). "Biological aspects of DNA / RNA quadruplexes." Biopolymers 56 (3): 209-27.

안티센스 올리고머는 현재 임상 개발에 있어서 안티센스 약물의 수로서 입증되고, 안티센스 올리고머의 수많은 잠재적 한계가 지난 몇 년간에 걸쳐서 성공적으로 다루어져온 사실로서 조력되는 바와 같이, 제약학적 약물로서의 커다란 잠재력을 제공한다. 신규한 비하전 올리고머 골격이 개발되어 세포로의 흡수를 향상시켰으며, 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 향상시켰다(Hudziak, Iversen, Summerton). 일부 올리고머 구조, 예를 들어, 모르폴리노 기재 구조에 대하여, 변형된 골격을 발견하여 그것의 표적 핵산에 대한 향상된 결합 친화성을 제공하였다(Iversen, Summerton). Antisense oligomers are currently demonstrated in clinical development as the number of antisense drugs and offer great potential as pharmaceutical drugs, as the numerous potential limitations of antisense oligomers have been aided in the fact that they have been successfully addressed over the years. New uncharged oligomeric backbones have been developed to enhance uptake into cells and to improve resistance to nuclease degradation (Hudziak, Iversen, Summerton). For some oligomeric structures, such as morpholino based structures, modified backbones have been found to provide improved binding affinity for their target nucleic acids (Iversen, Summerton).

더 최근에, 각종 아르기닌-풍부 펩티드는 포유동물 세포를 포함하는, 세포로의 비하전 올리고뉴클레오티드의 흡수 수준을 극적으로 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다(예를 들어, 공동 소유이고, 2003년 4월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 SN 60/466,703호, 및 2004년 4월 29일자로 출원된 제목이 "Compositions for Enhancing Transport of Molecules into Cells"인 대응 미국 특허 출원을 참조할 것, 상기 출원들은 모두 본원에서 전체가 참고로 인용됨). 이것은 선택된 단백질의 발현을 차단하고자 하고, 예비-프로세싱된 mRNA에서 특정 도너 또는 억셉터 스플라이스 위치를 차단하는 것을 목적으로 하며, 바이러스 유전자의 발현 또는 단일 가닥 바이러스 게놈의 복제를 차단함으로써 바이러스 감염을 치료하도록 설계된 것들 을 비롯하여, 각종 안티센스 올리고머의 치료적 잠재력을 유의적으로 증가시키는 잠재력을 발견하였다. More recently, it has been found that various arginine-rich peptides can dramatically increase the level of uptake of uncharged oligonucleotides into cells, including mammalian cells (eg, co-owned, April 2003 See U.S. Patent Application SN 60 / 466,703, filed 29, and corresponding U.S. Patent Application, filed April 29, 2004, entitled "Compositions for Enhancing Transport of Molecules into Cells." Hereby incorporated by reference in its entirety). It aims to block the expression of selected proteins and to block specific donor or acceptor splice sites in the pre-processed mRNA and to treat viral infections by blocking the expression of viral genes or the replication of a single stranded viral genome. We have discovered the potential to significantly increase the therapeutic potential of various antisense oligomers, including those designed to do so.

일부 안티센스 적용에 있어서, 특정화된 안티센스 올리고머에 대한 최적 표적 서열은 4개 이상의 런을 포함할 수도 있으며, 이 경우 올리고머는 4개 이상의 상보적 구아닌 염기의 상응하는 스트링을 함유할 것이다. 중요한 예로서, c-myc 단백질에 대한 최적의 표적 서열은 4개의 시토신 염기의 런을 포함하는 c-myc RNA의 AUG 개시 위치를 함유하는 영역이다. c-myc의 개시-코돈 영역에 대한 안티센스 올리고머는 암, 다낭신장 질환(예를 들어, 그 전체가 참고로서 인용되는 공동 소유의 미국 특허 제 6,875,747호를 참조할 것), 심장-혈관 재협착(예를 들어, 본원에서 참고로 인용되는 공동 소유의 PCT 특허 출원 WO00/44897호를 참조할 것)의 치료, 및 암 요법(예를 들어, 본원에서 참고로서 인용되는 2003년 8월 5일자로 출원된 공동 소유의 미국 특허 출원 US-2003-0087861-A1 참조)을 포함하는 수많은 중요한 치료적 적용을 갖는다. In some antisense applications, the optimal target sequence for a specified antisense oligomer may comprise four or more runs, in which case the oligomer will contain corresponding strings of four or more complementary guanine bases. As an important example, the optimal target sequence for c-myc protein is the region containing the AUG start position of c-myc RNA comprising a run of four cytosine bases. Antisense oligomers to the initiation-codon region of c-myc include cancer, polycystic kidney disease (see, eg, co-owned US Pat. No. 6,875,747, which is incorporated by reference in its entirety), cardiovascular restenosis ( See, eg, the co-owned PCT patent application WO00 / 44897, which is incorporated herein by reference, and cancer therapy (eg, filed on Aug. 5, 2003, which is incorporated herein by reference). In the US patent application US-2003-0087861-A1).

놀랍게도, 올리고머의 세포 흡수를 향상시키기 위한 일환으로, 4개 이상 런의 시토신 염기를 갖는 안티센스 화합물에 아르기닌-풍부 펩티드를 결합시키는 것은 화합물을 정제하는 능력 뿐만 아니라, 화합물의 안티센스 활성을 심각하게 손상시킨다는 것이 현재 밝혀졌다. 이 문제의 근거가 이해되지는 않지만, 올리고머 내 G-4중체의 형성을 촉진시켜서, 용해도 및/또는 화합물이 그것의 표적 핵산에 결합하는 능력을 감소시키는 방식으로 양으로 하전된 펩티드 및 올리고머 화합물 간의 상호작용에 관여하는 것으로 보인다. 따라서, 세포내 표적에 대한 화합물의 안티센 스 활성을 떨어뜨리지 않으면서, 상기 화합물과 아르기닌-풍부 펩티드를 결합시킴으로써, 그러한 안티센스 올리고머 화합물의 세포 흡수를 향상시키는 것이 유용할 것이다. Surprisingly, as part of enhancing the cellular uptake of oligomers, the binding of arginine-rich peptides to antisense compounds having four or more runs of cytosine bases not only has the ability to purify the compounds, but also severely impairs the antisense activity of the compounds. Is now revealed. Although the basis of this problem is not understood, the positively charged peptide and oligomeric compound between the charged and oligomeric compounds in a manner that promotes the formation of G-4 intermediates in the oligomer, thereby reducing the solubility and / or the ability of the compound to bind its target nucleic acid. It appears to be involved in interaction. Thus, it would be useful to enhance the cellular uptake of such antisense oligomeric compounds by combining the compounds with arginine-rich peptides without compromising the antisense activity of the compounds against intracellular targets.

특히, 암, 다낭신장 질환 또는 심장-혈관 재협착의 치료에서 화합물의 치료적 활성을 향상시키기 위한 목적으로, 안티센스 활성을 잃지 않으면서 상기 c-myc 안티센스 화합물의 세포 흡수를 향상시키는 것이 유용할 것이다. In particular, for the purpose of improving the therapeutic activity of a compound in the treatment of cancer, polycystic kidney disease or cardio-vascular restenosis, it would be useful to enhance cellular uptake of the c-myc antisense compound without losing antisense activity. .

발명의 개요Summary of the Invention

한 양태에서, 본 발명의 방법은 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물과 이 화합물의 표적 세포로의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드와의 콘쥬게이트를 형성함으로써, 상기 화합물의 세포 흡수를 향상시키는 방법의 개선을 포함하며, 상기 화합물은 결합을 의도하는 표적 핵산 영역에서 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 포함한다. 개선은 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하로 제한하기 위해 화합물 내 염기의 스트링 중 적어도 하나의 구아닌을 이노신 염기로 치환하는 것을 포함한다. In one embodiment, the methods of the present invention form a conjugate of a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound with an arginine-rich peptide that is effective to enhance uptake of the compound into target cells, thereby promoting cellular uptake of the compound. Including improvement of the method of enhancing, said compound comprises a string of bases complementary to at least four contiguous cytosine bases in the target nucleic acid region to which binding is intended. Improvements include replacing at least one guanine of a string of bases in a compound with an inosine base to limit the number of contiguous guanine bases in the string to no more than three, preferably no more than two.

개선은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 콘쥬게이트의 양이온 교환 수지에 대한 결합 및 그것으로부터의 방출에 관여하는 정제 단계 중 콘쥬게이트의 수용성을 향상시키는데 효과적일 수도 있다. 표적 핵산 영역이 mRNA에 개시 코돈을 포함하는 경우, 개선은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 전사를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적일 수도 있다. 표적 핵산 영역이 예비 프로세싱된 mRNA에 도너 또는 리셉터 스프라이스 위치를 포함하는 경우, 개선은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 표적 영역에서 mRNA 스플라이싱을 막는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적일 수도 있다. The improvement may be effective in improving the water solubility of the conjugate during the purification step involving engagement of and release from the cation exchange resin of the conjugate over the same conjugate without inosine substitution. If the target nucleic acid region comprises an initiation codon in the mRNA, the improvement may be effective to enhance the conjugate's ability to block transcription of the protein encoded by the mRNA, relative to the same conjugate without inosine substitution. If the target nucleic acid region includes a donor or receptor splice site in the preprocessed mRNA, the improvement is effective to enhance the ability of the conjugate to prevent mRNA splicing in the target region, relative to the same conjugate without inosine substitution. It may be.

표적 핵산 영역이 바이러스 복제에 관여하는 바이러스-코딩된 시스-작용 요소를 포함하는 경우, 개선은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 바이러스 복제를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적일 수도 있다. If the target nucleic acid region comprises a virus-coded cis-acting element involved in viral replication, the improvement may be effective in enhancing the conjugate's ability to block viral replication, as compared to the same conjugate lacking inosine substitutions. have.

전형적인 구체예에서, 아르기닌-풍부 펩티드는 적어도 6개의 X 서브유닛, 적어도 2개의 Y 서브유닛, 및 최대 3개의 Z 서브유닛을 포함하는, X 서브유닛, Y 서브유닛, 및 선택적 Z 서브유닛으로부터 선택된 8 내지 16 서브유닛을 포함하며, In typical embodiments, the arginine-rich peptide is selected from an X subunit, a Y subunit, and an optional Z subunit, including at least 6 X subunits, at least two Y subunits, and at most three Z subunits. 8 to 16 subunits,

여기서, 상기 서브유닛의 >50%는 X 서브유닛이며, 여기서 Wherein> 50% of the subunits are X subunits, where

(a) 각각의 X 서브유닛은 독립적으로 아르기닌 또는 아르기닌 유사체를 나타내며, 상기 유사체는 구조식 R¹N=C(NH₂)R²의 측쇄를 포함하는 양이온 α-아미노산이며, 상기식에서 R¹은 H 또는 R이고; R²는 R, NH₂, 또는 NR²이며, R은 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고 산소 또는 질소를 더 포함할 수도 있으며; R¹ 및 R²는 함께 고리를 형성할 수도 있고; 상기 측쇄는 R¹ 또는 R²를 통해 상기 아미노산에 연결되며; (a) each X subunit independently represents an arginine or arginine analog, which analog is a cationic α-amino acid comprising a side chain of the formula R ¹ N = C (NH ₂ ) R ² , wherein R ¹ is H Or R; R ² is R, NH ₂ , or NR ² , R is lower alkyl or lower alkenyl and may further comprise oxygen or nitrogen; R ¹ and R ² may together form a ring; The side chain is linked to the amino acid via R ¹ or R ² ;

(b) 각각의 Y 서브유닛은 독립적으로 중성 아미노산 -C(O)-(CHR)_n-NH-을 나타내며, 여기서 (i) n은 2 내지 7이고 각각의 R은 독립적으로 H 또는 메틸이거나, 또는 (ii) n은 1이고 R은 치환 또는 비치환 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아랄킬로부터 선택된 중성 측쇄이며, 치환된 알킬, 알케닐, 및 알키닐로부터 선택되는 경우, 상기 중성 측쇄는 4개의 탄소 원자 마다 최대 하나의 헤테로원자를 포함하며;(b) each Y subunit independently represents a neutral amino acid -C (O)-(CHR) _n -NH-, wherein (i) n is 2 to 7 and each R is independently H or methyl, or Or (ii) n is 1 and R is a neutral side chain selected from substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, and aralkyl, and when selected from substituted alkyl, alkenyl, and alkynyl, said neutral The side chain contains at most one heteroatom every 4 carbon atoms;

(c)각각의 Z 서브유닛은 독립적으로 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 세린, 및 트레오닌으로부터 선택된 아미노산을 나타낸다. (c) Each Z subunit independently represents an amino acid selected from alanine, asparagine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, serine, and threonine.

또한, 전형적인 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소 및 인접 서브유닛의 모르폴리노 3-위치에 있는 환외 탄소 사이의 인-함유 연결에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛으로 이루어진 모르폴리노 올리고머이다. 모르폴리노 서브유닛은 하기 구조식과 같이, 비하전 포스포로디아미데이트 연결에 의해 결합될 수도 있으며:Further, in typical embodiments, the oligonucleotide compound is linked to a morpholino subunit linked by a phosphorus-containing linkage between the morpholino nitrogen of one subunit and the extra-focal carbon at the morpholino 3-position of the adjacent subunit. Morpholino oligomers. The morpholino subunits may also be linked by uncharged phosphorodiamidate linkages, as shown in the following structural formula:

상기 식에서 Y₁=0, Z=0이고, Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해, 폴리뉴클레오티드 내 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이며, X는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 또는 알킬 아미노이다. Wherein Y ₁ = 0, Z = 0, Pj is a purine or pyrimidine base pair moiety effective for binding to a base in the polynucleotide by base-specific hydrogen bonding, and X is alkyl, alkoxy, thioalkoxy, or Alkyl amino.

다른 양태에서, 본 발명은 (a) 결합을 의도하는 표적 핵산 부위에서 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 포함하는 염기 서열을 갖는 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물, 및 (b) 상기 화합물에 콘쥬게이트된, 표적 세포로의 화합물의 흡수를 증대시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드로 이루어진 치료적 올리고머-펩티드 콘쥬게이트를 포함한다. 화합물 내 염기의 스트링은 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하, 바람직하게는 2개 이하로 제한하기 위해 스트링 내에 배치된 적어도 하나의 이노신 염기를 포함한다. 콘쥬게이트의 대표적인 구체예는 상기 설명한 바와 같다. In another aspect, the invention provides an antibody comprising: (a) a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound having a base sequence comprising a string of bases complementary to at least four contiguous cytosine bases at a target nucleic acid site intended for binding, and (b A therapeutic oligomeric-peptide conjugate consisting of an arginine-rich peptide effective for enhancing uptake of the compound into target cells conjugated to the compound. The string of bases in the compound comprises at least one inosine base disposed in the string to limit the number of adjacent guanine bases in the string to no more than three, preferably no more than two. Representative embodiments of the conjugates are as described above.

특히, c-myc 단백질의 전사를 차단하는데 사용하기 위해, 사람 c-myc mRNA의 AUG 개시 위치를 포함하는 영역에 결합함으로써, 화합물의 표적 서열은 SEQ ID NO: 2-10으로서 동정된 서열 중 하나를 포함할 수도 있다. 상기 화합물에 결합된 아르기닌-풍부 펩티드는 SEQ ID NO: 16, 17 또는 18로서 동정된 서열을 포함할 수도 있다. In particular, by binding to a region comprising the AUG initiation position of human c-myc mRNA, for use in blocking transcription of c-myc protein, the target sequence of the compound is one of the sequences identified as SEQ ID NO: 2-10. It may also include. The arginine-rich peptide bound to the compound may comprise a sequence identified as SEQ ID NO: 16, 17 or 18.

또한, 피험체 표적 세포에서 c-myc 발현의 억제에 반응하는 병적 상태를 갖는 피험체를 치료하는 방법이 개시된다. 방법을 실행할 때, 방금 설명된 유형의 콘쥬게이트를 치료적으로 유효한 양으로 피험체에 투여한다. 콘쥬게이트는 아르기닌-풍부 펩티드가 부재하는 안티센스 화합물 단독의 경우 보다 더 많이 세포에 흡수되며, 하나 이상의 이노신 염기가 부재하는 동일한 콘쥬게이트 보다 c-myc 전사를 차단함에 있어서 더 활성이다. 상기 방법에서 사용된 콘쥬게이트의 전형적인 구체예는 상기 설명한 바와 같다. Also disclosed are methods of treating a subject having a pathological condition responsive to inhibition of c-myc expression in subject target cells. In practicing the method, a conjugate of the type just described is administered to a subject in a therapeutically effective amount. The conjugate is taken up more into the cell than the antisense compound alone without the arginine-rich peptide and is more active in blocking c-myc transcription than the same conjugate without one or more inosine bases. Typical embodiments of the conjugates used in the method are as described above.

방광암을 치료하는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트를 경요도 수송에 의해 투여할 수도 있으며, 상기 방법은 환자에 시스-플라틴 항암 화합물을 투여하는 것을 더 포함할 수도 있다. For use in treating bladder cancer, the conjugate may be administered by transurethral transport, and the method may further comprise administering a cis-platin anticancer compound to the patient.

혈관확장술 처리 후 혈관 손상 부위에서의 관상-동맥 재협착의 위험을 감소시키는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트는 예를 들어, 약물-방출 스텐트를 통해 또는 약물을 함유하는 마이크로 버블의 정맥내 주사를 통해 혈관내 송달에 의해 송달될 수도 있다. For use in reducing the risk of coronary-artery restenosis at the site of vascular injury after vasodilation treatment, the conjugate can be used for example, via a drug-release stent or via intravenous injection of a drug-containing microbubble. It may be served by my service.

관상 동맥 바이패스 수술 중에 놓인 두렁(saphenous) 정맥을 보호하는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트는 수술적 배치 전에 정맥을 콘쥬게이트에 노출시킴으로써 투여할 수도 있다. For use in protecting saphenous veins placed during coronary artery bypass surgery, the conjugate may be administered by exposing the vein to the conjugate prior to surgical placement.

다낭신장 질환을 치료하는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트는 경구 또는 비경구 투여에 의해 피험체에 투여될 수도 있다. For use in treating polycystic kidney disease, the conjugate may be administered to a subject by oral or parenteral administration.

본 발명의 이들 및 다른 목적과 양태는 하기 상세한 설명을 첨부 도면과 함께 읽는다면 보다 완전하게 이해할 것이다. These and other objects and aspects of the present invention will be more fully understood upon reading the following detailed description in conjunction with the accompanying drawings.

도 1A-1D는 중합체를 형성하기에 적합한 5-원자(A), 6-원자(B) 및 7-원자(C-D) 연결 기를 갖는 몇 개의 바람직한 모르폴리노형 서브유닛을 보여준다;1A-1D show some preferred morpholino-type subunits having 5-atom (A), 6-atom (B) and 7-atom (C-D) linking groups suitable for forming a polymer;

도 2A-2D는 각각 도 1의 서브유닛 A-D를 사용하여 구성된 전형적인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복적인 서브유닛 절편을 보여준다;2A-2D show repetitive subunit fragments of typical morpholino oligonucleotides each constructed using subunits A-D of FIG. 1;

도 3A-G는 본 발명에서 사용된 아르기닌-풍부 펩티드의 각종 구체에예서 사용하기 위한, 전형적인 X 측쇄 구조를 보여준다; 3A-G show typical X side chain structures for use in various embodiments of the arginine-rich peptide used in the present invention;

도 4A-D는 올리고머-펩티드 콘쥬게이트 및 그것들의 제조 방법을 보여주며, 여기서 도 4C는 생체 내에서 쪼개질 수 있는 콘쥬게이트의 제조를 보여주며 도 4D는 6-아미노헥산산/베타-알라닌 링커를 갖는 콘쥬게이트의 제조를 보여준다;4A-D show oligomeric-peptide conjugates and methods for their preparation, where FIG. 4C shows the preparation of cleavable conjugates in vivo and FIG. 4D shows 6-aminohexanoic acid / beta-alanine linkers. Shows the preparation of conjugates with;

도 5는 G-4분체 염기쌍의 개략적 표현이며 여기서 PMO는 올리고머 골격의 분자간 또는 분자내 모르폴린 잔기를 나타낸다. 5 is a schematic representation of G-4 powder base pairs where PMO represents intermolecular or intramolecular morpholine residues of the oligomeric backbone.

도 6은 각종 비결합된 이노신 치환 및 비치환 c-myc 올리고머를 사용하는 무세포 래빗 망상 적혈구 용해물 전사 억제의 결과를 그래프로 보여준다;6 graphically shows the results of cell-free rabbit reticulocyte lysate transcription inhibition using various unbound inosine substitutions and unsubstituted c-myc oligomers;

도 7은 이노신 치환이 있거나 또는 이노신 치환이 없는 아르기닌-풍부 펩티드 결합된 c-myc PMO를 사용하는 무세포 전사의 억제를 나타낸다. FIG. 7 shows inhibition of cell-free transcription using arginine-rich peptide bound c-myc PMO with or without inosine substitution.

발명의 상세한 설명Detailed description of the invention

I. 정의I. Definition

"알킬"은 탄소 및 수소를 함유하는 완전히 포화된 1가 라디칼을 말하며, 분지형, 선형, 또는 환형(시클로알킬)일 수도 있다. 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸, 이소프로필, 시클로프로필, 시클로펜틸, 에틸시클로펜틸, 및 시클로헥실이다. 일반적으로 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기가 바람직하며, 이것을 "저급 알킬"이라 부르고, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소아밀, n-펜틸, 및 이소펜틸로서 예시된다. 한 구체예에서, 저급 알킬은 C₁ 내지 C₄ 알킬을 말한다. "Alkyl" refers to a fully saturated monovalent radical containing carbon and hydrogen, which may be branched, linear, or cyclic (cycloalkyl). Examples of alkyl groups are methyl, ethyl, n-butyl, t-butyl, n-heptyl, isopropyl, cyclopropyl, cyclopentyl, ethylcyclopentyl, and cyclohexyl. In general, alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms are preferred, which are referred to as "lower alkyl" and are methyl, ethyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, isoamyl, n-pentyl, and isopentyl Is illustrated. In one embodiment, lower alkyl refers to C ₁ to C ₄ alkyl.

"알케닐"은 탄소 및 수소를 함유하는 불포화 1가 라디칼을 말하며, 분지형, 선형, 또는 환형일 수도 있다. 알케닐 기는 단일불포화 또는 다중불포화일 수도 있다. 일반적으로, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 기가 바람직하며, 이것을 "저급 알케닐"이라 부른다."Alkenyl" refers to an unsaturated monovalent radical containing carbon and hydrogen, which may be branched, linear, or cyclic. Alkenyl groups may be monounsaturated or polyunsaturated. In general, alkenyl groups having 1 to 6 carbon atoms are preferred, which are referred to as "lower alkenyl".

"아릴"은 일반적으로 단일 고리(예를 들어, 벤젠) 또는 2개의 축합 고리(예를 들어, 나프틸)을 갖는 치환 또는 비치환 1가 방향족 라디칼을 말한다. 이 용어는 푸릴, 피롤, 피리딜, 및 인돌과 같이 고리에 하나 이상의 질소, 산소, 또는 황 원자를 갖는 방향족 고리 기인 헤테로아릴 기를 포함한다. "치환된"은 아릴 기 내 하나 이상의 고리 수소가 플루오르, 염소, 또는 브롬과 같은 할로겐화물; 1 또는 2개의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬 기; 니트로, 아미노, 메틸아미노, 디메틸아미노, 메톡시, 할로메톡시, 할로메틸, 또는 할로에틸로 치환되는 것을 의미한다. 바람직한 치환기는 할로겐, 메틸, 에틸, 및 메톡시를 포함한다. 일반적으로 단일 고리를 갖는 아릴 기가 바람직하다. "Aryl" generally refers to a substituted or unsubstituted monovalent aromatic radical having a single ring (eg benzene) or two condensed rings (eg naphthyl). The term includes heteroaryl groups that are aromatic ring groups having one or more nitrogen, oxygen, or sulfur atoms in the ring, such as furyl, pyrrole, pyridyl, and indole. “Substituted” means that one or more ring hydrogens in the aryl group is a halide such as fluorine, chlorine, or bromine; Lower alkyl groups containing 1 or 2 carbon atoms; Substituted by nitro, amino, methylamino, dimethylamino, methoxy, halomethoxy, halomethyl, or haloethyl. Preferred substituents include halogen, methyl, ethyl, and methoxy. In general, aryl groups having a single ring are preferred.

"아랄킬"은 아릴 기로 더 치환된 알킬 치환기, 바람직하게는 저급(C₁-C₄, 더 바람직하게는 C₁-C₂) 알킬 치환기를 말하며; 예는 벤질(-CH₂C₆H₅) 및 페네틸(-CH₂CH₂C₆H₅)이다. "Aralkyl" refers to an alkyl substituent further substituted with an aryl group, preferably a lower (C ₁ -C ₄ , more preferably C ₁ -C ₂ ) alkyl substituent; Examples are benzyl (-CH ₂ C ₆ H ₅ ) and phenethyl (-CH ₂ CH ₂ C ₆ H ₅ ).

"헤테로사이클"은 고리 원자가 탄소, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 비방향족 고리, 바람직하게는 5- 내지 7-원 고리를 말한다. 바람직하 게, 고리 원자는 3 내지 6 탄소 원자를 포함한다. 이러한 헤테로사이클은 예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진, 및 모르폴린을 포함한다. "Heterocycle" refers to non-aromatic rings, preferably 5- to 7-membered rings, wherein the ring atoms are selected from the group consisting of carbon, nitrogen, oxygen and sulfur. Preferably, the ring atom contains 3 to 6 carbon atoms. Such heterocycles include, for example, pyrrolidine, piperidine, piperazine, and morpholine.

알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 또는 알카릴 기에 관하여, 용어 "치환된"은 예를 들어, 할로겐, 히드록시, 알콕시, 티올, 알킬티오, 아미노, 알킬아미노, 이미노, 옥소(케토), 니트로, 시아노, 또는 카르복시, 설폰, 또는 포스폰과 같은 각종 산 또는 에스테르와 같은 헤테로원자-함유 치환기로 수소 원자를 치환하는 것을 말한다. With respect to alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, or alkaryl groups, the term "substituted" means, for example, halogen, hydroxy, alkoxy, thiol, alkylthio, amino, alkylamino, imino, oxo Substituting a hydrogen atom with a heteroatom-containing substituent such as (keto), nitro, cyano, or various acids or esters such as carboxy, sulfone, or phosphone.

"안티센스 올리고머 화합물" 또는 "안티센스 올리고머 유사체" 또는 안티센스 화합물" 또는 "올리고머 유사체 화합물" 모두는 전형적으로 8 내지 40 염기 사이의 길이를 가지며 단일 가닥 표적 핵산에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 염기 서열을 갖는 실질적으로 비하전 핵산 유사체를 나타내며, 예를 들면, 프로세싱된 또는 예비 프로세싱된 mRNA 전사체, 또는 단일가닥 바이러스 게놈 RNA 또는 DNA이다. 화합물은 결합되지 않거나 또는, 예를 들어, 아르기닌-풍부 펩티드에 결합된 형태일 수도 있다. Both “antisense oligomeric compounds” or “antisense oligomer analogs” or antisense compounds ”or“ oligomeric analog compounds ”are typically between 8 and 40 bases in length and have base sequences that are complementary or substantially complementary to a single stranded target nucleic acid. Substantially uncharged nucleic acid analogs, for example, processed or preprocessed mRNA transcripts, or single-stranded viral genomic RNA or DNA Compounds are not bound or bind to, for example, an arginine-rich peptide It may be in the form.

"모르폴리노 올리고머"는 도 1에 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조들로 이루어진 올리고뉴클레오티드 유사체이며, 여기서 (i) 구조들은 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 결합하면서, 1 내지 3 원자 길이, 바람직하게는 2 원자 길이로, 바람직하게는 비하전되어, 인-함유 연결에 의해 함께 연결되며, (ii) P_i 및 P_j는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오 티드 내 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분은 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특성은 본원에서 참고로 모두 인용되는 미국 특허 제 5.698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337호에서 상세히 설명된다. An "morpholino oligomer" is an oligonucleotide analog consisting of morpholino subunit structures of the type shown in Figure 1, wherein (i) the structures carry the morpholino nitrogen of one subunit to the 5 'outside of the adjacent subunit. While binding to carbon, 1 to 3 atoms in length, preferably 2 atoms in length, preferably uncharged, linked together by a phosphorus-containing linkage, (ii) P _i and P _j are base-specific hydrogen A purine or pyrimidine base pair moiety that is effective for binding to a base in a polynucleotide by binding. The purine or pyrimidine base pair moiety is typically adenine, cytosine, guanine, uracil or thymine. The synthesis, structure, and binding properties of morpholino oligomers are described in detail in US Pat. Nos. 5.698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, and 5,506,337, all of which are incorporated herein by reference.

2-원자 연결을 갖는 도 1B에 나타낸 서브유닛은 도 2B에 나타낸 바와 같은 6-원자 반복-유닛 골격을 위하여 사용된다. 이들 구조에서, 5' 모르폴리노 탄소를 인 기에 연결하는 원자 Y₁은 황, 질소, 탄소 또는, 바람직하게는, 산소일 수도 있다. 인에 부속된 X 부분은 염기-특이적 수소 결합을 방해하지 않는 어떤 안정한 기이다. 바람직한 기는 환형 아민을 포함하는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 및 환형 아민을 포함하는 알킬 아미노를 포함하며, 이들 모두는 염기-특이적 결합이 붕괴되지 않는 한, 다양하게 치환될 수 있다. 알킬, 알콕시 및 티오알콕시는 바람직하게 1-6 탄소 원자를 포함한다. 알킬 아미노는 바람직하게 저급 알킬(C₁ 내지 C₆) 치환을 말하며, 환형 아민은 바람직하게 산소, 질소, 및 황으로부터 선택된 1-2개의 추가의 헤테로원자를 선택적으로 함유하는 5- 내지 7-원 질소 헤테로사이클이다. Z는 황 또는 산소이며, 바람직하게는 산소이다. The subunit shown in FIG. 1B with 2-atomic linkage is used for the 6-atomic repeat-unit backbone as shown in FIG. 2B. In these structures, the atom Y ₁ connecting the 5 'morpholino carbon to the phosphorus group may be sulfur, nitrogen, carbon or, preferably, oxygen. The X moiety attached to phosphorus is any stable group that does not interfere with base-specific hydrogen bonding. Preferred groups include alkyl, alkoxy, thioalkoxy, and alkyl amino, including cyclic amines, all of which may be variously substituted as long as the base-specific bonds are not disrupted. Alkyl, alkoxy and thioalkoxy preferably contain 1-6 carbon atoms. Alkyl amino preferably refers to lower alkyl (C ₁ to C ₆ ) substitutions, and cyclic amines are preferably 5- to 7-membered optionally containing 1-2 additional heteroatoms selected from oxygen, nitrogen, and sulfur. Nitrogen heterocycle. Z is sulfur or oxygen, preferably oxygen.

바람직한 모르폴리노 올리고머는 포스포로디아미데이트-연결된 모르폴리노 올리고머이며, 본원에서 PMO라 부른다. 이러한 올리고머는 도 2B에서 나타낸 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 이루어져 있으며, 여기서 구조는 하나의 서브유닛 의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 결합하면서 포스포로디아미데이트 연결로 함께 연결되며, 여기서 X=NH₂, NHR, 또는 NR²(여기서 R은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸임)이고, Y=O이며, 및 Z=O이고, P_i 및 P_j는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드 내 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이다. 또한, 대안의 포스포로디아미데이트 연결을 갖는 구조가 바람직하며, 여기서, 도 2B에서, X는 메톡시 또는 에톡시와 같은 저급 알콕시이고, Y=NH 또는 NR이며, R은 저급 알킬이고, Z=0이다. Preferred morpholino oligomers are phosphorodiamidate-linked morpholino oligomers, referred to herein as PMO. This oligomer consists of a morpholino subunit structure of the type shown in FIG. 2B, wherein the structure binds to the phosphorodiamidate linkage while binding the morpholino nitrogen of one subunit to the 5 'extra carbon of the adjacent subunit. Linked together, wherein X = NH ₂ , NHR, or NR ² , where R is lower alkyl, preferably methyl, Y = O, and Z = O, and P _i and P _j are base-specific A purine or pyrimidine base pair moiety that is effective for binding to a base in a polynucleotide by red hydrogen bonding. Also preferred are structures with alternative phosphorodiamidate linkages, where, in FIG. 2B, X is lower alkoxy, such as methoxy or ethoxy, Y = NH or NR, R is lower alkyl, Z = 0

모르폴리노-기재 올리고머의 바람직한 화학적 특성은 고온에서, 8-14 염기의 짧은 올리고머와 함께 일때 조차, 표적 RNA를 포함하는 상보성-염기 표적 핵산과 선택적으로 하이브리드화하는 능력, 포유동물 세포로 능동 수송되는 능력, RNAse 분해에 내성인 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 능력을 포함한다. Preferred chemical properties of morpholino-based oligomers include the ability to selectively hybridize with complementary-base target nucleic acids, including target RNA, to active mammalian cells, even at high temperatures, even with short oligomers of 8-14 bases. Ability to become oligomeric: RNA heteroduplex resistant to RNAse degradation.

"실질적으로 비치환된" 모르폴리노 올리고머는 4개, 바람직하게는 10개, 더 바람직하게는 12개의 비하전 서브유닛간 연결 당 최대 1개의 하전된 서브유닛간 연결을 포함한다. 어떤 하전된 연결은 바람직하게는 하전된 포스포르아미데이트(또는 티오포스포르아미데이트) 연결이며, 예를 들어, 도 2B에 나타낸 바와 같은 연결이고, 여기서 X는 O^- 또는 S^-이다. 바람직하게, 모르폴리노 올리고머는 완전히 비하전되어 있다. A “substantially unsubstituted” morpholino oligomer comprises at most one charged subunit linkage per 4, preferably 10, more preferably 12 uncharged subunit linkages. Some charged linkages are preferably charged phosphoramidate (or thiophosphoramidate) linkages, eg, as shown in FIG. 2B, where X is O ⁻ or S ⁻ . Preferably, the morpholino oligomer is completely uncharged.

"아미노산 서브유닛"은 바람직하게는 α-아미노산 잔기(즉, -CO-CHR-NH-)이 며, 또한 β- 또는 기타 아미노산 잔기(예를 들어, -CO-CH2CHR-NH-)일 수도 있고, 여기서 R은 측쇄이다. “Amino acid subunit” is preferably an α-amino acid residue (ie, —CO—CHR—NH—), and may also be β- or other amino acid residue (eg, —CO—CH 2 CHR—NH—). , Where R is side chain.

"G-4중체"는 구아닌-풍부 핵산이 G-4중체의 존재에 의해 안정화되는 분자간 및 분자내 4중 구조를 채택하도록 야기할 수 있는 쌓아 올린 평면 수소-결합된 구아닌 테트라머로 이루어진다. "G-4" is made up of stacked planar hydrogen-bonded guanine tetramers that can cause guanine-rich nucleic acids to adopt intermolecular and intramolecular quadratic structures that are stabilized by the presence of G-4.

용어 "비-천연 아미노산"은 베타-알라닌(β-Ala) 또는 6-아미노헥산산(Ahx)과 같이 천연에서 발견되는 단백질에 존재하지 않는 아미노산들을 말한다. The term “non-natural amino acid” refers to amino acids that are not present in proteins found in nature, such as beta-alanine (β-Ala) or 6-aminohexanoic acid (Ahx).

II. 화합물-수송체 콘쥬게이트 II. Compound-Transport Conjugates

한 양태에서, 본 발명은 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물 및, 그것에 결합된, 표적 세포로 화합물의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드로 이루어진 치료적 올리고머-펩티드 콘쥬게이트를 포함한다. 화합물은 결합을 의도하는 표적 핵산 부위에 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 함유하며, 이 스트링은 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하로 제한하기 위해 스트링 내 위치된 적어도 하나의 이노신 염기를 포함한다. 바람직하게, 염기의 스트링은 적어도 2개의 이노신 염기를 포함하며, 스트링 내 인접 구아닌의 수는 2개 이하이다. In one aspect, the invention includes a therapeutically oligomeric-peptide conjugate consisting of an substantially uncharged oligonucleotide analogue compound and an arginine-rich peptide effective therein that is effective for enhancing uptake of the compound into a target cell. The compound contains a string of bases complementary to four or more contiguous cytosine bases at the target nucleic acid site to which binding is intended, wherein the string is at least one positioned in the string to limit the number of adjacent guanine bases in the string to three or less Inosine base of. Preferably, the string of bases comprises at least two inosine bases and the number of contiguous guanines in the string is no more than two.

하기에 나타내는 바와 같이, 표적 시토신 염기에 상보적인 이노신 염기(들)은 일반적인 G-C 염기쌍 보다 덜 안정한 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하고, 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 양이온 교환 수지에 결합하고 그것으로부터 방출되는 콘쥬게이트에 관여하는 정제 단계 중 콘쥬게이트의 가용성을 향상 시키는 작용을 한다. 이 향상은 실제 정제 방법에 의해 정제된 콘쥬게이트를 획득하는데 있어서 중요하다. 본 발명의 다른 양태에 따라서, 이노신-염기 치환(들)은 또한 하기로서 증명되는 바와 같이, 그것의 표적 핵산에 관한 화합물의 활성을 향상시키는데 효과적이다:As shown below, inosine base (s) complementary to the target cytosine base form Watson-Crick base pairs that are less stable than normal GC base pairs, and bind to and bind to cation exchange resins as compared to the same conjugate without inosine substitutions. It acts to enhance the solubility of the conjugate during the purification step involving the conjugate released from. This improvement is important in obtaining the conjugates purified by the actual purification method. According to another aspect of the present invention, inosine-base substitution (s) are also effective in enhancing the activity of a compound with respect to its target nucleic acid, as demonstrated below:

(i) 표적 핵산 영역은 mRNA에 개시 코돈을 포함하며, 치환(들)은 mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 전사를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키기에 효과적이고; (i) the target nucleic acid region comprises an initiation codon in the mRNA and the substitution (s) is effective to enhance the ability of the conjugate to block transcription of the protein encoded by the mRNA;

(ii) 표적 핵산 영역은 예비 프로세싱된 mRNA에 도너 또는 억셉터 스플라이스 위치를 포함하며, 치환(들)은 상기 표적 영역에서 mRNA 스플라이싱을 막는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키기에 효과적이며; (ii) the target nucleic acid region comprises a donor or acceptor splice position in the preprocessed mRNA, and the substitution (s) is effective to enhance the ability of the conjugate to prevent mRNA splicing in the target region;

(iii) 표적 핵산 영역은 바이러스 복제에 관여하는 바이러스-코딩된 시스-작용 요소를 포함하며, 치환(들)은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 바이러스 복제를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는기에 효과적이다. (iii) the target nucleic acid region comprises a virus-coded cis-acting element involved in viral replication, wherein the substitution (s) reduces the ability of the conjugate to block viral replication compared to the same conjugate lacking inosine substitutions. Effective for improving

이노신-염기 치환된 올리고머-펩티드 콘쥬게이트의 향상된 안티센스 활성을 입증하는 방법은 전형적으로 mRNA 전사의 억제, 예비 프로세싱된 mRNA 스플라이스 정확성 또는 바이러스 복제를 측정하도록 설계된 무세포 전사 분석법 및 조직 배양-기재 분석법이다. Methods demonstrating enhanced antisense activity of inosine-base substituted oligomeric-peptide conjugates are typically cell-free transcription assays and tissue culture-based assays designed to measure inhibition of mRNA transcription, pre-processed mRNA splice accuracy or viral replication. to be.

무세포 전사 분석법은 전사 컴피턴트 세포 용해물(예를 들어, 래빗 망상 적혈구 용해물) 및 반딧불이 루시퍼라제와 같은 리포터 유전자를 함유하며 바로 가까운 업스트림에 놓인 안티센스 올리고머 표적 서열이 있는 투입 mRNA로 구성된다. 각종 플라스미드 구성을 사용하여 리포터 mRNA를 생성할 수 있다. 안티센스 올리고머를 무세포 전사 반응물에 첨가하고 리포터 유전자 신호의 상대적인 억제는 안티센스 활성의 측정치이다. 본 발명을 설명하는데 사용되는 무세포 전사 분석법의 보다 상세한 설명은 실시예 4 및 5에 나타낸다.Cell-free transcription assays consist of input mRNAs containing a transcriptional competent cell lysate (eg, rabbit reticulocyte lysate) and a reporter gene such as firefly luciferase and with an antisense oligomer target sequence immediately upstream. Various plasmid constructs can be used to generate reporter mRNA. The addition of antisense oligomers to cell-free transcriptional reactants and the relative inhibition of reporter gene signals is a measure of antisense activity. A more detailed description of the cell free transcription assay used to describe the invention is shown in Examples 4 and 5.

mRNA 전사의 억제를 입증하기 위해 설계된 조직 배양-기재 분석법은 전사 생성물(예를 들어, 단백질)이 양적으로 측정될 수 있는 본래의 세포 유전자 또는 셀라인으로 안정하게 트랜스펙션된 리포터 유전자에 표적된 안티센스 올리고머를 사용한다. 표적 mRNA의 전사 억제도에 대한 측정은 리포터 유전자 신호 출력 또는 면역학적 방법을 사용하는 단백질 발현의 정량화를 포함하는 각종 분석 방법을 사용하여 수행될 수 있다. Tissue culture-based assays designed to demonstrate inhibition of mRNA transcription are targeted to reporter genes that have been stably transfected with the original cell gene or cell line from which the transcription product (eg protein) can be quantitatively measured. Antisense oligomers are used. Measurement of the transcriptional inhibition of target mRNA can be performed using a variety of assay methods, including reporter gene signal output or quantification of protein expression using immunological methods.

예비 프로세싱된 mRNA 스플라이싱의 억제는 노던법에 의하거나 또는 스플라이스 도너 또는 억셉터 위치에 표적된 안티센스 올리고머로 처리된 세포에서 정량적 중합체 연쇄 반응을 하여 잘못 스플라이싱된 mRNA의 수준을 측정함으로써 입증될 수 있다. 대안적 접근법(예를 들어, (Kang, Cho 등 1998))은 부정확한 스플라이싱을 유발하는 돌연변이된 사람 베타-글로빈 인트론이 개입된 루시퍼라제 유전자를 갖는 플라스미드로 안정하게 트랜스펙션된 셀라인을 이용한다. 인트론 내 돌연변이에 표적된 안티센스 올리고머는 스플라이스 정정 및 기능적 루시퍼라제 리포터 단백질의 상향 조절을 초래한다. Inhibition of preprocessed mRNA splicing is determined by measuring the level of misspliced mRNA by the Northern method or by quantitative polymer chain reaction in cells treated with antisense oligomers targeted to splice donor or acceptor sites. Can be proven. Alternative approaches (e.g. (Kang, Cho et al. 1998)) are cell lines stably transfected with plasmids with luciferase genes involved with mutated human beta-globin introns that cause inaccurate splicing Use Antisense oligomers targeted to mutations in introns result in splice correction and upregulation of functional luciferase reporter proteins.

바이러스 복제에 관여하는 시스-작용 요소에 표적된 안티센스 올리고머의 향상된 활성은 표준 조직 배양-기재 바이러스 복제 분석 또는 바이러스 레플리콘을 사용하여 입증될 수 있다. 안티센스 올리고머의 존재하에 바이러스 복제의 억제는 안티센스 올리고머의 존재하에 복제된 바이러스의 역가를 결정함으로써 측정된다. 바이러스 레플리콘 시스템은 바이러스 구조 유전자가 부분적으로 혹은 전체적으로 리포터 유전자로 치환된 총길이 감염성 바이러스 클론의 유도체를 이용한다. 레플리콘은 일반적으로 트랜스펙션에 의해, 복제 컴피턴트 바이러스로 감염된 세포로 도입된다. 레플리콘은 바이러스의 복제 기구에 의해 인지되는 필수적인 시스-작용 복제 요소를 코딩하여 리포터 유전자의 증폭 및 리포터 신호, 예를 들어 루시퍼라제 활성의 증가를 가져온다. Improved activity of antisense oligomers targeted to cis-acting elements involved in viral replication can be demonstrated using standard tissue culture-based viral replication assays or viral replicons. Inhibition of viral replication in the presence of antisense oligomers is measured by determining the titer of virus replicated in the presence of antisense oligomers. Viral replicon systems utilize derivatives of full-length infectious viral clones in which viral structural genes have been partially or wholly replaced by reporter genes. Replicons are generally introduced into cells infected with a replication competent virus by transfection. Replicons encode essential cis-acting replication elements recognized by the viral replication machinery resulting in amplification of reporter genes and an increase in reporter signals such as luciferase activity.

A. 아르기닌-풍부 폴리펩티드 부분A. Arginine-Rich Polypeptide Parts

생물학적 막을 통해 실질적으로 비하전 안티센스 올리고머 화합물의 흡수를 향상시키기 위해 본 발명에서 사용된 아르기닌-풍부 펩티드는 일반적으로 8-13 X 서브유닛, 2-4 인접 Y 서브유닛, X 서브유닛 한복판에 단독으로 산재된 Y 서브유닛을 포함하는 X 및 Y로부터 선택된 10-15 서브유닛, 및 작용제가 연결되어 있는 선택적인 링커 서브유닛으로 이루어진 부분을 포함한다. X는 구조식 R¹N=C(NH₂)R²(도 3A 참조)의 측쇄 부분을 포함하는 아미노산 서브유닛을 나타내며, 여기서 R¹은 H 또는 R이고; R²는 R, NH₂, NHR, 또는 NR²이며, R은 저급알킬 또는 저급 알케닐이며 산소 또는 질소를 더 포함할 수도 있고; R¹ 및 R²는 함께 고리를 형성할 수도 있으며; 측쇄 부분은 R¹ 또는 R²를 통해 아미노산 서브유닛에 연결된다. Arginine-rich peptides used in the present invention to enhance the uptake of substantially uncharged antisense oligomeric compounds through biological membranes are generally alone in the middle of 8-13 X subunits, 2-4 contiguous Y subunits, X subunits. 10-15 subunits selected from X and Y, including interspersed Y subunits, and optional linker subunits to which the agent is linked. X represents an amino acid subunit comprising the side chain portion of the structure R ¹ N═C (NH ₂ ) R ² (see FIG. 3A), wherein R ¹ is H or R; R ² is R, NH ₂ , NHR, or NR ² , R is lower alkyl or lower alkenyl and may further comprise oxygen or nitrogen; R ¹ and R ² may together form a ring; The side chain moiety is linked to the amino acid subunit via R ¹ or R ² .

선택된 구체예에서, 각각의 X에 대하여, 측쇄 부분은 구아니딜(NH=C(NH2)NH-), 아미디닐(HN=C(NH2)C<), 2-아미노디히드로피리미딜, 2-아미노테트라히드로피리미딜, 2-아미노피리디닐, 및 2-아미노피리미도닐(도 3B-G, 각각 표시된 가능한 연결 위치가 있음)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 구조식 3D, 3E, 및 3G에서, 측쇄의 아미노산 서브유닛에 대한 연결은 표시된 임의의 탄소 원자를 통해서 뿐만 아니라 임의의 고리 -NH- 기를 통해 발생할 수 있음을 주지하라. 한 구체예에서, 측쇄 부분은 아미노산 서브유닛 아르기닌(Arg)으로서, 구아니딜이다. In selected embodiments, for each X, the side chain moiety is guanidyl (NH═C (NH 2) NH—), amidinyl (HN═C (NH 2) C <), 2-aminodihydropyrimidyl, Independently selected from the group consisting of 2-aminotetrahydropyrimidyl, 2-aminopyridinyl, and 2-aminopyrimidonyl (FIG. 3B-G, each with possible linking positions indicated). Note that in Structural Formulas 3D, 3E, and 3G, the linkage of the side chain to the amino acid subunit can occur through any ring-NH- group as well as through any carbon atom indicated. In one embodiment, the side chain moiety is the amino acid subunit arginine (Arg), which is guanidyl.

Y는 이들 중 임의의 것이 치환 또는 비치환될 수도 있는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 및 알카릴로 이루어진 군으로부터 선택된 측쇄를 갖는 소수성 아미노산 서브유닛을 나타내며; 여기서 측쇄는 치환 알킬, 치환 알케닐, 및 치환 알키닐로부터 선택되며, 그것은 6개의 탄소 원자 당 최대 1개의 헤테로원자를 포함한다. 선택된 구체예에서, Y는 치환 또는 비치환 아릴, 아랄킬, 및 알카릴로 이루어진 군으로부터 선택된 측쇄를 갖는 소수성 아미노산 서브유닛을 나타낸다. 다른 구체예에서, 각각의 Y는 페닐알라닌, 티로신, 류신, 이소류신, 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 바람직한 구체예에서, 각각의 Y는 페닐알라닌(Phe 또는 F) 서브유닛이다. 다른 바람직한 구체예에서, Y 서브유닛은 비천연 아미노산 6-아미노헥산산(Ahx)이다. X 및 Y 서브유닛은 본원에서 "양이온 서브유닛" 및 "소수 성 서브유닛"으로 칭할 수도 있다. Y represents a hydrophobic amino acid subunit having a side chain selected from the group consisting of alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, aralkyl, and alkaryl, any of which may be substituted or unsubstituted; Wherein the side chain is selected from substituted alkyl, substituted alkenyl, and substituted alkynyl, which contains at most one heteroatom per six carbon atoms. In selected embodiments, Y represents a hydrophobic amino acid subunit having a side chain selected from the group consisting of substituted or unsubstituted aryl, aralkyl, and alkaryl. In other embodiments, each Y is selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, and valine. In one preferred embodiment each Y is a phenylalanine (Phe or F) subunit. In another preferred embodiment, the Y subunit is unnatural amino acid 6-aminohexanoic acid (Ahx). X and Y subunits may also be referred to herein as “cationic subunits” and “hydrophobic subunits”.

상기 주지한 바와 같이, Y 서브유닛들은 X 서브유닛들이 Y 서브유닛들 사이에 있지 않으면서 인접해 있거나, 아니면 X 서브유닛들 사이에 하나씩 산재되어 있다. 그러나, 연결 서브유닛은 Y 서브유닛들 사이에 있다. 한 구체예에서, Y 서브유닛은 수송체의 말단에 존재하며; 다른 구체예에서, 그들은 X 서브유닛의 양쪽에 인접한다. As noted above, the Y subunits are contiguous while the X subunits are not between the Y subunits, or are interspersed one by one between the X subunits. However, the connecting subunit is between the Y subunits. In one embodiment, the Y subunit is at the end of the transporter; In other embodiments, they are adjacent to both sides of the X subunit.

바람직하게, 수송체는 펩티드이며, 여기서 아미노산은 펩티드 연결에 의해 결합되어 있다. 아미노산은 d-아미노산, l-아미노산, 비천연 아미노산 또는 그것들의 조합일 수도 있다. 송달되는 화합물은 형광 화합물과 같이, 검출을 위해 사용되는 화합물일 수도 있으나, 그것은 바람직하게는 예를 들어, 치료제 또는 진단제와 같은 생물학적 활성제이다. 이러한 작용제는 핵산 또는 핵산 유사체, 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. Preferably, the transporter is a peptide, wherein the amino acids are linked by peptide linkages. The amino acids may be d-amino acids, l-amino acids, unnatural amino acids or combinations thereof. The compound to be delivered may be a compound used for detection, such as a fluorescent compound, but it is preferably a biologically active agent such as, for example, a therapeutic or diagnostic agent. Such agents include nucleic acids or nucleic acid analogs, in particular antisense oligonucleotides.

본원에서 입증되는 바와 같이, 상기 설명된 수송 부분은 부착된 수송 부분이 부재하는 경우 화합물의 흡수에 비하여, 그리고 소수성 서브유닛 Y가 없는 부착된 수송 부분에 의한 흡수에 비하여, 부착된 비하전 올리고머 화합물의 세포 진입을 매우 향상시킨다. 이러한 향상된 흡수는 바람직하게는 소수성 서브유닛 Y가 없는 부착된 수송 부분에 의한 작용제의 흡수에 비하여, 포유 동물 세포로의 화합물의 흡수시, 적어도 2배 증가, 및 바람직하게는 4배 증가로서 입증된다. 흡수는 바람직하게는 비결합 화합물에 비하여, 적어도 2배, 더 바람직하게는 4배 향상된다. As demonstrated herein, the transport moieties described above are attached uncharged oligomeric compounds relative to the absorption of the compound in the absence of an attached transport moiety and relative to the absorption by the attached transport moiety without the hydrophobic subunit Y. Greatly improves cell entry. This enhanced uptake is preferably demonstrated as at least a twofold increase, and preferably a fourfold increase upon uptake of the compound into mammalian cells, as compared to the uptake of the agent by the attached transport moiety without the hydrophobic subunit Y. . The absorption is preferably improved at least twice, more preferably four times as compared to the unbound compound.

수송 부분의 추가적 이점은, 추정상 양으로 하전된 수송 부분 및 음으로 하 전된 핵산 사이의 정전기적 상호작용에 의한, 안티센스 올리고머 및 그것의 표적 핵산 서열 간의 듀플렉스를 안정화하는 것으로 예상되는 그것의 능력이다. 수송체 내 하전된 서브유닛의 수는 상기 나타낸 바와 같이 14 미만이며, 바람직하게는 8 내지 11인데, 이것은 너무나 많은 하전된 서브유닛이 서열 특이성의 감소를 야기할 수도 있기 때문이다. A further advantage of the transport moiety is its ability to stabilize the duplex between the antisense oligomer and its target nucleic acid sequence by electrostatic interaction between the putatively positively charged transport moiety and the negatively charged nucleic acid. . The number of charged subunits in the vehicle is less than 14 as indicated above, preferably 8 to 11, because too many charged subunits may cause a decrease in sequence specificity.

또한, 수송체 부분은 조직 배양 및 무세포 시스템에서 측정된 바와 같이 안티센스 활성을 이루기 위한 안티센스 올리고머의 유효 농도를 낮춘다. 무세포 전사 시스템은 안티센스 올리고머의 표적에 결합하고, 입체 배치적 차단을 통해, 다운스트림 서열의 전사를 억제하는 안티센스 올리고머의 능력에 있어서 수송 부분의 향상된 영향력을 평가하는 독립적인 수단을 제공한다. 아르기닌-풍부 펩티드-PMO 콘쥬게이트의 안티센스 활성을 테스트하기 위해 설계된 무세포 전사 분석법은 비결합 PMO와 비교하여 안티센스 활성의 100배 내지 500배 증가를 실증한다(실시예 5 및 도 6과 7 참조). The transporter moiety also lowers the effective concentration of antisense oligomers for achieving antisense activity as measured in tissue culture and cell free systems. The cell-free transcription system provides an independent means of assessing the enhanced impact of the transport moiety on the antisense oligomer's ability to bind to the target of the antisense oligomer and to inhibit transcription of the downstream sequence through steric batch blocking. Cell-free transcription assays designed to test the antisense activity of arginine-rich peptide-PMO conjugates demonstrate a 100 to 500-fold increase in antisense activity compared to unbound PMO (see Example 5 and FIGS. 6 and 7). .

B. 올리고머 안티센스 화합물B. Oligomeric Antisense Compounds

상기 나타낸 바와 같이, 한 구체예에서, 안티센스 올리고머 화합물은 폴리뉴클레오티드의 표적 서열에 염기-특이적 결합할 수 있는 합성 올리고머, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체이다. 천연 폴리뉴클레오티드의 골격 구조, 고리 구조, 또는 이보다는 덜 빈번하게, 염기 구조가 변형되는 그러한 유사체들은 주지되어 있으며 포스포로티오에이트-결합된 올리고뉴클레오티드와 같은 하전된 유사체, 및 메틸포스포네이트 및 펩티드 핵산과 같은 비하전 유사체를 포함한다. N3→ P5' 포스포르아미데이트와 같은 일부 유사체들은 연결 부분의 상태에 따라 하전되거나 비하전될 수도 있다. As indicated above, in one embodiment, the antisense oligomer compound is a synthetic oligomer, such as an antisense oligonucleotide analog, capable of base-specific binding to a target sequence of a polynucleotide. Skeletal structure, ring structure, or less frequently, analogues of which the base structure is modified are well known and charged analogues such as phosphorothioate-linked oligonucleotides, and methylphosphonates and peptides of natural polynucleotides. Non-charged analogs such as nucleic acids. Some analogs, such as N3 → P5 ′ phosphoramidate, may be charged or uncharged depending on the state of the linking moiety.

바람직한 구체예에서, 중합체는 상기 정의된 바와 같은 모르폴리노 올리고머이며, 이것은 길이가 약 8-40 서브유닛이다. 더 일반적으로, 올리고머는 길이가 약 10-30, 또는 약 12-25 서브유닛이다. 항균과 같은 일부 적용에 있어서, 예를 들어, 길이가 약 8-12 서브유닛인 짧은 올리고머는 특히 본원에서 개시된 펩티드 수송체에 부착되는 경우 특히 이로울 수 있다. 바람직하게, 올리고머는 또한, 상기 정의된 비하전 포스포로디아미데이트-결합된 모르폴리노 올리고머이다. PMO는 지지된 염기쌍 기가 표준 또는 변형 A, T, C, G, I 및 U 염기를 포함하는 임의의 서열일 수 있다. In a preferred embodiment, the polymer is a morpholino oligomer as defined above, which is about 8-40 subunits in length. More generally, the oligomer is about 10-30, or about 12-25 subunits in length. In some applications, such as antibacterial, for example, short oligomers of about 8-12 subunits in length can be particularly beneficial when attached to the peptide transporters disclosed herein. Preferably, the oligomer is also an uncharged phosphorodiamidate-linked morpholino oligomer as defined above. The PMO can be any sequence in which the supported base pair group comprises standard or modified A, T, C, G, I and U bases.

본 발명의 한 양태에 따라서, 특정화된 올리고머 화합물에 대한 표적 핵산 서열은 4개 이상의 인접 시토신 염기의 영역을 포함한다. 이 표적 영역은 mRNA 내 AUG 개시 위치의 일부일 수도 있으며, 여기서 mRNA에 의해 코딩된 선택된 단백질의 발현을 억제 또는 차단하는 것이 바람직하다. 대안으로, 예비 프로세싱된 mRNA 내 도너 또는 억셉터 스플라이스 위치를 포함하거나 이것들에 인접할 수도 있으며, 여기서 스플라이스 돌연변이 폴리펩티드, 또는 불완전 또는 비활성 펩티드를 생성하기 위한 목적으로, 상기 위치에서 정확한 스플라이싱을 차단하는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에서, 표적은 바이러스 게놈에서 시스-작용 요소일 수도 있으며, 여기서 올리고머의 결합(이것은 + 또는 - 바이러스 게놈 가닥에 대해 표적될 수도 있음)은 바이러스 감염된 세포 내 바이러스 복제를 차단하는데 효과적이다. According to one aspect of the invention, the target nucleic acid sequence for the specified oligomeric compound comprises a region of four or more contiguous cytosine bases. This target region may be part of the AUG initiation site in the mRNA, where it is desirable to inhibit or block the expression of the selected protein encoded by the mRNA. Alternatively, it may comprise or be adjacent to a donor or acceptor splice position in the preprocessed mRNA, wherein the splicing is accurate at this position for the purpose of generating a splice mutant polypeptide, or an incomplete or inactive peptide. It is desirable to block. In another embodiment, the target may be a cis-acting element in the viral genome, wherein binding of the oligomers, which may be targeted to the + or − viral genome strand, is effective to block viral replication in the virus infected cell. .

각각 이들 3개의 표적 유형 중에서, 4개 이상의 구아닌 염기의 스트링을 함유하는 전형적인 표적 서열은 당업자에게 주지되어 있는 공공의 서열 데이타베이스에서 찾을 수 있다. 하기 설명된 하나의 전형적인 표적 서열은 사람 c-myc mRNA에 AUG 개시 위치를 포함한다. 그러나, 이 서열, 및 표적 올리고머 화합물에서 만들어진 구아닌 치환을 위한 각종 이노신은 본 발명의 이점을 이루기 위해, 4개 이상의 시토신 염기의 스트링을 갖는 임의의 표적 서열을 표적할 때, 올리고머 화합물이 어떻게 변형될 수 있는지를 예증한다. Of these three target types, respectively, typical target sequences containing strings of four or more guanine bases can be found in public sequence databases well known to those skilled in the art. One typical target sequence described below includes the AUG start position in human c-myc mRNA. However, this sequence, and the various inosines for guanine substitutions made in the target oligomer compound, may be modified to target any target sequence having a string of four or more cytosine bases to achieve the advantages of the present invention. Demonstrate that you can.

수송체는 당업자가 이용가능한 각종 방법에 의해 수송할 화합물에 연결시킬 수 있다. 전형적인 방법은 하기 실시예 1에서 제공되며 도 4A-D에서 도해된다. 이들 실시예 중 하나에서, 수송체는 측쇄 티올이 결합을 위해 사용되는 단일 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드이다. 연결 지점은 수송체를 따라서 각종 위치에 존재할 수 있다. 선택된 구체예에서, 연결 지점은 수송체의 말단이다. 전형적으로, 연결 지점은 수송체의 소수성 잔기에 인접한다. 원하는경우 여러개의 수송체를 단일 화합물에 부착시킬 수 있다. The transporter can be linked to the compound to be transported by various methods available to those skilled in the art. A typical method is provided in Example 1 below and illustrated in FIGS. 4A-D. In one of these examples, the transporter is a peptide containing a single cysteine residue in which side chain thiols are used for binding. Connection points can exist at various locations along the vehicle. In selected embodiments, the linking point is at the end of the transporter. Typically, the linking point is adjacent to the hydrophobic residue of the transporter. If desired, multiple transporters can be attached to a single compound.

또한, 링커는 PMO의 5' 종점 및 펩티드 수송체의 C-말단에 부착된 2개의 β-Ala 및/또는 Ahx 잔기의 임의의 조합일 수 있다. 바람직한 구체예는 도 4D에 나타낸 바와 같이 Ahx 잔기를 펩티드 수송체의 C 말단에 그리고 β-Ala 잔기를 PMO의 5' 말단에 부착시키는 것이다. The linker may also be any combination of two β-Ala and / or Ahx residues attached to the 5 ′ end of the PMO and the C-terminus of the peptide transporter. A preferred embodiment is to attach the Ahx residue to the C terminus of the peptide transporter and the β-Ala residue to the 5 ′ end of the PMO as shown in FIG. 4D.

화합물이 PMO인 경우, 수송체를 실시예 3에서 설명하고 도 4A에서 도해한 바와 같이, 예를 들어, 5'-히드록실 기를 통해, 또는 아민 캐핑(capping) 부분을 통 해, PMO의 5' 종점에 부착시킬 수 있다. 대안으로, 수송체를 예를 들어, 도 4B에서 나타낸 바와 같이, 모르폴리노 고리 질소를 통해, 또는 말단 또는 내부 연결에 있는 서브유닛간 연결의 측쇄를 통해 3' 종점에 부착시킬 수도 있다. 또한, 링커는 수송체 펩티드의 카르복시 말단 및 예를 들어, 카르보디이미드에 의해 촉진된 축합으로 형성된 PMO의 아민 또는 히드록시 기 사이에 직접 결합을 포함할 수도 있다. If the compound is PMO, the transporter is described in Example 3 and illustrated in FIG. 4A, for example, via a 5'-hydroxyl group, or via an amine capping moiety, 5 'of the PMO. Can be attached to the end point. Alternatively, the transporter may be attached to the 3 'terminus, for example, via morpholino ring nitrogen, or through the side chain of the intersubunit linkage at the terminal or internal linkage, as shown in FIG. 4B. The linker may also comprise a direct bond between the carboxy terminus of the transporter peptide and the amine or hydroxy group of the PMO formed by condensation promoted by, for example, carbodiimide.

링커는 정상 사용 조건하에서 절단할 수 없는 것들로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어, 티오에테르 또는 카르바메이트 결합을 함유한다. 일부 구체예에서, 생체 내에서 절단가능한 수송체 부분 및 화합물 사이에 연결을 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 생체 내 절단가능한 결합은 당업계 공지되어 있고, 예를 들어, 효소로 가수분해되는 카르복시산 에스테르, 및 글루타티온의 존재하에 절단되는 이황화물을 포함한다. 또한, 생체 내에서 적절한 파장의 방사능을 적용하여, 오르토-니트로페닐 에테르와 같은 광분해적으로 절단가능한 연결을 절단하는 것이 실행가능할 수도 있다. The linker may be selected from those which cannot be cleaved under normal use conditions, and contain, for example, thioether or carbamate bonds. In some embodiments, it may be desirable to include a linkage between the cleavable transporter moiety and the compound in vivo. Cleavable bonds in vivo are known in the art and include, for example, carboxylic esters that are hydrolyzed by enzymes, and disulfides that are cleaved in the presence of glutathione. It may also be feasible to apply a radiation of the appropriate wavelength in vivo to cleave photolytically cleavable linkages such as ortho-nitrophenyl ether.

예를 들어, 시약 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 또는 숙신이미딜옥시카르보닐 α-메틸-α-(2-피리딜디티오) 톨루엔 (SMPT)을 사용하여 이황화물 링커를 갖는 콘쥬게이트에 대한 제조를 도 4C에서 도해한다. 분할가능 이황화 기를 더 함유하는 전형적인 다른 2개의 기능을 가진(heterobifunctional) 연결제는 N-히드록시숙신이미딜 3-[(4-아지도페닐)디티오]프로피오네이트 및 (Vanin and Ji 1981)에서 설명된 그 밖의 것들을 포함한다. For example, reagent N-succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) or succinimidyloxycarbonyl α-methyl-α- (2-pyridyldithio) toluene (SMPT Production for conjugates with disulfide linkers is illustrated in FIG. 4C. Two other typical heterofunctional linkers containing further cleavable disulfide groups are N-hydroxysuccinimidyl 3-[(4-azidophenyl) dithio] propionate and (Vanin and Ji 1981). Includes others described in.

하기 단락에서 논의된 PMO, 펩티드-결합된 PMO 및 전형적인 수송체 펩티드의 서열에 관한 표는 표 1로서 아래 제공된다. 일반적으로, 펩티드는 N-말단 아미노 기 및 C-말단 아민(예를 들어, NH₂-RRRRRRRRRFFC-CONH₂ SEQ ID NO:16)을 포함한다. 이노신 치환된 구아닌 잔기는 굵은 글씨로 나타낸다. Tables relating to the sequences of PMOs, peptide-bound PMOs and typical transport peptides discussed in the following paragraphs are provided below as Table 1. In general, peptides include N-terminal amino groups and C-terminal amines (eg, NH ₂ -RRRRRRRRRFFC-CONH ₂ SEQ ID NO: 16). Inosine substituted guanine residues are shown in bold.

C. 올리고머 화합물에서 이노신-치환 C. Inosine-Substitution in Oligomeric Compounds

본 발명을 지지하여 수행되고, 하기에서 보고된 연구에서, 화합물의 세포 흡수를 객관적으로 향상시키면서, 아르기닌-풍부 펩티드를 4개 이상의 구아닌 염기의 스트링을 갖는 올리고머 화합물(즉, 4개 이상의 시토신 염기의 런을 갖는 서열에 대해 표적된 것)에 결합시키는 것은 예상치 못한 2가지 중대한 문제를 야기한 것으로 관찰되었다. 첫째로, 아르기닌-풍부 펩티드의 존재는 양이온 교환 수지 상에서 정제의 과정 중에 콘쥬게이트의 응집을 야기하였다. 두번째로, 표적에 대한 화합물의 안티센스 활성을 유의적으로 감소시켰다. In studies carried out in support of the present invention and reported below, arginine-rich peptides may be used in combination with oligomeric compounds having a string of four or more guanine bases (ie, four or more cytosine bases) while objectively enhancing the cellular uptake of the compounds. Binding to the targets for sequences with runs) has been observed to cause two unexpected major problems. First, the presence of arginine-rich peptides caused aggregation of the conjugates during the course of purification on the cation exchange resin. Secondly, the antisense activity of the compound against the target was significantly reduced.

실시예 2 및 3에서 설명한 바와 같이, 콘쥬게이트의 응집은 c-myc PMO(AVI-4126, SEQ ID NO:1)와 같은 G-풍부 PMO에 결합된 아르기닌-풍부 펩티드의 합성에서 극복할 큰 장애물이다. 펩티드 결합된 c-myc PMO의 초기 제조는 후속 분석에서 불일치점을 만들었다. 콘쥬게이트의 질량 스펙트럼은 예상대로 였으나 분석 강양이온 교환(SCX) HPLC는 상당히 다른 보유 시간과 함께 몇 개의 다른 피크를 제공하였다. 다수의 피크는 콘쥬게이트의 다른 응집체 형태에 해당하였다. 실시예 4 및 5에서 설명된 결과는 구아닌-풍부 PMO 서열이 c-myc PMO의 강양이온 교환(SCX) HPLC에서 관찰된 응집에 관여하며, 하나 이상의 인접 구아닌 염기에 대한 이노신 염기의 치환이 이 응집을 감소 또는 제거하였음을 설명한다. 표 1에서 열거한 바와 같이, AVI-5126(SEQ ID NO:12)에 대한 하나의 전형적인 구조는 3개의 이노신 잔기를 함유하며 응집을 강력히 촉진하는 조건하에서 조차 어떤 응집 종도 형성하지 않는다. As described in Examples 2 and 3, aggregation of conjugates is a major obstacle to overcome in the synthesis of arginine-rich peptides bound to G-rich PMOs such as c-myc PMO (AVI-4126, SEQ ID NO: 1). to be. Initial preparation of peptide bound c-myc PMO made inconsistencies in subsequent analysis. The mass spectra of the conjugates were as expected but analytical strong cation exchange (SCX) HPLC provided several different peaks with significantly different retention times. Many of the peaks corresponded to different aggregate forms of the conjugates. The results described in Examples 4 and 5 indicate that the guanine-rich PMO sequence is involved in the aggregation observed in strong cation exchange (SCX) HPLC of c-myc PMO, and substitution of inosine bases for one or more contiguous guanine bases results in this aggregation. Explain that it reduced or eliminated. As listed in Table 1, one typical structure for AVI-5126 (SEQ ID NO: 12) contains three inosine residues and does not form any aggregated species even under conditions that strongly promote aggregation.

아르기닌-풍부 수송 펩티드가 PMO에 결합되는 때 관찰된 응집 현상은 이 부류의 핵산 유사체에 한정되지는 않는다. 다른 모르폴리노 골격, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르(즉, DNA 및 RNA) 및 PNA를 포함하는 다른 비하전 핵산 또는 핵산 유사체는 모두 아르기닌-풍부 펩티드에 결합되는 때 응집에 대한 동일한 잠재력을 가지며, 따라서 본 발명의 이노신-대-구아닌 염기 치환에 의한 향상에 대한 잠재력을 가진다.The aggregation phenomenon observed when the arginine-rich transport peptide binds to PMO is not limited to this class of nucleic acid analogs. Other uncharged nucleic acids or nucleic acid analogues, including other morpholino backbones, methylphosphonates, phosphorothioates and phosphodiesters (ie, DNA and RNA) and PNAs, all bind to arginine-rich peptides when aggregated. Have the same potential and thus the potential for improvement by inosine-to-guanine base substitution of the present invention.

D. 이노신-치환된, 아르기닌-풍부 펩티드의 향상된 입체 배치적 차단 특성D. Improved steric batch blocking properties of inosine-substituted, arginine-rich peptides

c-myc 유전자를 표적하는 이노신 치환된 PMO는 실시예 4에서 설명된 무세포 래빗 망상 적혈구 용해물(SSR) 분석에서 테스트되었다. 이 실시예에서 설명되고 도 6에서 나타낸 바와 같이 구아닌 치환을 위한 이노신의 수적 증가는 감소된 전사의 억제와 상호관련하였다. 구아닌 치환을 위한 4개의 이노신이 있는 PMO(SEQ ID NO:10)는 전사 억제에 최소로 효과적이었던 반면에 G 치환을 위한 오직 1개의 I이 있는 PMO(SEQ ID NO:2 및 3)는 모든 이노신 함유 PMO 중 가장 효과적이었다. 이노신 치환이 없는 대조군 c-myc PMO(SEQ ID NO:1)는 이 분석에서 가장 높은 수준의 억제를 가졌다. 이노신 함유 PMO로 관찰된 감소된 전사의 억제는 3개의 수소 결합을 갖는 GC 염기쌍과 비교하여 I:C 염기쌍 사이의 하나의 수소 결합의 손실과 일치한다. PMO와 그것의 표적 사이의 낮은 온도는 RRL 분석이 측정하는 입체 배치적 차단의 상대적 손실에 있어서 소정의 역할을 할 수도 있다. Inosine substituted PMOs targeting the c-myc gene were tested in the cell free rabbit reticulocyte lysate (SSR) assay described in Example 4. The increase in number of inosine for guanine substitution as described in this example and shown in FIG. 6 correlated with reduced inhibition of transcription. PMO with 4 inosines for guanine substitutions (SEQ ID NO: 10) was minimally effective at inhibiting transcription, whereas PMO with only 1 I for G substitution (SEQ ID NOs: 2 and 3) was all inosine It was the most effective of the containing PMO. Control c-myc PMO without inosine substitutions (SEQ ID NO: 1) had the highest level of inhibition in this assay. The inhibition of reduced transcription observed with inosine containing PMO is consistent with the loss of one hydrogen bond between the I: C base pairs compared to the GC base pair with three hydrogen bonds. The low temperature between the PMO and its target may play a role in the relative loss of steric blockade measured by the RRL analysis.

상기 설명된 구아닌 치환을 위한 이노신이 있는 c-myc PMO 중 3개를 (RAhxR)₄ 송달 펩티드에 결합시키고 실시예 4에서 설명된 동일한 pCNmycluc 플라스미드 및 RRL 시스템을 사용하여 무세포 전사를 억제하는 그것들의 능력에 대하여 테스트하였다. 도 7에 나타내고 실시예 5에서 설명한 바와 같이, 최소 억제 PMO는 이노신 치환이 없는 대조군 펩티드 결합된 c-myc PMO 서열(SEQ ID NO:14)인 것으로 관찰되었다. 이와 반대로, 이노신 치환이 있는 화합물은 매우 현저한 전사의 억제를 실증하였다. 2개 또는 3개의 이노신 치환을 갖는 (RahxR)₄ 펩티드 PMO 콘쥬게이트(SEQ ID NO:11-13)을 도 7에서 나타낸다. 펩티드-결합되고, 이노신-치환된 PMO의 향상된 전사 억제는 실시예 4에서 설명되고 도 6에 나타낸 비결합된 PMO로 관찰된 감소된 억제와 두드러지게 대비된다. Three of the c-myc PMOs with inosine for guanine substitutions described above bind to (RAhxR) ₄ delivery peptides and those that inhibit cell free transcription using the same pCNmycluc plasmid and RRL system described in Example 4 The ability was tested. As shown in FIG. 7 and described in Example 5, the minimal inhibitory PMO was observed to be a control peptide bound c-myc PMO sequence (SEQ ID NO: 14) without inosine substitutions. In contrast, compounds with inosine substitution demonstrated very significant inhibition of transcription. (RahxR) ₄ peptide PMO conjugate (SEQ ID NO: 11-13) with two or three inosine substitutions is shown in FIG. 7. Improved transcriptional inhibition of peptide-bound, inosine-substituted PMOs contrasts markedly with the reduced inhibition observed with unbound PMOs described in Example 4 and shown in FIG. 6.

아르기닌-풍부 펩티드가 안티센스 PMO에 제공하는 증가된 입체 배치적 차단 억제는 비결합 이노신 치환된 PMO로 관찰된 감소된 입체 배치적 차단 특성을 완전히 극복한다. 실시예 5에서 설명되고 도 7에 나타낸 결과를 기초로 하여, 이노신 치환이 있는 PMO는 이노신 치환되지 않은 PMO에 비하여 현저히 증가된 입체 배치적 차단 특성을 갖는다. The increased steric blockade inhibition provided by the arginine-rich peptides to the antisense PMO completely overcomes the reduced steric blockade properties observed with unbound inosine substituted PMOs. Based on the results described in Example 5 and shown in FIG. 7, PMOs with inosine substitutions have significantly increased steric blockade properties compared to PMOs without inosine substitutions.

III. 적용:III. apply:

본 발명의 콘쥬게이트는 재협착과 같은 혈관 증식성 질환의 치료에 유용하다. 혈관 손상의 부위는 예를 들어, 스텐트를 삽입 하는 또는 스텐트 삽입을 하지 않는 관상 동맥 풍선 혈관확장술과 같은 혈관 시술 후 혈관 내강의 재협착(restenosis) 또는 재협소(renarrowing)를 포함한다. 재협착은 혈관확장술로 처치된 환부의 약 30% 내지 60%에서 및 상기 시술 후 3 내지 6 개월 내에 스텐트로 처한 환부의 약 20%에서 발생하는 것으로 여겨진다(예를 들어, Devi, N. B. et al., Cathet Cardiovasc Diagn 45 (3):337-45, 1998 참조). 또한, 협착은 관상 동맥 바이패스 수술 후 발생할 수 있으며, 여기서 심장 수술은 응고된 동맥 근처의 혈액을 우회하거나, "바이패스"하여 심장으로 혈액 및 산소의 공급을 향상시키도록 수행한다. 그러한 경우에, 협착은 이식된 혈관 단편, 및 특히 대체된 혈관의 연접에서 발생할 수도 있다. 또한, 협착은 투석을 위해 형성된 문합 연접에서 발생할 수 있다. The conjugates of the present invention are useful for the treatment of vascular proliferative diseases such as restenosis. Sites of vascular injury include restenosis or renarrowing of the vascular lumen following vascular procedures, such as coronary balloon angioplasty with or without stent insertion. Restenosis is believed to occur in about 30% to 60% of the lesion treated with vasodilation and in about 20% of the stent affected within 3 to 6 months after the procedure (eg, Devi, NB et al. , Cathet Cardiovasc Diagn 45 (3): 337-45, 1998). In addition, stenosis can occur after coronary artery bypass surgery, where cardiac surgery is performed to bypass or "bypass" blood near the coagulated artery to improve the supply of blood and oxygen to the heart. In such cases, narrowing may occur at the junction of the implanted vascular fragment, and in particular of the replaced vessel. Stenosis can also occur at anastomotic junctions formed for dialysis.

이 양태에서, PMO 콘쥬게이트, 바람직하게는 표적 c-myc는 코팅된 스텐트에서, 또는 두렁 정맥의 치료를 위한 생체 외 담금 용액으로 사용되며, 그렇지 않으면 혈관 손상의 부위로 송달된다. 마이크로버블 조성물은 간 및 신장과 같은 선택된 기관으로 뿐만 아니라 혈전증 또는 혈관 손상의 부위, 예를 들어, 손상된 내피(예를 들어, PCT 공개번호 제WO 2000/02588 참조)로 올리고뉴클레오티드와 같은 부착된 분자를 송달하는데 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 바람직한 재협착 방지 조성물은 Ahx-βAla 링커를 통해 (RAhxR)₄ 수송 펩티드에 결합된 이노신-치환, 항-c-myc PMO이다(예를 들어, SEQ ID NO:12).In this embodiment, the PMO conjugate, preferably the target c-myc, is used in a coated stent, or as an ex vivo immersion solution for the treatment of duplex veins, otherwise delivered to the site of vascular injury. Microbubble compositions may be attached molecules such as oligonucleotides to selected organs, such as the liver and kidneys, as well as to sites of thrombosis or vascular injury, such as damaged endothelial (see, eg, PCT Publication No. WO 2000/02588). It has been found to be particularly useful in delivering. Preferred anti-stenosis compositions are inosine-substituted, anti-c-myc PMOs bound to (RAhxR) ₄ transport peptides via Ahx-βAla linkers (eg SEQ ID NO: 12).

또한, 본원에서 설명된 c-myc 유전자를 표적하는 PMO 콘쥬게이트는 일반적으로 암의 치료, 특히 방광암의 치료에 유용하다. 화합요법과 함께, 바람직하게는 c-myc를 표적하는 PMO 콘쥬게이트의 경요도 투여는 본원에서 전체가 참고로 인용되는 (Knapp, Meta et al. 2003)에 설명한 것 및 공동 소유이며 공동 계류중인 미국 출원 10/151,008에서 설명한 것과 같이 증가된 항암 활성을 제공한다. 바람직한 항암 조성물은 Ahx-βAla 링커를 통해 (RAhxR)₄ 수송 펩티드에 결합된 이노신-치환, 항-c-myc PMO이다(예를 들어, SEQ ID NO:12).In addition, PMO conjugates targeting the c-myc gene described herein are generally useful for the treatment of cancer, particularly for bladder cancer. In combination with chemotherapy, the transcatheter administration of the PMO conjugate, preferably targeting c-myc, is described in (Knapp, Meta et al. 2003), incorporated herein by reference in its entirety, and co-owned and co-pending US It provides increased anticancer activity as described in application 10 / 151,008. Preferred anticancer compositions are inosine-substituted, anti-c-myc PMOs bound to (RAhxR) ₄ transport peptides via Ahx-βAla linkers (eg SEQ ID NO: 12).

하기 실시예는 제한없이 본 발명의 각종 구체예를 예증한다.The following examples illustrate various embodiments of the invention without limitation.

실시예 1: 펩티드 합성 및 PMO에 대한 결합Example 1: Peptide Synthesis and Binding to PMO

펩티드는 Fomc 고체상 펩티드 합성(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis)에 의해 합성하였으며, 본원에서 SPPS라 칭한다. p-벤질옥시벤질 알콜 수지를 C-말단 산과 함께 펩티드의 합성을 위해 사용한 반면, Rink Amide MBHA 수지는 펩티드 아미드에 대하여 사용하였다. 두개의 수지는 Novabiochem(미국 캘리포니아 샌디에고 소재)으로부터 구매가능하다. 일반적인 합성 사이클은 20% 피페리딘을 매개로 하여 N-말단 탈보호와 함께 시작하였다. 후속하여, N-α-Fmoc-보호된 아미노산을 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA)의 존재하에 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)와 함께 활성화시킴으로써 성장하는 펩티드 사슬에 결합시켰다. 아르기닌 측쇄는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-설포닐(Pbf) 보호기로, 시스테인은 트리틸로, 및 리신 측쇄는 t-부톡시카르보닐(Boc)로 보호시켰다. 사이클은 원하는 서열에서, 카르복시에서 아미노 방향으로, 모든 아미노산이 첨가될 때까지 반복하였다. 합성 수지로부터의 분할 및 측쇄 탈보호는 펩티딜-수지를 2.5% H₂O, 2.5% 트리이소프로필 실란(TIS), 및 95% 트리플루오로아세트산(TFA)의 용액으로 처리함으로써 동시에 수행하였다. 시스테인 잔기를 함유하는 펩티드에 대하여, 2.5% 1,2-에탄디티올(EDT)을 분할 칵테일에 첨가하였다. 미정제 펩티드를 10배 과량의 디에틸 에테르를 사용하여 침전에 의해 단리시켰다. Source 15S 수지(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)를 사용하는 강 양이온 교환 HPLC를 정제를 위해 사용한 후, Amberchrom 300M 수지(Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA)를 사용하여 역상 탈염에 사용하였다. 탈염 펩티드를 동결건 조시키고 매트릭스 보조 레이저 탈착이온화 비행시간형 질량분석기(MALDI-TOF MS), 강 양이온 고성능 액체 크로마토그래피(SCX HPLC), 및 모세관 전기영동(CE)에 의해 동정 및 정제를 위해 분석하였다. Peptides were synthesized by Fomc Solid Phase Peptide Synthesis, referred to herein as SPPS. p-benzyloxybenzyl alcohol resin was used for the synthesis of the peptide with C-terminal acid, while Rink Amide MBHA resin was used for the peptide amide. Two resins are available from Novabiochem (San Diego, Calif.). The general synthetic cycle started with N-terminal deprotection via 20% piperidine. Subsequently, the N-α-Fmoc-protected amino acid is replaced with 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3, in the presence of N, N-diisopropylethylamine (DIEA). Binding to growing peptide chains by activating with tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU). Arginine side chain is 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) protecting group, cysteine is trityl, and lysine side chain is t-butoxycarbonyl (Boc) Protected. The cycle was repeated at the desired sequence, in the carboxy to amino direction, until all amino acids were added. Splitting and branched deprotection from synthetic resins were performed simultaneously by treating peptidyl-resins with a solution of 2.5% H ₂ O, 2.5% triisopropyl silane (TIS), and 95% trifluoroacetic acid (TFA). For peptides containing cysteine residues, 2.5% 1,2-ethanedithiol (EDT) was added to the split cocktail. The crude peptide was isolated by precipitation using 10-fold excess of diethyl ether. Strong cation exchange HPLC using Source 15S resin (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) was used for purification, followed by reverse phase desalting using Amberchrom 300M resin (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, Pa.). Desalting peptides were lyophilized and analyzed for identification and purification by matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), strong cationic high performance liquid chromatography (SCX HPLC), and capillary electrophoresis (CE) It was.

각종 C-말단 소수성 연결을 함유하는 펩티드는 하기와 같이 제조하였다. 펩티드는 SPPS 중에 펩티드의 C-말단 종점에서 천연 및/또는 비천연 아미노산의 조합을 포함하여 PMO의 아민 또는 히드록시 기로 직접 축합을 위해 제조하였다. 구체적으로, 연결은 하나 또는 두개의 잔기의 상이한 조합에서 사용되는 아미노산 글리신, 베타-알라닌, 및/또는 6-아미노헥산산으로 이루어졌다. 그 외에 펩티드 합성은 그 밖의 펩티드산의 합성과 동일하였다. Peptides containing various C-terminal hydrophobic linkages were prepared as follows. Peptides were prepared for direct condensation with amine or hydroxy groups of PMO, including combinations of natural and / or non-natural amino acids at the C-terminal end point of the peptide in SPPS. Specifically, the linkage consisted of amino acids glycine, beta-alanine, and / or 6-aminohexanoic acid used in different combinations of one or two residues. In addition, peptide synthesis was the same as that of other peptide acids.

PMO의 아민 또는 히드록시 기와의 직접 축합을 위해 가려진 아민 기가 있는 펩티드는 하기와 같이 제조하였다. 유리 펩티드 아미노기는 PMO의 아민 또는 히드록시 기와 펩티드의 카르복시 말단의 직접 축합을 방해하므로, 가려져야 한다. 아민 측쇄를 함유하는 rTat 및 pTat과 같은 펩티드 서열(표 1)은 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥-1-실리덴)에틸(Dde) 아민 측쇄 보호기를 사용하여 제조하였다. 그 외에 펩티드 합성은 그 밖의 펩티드산의 합성과 동일하였다. 리신 Dde 기는 그 밖의 아미노산 측쇄 보호 기의 수지 분할 및 탈보호에서 살아남았다. 측쇄 아민은 결합을 통해 Dde에 의해 가려진 채 유지되고 후속하여 DMF 중 2% 히드라진으로의 처리에 의해 탈보호된다. Peptides with screened amine groups for direct condensation of the PMO with amine or hydroxy groups were prepared as follows. The free peptide amino group interferes with the direct condensation of the carboxy terminus of the peptide with the amine or hydroxy group of the PMO and should therefore be masked. Peptide sequences such as rTat and pTat containing amine side chains (Table 1) were prepared using a 1- (4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene) ethyl (Dde) amine side chain protecting group. Prepared. In addition, peptide synthesis was the same as that of other peptide acids. Lysine Dde groups survived resin cleavage and deprotection of other amino acid side chain protecting groups. Branched chain amines remain obscured by Dde through the bond and are subsequently deprotected by treatment with 2% hydrazine in DMF.

PMO의 5' 말단에서 수송 펩티드의 부착은 하기와 같이 아미드 결합을 통해 수행하였다. C-말단 반응성 펩티드-벤조트리아졸릴 에스테르는 200 μl NMP 중 펩 티드산(15μmol), HBTU(14.25 μmol), 및 HOBt(15μmol)를 용해시키고 DIEA(μmol)을 첨가하여 제조하였다. DIEA의 첨가 후 즉시, 펩티드 용액을 DMSO 중 5'-피페라진-작용기성, 3-아세틸-PMO의 12 mM 용액 12 ml에 첨가하였다. 30℃에서 180분 후, 반응물을 4배 과량의 물로 희석하였다. 미정제 콘쥬게이트를 처음에는 CM-Sepharose 약 양이온 교환 컬럼(Sigma, St. Louis, MO)을 통해 정제하여 비결합 PMO를 제거한 후, 역상 컬럼(HLB column, Waters, Milford, MA)을 통해 정제하였다. 콘쥬게이트를 동결건조시키고 MALDI-TOF MS, SCX HPLC, 및 CE를 사용하여 분석하였다. Attachment of the transport peptide at the 5 'end of the PMO was performed via amide bonds as follows. The C-terminal reactive peptide-benzotriazolyl ester was prepared by dissolving peptide acid (15 μmol), HBTU (14.25 μmol), and HOBt (15 μmol) in 200 μl NMP and adding DIEA (μmol). Immediately after addition of DIEA, the peptide solution was added to 12 ml of a 12 mM solution of 5'-piperazine-functional, 3-acetyl-PMO in DMSO. After 180 minutes at 30 ° C., the reaction was diluted with 4 times excess water. The crude conjugate was first purified through a CM-Sepharose weak cation exchange column (Sigma, St. Louis, MO) to remove unbound PMO, followed by a reversed phase column (HLB column, Waters, Milford, MA). . The conjugate was lyophilized and analyzed using MALDI-TOF MS, SCX HPLC, and CE.

실시예 2: 아르기닌-풍부 펩티드에 결합되는 경우 G-풍부 올리고머는 G-테트라플렉스 응집체를 형성한다Example 2: G-rich oligomers form G-tetraplex aggregates when bound to arginine-rich peptides

이 실시예는 관상 동맥 바이패스 이식(CABG) 임상적 적용을 위해 c-myc 유전자를 표적하는 아르기닌-풍부 펩티드-PMO 콘쥬게이트의 개발을 상세히 기술한다. 이 실시예에 기술된 프로젝트의 목적은 허용가능한 수율 및 순도를 갖는 콘쥬게이트의 합성 및 정제를 위한 과정을 개발하는 것이다. 더욱이, 콘쥬게이트의 분석 방법은 그것을 특성화 해야 하며 합성 과정을 통해 그리고 클리닉에서 사용된 어떤 공식을 통해 순도를 확인해야한다. 생성물에 남아있는 유리 펩티드의 양의 정량은 대개는 유리 펩티드가 콘쥬게이트 또는 유리 PMO 보다 잠재적으로 더 독성이므로 가장 중요한 분석적 특성이다. This example details the development of an arginine-rich peptide-PMO conjugate targeting the c-myc gene for coronary artery bypass transplantation (CABG) clinical application. The purpose of the project described in this example is to develop a process for the synthesis and purification of conjugates with acceptable yields and purity. Moreover, the analytical method of the conjugate must characterize it and confirm its purity through the synthesis process and any formula used in the clinic. Quantification of the amount of free peptide remaining in the product is usually the most important analytical property since the free peptide is potentially more toxic than the conjugate or free PMO.

하기 나타낸 바와 같이, 분자내 G-4중체의 형성을 통한 응집은 c-myc PMO(AVI-4126, SEQ ID NO:1)와 같은 G-풍부 PMO에 결합된 아르기닌-풍부 펩티드의 합성에서 극복할 주요한 장애물이다. 이러한 견지에서, 이 화합물의 추가적 개발 전에 몇 가지 문제점들의 해결이 필요하다. 첫째로, 비-결합된 형태의 콘쥬게이트를 생산하는 것이 가능한가? 둘째로, 제공된 샘플의 형태에 대한 정확한 평가를 우리에게 제공할 응집 또는 분해하지 않는 분석 방법을 개발하는 것이 가능할까? 최종적으로, 만약 있다면, PBS와 같은 주사 버퍼에서 제형되는 경우 어떤 응집체 형태가 콘쥬게이트일 것인가?As shown below, aggregation through the formation of intramolecular G-4 neutrals will overcome in the synthesis of arginine-rich peptides bound to G-rich PMOs such as c-myc PMO (AVI-4126, SEQ ID NO: 1). It is a major obstacle. In view of this, several problems need to be solved before further development of this compound. First, is it possible to produce conjugates in non-bound form? Second, is it possible to develop analytical methods that do not aggregate or degrade to provide us with an accurate assessment of the type of sample provided? Finally, if present, what aggregate form would be conjugate when formulated in an injection buffer such as PBS?

펩티드 결합된 cmyc PMO의 초기 제조는 후속적 분석에서 명백한 불일치점을 만들었다. 질량 스펙트럼은 예상대로 였으나 분석 강양이온 교환(SCX) HPLC는 아주 상이한 보유 시간과 함께 몇 개의 상이한 피크를 제공하였다. 여러개의 피크는 콘쥬게이트의 상이한 응집체 형태에 해당하였다. Initial preparation of peptide bound cmyc PMOs made clear discrepancies in subsequent analysis. Mass spectra were as expected but analytical strong cation exchange (SCX) HPLC provided several different peaks with very different retention times. Several peaks corresponded to the different aggregate forms of the conjugates.

응집의 증거는 그것을 예비 SCX HPLC에 의해 정제할 때 첫 시도로부터 온다. R₉F₂Ahx-cmyc(SEQ ID NO:15)의 118 OD₂₆₀은 20 ml Source 15S HPLC 컬럼 상에서 로딩하고 1.5 M KCl을 통한 용리로, pH 4.75에서 KH₂PO₄ 버퍼에서 전개하였다. A 및 B 버퍼 둘다 25% 아세토니트릴(ACN)을 함유하였다. 콘쥬게이트는 하나의 주요 피크로서 컬럼으로부터 용리되었고, 이것은 유리 펩티드 직후였으며, 후속 부분의 분석은 이후 용리 피크가 풍부화 되었음을 나타냈다. 이후의 용리 피크는 콘쥬게이트의 다중결합의 응집체 형태에 해당한다. 이후 용리 피크가 콘쥬게이트의 다중결합의 응집체 형태라는 증거는 증가된 전하로 인한 보다 긴 보유 시간과 함께, SCX 정제의 염 조건은 응집체 형태를 촉진하는 반면, 낮은 염 조건은 유리 형태를 촉진한다는 관찰로서 제공된다. 염은 G-4중체를 통해 4중 GRO의 형성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 1.5 M KCl 중 SCX HPLC 컬럼 상으로 콘쥬게이트를 로딩시켜서 2차 2개의 후속-용리 피크를 풍부화 하였으며, 초기 비응집 피크의 양을 감소시켰다. 2M 구아니디움 클로라이드 또는 6M 요소 중 로딩은 후속-용리 피크의 양을 현저히 감소시켰으며, 초기-용리 피크는 영향 받지 않은 채로 두었다. 따라서, 분자의 응집 상태는 로딩 환경을 변화시킴으로써 조작할 수 있다. 이것은 후속-용리 피크가 콘쥬게이트의 응집체 형태에 해당하며, 전통적인 분해제 요소(urea) 및 구아니디움은 그것이 수지 상으로 로딩되는 콘쥬게이트를 분해하는데 명백히 효과적이라는 추가적 증거를 제공하였다. Evidence of aggregation comes from the first attempt when it is purified by preparative SCX HPLC. 118 OD ₂₆₀ of R ₉ F ₂ Ahx-cmyc (SEQ ID NO: 15) was loaded on a 20 ml Source 15S HPLC column and developed in KH ₂ PO ₄ buffer at pH 4.75, eluting with 1.5 M KCl. Both A and B buffers contained 25% acetonitrile (ACN). The conjugate eluted from the column as one major peak, which was immediately after the free peptide, and subsequent analysis showed that the eluting peak was then enriched. The subsequent eluting peak corresponds to the aggregate form of the multiple bonds of the conjugate. Evidence that the elution peak is then in aggregate form of the multiple bonds of the conjugate, with longer retention times due to increased charge, observed that the salt conditions of the SCX tablets promoted the aggregate form, while the low salt conditions promoted the free form. As provided. Salts are known to enhance the formation of quadruple GRO through G-4 polymers. The conjugate was loaded onto an SCX HPLC column in 1.5 M KCl to enrich the second two post-elution peaks and reduce the amount of initial non-aggregation peaks. Loading in 2M guanidium chloride or 6M urea significantly reduced the amount of post-eluting peaks, leaving the early-eluting peaks unaffected. Thus, the aggregation state of the molecules can be manipulated by changing the loading environment. This provided additional evidence that the post-eluting peak corresponds to the aggregate form of the conjugate, and that traditional disintegrant urea and guanidium were clearly effective in breaking down the conjugate loaded onto the resin.

분석 SCX HPLC 상 가열의 효과는 응집을 위한 추가적 증거를 제공하였다. 이 크로마토그래피는 컬럼 오븐 내부에 위치한 Source 15S tricon SCX 컬럼을 사용하여 수행하였다. 금속 양이온을 크로마토그래피에서 완전히 배제시키고, 구아니디움으로 대체하는 경우, 컬럼에 가열을 적용하는 것은 후속-용리 피크를 사라지게 한다. 응집된 콘쥬게이트의 백분율은 컬럼 온도가 실온에서 65℃까지 증가함에 따라 감소하였다. 나트륨이 크로마토그래피 내내 양이온으로 사용되는 경우 "용출(melting-out)" 현상이 관찰되지 않으며, 이것은 금속 양이온이 응집된 화학종들을 안정화시킴을 암시한다. 이것은 앞서 언급한 SCX 정제 시도의 문맥에서 볼때, 칼륨이 도처에 존재하였으며 응집체 형태가 우세하였음을 의미한다. Analysis The effect of heating on SCX HPLC provided further evidence for aggregation. This chromatography was performed using a Source 15S tricon SCX column located inside the column oven. When metal cations are completely excluded from chromatography and replaced with guanidium, applying heating to the column causes the post-elution peak to disappear. The percentage of aggregated conjugates decreased as the column temperature increased from room temperature to 65 ° C. If sodium is used as a cation throughout the chromatography, no "melting-out" phenomenon is observed, suggesting that the metal cations stabilize the aggregated species. This means that in the context of the aforementioned SCX purification attempts, potassium was present everywhere and the aggregate form prevailed.

콘쥬게이트의 응집체 형태가 훨씬 더 긴 보유 시간을 갖는다는 사실은 분자가 상호작용하더라도, 아르기닌 측쇄 상의 전하는 여전히 이온 교환 수지와의 상호 작용에 이용할 수 있음을 암시한다. 이것은 콘쥬게이트 분자의 PMO-부분이 서로 상호작용하여 다중결합 응집체를 형성하는 경우일 것이며, 여기서 펩티드 부분은 상호작용에 참여하지 않았다. The fact that the aggregated form of the conjugate has a much longer retention time suggests that even if the molecules interact, the charge on the arginine side chain can still be used for interaction with the ion exchange resin. This would be the case when the PMO-parts of the conjugate molecules interact with each other to form multiple bond aggregates, where the peptide part did not participate in the interaction.

응집 문제는 c-myc PMO 서열에, 적어도 구아닌-풍부 올리고머(GRO)에 있어서 특이적인 것으로 보인다. 낮은 G-함량을 갖는 서열에 유사한 펩티드의 결합은 응집 문제가 없다. 연속적 G-런이 있는 다른 PMO의 콘쥬게이트는 SCX HPLC 상 응집의 동일한 유형을 나타낸다. PMO와 펩티드간 링커는 응집에 어떠한 영향도 미치지 않는 것으로 보인다. N-(4-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르(GMBS) 티오에테르 결합은 Gly2-Ahx, Ahx2, 또는 Ahx 아미드 결합에 대해 매우 유사한 SCX 용리 패턴을 제공한다. 최종적으로, 본 발명자들의 c-myc 콘쥬게이트, (RAhxR)_4-에서 사용된 보다 최근의 펩티드는, 그것이 이전의 R₉F_2-보다 58% 더 길지만, 더 짧은 펩티드와 동일한 응집 SCX 용리 패턴을 제공한다. 따라서, 응집은 어떤 아르기닌-풍부 펩티드와 함께, 그리고 데이팅에 사용되는 모든 결합과 함께 발생한다. 각종 연결을 갖는 동일한 펩티드가 "낮은-G" PMO 서열에 결합되어 있는 경우 응집이 관찰되지 않았기 때문에, 본 발명자들은 상기 현상은 c-myc PMO 서열의 G-풍부 특성으로 인한 것이라 생각한다. Aggregation problems appear to be specific for the c-myc PMO sequence, at least for guanine-rich oligomers (GRO). The binding of similar peptides to sequences with low G-content is free of aggregation problems. Conjugates of other PMOs with consecutive G-runs represent the same type of aggregation on SCX HPLC. The linker between PMO and peptide does not appear to have any effect on aggregation. N- (4-maleimidobutyryloxy) succinimide ester (GMBS) thioether bonds provide a very similar SCX elution pattern for Gly2-Ahx, Ahx2, or Ahx amide bonds. Finally, the more recent peptides used in our c-myc conjugate, (RAhxR) _4- , have the same aggregated SCX elution pattern as the shorter peptide, although it is 58% longer than the previous R ₉ F _2- . to provide. Thus aggregation occurs with any arginine-rich peptide and with all the bonds used for dating. Since aggregation was not observed when the same peptide with various linkages was bound to the "low-G" PMO sequence, we believe that this is due to the G-rich nature of the c-myc PMO sequence.

결합된 GRO와 함께 관찰된 관찰 응집은 연속적 구아닌의 런이 있는 DNA 및 RNA에서 나타난 G-4중체 구조를 형성하는 PMO 상호작용에 대한 PMO와 일치하였다. 상기 설명된 cmyc 20-mer PMO의 PMO 서열(SEQ ID NO:1)은 4-G 런 회전 전 장(spanning) 위치 8-11인 5'-ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC-3'이다. G-4중체 구조의 형성에 대한 증거는 응집의 정도에 있어서 상이한 양이온의 효과가 SCX HPLC에 의해 측정되는 경우 제공된다. 양이온 상호작용은 DNA 및 RNA 4중체를 조화시키기 위해 중요한 것으로 주지되어 있다. Observational aggregation observed with bound GRO was consistent with PMO for PMO interactions that formed the G-4 polymer structure shown in DNA and RNA with consecutive guanine runs. The PMO sequence (SEQ ID NO: 1) of the cmyc 20-mer PMO described above is 5'-ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC-3 'with 4-G run spanning positions 8-11. Evidence for the formation of the G-4 intermediate structure is provided when the effect of different cations on the degree of aggregation is measured by SCX HPLC. Cationic interactions are well known to be important for harmonizing DNA and RNA tetramers.

실시예 3: 구아닌에 대해 치환된 이노신은 아르기닌-풍부 펩티드에 결합된 G-풍부 올리고머의 응집을 막는다Example 3: Inosine substituted for guanine prevents aggregation of G-rich oligomers bound to arginine-rich peptides

구아닌-풍부 핵산 서열은 G-4중체의 존재로 인해 안정화되는 분자간 또는 분자내 4중체 구조를 채택할 수 있음은 오랜 시간 인지되어 왔다(도 5 참조). G-4분체는 2차원의 수소 결합된 구아닌 테트라머에 쌓아 올려지고 구아닌-풍부핵산이 4중체 구조를 형성하도록 야기한다. 일부 생물학적으로 중요한 G-풍부 서열이 시험관 내 생리학적 조건하에 G-4중체를 형성할 수 있으므로 생체내 4중체 형성의 잠재적 역할을 연구하였다. 추가적으로, 특이적 G-4중체-결합 단백질을 설명하는 보고서의 수가 현재 상당하다(Shafer and Smirnov 2000). It has long been recognized that guanine-rich nucleic acid sequences can adopt intermolecular or intramolecular quadruple structures that are stabilized due to the presence of G-4 polymers (see FIG. 5). The G-4 powder is stacked on two-dimensional hydrogen-bonded guanine tetramers, causing the guanine-rich nucleic acid to form a quadruple structure. The potential role of tetramer formation in vivo has been studied because some biologically important G-rich sequences can form G-4 polymers under in vitro physiological conditions. In addition, the number of reports describing specific G-4 intermediate-binding proteins is currently significant (Shafer and Smirnov 2000).

G-풍부 올리고머(GRO)는 열역학적 및 동역학적 고찰에 따라, 각종 가능한 4중체 구조를 형성할 수 있다. 형성된 구조는 올리고뉴클레오티드 염기 서열 및 농도, 및 어닐링(annealing)을 위해 사용한 조건(온도 및 버퍼), 특히 K⁺ 및 Na⁺와 같은 1가 양이온의 존재에 의해 영향받을 수 있다. 4중체는 1, 2 또는 4 분자의 올리고뉴클레오티드에 의해 형성될 수 있으며, 이것을 각각 모노머, 다이머 및 테트라머라고 부른다. 모노머 및 다이머 4중체는 추가적으로 의자형(측면 루프) 또는 바 스켓형(대각선 루프)로 그들의 루프 영역으로의 위치 정하기를 기초로 하여 분류되었다. 4중체의 4개의 가닥의 관련 가닥 개시점(5'에서 3' 양극단)은 평행하거나, 역평행하거나, 또는 혼재되어 있을 수도 있다(Dapic, Abdomerovic et al. 2003). G-rich oligomers (GRO) can form a variety of possible tetrameric structures, depending on thermodynamic and kinetic considerations. The structure formed can be influenced by oligonucleotide base sequence and concentration, and the conditions used for annealing (temperature and buffer), in particular the presence of monovalent cations such as K ⁺ and Na ⁺ . The tetramers can be formed by oligonucleotides of one, two or four molecules, which are called monomers, dimers and tetramers, respectively. Monomer and dimer tetramers were further classified on the basis of their positioning into the loop region, either chaired (side loops) or basketed (diagonal loops). The relevant strand initiation points (4 'to 3' extremes) of the four strands of the tetramer may be parallel, antiparallel, or mixed (Dapic, Abdomerovic et al. 2003).

G-테트라플랙스 구조를 촉진하는 수소 결합 상호작용을 파괴하기 위해, 9개의 PMO를 c-myc PMO(SEQ ID NO:1)의 4-G 런 내 상이한 위치에 구아닌에 대하여 치환된 이노신과 함께 합성하였다. 이노신 함유 PMO를 SEQ ID NO:2-10으로서 표 1에 열거한다. 펩티드와의 결합 후, 고도 응집성 SCX HPLC 조건하에 분석을 수행하였다. 상기 조건이 극도로 응집성이므로, 그들은 응집하는 각 분자의 상대적 경향에 대해 엄격히 테스트되어야 한다. To disrupt the hydrogen bond interactions that promote G-Tetraplex structure, nine PMOs were synthesized with inosine substituted for guanine at different positions in the 4-G run of c-myc PMO (SEQ ID NO: 1). It was. Inosine containing PMOs are listed in Table 1 as SEQ ID NO: 2-10. After binding to the peptide, the assay was performed under highly cohesive SCX HPLC conditions. Since the conditions are extremely cohesive, they must be rigorously tested for the relative tendency of each molecule to aggregate.

트리플루오로아세트산 염으로서, Ac-(Arg-Ahx-Arg)₄-Ahx-βAla-OH 펩티드를 비변형 및 표 1에 열거된 9개의 이노신 변형된 cmyc PMO 20-mer 서열(SEQ ID NO:1-10)에 결합시켰다. 결합은 NMP/DMSO 중 HBTU 결합을 사용하여, 통상적인 방식으로 수행하였다. 반응은 35℃에서 180 분 동안 교반하면서 진행하였다. 반응 혼합물을 3 ml H₂O로 희석하고, 2 ml CM-세파로스 컬럼으로 로딩시키고, 2ml ACN 및 1ml H₂O로 세척하였다. 콘쥬게이트를 4ml의 2mM 구아니디움 클로라이드로 희석하였다. 이온 교환 컬럼으로부터 용리된 염 콘쥬게이트 용액을 2ml Waters HLB 역상 컬럼 상에 로딩시키고, 4 ml H₂O로 세척하고, 4ml 50% ACN으로 용리하여 탈염화시켰다. 마지막으로, 용액을 동결건조시켰다. As the trifluoroacetic acid salt, the Ac- (Arg-Ahx-Arg) ₄ -Ahx-βAla-OH peptide was unmodified and the nine inosine modified cmyc PMO 20-mer sequences listed in Table 1 (SEQ ID NO: 1 -10). The binding was performed in a conventional manner, using HBTU binding in NMP / DMSO. The reaction proceeded with stirring at 35 ° C. for 180 minutes. The reaction mixture was diluted with 3 ml H ₂ O, loaded into a 2 ml CM-Sepharose column and washed with ₂ ml ACN and 1 ml H ₂ O. The conjugate was diluted with 4 ml of 2 mM guanidium chloride. The salt conjugate solution eluted from the ion exchange column was loaded on a 2 ml Waters HLB reversed phase column, washed with 4 ml H ₂ O and eluted with 4 ml 50% ACN to desalting. Finally, the solution was lyophilized.

MALDI-TOF MS에 의한 콘쥬게이트의 분석은 청정 생성물, N-1 절단된 PMO 서 열로 인한 주요 불순물을 제안하였다. HPLC는 Bio-Rad BioLogic HR HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 모든 전개를 위해 사용한 컬럼은 Tricorn Source 15S 4.6/100 PE(Amersham Biosciences; product 17-8182-01)였다. 사용된 버퍼 시스템은 pH 7.5에서 25% ACN 중 10 mM Na₂HPO₄였으며, 1.5M NaCl로 용리하였다. 샘플을 모두 버퍼 A에 로딩시켰다. 20-75%B/14 컬럼 부피 기울기와 함께 1 ml/분의 유속을 모든 전개에 대하여 사용하였다. 크로마토그래프 결과는 적분된 피크 값으로서 하기 표 2에 제공된다. 화학 불순물 및 약 7%의 적분 총량을 나타내는 작은 피크는 모두 크로마토그램에서 존재하였다.Analysis of the conjugates by MALDI-TOF MS suggested major impurities due to the clean product, N-1 cleaved PMO sequence. HPLC was performed using a Bio-Rad BioLogic HR HPLC system. The column used for all developments was Tricorn Source 15S 4.6 / 100 PE (Amersham Biosciences; product 17-8182-01). The buffer system used was 10 mM Na ₂ HPO ₄ in 25% ACN at pH 7.5 and eluted with 1.5M NaCl. Samples were all loaded into buffer A. A flow rate of 1 ml / min with 20-75% B / 14 column volume gradient was used for all runs. Chromatograph results are provided in Table 2 below as integrated peak values. Small peaks indicating chemical impurities and total amount of integration of about 7% were all present in the chromatogram.

구아닌에 대한 이노신의 치환은 상대적인 응집량에 명백한 영향을 미쳤다. 오직 하나의 구아닌에 대한 치환으로, 위치 9 또는 10에서, 응집체 형태 중 콘쥬게이트 백분율은 79%에서 평균 56%로 떨어졌다. 2개의 치환이 있는 서열 중 3개, (I8, I10), (I8, I11), 및 (I9, I11)는 평균 20% 응집된 콘쥬게이트가 있는 크로마토그램을 가졌다. 4개의 G 런의 2개의 중심 구아닌을 치환하는 것은 더 큰 영향을 미쳤으며, 오직 2.7% 응집체를 제공한다. 3개 이상의 구아닌(I9, I10)이 치환되는 경우, 응집은 전부 제거되었다. Substitution of inosine for guanine had a clear effect on the relative amount of aggregation. With substitutions for only one guanine, at positions 9 or 10, the percentage of conjugates in aggregate form dropped from 79% to an average of 56%. Three of the sequences with two substitutions, (I8, I10), (I8, I11), and (I9, I11) had chromatograms with an average 20% aggregated conjugate. Substituting two central guanines of four G runs had a greater impact, giving only 2.7% aggregates. When three or more guanines (I9, I10) were substituted, all aggregation was removed.

실시예 4: 구아닌 치환을 위한 이노신이 있는 PMO를 사용하는 무세포 전사의 억제Example 4 Inhibition of Cell-Free Transcription Using PMO with Inosine for Guanine Substitution

반딧불 루시퍼라제(fLUC)에 대한 코딩 서열을 Sal I 및 Not I 부위에 있는 플라스미드 pCi-Neo(Promega)의 여러개의 클로닝 위치로 하위 클로닝 시켰으며 결과의 플라스미드를 pCNlucr이라 칭하였다. 사람 c-myc 유전자 (5'-AGCCTCCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTA-3' (SEQ ID NO:29), Genbank 수탁 번호V00568)의 ATG 출발 코돈을 둘러싸고 있는 30개 염기 쌍 영역을 pCNlucr의 Nhe I 및 Sal I 부위로 하위 클로닝시키고 pCNmycluc라 칭하였다. 이것은 fLUC 유전자(c-myc:fLUC)의 아미노산 코딩 서열과 함께 프레임 내 c-myc 코딩 서열에 위치하였다. c-myc의 이 영역을 표적하는 PMO, AVI-4126은 SEQ ID NO:1으로서 열거된다. 이노신으로 치환되고 c-myc 개시 코돈 영역을 표적화하는 각종 수 및 위치의 구아닌 잔기가 있는 이노신-치환된 PNO를 SEQ ID NO:2-10에 열거한다. The coding sequence for firefly luciferase (fLUC) was subcloned into several cloning positions of plasmid pCi-Neo (Promega) at Sal I and Not I sites and the resulting plasmid was called pCNlucr. Subcloning the 30 base pair region surrounding the ATG start codon of the human c-myc gene (5'-AGCCTCCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTA-3 '(SEQ ID NO: 29), Genbank Accession No. V00568) to the Nhe I and Sal I sites of pCNlucr And called pCNmycluc. It was located in the frame c-myc coding sequence along with the amino acid coding sequence of the fLUC gene (c-myc: fLUC). PMO, AVI-4126, targeting this region of c-myc is listed as SEQ ID NO: 1. Inosine-substituted PNOs with guanine residues of various numbers and positions that are substituted with inosine and target the c-myc start codon region are listed in SEQ ID NO: 2-10.

상기 설명된 모든 플라스미드는 c-myc:fLUC 서열의 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 업스트림을 가지며 T7 폴리머라제-기재 Magascript 키트 및 프로토콜(Ambion)을 사용하여, NotI로 선형화(linearization) 한 후, RNA가 플라스미드로부터 생성되도록 허용하였다. 1nM의 각각의 반응물에서, 12 μl 뉴클레아제-처리된 래빗 망상적혈구 용해물(Promega)의 최종 농도로, 추가적으로 PMO, (RAhxR)₄-PMO, 또는 물을 포함하여 전사된 RNA를 사용하여 시험관 내 전사를 수행하였다. 10μl의 전사 반응물을 제조업자의 설명에 따라 50μl 루시퍼라제 분석 시약(Promega)와 혼합하고 빛 방출은 FLx800 마이크로플레이트 루미노미터(BIO-TEC Instruments) 상에서 판독하였다. 반응물을 발광 작용 및 125의 민감도 세팅을 사용하여 KC 쥬니어 프로그램(BIO-TEC)으로 상대적 광 단위에 대하여 분석하였다. 12개의 반응물을 동시에 분석하였으며, 각 줄의 첫번째 및 마지작 웰에 물-대조군 반응을 포함하여 분석하였다. PMO 또는 (RAhxR)₄-PMO 농도의 함수로서 각 반응물(n=3)에 의해 생산된 상대적 광 단위(RLU)를 도 6 및 7에 나타낸 바와 같이 표시하였다. All plasmids described above have a T7 RNA polymerase promoter upstream of the c-myc: fLUC sequence and are linearized with NotI, using the T7 polymerase-based Magascript kit and protocol, after which RNA is removed from the plasmid. Allowed to be generated. In 1 nM of each reaction, in vitro using a transcribed RNA, including PMO, (RAhxR) ₄ -PMO, or water, at a final concentration of 12 μl nuclease-treated rabbit reticulocyte lysate (Promega) My transcription was performed. 10 μl of transcriptional reaction was mixed with 50 μl Luciferase Assay Reagent (Promega) according to the manufacturer's instructions and light emission was read on a FL × 800 microplate luminometer (BIO-TEC Instruments). Reactions were analyzed for relative light units with the KC Junior Program (BIO-TEC) using luminescence and a sensitivity setting of 125. Twelve reactants were analyzed simultaneously, including water-control reactions in the first and final wells of each row. Relative light units (RLU) produced by each reactant (n = 3) as a function of PMO or (RAhxR) ₄ -PMO concentration are indicated as shown in FIGS. 6 and 7.

c-myc 유전자를 표적하는 각종 이노신 치환된 PMO는 상기 설명된 무세포 래빗 망상 적혈구 용해물(RRL) 분석에서 테스트하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 구아닌 치환을 위한 이노신의 수를 증가시키는 것은 감소된 전사의 억제와 상호관련되었다. 구아닌 치환을 위한 4개의 이노신이 있는 PMO(SEQ ID NO:10)는 전사를 억제하는데 가장 적게 효과적이었다. G 치환을 위한 오직 1개의 I가 있는 PMO(SEQ ID NO:2 및 3)는 모든 이노신 함유 PMO 중 가장 효과적이었다. 가장 효과적인 PMO는 이노신 치환을 갖지 않는 대조군 c-myc PMO(SEQ ID NO:1)이었다. 이노신 함유 PMO와 함께 관찰된 감소된 전사의 억제는 3개의 수소 결합이 있는 G:C 염기쌍과 비교하여 I:C 염기쌍 사이의 하나의 수소 결합의 손실로 인한 것으로 제안된다. Various inosine substituted PMOs targeting the c-myc gene were tested in the cell-free rabbit reticulocyte lysate (RRL) assay described above. As shown in FIG. 6, increasing the number of inosines for guanine substitutions correlated with reduced inhibition of transcription. PMO with four inosins for guanine substitutions (SEQ ID NO: 10) was least effective in inhibiting transcription. PMOs with only one I for G substitution (SEQ ID NOs: 2 and 3) were the most effective of all inosine containing PMOs. The most effective PMO was control c-myc PMO (SEQ ID NO: 1) with no inosine substitutions. The inhibition of reduced transcription observed with inosine containing PMO is suggested to be due to the loss of one hydrogen bond between the I: C base pairs as compared to the G: C base pair with three hydrogen bonds.

실시예 5: 이노신 치환된 펩티드-PMO 콘쥬게이트가 있는 무세포 전사의 증가된 억제Example 5: Increased Inhibition of Cell-Free Transcription with Inosine Substituted Peptide-PMO Conjugates

구아닌 치환을 위한 각종 이노신이 있는 3개의 상이한 c-myc PMO를 (RahxR)₄송달 펩티드에 결합시키고 실시예 4에서 설명된 동일한 pCNmycluc 플라스미드 및 RRL 시스템을 사용하여 무세포 전사를 억제하는 그들의 능력에 대하여 테스트하였다. 도 7에서 나타낸 바와 같이, 최소의 억제성 PMO는 이노신 치환을 갖지 않는 대조군 펩티드 결합된 c-myc PMO 서열(SEQ ID ON:14)인 것으로 관찰되었다. 2 또는 3개의 이노신 치환을 갖는 RahxR 펩티드 PMO 콘쥬게이트(SEQ ID NO:11-13)를 도 7에 나타낸다. 펩티드 결합된, 이노신 치환 PMO의 향상된 전사 억제는 실시예 3에서 설명되고 도 6에서 나타낸 비결합 PMO와 함께 관찰된 감소된 억제와 뚜렷하게 상반되었다. 아르기닌-풍부 펩티드가 안티센스 PMO에 수여하는 증가된 입체 배치적 차단 억제는 비결합 이노신 치환된 PMO와 함께 관찰된 감소된 입체 배치적 차단 특성을 완벽히 극복한다. 도 7에서 나타낸 결과를 기초로 하면, 이노신 치환이 있는 PMO는 이노신 치환되지 않은 PMO 보다 예상밖으로 더 많이 향상되었다. 아르기닌-풍부 펩티드가 이노신 치환된 PMO에 제공하는 증가된 입체 배치적 차단 특성에 대한 메카니즘은 현재 알려져 있지 않다. 그러나, 이것들의 향상된 안티센스 PMO의 합성 및 치료적 잠재력 면에서의 유용성은 상당하다. For their ability to bind three different c-myc PMOs with various inosines for guanine substitution to the (RahxR) ₄ delivery peptide and inhibit cell free transcription using the same pCNmycluc plasmid and RRL system described in Example 4 Tested. As shown in FIG. 7, the minimal inhibitory PMO was observed to be a control peptide bound c-myc PMO sequence (SEQ ID ON: 14) with no inosine substitutions. A RahxR peptide PMO conjugate (SEQ ID NO: 11-13) with two or three inosine substitutions is shown in FIG. 7. The enhanced transcriptional inhibition of peptide bound, inosine substituted PMOs was in sharp contrast to the reduced inhibition observed with unbound PMOs described in Example 3 and shown in FIG. 6. The increased steric blockade inhibition that the arginine-rich peptides confer to antisense PMO completely overcomes the reduced steric blockade properties observed with unbound inosine substituted PMOs. Based on the results shown in FIG. 7, PMO with inosine substitution unexpectedly improved more than PMO without inosine substitution. The mechanism for the increased steric blockade properties provided by arginine-rich peptides to inosine substituted PMOs is currently unknown. However, the usefulness in terms of the synthesis and therapeutic potential of these improved antisense PMOs is significant.

<110> AVI BioPharma, Inc. Iversen, Patrick L. Weller, Dwight D. Hassinger, Jed N. <120> PEPTIDE CONJUGATED, INOSINE-SUBSTITUTED ANTISENSE OLIGOMER COMPOUND AND METHOD <130> 504508067WO0 <140> Not Yet Assigned <141> Filed Herewith <150> US Not Yet Assigned <151> 2005-05-23 <150> US 60/574,048 <151> 2004-05-24 <160> 29 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <400> 1 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = inosine <400> 2 acgttgagng gcatcgtcgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n = inosine <400> 3 acgttgaggn gcatcgtcgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n = inosine <400> 4 acgttgangn gcatcgtcgc 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<220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <400> 18 Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n = inosine <400> 19 acgttgaggn gcatcgtcgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n = inosine <400> 20 acgttgangn gcatcgtcgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer 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beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> n = inosine <400> 26 acgttgannn ncatcgtcgc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 27 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n = inosine <400> 28 acgttgagng gcatcgtcgc 20 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agcctcccgc gacgatgccc ctcaacgtta 30 <110> AVI BioPharma, Inc. Iversen, Patrick L. Weller, Dwight D. Hassinger, Jed N. <120> PEPTIDE CONJUGATED, INOSINE-SUBSTITUTED ANTISENSE OLIGOMER COMPOUND AND METHOD <130> 504508067WO0 <140> Not Yet Assigned <141> Filed Herewith <150> US Not Yet Assigned <151> 2005-05-23 <150> US 60 / 574,048 <151> 2004-05-24 <160> 29 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <400> 1 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (9) N = inosine <400> 2 acgttgagng gcatcgtcgc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (10) .. (10) N = inosine <400> 3 acgttgaggn gcatcgtcgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (10) N = inosine <400> 4 acgttgangn gcatcgtcgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (11) N = inosine <400> 5 acgttgangg ncatcgtcgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (10) N = inosine <400> 6 acgttgagnn gcatcgtcgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (11) N = inosine <400> 7 acgttgagng ncatcgtcgc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (10) N = inosine <400> 8 acgttgannn gcatcgtcgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (11) N = inosine <400> 9 acgttgagnn ncatcgtcgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (11) N = inosine <400> 10 acgttgannn ncatcgtcgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (10) N = inosine <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'nucleotide modified to include Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala peptide, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 11 acgttgagnn gcatcgtcgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (10) N = inosine <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'nucleotide modified to include Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala peptide, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 12 acgttgannn gcatcgtcgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (11) <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'nucleotide modified to include Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala peptide, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 13 acgttgagnn ncatcgtcgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'nucleotide modified to include Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala peptide, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 14 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc, conjugated to synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'nucleotide modified to include Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Phe Phe Ahx peptide, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 15 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic transport peptide <400> 16 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Phe Phe Cys 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature (222) (2) .. (2) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (5) .. (5) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (8) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature <222> (11) .. (11) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <400> 17 Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg Arg Xaa Arg 1 5 10 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic transport peptide <220> <221> misc_feature <222> (11) .. (11) <223> Xaa is Ahx, which is 6-aminohexanoic acid <400> 18 Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa 1 5 10 15 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (10) .. (10) N = inosine <400> 19 acgttgaggn gcatcgtcgc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (10) N = inosine <400> 20 acgttgangn gcatcgtcgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (11) N = inosine <400> 21 acgttgangg ncatcgtcgc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (10) N = inosine <400> 22 acgttgagnn gcatcgtcgc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (11) N = inosine <400> 23 acgttgagng ncatcgtcgc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (10) N = inosine <400> 24 acgttgannn gcatcgtcgc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (11) N = inosine <400> 25 acgttgagnn ncatcgtcgc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (8) .. (11) N = inosine <400> 26 acgttgannn ncatcgtcgc 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <400> 27 acgttgaggg gcatcgtcgc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligomer antisense to c-myc <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1) <223> 5 'modified to include peptide Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Arg Ahx Arg Ahx beta-Ala, where Ahx = 6-aminohexanoic acid <220> <221> misc_feature (222) (9) .. (9) N = inosine <400> 28 acgttgagng gcatcgtcgc 20 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agcctcccgc gacgatgccc ctcaacgtta 30

Claims

실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물과, 이 화합물의 표적 세포로의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드와의 콘쥬게이트를 형성함으로써 상기 화합물의 세포 흡수를 향상시키는 방법으로서, 상기 화합물은 결합을 의도하는 표적 핵산 영역에 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 포함하고, 상기 화합물 내 상기 염기의 스트링에서 적어도 하나의 구아닌 염기를 이노신 염기로 치환하여 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하로 제한하도록 한 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. A method of enhancing cellular uptake of a compound by forming a conjugate with a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound and an arginine-rich peptide effective for enhancing uptake of the compound into target cells, wherein the compound binds A string of bases complementary to at least four contiguous cytosine bases in a target nucleic acid region, wherein the number of contiguous guanine bases in the string is replaced by replacing at least one guanine base in the string of the bases in the compound with an inosine base; Limiting the number to three or less.

제 1 항에 있어서, 이노신 치환은 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 2개 이하로 제한하기에 효과적인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein inosine substitution is effective to limit the number of adjacent guanine bases in the string to no more than two.

제 1 항에 있어서, 적어도 2개의 이노신 염기가 상기 염기의 스트링에서 치환되는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein at least two inosine bases are substituted in the string of said bases.

제 1 항에 있어서, 상기 치환은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 콘쥬게이트의 양이온 교환 수지에 대한 결합 및 그것으로부터의 방출에 관여하는 정제 단계 중 콘쥬게이트의 수용성을 향상시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법. 2. The method of claim 1, wherein said substitution is effective to enhance the water solubility of the conjugate during the purification step involved in binding to and releasing the conjugate to the cation exchange resin, relative to the same conjugate without inosine substitution. How to.

제 1 항에 있어서, 상기 표적 핵산 영역은 mRNA에 개시 코돈을 포함하고, 상기 치환은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, mRNA에 의해 코딩되는 단백질의 전사를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the target nucleic acid region comprises an initiation codon in the mRNA, wherein the substitution enhances the conjugate's ability to block transcription of the protein encoded by the mRNA as compared to the same conjugate without inosine substitution. Characterized in that it is effective to.

제 1 항에 있어서, 상기 표적 핵산 영역은 예비 프로세싱된 mRNA에 도너 또는 리셉터 스프라이스 위치를 포함하고, 상기 치환은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 상기 표적 영역에서 mRNA 스플라이싱을 막는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the target nucleic acid region comprises a donor or receptor splice location in the preprocessed mRNA, wherein the substitution prevents mRNA splicing in the target region relative to the same conjugate without inosine substitution. And is effective for improving the ability of the conjugate.

제 1 항에 있어서, 상기 표적 핵산 영역은 바이러스 복제에 관여하는 바이러스-코딩된 시스-작용 요소를 포함하고, 상기 치환은 이노신 치환이 부재하는 동일한 콘쥬게이트에 비하여, 바이러스 복제를 차단하는 콘쥬게이트의 능력을 향상시키는데 효과적인 것을 특징으로 하는 방법. The conjugate of claim 1, wherein the target nucleic acid region comprises a virus-coded cis-acting element involved in viral replication, wherein the substitution of the conjugate that blocks viral replication as compared to the same conjugate lacking inosine substitution. A method characterized by being effective in improving the ability.

제 1 항에 있어서, 상기 아르기닌-풍부 펩티드는 적어도 6개의 X 서브유닛, 적어도 2개의 Y 서브유닛, 및 최대 3개의 Z 서브유닛을 포함하는, X 서브유닛, Y 서브유닛, 및 선택적 Z 서브유닛으로부터 선택된 8 내지 16 서브유닛을 포함하며, The X subunit, the Y subunit, and the optional Z subunit of claim 1, wherein the arginine-rich peptide comprises at least six X subunits, at least two Y subunits, and at most three Z subunits. 8 to 16 subunits selected from

상기 서브유닛의 >50%는 X 서브유닛이고, > 50% of said subunits are X subunits,

(b) 각각의 Y 서브유닛은 독립적으로 중성 아미노산 -C(O)-(CHR)_n-NH-를 나타내며, (i) n은 2 내지 7이고 각각의 R은 독립적으로 H 또는 메틸이거나, 또는 (ii) n은 1이고 R은 치환 또는 비치환 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 및 아랄킬로부터 선택된 중성 측쇄이며, 치환된 알킬, 알케닐, 및 알키닐로부터 선택되는 경우, 상기 중성 측쇄는 4개의 탄소 원자 마다 최대 하나의 헤테로원자를 포함하며;(b) each Y subunit independently represents a neutral amino acid -C (O)-(CHR) _n -NH-, (i) n is 2 to 7 and each R is independently H or methyl, or (ii) n is 1 and R is a neutral side chain selected from substituted or unsubstituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, and aralkyl, and when selected from substituted alkyl, alkenyl, and alkynyl, said neutral side chain Contains at most one heteroatom every 4 carbon atoms;

(c)각각의 Z 서브유닛은 독립적으로 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 세린, 및 트레오닌으로부터 선택된 아미노산을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.(c) each Z subunit independently represents an amino acid selected from alanine, asparagine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, serine, and threonine.

제 8 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물은 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소 및 인접 서브유닛의 모르폴리노 3-위치에 있는 환외 탄소 사이의 인-함유 연결에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛으로 이루어진 모르폴리노 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법. The morpholino subunit of claim 8, wherein the oligonucleotide analogue compound is linked by a phosphorus-containing linkage between the morpholino nitrogen of one subunit and the extra-focal carbon at the morpholino 3-position of the adjacent subunit. Method comprising a morpholino oligomer consisting of.

제 9 항에 있어서, 상기 모르폴리노 서브유닛은 하기 구조식과 같이, 비하전 포스포로디아미데이트 연결에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 방법. 10. The method of claim 9, wherein the morpholino subunits are joined by uncharged phosphorodiamidate linkages, as shown in the following structural formula.

상기 식에서 Y₁=0, Z=0이고, Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해, 폴리뉴클레오티드 내 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이며, X는 알킬, 알콕시, 티오알콕시, 또는 알킬 아미노이다.Wherein Y ₁ = 0, Z = 0, Pj is a purine or pyrimidine base pair moiety effective for binding to a base in the polynucleotide by base-specific hydrogen bonding, and X is alkyl, alkoxy, thioalkoxy, or Alkyl amino.

(a) 결합을 의도하는 표적 핵산 영역에서 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 포함하는 염기 서열을 갖는 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물, 및 (a) a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound having a base sequence comprising a string of bases complementary to four or more adjacent cytosine bases in a target nucleic acid region intended for binding, and

(b) 상기 화합물에 콘쥬게이트된, 표적 세포로의 화합물의 흡수를 증대시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드를 포함하고,(b) an arginine-rich peptide effective for enhancing uptake of the compound into target cells conjugated to the compound,

화합물 내 상기 염기의 스트링은 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 3개 이하로 제한하기 위해 상기 스트링에 배치된 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하는 치료적 올리고머-펩티드 콘쥬게이트. And wherein said string of bases in the compound comprises at least one inosine base disposed in said string to limit the number of adjacent guanine bases in said string to no more than three.

제 11 항에 있어서, 상기 화합물 내 하나 이상의 이노신 염기의 배치는 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수를 2개 이하로 제한하기 위한 것임을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein the arrangement of one or more inosine bases in the compound is for limiting the number of adjacent guanine bases in the string to two or less.

제 12 항에 있어서, 상기 화합물은 상기 염기의 스트링 내 적어도 2개의 이노신 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 13. The conjugate of claim 12, wherein said compound comprises at least two inosine bases in a string of said bases.

제 11 항에 있어서, 상기 아르기닌-풍부 펩티드는 적어도 6개의 X 서브유닛, 적어도 2개의 Y 서브유닛, 및 최대 3개의 Z 서브유닛을 포함하는, X 서브유닛, Y 서브유닛, 및 선택적 Z 서브유닛으로부터 선택된 8 내지 16 서브유닛을 포함하며, The X subunit, Y subunit, and optional Z subunit of claim 11, wherein the arginine-rich peptide comprises at least 6 X subunits, at least two Y subunits, and at most three Z subunits. 8 to 16 subunits selected from

상기 서브유닛의 >50%는 X 서브유닛이며, > 50% of said subunits are X subunits,

(a) 각각의 X 서브유닛은 독립적으로 아르기닌 또는 아르기닌 유사체를 나타내고, 상기 유사체는 구조식 R¹N=C(NH₂)R²의 측쇄를 포함하는 양이온 α-아미노산이며, 상기식에서 R¹은 H 또는 R이고; R²는 R, NH₂, 또는 NR²이며, R은 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고 산소 또는 질소를 더 포함할 수도 있으며; R¹ 및 R²는 함께 고리를 형성할 수도 있고; 상기 측쇄는 R¹ 또는 R²를 통해 상기 아미노산에 연결되며; (a) each X subunit independently represents an arginine or arginine analog, which analog is a cationic α-amino acid comprising a side chain of the formula R ¹ N = C (NH ₂ ) R ² , wherein R ¹ is H Or R; R ² is R, NH ₂ , or NR ² , R is lower alkyl or lower alkenyl and may further comprise oxygen or nitrogen; R ¹ and R ² may together form a ring; The side chain is linked to the amino acid via R ¹ or R ² ;

(c)각각의 Z 서브유닛은 독립적으로 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 세린, 및 트레오닌으로부터 선택된 아미노산을 나타내는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. (c) each Z subunit independently represents an amino acid selected from alanine, asparagine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, serine, and threonine.

제 14 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물은 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소 및 인접 서브유닛의 모르폴리노 3-위치에 있는 환외 탄소 사이의 인-함유 연결에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛으로 이루어진 모르폴리노 올리고머인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. The morpholino subunit of claim 14, wherein the oligonucleotide analogue compound is linked by a phosphorus-containing linkage between the morpholino nitrogen of one subunit and the extra-focal carbon at the morpholino 3-position of the adjacent subunit. Conjugate, characterized in that consisting of morpholino oligomer.

제 15 항에 있어서, 상기 모르폴리노 서브유닛은 하기 구조식과 같이, 비하전 포스포로디아미데이트 연결에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 16. The conjugate of claim 15, wherein said morpholino subunit is joined by an uncharged phosphorodiamidate linkage, as shown in the following structural formula.

제 11 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이노신 염기가 없는 동일한 콘쥬게이트 보다 콘쥬게이트의 양이온 교환 수지에 대한 결합 및 그것으로부터의 방출에 관여하는 정제 단계 중 더 큰 수용성을 갖는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein said conjugate has greater water solubility during said purification step involving binding to and release from said conjugate to a cation exchange resin than said same conjugate without one or more inosine bases.

제 11 항에 있어서, 예비 프로세싱된 mRNA의 표적 핵산 영역 내 선택된 도너 또는 억셉터 스플라이스 위치에 있는 예비 프로세싱된 mRNA의 프로세싱을 차단할 때 사용하기 위한 콘쥬게이트로서, 상기 하나 이상의 이노신 염기가 없는 동일한 콘쥬게이트 보다 이러한 mRNA 스플라이스-위치 프로세싱을 차단함에 있어서 보다 활성인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein the conjugate is for use in blocking the processing of preprocessed mRNA at a selected donor or acceptor splice position in a target nucleic acid region of the preprocessed mRNA, wherein the same conjugate is free of one or more inosine bases. Conjugates which are more active in blocking such mRNA splice-position processing than gates.

제 11 항에 있어서, 표적 핵산 영역이 바이러스 복제를 위해 필수적인 시스-작용 요소를 포함하는 바이러스로 감염된 세포 내 바이러스 복제를 차단할 때 사용 하기 위한 콘쥬게이트로서, 하나 이상의 이노신 염기가 없는 동일한 콘쥬게이트 보다 이러한 mRNA 스플라이스-위치 프로세싱을 차단함에 있어서 보다 활성인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein the target nucleic acid region is for use in blocking viral replication in a cell infected with a virus comprising a cis-acting element essential for viral replication, rather than the same conjugate without one or more inosine bases. conjugates which are more active in blocking mRNA splice-position processing.

제 11 항에 있어서, 표적 핵산 영역이 개시 코돈을 포함하는 mRNA에 의해 코딩된 단백질의 전사를 차단하는데 사용하기 위한 콘쥬게이트로서, 상기 하나 이상의 이노신 염기가 없는 동일한 동일한 콘쥬게이트 보다 이러한 전사를 차단함에 있어서 보다 활성인 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein the target nucleic acid region is a conjugate for use in blocking transcription of a protein encoded by an mRNA comprising an initiation codon, wherein said target nucleic acid blocks said transcription rather than the same identical conjugate without said one or more inosine bases. In a more active conjugate.

제 20 항에 있어서, 상기 화합물은 (i) 사람 c-myc mRNA의 AUG 개시 위치를 포함하는 영역에 대해 표적하고, (ii) SEQ ID NO:2-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. The compound of claim 20, wherein the compound is targeted to (i) a region comprising the AUG initiation position of human c-myc mRNA, and (ii) comprises a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-10 Conjugate characterized in that.

제 21 항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 22. The conjugate of claim 21, wherein said peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 17 and 18.

제 11 항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. 12. The conjugate of claim 11, wherein said peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 17 and 18.

(a) mRNA 개시 코돈을 포함하는 표적 mRNA 영역에서 4개 이상의 인접 시토신 염기에 상보적인 염기의 스트링을 포함하는 염기 서열을 갖는 실질적으로 비하전된 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물, 및(a) a substantially uncharged oligonucleotide analogue compound having a base sequence comprising a string of bases complementary to at least four contiguous cytosine bases in a target mRNA region comprising an mRNA initiation codon, and

(b) 상기 화합물에 결합된, 이러한 표적 세포로 화합물의 흡수를 향상시키기에 효과적인 아르기닌-풍부 펩티드로 이루어진 치료적으로 유효량의 올리고머-펩티드 콘쥬게이트를 피험체에 투여하는 것을 포함하고, (b) administering to the subject a therapeutically effective amount of an oligomer-peptide conjugate consisting of an arginine-rich peptide that is effective to enhance the uptake of the compound into such target cells,

여기서, here,

(i) 화합물의 염기 서열은 화합물 내 상기 염기의 스트링이 상기 스트링 내 인접 구아닌 염기의 수가 3개 이하로 제한되도록 하기 위해 상기 스트링 내에 배치된 상기 염기의 스트링 내 적어도 하나의 이노신 염기를 포함하고, (i) the base sequence of the compound comprises at least one inosine base in the string of bases disposed within the string such that the string of bases in the compound is limited to three or fewer adjacent guanine bases in the string,

(ii) 콘쥬게이트는 상기 하나 이상의 이노신 염기가 없는 동일한 콘쥬게이트 보다 이러한 전사를 차단하는데 보다 활성인, 피험체 표적 세포 내 c-myc 발현의 억제에 반응하는 병적 상태를 갖는 피험체를 치료하는 방법.(ii) a method of treating a subject having a pathological condition responsive to inhibition of c-myc expression in a subject target cell, wherein the conjugate is more active in blocking such transcription than the same conjugate lacking one or more inosine bases. .

제 24 항에 있어서, 상기 아르기닌-풍부 펩티드는 적어도 6개의 X 서브유닛, 적어도 2개의 Y 서브유닛, 및 최대 3개의 Z 서브유닛을 포함하는, X 서브유닛, Y 서브유닛, 및 선택적 Z 서브유닛으로부터 선택된 8 내지 16 서브유닛을 포함하며, The X subunit, Y subunit, and optional Z subunit of claim 24, wherein the arginine-rich peptide comprises at least 6 X subunits, at least two Y subunits, and at most three Z subunits. 8 to 16 subunits selected from

(a) 각각의 X 서브유닛은 독립적으로 아르기닌 또는 아르기닌 유사체를 나타내며, 상기 유사체는 구조식 R¹N=C(NH₂)R²의 측쇄를 포함하는 양이온 α-아미노산이 며, 상기식에서 R¹은 H 또는 R이고; R²는 R, NH₂, 또는 NR²이며, R은 저급 알킬 또는 저급 알케닐이고 산소 또는 질소를 더 포함할 수도 있으며; R¹ 및 R²는 함께 고리를 형성할 수도 있고; 상기 측쇄는 R¹ 또는 R²를 통해 상기 아미노산에 연결되며; (a) each X subunit independently represents an arginine or arginine analog, which analog is a cationic α-amino acid comprising a side chain of the formula R ¹ N = C (NH ₂ ) R ² , wherein R ¹ is H or R; R ² is R, NH ₂ , or NR ² , R is lower alkyl or lower alkenyl and may further comprise oxygen or nitrogen; R ¹ and R ² may together form a ring; The side chain is linked to the amino acid via R ¹ or R ² ;

(c) 각각의 Z 서브유닛은 독립적으로 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 리신, 메티오닌, 세린, 및 트레오닌으로부터 선택된 아미노산을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법. (c) each Z subunit independently represents an amino acid selected from alanine, asparagine, cysteine, glutamine, glycine, histidine, lysine, methionine, serine, and threonine.

제 25 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 유사체 화합물은 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소 및 인접 서브유닛의 모르폴리노 3-위치에 있는 환외 탄소 사이의 인-함유 연결에 의해 연결된 모르폴리노 서브유닛으로 이루어진 모르폴리노 올리고머인 것을 특징으로 하는 방법. The morpholino subunit of claim 25, wherein the oligonucleotide analogue compound is linked by a phosphorus-containing linkage between the morpholino nitrogen of one subunit and the extra-focal carbon at the morpholino 3-position of the adjacent subunit. Method comprising a morpholino oligomer consisting of.

제 26 항에 있어서, The method of claim 26,

상기 모르폴리노 서브유닛은 하기 구조식과 같이, 비하전 포스포로디아미데이트 연결에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트. The morpholino subunit conjugate, characterized in that coupled by uncharged phosphorodiamidate linkage, as shown in the following structural formula.

제 27 항에 있어서, 상기 화합물은 SEQ ID NO:2-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 27, wherein the compound comprises a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-10.

제 27 항에 있어서, 상기 펩티드는 SEQ ID NO:16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. 28. The method of claim 27, wherein said peptide comprises a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 16, 17 and 18.

제 29 항에 있어서, 상기 화합물은 SEQ ID NO:2-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물. 30. The compound of claim 29, wherein the compound comprises a target sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2-10.

제 24 항에 있어서, 방광암을 치료하는데 사용하기 위해, 상기 콘쥬게이트를 경요도 수송에 의해 투여하며, 방법은 환자에 시스-플라틴 항암 화합물을 더 투여하는 것을 특징으로 하는 방법. 25. The method of claim 24, wherein the conjugate is administered by transurethral transport for use in treating bladder cancer and the method further comprises administering a cis-platin anticancer compound to the patient.

제 24 항에 있어서, 혈관확장술 처리 후 혈관 손상 부위에서의 관상-동맥 재협착의 위험을 감소시키는데 사용하기 위해, 상기 콘쥬게이트를 정맥내 송달에 의해 투여하는 것을 특징으로 하는 방법. 25. The method of claim 24, wherein said conjugate is administered by intravenous delivery for use in reducing the risk of coronary-artery restenosis at the site of vascular injury after vasodilation treatment.

제 32 항에 있어서, 상기 혈관확장술 처리는 혈관 손상의 부위에 스텐트의 배치를 포함하며, 상기 콘쥬게이트를 스텐트로부터의 방출에 의해 투여하는 것을 특징으로 하는 방법. 33. The method of claim 32, wherein the vasodilator treatment comprises placement of the stent at the site of vascular injury, wherein the conjugate is administered by release from the stent.

제 24 항에 있어서, 관상 동맥 바이패스 수술 중에 놓인 두렁 정맥을 보호하는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트는 수술적 배치 전에 정맥을 콘쥬게이트에 노출시킴으로써 투여하는 것을 특징으로 하는 방법. 25. The method of claim 24, wherein the conjugate is administered by exposing the vein to the conjugate prior to surgical placement for use in protecting the dilated vein placed during coronary artery bypass surgery.

제 24 항에 있어서, 다낭신장 질환을 치료하는데 사용하기 위해, 콘쥬게이트를 경구 또는 비경구 투여에 의해 피험체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 24, wherein the conjugate is administered to the subject by oral or parenteral administration for use in treating polycystic kidney disease.