KR20070007842A

KR20070007842A - 신장증가용 조성물

Info

Publication number: KR20070007842A
Application number: KR1020067022206A
Authority: KR
Inventors: 카즈와 나카오; 아키히로 야소다; 히데토모 기타무라
Original assignee: 카즈와 나카오
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2005-03-31
Publication date: 2007-01-16
Also published as: JPWO2005094890A1; EP1743653A4; EP3620530A1; US20080312142A1; EP3446711A1; US8815803B2; JP4972403B2; WO2005094890A1; CN1960757A; JP2012087127A; JP5683434B2; EP1743653A1

Abstract

본 발명은 저신장증 환자 또는 저신장증 환자 이외의 개체에서 신장을 증가시키기 위한 조성물을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성물질을 활성성분으로 함유하는 FGFR3 이상이 없는 개체에 투여하는 신장증가용 조성물이고, GC-B를 활성화함으로써, FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시키기 위한 방법과, GC-B의 활성을 지표로 해서 신장증가제를 선택하는 것을 포함한 신장증가제의 스크리닝 방법 및, GC-B를 활성화함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시키는 방법을 제공한다.

신장증가용 조성물, 구아닐 시클라제 B 활성화물질, 나트륨이뇨 펩티드

Description

신장증가용 조성물 {COMPOSITION FOR INCREASING BODY HEIGHT}

본 발명은 활성 성분으로서 구아닐 시클라제(guanyl cyclase) B (GC-B) 활성화물질을 포함하는 개체의 신장(身長) 증가용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명의 조성물은, FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자에 대한 치료 또는 저신장증 환자 이외의 개체의 신장 증가를 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 GC-B를 활성화함에 의한 신장증가방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 GC-B의 활성을 지표로 사용하는 신장증가제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GC-B를 활성화함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 연장시키는 방법에 관한 것이다.

의학적으로 "저신장증"이라는 용어는 동성 및 동년배의 평균신장보다 2SD (SD : 표준편차) 이하로 정의되고, 이 기준에 해당하는 경우, 저신장증으로 진단되고 있다. 그리고 저신장증은 성장호르몬이나 인슐린과 같은 성장인자-I (IGF-I)의 분비부전 등에 의한 내분비성 저신장증과, 가족성 저신장, 태내 발육부전성 저신장, 염색체 이상 등의 비-내분비성 저신장증, 그리고 약물치료나 방사선요법에 의한 2차성 저신장증으로 대별된다.

종래, 저신장증 또는 왜소발육증의 치료로서 성장호르몬의 투여나, 고관절의 인공관절 치환이나 사지 연장술과 같은 정형외과적 수술이 실행되어 왔다. 사지 연장술은, 10세 이후에 뼈를 잘라 특수한 기계(사지 연장기)로, 반년 정도 걸려 서서히 신장을 늘이는 것이다. 그러나, 이 수술은 환자에 큰 고통을 준다. 또 성장호르몬 요법은 유아기에서부터 정기적인 성장호르몬 주사에 의해 신장 증가가 개선된다; 그러나, 주사를 멈추면 성장이 그치고 만다. 이들 어느 치료법도 병을 고치는 것은 아니고, 환자의 생활환경기준(QOL)의 관점에서 이상적이라고 간주되지 않는다(American Journal of Medical Genetics 1997; 72: 71-76) ; European Journal of Endocrinology 1998; 138: 275-280). 저신장증 중 내분비성 저신장증은 재조합 성장호르몬 또는 IGF-I 등의 약제로 치료할 수 있는 질환이지만, 비내분비성 저신장증인 가족성 저신장증, 태내발육부전성 저신장증의 원인은 분명하지 않고, 성장호르몬은 비내분비성 저신장증에는 효과가 인정되고 있지 않기 때문에, 유효한 치료약은 존재하지 않았다(Merck Manual, 제17판 1999년 Nikkei Business Publications, Inc./Nikkei BP Publishing Center, Inc., Japan). 이러한 상황에서 새로운 메카니즘을 기준으로 하는 치료약의 개발이 요망되고 있다.

구아닐 시클라제(GC)는 GTP으로부터 세컨드 메신저인 cGMP의 합성을 촉매하는 효소과(family)에 속하는 막단백질로서, GC-A, GC-B, …, 및 GC-F가 알려져 있다. GC-B는 주로 혈관내피세포에서 발견되고, 평활근의 이완에 관여한다고 생각되고 있다.

나트륨이뇨(natriuretic) 펩티드(NP)류는, ANP(심방성 소듐 펩티드), BNP(뇌성 나트륨이뇨 펩티드) 및 CNP(C형 나트륨이뇨 펩티드)로 나누어지고, 2종류의 구 아닐 시클라제 컨쥬게이티드 수용체(ANP 및 BNP에 대한 NPR-A, CNP에 대한 NPR-B)를 매개로 세포내 cGMP 농도를 상승시키고, 다시 복수의 cGMP 이펙터 분자의 중개에 의해 세포내 신호전달이 이루어진다고 생각되고 있다(Ann Rev Biochem 1991;60: 229-255). NP류는 체액의 항상성 및 혈압 조절에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있고(J Clin Invest 1987; 93: 1911-1921, J Clin Invest 1994; 87: 1402-1412), 심장혈관계 이외의 여러 가지 조직에서의 발현과 그 생리활성도 알려져 있다(Endocrinol 1991; 129:1104-1106, Ann Rev Biochem 1991; 60: 553-575). 연골에 관해서는, BNP(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998; 95: 2337-2342) 또는 CNP의 관절부위에서의 과잉발현이 섬유아세포 증식인자 리셉터 3 (FGFR3) 유전자의 변이를 가져오는 연골무형성증의 치료에 유효하다는 것이 보고되어 있다(Nat Med., 2004; 10(1): 80-86 ; 일본국 특개 2003-113116 공보).

본 발명의 목적은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 또는 저신장증 환자 이외의 개체의 신장을 치료, 미용 또는 기타 목적을 위해 증가시키기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 GC-B를 활성화함으로써, FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 또는 저신장증 환자 이외의 개체의 신장을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GC-B의 활성을 지표로 해서 신장증가제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GC-B를 활성화함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은, 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화물질의 1종인 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP)가 전신에 발현하고, 혈중농도가 상승하는 CNP 유전자도입 마우스를 제조하고, 신장에 대한 영향 및 성장연골에 대한 영향을 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 CNP 유전자도입 마우스에서 신장증가가 촉진되고 대퇴골 성장연골이 의미있게 비후되고, 또 이들 CNP 유전자도입 마우스의 성상 해석으로부터, 신장증가는 FGFR3 이상이 없는 경우에 CNP가 혈행성에 작용함으로써 촉진된다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 다음을 포함한다:

제 1면에 따르면, 본 발명은 활성성분으로서 GC-B 활성화물질을 함유하고, FGFR3 이상이 없는 개체에 투여되는 신장증가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구현예에서, 상기 조성물은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자에게 사용된다.

본 발명의 다른 구현에에서, 상기 조성물은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 이외의 개체에 사용된다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장(伸張)이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 물질은 펩티드이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 펩티드는 CNP 또는 그것의 유도체이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CNP는 SEQ ID NO:1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO:2의 CNP-53이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유도체가, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 또한 CNP활성을 가진 것이다.

제 2면에 따라, 본 발명은 FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시키기 위해 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는 개체의 신장을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에서, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 GC-B는 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화된다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 또한 CNP활성을 가진 것이다.

제 3면에 따라, 본 발명은 GC-B의 활성을 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 신장증가제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 한 구현예에서, 상기 GC-B의 활성은 세포내 cGMP 생산량으로서 측정된다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 방법은 인간 GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 준비하고, 상기 세포주를 시험물질의 존재하에 또는 비존재하에 배양하고, 상기 세포주에서 새포내 cGMP의 생산량을 측정하고, 그리고 상기 시험물질의 존재하에 그리고 비존재하에 세포내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한, 개체에서 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는, FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 연장시키는 방법을 제공한다.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원 2004-107871호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.

도 1은 CNP 유전자도입 마우스 제조용 벡터의 구축을 나타낸다. 도 1A : pGEM-T Easy 벡터에 조립된 마우스 CNP의 cDNA를 Pst I로 잘라내어 양 말단을 평활화하였다. 도 1B : pSG1을 Eco RI로 처리해서 말단을 평활화하였다. 도 IC: 도 lA에서 얻어진 마우스 CNP의 cDNA를 도 1B에서 얻어진 pSG1에 조립하였다.

도 2는 인젝션용 DNA 단편을 나타낸다. 도 lC의 pSG1-CNP로부터, HindIII 및 XhoI로 처리한 후, CNP 유전자를 포함한 단편(약 2.3 kb)을 잘라내어 인젝션용 단편으로 하였다.

도 3는 CNP 유전자도입 마우스의 유전자형 해석결과를 나타낸다. 야생형 마우스(WT)에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)이 검출되고, 유전자도입 마우스(Tgm)에서는 야생형 CNP 유전자에 더하여 도입유전자 유래의 시그널(트란스유전자)이 2개 검출되었다.

도 4는 CNP 유전자도입 마우스의 성장곡선의 추이를 나타낸다. 암컷의 CNP 유전자도입 마우스(TG)는, 2주령 이후 계속해서 정상의 한배 암컷 마우스(WT)에 대해 의미 있게 비항장(naso-anal length)이 길었다(도 4 A). 수컷에서는, 4주령 이후 계속해서 정상의 한배 마우스(WT)에 대해 의미 있게 비항장이 길었다(도 4B). *: p＜0.05, **: p＜0.01 vs. WT, 대응이 없는(unpaired) 스튜던트 T 시험(Student's t-test).

도 5는 CNP 유전자도입 마우스의 대퇴골 성장연골의 비후를 나타낸다. CNP 유전자도입 마우스(CNP tgm)는, 휴지층(Resting), 증식층(Proliferating), 비대층(Hypertrophy) 및 이들의 합계(Total) 모두에 대해 정상의 한배새끼(Wild 형)에 대해 의미 있게 두꺼웠다. *: p＜0.05, **: p 구 0.01 vs. 야생형, 대응이 없는 스튜던트 T시험.

이하 도면을 참조하면서, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 하기의 실시예 2에 기재된 것과 같이 생산한 CNP 유전자도입 마우스(CNPTgm)에 대해 서던블롯팅(Southern blotting)을 이용해서 유전자형을 해석하였다. 그 결과, 본 발명자들은 도 3에 나타나 있듯이, 야생형 마우스에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)을 검출하였고, CNPTgm에서는 야생형 CNP 유전자에 더해, 도입유전자 유래의 2개의 시그널(트란스유전자)을 검출하였다. CNPTgm에서의 CNP의 발현을 검토하기 위해, 도입한 유전자의 고발현이 예상되는 장기인 간 및 혈장에서의 CNP의 농도를 조사하였다. 그 결과, CNP Tgm은 야생형에 비해, 간에서 약 10배, 혈장에서 약 24배의 CNP 농도를 나타내었고, 통계학적으로 의미 있게 CNP 펩티드가 과잉발현되어 있다는 것을 확인하였다(실시예 4의 표 1).

그리고 암수의 CNPTgm 및 그 정상의 한배새끼의 비항장을, 2 ~ 9 주간에 걸쳐 정기적으로 측정하였다. 결과로서, 암수 모두 CNPTgm는 비항장이 정상의 한배새끼보다도 컸고, 신장이 증가하였다(도 4; A : 암컷, B: 수컷). 따라서, 혈중의 CNP농도를 상승시킴으로써 신장증가가 촉진되는 것이 확인되었다.

대퇴골 슬개면의 성장연골의 휴지층, 증식층, 비대층의 두께의 평균치 및 성장연골의 두께로서 상기 3층의 합계치를 이용해서 CNPTgm의 성장연골의 두께를 조직학적으로 해석하였다. 그 결과, CNPTgm에서는 휴지층, 증식층, 비대층 및 그 합계 모두에 대해 통계학적으로 의미 있게 두껍다는 것이 확인되었다(도 5). CNP는 대퇴골의 연골성 뼈 이외에도, 예를 들면 경골, 요골, 척골 등의 다른 연골성 뼈의 휴지층, 증식층, 비대층 각 층을 두껍게 함으로써도 동물의 신장증가를 촉진하는 것이 나타났다.

따라서, 본 발명은 활성성분으로서 GC-B 활성화물질을 포함하는 개체의 신장증가용 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 FGFR3 이상이 없는 개체에 투여된다.

본 발명에서, "FGFR3 이상"이라는 용어는 FGFR3(섬유아세포 증식인자 리셉터-3) 유전자의 변이에 의한 연골의 성장억제에 기인하는 연골무형성증 및 연골형성 부전증이나, FGFR3 유전자의 변이에 의한 FGFR3의 기능항진을 포함하고, 또 FGFR3의 기능억제 부전, 또는 FGFR3 유전자의 발현항진 등을 원인으로 하는 연골 무형성증 및 연골형성 부전증을 의미한다(일본국 특개 2003-113116, Nat Med 2004, 10(1):80-86, 국제공개 W002/074234).

본 발명의 구현예에서, 상기 조성물은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자에 사용된다. 본 발명에서 용어 "저신장증"은 FGFR3 이상을 제외한 저신장증을 말하고, 예를 들면, (1) 성장호르몬 분비부전성 저신장증(하수체성 소인증), 갑상선 기능저하증, 부신피질 기능항진증 등에 의한 내분비성 저신장증, (2) 가족성 저신장, 태내발육부전성 저신장, 염색체 이상(타나증후군, 프라다·비리 증후군 등) 등에 의한 비내분비성 저신장증 및, (3) 약물치료나 방사선요법에 의한 2차성 저신장증을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 이외의 개체에도 사용될 수 있다. 본 발명은, 미용, 의료 및 스포츠 분야에서 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 이외의 개체에서 사용될 수 있다. 또한, 신장증가를 바라는 인간에의 사용은 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서의 사용이 의도된 개체의 예는 인간을 포함한 포유동물, 예를 들 면 인간, 돼지, 소 등을 포함하지만, 이들의 특정 예로 제한되지 않는다. 바람직한 개체는 인간이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장이다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장이다.

본 발명에서 "구아닐 시클라제 B (GC-B)"라는 용어는 나트륨이뇨 펩티드 수용태 B(NPR-B)와 같은 뜻의 용어로 사용한다.

본 발명에서 "GC-B 활성"이라는 용어는 구아닐 시클라제 활성과 같은 뜻의 용어로 사용된다.

본 발명에서, 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화물질 또는 GC-B 활성화물질은 CNP의 수용체로 알려진 GC-B와 결합해서 이를 활성화하는 펩티드 또는 비펩티드성 저분자화합물로서, 바람직하기는 CNP 펩티드 또는 그 유도체이다. 여기서, 펩티드는 복수의(L-, D- 및/또는 변형)아미노산의 아미드결합 연쇄로 된 물질을 지칭하고, 이 중에는 폴리펩티드 및 단백질도 포함된다. GC-B 활성화물질은, 예를 들면 COS-7 등의 배양세포주에 GC-B 수용체를 발현시키고, 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예를 들면 37℃, 5분) 세포주를 배양하고, 그리고 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252: 120-123)으로 동정될 수 있다. 즉, 이와 같은 분석 시스템을 사용해서 세포내 cGMP의 생산량을 지표로 하여 GC-B 활성화물질을 동정하고, 그를 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, GC-B 활성화물질은 펩티드로서, 바람직하기는 CNP 또 는 그 유도체이다. 바람직한 CNP는, 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는 것으로, 더 바람직하기는, SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 CNP 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되고 또한 CNP 활성을 가진 것이다. 또는, 상기 CNP 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열과 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상의 % 동일성을 가진 배열을 포함하면서 CNP 활성을 가진 것이다.

본 명세서 중에서 사용되는 "1개 내지 수개"라는 용어는, 통상 1 ~ 10, 바람직하기는 1 ~ 5, 더 바람직하기는 1 ~ 3의 임의의 정수를 나타낸다. 또, 2 개의 아미노산배열 사이의 "% 동일성"는 당업자에게 공지의 BLAST 단백질 검색 등의 수법을 이용해서 결정할 수 있다(Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D.J.(1990) " Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215:403-410).

본 발명에서 사용할 수 있는 CNP의 예는, 인간을 포함한 포유류 유래 CNP(CNP-22:Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 168: 863-870, 국제공개 W091/16342, CNP-53: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 170:973-979, 일본국 특개평 4-74198호 공보, 일본국 특개평 4-139199호 공보, 일본국 특개평 4-121190호 공보), 조류 유래 CNP(일본국 특개평 4-120094호 공보), 양서류 유래 CNP(일본 국 특개평 4-120095호 공보) 및, 일본국 특개평 6-9688호 공보, 국제공개 W002/074234에 개시된 CNP 유사체 펩티드와 같은 CNP 유도체를 포함한다.

천연 유래 CNP로서, 각각 22 및 53 아미노 잔기로 된 CNP-22 및 CNP-53 이 알려져 있고, 조류 및 인간을 포함한 포유류 유래의 각 CNP를 비교하면 종을 넘어 배열상동이 높기 때문에, 본 발명에서는 조류 또는 인간을 포함한 포유류 유래의 CNP, 바람직하기는 인간을 포함한 포유류 유래의 CNP, 더 바람직하기는 인간 유래의 CNP가 사용될 수 있다. 인간 CNP-22 및 CNP-53의 아미노산 배열은, 하기의 SEQ ID NO: l 및 SEQ ID NO: 2로 나타내는 배열을 갖고 있고, 또 모두 분자내 이황산염 (disulfide) 결합을 갖고 있다:

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(인간 CNP-22: SEQ ID NO: 1) ; 또는

Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu GIn Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(인간 CNP-53: SEQ ID NO: 2),

여기서, 각각은 인간 CNP-22에서는 6-Cys와 22-Cys 사이에, 또 인간 CNP-53에서는 37-Cys와 53-Cys 사이에 분자내 이황산염 결합을 갖고, 환상 펩티드구조를 형성한다.

돼지 CNP-22 및 래트 CNP-22는 인간 CNP-22와 동일한 아미노산 배열을 갖지만, 한편 돼지 CNP-53 및 래트 CNP-53에는 17 및 28 위치에서 아미노산 잔기가 각 각 His 및 Gly인 것인 반면, 인간 CNP-53에서는 각각 Gln 및 Ala이므로, 2개의 아미노산이 다르다(일본국 특개평 4-139199호 공보, 일본국 특개평 4-121190호 공보, 일본국 특개평 4-74198호 공보). 그리고 또, 닭 CNP-22는 9 위치의 아미노산 잔기 Val 만이 인간 CNP-22와 다르고, 이 외는 동일한 1차 구조를 갖고 있다(일본국 특개 4-120094호 공보).

본 발명에서 사용될 수 있는 CNP는 천연으로부터의 정제된 CNP, 기존의 유전자공학적 방법으로 제조된 재조합 CNP, 기존의 화학합성법(예를 들면 펩티드 합성기를 이용하는 고체상 합성법)으로 제조된 CNP를 포함하고, 바람직하기는 유전자공학적 방법으로 제조된 인간 CNP-22 및 인간 CNP-53이다. 유전자공학적 방법에 의한 인간 CNP의 제조는, 예를 들면 인간 CNP-22 또는 CNP-53의 DNA 배열(일본국 특개평 4-139199호 공보)을 플라즈미드나 파아지 등의 벡터에 조립하여, 대장균이나 효모 등의 원핵 또는 진핵생물 숙주세포로 형질전환한 후, 적합한 배지 중에서 발현시키고, 바람직하기는 세포 밖으로 CNP 펩티드를 분비시켜, 생산한 CNP 펩티드를 회수하여 정제하는 각 공정을 포함한다. 또, 표적 DNA의 증폭을 위해, 폴리머라제 연쇄반응(PCR) 기술을 사용할 수 있다.

유전자 재조합 기술, 부위 특이적 돌연변이 유발법, PCR 기술 등의 기본적인 기술은 당업자에는 공지로서, 예를 들면 J. Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Ausubel 등, Current Protocols In Molecular Biology; John Wiley & Sons(1998) 등에 기재되어 있고, 그곳에 개시되는 기술을 본 발명을 위해 이용할 수 있다. 또 벡터로는, 시판되는 벡터 또는 간행물 기재의 벡터가 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 CNP 유도체는 CNP 활성을 가지며 인간 CNP-22 또는 CNP-53과 동일한 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황산염 결합에 의한 환상 펩티드구조를 갖는다. 상기 CNP의 단편, 상기 CNP 또는 그 단편의 구성 아미노산의 적어도 1개를 다른 아미노산으로 치환한 펩티드, 상기 CNP 그것 또는 그 부분 펩티드의 구성 아미노산의 적어도 1개를 결실한 펩티드 및, 상기 CNP 그것 또는 그 부분 펩티드의 구성 아미노산에 1개 이상의 아미노산을 첨가시킨 펩티드를 포함한다. 아미노산의 치환, 결실, 부가라 함은, CNP 활성을 훼손하지 않는 한 부위특이적 돌연변이 유발법 등의 공지의 방법으로 아미노산을 치환, 결실 또는 부가할 수 있을 정도의 수의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되는 것을 의미한다. 이와 같은 CNP-22 또는 CNP-53의 유도체는, 예를 들면 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되고 또한 CNP 활성을 갖는 것이다.

아미노산의 치환은, 일반적으로 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산은, 예를 들면 극성도(또는 소수성도)나 전하의 종류에 따라 분류될 수 있다. 예를 들면, 비극성, 비하전형 아미노산의 예는 글리신, 알라닌, 발린, 로이신, 이소로이신, 프롤린 등을 포함하고; 방향족 아미노산의 예는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판을 포함하고; 극성, 비하전형 아미노산의 예는 세린, 트레오닌, 시스테인, 메티오닌, 아스파라긴, 글루타민 등을 포함하고; 음으로 하전된 아미노산의 예는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하고; 그리고, 양으로 하전된 아미노산의 예 는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘을 포함한다.

본 명세서 중에서 사용되는 "CNP 활성"이란 용어는 GC-B에 작용해서 구아닐 시클라제 활성을 상승시키는 활성 또는 신장을 의미 있게 증가시키는 활성을 말한다. CNP 활성은 세포의 구아닐 시클라제 활성, 예를 들면 세포 내 cGMP의 생산량을 측정함에 의한 것, 또는 마우스이나 래트 등의 동물에 일정기간 GC-B 활성화물질을 투여한 후, 뒤에 설명되는 실시예 5에 기재되어 있듯이 비항장을 측정하는 것에 의해 결정할 수 있다.

CNP-22 유사 펩티드는 예를 들면 일본국 특개평 6-9688호 공보나 국제공개 W002/074234에 기재된 것과 같은 하기의 환상 펩티드를 포함한다(여기서, 서열 중의 밑줄은 인간 CNP-22로부터의 변이를 나타낸다).

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala Met Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO: 3)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO: 4)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Ala Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO: 5)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO: 6)

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys(SEQ ID NO: 7)

Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO: 8)

Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr(SEQ ID NO: 9)

Cys Phe Gly Xaa Xbb Xcc Arg Ile Gly Xdd Xee Ser Xff Xgg Gly Cys

(여기서, Xaa=Leu, Ile, Val; Xbb=Lys, Leu, Met; Xcc=Leu, Ile, Ala, Val; Xdd=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; Xee=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly; Xff=Gly, Lys, Ala, Leu; Xgg=Leu, Met이다.)(SEQ ID NO: 10)

또, CNP-53 유사 펩티드의 예는 상기의 CNP-22 유사 펩티드의 변이에 대응하는 아미노산 변이를 포함한 환상 펩티드가 포함된다.

본 발명은 또, FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시키기 위해 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는 신장증가방법을 제공한다. 본 발명은, GC-B 활성화물질이 FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시킬 수 있다는 발견을 기초로 한다. 구체적으로는, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장이고, 보다 구체적으로는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장이다. GC-B 활성화물질의 구체적인 예는, 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체이다. CNP는 바람직하기는, 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53으로서, 더 바람직하기는 SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53이다. 또, CNP 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되고 또한 CNP 활성을 갖는 것을 포함한다. 다른 GC-B 활성화물질은, 예를 들면, COS-7 등의 배양세 포주에 GC-B 수용체를 발현시켜, 배지에 후보약제를 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예를 들면 37℃, 5분) 세포주를 배양한 후, 세포 내의 cGMP 생산량을 측정하는 방법(Science 1991; 252: 120-123)으로 동정될 수 있다. 즉, 이와 같은 분석 시스템의 생산량을 지표로 하여 B 활성화물질을 동정하고, 그것을 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, GC-B의 활성을 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는, 신장증가제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 구현예에 따라, GC-B는 상기 정의의 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화될 수 있다. GC-B는 구아닐 시클라제 활성에 의해 GTP으로부터 세컨드 메신저인 cGMP의 합성을 촉매한다는 것이 알려져 있기 때문에, GC-B의 활성은 세포 내 cGMP 생산량으로 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골세포 유래의 세포를 준비하고, 상기 세포를 후보약제의 존재하에서 배양하고, 상기 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝함으로써 이루어지는 방법을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 제조하고, 상기 세포주를 후보약제의 존재하에 또는 비존재하에 배양하고, 상기 세포주의 세포내 cGMP의 생산량을 측정하고, 후보약제의 존재하에 그리고 비존재하에 세포내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 하여 신장증가에 대해 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 예를 들면, COS-7 등의 배양세포주에 GC-B 수용체를 발현시키고, 배지에 시험물질을 첨가하고, 일정한 온도 및 일정한 시간(예를 들면, 37℃, 5분) 세포주를 배양하고, 그리고 세포내의 cGMP 생산량을 측정함에 의해(Science 1991; 252: 120-123) 신장증가제를 스크리닝하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 GC-B를 활성화함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 구현예에서, 연골성 뼈의 신장은 GC-B를 활성화함으로써 인비보, 엑스비보 또는 인비트로에서 촉진될 수 있다. 본 발명의 구현예에서는 바람직하기는 배양 뼈, 배양 연골을 배양할 때 GC-B를 활성화하는 물질을 첨가함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈의 신장을 촉진하는 방법을 포함한다.

본 발명의 조성물은, 활성성분으로서의 상기 정의의 GC-B 활성화물질을, 제약상 허용가능한 담체, 부형제, 첨가제 등과 조합해서 경구투여용 또는 비경구투여용으로 제제화하게 된다.

본 발명의 조성물은 상기 정의의 GC-B 활성화물질을 활성성분으로 함유하고, 추가로 통상적 의약 제제에 사용되는 담체, 부형제 및 기타의 첨가제를 포함한다.

제제용 담체 또는 부형제의 예는 락토스, 스테아린산 마그네슘, 전분, 탈크, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 올리브유, 참기름, 카카오버터, 에틸렌글리콜 등 또는 기타 상용되는 것을 포함한다.

경구투여용 고체조성물의 예는 정제, 환제, 캡슐제, 분말제, 과립제 등을 포함한다. 이와 같은 고체조성물에서는, 적어도 하나의 활성성분이 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 락토스, 만니톨, 포도당, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 미결정성 셀룰로오스, 전분, 폴리비닐 피롤리돈, 마그네슘 알루미노메타실리케이트 등과 혼합된다. 조성물은, 통상적인 방법에 따라 불활성 희석제 이외의 첨가물, 예를들면, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 섬유소 글리콜산 칼슘과 같은 붕해제, 글루타민산 또는 아스파라긴산과 같은 용해보조제를 함유할 수 있다. 정제 또는 환제는, 필요에 따라 슈크로스, 젤라틴, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트 등의 당의나 위용성 또는 장용성 물질의 필름으로 피복될 수 있고, 2개 이상의 층으로 피복될 수 있다. 그리고, 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐도 포함된다.

경구투여용 액체조성물은, 약제학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 엘릭서제 등을 포함하고, 일반적으로 쓰이는 불활성 희석제, 예를 들면, 정제수, 에탄올 등을 포함할 수 있다. 이 조성물은, 불활성 희석제 이외에 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방향제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

비경구투여용 주사제로는, 무균의 수성 또는 비수성의 용액제, 현탁제, 에멀젼화제가 포함된다. 수성의 용액제, 현탁제로는, 예를 들면 주사용 물 및 주사용 생리식염액이 포함된다. 비수성의 용액제, 현탁제로는, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물성유, 에탄올과 같은 알코올류, 폴리솔베이트 80(등록상표) 등이 포함된다. 이와 같은 조성물은, 다시 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예를 들면, 유당), 용해보조제(예를 들면, 글루타민산, 아스파르트산)와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 이들은, 예를 들면, 정밀여과막에 의한 여과멸균, 고압증기멸균과 같은 가열멸균, 또는 살균제 배합 등의 통상적인 멸균방법으로 무균화할 수 있다. 주사제는 용액제제, 또는 사용 전에 용해 재구성될 수 있는 동결-건조 제제일 수 있다. 동결-건조를 위한 부형제로는 예를 들면, 만니톨, 글루코스 등의 당알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는 약제학적으로 일반적으로 사용되는 경구투여방법 또는 비경구 투여방법으로 투여된다. 바람직하기는 비경구 투여방법, 예를 들면, 주사에 의한 투여(피하주사, 정맥주사, 근육주사, 복강 내에의 주사 등으로 투여), 경피투여, 경점막투여(경비투여, 경직장투여 등), 경폐투여 등이다. 경구투여방법도 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물에 함유되는 활성성분인 GC-B 활성화물질, 바람직하기는 앞에서 정의한 CNP 또는 그 유도체의 양은, 치료해야 할 질환의 종류, 질환의 중증도, 환자의 연령 등에 따라 결정할 수 있지만, 일반적으로 0.005 ㎍/kg ~ l00 mg/kg의 범위이고, 바람직하기는 0.02㎍/kg ~ 5mg/kg의 범위이다. 그러나, 본 발명의 GC-B 활성화물질을 함유하는 약제학적 조성물의 투여량이 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 다음을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

(1) 활성 성분으로서 구아닐 시클라제 B(GC-B) 활성화물질을 포함하는, FGFR3 이상을 갖지 않은 개체에 투여되는 신장증가용 조성물.

(2) 저신장증 환자에 사용하기 위한 상기 (1)에 기재된 조성물.

(3) 저신장증 환자 이외의 개체에 사용하기 위한 상기 (1)에 기재된 조성물.

(4) 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장인, 상기 (1) ~ (3) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(5) 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장인, 상기 (1) ~ (4) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(6) 상기 물질은 펩티드인, 상기 (1) ~ (5) 중 어느 하나에 기재된 조성물.

(7) 상기 펩티드는 CNP 또는 그 유도체인, 상기 (6)에 기재된 조성물.

(8) 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53으로부터 선택되는, 상기 (7)에 기재된 조성물.

(9) 상기 CNP는 SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53인, 상기 (7)에 기재된 조성물.

(10) 상기 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 또한 CNP 활성을 가진 것인, 상기 (7)에 기재된 조성물.

(11) FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시키기 위해 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는 신장증가방법.

(12) 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장인, 상기 (11)에 기재된 신장증가방법.

(13) 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장인, 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 신장증가방법.

(14) 상기 GC-B는 CNP 또는 그 유도체에 의해 활성화되는, 상기 (11) ~ (13) 중 어느 하나에 기재된 신장증가방법.

(15) 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53 인, 상기 (14)에 기재된 신장증가방법.

(16) 상기 CNP는 SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53인, 상기 (14)에 기재된 신장증가방법.

(17) 상기 유도체는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 배열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되면서 또한 CNP 활성을 가진 것인, (14)에 기재된 신장증가방법.

(18) GC-B의 활성을 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 신장증가제의 스크리닝 방법.

(19) GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골세포 유래의 세포를 제조하고, 상기 세포를 후보약제의 존재하에 배양하고, 상기 세포의 GC-B 활성을 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 (18)에 기재된 스크리닝 방법.

(20) 상기 GC-B의 활성은 세포 내 cGMP 생산량으로서 측정되는, 상기 (18) 또는 (19)에 기재된 스크리닝 방법.

(21) GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 제조하고, 상기 세포주를 시험물질의 존재하에 또는 비존재하에 배양하고, 상기 세포주의 세포내 cGMP의 생산량을 측정해서, 상기 시험물질의 존재하에 그리고 비존재하에 세포내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 해서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 상기 (18) ~ (20)에 기재된 스크리닝 방법.

(22) GC-B를 활성화함으로써 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시키는 방법.

본 발명은 이하의 실시예에 의해 더욱 상세히 설명될 것이고, 실시예는 단지 예시를 목적으로 한 것으로서 본 발명을 제한하는 의도는 아니다. 그러므로, 본 발명은 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실시예 1: CNP 유전자도입 마우스 제조용 벡터의 구축

도 lA에 도시된 것과 같이, pGEM-T easy vector(Promega 사제)에 뮤린 CNP cDNA(526 bp; FEBS Lett. 276:209-213, 1990)를 서브클로닝하고, 그리고 나서 Pst I로 절단하고, 말단을 평활화해서 마우스 CNP cDNA를 제조하였다. PSG 1 벡터(Promega 사제; 도 1B)를 Eco RI로 절단하고 말단을 평활화하고 뮤린 CNP cDNA으로 결찰하여 SAP-mCNP 벡터(pSGl-CNP)를 제조하였다.

실시예 2: CNP 유전자도입 마우스의 제조

인젝션용 DNA 단편을 다음과 같이 조제하였다. 삽입된 CNP 유전자를 갖는 SAP-mCNP 벡터(pSGI-CNP ; 도 lC)를 HindlII 및 XhoI로 처리한 후, CNP 유전자를 포함하는 단편(약 2.3kb)을 잘라내었다. 그리고 나서, 이 단편을 Gel Extraction Kit(QIAGEN)을 사용하여 수집하고, 3ng/㎕의 농도로 PBS^-로 희석하고, 그것에 의해 인젝션용 DNA 단편을 얻었다(도 2).

DNA 단편이 주입되는 마우스 전핵기란은 다음과 같이 수집하였다. 우선, C57BL/6 암컷 마우스(Clea Japan, Inc.)에 5i.u의 암마혈청성 고나도트로핀(PMSG) 을 복강 내 투여하고, 48시간 후, 5i.u의 인융털막성 고나도트로핀(hCG)을 복강 내 투여함으로써 과배란을 유도하였다. 이 암컷 마우스를 동계통의 수컷 마우스와 교배시켰다. 교배 이튿날 아침, 암컷마우스에서 플러그(plug)의 존재를 확인하고, 이어서 마우스 전핵기란을 수집하기 위해 난관을 관류하였다.

인젝션용 DNA 단편을 현미조작을 이용해서 전핵기란에 주입하였다(Gene Targeting의 최신기술(Yodosha, Japan), 190-207, 2000). DNA 단편을 660개의 C57BL/6J 배아에 주입하고, 다음날 2-세포기에서 발생된 배아 561개를, 허위 임신 l일째의 수용자 암컷의 난관에 한쪽 편당 10개 전후(1마리당 약 20개)를 이식하였다.

분만예정일에 이르러도 새끼를 분만하지 않은 수용자 암컷에 대해서는, 제왕절개를 시술하여 수양부모에게 포육시켰다. 총 136마리 새끼를 얻었고, 그 중의 5 마리는 CNP 유전자가 도입된 유전자도입 마우스(이하, Tgm이라 함)였다. 이하, 최초로 얻어진 마우스를 시조(Founder)로 명명하였다.

시조는 모두 수컷 마우스였고, 이들 5라인 중 4라인으로부터 다음 세대(Fl 마우스)의 새끼를 얻었다.

실시예 3: CNP 유전자도입 마우스의 유전자형 해석

유전자형 해석은 하기 과정에 따라 서던블롯팅법으로 실행하였다.

3주령이 된 마우스의 꼬리(약 l5mm)를 채취해서 프로테나제 K로 처리(55℃, 100rpm에서 l주야 진탕)해서 용해액을 얻었다. 이 용해액을 핵산 자동분리장치(KURABO NA-lOOO)에 걸어 게놈 DNA를 조제하였다. 게놈 DNA 15㎍을 Pvu II(200 U)로 처리하고, 그리고 나서 페놀·클로로포름으로 처리하여 제한효소를 제거하고, 에탄올로 침전시켜 DNA를 수집하였다. 얻어진 DNA를 25μL의 TE에 용해시키고 0.7% 아가로스겔 전기영동(50V 정전압)에 걸고, 영동 종료 후, 겔을 0.25 M HCl 용액으로 15분간 처리해서 DNA를 절단하고, 수세하고 나서 0.4 M NaOH 용액으로 나일론막에 하룻밤 블롯팅 하였다. 그 후, 멤브레인 상의 DNA를 UV 크로스링크법(crosslink method)으로 고정하였다. 멤브레인을 혼성화용액(50% 포름아미드, 0.5 x Denhardt's, 0.5% SDS, 5x SSPE)으로 처리(42℃, 2시간)하고, CNP의 cDNA(약 0.5kb)를 주형으로 하여 BcaBEST Labeling Kit(TaKaRa, Japan)로 조제한 ³²P 표지 프로브를 붙여 42℃에서 하룻밤 혼성화 하였다. 그 후, 세정용액(2 x SSC, 0.1% SDS)으로 55℃에서 20분간 처리하고 나서 Imaging Plate(Fuji Film)에 밤샘 노출시키고, 유전자도입의 시그널을 BAS2000(Fuji Film)로 검출하였다(도 3). 야생형 마우스(WT)에서는 3개의 시그널(야생형 CNP 유전자)이 검출되고, 유전자도입 마우스(Tgm)에서는 야생형 CNP 유전자에 더하여, 유전자도입 유래의 시그널(트란스유전자)이 2개 검출되었다.

실시예 4: CNP 유전자도입 마우스에서의 CNP의 발현

CNP 농도를 측정하기 위해 CNP-22 EIA 측정 키트(PHOENIX PHARMACEUTICALS INC. 사제)를 사용하였다.

7주령의 자웅 CNP 유전자도입 마우스 및, 자웅의 정상 동복 마우스 각 3마리를 에테르마취 하에서 상행대정맥으로부터 전채혈하여 안락사시켰다.

고발현의 유전자도입이 예상되는 장기인 간을 채취하여, 간 중량 0.1 g에 대해, 상기 측정 키트의 EIA 분석 완충액 1mL를 첨가하고, 이어서 빙냉시켰다. 웨어링 블렌더(Waring blender; Physcotron 사제)로 균질화하고, 원심분리(2,000rpm, 5분간)한 후, 상등액을 CNP-22 농도측정 샘플로 사용하였다.

채취한 혈액에 에틸렌디아민테트라아세테이트 4-Na(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan)와 2 트립신-억제 단위의 아프로티닌(Sigma사제)을 첨가하여 교반하여혈장을 분리하여, CNP-22 농도측정 샘플로 사용하였다.

측정결과를 표 1에 나타내었다.

표 1 : CNP 유전자도입 마우스에서의 CNP의 발현

		간 (ng/g 조직)	평균 ± SD	혈장 (ng/mL)	평균 ± SD
야생형	No.1	38.8	29.3 ± 20.5	0.3	0.3 ± 0.06
	No.2	5.9		0.4
	No.3	43.3		0.3
CNP tgm	No.1	293.3	290 ± 81.7^**	10.3	8.0 ± 4.7^#
	No.2	370.0		11.1
	No.3	206.7		2.6

**: p＜0.01(대응이 없는 Student t-test)

#: p＜0.05(Wilcoxon 순위화 검정)

CNP 유전자도입 마우스는 야생형에 대한 평균치 ± 표준편차(mean ± SD)의 비교에서는 간장에서 약 10배, 혈장에서 약 24배의 CNP-22 농도를 나타내고 있는바, 모두 통계학적으로 의미 있는 차이였다. 이들 결과로부터, CNP 유전자도입 마우스에서 CNP 펩티드가 과잉발현되어 있는 것이 확인되었다.

실시예 5: CNP 유전자도입 마우스에서의 성장곡선

자웅의 CNP 유전자도입 마우스 및 그 정상의 한배새끼의 비항장을 2 ~ 9주간에 걸쳐 정기적으로 측정하였다(도 4). 그 결과, 암수 모두 CNP 유전자도입 마우스는 비항장이 정상의 한배새끼 보다도 크고, 신장증가가 촉진되어 있는 것이 판명되었다. 또, 이 결과는 혈중의 CNP 농도를 상승시킴으로써 신장증가가 촉진되는 것도 동시에 나타낸 것이다.

실시예 6: CNP 유전자도입 마우스 성장연골의 조직학적 해석

성장연골의 두께를 조직학적으로 해석할 목적으로, 9주령의 CNP 유전자도입 마우스 및 동복의 정상 마우스의 암컷 5마리를 에테르마취 하에서 후대정맥으로부터 전채혈해서 안락사시켜, 대퇴골을 20% 포르말린으로 1주간 고정하였다. 그 후 20% EDTA-4Na(Junsei Chemical Co., Ltd., Japan) 수용액(pH7.4)에 침지해서 탈회ecdealcification)한 후, 대퇴골 슬개면을 정중선 시상 절단면(midline sagittal section)형상으로 잘라 통상적인 방법으로 파라핀으로 싸서 파라핀블록을 만들었다. 두께 4㎛의 절단면을 마이크로톰(microtome)을 이용해서 더욱 절단하여 파라핀 절단면을 만들고, 헤마톡실린과 에오진(hematoxiline and erosin)으로 염색하였다. 성장연골의 두께는, 대물렌즈 10배에서의 1시야(視野)를 영상소프트웨어(IPAP, Sumika Technoservice, Japan)에 병합시키고, 동 소프트웨어를 이용해서 시야의 5 지점에서 휴지층, 증식층, 비대층의 두께를 측정하고, 값들의 평균치를 산출하여 그 개체의 각 층의 두께로 하였다. 또, 상기 3층의 합계치를 그 개체의 성장연골의 두께로 하였다. 이들 항목에 대해, 정상의 한배새끼와 CNP 유전자도입 마우스 사이에서 평균치 및 표준편차를 산출하고(Microsoft Excel 2000, Microsoft 사제), 대 응이 없는 스튜던트 T 검정에 의해 통계학적 해석을 실행하였다(SAS ver. 6.12; SAS Institute Japan).

CNP 유전자도입 마우스(CNP tgm)에서는, 정상 마우스(야생형)에 비해 휴지층, 증식층, 비대층 및 그 합계(Total) 모두에 대해 통계학적으로 의미 있게 성장연골층이 두꺼운 것이 판명되었다(도 5). 이들 결과로부터, GC-B 활성화물질의 1종인 CNP는 성장연골의 각 층을 두껍게 함으로써, 포유동물의 신장증가를 촉진하는 것이 판명되었다.

활성성분으로서 GC-B 활성화물질을 포함하는 본 발명의 조성물은, FGFR3 이상이 없는 개체에서의 내분비성 저신장증, 비-내분비성 저신장증 및 2차성 저신장증 등의 저신장증을 치료하는 것을 가능하게 한다. 이 조성물은, 성장호르몬이나 인슐린과 같은 성장인자-I (IGF-I)의 주사 또는 골절제술 등의 정형외과적 수술과 비교해서 환자의 부담과 고통이 적어, 환자의 QOL를 배려한 뛰어난 치료제로 될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 FGFR3 이상이 없는 저신장증 환자 이외의 개체에서의 신장용도에 이용할 수 있다. 본 발명은 또 GC-B를 활성화함으로써 인비보, 엑스비보 또는 인비트로에서 FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시킬 수 있다.

본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.

서열 프리텍스트

SEQ ID NO: 1의 설명 : 6-Cys와 22-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성되어 있 다.

SEQ ID NO: 2의 설명 : 37-Cys와 53-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성되어 있다.

SEQ ID NO: 3의 인공서열 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 4의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys의 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 5의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 6의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 1-Cys와 17-Cys의 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 7의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 7-Cys와 23-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 8의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 6-Cys와 22-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 9의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 1-Cys와 17-Cys 사이에 디슬파이드 결합이 형성된다).

SEQ ID NO: 10의 인공서열의 설명 : CNP-22 유도체(여기서, 4-Xaa=Leu, Ile, Val; 5-Xaa=Lys, Leu, Met; 6-Xaa=Leu, Ile, Ala, Val; 11-Xaa=Ser, Ala, Gly, Thr, Asn; 12-Xaa=Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, Gly;14-Xaa=Gly, Lys, Ala, Leu; 15-Xaa=Leu, Met이고, 1-Cys와 17-Cys 사이에 이황산염 결합이 형성되어 있다.).

SEQUENCE LISTING <110> Nakao, Kazuwa <120> Composition for increasing body height <130> PH-2443-PCT <150> JP 2004-107871 <151> 2004-03-31 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 1 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 2 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DISULFID <222> (37)..(53) <223> A disulfide bond is formed <400> 2 Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly 20 25 30 Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met 35 40 45 Ser Gly Leu Gly Cys 50 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 3 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ala 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 4 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Gln Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 5 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Ala Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 6 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (7)..(23) <223> A disulfide bond is formed <400> 7 Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly 1 5 10 15 Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys 20 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (6)..(22) <223> A disulfide bond is formed <400> 8 Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser 1 5 10 15 Met Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 25 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 9 Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Gln Ser Gly Leu Gly 1 5 10 15 Cys Asn Ser Phe Arg Tyr 20 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa is Leu, Ile, or Val <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa is Lys, Leu, or Met <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa is Leu, Ile, Ala, or Val <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa is Ser, Ala, Gly, Thr, or Asn <220> <221> MUTAGEN <222> (12)..(12) <223> Xaa is Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, or Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (12)..(12) <223> Xaa is Met, Ala, Trp, His, Lys, Ser, or Gly <220> <221> MUTAGEN <222> (14)..(14) <223> Xaa is Gly, Lys, Ala, or Leu <220> <221> MUTAGEN <222> (15)..(15) <223> Xaa is Leu or Met <220> <221> DISULFID <222> (1)..(17) <223> A disulfide bond is formed <400> 10 Cys Phe Gly Xaa Xaa Xaa Asp Arg Ile Gly Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Cys

Claims

구아닐 시클라제 B (GC-B) 활성화물질을 활성성분으로 포함하고, FGFR3 이상이 없는 개체에 투여하는 신장(身長)증가용 조성물.
제1항에 있어서, 저신장증 환자에 사용되는 것인 신장증가용 조성물.
제1항에 있어서, 저신장증 환자 이외의 개체에 사용되는 것인 신장증가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장(伸張)인 신장증가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장인 신장증가용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 활성화물질은 펩티드인 신장증가용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 펩티드는 C형 나트륨이뇨 펩티드(CNP) 또는 그것의 유도체인 신장증가용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 및 CNP-53인 신장증가용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 CNP는 SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53인 신장증가용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 유도체는 CNP 활성을 가지면서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열에서 1개 내지 수개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 것인 신장증가용 조성물.
FGFR3 이상이 없는 개체의 신장을 증가시키기 위해 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는, 개체의 신장을 증가시키는 방법.
제11항에 있어서, 상기 신장증가는 연골성 뼈의 신장인 방법.
제11항에 있어서, 상기 신장증가는 대퇴골, 경골, 요골 및/또는 척골의 신장인 방법.
제11항에 있어서, 상기 GC-B는 CNP 또는 그것의 유도체에 의해 활성화되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 CNP는 인간을 포함한 포유류 또는 조류 유래의 CNP-22 또는 CNP-53인 방법.
제14항에 있어서, 상기 CNP는 SEQ ID NO: 1의 CNP-22 또는 SEQ ID NO: 2의 CNP-53인 방법.
제14항에 있어서, 상기 유도체는 CNP 활성을 가지면서, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열에서 1개 내지 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가되는 것인 방법.
GC-B의 활성을 지표로 사용하는 신장증가제용 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 신장증가제의 스크리닝 방법.
제18항에 있어서, GC-B를 발현하는 배양세포 또는 관절연골 세포 유래의 세포를 제조하고, 상기 세포를 후보약제의 존재하에 배양하고, 그리고 상기 세포의 GC-B 활성을 지표로 사용하여 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 GC-B의 활성은 세포 내 cGMP 생산량으로 측정되는 것인 방법.
제18항에 있어서, GC-B를 강제발현시킨 배양세포주를 제조하고, 상기 세포주를 시험물질의 존재하에 또는 비존재하에 배양하고, 상기 세포주의 세포내 cGMP의 생산량을 측정하고, 상기 시험물질의 존재하에 그리고 비존재하에 세포내 cGMP 생산량의 차이를 지표로 하여서 신장증가제의 후보약제를 스크리닝하는 것을 포함하는 방법.
개체에서 GC-B를 활성화하는 것을 포함하는, FGFR3 이상이 없는 연골성 뼈를 신장시키는 방법.