KR20070004725A - 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및부품 키트 - Google Patents

타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및부품 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20070004725A
KR20070004725A KR1020067018925A KR20067018925A KR20070004725A KR 20070004725 A KR20070004725 A KR 20070004725A KR 1020067018925 A KR1020067018925 A KR 1020067018925A KR 20067018925 A KR20067018925 A KR 20067018925A KR 20070004725 A KR20070004725 A KR 20070004725A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
saliva
mrna
disease
biomarker
fluid
Prior art date
Application number
KR1020067018925A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 티 더블유 옹
메이에 에이 알 에스티 존
양 리
Original Assignee
더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 filed Critical 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Publication of KR20070004725A publication Critical patent/KR20070004725A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Abstract

본 발명은 세포 외 mRNA인 생물 마커를 타액에서 검출하는 방법에 관한 것이며, 무세포 타액에서 세포 외 mRNA를 검출하는 것을 포함하며, 타액의 트랜스크립톰 분석은 무세포 타액에서 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 것을 포함하며, 타액을 분석하여 기관 또는 기관내의 유전자의 유전적 변화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 무세포 타액에서 유전자의 트랜스크립톰 패턴 및/또는 mRNA 프로파일링을 검출하는 것을 포함하며, 개체에서 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 제공되며, 이는 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 생물 마커, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 프로파일을 무세포 타액 및/또는 혈청에서 검출하는 것을 포함하며, 상기 방법 중 적어도 하나를 실시하기 위한 생물 마커 적어도 하나를 위한 식별자를 포함하는 키트를 제공하며, 그리고 구강 및/또는 전신 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 타액 생물 마커 및/또는 혈청 mRNA의 용도를 제공한다.
생물 마커, 타액 mRNA 프로파일링

Description

타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및 부품 키트{SALIVARY MRNA PROFILING, BIOMARKERS AND RELATED METHODS AND KITS OF PARTS}
본 발명은 NIH에서 받은 그랜트 U01-DE15018의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 소정의 권리를 갖는다.
본 발명은 생물 마커의 프로파일링 및 상기 생물 마커를 이용하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 및 특히 구강 및 구강 편평 세포 암종(OSCC)의 검출을 위한 생물 마커에 관한 것이다.
생물 마커는 질병의 진행 또는 치료의 효과를 측정하기 위해 이용될 수 있는 특이적 생물 특성, 생화학적 특징 또는 양상의 분자 지표이다.
단백질 및 핵산은 예시적인 생물 마커이다. 구체적으로, 세포 외에서 검출되는 게놈 메신저가 질병을 위한 생물 마커로 작용할 수 있음이 널리 받아들여지고 있다[6]. 특히, 핵산은 혈액, 소변 및 뇌척수액을 비롯한 대부분의 체액에서 확인되었으며, 질병을 위한 진단 생물 마커로 사용하기 위해 성공적으로 적용되었다[28, 42,49].
타액은 혈청의 수동적 "한외여과물"이 아니지만[41], 효소, 호르몬, 항체, 및 다른 분자의 구별되는 조성을 함유한다. 과거 10년 이내에, 진단액으로서 타액 의 사용은 진단학 및 다양한 상태의 위험이 있는 집단을 예측하는 데 있어서 성공적으로 적용되었다.
타액 내의 특이적이고 정보성인 생물 마커는 질병을 진단하고 인간 건강을 모니터링하는데 작용하는 것이 바람직하다[30,47,6]. 예를 들어, 생물 마커는 캐어리, 치주염, 구강암, 타액선 질병, 및 전신성 질환, 예, 간염 및 HIV를 모니터하기 위해 타액에서 확인되었다[35]. 또한 이전의 연구는 사람 DNA 생물 마커가 타액에서 확인될 수 있으며 구강암 검출에 이용될 수 있음을 보여준다[30,36]. RNA는 DNA보다 더욱 유연하며 RNase에 의한 분해에 매우 민감한 것으로 추정된다. 더욱이, RNase 활성은 타액에서 증가되는 것으로 보고되며, 타액은 이상적인 진단 매질로 작용하기에 적합한, 저렴하고 비침입성이며 접근가능한 체액을 구성한다. 구체적으로, RNAse 활성은 암환자의 타액에서 증가되는 것으로 보고된다[83]. 따라서, 사람 mRNA는 타액에서 세포 외에서는 생존할 수 없는 것으로 흔히 추정되었었다. OSCC는 세계에서 여섯 번째로 흔한 암이며 해마다 50,000 명의 미국인에게서 발병한다. 세계적으로, 구강 및 입인두의 암은 큰 공중 보건 문제를 대표한다. OSCC는 인도에서 새로 진단된 모든 암의 거의 50%를 차지하며 프랑스에서 주요 사망 원인이다[1].
지역적 조절의 개선에도 불구하고, 질병률 및 사망률은 지난 30년 동안 거의 개선되지 않았다[2]. 따라서, 이 질병의 초기 검출 또는 방지가 가장 효과적일 것이다. 초기 단계에서 OSCC의 검출은 이 질병으로 인한 사망 및 손상을 감소시키는 가장 효과적인 수단으로 생각된다. 대부분의 머리 및 목 암을 위한 명확한 초기 경고 신호의 부재는 민감하고 특이적인 생물 마커가 고 위험 환자를 스크리닝함에 있 어서 중요할 것임을 제안한다.
첫 번째 양태에 따라, 세포 상 및 유체 상을 포함한 체액 내의 생물 마커를 검출하는 방법이 개시되며, 이때 생물 마커는 세포 외 mRNA이며 체액은 타액, 바람직하게는 비자극 타액이다. 상기 방법은 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 및 체액의 무세포 유체상 부분 내의 세포 외 mRNA를 검출하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 세포 외 mRNA의 검출은 체액의 무세포 유체상 부분으로부터 세포 외 mRNA를 분리하는 단계 및 세포 외 mRNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
두 번째 양태에 따라, 세포 상 및 유체 상을 포함하는 체액의 트랜스크립톰(transcriptome) 분석이 개시되며, 상기 체액은 타액이다. 상기 방법은 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 및 체액의 무세포 유체 상 부분 내의 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계를 포함한다. 체액은 바람직하게는 비자극된 타액이다.
구체적으로, 타액 상등액 내의 트랜스크립톰 패턴의 검출은 바람직하게는 마이크로어레이 분석에 의해 실행되며, 가장 바람직하게는 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석에 의해 실행된다. 타액 상등액 내의 트랜스크립톰 패턴의 검출은 또한 정량성 PCR 분석 또는 RT-PCR 분석에 의해 실행될 수 있다.
세 번째 양태에 따라, 기관으로부터 배출되며 세포 상 및 유체 상을 포함하는 체액을 분석하여 기관 내의 유전적 변형을 검출하는 방법이 개시된다. 체액은 구체적으로 타액이며, 바람직하게는 비자극된 타액이며 상기 방법은 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 체액의 무세포 유체 상 부분 내의 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계; 및 트랜스크립톰 패턴을 선결된 패턴과 비교하는 단계를 포함하며, 선결된 패턴은 체액의 정상 무세포 유체 상 부분의 일반적인 트랜스크립톰 패턴을 나타낸다.
네 번째 양태에 따라, 기관으로부터 배출되며 세포 상 및 유체 상을 포함하는 체액을 분석하여 기관 내의 유전자의 유전적 변형을 검출하는 방법이 개시된다. 체액은 구체적으로 타액이며, 상기 방법은 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 체액의 무세포 유체 상 부분 내의 유전자의 mRNA 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일과 상기 유전자의 mRNA 프로파일을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일은 체액의 정상 무세포 유체 상 부분 내의 유전자의 mRNA 프로파일을 나타낸다.
다섯 번째 양태에 따라, 개체에서 경구 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 타액의 무세포 유체상 부분을 제공하는 단계; 제공된 무세포 타액 유체 상 부분에서 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 유전자의 mRNA 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일과 상기 유전자의 RNA 프로파일을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일은 개체에서 병리학, 질병 또는 질환의 존재를 나타내는 것이다.
첫 번째 구체예에서, 상기 병리학, 질병 또는 질환은 구강 및/또는 구강 인두의 암이며, 체액은 타액이며 유전자는 IL8(인터루킨 8), IL1B(인터루킨 1, 베타), DUSP1(이중 특이성 포스파타제 1), H3F3A(H3 히스톤, 패밀리 3A), OAZ1(오르니틴 디카르복실라제 안티자임 1), S100P(S100 칼슘 결합 단백질 P) 및 SAT(스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸트랜스퍼라제)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
두 번째 구체예에서, 상기 병리학, 질병 또는 질환은 구강 및/또는 구강 인두의 암이며, 체액은 혈청이며 유전자는 IL6(인터루킨 6), H3F3A, TPT1(번역 조절되는 종양 단백질 1), FTH1(페리틴 중 폴리펩티드 1), NCOA4(핵 수용체 보조활성자 4) 및 ARCR(Ras 상동체 유전자 패밀리, 구성원 A)로부터 선택된다.
진단될 수 있는 질병은 구강 인두 편평 세포 암종 및 가능하게는 다른 전신성 질병을 포함한다.
여섯 번째 양태에 따라, 개체에서 구강 또는 전신 병리학, 질병 또는 질환을 질단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 타액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 제공된 무세포 유체 상 부분에서 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계; 및 선결된 패턴과 트랜스크립톰 패턴을 비교하는 단계를 포함하며, 트랜스크립톰 패턴 내에서 선결된 패턴의 특징의 확인은 개체에서 병리학, 질병 또는 질환의 진단이다.
구체예에서, 병리학, 질병 또는 질환은 구강 및/또는 구강 인두의 암이며, 트랜스크립톰은 타액으로부터의 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT를 위한 전사물로 구성되는 군으로부터 선택되는 전사물을 포함한다.
일곱 번째 양태에 따라, 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 개체에서 진단하는 방법이 개시되며, 상기 방법은 개체의 혈청을 제공하는 단계; 제공된 혈청에서 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계; 및 선결된 패턴과 트랜스크립톰 패턴을 비교하는 단계를 포함하며, 트랜스크립톰 패턴에서 선결된 패턴의 특징의 확인은 개체에서 병리학, 질병 또는 질환의 진단이다.
한 구체예에서, 병리학, 질병 또는 질환은 구강 및/또는 구강 인두의 암이며, 트랜스크립톰은 혈청으로부터의 IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR을 위한 전사물로 구성되는 군으로부터 선택된다.
진단될 수 있는 질병은 구강 인두 편평 세포 암종, 가능하게는 다른 전신성 질병을 포함한다.
여덟 번째 양태에 따라, 개체에서 암을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 체액을 제공하는 단계; 체액에서 생물 마커의 프로파일을 검출하는 단계; 생물 마커의 프로파일과 생물 마커의 선결된 프로파일을 비교하는 단계를 포함하며, 생물 마커의 프로파일에서 생물 마커의 선결된 프로파일의 특징의 확인은 암의 진단이다.
진단될 수 있는 병리학, 질병 또는 질환은 구강 인두 편평 세포 암종 및 가능하게는 다른 전신성 질병을 포함한다. 생물 마커는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR을 포함한다.
첫 번째 구체예에서, 병리학, 질병 또는 질환은 구강 인두 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT로 구성되는 군으로부터 선택되며, 체액은 타액이며 생물 마커의 프로파일 검출은 생물 마커의 mRNA 프로파일을 검출하여 실행된다.
두 번째 구체예에서, 병리학, 질병 또는 질환은 구강 인두 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성되는 군으로부터 선택되며, 체액은 혈청이며 생물 마커의 프로파일 검출은 생물 마커의 mRNA 프로파일을 검출하여 실행된다.
세 번째 구체예에서, 병리학, 질병 또는 질환은 구강 인두 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL6이며, 체액은 혈청이며 생물 마커의 프로파일 검출은 생물 마커의 단백질 프로파일을 검출하여 실행된다.
여덟 번째 양태에 따라, 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환의 진단을 위한 키트가 개시되며, 상기 키트는 체액 내의 적어도 하나의 생물 마커의 식별자, IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성된 군으로부터 선택되는 생물 마커, 및 식별자를 위한 검출자를 포함한다.
진단될 수 있는 병리학, 질병 또는 질환은 구강 인두 편평 세포 암종 및 가능하게는 다른 전신성 질병을 포함한다.
식별자 및 검출자는 본원에서 개시된 방법에 따라 생물 마커의 체액 프로파일을 검출하는 데 이용된다. 구체적으로, 식별자는 체액 내의 생물 마커와 연합되며, 검출자는 식별자를 검출하기 위해 이용되어, 식별자와 검출자는 생물 마커의 체액 프로파일의 검출을 가능하게 한다.
아홉 번째 양태에 따라, 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 타액 및/또는 혈청 mRNA를 이용하는 것을 포함한다.
바람직한 구체예에서, mRNA는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성된 군으로부터 선택되는 생물 마커 중 적어도 하나를 암호한다.
진단될 수 있는 질병은 구강 인두 편평 세포 암종 및 가능하게는 다른 전신성 질병을 포함한다.
열 번째 양태에 따라, 구강 및/또는 전신성 병리학을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 타액 또는 혈청 단백질, 특히 혈청 내의 IL6 단백질 및 타액 내의 IL8 단백질을 이용하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법 및 키트는 첨부된 도면의 도움으로 예시될 것이다.
도 1A는 1개월(레인 2), 3 개월(레인 3) 및 6 개월(레인 4)동안 저장 후 사람으로부터의 무세포 타액 상등액에서 분리된 RNA에서 실시된 ACTB를 위한 RT-PCR 타이핑의 결과를 100 bp 래더 분자량 마커(레인 1) 및 음성 대조구(주형 생략)(레인 5)와 함께 보여준다. 분자 크기 마커는 화살표에 의해 도면의 좌측에 표시된다.
도 1B는 사람으로부터의 무세포 타액 상등액으로부터 분리된 RNA에서 실시된 RT-PCR의 결과 및 타이핑 GAPDH(B1), RPS9(B2) 및 ACTB(B3)을 양성 대조구(사람 전체 RNA, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)(레인 2) 및 음성 대조구(주형 생략)(레인 3)과 함께 보여준다. 분자 크기 마커는 화살표에 의해 도면의 좌측에 표시된다.
도 2A는 사람으로부터의 무세포 타액 상등액으로부터 분리된 RNA로부터의 RNA 증폭을 모니터하기 위해 실시된 모세관 전기영동의 결과를 보여준다. 레인 1 내지 5는 1kb DNA 래더(레인 1), RNA 분리 후 5 ㎕ 타액(미검출)(레인 2), 2회 증폭된 cRNA 1 ㎕(200 bp 내지 ~ 4kb 범위), 단편화(약 100 bp) 후 cRNA 1 ㎕(레인 4) 및 암비온 RNA 센츄리 마커(레인 5)를 보여준다. 분자 크기 마커는 화살표에 의해 도면의 좌측 및 우측에 표시된다.
도 2B는 다양한 증폭 단계에서 사람으로부터의 무세포 타액 상등액으로부터 분리된 RNA에서 실시된 PCR 및 ACTB를 위한 타이핑의 결과를 보여준다. 레인 1 내지 8은 100 bp DNA 래더(레인 1), 무세포 타액에서 분리된 전체 RNA(레인 2), 첫 번째 라운드 cDNA(레인 3), RT 후 첫 번째 라운드 cRNA(레인 4), 두 번째 라운드 cDNA(레인 5), RT 후 두 번째 라운드 cRNA(레인 6), 양성 대조구(사람 전체 RNA, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)(레인 7) 및 음성 대조구(주형 생략)(레인 8)을 보여준다. 분자 크기 마커는 화살표에 의해 도면의 좌측에 표시된다.
도 2C는 마이크로어레이에서의 하이브리드화 전에 Agilent 2100 생물분석기에 의해 실시된 표적 cRNA의 분석의 결과를 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축 에서, 마커 RNA를 기준으로 한 단편화된 cRNA의 분자량(bp)이 표시된다. y 축에는, 생물분석기에 의해 측정가능한 단편화된 cRNA의 양(㎍/ml)이 표시된다.
도 3은 래더(Mrkr), 양성 대조구(Ctrl(+)) 및 음성 대조구(Ctrl(-))와 함께 사람으로부터의 무세포 타액 상등액으로부터 분리된 RNA에서 실시된 RT-PCR의 결과 및 IL6(IL6), IL8(IL8) 및 β-액틴(β-액틴)을 위한 타이핑을 보여준다.
도 4는 세포 용해 및 세포내 화합물의 누출을 위한 마커(Mrkr)로서 게놈 DNA를 이용하여 0 x g(0 x g), 1000 x g(1000 x g), 2600 x g(2600 x g), 5000 x g(5000 x g) 및 10000 x g(10000 x g)에서 원심분리된 전체 타액, 혈청 샘플, 및 샘플에서 하우스키핑 β-액틴에 대해 실시된 PCR의 결과를 보여준다.
도 5A는 OSCC를 가진 환자(암) 및 정상 개체(대조구)로부터의 타액에서 qRT-PCR에 의해 복제 샘플에서 검출된 IL8을 위한 mRNA의 평균 농도를 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 샘플 그룹이 보고된다. y 축에는 검출된 카피 수가 보고된다.
도 5B는 OSCC을 가진 환자(암) 및 정상 개체(대조구)로부터의 타액에서 ELISA에 의해 복제 샘플에서 검출된 IL8의 평균 농도를 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 샘플 그룹이 보고된다. y 축에는 pg/ml로 표현된 농도가 보고된다.
도 6A는 OSCC를 가진 환자(암) 및 정상 개체(대조구)로부터의 혈청에서 qRT-PCR에 의해 복제 샘플에서 검출된 IL6을 위한 mRNA의 평균 농도를 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 샘플 그룹이 보고된다. y 축에는 검출된 카피 수가 보 고된다.
도 6B는 OSCC을 가진 환자(암) 및 정상 개체(대조구)로부터의 혈청에서 ELISA에 의해 복제 샘플에서 검출된 IL6의 평균 농도를 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 샘플 그룹이 보고된다. y 축에는 pg/ml로 표현된 농도가 보고된다.
도 7A는 타액 내의 IL8에 대해 계산된 수용체 작동 특징(Receiver Operating Curve)(ROC) 곡선을 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 1-특이성이 보고된다. y 축에는 민감성이 보고된다.
도 7B는 혈청 내의 IL6에 대해 계산된 ROC 곡선을 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 1-특이성이 보고된다. y 축에는 민감성이 보고된다.
도 7C는 타액 내의 IL8 및 혈청 내의 IL6의 조합에 대해 계산된 ROC 곡선을 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 1-특이성이 보고된다. y 축에는 민감성이 보고된다.
도 8은 RPS9(레인 2,3,4); GAPDH(레인 5,6,7); B2M(레인 8,9,10) 및 ACTB(레인 11, 12, 13)을 위한 타액 mRNA의 혈청 사람 mRNA 표현형결정에서 실시된 PCR 반응의 결과를 대조구로서 DNA 래더(레인 1)와 함께 보여준다.
도 9는 혈청 내의 순환 mRNA를 위한 로지스틱(logistic) 회귀 모델의 ROC 곡선을 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 1-특이성이 보고된다. y 축에는 민감성이 보고된다.
도 10은 OSCC를 위한 혈청 mRNA 예측자를 평가하는 분류 및 회귀 트리(CART) 모델을 보고하는 다이아그램을 보여준다.
도 11은 조합된 타액 mRNA 생물 마커의 예측성 파워를 위한 로지스틱 회귀 모델의 ROC 곡선을 보고하는 다이아그램을 보여준다. x 축에는 1-특이성이 보고된다. y 축에는 민감성이 보고된다.
도 12는 OSCC를 위한 타액 mRNA 예측자를 평가하는 분류 및 회귀 트리(CART) 모델을 보고하는 다이아그램을 보여준다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
체액 내의 세포 외 mRNA를 검출하는 방법이 개시되며, 이때 체액은 타액이며 세포 외 mRNA는 타액의 무세포 유체 상 부분에서 검출된다. 타액의 무세포 유체 상 부분내의 RNA 존재는 실시예에서 개시된 과정에 의해 확인하였으며, 검출된 mRNA의 품질은 PCR, qPCR, 및 마이크로어레이 분석과 같은 기법을 위한 요구에 부합된다.
상기 방법에서, 정보성 mRNA라고도 하는 세포 외 mRNA의 검출은 또한 조사성 분석을 위한 이상적인 매질로 작용하기 위한 저렴하고 비침입성이며 접근가능한 체액의 요구를 충족하는 체액, 타액에서 실시된다.
정보성 mRNA의 검출은 특히 미생물 및 음식 찌꺼기와 같은 외인성 물질의 존재가 최소화되어 간단하고 정확한 방식으로 분자를 분석하도록 하는 타액의 부분(무세포 유체 상)에서 실시된다. 바람직하게는, 무세포 유체 상 부분은 비자극 타액으로부터 유래 된다.
상기 방법에서, 타액은 공지의 과정에 따라 수집될 수 있으며 이어서 예를 들어, 수집된 타액의 원심분리에 의해 그 무세포 유체 상을 유도하도록 가공될 수 있으며, 그 결과 침전된 타액 세포 상 및 무세포 타액 유체 상 상등액이 얻어진다(실시예 1, 5 및 13에 개시된 과정 참고).
본 개시 내용에 따라, 타액의 세포 상과 유체 상을 분리하기 위한 조건은 유체 무세포 상에서 검출된 RNA에 기여할, 세포 요소의 기계적 파괴를 피하도록 최적화된다.
상기 분리가 원심분리에 의해 실시되는 구체예에서, 최적의 원심분리 속도를 유도하기 위하여, 세포 용해 및 누출의 마커로서 DNA를 이용하여, 다양한 속도에서 원심분리된 샘플 및 전체 타액 샘플에서 하우스키핑 유전자를 시험하여 최적화를 실시할 수 있다(실시예 5에 개시된 과정 참고).
무세포 타액 유체 상 부분에서 세포 외 mRNA(타액 mRNA)의 검출은 이어서 RT-PCR, Q-PCR 및 마이크로어레이와 같은 공지의 기술에 의해 실시되어 mRNA 정성 및/또는 정량 분석을 허용한다. 상기 검출은 특히 실시예에서 예시된 타액 mRNA의 분리 및 증폭을 포함할 수 있는 과정에 따라 실시될 수 있다.
상기 방법에서 타액 mRNA의 검출은 타액 mRNA를 프로파일링하는 목적을 위해 실시될 수 있다.
첫 번째 시리즈의 구체예에서, 선결된 유전자의 발현은 타액의 무세포 유체 상 부분에서 프로파일될 수 있다. 이들 구체예에서, mRNA 프로파일의 검출은 RT-PCR 또는 선결된 표적 mRNA의 확인을 허용하는 임의 기법에 의해 실시할 수 있다. 이어서 RT-PCR에 의해 확인된 mRNA의 존재를 확인하기 위한 정량적 PCR(Q-PCR)과 같은 기법으로 정량적 분석을 실시할 수 있다. 이어서 그렇게 얻어진 mRNA 프로파 일에 기초하여 기준 데이터베이스를 생성할 수 있다. 타액 mRNA의 그러한 정성 및 정량 분석을 실시하기 위한 예시 과정은 실시예 1, 4 및 9에 상세히 개시된다.
두 번째 시리즈의 구체예에서, 타액의 트랜스크립톰 분석은 타액의 무세포 유체 상 부분에서 트랜스크립톰 패턴을 검출함으로써 실시할 수 있다. 트랜스크립톰 패턴의 검출은 타액 mRNA를 분리하고 선형 증폭 시킴으로서 실시할 수 있으며, 이어서 이를 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이와 같은 기술로 프로파일할 수 있다. 이어서 Q-PCR과 같은 기술로 정량 분석을 실시하여 마이크로어레이에 의해 확인된 패턴 내의 mRNA의 존재를 확인할 수 있다. 이어서 그렇게 얻어진 mRNA 프로파일에 기초하여 기준 데이터베이스를 생성할 수 있다. 그러한 타액 mRNA의 정성 및 정량 분석을 실시 하는 예시적인 과정은 실시예 2-3, 9-10 및 14-15에 상세히 개시된다.
타액 RNA의 프로파일링은 사람 건강 및 질병을 검출 및/또는 모니터하기 위해 또는 예를 들어, 타액 내의 mRNA의 기원, 방출 및 제거와 같은 생물학적 질문을 조사하기 위하여 실시될 수 있다. 타액 mRNA는 구강 및 전신성 병리학, 질병 또는 질환의 위험이 높은 집단 및 환자를 확인하기 위한 실질적 또는 잠재적 생물 마커를 제공한다.
정상 개체의 타액의 무세포 유체상 부분을 특징짓는 타액 mRNA 프로파일 및 트랜스크립톰 패턴의 변화는 다양한 기원의 병리학, 질병 또는 질환을 나타낼 수 있다. 그러한 병리학, 질병 또는 질환의 예는 구강, OSCC의 염증 상태 또는 당뇨병, 유방암 및 HIV와 같은 다른 상태에 의해 제공된다.
또한 결정된 병리학, 질병 또는 질환에 걸린 개체의 mRNA 프로파일과 트랜스크립톰 패턴 사이의 비교는 결정된 병리학, 질병 또는 질환을 위한 정보성 생물 마커의 확인을 야기할 수 있다. 구체적으로, 타액 mRNA는 구강에서 확대될 수 있는 구강 및 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 위한 진단 생물 마커로 이용될 수 있다.
특히, 타액 mRNA는 구강에서 확대되거나 및/또는 구강에 영향을 주는 암을 위한 진단 생물 마커로 이용될 수 있다. 타액에 기초한 mRNA 분석은 신뢰성 있는 진단을 위해 필요한 특이성 및 민감성을 갖는다.
다양한 형태의 암의 경우에, 정상 타액 mRNA 및 트랜스크립톰 패턴의 변화는 또한 종양의 존재와 관련된 구강의 하나 이상의 부분에서의 유전적 변형을 반영할 수 있다. 구강 암 환자의 경우, 검출된 암-관련 RNA 시그너쳐는 세 가지 주요 공급원의 각각(타액선, 잇몸 틈새 액, 및 구강 점막 세포)에서 오는 전체 타액 내의 그 자체를 추가로 반영하는 매치된 종양 및/또는 전신성 반응(국소 또는 말단)에서 기원할 가능성이 있다. 질병-관련 RNA는 잇몸 틈새 액을 통한 순환 또는 타액선을 통해 구강내로 찾아오는 것으로 생각된다. 좋은 예는 유방암 환자의 타액에서 HER-2 단백질의 존재 증가이다[87].
정상 타액 핵심 트랜스크립톰(NSCT)이라고도 불리는, 약 185개의 상이한 사람 mRNA를 비롯한 정상 무세포 타액의 일반적인 트랜스크립톰이 정상 개체로부터의 타액의 무세포 유체 상에서 실시된 트랜스크립톰 분석의 결과에서 확인되었다(실시예 2, 표 2 참고).
NSCT는 단지 약 19000개의 사람 유전자를 나타내는 HG U133A 마이크로어레이 상의 프로브 세트를 이용하여 확인되었으며 사람 게놈은 30000개를 넘는 유전자로 구성되므로[48], 보다 많은 사람 mRNA가 다른 방법에 의해 타액에서 확인될 것이며 본원에서 개시된 방법에 의해 추가의 타액 패턴이 확인가능하다.
정상 집단으로부터의 무세포 타액에서 NSCT 및/또는 다른 타액 트랜스크립톰 패턴은 정상 건강 검진뿐만 아니라 질병 진단에서의 가능한 적용을 위하여, 타액 트랜스크립톰 진단(SlvTD)에서 이용될 수 있다.
따라서, SlvTD의 첫 번째 구체예에서, 개체에서 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 타액의 무세포 유체상 부분을 제공하는 단계; 제공된 무세포 타액 유체 상 부분에서 질병과 관련된 유전자의 mRNA 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일과 상기 유전자의 RNA 프로파일을 비교하는 단계를 포함하며, 이때 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일은 개체에서 질병의 존재를 나타내는 것이다.
SlvTD의 두 번째 구체예에서, 개체에서 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 타액의 무세포 타액 상등액을 제공하는 단계; 무세포 타액 상등액 부분에서 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계; 및 선결된 패턴과 트랜스크립톰 패턴을 비교하는 단계를 포함하며, 트랜스크립톰 패턴내에서 선결된 패턴의 특징의 확인은 개체에서 병리학, 질병 또는 질환의 진단이다.
SlvTD의 세 번째 구체예에서, 선결된 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 생물 마커를 확인하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 병리학, 질병 또는 질환에 걸린 개 체의 타액의 무세포 유체 상 부분내의 선결된 유전자의 첫 번째 mRNA 프로파일링을 검출하는 단계; 정상 개체의 타액의 무세포 유체 상 부분내의 선결된 유전자의 두 번째 mRNA 프로파일링을 검출하는 단계; 첫 번째 mRNA 프로파일링과 두 번째 mRNA 프로파일링을 비교하며 첫 번째 mRNA 프로파일링과 두 번째 mRNA 프로파일링 사이의 차이를 확인하는 단계를 포함하며, 상기 차이는 통계적 분석에 의해 확인되고, 선결된 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 선결된 유전자의 확인을 나타낸다.
구체적으로, 한 가지 질병 카테고리와 한 가지 건강한 카테고리로부터의 RNA 프로파일링 사이의 차이는 마이크로어레이 통계적 방법에 의해 분석된다. 이용되는 알고리즘은 MAS 5.0, DNA-칩 분석기 1.3 및 RMA 3.0을 포함한다. 바람직하게는, 상기 분석은 보다 강력하고 정확한 마커를 시험에 제공하기 위한 이들 방법의 조합에 의해 실시된다. 마이크로어레이에 의해 확인된 마커는 Q-PCR과 같은 종래의 기법에 의해 시험될 것이다.
SlvTD의 네 번째 구체예에서, 진단 방법이 실시될 수 있으며, 이때 무세포 타액이 생물 마커의 존재 또는 발현에 대한 식별자와 접촉되며, 생물 마커의 존재 또는 발현에 관련된 식별자의 존재는 바람직하게는 검출자에 의해 검출된다.
SlvTD는 치료가 성공적일 정도로 충분히 초기 단계에서 종양과 같은 질병의 검출을 허용하며, 스크리닝 도구는 높은 민감성과 높은 특이성의 조합된 특징을 나타낸다. 더욱이, 스크리닝 도구는 광범위한 적용성을 허용할만큼 충분히 비침입성이고 저렴하다.
SlvTD의 상기 방법의 결과는 mRNA 및/또는 단백질 수준 및/또는 혈청과 같은 다른 체액에서 실시되는 해당 분석과 통합될 수 있다.
혈청에서 검출된 단백질 또는 트랜스크립톰 패턴과 같은 생물 마커는 또한 정상 건강 검진뿐만 아니라 질병 진단에서의 가능한 적용을 위해 혈청 트랜스크립톰 진단(SrmTD)에서 작용할 수 있다. SrmTD의 구체예는 SlvTD를 위해 전술한 것에 해당하는 방법을 포함하며, 이때 분석되는 체액은 무세포 타액 대신 혈청이다.
구체적으로, SlvTD 후 얻어진 결과는 조합된 타액 및 혈청 트랜스크립톰 방법(SSTD)에서, SrmTD에서 얻어진 결과와 조합될 수 있다.
SSTD에 따라 진단 방법이 실시될 수 있으며, 이때 체액, 혈청 및/또는 타액은 생물 마커의 존재 또는 발현에 대한 식별자와 접촉되며, 이때 생물 마커는 단백질 또는 mRNA일 수 있으며 생물 마커의 존재 또는 발현과 관련된 식별자의 존재는 바람직하게는 검출자에 의해 검출된다.
SlvTD, SrmTD 및 SSTD의 예는 OSCC를 기준으로 제공된다. 당업자는 본 명세서를 읽을 경우 OSCC외의 다른 질병을 위해 본원에서 예시된 STD의 적절한 변형을 유도할 수 있다.
두 가지 특이적 사이토카인인 IL6 및 IL8의 프로파일링을 실시예 4-8에 개시된 과정에 따라, OSCC를 가진 환자의 타액 및 혈청의 무세포 유체 상 부분에서 측정하였다. IL8은 OSCC를 가진 환자의 타액에서 보다 높은 농도로 검출되었으며(P<0.01) IL6은 OSCC를 가진 환자의 혈청에서 보다 높은 농도로 검출되었다(P<0.01). 이들 결과는 mRNA 및 단백질 수준에서 확인되었으며, 결과는 일치하였 다. 타액내의 IL8의 농도 및 혈청내의 IL6의 농도는 성, 연령, 또는 알콜 또는 담배 사용과 관련되는 것으로 보이지 않았다(P>0.75). 데이터를 통계 분석, 특히 ROC 분석을 실시하여, OSCC를 검출하기 위한 각 생물 마커의 역치값, 민감성 및 특이성을 결정할 수 있었다(실시예 8, 표 3 참고). 더욱이, 발명자들은 타액 시료에서 mRNA를 측정할 수 있었다.
OSCC를 가진 환자 및 정상 개체로부터 수집된 비자극 타액의 트랜스크립톰 분석을 실시예 9-12 및 실시예 13-16에 개시된 대로 실시하였다.
RNA 분리를 타액 상등액으로부터 실시하고, T7 RNA 폴리머라제를 이용한 2 라운드 선형 증폭을 실시하였다. 사람 게놈 U133A 마이크로어레이를 사람 타액 트랜스크립톰의 프로파일링을 위해 적용하였다. 상이한 유전자 발현 패턴을 10명의 매치된 암 환자 및 대조구에서 t 테스트 비교와 배수 변화 분석을 조합하여 분석하였다. 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 이용하여 마이크로어레이에 의해 상당한 차이를 나타낸(P<0.01) 선택된 유전자를 확인하였다. 이들 타액 mRNA 생물 마커의 예측력을 수용체 작동 특징 곡선 및 분류 모델에 의해 분석하였다.
첫 번째 세트의 마이크로어레이 분석의 결과는 암 환자와 대조구 사이에서 타액내의 상당히 상이한 발현 수준을 나타낸 1679개 유전자가 있음을 보여주었다(P<0.05). OSCC 타액에서 적어도 3.5-배 증가를 나타낸 7개의 암-관련 mRNA 생물 마커(P<0.01)는 OSCC 환자(n =32) 및 대조구(n =32)로부터의 타액 샘플에서의 qPCR에 의해 일치하게 확인되었다. 이들 타액 RNA 생물 마커는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S-100P 및 SAT의 전사물이다. 이들 생물 마커의 조합은 대조구로부터 OSCC를 구별하는 데 있어서 민감성(91%), 및 특이성(91%)를 생산하였다(실시예 13-16 참고).
두 번째 세트의 마이크로어레이 분석의 결과는 그들의 보고된 암-관련성에 기초하여 선택된 상향-조절된 10개의 유전자 중 다섯 개가 OSCC 환자의 혈청에서 상당히 증가된 전사물을 나타냄을 보여주었다. 이들 RNA 생물 마커는 H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR의 전사물이다. qPCR에 의해 확인된 결과는 이들 다섯 개의 유전자의 전사물이 OSCC 환자의 혈청에서 크게 증가되었음을 확인하였다(윌콕손 사인된 랭크 시험(Wilcoxon Signed Rank test), P<0.05).(실시예 9 내지 12 참고).
개시된 수집 및 처리 프로토콜을 이용하여, RT-PCR에 의해 모든 혈청(환자 및 대조구)에서 ACTB, B2W, GAPDH 및 RPS9 mRNA의 존재를 확인하였다.
따라서, 개체내의 암, 특히 OSCC를 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 개체의 체액을 제공하는 단계; IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성된 군으로부터 선택되는 생물 마커의 프로파일을 체액에서 검출하는 단계; 및 생물 마커의 프로파일을 생물 마커의 선결된 프로파일과 비교하여 생물 마커의 선결된 프로파일의 특징이 생물 마커의 프로파일에서 인식되면 암의 진단이 되는 단계를 포함한다.
또한, 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환, 특히 OSCC를 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 구강 및/또는 전신성 질병을 위한 생물 마커로서 타액 mRNA, 특히 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P 및 SAT로 구성되는 군으로부터 선택되는 타액 mRNA를 이용하는 것을 포함한다.
추가로, 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환, 특히 OSCC를 진단하는 방법이 개시된다. 상기 방법은 구강 및/또는 전신성 질병을 위한 생물 마커로서 혈청 mRNA 및/또는 단백질, 특히 IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성된 군으로부터 선택되는 혈청 mRNA 및 혈청 IL6 단백질을 이용하는 것을 포함한다.
암발생의 다인자적 특성과 발암 경로의 이종성을 고려할 때, 질병을 검출하기 위하여, 보다 높은 특이성 및 민감성을 보장하면서, 타액 및/또는 혈청 생물 마커의 조합을 이용하는 것이 바람직하다. 보고된 다수 통계적 전략 및 실시예에서 개시된 위험 모델을 이용하여 OSCC 환자 샘플을 식별할 수 있는 생물 마커의 조합을 확인하고 환자의 특이적 암 위험을 위한 적절한 혈청 트랜스크립톰-계 진단의 할당을 촉진할 수 있다.
타액의 무세포 유체 상 부분 및/또는 혈청과 같은 다른 체액내의 타액 mRNA의 프로파일의 모니터링을 OSCC 환자의 수술 후 관리에 이용할 수 있다. 이것은 치료의 효능, 또는 치료가 끝난 후 질병 재발을 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. 타액 mRNA 및 특히 IL8은 또한 구강암을 가진 환자의 치료를 지시하기 위한 예후적 지시자로 작용할 수 있다. 고위험 환자는 보다 공격적이거나 보조적 치료 요법을 지시받을 수 있다.
이들 생물 마커의 이용은 또한 종양의 단계를 개선시킬 수 있다. 종래의 기법을 이용하여, 미시적 원격 질병(microscopic distant disease)의 존재는 종종 확인되지 않는다. 최근에는, 추정되는 지역적 국소적 질병에 대해 치료된 환자를 위해 국소적 실패에서 멀리 떨어진 실패로의 이전이 있었다[18]. 이것은 부분적으로 는 치료의 개시에 앞서 존재하는 무증상의 원격 질병의 반영이다. 생물 마커의 존재의 시험은 정상 조직의 배경에서 소량의 종양 세포의 검출을 허용할 수 있다. 두경부 종양에 특이적인 생물 마커로서 타액 mRNA 또는 그러한 생물 마커 패널은 원격 미시적 질병의 검출을 허용할 수 있다. 구강 암의 경우, 이 양태에서 STD 접근법의 가장 중요한 적용 중 하나는 구강 악성전 병변의 암 전환을 검출하는 것이다.
타액 mRNA의 프로파일링은 또한 암의 발생에서 유전자의 역할을 조사하기 위해 이용될 수 있으며, 특히 이들 유전자의 비정상 발현이 기능적으로 사람 OSCC의 발생에 기여하는 지를 조사하기 위해 이용될 수 있다. 두경부/구강암에서 이들 유전자의 차등 발현의 생물학적 중요성이 결정되어야 한다. 암환자에서 일치되게 변하는 암관련 유전자의 확인은 진단 마커뿐만 아니라 두경부암 발생에 관련된 분자 프로파일에 대한 정보를 제공할 것이다. 임의의 특정 암에서 분자 변화의 프로파일의 이해는 그 암의 결과적인 표현형을 분자 사건과 상관시키는 것이 가능해질 것이므로 극히 유용할 것이다.
본원에서 개시된 방법과 관련된 부분들의 키트가 또한 개시된다. 예시적인 구체예에서, 키트는 타액 mRNA 또는 단백질 및 혈청 mRNA 또는 단백질과 같은, 체액내의 생물 마커의 식별자, 및 식별자를 위한 검출자를 포함하며, 상기 생물 마커는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성되는 군으로부터 선택되며, 상기 식별자와 검출자는 본원에서 개시된 방법 중 하나의 생물 마커의 체액 프로파일을 검출하는 데 이용되며, 이때 식별자는 체액 내의 생물 마커에 연합되며, 검출자는 식별자를 검출하기 위해 이용되 어, 식별자와 검출자는 생물 마커의 체액 프로파일의 검출을 가능하게 한다.
상기 체액은 타액일 수 있으며, 검출은 그 무세포 유체 상 부분 또는 혈청과 같은 다른 체액에서 실시된다.
식별자 및 식별자를 검출할 수 있는 검출자는 당업자가 확인가능하다. 키트에 적합하게 포함될 수 있는 다른 조성물 및/또는 성분은 또한 당업자에 의해 확인가능하다.
식별자와 시약은 식별자 및/또는 시약이 적합한 비히클, 담체 또는 보조제와 함께 포함되는 조성물 하나 이상에 포함될 수 있다.
여기서 개시된 진단 키트에서, 제제와 식별자 시약이, 본원에서 개시된 방법을 실시하기 위하여, 적합한 설명서 및 다른 필요 시약과 함께 키트에 제공될 수 있다. 키트는 대개 별도의 용기내에 상기 조성물을 함유할 것이다. 설명서, 예를 들어, 분석을 실시하기 위한, 테입 또는 CD-ROM과 같은 전자적 지지체 또는 종이 상의 기록되거나 청각적인 설명서가 키트에 포함될 것이다. 키트는 또한 이용되는 구체적인 방법에 따라, 다른 포장된 시약 및 물질(즉, 세척 완충액 등)을 함유할 수 있다.
조성물의 적합한 담체 제제 또는 보조제의 확인, 및 키트의 제조 및 패키징에 관한 추가의 상세 사항은 본 명세서를 읽으면 당업자가 확인할 수 있다.
본원에서 개시된 부분들의 키트는 특히 진단 목적을 위해 이용될 수 있다. 그 결과, 병리학, 질병 또는 질환의 비침입성 진단 검출 및 특히 환자의 구강 및 구강 인두암의 비침입성 진단 검출이 개시된다.
타액의 유체 상의 이용은 박리된 세포의 사용에 비해 독특한 잇점을 갖는다. 종양의 위치에 따라, 종양 베드에 쉽게 접근하여 스왑할 수 없을 수도 있다. 타액 생물 마커가 종양이 기원한 부위를 확인할 수 없음에도 불구하고, 이들은 위험한 환자를 확인할 수 있다. 그러한 타액 시험은 상부 호흡소화기의 주의 깊은 평가를 위해 다른 병원으로 보낼 환자를 선택하기 위한 스크리닝 도구로서 원격 위치에서 비전문가에 의해 투여될 수 있다. 초기 단계에 발견하면, 이전에 검출되지 않았던 질병은 궁극적으로 생명을 구할 수 있다. 더욱이, 쉽게 접근가능한 생물 마커의 이용은 큰 집단 또는 화학암 예방 시험에서 매우 유익함을 입증할 수도 있다. 이것은 일상적인 치과 방문 또는 질병의 발생 위험이 높은 개인의 표적화된 스크리닝 동안 계획될 수도 있다. 가정용 시험 키트 또한 가능할 수 있다.
또한 혈액 시험의 사용은 암 조기 검출에 대해 구체적으로 계획된다. OSCC를 진단하는 IL6 mRNA 및 단백질, H3F3A mRNA, TPT1 mRNA, FTH1 mRNA, NCOA4 mRNA 및 ARCR mRNA와 같은 종양 유전적 변화의 특징을 나타내는 암 환자의 혈청내의 무세포 순환 mRNA 또는 단백질 생물 마커의 회수는 구강암 발생 위험이 높은 개인의 표적화된 스크리닝 또는 혈액 작업을 이용한 일상적인 의사의 방문동안 소량으로 존재하는 OSCC의 존재를 위한 스크리닝 시험으로 계획될 수 있다. 가정용 시험 키트 또한 생각할 수 있다.
구체적으로, 말초 혈액을 일상적인 임상 과정을 이용하여 개체로부터 얻을 수 있으며, mRNA와 단백질을 분리할 수 있으며, 바람직하게는 최적화된 과정이 본원에서 개시된다. 각 사이토카인을 위한 실시간 정량 PCR 및 ELISA를 IL6와 같은 하나 이상의 생물 마커에 대해 실시할 것이다.
본원에서 개시된 방법의 예상되는 구체예는 구강액내의 분자 생물 마커의 초민감 검출을 위한 미세-/나노-전기 기계적 시스템(MEMS/NEMS)의 궁극적인 생성에 대한 것이다. 확인된 OSCC 생물 마커를 위한 RNA 및 단백질 발현은 암 검출을 위한 표적으로 선택될 것이다. 다수의 OSCC 생물 마커를 위한 mRNA와 단백질의 동시 검출을 위한 이들 검출 시스템의 통합은 구강액에 기초한 암 진단을 위한 효율적이고, 자동화되며, 수용할만한 시스템을 생성할 것이다.
본 발명의 방법 및 키트에 사용될 시약, 조건, 조성물, 기술에 대한 추가의 상세 사항은 본 명세서를 읽을 경우 당업자가 알 수 있다.
다른 병리학, 질병 및 질환의 조사 및 진단과 관련된 mRNA 프로파일링 및 트랜스크립톰 분석을 위해, 본원에서 개시되고 OSCC 및/또는 HSNCC에 연합된 것으로 예시된 STD 방법 및 키트의 적절한 변형은 본 명세서를 읽을 경우 당업자가 만들 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 상세히 개시하기 위하여 제공된다. 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되는 바람직한 모드를 개시하는 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며 제한하는 것이 아니다.
실시예 1 : 정상 공여체의 무세포 타액으로부터 RNA 분리, 증폭 및 유전자 발현 프로파일링
정상 개체
UCLA 기관 리뷰 보드에 의해 승인된 프로토콜에 따라, 캘리포니아주 로스앤젤레스의 캘리포니아대학의 의학 센터에서, 이비인후과학, 두경부 수술 분과로부터의 10명의 정상 공여자로부터 타액 샘플을 얻었다. 다음과 같은 포함 기준을 이용하였다: 연령 30세; 악성, 면역결핍, 자가면역 질환, 간염, HIV 감염 또는 흡연의 병력이 없음. 연구 집단은 6명의 남성과 4명의 여성으로 구성되었으며, 평균 연령은 42세였다(32세 내지 55세).
관련 유체 상을 얻기 위한 타액 수집 및 처리
간행된 프로토콜[38]에 따라 아침 9시에서 10시 사이에 비자극 타액을 수집하였다. 개체는 타액 수집에 앞서 적어도 한 시간 동안 식사, 음주, 흡연 또는 구강 위생 과정을 금하도록 요청하였다. 타액 샘플을 4 ℃에서 15분간 2600 x g에서 원심분리하였다. 타액 상등액을 세포 상으로부터 분리하였다. RNase 억제제(Superase-In, Ambion Inc., Austin, TX, USA) 및 프로테아제 억제제(Aprotinin, Sigma, St.Louis, MO, USA)를 이어서 무세포 타액 상등액에 첨가하였다.
무세포 타액으로부터 RNA 분리
제조자로부터의 변형된 프로토콜을 이용하여 무세포 타액 상등액으로부터 RNA를 분리하였다(QIAamp Viral RNA kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). AVL 완충액 (2240 ㎕)와 잘 혼합된 타액(560 ㎕)을 실온에서 10분간 항온처리하였다. 순수 에탄올(2240 ㎕)을 첨가하고 용액을 1분동안 6000 x g에서 원심분리시켜 실리카 컬럼을 통과시켰다. 이어서 컬럼을 두번 세척하고, 20000 x g에서 2분동안 원심분리하고, 2분동안 9000 x g에서 30 ㎕의 RNase없는 물로 용출시켰다. RNA의 분액을 제조 자의 설명에 따라 RNase없는 DNase(DNase I-DNA-없음, Ambion, Inc., Austin, TX, USA)로 처리하였다.
분리된 RNA의 안정성을 1,3, 및 6 개월동안 저장 후 액틴-β(ACTB)를 위한 RT-PCR 타이핑에 의해 검사하였다. 도 1A에 보고된 결과는 분리된 mRNA가 -80℃에서 6개월 이상동안 상당한 분해 없이 보존될 수 있음을 보여준다.
분리된 RNA의 품질을 세 가지 하우스-키핑 유전자 전사물인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH), 액틴-β(ACTB) 및 리보좀 단백질 S9(RPS9)에 대한 RT-PCR에 의해 검사하였다. PRIMER3 소프트웨어(http://www.genome.wi.mlt.edu)를 이용하여 프라이머를 고안하고 하기와 같이 상업적으로 합성하였다(Fisher Scientific, Tustin, CA, USA): GAPDH를 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로서 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; ACTB를 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로서 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; RPS9를 위한 서열번호 5 및 서열번호 6으로 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머. RNA의 양은 Ribogreen® RNA 정량화 키트(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 이용하여 추정하였다. 결과는 도 1B에 나타나며, 여기서 GAPDH(B1), RPS9(B2) 및 ACTB(B3)는 시험된 모든 10 가지 경우에서 일치하게 검출되어, 모든 10개의 타액 샘플이 하우스 키핑 유전자인 GAPDH, ACTB 및 RPS9를 암호하는 mRNA를 함유함을 입증하였다.
이들 유전자의 mRNA는 -80 ℃에서 6개월 이상동안 큰 분해없이 보존될 수 있 었다(도 1A에 보고된 ACTB를 위한 결과 참고).
표적 cRNA 제조
분리된 RNA를 본 실험실로부터의 공개된 방법(Ohyama et al., 2000)에 따라 선형 증폭시켰다. 요약하면, T7 -올리고-(dT)24(서열번호 53)를 프라이머로 이용한 역전사를 실시하여 첫 번째 쇄 cDNA를 합성하였다. 인비트로 전사(IVT)의 첫 번째 라운드를 T7 RNA 폴리머라제(Ambion, Inc., Austin, TX, USA)를 이용하여 실시하였다. BioArrayTM 고수율 RNA 전사물 라벨링 시스템(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)를 cRNA 생성물을 비오틴화하기 위해 두 번째 라운드의 IVT를 위해 이용하였다. 라벨된 cRNA를 GeneChip® 샘플 정화 모듈(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 정제하였다.
cRNA의 양 및 품질을 분광학 및 젤 전기영동에 의해 결정하였다. 도 2A에 보고된 아가로즈 젤 전기영동 시험의 예시적인 결과는 RNA 증폭의 상이한 단계에서 증폭된 cRNA의 상이한 양을 보여준다.
분리 및 증폭 단계의 각각으로부터의 소량을 이용하여 RT-PCR에 의한 품질 평가에 이용하였다. 도 2B에 보고된 예시적인 결과는 RNA 증폭의 다양한 단계에서 실시된 PCR 타이핑 ACTB를 보여주며, 이때 예상된 단일 밴드(153 bp)는 타액 RNA 증폭 과정의 매 주요 단계에서 검출될 수 있다.
단편화된 cRNA의 품질(Kelly, 2002에 의해 개시된 대로 제조됨)은 또한 2100 생물분석기(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용한 모세관 전기영동 에 의해 평가하였다. 도 2C에 보고된 예시적인 결과는 적절한 단편화를 입증하는 좁은 범위에서(50-200bp) 하나의 단일 피크를 보여준다.
표적화된 cRNA 제조에서 유전자 발현 프로파일링
유전자 발현 프로파일링은 10명의 정상 공여자로부터 얻은 무세포 타액에서 실시하였으며, 이때 평균적으로 60.5 ± 13.1 ng(n=10)의 전체 RNA를 560 ㎕ 무세포 타액 샘플로부터 얻었다. 결과는 표 1에 보고된다.
Figure 112006066644219-PCT00001
전체 RNA 양은 560 p.L 무세포 타액 상등액내의 RNA이며; cRNA 양은 T7 증폭2 라운드 후이다. 프로브의 수는 HG U133A 마이크로어레이상의 존재 콜을 보여준다(검출 p<0.04). 존재 퍼센티지(P%) = 존재 콜에 할당된 프로브의 수/전체 프로브의 수(HG U133A 마이크로어레이의 경우 22283).
T7 RNA 선형 증폭의 2 라운드 후, 비오틴화된 cRNA의 평균 수율은 A260/280 = 2.067 ± 0.082를 갖는 42.2 ± 3.9 ㎍이었다(표 1). cRNA는 단편화 전에 200 bp 내지 4 kb 범위였으며; 단편화 후 약 100 bp로 집중되었다. cRNA 프로브의 품질은 하이브리드화 전에 모세관 전기영동에 의해 확인하였다. 원래 샘플 및 각 증폭 단계로부터의 생성물에서의 PCR/RT-PCR을 이용하여 ACTB mRNA는 검출가능하였으며 생성된 아가로즈 전기영동 패턴은 도 2B에 나타난 것과 비교가능하였다; 첫 번째 cDNA, 첫 번째 인비트로 전사(IVT), 두 번째 cDNA 및 두 번째 IVT.
실시예 2 : 정상 공여체의 무세포 타액으로부터의 mRNA 의 마이크로어레이 프 로파일링
실시예 1에 보고된 대로 타액을 수집하고 처리하였으며, RNA를 분리하였다. 또한, RNA의 안정성, 품질 및 양을 실시예 1에 보고된 대로 평가하였다.
HG-U133TA 마이크로어레이 분석
~ 19000개 유전자를 나타내는 22215개의 사람 유전자 cDNA 프로브 세트를 함유하는 아피메트릭스 사람 게놈 U133A 어레이(즉, 각 유전자는 하나보다 많은 프로브 세트에 의해 나타내질 수 있음)를 유전자 발현 프로파일링을 위해 적용하였다. 에러이 데이터를 마이크로어레이 스윗(MAS) 소프트웨어(Affymetrix)를 이용하여 정규화하고 분석하였다. 검출 p-값을 각 프로브 세트에 대해 얻었다. p<0.04를 갖는 임의의 프로브 세트에 "존재함"을 할당하여, 매칭되는 유전자 전사물이 신뢰성있게 검출됨을 나타냈다(Affymetrix, 2001). 각 어레이상의 존재하는 프로브 세트의 전체 수를 얻고 존재하는 유전자의 존재 퍼센티지(P%)를 계산하였다. 유전자 존재학 마이닝 도구(www.netaffx.com)를 이용하여 선택된 유전자(모든 10개 어레이에 존재함, p<0.01)에서 기능적 분류를 실시하였다.
22283 cDNA 프로브를 함유하는 HG U133A 어레이를 이용하여 10명의 정상 개체의 타액 mRNA 프로파일을 얻었다. 평균 3143 ± 665.0 프로브 세트(p<0.04)가 각 어레이에서 존재 콜이 할당되는 것으로 발견되었다(n = 10). 이들 프로브 세트는 약 3000개의 상이한 mRNA를 나타낸다. 평균 존재 콜 퍼센티지는 14.11 ± 2.98%(n = 10)였다. 10개의 어레이로부터의 데이터를 포함하는 기준 데이터베이스가 생성되었다. GAPDH, ACTB 및 RPS9를 나타내는 프로브 세트는 모든 10개의 어레이상에 존재 콜을 할당하였다. 검출 p<0.01로 모든 10 어레이상의 존재 콜이 할당된 185개 유전자를 나타내는 전체 207개 프로브 세트가 있었다. 이들 10개 유전자는 생물학적 과정에서 그들의 공지 역할 및 분자적 기능을 기초로 분류되었다. 10명의 정상 공여자로부터의 무세포 타액내의 185개 유전자의 생물학적 과정 및 분자 기능(유전자 존재학 마이닝 도구를 이용하여 얻은 데이터)이 표 2에 보고된다.
생물학적 과정a 유전자, nb 분자 기능a 유전자, nb
세포 성장 및/또는 유지 119 결합 118
대사 93 핵산 결합 89
생합성 70 RNA 결합 73
단백질 대사 76 칼슘 이온 결합 12
뉴클레오티드 대사 10 기타 결합 23
기타 대사 18 구조적 분자 95
세포 조직화 및 생물생성 2 리보좀 구성원 73
항상성 3 세포골격 구성원 17
세포 사이클 5 근육 구성원 2
세포 증식 11 폐물 15
수송 5 수송자 4
세포 이동 8 효소 20
세포 통신 34 시그널 전달 10
외부 자극에 대한 반응 19 전사 조절자 7
세포 부착 3 번역 조절자 5
세포-세포 시그널링 5 효소 조절자 5
시그널 전달 17 세포 부착 분자 1
폐물 8 분자 기능 미지 61
발생 18
사멸 2
생물 과정 미지 11
한 가지 유전자는 다수의 분자 기능을 갖거나 상이한 생물 과정에 참여할 수 있다. 많은 유전자가 소정의 그룹/서브그룹으로 분류될 수 있다. 185개 유전자의 주요 기능은 세포 성장/유지(119개 유전자), 분자 결합(118개 유전자) 및 세포 구조 조성(95개 유전자)에 관련된다. 이들 185개 유전자를 "정상 타액 핵심 트랜스크립톰(NSCT)"로 명명하였다.
실시예 3: 정상 공여자의 무세포 타액으로부터의 마이크로어레이 프로파일링의 Q- PCR 확인 및 정량 분석
실시예 2에서 실시된 마이크로어레이 분석을 Q-PCR에 의한 정량적 유전자 발현 분석을 통해 확인하였다.
Q- PCR 에 의한 정량적 유전자 발현 분석
실시간 정량적 PCR(Q-PCR)을 이용하여, 실시예 2에서 보고된 마이크로어레이 프로파일링에 의해 검출된 185개의 "정상 타액 핵심 트랜스크립톰" 유전자로부터 선택된 유전자를 정량하여 타액내의 사람 mRNA의 존재를 확인하였다. 모든 10개 어레이에서 존재 콜이 할당된 유전자 IL1B, SFN 및 K-ALPHA-1를 확인을 위해 임의로 선택하였다.
iCyclerTM 열 순환기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 Q-PCR을 실시하였다.
분리된 타액 RNA(증폭 없음) 2 ㎕ 분액을 MuLV 역전사효소(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 cDNA로 역전사하였다. 생성된 cDNA(3 ㎕)를 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용한 PCR 증폭에 이용하였다. 시그마-제노시스(Woodlands, TX, USA)에 의해 다음과 같이 프라이머를 합성하였다: 인터루킨 1, 베타(IL1B)를 위한 서열번호 7 및 서열번호 8과 같은 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; 스트라타핀(SFN)을 위한 서열번호 9 및 서열번호 10과 같은 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; 튜뷸린, 알파, 유비퀴터스(K-ALPHA-1)을 위한 서열번호 11 및 서열번호 12와 같은 보고된 첨부된 서열 목록을 갖는 프라이머. 특이적 PCR 생성물을 위해 맞춰진 조건으로 모든 반응을 세벌로 실시하였다. 특정 주형의 cDNA의 초기 양은 LightCycler 소프트웨어 3.0(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 표준 곡선으로부터 외삽하였다. 표준 곡선에 의한 정량을 위한 상세한 과정은 이전에 개시되었다(Ginzinger, 2002).
Q-PCR 결과는 IL1B, SFN 및 K-ALPHA-1의 mRNA를 모든 10개의 원래의 비증폭된 무세포 타액에서 검출가능함을 보여주었다. 이들 전사물의 상대적인 양(카피 수)은 다음과 같다: IL1B를 위해 8.68 X 103 ± 4.15 X 103; SFN을 위한 1.29 X 105 ± 1.08 X 105; 및 K-ALPHA-1을 위한 4.71 X 106 ± 8.37 X 105. Q-PCR에 의해 측정한 이들 유전자의 상대적인 RNA 발현 수준은 마이크로어레이에 의해 측정한 것과 유사하였다(데이터 제시안함).
실시예 4 : OSCC 환자의 무세포 타액에서 IL6 및 IL8 mRNA 분리 증폭 및 발현의 분석
환자 선별
캘리포니아 대학, 로스앤젤레스(UCLA) 의학 센터(Los Angeles, CA); 남가주 대학(USC) 의학 센터(Los Angeles, CA); 및 캘리포니아 대학, 샌프란시스코(UCSF) 의학 센터(San Francisco, CA)의 두경부 수술 분과로부터 6개월동안 환자를 수집하였다.
구강(OC) 또는 구강 인두(OP)의 일차 T1 또는 T2 편평세포 암종의 기록을 가진 32명의 환자를 이 연구에 포함시켰다. 모든 환자가 최근에 일차 질병으로 진단받았으며, 화학치료, 방사선치료, 수술 또는 대체 요법의 형태의 어떤 이전 치료도 받지 않았다. 비교할만한 흡연 이력을 가진 동일한 수의 연령 및 성의 개체를 대조 비교군으로 선택하였다.
두 개의 개체군 사이에서, 평균 연령(표준 편차, SD): OSCC 환자, 49.3(7.5)세; 정상 개체, 48.8(5.7)세(스튜던트 t 테스트 P>0.80); 성별(스튜던트 t 테스트 P>0.90); 또는 흡연 이력(스튜던트 t 테스트 P>0.75)면에서는 큰 차이가 없었다. 어떤 개체도 이전의 악성, 면역결핍, 자가면역 질환, 간염, 또는 HIV 감염의 병력을 가지지 않았다. 대조군 내의 개인 각각은 두경부 전문의가 건강 검사를 실시하여 의심스러운 점막성 병변이 없음을 확실히 하였다.
타액 수집 및 처리
모든 환자들의 동의를 얻었다. 타액 및 혈청 획득 과정은 각 기관의 기관 리뷰단에 의해 승인되었다: 캘리포니아 대학, 로스앤젤레스(UCLA) ; 남가주 대학(USC); 및 캘리포니아 대학, 샌프란시스코(UCSF).
OC 또는 OP SCCA를 가진 32명의 환자 및 32명의 병에 걸리지 않은 연령- 및 성별-매치되는 대조구 개체로부터의 타액을 사이토카인 농도의 비교를 위해 얻었다.
개체들은 타액 수집에 앞서 적어도 한 시간 동안 금식, 금주, 금연, 또는 구강 위생 제품의 사용 금지가 요구되었다. 타액 수집은 5 cc 타액의 전체 제공을 위해 Navazesh and Christensen[7]의 "배출(군침흘리기)" 방법을 이용하여 실시하였다. 타액 샘플을 Sorvall RT6000D 원심분리기(DuPont, Wilmington, DE)에 의해 4 ℃에서 15분 동안 3500 rpm(2600 x g)에서 원심분리시켰다. 이어서 유체 상을 제거하고, RNAse(Superase-In, RNAse 억제제, Ambion Inc.,Austin, TX) 및 프로테아제(Aprotinin, Sigma, St.Louis, MO; 페닐메틸설포닐플루로이드, Sigma, St.Louis, MO; 소듐 오르토바나데이트, Sigma, St.Louis, MO) 억제제를 즉시 얼음에서 첨가하였다. 타액의 세포 상과 유체 상의 분리를 위한 조건을 최적화하여 유체 상에서 검출되는 mRNA에 기여하는 세포 요소의 기계적 파열을 막았다. 이어서 모든 샘플을 DNAse(DNAseI-DNA-없음, Ambion Inc.,Austin, TX)로 처리하였다. 세포 침전물을 보유하고 -80℃에서 저장하였다.
무세포 타액으로부터 RNA 분리
이어서 타액 상등액 560 ㎕를 QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트(QIAGEN, Chatsworth, CA)를 이용하여 처리하였다. 제조자의 설명서에 따라 RNA를 추출하였다. 샘플을 공기 건조시키고 디에틸 피로카보네이트로 처리된 물에 재현탁시키고 즉시 사용하기 위해 얼음에 보관하거나 -80 ℃에 저장하였다. RNA 분액을 제조자의 설명서에 따라 RNAse가 없는 DNAse(DNAseI-DNA-없음, Ambion Inc.,Austin, TX)로 처리하였다. RNA 농도를 분광법에 의해 측정하고, 포름알데히드를 함유한 아가로즈젤에서의 전기영동에 의해 강도를 확인하였다.
역전사 효소- 폴리머라제 연쇄 반응
타액내의 유체 상내의 IL6 및 IL8 mRNA 전사물의 존재를 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 시험하였다.
각 샘플로부터의 RNA를 2.5 U의 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소(Applied Biosystems Inc.(ABI, Foster City,CA)) 및 50 pmol의 임의 헥사뉴클레오티드(ABI, Foster City,CA)를 함유한 반응 혼합물 40 ㎕에서 45분 동안 42 ℃에서 역전사시켰다. 공개된 서열에 기초하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 하기와 같이 PCR을 위해 피셔 사이언티픽(Tustin,CA)에서 상업적으로 합성하였다: β-액틴을 위한 서열번호 13 및 서열번호 14와 같은 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; IL8을 위한 서열번호 15 및 서열번호 16과 같은 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머; 및 IL6을 위한 서열번호 17 및 서열번호 18과 같은 보고된 첨부된 서열 목록의 서열을 갖는 프라이머.
상보성 DNA(cDNA)의 증폭은 95 ℃에서 20초, 60 ℃에서 30초, 및 72 ℃에서 30초의 50 사이클 및 이어서 7분동안 72 ℃의 최종 연장 사이클을 이용하여 실시하였다. PCR 생성물의 특이성은 예측된 크기 및 제한 분해에 의해 입증하였다. 반응의 특이성을 확립하기 위하여, 입력 RNA가 생략되거나 RNA는 이용되지만 역전사효소가 생략되는 음성 대조구를 이용하였다. 양성 대조구로서, mRNA를 전체 타액선 RNA로부터 추출하였다(사람 타액선 전체 RNA, Clontech, Palo Alto, CA). RNA 품질을 보장하기 위하여, 모든 제제를 발현 분석시켰다.
이렇게 실시된 RT-PCR 연구는 타액 및 혈청이 IL6 및 IL8을 암호하는 mRNA를 함유함을 보여주었다. 도 3에서 보고된 예시적인 결과는 선택된 프라이머로부터 예상된 크기(IL6을 위해 95bp 및 IL8을 위해 88 bp)의 PCR 생성물을 보여준다. 같은 크기의 생성물이 양성 대조구에서 발현되었다.
분석된 RNA와 단백질이 타액의 유체 상으로부터만 오며 세포내 성분에 의한 오염이 없음을 확실히 하기 위하여, 타액 샘플을 위한 원심분리 속도를 최적화하였다. 전체 타액 샘플, 및 세포 용해 마커로서 그리고 세포내 성분 누출의 마커로서 DNA를 이용하여 다양한 속도에서 원심분리된 샘플상의 하우스키핑 유전자 β-액틴 및 유비퀴틴을 위한 PCR을 실시하였다. 상기 결과는 타액 샘플을 위한 적절한 원심분리 속도가 2600 ± 52 x g이며, 바람직한 속도가 2600 x g(예시적인 결과는 도 4에 보고됨)임을 지지한다.
실시예 5 : OSCC 환자의 혈청에서 IL6 및 IL8 mRNA 분리, 증폭 및 발현의 분석
환자는 실시예 4에 개시된 대로 선별하였으며, 여기서는 혈청내에 IL6 및 IL8 mRNA의 존재를 분석하였다.
혈청 수집 및 처리
OC 또는 OP SCCA를 가진 19명의 환자, 및 32명의 병에 걸리지 않은 연령- 및 성별-매치되는 대조구 개체로부터의 혈청을 사이토카인 농도의 비교를 위해 얻었다. 개체 그룹간에서는, 연령, 성별, 알콜 소비, 또는 흡연 이력면에서 큰 차이는 없었다(P>0.75).
처리에 앞서 대조구 개체와 환자로부터 혈액을 얻었다. Sorvall RT6000D 원심분리기(DuPont, Wilmington, DE)에 의해 15 ℃에서 10분 동안 3000 rpm(1000 x g)에서 전혈을 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 이어서 혈청을 분리하고, RNAse(Superase-In, RNAse 억제제, Ambion Inc.,Austin, TX) 및 프로테아제(Aprotinin, Sigma, St.Louis, MO; 페닐메틸설포닐플루로이드, Sigma, St.Louis, MO; 소듐 오르토바나데이트, Sigma, St.Louis, MO) 억제제를 즉시 얼음에서 첨가하였다.이어서 모든 샘플을 DNAse(DNAseI-DNA-없음, Ambion Inc.,Austin, TX)로 처리하였다. 분액을 추가 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
역전사 효소 - 폴리머라제 연쇄 반응
혈청내에 IL6 및 IL8 mRNA 전사물의 존재를 상기 실시예 4에 개시된 대로 실시한 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 시험하였다.
그렇게 실시된 RT-PCR 연구는 혈청이 IL6 및 IL8을 암호하는 mRNA를 함유함을 보여주었으며, 전기영동 젤 패턴은 도 3에 나타난 것과 비교할만하였다.
분석된 RNA 및 단백질이 단지 혈청의 유체상만으로부터 온 것임을 확실히 하고 세포내 성분에 의한 오염이 없음을 확실히 하기 위하여, 혈청 샘플을 위한 원심분리 속도를 타액 샘플을 위한 실시예 4에 개시된 동일한 방법을 따라 최적화하였다. 그 결과는 1000 ± 20 x g의 타액 샘플을 위한 최적의 원심분리 속도를 지지하며 1000 x g가 바람직한 속도이다.
실시예 6 : OSCC 환자로부터의 타액내의 IL6 및 IL8 사이토카인 수준 분석
IL6 및 IL8 mRNA 전사물이 타액내의 유체 상에 존재함을 증명하였으므로, 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 및 ELISA를 이용하여 OSCC를 가진 환자와 병에 걸리지 않은 개체의 타액내의 IL6 및 IL8의 수준을 검사하고 비교하였다.
OSCC를 가진 32명의 환자와 32명의 연령- 및 성별-매치되는 대조구 개체로부터 타액을 얻었다. 개체군 사이에서, 연령, 성별, 알콜 소비 또는 흡연 이력에는 큰 차이가 없었다(P>0.75).
환자 및 정상 개체로부터의 타액에서 IL6 및 IL8 mRNA 농도의 정량을 위한 실시간 PCR
RT-PCR의 결과를 정량적으로 분석하기 위하여, 정량적 실시간 PCR(Bio-Rad iCycler, Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)을 이용하였다. 각 샘플을 세벌로 시험하였다. 증폭 반응을 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 이용하여 20 ㎕ 혼합물에서 실시하였다. 95 ℃에서 3분동안 초기 변성 후, 60 ℃에서 20초간, 72 ℃에서 20초간, 그리고 83 ℃에서 20초간 50 PCR 사이클을 실시하고, 이어서 95 ℃에서 1분 및 이어서 55 ℃에서 최종 1분 연장을 실시하였다. 각 웰로부터 분액을 취하여 아가로즈 젤에서의 전기영동에 의해 확인하여 생성물의 특이성을 확실히 하였다.
RT-PCR 결과는 도 5A에 나타난 다이아그램에 의해 예시된다. 그러한 결과는 mRNA와 단백질 수준 둘다에서 IL8이 대조구 개체와 비교할 때 OSCC를 가진 환자의 타액에서 더 높은 농도로 검출되었음을 보여준다(t 테스트, P<0.01). OSCC 환자와 질병없는 대조구로부터의 타액 사이에는 IL8 mRNA 발현의 양에서 큰 차이가 있었다. 평균 카피 수는 OSCC 그룹을 위해서는 1.1 X 103이고, 대조군을 위해서는 2.6 X 101 이었다. 두 그룹간의 차이는 통계적으로 매우 유의했다(P<0.0008).
mRNA 수준에서 IL6의 타액 농도에서는 큰 차이는 발견되지 않았다. 샘플 크기 연구에서, 발명자들은 또한 흡연 개체와 비흡연 개체 사이에 차이를 검출할 수 없었다.
환자 및 정상 개체로부터의 타액에서 IL6 및 IL8 단백질 농도의 정량을 위한 ELISA
IL6 및 IL8을 위한 ELISA 키트를 제조자의 설명서에 따라 이용하였다(Pierce Endogen, Rockford, IL). 각 샘플을 두 가지 중복 실험의 각각에서 두벌로 시험하였다. 비색 반응의 발생 후, 450 nm에서의 흡광도를 8 채널 분광계(EL800 유니버셜 미세플레이트 판독기, BIO-TEK Instruments, Inc., Winooski, VT)에 의해 정량하고, 흡광도 판독값을 각 분석에서 재조합 사이토카인에서 얻어진 표준 곡선에 기초하여 pg/ml로 전환하였다. 만일 흡광도 판독값이 표준 곡선의 선형 범위를 초과하면, ELISA 분석을 상등액의 연속 희석 후에 반복하였다. 각 샘플을 적어도 두 개의 ELISA 실험에서 시험하고, 데이터를 각 샘플을 위한 시험의 평균으로부터 계산하였다.
ELISA 결과는 도 5B에 나타난 다이아그램에 의해 예시된다. OSCC 환자의 타액내의 IL8의 수준(720 pg/dL)은 대조군의 타액내의 수준(250 pg/dL)보다 상당히 더 높았다(P<0.0001). 타액내의 IL8 단백질의 증가된 수준이 OSCC 환자의 타액내의 전체 단백질 수준의 증가로 인한 것이 아님을 확실히 하기 위하여, 두 그룹에서 타액내의 전체 단백질 농도를 비교하였다. 큰 차이는 발견되지 않았다(P>0.05).
단백질 농도에서 IL6의 타액 농도에서 큰 차이는 발견되지 않았다. 또한 ELISA 분석에서, 흡연 개체와 비흡연 개체 사이에서 샘플 크기 연구내에서 차이는 검출되지 않았다.
실시예 7 : OSCC 환자로부터의 혈청에서 IL6 및 IL8 사이토카인 수준 분석
본 발명자들은 또한 qRT-PCR 및 ELISA를 이용하여 정상 개체와 OSCC 환자의 혈청에서 IL6 및 IL8의 수준을 검사하고 비교하였다. 환자는 실시예 4에 개시된 대로 선택되었으며 혈청은 실시예 5에 개시된 대로 처리하였다.
환자 및 정상 개체로부터의 혈청에서 IL6 및 IL8 mRNA 농도의 정량을 위한 실시간 PCR
RT-PCR의 결과를 정량적으로 분석하기 위하여, 정량적 실시간 PCR을 실시예 6에 개시된 대로 실시하였다.
RT-PCR 결과는 도 6A에 나타난 다이아그램에 의해 예시된다. OSCC 환자의 혈청 내의 IL6의 mRNA 수준은 대조구 개체와 비교할 때 상당히 더 높았다(t 테스트, P<0.001). OSCC 환자와 질병이 없는 대조구로부터의 혈청 사이에서 IL6 mRNA 발현의 양에서 큰 차이를 발견하였다. 평균 카피 수는 OSCC 그룹을 위해서는 5.2 X 104 이었으며, 대조군을 위해서는 3.3 X 103 이었다. 두 그룹 사이의 차이는 통계적으로 매우 유의하였다(P<0.0004).
mRNA 수준에서 IL8의 혈청 농도에서는 큰 차이는 발견되지 않았다. 샘플 크기 연구내에서, 발명자들은 또한 흡연 개체와 비흡연 개체 사이의 차이를 검출할 수 없었다.
환자 및 정상 개체로부터의 혈청 내의 IL6 및 IL8 단백질 농도의 정량을 위한 ELISA
혈청내의 IL6와 IL8 단백질 농도의 정량을 위한 ELISA 시험을 실시예 6에 개시된 대로 실시하였다.
관련 ELISA 결과는 도 6B에 나타난 다이아그램에 의해 예시된다. OSCC 환자의 혈청 내의 IL6의 평균 수준은 대조군의 혈청 내의 수준(0 pg/dL)보다 상당히 더 높았다(87pg/dL)(P<0.0001).
단백질 수준에서 IL8의 혈청 농도에서 큰 차이는 발견되지 않았다. 또한 ELISA 분석에서, 흡연 개체와 비흡연 개체 사이에서 샘플 크기 연구내에서는 차이가 검출되지 않았다.
실시예 8: ROC 및 민감성/특이성 분석
상기 실시예 1 내지 7에서 보고된 실험의 결과에서 수집된 데이터의 통계적 분석은 HNSCC를 위한 이들 생물 마커의 특이성과 민감성, 및 그들의 예측 값을 증명한다.
통계적 분석
환자 인구통계학의 분포를 OSCC 경우 및 대조구를 위해 전체적으로 그리고 별도로 계산하였으며, 연속 측정을 위한 스튜던트 t-테스트 또는 카테고리적 측정을 위한 투-바이-투 카이-스퀘어(two-by-two Chi-square) 표를 이용하여 양측 사이에서 비교하였다. 타액 및 혈청내의 IL6 및 IL8 수준의 분포를 계산하였으며 두 개의 독립적인 그룹 t-테스트를 이용하여 OSCC 경우와 대조구 사이에서 비교하였다. 0.01보다 낮은 P 값에 대해서는 차이가 큰 것으로 간주하였다. IL6 및 IL8 수준의 범위로 인해, 이들 측정값의 로그 변환 또한 분석에 이용하였다. 데이터는 평균 ± SD로 표현하였다. 연령, 성별, 및 흡연 이력을 실험 고안에서 그룹 수준에서 조절하였으며, 이들 환자 인자는 또한 회귀 모델링을 통해 IL6과 IL8을 비교할 때 분석에서 조절되었다.
종속적 변수로서 질병(OSCC 경우)와 비질병(대조구)의 이진수 결과를 이용하여, 환자 연령, 성별, 및 흡연 이력을 조절하면서, 로지스틱 회귀 모델을 최적화하여 잠재적인 생물 마커(IL6 또는 IL8)의 각각의 함수로서 OSCC 발생 확률을 추정하였다. 최적화된 로지스틱 모델을 이용하여, 수용체 작동 특징(ROC) 곡선 분석을 실시하여 생물 마커의 각각의 예측력을 평가하였다[8][9][10]. ROC 분석을 통하여, 최소(0의 확률에서의 컷)에서 가장 엄격한(1의 확률에서 컷) 것까지 긍정성의 기준을 변화시켜 민감성 및 특이성을 계산하였다. 적절한 민감성과 특이성을 생물 마커 각각을 위해 결정하고, 각 생물 마커의 해당하는 컷오프/역치 값을 확인하였다. ROC 곡선아래의 가장 큰 면적을 갖는 생물 마커를 OSCC를 검출하기 위한 가장 강한 예측력을 갖는 것으로 확인하였다.
임상 데이터
OSCC를 가진 환자의 평균(SD) 연령은 49.3(7.5)세(범위, 42-67세)이고 대조군에서는 48.8(5.7)세(범위, 40-65세)였다(스튜던트 t 시험 P>0.80). 두 개체군에서, 연령면에서 큰 차이는 없었다(평균 연령): OSCC 환자, 49.3세; 정상 개체, 48.8세(스튜던트 t 테스트 P>0.80); 성별(스튜던트 t 테스트 P>0.90); 또는 흡연 이력(스튜던트 t 테스트 P>0.75).
ROC(수용체 작동 특징) 곡선, 민감성 대 1-특이성의 플롯을 잠재적 생물 마커의 각각에 대해 생성하였다. 전술한 대로 연령, 성별, 및 흡연 이력을 조절하였다. ROC 곡선 아래 면적을 OSCC를 검출하기 위한 각 생물 마커의 유용성의 척도로서 계산하였다.
도 7A와 도 7B는 각각 타액 내의 IL8 및 혈청 내의 IL6를 위한 ROC 곡선을 보여준다. 계산된 ROC 값(OSCC 예측을 위함)은 타액 내의 IL8을 위해서는 0.978이고, 혈청 내의 IL6을 위해서는 0.824였다. 민감성 및 특이성의 분포에 기초하여, 생물 마커의 역치를 OSCC를 검출하기 위해 선택하였다. 본 발명자의 데이터에 기초하여, 타액 내의 IL8의 경우, 600 pg/dL의 역치 값은 86%의 민감성 및 97%의 특이성을 낳는다. 유사하게, 혈청 내의 IL6의 경우, 0 pg/dL보다 큰 역치값은 64%의 민감성 및 81%의 특이성을 낳는다.
생물 마커의 조합인 타액내의 IL-8과 혈청내의 IL-6는 OSCC 진단을 위해 더 큰 잠재력을 가지며, 이는 ROC 분석이 도 7C에 나타난 대로 99%의 민감성 및 90%의 특이성을 낳기 때문이다.
ROC 곡선아래 면적, 역치값, 및 타액 및 혈청 내의 잠재적 생물 마커의 각각을 위한 해당하는 민감성 및 특이성의 상세한 통계학이 표 3에 열거된다.
생물 마커 ROC 아래 면적 역치/컷오프 민감성 특이성
IL8 타액 단백질 0.978 600 pg/mL 86% 97%
IL6 혈청 단백질 0.824 >0 pg/mL 57% 100%
IL8 타액 단백질 & IL6 혈청 단백질 0.994 >600 pg/ml >0 p/ml 99% 90%
실시예 9 : OSCC 환자의 혈청으로부터의 RNA 분리, 증폭 및 유전자 발현 프 로파일링
개체 선별
캘리포니아 대학, 로스앤젤레스(UCLA) 및 남가주 대학(USC)(로스앤젤레스, CA)의 의학 센터로부터 환자를 수집하였다. 모든 환자는 최근에 일차 T1/T2 OSCC로 진단받았으며, 화학치료, 방사선치료, 수술, 또는 대체 치료 형태의 어떤 이전 치료도 받지 않았다. 35명의 정상 공여자를 UCLA의 치과대학의 일반 집단으로부터의 대조구로서 수집하였다. 개체는 이전의 악성, 면역결핍증, 자가면역 질환, 간염, 또는 HIV 감염의 이력을 갖지 않았다. 모든 개체는 이 연구를 위한 혈액 공여자 역할에 동의하는 기관 리뷰 보드에 의해 승인된 동의서에 사인하였다.
총 67명의 개체를 구하였으며, 32명의 OSCC 환자와 35명의 정상 개체를 포함하였다. 두 개체 군에서, 평균 연령면에서 큰 차이는 없었다(표준 편차, SD): OSCC 환자, 49.3(7.5)세; 정상 개체, 47.8(6.4)세(스튜던트 t 테스트 P=0.84). OSCC 그룹에서 성별 분포는 10:22(여성 수/남성 수)이고 대조군에서는 14:21(카이-스퀘어 테스트 P=1)였다. 하기를 결정하여 이들 두 그룹의 흡연 이력을 매치시켰다. 모든 개체에게 다음과 같이 질문하였다: (1) 몇년동안 흡연하였는가? (2) 하루에 몇갑이나 피우는가? (3) (만일 담배를 끊었다면) 흡연을 그만둔지 몇년이나 되었는가? (4) 담배만 피웠는가, 그렇지 않으면 시가, 파이프, 씹는 담배, 또는 마리화나를 이용하였는가? 이어서 하기 면에서 환자와 대조구 사이의 매치를 최적화하였다: (1) 유사한 갑-년수 이력 (2) 금연 후 유사한 시간 경과 (3) 배타적인 담배 이용. 흡연 이력에서 두 그룹 사이에 큰 차이는 없었다(스튜던트 t 테스트 P=0.77).
혈액 수집 및 처리
혈액 획득 과정은 UCLA 및 USC의 기관 리뷰 보드에 의해 승인받았다. 처리에 앞서 대조구 및 환자로부터 혈액을 취하였다. 이어서 전혈을 Sorvall RT6000D 원심분리기(DuPont, Wilmington, DE)에 의해 15 ℃에서 10분 동안 1000 x g에 의해 원심분리시켰다. 이어서 혈청을 분리하고, 100 U/mL RNAse 억제제(Superase-In, Ambion Inc.,Austin, TX)를 혈청에 즉시 첨가하였다. 분액을 추가 사용시까지 -80 ℃에서 저장하였다.
혈청으로부터 RNA 분리
QIAamp 바이러스 RNA 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 560 ㎕ 혈청으로부터 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA의 분액을 제조자의 설명서에 따라 RNase-없는 DNase(DNaseI-DNA-없음, Ambion Inc., Austin, TX)로 처리하였다. 분리된 RNA의 양을 하우스키핑 유전자 전사물 4 가지에 대해 RT-PCR에 의해 검사하였다: β-액틴(ACTB), β-2-마이크로글로불린(B2M), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH), 및 리보좀 단백질 S9(RPS9). 공개된 서열에 기초하여, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 고안하고 PCR을 위하여 합성하였다(Sigma Genosis, Woodlands, TX). 표 4에 나타난 RT-PCR을 위한 4개의 하우스키핑 유전자 전사물로부터 선택된 일반적인 업스트림 프라이머 및 3 가지 상이한 다운스트림 프라이머를 이용하여 3 분절로 표현형을 갖는 mRNA 암호 영역을 증폭시키기 위해 RT-PCR을 실시하였다.
명칭 기탁 번호(NCBI) 전길이(bp) 프라이머 서열 앰플리콘(bp)
ACTB X00351 1761 F: 서열번호 19 R1:서열번호 20 R2:서열번호 21 R3:서열번호 22 195 705 1000
B2M NM_004048 987 F: 서열번호 23 R1:서열번호 24 R2:서열번호 25 R3:서열번호 26 216 591 848
GAPDH M33197 1268 F: 서열번호 27 R1:서열번호 28 R2:서열번호 29 R3:서열번호 30 140 755 1184
RPS9 NM_001013 692 F: 서열번호 31 R1:서열번호 32 R2:서열번호 33 R3:서열번호 34 188 426 614
구체적으로 4 가지 혈청 사람 mRNA를 선택하고 일반적인 업스트림 프라이머와 3 가지 상이한 다운스트림 프라이머를 이용하여 3 분절로 표현형된 암호 영역을 약 3 부분으로 분할하였다. 각 PCR 반응물 10 ㎕를 2% 아가로즈젤에서 전기영동시키고 EtBr로 염색하였다.
모든 PCR 생성물의 특이성을 양성 대조구(사람 타액선 전체 RNA, Clontech, Palo Alto, CA)와 비교한 예측된 크기에 의해 확인하였다. 포함되는 RNA가 생략되거나 RNA를 이용하지만 역전사효소가 생략된 음성 대조구를 이용하였다.
사람으로부터의 mRNA 생성물의 혈청 표현형을 RT-PCR 및 전기영동에 의해 평가하였다. 예시적인 결과가 도 8에 나타나며, 네 가지 하우스키핑 유전자(ACTB, B2M, GAPDH, 및 RPS9)로부터의 전사물이 검출될 수 있음을 보여준다. 구체적으로, 188, 426 및 614 bp의 크기를 가진 RPS9를 위한 앰플리콘이 검출되었으며(각각 도 8 레인 2,3, 및 4 참고); 140, 755 및 1184 bp의 크기를 갖는 GAPDH를 위한 앰플리콘이 검출되었으며(도 8 레인 5,6, 및 7 각각 참고); 216, 591 및 848 bp의 크기를 갖는 B2M을 위한 앰플리콘이 검출되었으며(도 8 레인 8, 9 및 10 각각 참고); 195, 705 및 1000 bp의 크기를 갖는 ACTB를 위한 앰플리콘이 검출되었다(도 8 레인 11, 12 및 13 각각 참고). 대조구 데이터가 도면에 나타나지 않지만 대조구도 실시하였다.
본 발명자들이 증폭한 가장 긴 PCR 생성물은 NCBI 젠뱅크 데이터베이스에 따라, 해당하는 mRNA의 전길이의 56.8%(ACTB), 85.9%(B2M), 93.4%(GAPDH) 및 88.9%(RPS9)를 커버하였다. 이 결과는 또한 무세포 형태의 혈액내에 순환하는 그대로의 사람 mRNA가 있을 수 있음을 나타냈다.
실시예 10 : OSCC 환자로부터의 혈청의 mRNA 의 마이크로어레이 프로파일링
10명의 OSCC 환자(8명 남성, 2명 여성, 연령 = 51±9.0) 및 10명의 성별 및 연령 매치되는 정상 공여자(연령 = 49±5.6)로부터 혈청을 수집하고 마이크로어레이 분석에서 사용하기 위해 실시예 9에 보고된 대로 처리하였다.
마이크로어레이 분석
혈청으로부터 분리된 RNA를 RiboAmpTM RNA 증폭 키트(Arcturus, Mountain View, CA)에 의해 선형 증폭시켰다. 이전에 보고된 프로토콜[55]에 따라, ~ 19000개 유전자를 나타내는 22215개 사람 유전자 cDNA 프로브 세트를 함유하는(즉, 각 유전자는 하나보다 많은 프로브 세트에 의해 나타내질 수 있음) 아피메트릭스 사람 게놈 U133A 어레이를 유전자 발현 프로파일링을 위해 적용하였다.
정규화 및 모델계 분석[60]을 위해 가공되지 않은 데이터를 DNA-칩 분석기 1.3(dChip) 소프트웨어내로 입력하였다. dChip은 mRNA/유전자 발현의 양 및 mRNA 전사물이 실제로 샘플 내에 존재하는지 여부에 대한 존재 콜이라고 불리는 다른 파라미터를 나타내는 발현 지수를 제공한다(14). S-플러스 6.0(Insightful, Seattle, WA)을 모든 통계적 시험에 이용하였다.
OSCC와 대조구 사이에 상이하게 발현된 유전자를 결정하기 위하여 세 가지 기준을 이용하였다. 먼저, 모든 샘플에서 "부재" 콜이 부여된 유전자를 제외시켰다. 두 번째, OSCC(n=10)와 대조구(n=10) 에서 평균 유전자 발현 수준의 비교를 위해 2-테일 스튜던트 t 테스트를 이용하였다. 통계적 유의성을 위해 0.05의 임계적 알파 수준을 정의하였다. 세 번째, 통계적으로 유의한 차이를 나타낸 유전자들을 위해 배수비를 계산하였다(P<0.05). 적어도 2배 변화를 나타낸 유전자만이 추가 분석을 위해 포함될 것이다.
암 환자 및 매치되는 정상 개체 사이의 타액 RNA 프로파일의 차이를 확인하기 위하여 HG U133A 마이크로어레이를 이용하였다. 이전에 개시된 기준에 의해 포함된 14268개 유전자 중에서, 0.05 미만의 P 값과 2 이상의 배수 변화를 갖는 335개 유전자를 확인하였다. 이들 유전자중에서, 223개의 상향-조절된 유전자 및 112개의 하향-조절된 유전자가 OSCC 그룹에 있다. 아피메트릭스에 따라, 존재 콜이 부여된 유전자는 이 유전자가 원래 샘플에서 신뢰성있게 검출될 수 있음을 나타낸다. 존재 콜이 부여된 유전자의 수 및 각 어레이상의 존재 퍼센티지가 표 5에 나타나 혈청내의 사람 mRNA 발현 프로파일링을 보고한다.
Figure 112006066644219-PCT00002
(a) HG U133A 마이크로어레이상의 존재 콜을 나타내는 프로브의 수(검출 P<0.04).
(b) 존재 퍼센티지(P%) = 존재 콜이 부여된 프로브의 수/전체 프로브의 수(HG U133A 마이크로어레이이 경우 22283).
* OSCC를 위한 어레이는 대조군보다 존재 콜이 부여된 프로브가 더 많다(P≤0.002, 윌콕손 테스트).
평균적으로, 존재 콜이 부여된 프로브는 OSCC 어레이에는 2623 ± 868 개이며 대조구 어레이는 1792 ± 165개 이다. OSCC 그룹은 대조군보다 상당히 더 많은 존재 프로브를 갖는다(P≤0.002, 윌콕손 테스트).
일부 유전자의 경우, 존재 콜이 모든 암(n=10) 또는 모든 대조구(n=10)에서 모든 어레이에 대해 일치하게 부여되는 보다 엄격한 기준을 이용하여, 추가 분석을 위한 후보인 유전자 62개를 확인하였다. 이들 62 개 유전자는 OSCC 혈청에서는 모두 상향 조절되는 한편, 동일한 필터링 기준을 이용하여 하향-조절되는 유전자는 발견되지 않는다.
실시예 11 : OSCC 환자의 무세포 타액으로부터의 마이크로어레이 프로파일링의 Q- PCR 확인 및 정량화 분석
타액내의 상이하게 발현된 전사물의 서브세트를 정량화하고 실시예 10의 마이크로어레이 결과를 확인하기 위하여 32명의 OSCC 환자 및 35명의 대조구로부터의 타액을 포함하는 확대된 샘플 크기에서 qPCR을 실시하였다.
정량적 PCR ( qPCR ) 분석
PRIMER3 소프트웨어를 이용하여 프라이머 세트를 고안하였다(표 2). MuLV 역전사효소(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 프라이머로서 임의 헥사머(ABI, Foster City, CA)를 이용하여, 원래의 그리고 비증폭된 혈청 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. qPCR 반응을 iCyclerTM IQ 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 실시하였다. 모든 반응은 구체적인 생성물을 위한 관례화된 조건으로 세벌씩 실시하였다. 특정 주형의 cDNA/RNA의 상대량을 LightCycler 소프트웨어 3.0(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 표준 곡선으로부터 외삽하였다. 2-테일 스튜던트 t 테스트를 통계 분석을 위하여 실시하였다.
10 가지의 상당히 상향 조절된 유전자인, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4, ARCR, THSMB(티모신 베타 10), PRKCB1(단백질 키나제 C, 베타 1), FTL1(페리틴 경 폴리펩티드), COX411(사이토크롬 c 옥시다제 서브유닛 IV 아이소형태 1) 및 SERP1(스트레스 연합 소포체 단백질 1; 리보좀 연합 막 단백질 4)를, qPCR 확인을 위해 선택된 10개 유전자를 보고하는 표 6에 나타난 대로 그들의 보고된 암-관련성에 기초하여 선택하였다.
Figure 112006066644219-PCT00003
표 6은 qPCR에 의해 결정된, OSCC 환자로부터의 혈청에서 그들의 정량적 변화를 제시한다. 그 결과는 H3F3A, TPT1, NCOA4 및 ARCR의 전사물이 OSCC 환자의 타액에서 크게 증가하였음을 확인한다(윌콕손 사인된 랭크 테스트, P<0.05). qPCR에 의해 다른 다섯 개의 전사물의 양에서 통계적으로 유의한 차이를 검출하지 못했다.
실시예 12 : ROC 및 민감성/특이성 분석
상기의 실시예 9 내지 11에 보고된 실험의 결과에서 수집된 데이터의 통계적 분석은 HNSCC를 위한 이들 생물 마커의 특이성 및 민감성, 그리고 그들의 예측값을 증명한다.
수용체 작동 특징 곡선 분석 및 예측 모델
qPCR 결과를 이용하여, 다중변수 분류 모델을 구성하여 암 예측을 위한 선택된 혈청 전사물의 최상의 조합을 결정하였다. 먼저, 의존적 변수로서 질병(OSCC) 및 비-질병(정상)의 이원 결과를 이용하여, 로지스틱 회귀 모델을 구성하였다[61]. 연령, 성별 및 흡연 이력은 데이터 수집 과정에서 조절된다.
로지스틱 회귀 모델을 확실히 하기 위하여 리브-원 아웃 교차 확인(leave-one out cross validation)을 이용하였다. 교차 확인 전략은 먼저 한 가지 관찰을 제거하고 이어서 모든 마커를 이용하여 나머지 경우로부터 로지스틱 회귀 모델에 맞춘다. 이들 모델의 각각이 모델을 개선하지 않는 변수를 제거하도록 하기 위해 단계적인 모델 선택을 이용한다. 이어서, 남겨진 경우를 위한 관찰 값을 이용하여 그 관찰을 위한 예측된 부류를 계산하였다. 교차 확인 에러율은 샘플의 수로 부정확하게 예측된 샘플의 수를 나눈 것이다.
이어서, 민감성과 특이성의 계산을 위한 가능한 컷포인트로서 모델로부터의 최적화된 확률을 이용하여, 최상의 최종 로지스틱 모델을 위해 수용체 작동 특징(ROC) 곡선 분석을 계산하였다(S-플러스 6.0). 곡선 아래 면적은 ROC 곡선의 수치 적분을 통해 계산하였다.
OSCC 구별을 위해 혈청내의 순환하는 mRNA의 유용성을 입증하기 위하여, 두 가지 분류/예측 모델을 관찰하였다. qPCR 데이터를 이용하여, 이전에 검사된 여섯 개의 혈청 전사물인 ARHA, FTH1, H3F3A, TPT1, COX4I1 및 FTL1로 구성된 로지스틱 회귀 모델을 구성하였다. 이들 여섯 개의 전사물은 함께 최상의 예측을 제공하였으며, 이는 이어서 리빙-원-아웃 확인에 의해 확인하였다. 67개의 리빙-원-아웃 시험중에서, 최상의 로지스틱 모델 중 54개(81%)는 전체 데이터로부터의 모델과 동일한 모델인 것으로 밝혀졌으며 확인 에러율은 31.3%(21/67)였다.
결과는 도 9에 보고되며, 여기서 이 로지스틱 회귀 모델을 위해 계산된 ROC 곡선이 나타난다.
44%의 컷오프 확률을 이용하여, 84%의 민감성 및 83%의 특이성을 얻었다. 마지막 모델은 0.84(27/32)의 민감성 및 0.83(29/35)의 특이성으로 67명 중 56명 개체(83.5%)에 대해 정확하게 예측하며 대조구를 위해서는 6 개체 및 OSCC를 위해서는 5 개체를 잘못 분류한다. ROC 곡선 아래의 계산된 면적은 이 로지스틱 회귀 모델을 위해서는 0.88 이었다.
트리계 분류 모델, 분류 및 회귀 트리( CART )
두 번째로, qPCR 결과를 이용하는 다른 예측 모델을 트리계 분류 방법에 의해 구성하였다. 분류 및 회귀 트리(CART)는 qPCR 결과로부터의 예측자로서 혈청 전사물을 이용하여 S-플러스 6.0에 의해 구성하였다. CART는 이원 회귀성 분할에 의한 분류 모델에 적합하며, 이때 각 단계는 암 대 정상 그룹의 최상의 스플릿(split)을 야기하는 예측자 변수를 조사하는 것에 관련된다[62]. CART는 S-플러스를 위한 디폴트 세팅에 의해 결정된 스플리팅(splitting) 기준을 가진 엔트로피 함수를 이용하였다. 이 방법에 의해, 전체 샘플(n=67)을 함유하는 모 그룹을 이어서 암 그룹과 정상 그룹으로 나누었다. 우리의 초기 트리는 상이한 분류를 갖는 서브-브랜치를 야기하지 않은 모든 스플릿을 제거하기 위하여 정리하였다.
도 10에 보고된 다이아그램에 따라 두 번째 모델인 "분류 및 회귀 트리(CART) 모델"을 생성하였다.
본 발명의 최적화된 CART 모델은 OSCC를 위한 예측자 변수로서 THSMB 및 FTH1의 혈청 mRNA 농도를 이용하였다. 초기 스플릿으로서 선택된 THSMB는 4.59E-17 M의 역치값을 가지고, 전체 67개 샘플을 함유하는 모 그룹으로부터 두 개의 자식 그룹을 생산하였다. 4.59E-17 M 미만의 THSMB 농도를 갖는 47개 샘플을 "정상-1"로 할당하는 한편, 4.59E-17 M 이상의 THSMB 농도를 갖는 20개 샘플을 "암-1"로 할당하였다. "정상-1" 그룹은 8.44E-16 M의 역치를 갖는 FTH1에 의해 추가로 분할되었다. 얻어진 하위그룹인 "정상-2"는 8.44E-16 M 미만의 FTH1 농도를 갖는 28개 샘플을 함유하였으며, "암-2" 는 8.44E-16 M 이상의 FTH1 농도를 갖는 19개 샘플을 함유하였다. 결과적으로, 본 연구에 관련된 67개 혈청 샘플은 CART 분석에 의해 "정상" 그룹과 "암" 그룹으로 분류되었다.
"정상" 그룹은 정상 개체로부터 25개 및 암환자로부터 3개를 포함한 전체 28개 샘플을 포함하는 "정상-2"로부터의 샘플로 구성되었다. 따라서, OSCC 예측을 위한 THSMB 및 FTH1의 조합을 이용함으로써, 전체적인 특이성은 78%(25/35)이다. "암" 그룹은 "암-1" 및 "암-2"로부터의 샘플로 구성되었다. 최종 "암" 그룹으로 할당된 샘플은 전체 39개였으며, 29개는 암환자로부터 그리고 10개는 정상 개체로부터 왔다. 따라서, OSCC 예측을 위해 이들 두 가지 혈청 mRNA의 조합을 이용함으로써, 전체적인 민감성은 91%(29/32, 암 그룹에서)이고 특이성은 78%이다(25/35, 정상 그룹에서).
실시예 13 : OSCC 환자의 타액으로부터의 RNA 분리, 증폭 및 유전자 발현 프 로파일링
환자 선별
캘리포니아 대학, 로스앤젤레스(UCLA) 의학 센터; 남가주 대학(USC) 의학 센터(Los Angeles, CA); 및 캘리포니아 대학, 샌프란시스코(UCSF) 의학 센터(San Francisco, CA)로부터 OSCC 환자를 수집하였다.
일차 T1 또는 T2 OSCC 기록을 가진 32명의 환자를 포함시켰다. 모든 환자가 최근에 일차 질병으로 진단받았으며, 화학치료, 방사선치료, 수술 또는 대체 요법의 형태의 어떤 이전 치료도 받지 않았다.
비교할만한 흡연 이력을 가진 동일한 수의 연령- 및 성별-매치되는 개체를 대조군으로서 선택하였다. 두 가지 개체 군에서, 평균 연령: OSCC 환자, 49.8 ± 7.6세; 정상 개체, 49.1 ± 5.9세(스튜던트 t 테스트, P>0.80); 성별(P>0.90); 또는 흡연 이력(P>0.75)면에서 큰 차이는 없었다. 어떤 개체도 이전의 악성, 면역결핍증, 자가면역 질환, 간염 또는 HIV 감염을 가지지 않았다. 모든 개체는 실험을 위한 타액 공여자로서 참가함에 동의하는 기관 리뷰 보드-승인된 동의서에 서명하였다.
타액 수집 및 RNA 분리
이전에 확립된 프로토콜을 이용하여 비자극된 타액 샘플을 오전 9시와 10시 사이에 수집하였다.[38]. 개체들은 타액 수집에 앞서 적어도 한시간동안 금식, 금주, 금연, 또는 구강 위생 제품의 사용 금지가 요구되었다. 타액 샘플을 4 ℃에서 15분간 2600 X g에서 원심분리시켰다.
침전물로부터 상등액을 제거하고 RNase 억제제(Superase-In, Ambion Inc.,Austin, TX)로 처리하였다. QIAamp 바이러스 RNA 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 타액 상등액 560 ㎕로부터 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 분액을 제조자의 설명서에 따라 RNase-없는 DNase(DNaseI-DNA-없음, Ambion Inc.)로 처리하였다. 세 가지 세포 유지 유전자 전사물인 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH), 액틴-β(ACTB), 및 리보좀 단백질 S9(RPS9)을 위한 RT-PCR에 의해 분리된 RNA의 품질을 검사하였다. 모든 세 mRNA를 위한 PCR 생성물을 나타내는 샘플만을 추가 분석을 위해 이용하였다.
평균적으로, 54.2 ± 20.1 ng(n=64)의 전체 RNA를 타액 상등액 560 ㎕로부터 얻었다. OSCC와 매치된 대조구 사이에 전체 RNA 양에는 큰 차이가 없었다(t 테스트, P=0.29, n=64). RT-PCR 결과는 모든 타액 샘플(n=64)이 세 가지 유전자(GAPDH, ACTB, 및 RPS9)로부터의 전사물을 함유함을 입증하였으며, 이들은 사람 타액 RNA를 위한 품질 대조구로 사용되었다[55]. 2 라운드의 RNA 증폭 후 지속적인 증폭 양(658 ± 47.2, n=5)를 얻을 수 있었다. 평균적으로, 비오티닐화된 cRNA의 양은 39.3 ± 6.0 ㎍(n =20)이었다. OSCC와 대조구 사이에 생산된 cRNA 양의 큰 차이는 없었다(t 테스트, P = 0.31, n=20).
실시예 14 : OSCC 환자로부터의 타액의 mRNA 의 마이크로어레이 프로파일링
10명의 OSCC 환자(7명 남성, 3명 여성; 연령, 52±9.0세) 및 10명의 성별- 및 연령-매치되는 정상 공여자(연령, 49 ± 5.6세)로부터의 타액을 마이크로어레이 연구에 사용하였다. 타액으로부터 분리된 RNA를 RiboAmp RNA 증폭 키트(Arcturus, Mountain View, CA)에 의해 선형 증폭시켰다. RNA 증폭 효율은 5회의 독립적인 시행에서 20 샘플을 이용하여 평행하게 실시되는 공지량(0.1 ㎍)의 대조구 RNA를 이용하여 측정하였다.
마이크로어레이 분석
이전에 보고된 프로토콜에 따라[55], 사람 게놈 U133A 어레이(HG U133A, Affymetrix, Santa Clara, CA)를 유전자 발현 분석을 위해 적용하였다. 어레이를 스캔하고 마이크로어레이 스윗 5.0 소프트웨어(Affymetrix, Santa Clara, CA)에 의해 형광 강도를 측정하였으며; 이어서 정규화 및 모델계 분석을 위해 어레이를 DNA-칩 분석기 소프트웨어(http:www.dchp.org)내로 입력하였다[60]. S-플러스 6.0(Insightful, Seattle, WA)을 이용하여 모든 통계 테스트를 실시하였다.
세 가지 기준을 이용하여 상이하게 발현되는 유전자 전사물을 결정하였다. 먼저, 모든 샘플에서 "부재" 콜이 부여된 어레이상의 프로브 세트를 제외시켰다. 두 번째, 2-테일 스튜던트 t 테스트를 OSCC(n=10)와 대조구(n=10) 사이의 평균 유전자 발현 신호 강도의 비교를 위해 이용하였다. 0.05의 임계 수준을 통계적 유의성에 대해 정의하였다. 세 번째, 통계적으로 유의한 차이(P<0.05)를 나타낸 유전자 전사물에 대해 배수 비율을 계산하였다. 적어도 2배 변화를 나타낸 유전자 전사물만을 추가 분석에 포함시켰다.
HG U133A 마이크로어레이를 이용하여 암 환자와 매치된 정상 개체 사이의 타액 RNA 프로파일에서의 차이를 확인하였다. 이전에 개시된 기준에 의해 포함된 10316 전사물중에서, 0.05 미만의 P 값을 갖는 1679개 전사물을 확인하였다. 이들 전사물 중에서, OSCC에서 836개는 상향 조절되고 843개는 하향 조절되었다. 이들 관찰된 전사물은 P<0.05를 갖는 거짓 양성을 고려할 때 단독으로 기여하기는 힘들었다(2 테스트, P<0.0001). 모든 10개의 OSCC 타액 시료에서의 3배 이상의 조절에서의 변화 및 0.01 미만의 P 값의 컷오프의 미리정해진 기준을 이용하여, OSCC 타액에서 상당한 상향 조절을 나타내는 17개 mRNA를 확인하였다. 17개 전사물은 모든 10개 OSCC 타액 시료에서 3배 이상의 조절 변화를 나타냈으며, 0.01 미만의 P 값의 보다 엄격한 컷오프를 나타냈다. 이들 17개의 타액 mRNA는 OSCC 타액에서 모두 상향 조절되는 한편, 동일한 필터링 기준에서 하향 조절되는 mRNA는 발견되지 않는다. 이들 유전자 및 그들의 생성물의 생물 기능이 마이크로어레이에 의해 확인된 OSCC에서 상향 조절된 (>3배, P<0.01) 타액 mRNA를 보여주는 표 7에 제시된다.
유전자 기호 유전자 명칭 젠뱅크 기탁 번호 좌 유전자 기능
B2M_ β-2-마이크로글로불린 NM_04048 15q21-q22.2 항어팝코시스; 항원 제시
DUSP1 이중특이성 포스파타제 1 NM_04417 5q34 단백질 변형; 신호 전달 산화성 스트레스
FTH1 페리틴, 중 폴리펩티드 1 NM_02032 11q13 철이온 수송; 세포 증식
GOS2 추정 림프구 G0-G1 스위치 유전자 NM_015714 1q32.2-q4.1 세포 성장 및/또는 유지; 세포 사이클의 조절
GADD45B 성장 중지 및 DNA-손상-유도성β NM_015675 19p13.3 키나제 캐스케이드; 어팝토시스
HEFEA H3 히스톤, 패밀리 3A BE869922 1q41 DNA 결합 활성
HSPC016 가설적 단백질 HSPC016 BG167522 3p21.31 미지
IER3 즉시 초기 반응 3 NM_003897 6p21.3 배발생; 형태발생; 어팝토시스;세포 성장 및 유지
IL1B 인터루킨 1β M15330 2q14 시그널 전달; 증식;염증;어팝토시스
IL8 인터루킨 8 NM_000584 4q13-q21 혈관신생;복제;칼슘-매개 시그널링 경로; 세포 부착; 주화성 세포 사이클 중지;면역 반응
MAP2K3 미토젠-활성화된 단백질 키나제 키나제 3 AA780381 17q11.2 시그널 전달; 단백질 변형
OAZ1 오르니틴 디카복실라제 안티자임 1 D87914 19p13.3 폴리아민 생합성
PRG1 프로테오글리칸 1, 분비성 입자 NM_002727 10q22.1 프로테오글리칸
RGS2 G-단백질 시그널링의 조절자, 2.24 kDa NM_002923 1q31 암발생; G-단백질 시그널 전달
S100P S100 칼슘 결합 단백질 P NM_005980 4p16 단백질 결합; 칼슘이온 결합
SAT 스퍼미딘/스퍼민 N1-아세틸트랜스퍼라제 NM_002970 Xp22.1 효소, 트랜스퍼라제 활성
EST 매우 유사한 페리틴 경쇄 BG537190 철이온 항상성, 페리틴 복합체
사람 게놈 U133A 마이크로어레이를 이용하여 10명의 암환자와 10명의 매치되는 정상 개체로부터의 타액에서 RNA 발현 패턴의 차이를 확인하였다. 모든 10개의 OSCC 타액 시료에서 3배 이상의 조절 변화 및 0.01 미만의 P 값의 컷오프의 기준을 이용하여, OSCC 타액에서 상당한 상향 조절을 나타내는 17개의 mRNA를 확인하였다.
실시예 15 : OSCC 환자의 무세포 타액으로부터의 Q- PCR 확인 및 마이크로어 레이 프로파일링의 정량화 분석
정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR)을 실시하여 실시예 14의 마이크로어레이 분석에 의해 확인된 상이하게 발현된 전사물의 서브세트를 확인하였다.
정량적 폴리머라제 연쇄 반응 확인
MuLV 역전사효소(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 프라이머로서 임의 헥사머(Applied Biosystems)를 이용하여, 원래의 비증폭된 타액 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. iQ SYBR 그린 수퍼믹스(Bio-Rad, Hercules, CA)를 가진 iCycler PCR 시스템에서 qPCR 반응을 실시하였다. PRIMER3 소프트웨어(http://www.genome.wi.mit.edu)를 이용하여 프라이머 세트를 고안하였다.
특정 생성물을 위한 관례적인 조건을 이용하여 모든 반응을 세벌로 실시하였다. 특정 주형의 cDNA/RNA의 초기 양은 이전에 개시된 대로 표준 곡선으로부터 외삽하였다[32]. 이 확인은 마이크로어레이 연구를 위해 이전에 이용된 20개를 비롯한 모든 샘플(n=64)을 시험하여 완결하였다. 윌콕손 사인된 랭크 테스트를 통계적 분석에 이용하였다.
정량적 PCR을 실시하여 32명의 OSCC 환자와 32명의 매치되는 대조구로부터의 타액을 포함하는 확대된 샘플 크기에서 마이크로어레이 결과를 확인하였다. 타액 mRNA 생물 마커의 9개의 후보인 DUSP1, GADD45B, H3F3A, IL1B, IL8, OAZ1, RGS2, S100P, 및 SAT를 표 7에 보고된 그들의 암 관련성에 기초하여 선택하였다. 표 8은 qPCR에 의해 결정된, OSCC 환자로부터의 타액에서 상기 9개의 후보의 정량적 변화를 제시한다.
Figure 112006066644219-PCT00004
9개의 잠재적인 후보 중 7개는 qPCR(P<0.05)에 의해 확인되었다.
* 윌콕손의 사인된 랭크 테스트: P<0.05이면, 확인됨(예); P≥0.05이면, 확인안됨(아니오).
결과는 9개의 후보 mRNA중 7개의 전사물(78%)인 DUSP1, H3F3A, IL1B, OAZ1, S100P 및 SAT는 OSCC 환자의 타액에서 상당히 증가되었음을 확인하였다(윌콕손 사인된 랭크 테스트, P<0.05). qPCR에 의해 RGS2(P=0.149) 및 GADD45B(P=0.116)의 양에서는 통계적으로 유의한 차이를 검출하지 못했다. 확인된 7개의 유전자는 증가량에 의해 세 등급으로 분류될 수 있다: IL8을 포함한 높이 상향조절되는 mRNA(24.3배); H3F3A(5.61배), IL1B(5.48) 및 S100P(4.88배)를 포함한 적절히 상향 조절되는 mRNA; 및 DUSP1(2.60배), OAZ1(2.82배), 및 SAT(2.98배)를 포함한 낮게 상향 조절되는 mRNA.
실시예 16: ROC 및 민감성/특이성 분석
qPCR 결과를 이용하여, 실시예 15에서 확인된 생물 마커 각각의 예측력을 평가하기 위하여 S-플러스 6.0에 의해 수용체 작동 특성(ROC) 곡선 분석을 실시하였다[82].
수용체 작동 특성 곡선 분석 및 예측 모델
최대의 상응하는 민감성 및 특이성을 생산한 것들을 조사함으로써 각 생물 마커를 위한 최적의 컷포인트를 결정하였다. 이어서 ROC 곡선을 최적의 민감성 및 특이성 값 세트를 기초로 그렸다. 곡선 아래 면적을 ROC 곡선의 수치 적분을 통해 계산하였다. 가장 큰 ROC 곡선 아래 면적을 갖는 생물 마커를 OSCC 검출을 위한 가장 강한 예측력을 갖는 것으로 확인하였다.
이어서, 암 예측을 위한 타액 마커의 최상의 조합을 결정하기 위하여 다변수 분류 모델을 구성하였다. 먼저, 종속적 변수로서 질병(OSCC)와 비질병(정상)의 이원 결과를 이용하여, 환자 연령, 성별, 및 흡연 이력을 조절하는 로지스틱 회귀 모델을 구성하였다. 후진 단계적 회귀[61]를 이용하여 최상의 최종 모델을 찾았다.
로지스틱 회귀 모델을 확인하기 위하여 리브-원-아웃 교차-확인을 이용하였다. 교차-확인 전략은 먼저 하나의 관찰을 제거하고 이어서 모든 마커를 이용하여 나머지 경우로부터 로지스틱 회귀 모델을 최적화한다. 단계적 모델 선택을 이들 모델의 각각을 위해 이용하여 모델을 개선시키지 않는 변수를 제거한다. 이어서, 그 관찰을 위해 예측된 부류를 계산하기 위하여 남겨진 경우를 위해 마커 값을 이용하였다. 이어서 교차-확인 에러율은 부정확하게 예측된 샘플의 수를 샘플의 수로 나눈 것이다.
도 11에 예시된 대로, ROC 곡선을 이어서 유사한 과정에 의해 로지스틱 모델을 위해 계산하였으며, 민감성과 특이성의 계산을 위해 가능한 컷포인트로서 상기 모델로부터의 최적화된 확률을 이용하였다.
수용체 작동 특징(ROC) 곡선 아래 면적의 상세한 통계학, 역치 값, 및 OSCC를 위한 7개의 잠재적인 타액 mRNA 생물 마커 각각을 위한 상응하는 민감성 및 특이성이 OSCC-관련 타액 mRNA 생물 마커의 ROC 곡선 분석을 보여주는 표 9에 열거된다.
Figure 112006066644219-PCT00005
qPCR 결과를 이용하여, 생물 마커 각각의 예측력을 평가하기 위하여 ROC 곡선 분석을 실시하였다. 최적의 컷포인트를 결정하여 최대의 상응하는 민감성과 특이성을 얻었다. 가장 큰 ROC 곡선 아래 면적을 가진 생물 마커가 OSCC를 검출하기 위한 가장 강한 예측력을 갖는 것으로 확인되었다.
데이터는 OSCC의 존재를 예측하기 위해 7개의 잠재적인 생물 마커 중에서 IL8 mRNA가 성능이 최고임을 보여주었다. IL8을 위한 계산된 ROC 곡선 아래 면적은 0.85였다. 3.19E-18 mol/L의 역치값을 가지고, 타액 내의 IL8 mRNA는 정상으로부터 OSCC를 구별하기 위해 88%의 민감성과 81%의 특이성을 생산한다.
질병 구별을 위한 타액 mRNA의 유용성을 입증하기 위하여, 2가지 분류/예측 모델을 검사하였다. 7개의 확인된 생물 마커 중 4개인 IL1B, OAZ1, SAT 및 IL8에 기초하여 로지스틱 회귀 모델을 구성하였으며, 이들은 함께 최상의 예측을 제공하였다(표 10). 표 10은 로지스틱 회귀 모델에 의해 선택된 OSCC를 위한 타액을 보여준다.
Figure 112006066644219-PCT00006
7개의 확인된 생물 마커 중 4개(IL1B, OAZ1, SAT 및 IL8)에 기초하여 로지스틱 회귀 모델을 구성하였으며, 이들은 함께 최상의 예측을 제공하였다. 계수 값은 이들 4개 마커에 대하여 양성이어서, 타액에서 그들의 농도의 동시적인 상승이 샘플이 OSCC 개체로부터 얻어졌을 확률을 증가시켰음을 나타낸다.
계수 값은 이들 4개 마커에 대하여 양성이어서, 타액에서 그들의 농도의 동시적인 상승이 샘플이 OSCC 개체로부터 얻어졌을 확률을 증가시켰음을 나타낸다. 로지스틱 회귀 모델에 기초한 리브-원-아웃 교차-확인 에러율은 19% 였다(64개 중 12). 리브-원-아웃 분석에서 생성된 모델 중 (64개 중) 하나를 제외한 모두는 표 10에 특정된 전체 데이터 모델에서 중요한 것으로 밝혀진 4개 마커의 동일한 세트를 이용하였다.
로지스틱 회귀 모델에 대해 ROC 곡선을 계산하였다. 50%의 컷오프 확률을 이용하여, 91%의 민감성 및 91%의 특이성을 얻었다. ROC 곡선 아래의 계산된 면적은 로지스틱 회귀 모델을 위해 0.95였다(도 11).
트리계 분류 모델, 분류 및 회귀 트리( CART )
두 번째 모델인 트리계 분류 모델, 분류 및 회귀 트리(CART) 모델을 생성하였다. CART 모델은 예측자로서 확인된 mRNA 생물 마커를 이용하는 S-플러스 6.0에 의해 구성하였다. CART는 이원 회귀 분할에 의해 분류 모델에 적합해지며, 여기서 각 단계는 암 대 정상 그룹의 최상의 스플릿을 야기하는 예측자 변수를 조사하는 것을 포함한다[62]. CART는 S-플러스를 위한 디폴트 세팅에 의해 결정된 스플릿 기준을 가진 엔트로피 함수를 이용하였다. 이 방법에 의해, 전체 샘플(n=64)을 함유하는 모그룹을 이어서 암 그룹과 정상 그룹으로 나누었다. 본 발명의 초기 트리는 상이한 분류를 갖는 하위-브랜치를 야기하지 않은 모든 스플릿을 제거하기 위하여 정제되었다.
결과는 도 12의 다이아그램에 나타난다. 본 발명의 최적화된 CART 모델은 IL8, H3F3A, 및 SAT의 타액 mRNA 농도를 OSCC를 위한 예측자 변수로서 이용하였다. 초기 스플릿으로 선택되었으며 3.14E - 18 mol/L의 역치를 가진 IL8은 전체 64개 샘플을 함유한 모 그룹으로부터 2개의 자식 그룹을 생산하였다. 3.14E - 18 mol/L 미만의 IL8 농도를 갖는 30개 샘플은 "정상-1"로 할당된 한편, 3.14E - 18 이상의 IL8 농도를 갖는 34개는 "암-1"로 할당되었다. "정상-1" 그룹은 추가로 1.13E -14 mol/L의 역치를 갖는 SAT에 의해 분할되었다.
얻어진 하위그룹인 "정상-2"는 1.13E-14 mol/L 미만의 SAT 농도를 갖는 25개 샘플을 함유하였으며, "암-2"는 1.13E-14 mol/L 이상의 SAT 농도를 갖는 5개 샘플을 함유하였다. 유사하게, "암-1" 그룹은 2.07E -16 mol/L의 역치를 갖는 H3F3A에 의해 추가로 분할되었다. 얻어진 하위그룹인 "암-3"은 2.07E -16 mol/L 이상의 H3F3A 농도를 갖는 27개 샘플을 함유하였으며, "정상-3" 그룹은 2.07E -16 mol/L 미만의 H3F3A 농도를 갖는 7개 샘플을 함유하였다.
결과적으로, 본 연구에 관련된 64개 타액 샘플은 CART 분석에 의해 "암" 그룹과 "정상" 그룹으로 분류되었다. "정상" 그룹은 "정상-2"로부터의 샘플 및 "정상-3"으로부터의 샘플로 구성되었다. "정상" 그룹에 할당된 샘플은 전체 32개이며, 29개는 정상 개체로부터 그리고 3개는 암 환자로부터 왔다.
따라서, OSCC 예측을 위하여 IL8, SAT, 및 H3F3A의 조합을 이용함으로써, 전체 민감성은 90.6%이다(32개 중 29개). "암" 그룹은 "암-2" 및 "암-3"으로부터의 샘플로 구성되었다. "암" 그룹에 할당된 샘플은 전체 32개이며, 29개는 암 환자로부터 그리고 3개는 정상 개체로부터 왔다. 따라서, OSCC 예측을 위해 이들 세 개의 타액 mRNA 생물 마커의 조합을 이용함으로써, 전체 특이성은 90.6%이다(32개중 29개).
요약하면, 본 발명은 세포 외 mRNA인 생물 마커를 타액에서 검출하는 방법에 관한 것이며, 무세포 타액에서 세포 외 mRNA를 검출하는 것을 포함하며, 타액의 트랜스크립톰 분석은 무세포 타액에서 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 것을 포함하며, 타액을 분석하여 기관 또는 기관내의 유전자의 유전적 변화를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 무세포 타액에서 유전자의 트랜스크립톰 패턴 및/또는 mRNA 프로파일링을 검출하는 것을 포함하며, 개체에서 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법이 제공되며, 이는 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 생물 마커, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 프로파일을 무세포 타액 및/또는 혈청에서 검출하는 것을 포함하며, 상기 방법 중 적어도 하나를 실시하기 위한 생물 마커 적어도 하나를 위한 식별자를 포함하는 키트를 제공하며, 그리고 구강 및/또는 전신 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 타액 생물 마커 및/또는 혈청 mRNA의 용도를 제공한다.
본원에서 언급된 모든 문헌 및 참고문헌의 개시는 전체가 참고로 본원에 통합된다.
본 명세서는 특정 구체예를 참고로 설명되었다. 전술한 설명에서 볼때 당업자에게 다른 구체예가 명백할 것이다. 본 개시의 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해 한정된다.
참고 문헌
Figure 112006066644219-PCT00007
Figure 112006066644219-PCT00008
Figure 112006066644219-PCT00009
Figure 112006066644219-PCT00010
Figure 112006066644219-PCT00011
Figure 112006066644219-PCT00012
Figure 112006066644219-PCT00013
Figure 112006066644219-PCT00014
Figure 112006066644219-PCT00015
Figure 112006066644219-PCT00016
Figure 112006066644219-PCT00017
Figure 112006066644219-PCT00018
SEQUENCE LISTING <110> Wong, David T. W. St. John, Maie A. R. Li, Tang The Regents of the University of California <120> Salivary mRNA Profiling, Biomarkers and Related Methods and Kits of Parts <130> 02307K-159700PC <140> WO PCT/US05/05263 <141> 2005-02-17 <150> US 60/546,507 <151> 2004-02-20 <150> US 60/546,521 <151> 2004-02-21 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic primer <400> 1 tcaccagggc tgcttttaac tc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic primer <400> 2 atgacaagct tcccgttctc ag 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene beta-actin (actin-beta, ACTB) RT-PCR synthetic primer <400> 3 aggatgcaga aggagatcac tg 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene beta-actin (actin-beta, ACTB) RT-PCR synthetic primer <400> 4 atactcctgc ttgctgatcc ac 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic primer <400> 5 gacccttcga gaaatctcgt ctc 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> house-keeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic primer <400> 6 tctcatcaag cgtcagcagt tc 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 1, beta (IL1B) Q-PCR synthetic primer <400> 7 gtgctgaatg tggactcaat cc 22 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 1, beta (IL1B) Q-PCR synthetic primer <400> 8 accctaaggc aggcagttg 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stratifin (SFN) Q-PCR synthetic primer <400> 9 cctgcgaaga gcgaaacctg 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stratifin (SFN) Q-PCR synthetic primer <400> 10 tcaatactgg acagcaccct cc 22 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tubulin, alpha, ubiquitous (K-ALPHA-1) Q-PCR synthetic primer <400> 11 agcgtgcctt tgttcactg 19 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tubulin, alpha, ubiquitous (K-ALPHA-1) Q-PCR synthetic primer <400> 12 cacaccaacc tcctcataat cc 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin (ACTB) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 13 aggatgcaga aggagatcac tg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin (ACTB) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 14 atactcctgc ttgctgatcc ac 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 8 (IL8) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 15 gagggttgtg gagaagtttt tg 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 8 (IL8) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 16 ctggcatctt cactgattct tg 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 6 (IL6) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 17 ctggcagaaa acaacctgaa c 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 6 (IL6) RT-PCR and qRT-PCR synthetic oligonucleotide primer <400> 18 atgattttca ccaggcaagt c 21 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-actin (ACTB) RT-PCR synthetic oligonucleotide upstream primer F <400> 19 cgtcttcccc tccatcgt 18 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-actin (ACTB) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R1 <400> 20 agctcattgt agaaggtgtg gtg 23 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-actin (ACTB) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R2 <400> 21 atactcctgc ttgctgatcc ac 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-actin (ACTB) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R3 <400> 22 ggtgtgcact tttattcaac tgg 23 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-2-microglobulin (B2M) RT-PCR synthetic oligonucleotide upstream primer F <400> 23 gtgctcgcgc tactctctct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-2-microglobulin (B2M) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R1 <400> 24 ccagtccttg ctgaaagaca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-2-microglobulin (B2M) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R2 <400> 25 ttctctgctc cccacctcta 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene beta-2-microglobulin (B2M) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R3 <400> 26 ccagattaac cacaaccatg c 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic oligonucleotide upstream primer F <400> 27 gagtcaacgg atttggtcgt at 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R1 <400> 28 atgggtggaa tcatattgga ac 22 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R2 <400> 29 gatgtcatca tatttggcag gtt 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GADPH) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R3 <400> 30 agcacagggt actttattga tgg 23 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic oligonucleotide upstream primer F <400> 31 ctgggtttgt cgcaaaactt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R1 <400> 32 gtgggtcctt ctcatcaagc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R2 <400> 33 atgaaggacg ggatgttcac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> housekeeping gene ribosomal protein S9 (RPS9) RT-PCR synthetic oligonucleotide downstream primer R3 <400> 34 ggcaggaaaa cgagacaatc 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dual specificity phosphatase 1 (DUSP1) Q-PCR primer F <400> 35 cctaccagta ttattcccga cg 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dual specificity phosphatase 1 (DUSP1) Q-PCR primer R <400> 36 ttgtgaaggc agacacctac ac 22 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 histone, family 3A (H3F3A) Q-PCR primer F <400> 37 aaagcaccca ggaagcaac 19 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H3 histone, family 3A (H3F3A) Q-PCR primer R <400> 38 gcgaatcaga agttcagtgg ac 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 1beta (IL1B) Q-PCR primer F <400> 39 gtgctgaatg tggactcaat cc 22 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 1beta (IL1B) Q-PCR primer R <400> 40 accctaaggc aggcagttg 19 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 8 (IL8) Q-PCR primer F <400> 41 gagggttgtg gagaagtttt tg 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> interleukin 8 (IL8) Q-PCR primer R <400> 42 ctggcatctt cactgattct tg 22 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1) Q-PCR primer F <400> 43 agagagagtc ttcgggagag g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ornithine decarboxylase antizyme 1 (OAZ1) Q-PCR primer R <400> 44 agatgagcga gtctacggtt c 21 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100 calcium binding protein P (S100P) Q-PCR primer F <400> 45 gagttcatcg tgttcgtggc tg 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100 calcium binding protein P (S100P) Q-PCR primer R <400> 46 ctccagggca tcatttgagt cc 22 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SAT) Q-PCR primer F <400> 47 ccagtgaaga gggttggaga c 21 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spermidine/spermine N1-acetyltransferase (SAT) Q-PCR primer R <400> 48 tggaggttgt catctacagc ag 22 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> growth arrest and DNA-damage-inducible beta (GADD45B) Q-PCR primer F <400> 49 tgatgaatgt ggacccagac 20 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> growth arrest and DNA-damage-inducible beta (GADD45B) Q-PCR primer R <400> 50 gagcgtgaag tggatttgc 19 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> regulator of G-protein signaling 2, 24 kda (RGS2) Q-PCR primer F <400> 51 cctgccataa agactgacct tg 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> regulator of G-protein signaling 2, 24 kda (RGS2) Q-PCR primer R <400> 52 gcttcctgat tcactaccca ac 22 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-oligo-(dT)-24 RT primer for amplification of first strand cDNA <400> 53 tttttttttt tttttttttt tttt 24

Claims (27)

  1. 세포 상과 유체 상을 포함하는 체액에서 세포외 mRNA를 검출하는 방법으로서, 체액의 무세포 유체상 부분을 제공하는 단계와 체액의 무세포 유체 상 부분에서 세포외 mRNA를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 체액이 타액인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 체액이 비자극 타액인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세포외 mRNA를 검출하는 단계가 체액의 무세포 유체상 부분으로부터 세포외 mRNA를 분리하고 세포외 mRNA를 증폭하는 것을 포함하는 방법.
  4. 세포 상과 유체 상을 포함하는 체액의 트랜스크립톰 분석을 실시하는 방법으로서, 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계와 체액의 무세포 유체 상 부분에서 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계를 포함하며, 체액이 타액인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 트랜스크립톰 패턴의 검출이 마이크로어레이 분석에 의해 실시되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 트랜스크립톰 패턴의 검출이 고밀도 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 분석에 의해 실시되는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 트랜스크립톰 패턴의 검출이 정량적 PCR 분석 또는 RT-PCR 분석에 의해 실시되는 방법.
  8. 기관으로부터 배출되는 세포 상과 유체 상을 포함하는 체액을 분석하여 기관에서 유전적 변형을 검출하는 방법으로서, 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 체액의 무세포 유체 상 부분에서 트랜스크립톰 패턴을 검출하는 단계; 및 선결된 패턴과 트랜스크립톰 패턴을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 선결된 패턴은 체액의 정상 무세포 유체상 부분의 일반적인 트랜스크립톰 패턴을 나타내고, 상기 체액은 타액인 방법.
  9. 기관으로부터 배출되는 세포 상과 유체 상을 포함하는 체액을 분석하여 기관내의 유전자의 유전적 변형을 검출하는 방법으로서, 체액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 체액의 무세포 유체 상 부분내의 유전자의 mRNA 프로파일을 검출하는 단계; 및 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일과 상기 유전자의 mRNA 프로파일을 비교하는 단계를 포함하며, 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일은 체액의 정상 무세포 유체상 부분내의 상기 유전자의 mRNA 프로파일을 나타내고, 상기 체액은 타액인 방법.
  10. 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 개체에서 진단하는 방법으로서, 개체의 타액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 상기 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 유전자의 mRNA 프로파일을 제공된 무세포 타액 유체 상 부분에서 검출하는 단계; 및 상기 유전자의 RNA 프로파일을 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일과 비교하는 단계를 포함하며, 상기 유전자의 선결된 mRNA 프로파일은 개체에서 병리학, 질병 또는 질환의 존재를 나타내는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 질병이 구강 및/또는 구강인두의 암이며, 상기 유전자는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P 및 SAT를 암호하는 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 질병은 구강 및/또는 구강인두의 암이며, 유전자는 IL8을 암호하는 유전자인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 질병이 구강인두 편평 세포 암종 또는 두경부 편평 세포 암종인 방법.
  14. 개체에서 구강 또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법으로서, 개체의 타액의 무세포 유체 상 부분을 제공하는 단계; 상기 병리학, 질병 또는 질환과 관련된 트랜스크립톰 패턴을 제공된 무세포 유체 상 부분에서 검출하는 단계; 및 트랜스크립톰 패턴을 선결된 패턴과 비교하는 단계를 포함하며, 트랜스크립톰 패턴에서 선결된 패턴의 특징의 확인은 개체에서 상기 병리학, 질병 또는 질환의 진단인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 질병이 구강 및/또는 구강인두의 암이며, 상기 트랜스크립톰은 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P 및 SAT를 위한 전사물로 구성되는 군으로부터 선택되는 전사물을 포함하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 질병은 구강인두 편평 세포 암종 또는 두경부 편평 세포 암종인 방법.
  17. 개체에서 암을 진단하는 방법으로서, 개체의 체액을 제공하는 단계; IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성되는 군으로부터 선택되는 생물 마커의 프로파일을 체액에서 검출하는 단계; 상기 생물 마커의 선결된 프로파일을 생물 마커의 프로파일과 비교하는 단계를 포함하며, 생물 마커의 프로파일에서 생물 마커의 선결된 프로파일의 특징의 확인이 암의 진단인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 암은 구강인두 편평 세포 암종 또는 두경부 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, 및 SAT로 구성되는 군으로부터 선택되고, 체액은 타액이며, 생물 마커의 프로파일의 검출은 생물 마커 의 mRNA 프로파일의 검출에 의해 실시되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 암은 구강인두 편평 세포 암종 또는 두경부 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성되는 군으로부터 선택되고, 체액은 혈액 혈청이며, 생물 마커의 프로파일의 검출은 생물 마커의 mRNA 프로파일의 검출에 의해 실시되는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 암은 구강인두 편평 세포 암종 또는 두경부 편평 세포 암종이며, 생물 마커는 IL6이고, 체액은 혈액 혈청이며, 생물 마커의 프로파일의 검출은 생물 마커의 단백질 프로파일을 검출에 의해 실시되는 방법.
  21. 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환의 진단을 위한 키트로서, IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, SAT, IL6, H3F3A, TPT1, FTH1, NCOA4 및 ARCR로 구성되는 군으로부터 선택되는, 상기 병리학, 질병 또는 질환을 위한, 체액내 생물 마커의 식별자; 및 식별자를 위한 검출자를 포함하며, 상기 식별자와 검출자는 제14항 내지 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항의 방법의 생물 마커의 체액 프로파일을 검출하는 데 이용되고, 식별자는 체액내의 생물 마커와 관련되며, 검출자는 식별자를 검출하기 위해 이용되며, 이로써 식별자와 검출자는 생물 마커의 체액 프로파일의 검출을 가능하게 하는 키트.
  22. 제21항에 있어서, 질병이 구강 및 구강인두 편평 세포 암종인 키트.
  23. 제21항에 있어서, 질병이 두경부 편평 세포 암종인 키트.
  24. 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 진단하는 방법으로서, 구강 및/또는 전신성 병리학, 질병 또는 질환을 위한 생물 마커로서 타액 mRNA를 이용하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, mRNA는 IL8, IL1B, DUSP1, H3F3A, OAZ1, S100P, 및 SAT를 암호하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 질병이 구강 및 구강인두 편평 세포 암종인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 질병이 두경부 편평 세포 암종인 방법.
KR1020067018925A 2004-02-20 2005-02-17 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및부품 키트 KR20070004725A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54650704P 2004-02-20 2004-02-20
US60/546,507 2004-02-20
US54652104P 2004-02-21 2004-02-21
US60/546,521 2004-02-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127034042A Division KR20130018438A (ko) 2004-02-20 2005-02-17 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 바이오마커 및 관련 방법 및 부품 키트

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070004725A true KR20070004725A (ko) 2007-01-09

Family

ID=34915575

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067018925A KR20070004725A (ko) 2004-02-20 2005-02-17 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및부품 키트
KR1020127034042A KR20130018438A (ko) 2004-02-20 2005-02-17 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 바이오마커 및 관련 방법 및 부품 키트

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127034042A KR20130018438A (ko) 2004-02-20 2005-02-17 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 바이오마커 및 관련 방법 및 부품 키트

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10072297B2 (ko)
EP (1) EP1730304B1 (ko)
JP (2) JP4880484B2 (ko)
KR (2) KR20070004725A (ko)
CN (1) CN1977051B (ko)
AU (1) AU2005216095B2 (ko)
CA (1) CA2558666C (ko)
HK (1) HK1095163A1 (ko)
IL (1) IL177579A (ko)
NO (1) NO340089B1 (ko)
WO (1) WO2005081867A2 (ko)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005081867A2 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 The Regents Of The University Of C Alifornia Salivary mrna profiling, biomarkers, and related methods and kits of parts
US7727715B2 (en) 2004-03-30 2010-06-01 Vector Tobacco, Inc. Global gene expression analysis of human bronchial epithelial cells exposed to cigarette smoke, smoke condensates, or components thereof
CA2574706A1 (en) * 2004-07-21 2006-02-23 The Regents Of The University Of California Salivary transcriptome diagnostics
US20100021928A1 (en) * 2006-06-26 2010-01-28 Technion Research & Development Foundation Ltd. Methods and kits for diagnosing cancer
JP4827025B2 (ja) * 2006-10-12 2011-11-30 国立大学法人 新潟大学 舌癌の悪性度の判定方法
JP2008295327A (ja) * 2007-05-30 2008-12-11 Fujifilm Corp 口腔扁平上皮癌の検出方法、及び抑制方法
WO2008157501A1 (en) * 2007-06-15 2008-12-24 The Regents Of The University Of California Salivary exon core transcriptome
WO2009012340A2 (en) * 2007-07-16 2009-01-22 California Institute Of Technology Microfluidic devices, methods and systems for detecting target molecules
US8476008B2 (en) * 2008-07-23 2013-07-02 Diabetomics, Llc Methods for detecting pre-diabetes and diabetes
ES2441586T3 (es) 2008-08-04 2014-02-05 Institut Clinident Método de evaluación del riesgo de cáncer oral en seres humanos
US20130143747A1 (en) * 2011-12-05 2013-06-06 Myriad Genetics, Incorporated Methods of detecting cancer
US9075060B2 (en) 2009-06-16 2015-07-07 Technion Research & Development Foundation Limited Methods for diagnosing oral or oral-pharyngeal cancer
US10132811B2 (en) * 2009-06-25 2018-11-20 The Regents Of The University Of California Salivary transcriptomic and microbial biomarkers for pancreatic cancer
WO2011031877A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
US20130029339A1 (en) 2009-09-09 2013-01-31 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing kras mutations
JP2011072229A (ja) * 2009-09-29 2011-04-14 Keio Gijuku バイオマーカーとしてのマイクロｒｎａを用いた下咽頭がんの診断・治療選択
US8309299B2 (en) * 2010-05-19 2012-11-13 Hoffmann-La Roche Inc. Combination therapy and method for assessing resistance to treatment
US20140045915A1 (en) 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
US20130295574A1 (en) 2010-11-10 2013-11-07 Exosome Diagnostics, Inc. Method for Isolation of Nucleic Acid Containing Particles and Extraction of Nucleic Acids Therefrom
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
US10676780B2 (en) 2011-09-26 2020-06-09 Qiagen Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
EP2888349B1 (en) 2012-08-24 2022-02-09 Yale University System, device and method for high-throughput multi-plexed detection
JP6608280B2 (ja) 2012-09-25 2019-11-20 キアゲン ゲーエムベーハー 生物学的試料の安定化
US20140188442A1 (en) * 2012-12-27 2014-07-03 Pearson Education, Inc. System and Method for Selecting Predictors for a Student Risk Model
EP2976425B1 (en) 2013-03-18 2019-11-06 Qiagen GmbH Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
WO2014146781A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
WO2014182598A1 (en) * 2013-05-06 2014-11-13 Physicians Choice Laboratory Services, Llc Diagnostic assay combining cellular and cell free nucleic acid
CN105765383B (zh) * 2013-10-28 2018-04-10 唾液科技有限公司 胰腺癌用唾液生物标记物以及使用了胰腺癌用唾液生物标记物的胰腺癌的诊断方法
US20210005324A1 (en) * 2018-08-08 2021-01-07 Hc1.Com Inc. Methods and systems for a health monitoring command center and workforce advisor
GB201417281D0 (en) * 2014-09-30 2014-11-12 Ge Healthcare Uk Ltd Methods and devices relating to the detection of oral cancer biomarkers
WO2016090148A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 IsoPlexis Corporation Analysis and screening of cell secretion profiles
CN107430105A (zh) * 2015-02-09 2017-12-01 阿波根有限公司 用于采集相关应用、分析和诊断的样本的设备、溶液和方法
US11353448B2 (en) 2015-02-13 2022-06-07 California Institute Of Technology Methods and compositions for quantifying metabolites and proteins from single cells
PL3262190T3 (pl) * 2015-02-24 2021-12-20 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Panel biomarkerów do wykrywania nowotworu
CN106446599A (zh) * 2015-08-11 2017-02-22 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种筛选婴幼儿龋病的口腔致病性生物标记物的方法
JP7166169B2 (ja) 2015-11-20 2022-11-07 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の滅菌のための滅菌組成物を調製する方法
GB201602210D0 (en) 2016-02-08 2016-03-23 Ucl Business Plc Detection of cancer
DK3538891T3 (da) 2016-11-11 2022-03-28 Isoplexis Corp Sammensætninger og fremgangsmåder til samtidig genomisk, transkriptomisk og proteomisk analyse af enkeltceller
CN110226084A (zh) 2016-11-22 2019-09-10 伊索普莱克西斯公司 用于细胞捕获的***、装置和方法，以及其制造方法
US20200157637A1 (en) * 2017-05-26 2020-05-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Targeting of anaplastic lymphoma kinase in squamous cell carcinoma
US11124833B2 (en) * 2017-10-27 2021-09-21 Colgate-Palmolive Company Salivary extracellular RNA biomarkers for gingivitis
US20210018507A1 (en) * 2018-03-04 2021-01-21 Mazumdar Shaw Medical Foundation Sall.ivary protein biomarkers for the diagnosis and prognosis of head and neck cancers, and precancers
WO2020128546A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-25 Kromat Műszerforgalmazó Kft. A simple, non-invasive method for diagnosing oral cancer
EP3671213A1 (en) * 2018-12-20 2020-06-24 Kromat Muszerforgalmazó Kft. In vitro method for the diagnosis of malignant conditions
JP2020195314A (ja) * 2019-05-31 2020-12-10 医薬資源研究所株式会社 疾患・体質の分析方法、疾患・体質の分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体
JP7373843B2 (ja) 2019-12-19 2023-11-06 国立大学法人東海国立大学機構 感染の原因生物を予測するための予測装置、予測プログラム及び予測方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6511805B1 (en) * 1996-03-15 2003-01-28 The Penn State Research Foundation Methods for detecting papillomavirus DNA in blood plasma and serum
US6607898B1 (en) 1996-03-26 2003-08-19 Oncomedx, Inc. Method for detection of hTR and hTERT telomerase-associated RNA in plasma or serum
US6759217B2 (en) 1996-03-26 2004-07-06 Oncomedx, Inc. Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer
US20020102553A1 (en) 1997-10-24 2002-08-01 University Of Rochester Molecular markers for the diagnosis of alzheimer's disease
US6294349B1 (en) * 1999-03-01 2001-09-25 University Of Mississippi Medical Ctr. Method of diagnosing and monitoring malignant breast carcinomas
US6291663B1 (en) * 1999-03-03 2001-09-18 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas TADG-12: a novel transmembrane serine protease overexpressed in a ovarian carcinoma
US6617112B2 (en) 2000-10-11 2003-09-09 Monsanto Technology Llc Methods for gene array analysis of nuclear runoff transcripts
WO2003009806A2 (en) 2001-07-25 2003-02-06 Oncomedx Inc. Methods for evaluating pathologic conditions using extracellular rna
WO2005081867A2 (en) * 2004-02-20 2005-09-09 The Regents Of The University Of C Alifornia Salivary mrna profiling, biomarkers, and related methods and kits of parts

Also Published As

Publication number Publication date
JP2011229532A (ja) 2011-11-17
CN1977051A (zh) 2007-06-06
IL177579A (en) 2012-03-29
US9983210B2 (en) 2018-05-29
NO340089B1 (no) 2017-03-06
AU2005216095B2 (en) 2009-09-17
CA2558666A1 (en) 2005-09-09
JP5367760B2 (ja) 2013-12-11
IL177579A0 (en) 2006-12-10
KR20130018438A (ko) 2013-02-22
US20080280772A1 (en) 2008-11-13
US20190040471A1 (en) 2019-02-07
US20140249236A1 (en) 2014-09-04
CA2558666C (en) 2015-11-24
US10072297B2 (en) 2018-09-11
EP1730304B1 (en) 2013-01-02
WO2005081867A2 (en) 2005-09-09
EP1730304A2 (en) 2006-12-13
JP4880484B2 (ja) 2012-02-22
AU2005216095A1 (en) 2005-09-09
JP2007522819A (ja) 2007-08-16
WO2005081867A3 (en) 2006-07-06
CN1977051B (zh) 2013-07-17
NO20064226L (no) 2006-11-16
HK1095163A1 (en) 2007-04-27
EP1730304A4 (en) 2007-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070004725A (ko) 타액 ｍＲＮＡ 프로파일링, 생물 마커 및 관련 방법 및부품 키트
US20200370127A1 (en) Biomarkers in Peripheral Blood Mononuclear Cells for Diagnosing or Detecting Lung Cancers
US11578367B2 (en) Diagnosis of sepsis
EP2715348B1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
AU2005274974B2 (en) Salivary transcriptome diagnostics
US20090208939A1 (en) Identification of Molecular Diagnostic Markers for Endometriosis in Blood Lymphocytes
JP2022163063A (ja) 外傷性脳傷害のバイオマーカー
EP4060048A2 (en) Non-invasive diagnostic method for diagnosing bladder cancer
CA2646254A1 (en) Propagation of primary cells
KR20070085817A (ko) 혈액 내 숙주 유전자 표현 바이오마커를 사용한 전염성질병 임상 표현형 및 기타 생리상태의 진단 및 예측방법
IL295132A (en) Methods for diagnosis and treatment of squamous cell skin carcinoma patients
CN106319062B (zh) 一种用于甲状腺癌辅助诊断或疗效预测的微创试剂盒
US20140308241A1 (en) Biomarkers for t cell malignancies and uses thereof
JP2023157965A (ja) アトピー性皮膚炎の検出方法
US20210079479A1 (en) Compostions and methods for diagnosing lung cancers using gene expression profiles
CN110331207A (zh) 肺腺癌生物标志物及相关应用
US20160298198A1 (en) Method for predicting development of melanoma brain metastasis
WO2007137366A1 (en) Diagnostic and prognostic indicators of cancer
WO2022103947A2 (en) Lactotransferrin and mif promoter polymorhpism detection for cancer detection and treatment
Hou Comparison of multiple comparison methods for identifying differential gene expression in simulated and real papillary thyroid cancer microarray data
WO2019195935A1 (en) Methods for monitoring and treating prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B601 Maintenance of original decision after re-examination before a trial
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20121127

Effective date: 20140731