KR20070000892A - 누에실크 피브로인의 재생방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피브로인 섬사가 용매와 응고제가 완전히 교환되도록 4시간 동안 방치되며 용매와 응고제가 완전히 교환된 후 젖은 상태에서 약 3.0x의 비율로 방사된 섬유를 연신하는 연신단계를 특징으로 하는 실크 피브로인의 재생방법을 제공한다.

Description

누에실크 피브로인의 재생방법{Method of regeneration for fibroin of silk}

도 1은 천연 실크 섬유(실크 II)의 대표적인 X선 섬유 패턴.

도 2는 실크 I과 실크 II에 대한 C CP/MSP NMR 화학적 편이 비교도.

도 3은 희석된 수성 피브로인 용액에서 얻은 주조 상태의 피브로인 필름과 열처리된 피브로인 필름의 DSC 곡선.

도 4는 비정질 피브로인 필름과 200℃에서 열처리한 피브로인 필름의 X선 회절도.

도 5는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 모세관을 이용한 응고율 시험 개요도.

도 6은 상기 실시예에 따른 여러 가지 요인에 따른 투석된 피브로인 용액의 젤화 시간의 변화 그래프로서 도 6a는 젤화 시간에 대한 요소의 영향(0.5g SDS/g 단백질 첨가)을 나타낸 그래프이고 도 6b는 젤화 시간에 대한 SDS 농도의 영향을 나타낸 그래프이고, 도 6c는 젤화 시간에 대한 온도 영향(0.5g SDS/g 단백질 첨가)을 나타낸 그래프이고, 도 6d는 젤화 시간에 대한 pH 영향(SDS 첨가하지 않음)을 나타낸 그래프.

도 7은 상기 실시예에 따른 동결 건조된 피브로인 젤의 X선 회절 곡선으로서 도 7a는 시료의 X선 회절 곡선이고, 도 7b는 동결 건조된 피브로인 젤의 X선 회절 곡선(dH₂O=탈이온수).

도 8은 상기 실시예에 따른 실크 피브로인의 SDS-PAGE.

도 9는 상시 실시예에 따른 시간에 따른 투석된 피브로인 용액 또는 용매(Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH)의 칼슘 농도를 나타낸 그래프.

도 10은 상기 실시예에 따른 실크 피브로인 용액의 13C NMR 스펙트럼 그래프.

도 11은 상시 실시예에 따른 실크 피브로인 용액의 13C NMR 스펙트럼 그래프.

도 12는 상기 실시예에 따른 25℃에서 60분 후 여러 가지 분자 크기에 따른 확산의 차이를 나타낸 그래프.

도 13은 상기 실시예에 따른 피브로인 용액의 응고 과정에서 경계 이동(피브로인의 농도는 13w/v) 상태를 나타낸 그래프.

도 14는 상기 실시예에 따른 수동 연신 시 힘의 분포 상태를 나타낸 도면.

도 15는 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 섬유의 응력-변형 곡선.

도 16은 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 필름의 FTIR 스펙트럼 곡선.

도 17은 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 필름의 X선 회절곡선.

도 18은 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 섬유의 X선 회절곡선.

도 19는 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 섬유의 고체 C NMR 스펙트럼.

도 20은 상기 실시예에 따른 재생 피브로인 섬유의 SEM 영상으로서 도 20a는 천연 실크 섬유이고, 도 20b는 개미산 진액으로부터 얻은 방사 상태의 섬유이고, 도 20c는 개미산 진액에서 연신된 섬유이고, 도 20d는 개미산 진액에서 연신된 섬유의 단면에서 본 세섬유이고, 도 20e는 TFA 진액에서 얻은 방사 상태의 섬유이고, 도 20f는 TFA 진액에서 연신된 섬유.

도 21은 상기 실시예에 따른 누에 실크 피브로인 중쇄의 아미노산 서열.

도 22는 상기 실시예에 따른 누에 실크 피브로인 중쇄의 아미노산 서열의 재배열.

도 23은 상기 실시예에 따른 상합성 실크 펩타이드의 화학 구조식.

도 24는 상기 실시예에 따른 피브로인 중쇄와 경쇄에 제안된 2차원 그림.

도 25는 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 H NMR 스펙트럼.

도 26은 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 C NMR 스펙트럼.

도 27은 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-1H COSY 스펙트럼.

도 28은 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-1H TOCSY 스펙트럼.

도 29는 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-C HMQC(단 결합) 스펙트럼.

도 30은 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-C HMBC(긴 범위) 스펙트럼.

도 31은 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-1H NOESY 스펙트럼.

도 32는 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 1H-1H ROESY 스펙트럼.

도 33은 상기 실시예에 따른 2-D COSY 및 2-D TOCSY 스펙트럼의 지문 영역(Fingerprint Region)비교도.

도 34는 상기 실시예에 따른 실크 펩타이드의 2-D 이종핵 실험 (HMQC 및 HMBC) 도면으로서, 도 34a는 실크 펩타이드 HMQC 스펙트럼의 방향성 구간이고, 도 34b는 실크 펩타이드 HMBC 스펙트럼의 H-C에 대한 긴 구간 상관관계.

도 35는 상기 실시예에 따른 NOESY 스펙트럼에 나타난 긴 거리 1H-1H 공간 작용을 나타낸 도면으로서, 도 35a는 긴 거리 1H-1H 공간 작용이고, 도 35b는 긴거리 -1H 공간 작용.

도 36은 상기 실시예에 따른 NOESY 스펙트럼에 나타난 긴 거리 1H-1H 공간 작용을 나타낸 도면.

도 37은 상기 실시예에 따른 이차원적 펩타이드 중첩 설명도.

도 38은 상기 실시예에 따른 합성 실크 펩타이드의 3-D 모델로서, 도 38a는 기하학적 거리 및 시뮬레이션에 의한 어닐링 계산 전에 확장된 실크 펩타이드의 3-D 구조이고, 도 38b는 시뮬레이션 된 어닐링만으로 계산한 실크 펩타이드의 3-D 모델이고, 도 38c는 시뮬레이션 된 어닐링과 함께 기하학적 거리로 계산한 실크 펩타이드의 3-D 구조.

본 발명은 누에실크의 피브로인의 재생방법에 관한 것으로서, 연신방법 및 연신율을 제어함으로서 습식방사가 가능한 점도특성을 확보하며 인장력이 증가된 재생실크를 형성하는 재생방법에 관한 것이다.

직물 과학은 여러 가지 합성 중합체를 이용한 섬유 재질을 개발해왔다. 그러나 동물 또는 식물에서 얻은 자연 섬유와 비교할 때 많은 경우에 있어서 인조 섬유가 자연 섬유보다 더 좋다고 할 수는 없을 듯하다. 주로 곤충과 같은 몇 가지 동물은 단백질을 이용하여 섬유 조직을 생산하는 독특한 방법을 개발해 왔다. 비록 용도는 다르지만 누에와 거미는 피브로인(Fibroin)으로 알려진 유사한 단백질 물질을 이용하는 동물로 잘 알려져 있다.

자연 섬유 중 실크 피브로인(Silk Fibroin)은 섬유소 섬유 시대 이후로 가장 집중적으로 연구된 재질이다. 예를 들면 1950년대에 여러 관점에서의 연구, X선 회절에 의한 조직 연구 및 실크와 유사한 모델 연구가 실시되어 실크 피브로인의 분자 구조를 밝혀내게 되었다. 그러나 높은 분자량뿐만 아니라 20 가지 서로 다른 암모니아 산의 조합으로 이루어진 단백질의 복잡한 성질은 실크 피브로인의 분자 배열을 결정하고 더 미세한 데니어를 가진 고 강도 섬유로 재생하기 어렵게 만들었다. 재생 피브로인 재질의 공통적인 문제는 천연 실크 섬유보다 약하고 점성이 약하다는 것이다. 이러한 문제는 아직도 해결되지 않고 있다.

같은 기간에 옥수수의 제인 (Zein), 땅콩의 아라친(Arachin) 및 콩의 카제인(Casein)과 같이 식물로부터 얻은 단백질에 대해서도 양모 케라틴 또는 실크 피브로인과 유사한 섬유를 개발하려는 연구가 광범위하게 진행되었다. 그러나 식물 단 백질로부터 얻은 이러한 섬유는 낮은 결정도로 인해 장력이 충분치 못하였. 더욱이 단백질을 추출하기 위한 높은 비용과 강도를 향상하기 위한 후 가공 처리의 필요성으로 인해 이러한 섬유는 경제적으로 실용적이지 못하였다.

지난 수년간 생물 의학과 생명 공학 분야에 실크 피브로인을 이용하는 것에 대한 관심이 증가되어 왔다. 이러한 관심이 증가한 이유는 젖은 상태에서 유연성, 조직 적합성 및 높은 산소 투과성과 결합한 탁월한 기계적 성질 때문이다. 이러한 귀중한 재료를 이용하기 위해서는 분말, 필름, 섬유 또는 매끈한 종이와 같이 원하는 형태로 재생할 필요가 있다.

최근에 연구가들은 최대 강도의 폴리머 Kevlarㄾ에 견줄 수 있는 탁월한 강도, 신장도 및 견고함을 보이는 눈-뜨개 거미(Orb Weaving Spider)에서 얻은 드래그라인(Dragline) 실크에 흥미를 가지게 되었다. 생명 공학은 거미 없이 박테리아, 식물 또는 포유동물 숙주를 이용하여 거미 실을 생산할 수 있도록 하였다. 그러나 위에 말한 문제를 해결하지 않고는 재생 거미 실을 이용하기가 어려울 듯하다.

생합성과 누에가 실크를 생산하는 과정은 실내 온도에서 어떠한 화학물질도 이용하지 않고 물리적 힘으로 고분자 물질의 결정화와 결합한 선택적인 유전자 표현 시스템을 보여줄 수 있기 때문에 흥미롭다. 여러 연구가들이 실크 피브로인의 결정화에 관하여 연구하였지만, 메탄올, 전단 응력 또는 온도 유도에 의한 결정화와 같이 실크 피브로인의 결정화에 대한 몇몇 중요한 요소를 제시할 수 있을 뿐이었다. 실크 가공에 있어서 가장 중요한 전단 응력 유도에 의한 결정화 기법은 방식은 아직 명확하지가 않다.

누에는 50일 이내에 4 단계의 변태 과정인 알 또는 애벌레, 유충, 번데기 및 성충(나방) 과정을 완료한다. 누에는 유충 단계에서만 먹이(뽕잎)를 먹고 방사를 완료하면 번데기가 된다(고치가 만들어짐). 누에 실크는 기본적으로 번데기로 탈피하기 직전 다섯 번째 유충 단계에서만 생산한다.

Shimura et al.은 누에에 의한 생합성 및 실크 단백질 합성의 생물학적 및 생리학적 측면을 조사하였다. 후방 견사선은 실크 피브로인을 합성하여 루멘(Lumen)으로 분비한다. 피브로인은 중간 견사선에 옮겨져서 실짓기에 요구될 때 까지 저장된다. 중간 견사선에서는 루멘으로 세리신(Sericin)을 분비하여 피브로인에 입힌다. 전방 견사선은 실크 방사 과정에서 중요한 역할을 한다.

후방 샘에서는 방사 직전의 다섯 번째 단계에서 상당한 수준까지 DNA 합성이 일어난다. 이 때 후방 샘 세포의 DNA 성분은 이배체 세포에서 예상되는 값보다 200,000배 이상 높은데, 이것은 이러한 세포가 일반 세포보다 더 많은 실크 피브로인 단백질을 생산할 수 있음을 나타낸다. 실크 피브로인은 소단위(Small Subunit)와 대단위(Large Subunit)로 구성된다. 두 종류의 mRNA가 두 가지의 서로 다른 단위인 중쇄(Heavy Chain)와 경쇄(Light Chain)에 대해 복사된다. 그 후 mRNA는 피브로인 합성 장소인 조면소포체(Rough ER)로 이동한다.

실크 단백질 합성과 방사는 전적으로 호르몬으로 제어된다. 뇌 호르몬은 주로 알라타체(Corpus Allatum)에서 혈류로 방출되어 엑디스테로이드(Ecdysteroid)를 분비하도록 전흉선(Prothoracic Gland)을 자극한다. 엑디스테로이드는 피브로인 합성 촉진 및 유지에 중요한 역할을 한다. 엑디스테로이드 성분이 최고에 도달하면 실크 단백질도 최고로 많이 합성된다.

최근 Tanaka et al.은 실크 피브로인이 세 단위인 중쇄(350kDa), 경쇄(26kDa) 및 P25(30kDa)로 구성된다는 것을 발견하였다. 두 가지 다른 mRNA로 합성되는 두 단백질(중쇄와 경쇄)은 이황화 결합(Disulfide Bond)으로 구속된다. 당단백질인 P25는 소수성 작용(Hydrophobic Interaction)에 의해 6개의 결합된 단백질(각각 6개의 중쇄와 경쇄)에 결합된다. 한 개의 P25 분자는 내부적으로 위치하며 복합체의 무결성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 중쇄, 경쇄 및 P25의 실크 피브로인의 분자량은 몰 비로 각각 6:6:1이 되며, 이 비율은 고치 실크와 전방 견사선의 루멘으로 분비되는 피브로인 모두에서 동일하다.

합성된 피브로인은 골지 액포(Golgi Vacuole)에 의해 세포질(Cytoplasm)로 이동한다. 피브로인은 세포막을 통과하여 견사선 루멘에 저장된다. 중간 샘은 피브로인이 아니라 세리신을 합성한다는 점을 제외하고는 후방 샘과 유사하다. 세리신은 세포막을 통과하여 피브로인에 내부 세리신 층에 쌓인 후 후방 샘으로 이동한다.

이 때 피브로인은 회전하는 것이 아니라 원 또는 미셀 구조이다. 그러나 피브로인 분자가 견사선의 전방 부분을 향해 이동함에 따라 정열된 구조를 형성하기 시작한다. Magoshi et al., Viney et al. 및 Vollrath et al.은 견사선 루멘에 저장된 액체 피브로인은 누에(Bombyx Mori) 및 거미(Nephila Clavipes)가 실을 잣기 직전에 액체 결정성을 보인다고 보고하였다. 또한 Vollrath et al.은 방사 전의 피브로인 분자는 산 상태임을 기술하였다. 이러한 산은 프로톤 펌프(Proton Pump)로 제거된다.

견사선 전방 부분에 있는 액체 실크는 누에의 머리 운동에 의한 연신(Drawing)과 방적돌기를 통한 내부로부터의 방출 힘의 결합에 의하여 섬유가 된다. 방사 속도는 0.4~1.4cm/sec이다. 실크를 강제로 더 빨리 당겨내면 견사선의 전방 부분에서 액체 실크가 굳어진다. 전방 부분에서 기계적인 변성이 일어나 형성된 핵이 방적돌기를 향해 이동할 때 전단 변형에 의해 회전된 미세 섬유(Micro-fibril)로 성장한다. 이러한 미세 섬유는 경사진 노즐을 통해 함께 빠져나와 세섬유를 형성하고 다시 결합하여 두 개의 삼각형 단면을 가진 피브로인 섬사를 만든다. 두 개의 피브로인 섬사는 세라신 접합제로 코팅되어 한 개의 실크사로 보이게 된다.

누에 실크는 피브로인과 세라신의 두 가지 단백질로 이루어진다. 실크 섬유에 기계적 강도와 독특한 광채를 주는 피브로인은 조직 물질로 이용되며 세라신은 피브로인 섬사를 함께 접합하여 실크사로 만든다. 수확한 고치는 160℃에서 한 시간 동안 오븐에서 가열하여 번데기를 죽인다. 세라신을 부드럽게 하기 위해 뜨거운 물로 적신 고치에서 실을 뽑으면 실크 원사가 된다. 세라신은 직물 가공 또는 생체 물질로 이용되기는 하지만 응용 범위가 넓지는 않다. 따라서 세라신은 보통 실크 가공 시작단계에서 알카리성 비눗물에서 끓여 제거한다. 이 과정을 정련(Degumming)이라 부른다. 정련 과정에서는 약 22~25%의 무게 손실이 발생한다.

실크 피브로인을 재생하기 위해서는 결정 형태의 β-시트 구조를 파괴하기 위한 용해 과정이 필요하다. 실크 피브로인을 용해하기 위해서는 보통 농축된 수성 리튬염 용액과 중성 소금물-알코올 시스템의 두 가지 종류의 용매를 사용한다. 9M 수성 LiBr 용액 또는 9M 수성 LiSCN 용액은 전자에 속하며 질산 칼륨-메탄올시스템(Ca(NO₃)₂4H₂O-MeOH; 몰 비: Ca:H₂O:MeOH=1:4:2 또는 염화칼슘-에탄올 시스템(Ajisawa의 방식;몰 비: CaCl₂:H₂O:EtOH=1:8:2)은 후자에 속한다. 이러한 용매에 포함된 피브로인 용액은 상당한 양의 염분을 함유하고 있으므로 어떤 경우에든 염분(리튬 또는 칼슘)을 제거해야 한다. 이러한 용매 외에도 구리에틸렌 디아민(Cupriethylene Diamine) 또는 N-methyl morpholine N-oxide(NMMO)도 실크 피브로인 용매로 이용된다. 그러나 구리에틸렌 디아민은 용해 과정에서 상당한 열화를 일으킨다.

Yamada et al.은 조사(Reeling), 정련(Degumming) 및 용해(Dissolution)과정이 누에 실크 피브로인의 분자량 B를 감소시킬 수 있다고 보고하였다. 또한 피브로인 용액을 준비하기 위한 최소 열화 조건을 발견하였다. 신선한 고치를 80℃로 예열한 8M 수성 요소로 적신 후 고치가 파괴되도록 10분간 강한 교반 과정을 거친다. 세척하여 건조한 후 15분간 실온에서 저으면서 9M 수성 LiSCN으로 고치를 용해한다. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Surfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)는 피브로인의 중쇄를 나타내는 350kDa의 분자량에서 이러한 용액이 분명한 띠를 만드는 반면에 다른 용액은 그렇지 못하다는 것을 보여주었다.

투석된 피브로인 용액은 전단 변형력이 없으면 시간이 경과함에 따라 혼탁도가 증가하므로 적합하지 못하다. 따라서 투석(Dialysis)을 완료한 직후에는 다음 공정이 요구된다. 투석된 피브로인 용액은 점성이 낮기 때문에 방사에는 적합하지 못하며 초원심 분리(Ultra-centrifugation)로 농축한 후 방사를 위한 진액으로 사 용할 수 있다. 그러나 응축된 수성 피브로인 액체는 전단 변형력에 너무 민감하여 방적돌기를 막고 압출 헤드에서 굳어버리기 때문에 습식 방사가 불가능하다. 투석된 피브로인 용액을 바로 얇은 필름 형태로 만들 수는 있지만 상당히 긴 기간 동안 피브로인의 안정성을 유지하기 위해서는 동결 건조시켜야 한다.

동결 건조된 피브로인 또는 피브로인 용액에서 주조된 필름은 HFIP(Hexafluoroisopropanol), HFA(Hexafluoroacetone) 또는 개미산과 같은 강한 산성 용매로 용해할 수 있다. 개미산에 용해된 약 15% w/v 피브로인 용액은 전통적인 습식 방사(Wet Spinning)에 적합한 점도를 가진다. 메탄올은 응고제로 흔히 사용된다. 습식 방사 중 또는 후에는 습식 방사된 피브로인 섬유의 β-시트 성분을 증가시키기 위한 연신(Drawing)이 필수적인데, 이것은 재생 피브리온 섬유의 기계적 강도를 결정한다.

전통적인 습식 방사에 의한 섬유 제조 외에도 몇몇 연구가들은 필름 또는 막 주소, 다른 폴리머와 혼합(생체 또는 합성 중합체), 화학적 변이, 효소 고정화및 전기방사와 같이 실크 피브리온을 이용한 연구를 계속하고 있다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명의 목적은 실크의 피브로인을 섬유로서 물성을 확보하면서 재생할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 습식방사가 가능할 수 있도록 물성이 보강된 실크의 재생방법을 을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 실크 피브로인의 구조적 측면을 분석하여 실크의 재생방법을 제안함에 있다.

이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 고안의 바람직한 일실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.

실크 단백질의 아미노산 성분은 표 1에 나타나 있다. 누에 실크 피브로인은 세 개의 β-아미노산인 글리신(G;Gly), 알라닌(A;Ala) 및 세린(S;Ser)을 몰 비로 각각 3:2:1의 비율로 함유하고 있다. 피브로인 용액을 키모트립신(Chymotryipsin)으로 처리하면 처음 물질의 약 60%로 알맹이 형태의 침전물이 형성된다. 이 침전물은 Cp(키모트립신 침전물)로 나머지 부분은 Cs(키모트립신 가용성 물질)로 불린다. Cp 부분은 주로 Gly, Ala, Ser 및 소량의 Tyr로 구성되며 분자량이 약 4kDa이다. 더 큰 아미노산은 주로 Cs 부분에 포함된다. 다양한 시간 동안 HCl로 Cp 부분을 부분 분해한 결과 주로 AG, GA, SG, YG 및 GY(Y=티로신, Tyr)와 같은 디펩타이드(Dipeptide)가 발견되었으며 소량의 AA도 발견되었다. 이러한 성분은 여러 가지 트리펩타이드(Tripeptide)인 GAG, SGA, AGA 및 GVG(G=발린, Val)로 분리하고 두 가지의 테라펩타이드 AGAG 및 SGAG도 분리하였다. 이러한 결과로부터 Cp 부분의 주된 아미노산 서열은 다음과 같다는 결론을 내렸다:

- GAGAGSGAAG[SG(AG)N]8Y-

여기서 n은 보통 2이다. 천연 실크 섬유와 유사한 d-간격을 보이는 Cp 부분의 X선 분말 패턴으로부터 Warwicker et al.은 실크 피브로인의 결정체 구간은 반복되는 GAGAGS 서열을 포함한다고 제안하였다. 이것은 유전자 서열로도 확인되었다. Zhou et al.은 대부분의 GX 디펩타이드 단위는 두 개의 헥사펩타이드인 GAGAGA (420회 복사) GAGAGY(120회 복사)의 일부로 존재한다고 보고하였다. 여기서 X는 65%는 A, 23%는 S, 10%는 Y로 반복된다. 따라서 누에 실크 피브로인의 결정체 구간은 주로 (GAGAGS)n과 같이 반복되는 6개의 아미노산 서열로 구성된다.

실크 피브로인의 분자량은 여러 가지 측정방법을 이용하여 다양한 결과를 얻었다는 점에서 확실하지가 않다. 예를 들면 초원심분리로는 400kDa, 침전 분석으로는 370kDa, 빛의 분산에 의해서는 435kDa의 값을 구하였다. 그 이유는 서로 다른 분자량 평균을 측정하며 합계의 정도가 다르기 때문이다. Cantor et al.은 전기이동(Electrophoresis) 측정으로 Gly와 Ala 함유량이 높은 폴리펩타이드는 실제 크기보다 더 큰 것처럼 행동한다고 보고하였다. 이러한 이유로 인해 정확한 분자량을 측정하는 것이 어려웠다. 그러나 전기이동(Electrophoresis) 및 유전자 서열 연구로부터 중쇄가 350kDa, 경쇄가 26kDa, P25가 30kDa로서 일반적으로 실크 피브로인의 분자량은 약 400kDa인 것으로 생각된다.

1. 천연 실크 섬유(Silk II)의 결정 구조

X선 회절로 실크 피브로인의 결정 구조를 밝히고자 하는 여러 가지 연구가 진행되어 왔다. 고체 상태에서 실크 피브로인은 주로 두 가지 동질 이상 결정체인 실크 I과 실크 II로 존재한다. 천연실크는 본래는 실크 II 상태로 존재한다. Marsh et al., Warwicker et al. 및 Lutz et al.은 X선 회절로 실크 II의 결정 구조를 연구하였다. 도 1은 천연 실크 섬유(실크 II)의 대표적인 X선 섬유 패턴을 보여주며, 여러 저자가 계산하고 측정한 적도방향 반사 간격은 표 2에 주어져 있다.

저자들은 실크 II가 직교 단위 셀 (a=9.40Å; 수소 결합 방향, b=6.97Å; 섬유 축, c=9.20Å; 시트간 간격)을 가진다고 제안했으며 실크 II가 역 평행 사슬로 주름잡힌 β-시트 구조를 가지는 것으로 기술하였다. 또한 저자들은 결정 단위 셀이 Gly, Ala 및 Ser 잔기(Residue)만 포함한다고 가정하였다. Tyr 및 Leu(류신:L)과 같은 더 큰 아미노산은 비정질 구간에 위치한다. 4개의 사슬(8개의 아미노산 잔기)은 b 축(섬유 축)을 따라 단위 셀에 결합하여 주름 잡힌 두 시트를 수용한다. c 축을 따라 주름 잡힌 시트의 간격은 적도 방향 반사(00l)의 강도로부터 구한다. 아래의 일차원 Patterson 함수를 이용하여 인접하는 시트간의 거리는 번갈아 3.5Å 및 5.7Å이 된다는 것을 발견하였다:

이 함수는 두 개의 최대값인 3.5Å 및 5.7Å을 가진다. 따라서 Gly 잔기로만 구성된 두 시트는 3.5Å의 거리로 결합할 수 있으며 Ala 및 Ser을 포함하는 시트는 5.7Å으로 결합할 수 있다. 단위 셀은 직교하지만 제안된 구조의 대칭성은 P21의 공간 그룹을 가지며, 이것은 단사정계의 단위 셀로 나타난다. 이러한 이유로 인해 Marsh et al.은 실크 II가 가성 사방정계(Pseudo-orthorhombic) 또는 단사정계(monoclinic, β=90°) 단위 셀을 가진다고 기술하였다. 2중 나선 축은 Ser과 Ala 잔기가 동일하다는 가정을 기본으로 한다. 6개의 아미노산 서열 GAGAGS가 규칙적으로 반복하면 b-축에서 21Å의 반복 거리를 가진 더 약한 일차 및 이차 선이 강하게 노출된 필름에 나타내난다. 이것은 실크 II의 X선 섬유 패턴을 잘 설명하지만 (001)로부터의 반사에 대한 계산 및 측정한 강도가 거의 일치하지 않기 때문에 실크 II의 결정 구조로 채택하기에는 한계가 있다. 적도 방향 반사에 대해 관측한 스펙트럼은 c축 거리가 9.2Å밖에 되지 않음을 충분히 설명하지 못하는데, 이것은 모델 펩티튜드 (GAGAGS)n에 대한 시트간 간격(9.13Å)에 가깝다. 35Å 및 15Å의 간격으로 확산 반사가 일어난다는 사실은 동일 간격이 9.2Å보다 훨씬 더 크다는 것을 강하게 나타낸다. 제안된 가상 구조는 Gly, Ala 및 Ser 잔기만 고려한다. 보통 Tyr인 더 큰 아미노산의 나머지 18%는 가상 단위 셀의 c 축의 변형의 원인이 된다. 또한 실크 피브로인의 결정 부위에 Tyr 잔기의 존재 유무를 만족스럽게 제시하지 못한다.

Faster er al.은 실크 피브로인의 결정 조직을 기술하였다. 결정체는 섬유축을 따라 연장된다. 001 반사의 확산성은 격자 변형 또는 c 축에 평행한 구조가 여러 번 반복되기 때문이라는 것을 발견하였다. 적도방향 반사 폭의 절반에서 결정체의 측면 치수는 약 a 축으로 약 59Å c축으로 약 23Å이다. 결정체는 각각 12개의 사슬을 가진 약 5개의 주름 잡힌 시트를 수용한다. 피브로인 격자 결정의 변형된 특성은 피브로인 단일 결정에 SEM 연구에서 Lotz et al.도 보고한 바 있다.

최근에 Takahashi et al은 누에 실크 섬유에 대한 더 자세한 X선 분석을 보고하였다. 분자 배열에 대한 4 범주의 모델 중에서 저자들은 두 개의 반 극성 역 평행(AA)하는 β-시트구조가 여러 방향에서 만족스럽게 쌓일 수 있다고 제안하였다. March et al.이 이전에 제안한 바와 같이 부분적인 피브로인 결합이 역평행하는 주름잡힌 β-시트에 의해 이루어지기는 하지만 개선된 실크 II 모델은 통계적인 방식으로 β-시트 면의 무질서를 설명한다. 더욱이 AA β-시트 모델은 이전의 연구에서 Ala 잔기에 동일한 것으로 간주되었던 피브로인 분자의 Ser 잔기가 이웃 체인의 펩타이드 결합에서 Carbonyl Oxygen과 수소결합을 하는데 실제로 기여함을 나타낼 수 있다.

폴리펩타이드의 13C NMR에 의한 화학적 편이는 서열과 결합에 따라 달라진다. 그러나 화학적 편이에 대한 서열 효과는 5개가 고리를 형성하는 Pro(프롤린;P) 잔기를 제외하고는 결합 효과에 비해 비교적 작다. 천연 실크(실크 II)의 역평행 β-시트 고조도 Gly의 Carbonyl Carbon과 Ala의 Carbonyl Carbon인 Cα 및 Cβ의 배열에 따른 CNMR 화학적 편이로 확인하였는데, 이것은 해당 모델 펩타이드로도 잘 설명된다.

2. 누에 피브로인의 용액 구조

실크 가공 중에 실크 피브로인은 수성 용액(투석된 피브로인 용액; 희석 또는 방사 진액; 농축)과 농축된 소금 용액(피브로인이 농축된 소금 용액에 용해됨)의 두 가지 형태로 존재한다. Canetti et al.은 CD(Circular Dichroism) 스펙트럼을 분석하고 희석된 수성 용액에 포함된 피브로인 분자는 주로 불규칙한 코일 형태를 이룬다고 보고하였다. 이러한 사실은 IR 및 용액 13C NMR 연구로도 확인되었다. Siddiquee et al.은 광학적 유동 측정(Otical Rheometry)를 이용하여 농축된 소금 용액에 포함된 피브로인 결합에 관하여 연구하였다. 저자들은 피브로인 분자가 농축된 소금 용액에서도 불규칙한 코일 형태로 존재하며 농축된 소금용액에 포함된 피브로인의 결합은 용액의 정전기 특성에 따라 달라진다고 결론을 내렸다. 또한 정전기 차폐는 전단 응력이 가해지면 구조 형성을 억제한다.

응축된 용액에서의 피브로인 결합은 실크 섬유의 형성 기법을 보여줄 수 있기 때문에 특히 중요하다. Askura et al.는 13C NMR 분광법을 이용하여 누에 피브로인의 수용액에 대한 결합과 체인 동역학에 관하여 연구하였다. Samia Cynthia Ricini 실크 피브로인의 Ala 카본(C=O, Cα 및 Cβ)에서 구한 첨두치와 비교하면 S. C. Richini 실크 피브로인과는 달리 B. mori 실크 피브로인은 α-나선형 부분을 가지지 않음을 보여주었다. 또한 긴 범위 상수인 3JC'-N-Cα-H는 1H-결합된 13C NMR 스펙트럼의 Gly Carbonly Carbon 첨두치에 대한 이중선의 간격으로 결정되었다. 긴 범위 결합 상수(~2.6Hz)에 대한 값은 농도가 증가함에 따라 약간 감소한다. 실크 I 구조의 C'-N-Cα-H의 토션 각 φ로부터 3JC'-N-Cα-H는 0.75Hz로 계산된다. 이것은 실크 피브로인의 실크 I 배열이 농도가 증가하는 것으로 나타날 수 있음을 의미한다. 최근의 CD 데이터는 수성 피브로인 용액의 나선 부분의 농도가 5% w/v 이상임을 보여준다. 저자들은 이것이 α 나선이기 보다는 실크 I 형식의 느슨한 나선일 수 있다고 결론지었다. 그러나 스핀-격자 이완 시간 (T1) 연구에서 τ에 따른 In(M

-Mτ)의 도표는 단일 지수형태로서 체인 동력학 관점에서 보면 액체 실크(농도≒30w/v%)에는 한 가지 성분만 존재한다는 것을 의미한다.

Aybu et al.은 피브로인 용액의 젤화(Gelation)에 관하여 연구하였다. 저자들은 피브로인 용액에서 형성되는 실크 II 구조로 인해 젤이 형성되며 젤화는 피브로인 용액의 pH에 따라 달라진다는 사실을 발견하였다. pH가 약 3.0~4.0일 때는 2일 이내에 젤화가 발생하며 pH가 1.5 이하 또는 13.0이상에서는 젤화가 일어나지 않았다. Vallrach et al.은 산성 상태에서 β-시트 형성에 의한 젤화는 산성 상태에서 거미 섬유의 형성에 따른다고 보고하였다.

4. 실크 I의 구조

실크 피브로인은 주로 두 가지의 동질 이상 결정체인 실크 I과 실크 II로 존재한다. 누에의 견사선(Silk Gland)에 들어있는 액체 실크는 농도가 증가함에 따라 방사(Spinning) 직전에 불규칙한 코일에서 실크 I으로 배열을 바꾸는 것으로 생각된다. 실크 I은 견사선에서 나온 액체 실크를 기계적 장애 없이 천천히 말리거나 결정체 부분(Cp)을 수성 LiBr 용액에서 침전시킴으로써 얻어진다. 이전에는 X선 회절 연구로 실크 I의 구조를 연구하였다. 이러한 샘플은 분말 패턴에서 실크의 단위 셀의 크기와 모양을 제공하지만 실크 I의 섬유 패턴을 구하기 위해 샘플을 준비하면 실크 I에서 실크 II로 배열이 천이하므로 X선 회절로 분자 배열을 정의하기는 어렵다.

Lotz와 keith는 Ala 및 Gly 잔기가 각각 β-시트와 α-나선과 가까운 폴리 (Ala-Gly)n의 회절 패턴과의 유사성을 바탕으로 크랭크 축 모델을 제시하였다. 반면에 Konishi와 Kurokawa는 희석된 LiBr 용액의 Cp 부분에 대한 X선 회절 연구에서 느슨한 나선 모델을 제시하여 a=4.59Å(수소 결합 방향), b=7.20Å(시트간 거리) 및 c=9.08Å9섬유 축)인 직각 단위 셀을 설명하였다. 섬유 축에 따른 전이는 2.27Å로서 α-나선(1.5Å)에 해당하는 값도 길고 실크 II 타입(역평행 β-시트; 3.5Å)보다 짧다. Fossey et al.는 시트와 유사한 모델을 제안하였는데, 여기서는 폴리 (L-Ala-Gly)n의 결합 에너지 계산을 바탕으로 Ala 잔기는 오른손, Gly 잔기는 왼손 시트와 같은 배열을 채택한다.

최근에 Asaura et al.은 CP/MAS(C Cross Polarization and Magic Angle Spinning) NMR을 이용하여 고체 상태의 실크 I 구조를 연구하였다. 실크 I과 실크 II에 대한 C CP/MSP NMR 화학적 편이 비교는 도 4에 나타내었다. 저자들은 Ala(β-시트)과 Gly(α-나선)의 배열이 배열에 따라 달라지는 C 화학적 편이와 일치하지 않으므로 Lotz와 Keith의 크랭크 축 모델은 수용할 수 없다는 것을 보여주었다. Konishi와 Kurokawa의 느슨한 나선 모델은 배열에 따라 달라지는 C 화학적 편이와 일치였지만 Fossy et al.의 시트와 유사한 모델도 N 및 C NMR 화학적 편이 곡선과 일치하였기 때문에 이 모델을 수용할 수 있을지에 대해서는 언급할 수 없었다. 최근에 Asakura et al.은 OMAS(Off Magic Anagle Spinning) 및 REDOR(Rotational Echo Double response)에 대해 이차원적 (2-D) 스핀 확산 NMR을 이용하여 연구한 (Aal-Gly)15 구조로부터 반복적인 β-회전 형식 II 구조와 같이 실크 I에 대한 새로운 모델을 제안하였다.

5. 실크 III의 구조

최근에 Valluzzi et al.은 TEM과 단결정 전자 회절 방법을 이용하여 실크 III 구조를 발견하여 보고하였다. 희석된 수성 피브로인 용액은 공기-물 접합부에 얇은 막을 형성한다. 단일 축으로 회전한 결정 조직이 압력을 가한 필름에서 발견되었다. 계산한 d-간격과 강도는 3중 왼손 나선 체인 구조와 일치한다. 실크 피브로인의 결정체 잔기 (GAGAGS)n은 3중 나선 결합에 의해 친수성 Ser 잔기와 친수성 Ala 잔기로 분리된다. 이것은 체인이 계면활성제로 작용하게 하여 한편으로는 Ser 잔기(CH₂-OH)의 친수성 측 체인이 물과 작용하게 하고 다른 한편으로는 Ala 잔기(-CH₃)의 친수성 측 체인이 공기중으로 튀어나오게 한다. 3중 나선 구조는 공기-물 접합부에서 양친성(Amphiphilic)에 의해 유도된다. 3/2 왼선 나선으로 된 피브로인 분자는 삼각형 단면 사슬 형태를 형성하여 육각형으로 완성된다. 그러나 실크 III 구조는 안정도가 낮을 뿐만 아니라 물질에서 큰 비중을 차지하지 않으므로 중요하지 않다. 실크 III은 실크 I과 마찬가지로 기계적 응력, 메탄올 처리, 열처리, 등으로 쉽게 실크 II로 변한다.

6 재생 피브로인 재질의 구조 및 특성

실크 피브로인은 필름, 분말, 젤 또는 섬유와 같은 여러 가지 형태로 재생할 수 있다. 필름 주조는 실크 피브로인을 가공하는 가장 쉬운 방법이다. 1970년대에 Magoshi et al.은 DSC(Differential Scanning Calorimetry)를 이용하여 재생 피브로인 필름의 열 특성을 연구하고 IR 분광법과 X선 회절을 이용하여 구조를 확인하였다. 도 3은 주조 형태의 피브로인 필름에 대한 DSC 곡선을 보여준다. 175℃에서 발생한 굴곡은 유리 천이에 기인하며 210℃에서의 발열성 피크는 결정질화(불규칙한 코일->β-시트)로 인식된다. 280℃에서의 고온은 열화로 보여진다. 희석된 수성 피브로인 용액에서 만든 주조 상태의 피브로인 필름은 불규칙한 코일 배열(비정질)을 이루는 것으로 알려져 왔다. 비정질 피브로인 필름은 열처리, 유기 용매(메탄올, 에탄올, 아세트산 등) 처리, UV 조사, 장시간 보관 등으로 β-시트 구조로 배열을 바꿀 수 있다. 이러한 처리 후에는 불규칙 코일에서 β-시트 구조로 천이하여 175℃에서의 굴곡 및 210℃에서의 발열이 DSC 곡선 상에서 사라진다.

IR 분광법 또한 실크 피브로인이 불규칙 코일에서 β-시트 구조로 천이하는 것을 확인하기 위한 유용한 방법이다. 1660, 1540, 1235 및 650cm-1에서 관측되는 흡수 밴드는 각각 아미드 I(C=O 신축 ), 아미드 II(NH 굽힘), 아미드 III(C-N 신축) 및 아미드 V (NH 진동)에 해당하며, 불규칙 코일 구조의 특징을 나타낸다. 1630, 1535, 1265 및 700cm-1에서 나타나는 해당 밴드는 각각 β-시트 배열을 나타낸다. 배열 변화에 의한 이러한 대역의 편이는 수소 결합 상태가 변하기 때문이다. X선 회절도 재생 피브로인 필름의 구조가 불규칙 코일(주조 상태의 필름; Ring of Halo)에서 β-시트 구조(열처리된 필름; Debye-Scherrer Ring)로 천이하는 것을 보여준다(도 4). 유기 용매 처리와 열처리에 의한 배열 천이는 이 두 요인에 의해 응고제와 어닐링 온도가 각각 결정되므로 섬유 생성 과정에서 특히 중요하다.

Park et al.은 동결 건조된 피브로인의 조직과 특성을 조사하고 개미산 용액으로 피브로인 필름을 재생하였다. 저자들은 투석한 수성 피브로인 용액에서 얻은 냉동 건조된 피브로인은 냉동 온도(-10℃~-60℃)와 무관하게 불규칙한 코일 구조를 가지는 것으로 보고하였다. 또한 UV-VIS 분광법을 이용한 혼탁도 연구에서 피브로인-개미산 용액은 수성 피브로인 용액보다 더 나은 안정도를 가진다고 보고하였다. 중요한 사실은 피브로인-개미산 용약으로부터 얻은 주조 상태의 필름은 열 또는 메탄올 처리 없이도 이미 β-시트 구조를 가진다는 것을 발견하였다. 또한 X선으로부터 계산한 결정도를 IR 스펙트럼으로부터 구한 결과와 비교하고 동적인 열역학적 분석(DMTA) 데이터를 분석하여 개미산과 메탄올에서 얻은 재생 피브로인 필름의 규칙적인 구조 형성(좁은 범위의 규칙성/넓은 범위의 규칙성) 기법을 제시하였다.

최근 거미에서 유전공학적으로 수 그램의 실크 피브리온을 생산할 수 있게 됨에 따라 실크 피브리온을 이용한 섬유 형성에 관한 연구가 증가하고 있다. Yao는 섬유에 적용되는 용매의 성질과 방사 후 처리가 재생 피브리온 섬유의 전반적인 양과 질에 영향을 미치는 중요한 요인이 될 것이라고 지적하였다. 생사 또는 유전 공학적 합성으로 얻은 피브로인에서 방사 진액을 직접 구하는 것은 불가능하며, 피브로인의 결정 구조를 응축된 소금 용액으로 파괴한 후에 방사 진액을 얻을 수 있다. 지금 까지는 비록 매우 독성이 강한 용매이기는 하지만 HFIP(Hexafluoroisopropanol) 및 HFA (Hexafluoroacetone)을 이용하여 상대적으로 안정된 방사 원액을 제조하였다. 또한 개미산도 이러한 목적으로 이용할 수 있다.

Jelinsky et al.은 C CP/MAS NMR 스펙트럼으로부터 재생된 피브로인 섬유의 β-시트 성분은 방사 후 연신(Drawing)에 의해 상당히 증가함을 인식하였다. 응력-변형 곡선은 재생 피브로인 섬유의 강도가 β-시트 성분에 따라 증가함을 확인시켜 주었다. Yao et al.은 WAXS 자료로부터 방사 후 어닐링이 결정 크기를 확대한다고 주장하였다.

7. β-시트 형성

중합체 물질의 결정 크기와 순서가 기계적 강도를 포함하여 물리적 성질을 결정하는 것으로 알려져 있다. 역 평행 β-시트는 실크 피브로인의 기본적인 결정 형태이다. 따라서 β-시트 결정의 형성 기법과 실크 피브로인에 함유된 β-시트 결정의 크기와 순서를 연구하는 것이 중요하다. 상대적으로 작은 단백질 분자(분자량 15kDa 이하)의 경우, 전체 분자 구조와 구조 천이 메카니즘은 다차원 다핵 NMR 분광법 또는 분자 레벨의 X선 결정 분석으로 검사할 수 있다. 그러나 실크 피브로인과 같이(약 400 kDa) 분자량이 큰 고분자의 경우에는 이러한 분석이 매우 어렵다. 이러한 이유로 인해 지금까지 실크 피브로인의 β-시트 형성 또는 섬유 형성 메카니즘에 관한 연구는 거시적 레벨로 한정되었다.

여러 연구가들이 전단 변형에 의한 결정화 관점에서 누에의 섬유 형성 메카니즘에 관하여 연구하였다. Iizuka는 실크 피브로인(불규칙 코일)의 분자가 변형되어 용액에서 섬유 구조(β-시트)를 형성하는 임계 전단 변형율을 보고하였다. 이러한 전이는 전단 응력에 의해 분자 사슬이 풀리면서 발생하여 섬유 핵을 생성하며 이것은 피브로인 섬사로 성장한다. 임계 전단 변형율(전체 농도 범위에 걸쳐 100s-1 이하)은 용액의 피브로인 농도가 증가함에 따라 증가한다. 그러나 이러한 놀라운 결과는 실크 섬유를 용해하기 위해 사용한 잔여 리튬 염 때문일 수도 있다. 피브로인 농도가 증가함에 따라 투석으로 염분을 제거하는 것은 더 어려워진다. 사실 리튬은 실크 피브로인과 친화력이 높으며 특히 제거하기가 어렵다. 리튬 염이 남아 있으면 임계 전단 응력율이 증가할 수 있다.

Magoshi et al.은 누에의 중간 견사선으로부터 액체 실크의 신장비(Extension Ratio)로 누에가 실크를 만드는 방법을 설명하였다. 신장비가 100~450mm/sec일 경우 피브로인 분자는 신장 방향으로 회전하지만 불규칙 코일 배열은 여전히 유지된다. 500mm/sec 이상의 비율에서는 불규칙 코일에서 β-시트로의 배열 변경과 회전된 세섬유로의 결정화가 관측된다. Yamaura et al.은 정적인 상태에서 유동에 의한 실크 피브로인의 결정화를 기술하였다. 유동에 의한 결정화와 결합한 전단 변형에 의한 결정화는 누에가 섬유를 만드는 과정을 설명하는 중요한 요인이 될 수 있다.

천연 실크 섬유와 재생 피브로인 재질이 거시적으로 같은 β-시트 구조를 가짐에도 불구하고 기계적 강도 및 부스러짐 등에서 완전히 다른 성질을 보인다는 점은 커다란 수수께끼였다. 대답은 피브로인 분자 또는 조직의 미세구조에 있을 것이다. 전단 변형에 의한 β-시트의 형성은 아직 분명하지 않다. 그러나 이러한 질문은 분자를 구역별로 이해함으로써 해결할 수 있을 것이다. 이것은 실크 피브로인이 진화적으로 보존되는 유전자에 의해 생성되는 독특한 서열 특성을 가지며 이로 인해 여분의 서열 및 불규칙한 서열은 독특한 기능을 한다는 것을 의미하므로 가능할 수도 있다.

이 연구의 목표는 실크 피브로인 섬유의 방사 시 β-시트 형성에 관하여 연구하는 것이다. 이 연구는 섬유 가공 기법을 향상시킴으로써 천연 재질의 특성에 가까운 향상된 특성을 가진 피브로인 섬유의 재생에 초점을 맞춘다. 또한 보존된 서열과 중요한 부분의 분자 결합 사이의 관계를 연구함으로써 이러한 분자를 이해하는데 중점을 둔다.

8. 실험방법

(1) 원사 : 브라질에서 Fiacao de Seda Bratac S.A가 생산한 실에 대한 평균 데니어가 20.86인 등급 5A 생사를 사용하였다. 실의 특성은 표 3에 주어져 있다.

(2) 화학물질

질산칼슘 및 메탄올과 같이 피브로인을 용해하기 위한 화학 물질은 더 이상의 정제가 필요 없는 시약 등급으로 Fisher Scientific과 Aldrich에서 구입하였다. 기계적 교반기와 실리콘 항온 유조(Oil Bath)와 같이 용해 과정에 필요한 장비는 Fisher Scientific에서 구입하였다.

(3) 정련(Degumming)

실크 피브로인을 얻기 위해 정련 과정을 통해 세리신을 제거하였다. 뜨거운 물(80℃)에서 10분간(항온조에 대한 실크의 욕비(Bath Ratio)는 1:100 w/v (g/mL)였다) 0.25% w/v Sodium Lauryl Sulfate 및 0.25 % w/v Sodium Carbonate을 사용하여 생사를 정련하였다. 정련 후 탈이온수로 30분간 피브로인을 철저히 세척하여 잔여 세리신과 계면 활성제를 제거하고 공기 중에서 건조시켰다. 정련 및 건조 후 생사는 원래 무게의 23%를 손실하였다.

(4) 질산칼슘-알코올 용액의 준비

용매 시스템은 메탄올(MeOH)에 Tetrahydrate Calcium Nitrate(Ca(NO₃)₂.4H₂O)를 용해하여 준비하였다. Ca:H₂O: MeOH의 몰 비는 1;4:2였다. Tetrahydrate Calcium Nitrate는 실온에서 2 시간 동안 적절히 교반하여 용해시켰다.

(5) 실크 피브로인의 용해 조건

테플론 교반 날과 진공 작업을 위한 유리 손잡이를 기계적 교반기에 연결하여 충분한 물리적 동작을 일으킬 수 있도록 하였다. Cole Palmer 가열기와 실리콘 항온 유조(Oil Bath)를 사용하여 일정한 온도 범위를 얻을 수 있도록 하였다. 정련된 실크와 Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH 용액을 밑이 둥근 플라스크에 함께 주입하였다. 온도 범위는 메탄올의 끓는점 바로 아래인 60℃~65℃ 사이에 유지하여 피브로인을 용해하였다. 피브로인을 완전히 용해하는 데 요구되는 시간은 약 4 시간이었다. 피브로인 용액을 준비 한 후 편광 현미경을 이용하여 완전히 용해되었는지 확인하였다. 전체 실험에서 10% w/v의 피브로인-염 용액을 사용하였다. 용해되지 않은 입자는 원심분리와 정제로 제거하였다.

(6) 투석 및 동결건조(Lyophilization)

10% w/v 피브로인-염 용액은 4일간 탈이온수로 투석하여 피브로인 용액(MWCO: 6,000~8,000Da)의 칼슘 농도를 줄였다. 투석된 피브로인 용액은 바로 동결 건조 또는 필름 주조용으로 사용하여 젤화를 방지해야 한다.

탈이온수로 투석한 피브로인 용액은 캘리포니아 주립대학 식품 과학과의 Labconco 동결 건조기로 건조하였다. 동결 건조된 피브로인은 다음에 사용하기 위해 데시케이터 내에 보관하였다.

(7) 습식 방사(Wet Spinning)를 위한 진액 준비

실온에서 동결 건조된 실크 피브로인을 95% (v/v)개미산과 13% w/v까지의 TFA(Tetrafluoroacetic Acid)에 완전히 용해한다. 그러나 95% 개미산에 용해한 피브로인은 진액의 점도가 떨어지고 색깔이 황색에서 오렌지색으로 변하는 것으로 보아 시간이 경과함에 따라 열화하는 것으로 보인다. TFA에 용해한 피브로인은 개미산에 용해한 것보다 더 안정적이었다. 열화가 진행되는 것을 방지하기 위해 모든 진액을 24시간 이내에 사용하였다. 용해되지 않은 입자는 사용 직전에 원심 분리 및 여과로 제거하였다.

(8) FTIR 및 X선 회절 연구를 위한 필름 준비

투석된 피브로인 용액(농도≒2.5% w/v)과 95% 개미산 및 TFA (2.5%w/v)에 용해된 동결 건조된 피브로인을 Plexyglas에 주조하여 재생 피브로인 필름을 얻었다. 재생 피브로인 필름 중 일부는 75% v/v 메탄올에 적셨다. 준비한 피브로인 필름(주조 상태 및 MeOH 처리)을 공기에 건조시키고 데시케이터에 보관하였다. 주조 상태의 필름과 메탄올 처리한 필름은 FTIR 및 X선 회절 연구에 이용하였다.

(9) 누에 실크 피브로인의 젤화

용해된 피브로인 용액이 탈이온수 및 2M 요소 액에 대해 젤화하는데 걸리는 시간을 여러 온도, DSDS 농도 및 pH에서 에서 기록하였다. 젤화 시간은 시료가 유동성을 보이지 않을 때 기록하였다. 여러 조건에서 얻은 젤은 동결 건조시키고 X선 회절 연구를 위한 시료로 사용하였다.

(10) 산화 용매에 용해된 누에 실크 피브로인의 습식 방사

a. 응고율

95% 개미산에 용해된 피브로인 진액(13% w/v)의 응고율을 결정하기 위해 모세관 및 편광 현미경을 사용하였다. 도 5에 나타낸 측정 기구는 피브로인 진액에 대한 응고제(메탄올)의 확산율을 결정하는데 사용하였다. 메탄올이 모세관으로 확산함에 따라 피브로인이 침전한다. 대안렌즈 격자선이 장치된 편광 현미경을 통해 경계가 이동하는 것을 관찰하였다. Brookfield DV-E 디지털 유량계로 측정한 점도 데이터에 외사법(Extrapolation)을 적용하여 전단 변형율이 0일때 진액의 점도를 계산하였다. 데이터 신뢰도를 위해 10%와 90% 사이의 토크 범위에서 점도 데이터를 수집하였다.

b. 습식 방사와 방사 후 처리

내경이 0.71mm인 강철 바늘에 부착된 기계적인 펌프와 10mL 플리스틱 주사기를 이용하여 개미산과 TFA(각각 13% w/v)에 용해된 피브로인 진액을 압출하였다. 조직학적 등급의 메탄올을 응고제로 사용하였다. 개미산 진액과 TFA 진액에 대한 기계적 펌프의 압출율은 각각 2.0mL/min과 1.5mL/min이었으며, 개미산 진액에 대해 8m/min, TFA 진액에 대해 10m/sec의 일정한 속도로 섬사를 감았다. 감은 피브로인 섬사는 용매와 응고제가 완전히 교환되도록 4시간 동안 응고 조에 내버려 두었다.

용매와 응고제가 완전히 교환된 후 젖은 상태에서 약 3.0x의 비율로 방사된 섬유를 연신하였다. 재생 피브로인 섬사의 섬유 표면을 향해 측면 압축력을 주기 위해 손으로 연신을 가하였다(연신 율은 위와 동일). 재생 섬유(방사 상태 및 연신된 섬유)를 공기 중에서 말리고 나중에 사용하기 위해 데시케이터에 보관하였다.

9 . 누에 실크 피브로인의 용액 성질과 구조

(1) SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Surfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

정련된 실크는 4가지의 용매 시스템인 Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH, CaCl₂.8H₂O-2EtOH, 9M 수성 LiBr 및 9M 수성 LiSCN에서 용해하였다. 피브로인-염 용액은 탈이온수와 2M 수성 요소 액으로 4일간 투석하였다. 여러 가지 용매에 용해된 피브로인 용액의 분자량 분포를 조사하기 위해 0.1% SDS 완충제를 함유하는 12% 폴리아크릴아미드 젤(Polyacrylamide Gel)에 Laemmli의 방법에 따라 PAGE를 실시하였다. 젤 상태의 단백질은 은 염색(Silver Staining)을 하여 눈으로 볼 수 있게 하고(미국 세인트루이스, Sigma Chemical Co.) 젤 패턴은 디지털 카메라로 포착하였다.

(2) 원자 흡수(AA)

Perkin-Elmer 원자 흡수 분광계 모델 AAnalyst 300을 이용하여 투석된 피브로인 용액의 잔류 칼슘 농도를 조사하였다. 칼슘의 감도를 증가시키기 위해 10% w/v 수성 Lanthanum Chloride (LaCl₃)의 5%v/v를 투석된 피브로인 용액에 첨가하였다. 시료의 칼슘 농도를 측정하기 위해 472nm의 단색 파장을 선택하였다. 슬리트 간격은 0.7nm였다. 교정을 위해 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 및 10.0 ppm의 칼슘을 함유하는 표준 용액을 준비하였다. 1~4일간 투석한 피브로인 용액과 용매(Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH)를 시료로 준비하였다. 투명한 용액을 얻기 위해 농축한 황산(각 시료의 40% v/v)을 첨가하였다. 이 연구에 사용한 Fisher Scientific의 미량 금속 등급(Trace Metal Grade) 황산의 칼슘 함유량은 0.5 ppb이하였다.

(3) 용액 1H 및 13C NMR 분광법

피브로인-염 용액(10% w/v)을 4일간 D₂O로 투석하여 피브로인 용액 NMR 시료를 준비하였다. D₂O로 투석한 피브로인 용액의 농도는 약 2.0% w/v 이었다. 개미산과 TFA에 용해된 피브로인 시료는 동결 건조한 실크 피브로인을 개미산(formic-d acid-d) 및 TFA(TFA-d)(각각 2.5% w/v)에 각각 용해하여 준비하였다.

모든 액체 NMR 실험은 Oxford Narrow Bor Magnet(1989), SGI NINDY 호스트 워크스테이션, XWINNMR 소프트웨어 버전 2.6을 이용하여 Bruker AVANCE 500 MHz 분광계(1996)로 실시하였다. 이 기구에는 3 주파수 채널, 파형 메모리 및 진폭 형성 장치, 3 채널 기울기 제어 장치(GRASP III), 가변 온도 장치, 예비 냉각 및 온도 안정화 장치가 장착되어 있다. 모든 측정에는 5mm ID IH/BB (Ag - P) 3중-축 기울기 프로브(ID500-5EB, Nalorac Cryogenic Corp.)를 이용하였다. NMR 프로브는 500MHz 분광계(H 주파수 = 500.128MHz)에서 125.75MHz인 C 주파수에 조정하였다.

16k 데이터 점과 충분한 스캔에 포함된 일차원 1H 데이터 세트를 수집하여 적절한 신호 잡음(S/N)비를 얻었다. 스펙트럼 폭 25,000Hz, 16k 데이터 점 및 광대역 양자 분리 (WALTZ)를 이용하여 125MHz에서 일차원 13C 스펙트럼을 기록하였다. 모든 스펙트럼은 298°ㅀK에서 얻었다. 1H 스펙트럼에 대해서는 용매 피크에 대해, 13C 스펙트럼에 대해서는 외분 기준 CDCl₃에 대한 상대적인 화학적 편이를 구하였다.

10. 재생 피브로인 재질의 특성 분석

(1) FTIR 분광법

투석된 피브로인 용액과 개미산과 TFA에 용해된 동결 건조된 피브로인으로 필름을 만들었다. 재생된 피브로인 필름의 FTIR 스펙트럼은 ATR (Attenuated Total Reflectance)가 장착된 Nicolet 510P FTIR 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 4,000~400cm-1에서 반복적으로 64회 측정한 결과를 평균하였다.

(2) X선 회절

Siemens 형식 F X선 회절장치를 이용하여 동결 건조된 피브로인 젤, 재생 피브로인 필름 및 섬유에 대한 X선 스캔을 실시하였다. X선원(X-ray Source)은 Ni-여과된 Cu Kα방사선이었다(30kV, 20mA). 시료를 알루미늄 틀에 장착하고 2.0°/min의 속도로 5°~ 50°(2θ)에서 주사하였다.

(3) 고체 13C NMR 분광법

천연 실크 섬유, 동결 건조된 피브로인(제어됨) 및 재생 피브로인 섬유(각각 100mg)에 대한 고체 13C NMR 스펙트럼은 3.5~4.0kHz 사이의 Zirconia 회전자 방사를 이용하여 교차 편광(Cross Polarization, CP)과 Magic Angle Spinning(MAS) 방식으로 50HMHz에서 Chemagnetic 200S 분광계를 이용하여 구하였다. 최적의 Hartmann-Hahn 및 요술각(Magic Angle) 조건은 TMS(Tetramethylsilane)에 따라 p-di-tert-butybenzene(PDTBB)을 이용하여 교정하였다. 스펙트럼을 구하는 동안 약 47KHz에서 고전력 DD(Dipolar Decoupling)을 인가하였다. 125KHz의 스펙트럼 폭은 푸리에 변환 전에 8k의 0으로 채워지는 2k 메모리에 저장하고, 외부 기준 HMB(Hexamethlybenzene)에 대해 상대적인 화학적 편이를 구하였다.

(4) 순도 측정 및 장력 특성

10개의 재생 피브로인 섬유 시료의 순도를 VIBROMATㄾ로 측정한 후, 최대 및 최소값을 제외한 시료의 평균 데니어 값을 구하였다. 장력 특성 측정은 ASTM D 3822를 참조하였다. 각 시료의 평균 데니어를 입력으로 하고 50mg의 로드 셀을 사용하여 SinTech 장력계로 재생 피브로인 섬유의 장력 특성을 측정하였다.

(5) SEM(Scanning Electron Microscopy)

Hitachi S-3200N SEM을 이용하여 천연 실크 섬유와 재생 피브로인 섬유를 조사하였다. 시료 표면에 전하 충전을 최소화하고 정밀한 이미지를 얻기 위하여 시료를 2분간 금도금한 후 표면과 단면에 대한 이미지를 구하였다.

11. 누에 실크 피브로인 중쇄(Heavy Chain) 구조 연구

(1) 피브로인 중쇄의 아미노산 서열에 대한 구조 연구

누에에 대한 전체 아미노산 서열을 Gen Bank에서 구하였다. 누에 피브로인 중쇄의 아미노산 서열은 규칙성과 아미노산 배열에 따라 여러 그룹으로 나누었다.

(2) 펩타이드 합성

불규칙적이지만 보존되는 GT~GT 서열 중 하나 (GTGSSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFGT; 아미노기 (N-terminus)에서 카르복실기(Carboxyl-terminus)까지)를 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl; 불안정한 기저 α-아미노를 일시적으로 보호하는 그룹)의 화학 작용을 이용하여 펩타이드 합성장치로 합성하고 북 캘리포니아 대학 미생물학 & 면역학과에서 고성능 액체 색층 분석 (HPLC, High Performance Liquid Chromatography)으로 정제하였다. 이 서열을 선택한 이유는 불규칙한 GT~GT 서열 중 가장 자주 나타나기 때문이다(한 피브로인 중쇄에서 11개중 6번). 아미노기와 카르복실기는 각각 아세틸화(Acetylation)와 차단 그룹인 아미드 결합에 의해 보호된다. 그러나 각 끝단에서 보호 그룹이 결합된 후 합성된 펩타이드의 용해도가 현저히 감소하는데, 이러한 사실은 UNC 펩타이드 합성 팀의 상당한 흥미를 끌었다. 결과적으로 재료의 90% 이상을 가공할 수 없게 되어 적절한 시료로 사용할 수 없었으며 합성한 펩타이드의 100mg 미만만 사용할 수 있었다. 한정된 시료의 양으로 인해 X선 결정분석 대신에 고 분해능 2차원 NMR 기법을 이용하여 실크 펩타이드의 3차원 구조를 조사하였다.

(3) 2차원 NMR 분광법

합성된 GT~GT 실크 펩타이드는 100% DMSO-d(Deuterated Demethylsulfoxide)로 용해하였다. 1H의 정확한 화학적 편이 할당에 중요한 역할을 하는 불안정한 아미드 양자를 보호하도록 양자 교환을 줄이기 위해 D₂O 대신 DMOSO-d를 용매로 선택하였다. 어느 양자가 NOESY 및 ROESY 스텍트럼의 어느 것과 작용하는지 알려주는 것은 화학적 편이 뿐이므로 1H 화학적 편이에 대한 정확한 할당은 매우 중요하다. 시료 농도는 3.2%W/V(약 16Mm)이었으며, 모든 스펙트럼은 298°K에서 얻었다. 일차원 1H 및 13C 데이터를 얻기 위한 기구 파라미터는 표 4에 주어져 있다.

COrrelated SpectroscopY(COSY), TOtal Correlatin SpectroscopY(TOCSY), Nuclear Overhauser Exchange SpectroscopY(NOESY) 및 Rotating frame Overhauser Enhancement SpectroscopY(ROESY)와 같은 2차원 동종핵 (1H-1H) NMR 실험과 Heteronuclear Multiple Quantum Correlation(HMQC) 및 Heteronuclear Multiple Bond Correlation(HMBC)와 같은 2차원 이종핵 (1H-13C) NMR 실험을 조합하여 짧은 실크 펩타이드 분자의 구조를 연구하였다. 정밀한 1H의 화학적 편이 할당에는 COSY와 TOCSY를 적용하였다. COSY와 TOCSY에 의한 1H의 화학적 편이 할당을 확인할 뿐만 아니라 데이터를 보완하기 위해 HMBC와 HMQC를 이용하였다. NOESY와 ROESTY 실험은 공간 작용을 통한 1H-1H를 조사하기 위해 이용하였다.

1) 2-D COSY(1H-1H): 2-Dimensional COrrelated SpectroscopY

2차원 위상 감지 COSY, NOESY 및 ROESTY 데이터는 초복합형(Hypercomplex) 위상 사이클 처리를 이용하여 수집하였다. 데이터는 10μsec의 90° 펄스, 512 블럭 각각에 대하여 32 스캔 및 블록 당 2k 데이터 점으로 구하였고, 스펙트럼 창은 6250Hz 였다. 데이터는 양쪽 크기에서 위상 편이된 사인 벨(Sine Bell)에 대해 XWINNMR Bruker 소프트웨어를 이용하여 처리하였으며, 2k x 2k 데이터 세트를 주기위해 0을 2배로 채웠다. NOESY 실험을 위한 혼합 시간은 250, 350 및 500msec였다.

2) 2-D TOCSY (1H-1H): 2-Dimensional TOtal Correlatin SpectroscopY

TOCSY는 신호 할당을 도우기 위해 이용된다. DMSO-d에 대한 TOCSY (또는 HOHAHA; 동종핵 Hartman-Hahm) 실험은 확장된 스핀 시스템에 대한 모든 상관관계를 주므로 아미드, 지방성 화합물 및 α 양자 사이의 연결을 추적할 수 있게 한다. 2차원 TOCSY 스펙트럼을 초복합형 위상 사이클 처리와 MILEV-17 동기 결합 변조(65msec 스핀 록)로 수집하였다. 데이터는 분리 채널 상에서 22μsec의 90° 펄스로 수집하였다. 64 스캔을 512 블럭으로 수집하고 양쪽 크기에 대해 위상 편이된 사인 벨(Sign Bell) 함수로 데이터를 처리하였다.

3) 2-D HMQC (1H-13C, 단일 결합): 2-Dimensional Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

역으로 검출된 이차원 이종핵 편이 상관관계 (HMQCHY) 스펙트럼을 역 편향-전송 프로브를 이용하여 초복합형 위상 사이클 처리로 수집하였다. 펄스 지연은 142Hz의 단일 결합 스칼라 결합 상수에 대해 최적화였다. 실험은 10μsec의 1H 관측 펄스로 실시하였으며, 13C 변조는 17μsec의 90° 펄스로 실실하였다. 스펙트럼 창은 1H에 대해서는 5800Hz, 13C에 대해서는 23,800Hz 였다. 256 블록(총 256)을 1024 데이터 점에 걸쳐 수집하고 위상 편이된 사인 벨 함수로 처리하였다.

4) 2-D HMBC (1H-13C): 2-Dimensional Heteronuclear Multiple Bond Correlation

역으로 검출된 이차원 다중 결합 이종핵 편이 상관관계 (HMBC)에 대한 실험을 크기 모드로 실시하였다. 실험은 142Hz의 단일 접합 스칼라 결합 작용과 7Hz의 다중 결합 작용에 대해 실시하였다.

(4) 3차원 핵 모델 분석

합성된 실크 펩타이드의 3차원 구조를 얻기 위해 CNS(Crystallography-NMR System)과 PyMol과 같은 컴퓨터 소프트웨어를 이용하였다. NMR 구속과 최소 에너지 계산에는 CNS를 이용하고 분자를 나타내기 위해서는 PyMol를 이용하였다. CNS를 이용하여 펩타이드의 아미노산 서열로부터 확장된 펩타이드 모델을 단백질 데이터베이스 (pdb) 파일 형식으로 작성하였다. NOESY 및 ROESY로부터 구한 공간을 통한 H-H 작용에 대한 데이터(총 103 NOE 연결성)를 어닐링 정형화 및 기하학적 거리 계산 시뮬레이션을 위한 NMR 구속 입력으로 사용하였다. 합성된 펩타이드 시료는 13C 또는 15N(자연 상태에서는 풍부함)이 풍부하지 않으므로 NOESY 및 ROESY 데이터로부터 구한 강도는 신뢰성이 없는 것으로 간주되었다. 이러한 이유로 인해 일반적으로 강도로 결정되는 가능한 모든 거리(1.8Å ~ 4.8Å)를 입력으로 사용하였다. 계산 후에는 가능한 낮은 에너지 상태를 가지는 여러 3D 모델을 CNS로부터 pdb 형식의 파일로 작성한 후 합성된 실크 펩타이드의 3D 구조를 PyMol로 나타내었다.

11. 결과

(1). 누에 실크 피브로인의 젤화

1) 시크 피브로인의 젤화에 영향을 미치는 요인

탈이온수로 투석한 피브로인 용액은 투석 후 4일 이내에 젤화한다(투명한 젤에서 혼탁한 젤로). SDS(Sodlum Dodecyl Sulfate)에 의한 실크 피브로인의 젤화는 SDS-PAGE를 위한 피브로인 시료 준비 중에 발견되었다. 그러나 탁월한 수소 결합 분해제인 2M 수성 요소(pH=8.0)로 투석한 피브로인 용액은 전기이동 중에 탈이온수로 투석한 것보다 훨씬 더 안정되었다.

온도, SDS 농도, pH, 요소의 유무 등과 같이 투석된 피브로인 용액의 젤화 시간에 영향을 미치는 많은 요인이 발견되었다. 도 6은 여러 가지 요인에 따른 투석된 피브로인 용액의 젤화 시간의 변화를 보여준다. 젤화 시간은 다음과 같은 경우에 짧아진다.

- 온도가 높다.

- SDS 농도가 높다.

- pH가 낮다.

- 탈이온수만으로 투석한 경우(요소 없이)

2M 요소를 포함하는 투석된 피브로인 용액은 2개월 이상 상당히 안정되어 있었다. 용매 효과는 작지만 9M LiSCN에 용해한 피브로인이 젤화에 가장 안정되어 있었다(안정성이 높은 순서; 9M LiSCN>9M LiBr>Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH >CaCl₂.8H₂O-2EtOH).

2) 동결 건조된 피브로인 젤의 X선 회절

원사, 동결 건조된 피브로인 (제어됨) 및 동결 건조된 피브로인 젤에 대한 X선 회절분석은 도 7에 나타내었다. 천연 실크 섬유는 2θ≒21°에서 두드러진 피크를 보이는데, 이것은 실크 II 결정 구조에 해당한다. 또한 재생 피브로인(MeOH 처리)도 2θ≒21°에서 두드러진 피크를 보이며 2θ≒21°에서 평평한 피크를 나타낸다. 동결 건조된 피브로인은 2θ≒21°에서 두드러진 피크를 보이지 않음으로써 완전히 비정질 상태임을 나타낸다. SDS는 2θ≒7°에서 강한 피크를 가진다. 요소는 2θ≒22°, 25°, 29°, 32°, 36°, 40°, 45° 및 49° 에서 여러개의 강한 피크를 가진다(도 7a). 동결 건조된 피브로인 젤은 2θ≒21°에서 두드러진 피크를 가짐으로써 β-시트 형성으로 인해 젤화가 일어났음을 나타낸다(도 7b). 탈이온수로 투석한 피브로인 용액에서 만들어진 동결 건조 젤(도 7b.1)은 이미 약간의 β-시트 결정을 가지고 있는 것에 반해 요소로 투석한 피브로인 용액에서 만들어진 동결 건조 피브로인(도 7b.3)은 2θ≒21°에서 두드러진 강도를 보이지 않음으로써 요소가 실크 피브로인의 β-시트 형성에 대한 훌륭한 억제제가 됨을 나타낸다. SDS를 함유하는 동결 건조 피브로인(도 7b.2,4)은 SDS를 함유하지 않은 것보다(도 7b.1,3) 2θ≒21°에서 강도가 훨씬 더 높은데, 이것은 SDS가 실크 피브로인의 β-시트 형성을 도와줌을 나타낸다. 젤5는 젤4를 탈이온수로 투석하여 준비하였다. 이것은 요소가 있더라도 SDS로 인한 β-시트 형성이 일어남을 보여준다. 동결 건조된 피브로인 젤(도 7b.1,2,4)과 메탄올 처리한 재생 피브로인(도 7a.3)은 약 θ≒21°에서 평평한 피크를 보인다(실크 I일 수 있음). 이러한 피크는 천연 실크 섬유에서는 나타나지 않으므로 재생 피브로인 재질은 실크 II와 알려지지 않은 결정 구조를 모두 가짐을 나타낸다.

이 연구는 투석된 피브로인 용액의 젤화는 수용액에서 실크 피브로인의 β-시트 형성이 일어나기 때문이라는 것을 보여준다. SDS의 함유, 온도 증가 또는 낮은 pH는 수용액에서 실크 피브로인의 β-시트 형성을 가속화시킨다. 용매에 미량의 칼슘 이온이 섞여있어도 β-시트 형성을 위한 핵으로 작용할 수 있는데, 이것은 아래에서 기술한 원소 흡수로 인한 결과와 일치한다. SDS는 흔히 PAGE 기법에 의한 단백질 분리에 이용된다. SDS는 단백질 분자를 코팅함으로써 단백질 분자의 정전기 특성을 차단한다. 그러나 수성 피브로인 용액의 경우 SDS는 β-시트 형성을 위한 훌륭한 핵으로 작용한다.

(2) 피브로인 용액의 성질과 구조

1) SDS-PAGE

피브로인 용액에 대한 용매 효과를 확인하기 위해 네 가지 용매 시스템으로 시료를 준비하였다. SDS-PAGE에 잘 분해되지 않는 9M 수성 LiSCN에 용해된 시료를 제외하고 모든 시스템은 유사한 단백질 분리 양상을 보였다(도 8). 350kDa 근처에서 나타나는 어두운 띠는 피브로인 중쇄를 나타내며, 200kDa 근처의 넓은 띠는 열화된 중쇄를 나타낸다. 24 kDA 근처의 가는 띠는 피브로인 경쇄를 나타낸다. 요소를 사용하지 않고 준비한 모든 시료는 폴리아크릴아미드 젤에 잘 분해되지 않으며, 이것은 SDS에 의해 실크 피브로인이 젤화 되었음을 나타낸다. 칼슘-알코올 시스템은 더 많은 열과 용해 시간을 필요로 한다. 이것은 이러한 두 시스템이 약 200 kDa에서 띠로 나타나는 열화를 보이는 이유가 될 수도 있다.

2) 분자 흡수(AA)

도 9는 투석된 피브로인 용액과 투석된 용매의 칼슘 농도를 보여준다. 두 시료가 같은 질산칼슘 농도(6.1g/10mL)로 시작하더라도 투석 4일 후 피브로인 용액은 더 많은 칼슘을 함유하는데, 이것은 투석된 피브로인 용액에서 칼슘 이온이 여전히 피브로인 분자와 상호작용을 함을 나타낸다. 잔여 칼슘 이온은 투석된 피브로인 용액에서 젤화를 위한 핵으로 작용할 수 있다.

3) 용액 C NMR 분광법

수성 피브로인 용액과 개미산과 TFA와 같은 산성 용매에 용해된 동결 건조된 피브로인 용액의 성질은 아주 다르다. 수성 피브로인 용액은 전단 응력에 매우 민감하며 2주 이내에 젤로 변한다. 산성 용매에 용해된 동결 건조된 피브로인 용액은 수성 피브로인 용액만큼 전단 응력에 민감하지는 않다. 그러나 이러한 산성 용매 시스템에서는 산의 가수분해에 의해 시간이 경과함에 따라 피브로인 체인이 점차 열화한다. 이러한 단점에도 불구하고 산성 용매에 용해된 동결 건조된 피브로인 용액이 다루기가 훨씬 더 쉬우므로 가공성이 더 우수하다.

용매 시스템에 따른 피브로인 분자의 구조적 차이를 연구하기 위해 액체 13C NMR 분광법을 이용하였다(도 10). 피브로인 중쇄의 약 7%는 Gly, Gla, Ser 및 Tyr로 구성된다. 이 네 가지 아미노산의 탄소 원자는 13C NMR 스펙트럼으로 쉽게 분석할 수 있다. 측면 사슬에 수산기(Hydroxyl) 그룹을 가지고 있는 Ser와 Tyr은 Ser Cα(높은장(Upfield) 편이, 3.5ppm)에 대해 첨두 편이를 보이며, 용매와 같이 수산기 그룹(Ser Cα, 낮은장(Downfield) 편이, 개미산의 경우 2ppm, TFA의 경우 4.5ppm; Tyr Caromatic, TFA에 대해 낮은장과 높은장으로 첨두 분리)에 직접 연결되는 탄소 원자는 산성 상태로 변한다. 이것은 산성 용매 분자가 수산기 그룹을 Ser및 Tyr 잔기에 가두어서 수산기 측 사슬에 결합된 Ser의 Cα 원자에 대한 화학적 환경을 변화시켜 탄소 원자가 Ser(Cα) 및 Tyr (Caromatic)의 수산기 그룹에 직접 달라붙기 때문일 수도 있다.

이전에 출간된 용액 13C NMR 스펙트럼으로 볼 때 수용액에 포함된 누에 피브로인 분자는 불규칙 코일 구조를 가짐이 명백하다. Mathur et al.와 Zhao et al.는 13C의 화학적 편이를 모델 펩타이드와 발표된 13C NMR 데이터와 비교하여 소금 용액(질산칼슘 메탄올)과 산성 용액(HFIP)에 용해된 실크 피브로인의 구조를 연구하였다. Mathur et al.은 소금 용액에 용해된 실크 피브로인은 약간의 규칙적인 구조(β-시트일 수 있음)를 포함한다고 보고했으며, Zhao et al.은 HFIP에 용해된 피브로인은 나선 구조를 가진다고 보고하였다. Ala Cα는 다음과 같이 자장이 증가하는 순으로 공명한다고 알려져 있다; β-시트 -> 불규칙 코일 -> α-나선(배열에 따른 C의 화학적 편이). 불규칙 코일 구조에 대한 Ala Cα 및 Cβ에서 관측된 13C의 화학적 편이는 각각 50.1과 16.9 ppm이며, β-시트 구조에 대한 편이는 각각 48.2와 19.9 ppm(고체 상태에서)이다. Ala Cα와 Cβ에 대한 실크 피브로인의 확장된 13C NMR 스펙트럼은 도 11에 주어져 있다. 개미산에 용해된 피브로인에 대한 13C NMR 스펙트럼의 19.0 ppm에서 나타나는 작은 피크는 이러한 시스템에서는 작은 부분의 β-시트 구조 또는 β-시트와 유사한 규칙적인 구조가 존재함을 나타낸다. 아마도 낮은 신호-잡음(S/N)비로 인해 Um et al.이 제안한 NMR 스펙트럼에서는 이러한 피크를 발견할 수는 없었지만 이것은 개미산에 용해된 피브로인 분자에 대한 긴 범위의 규칙성을 나타낼 수도 있다. TFA에 용해된 피브로인에 대한 Ala Cβ의 피크가 넓어지는 것은 이완 시간이 변하기 때문일 수도 있다. 그러나 구조에 따른 13C의 화학적 편이 관점에서 볼 때 TFA에 용해된 피브로인의 Ala Cβ는 HFIP에 용해된 피브로인의 경우와 마찬가지로 나선 구조(154.~15.9ppm) 특징을 보인다. TFA에 용해된 피브로인 분자는 다른 형태의 나선 구조를 형성하여 이것으로 인해 Ala Cβ의 피크가 넓어질 수도 있다. 따라서 이러한 용매 시스템에 용해된 실크 피브로인의 전체적인 구조는 수용액에서는 불규칙한 코일 형태이며 개미산(β-시트)과 TFA(나선)에서는 약간의 규칙적인 구조가 존재한다고 할 수 있다. 이러한 결과는 아래에서 기술한 바와 같이 산성 용액으로 만든 주소 상태의 피브로인 필름은 메탄올 처리를 하지 않고도 이미 규칙적인 구조를 가진다는 점에서 FTIR 스펙트럼의 결과와 일치한다. 그러나 개미산과 TFA에 용해된 피브로인 진액을 편광 현미경으로 관찰했을 때 어떠한 규칙적인 구조(β-시트 결정 또는 액체 결정)도 발견되지 않았다.

산성 용매로부터 얻은 Ser과 Tyr에서 수산기 양자에 대한 탈 양성자(Deprotonation) 가능성이 있다. 탈 양성자 수산기 그룹(음전하를 가진 산소 원자)을 가진 피브로인 분자는 고분자 전해질(Polyelectrolyte)로 작용하여 피브로인 분자의 β-시트 형성을 방해할 수도 있다. 또한 위에서 언급한 바와 같이 이러한 산성 용매는 방사 과정에서 전단 응력에 의한 실크 피브로인의 β-시트 형성을 방지하는데 효과적이며, 실크 피브로인의 β-시트 결정 성분인 Ser과 Tyr 잔기(Residue)에 수산기 그룹과 작용하여 실크 가공을 쉽게 만든다. Vollrath et al.는 누에가 방사하기 전의 피브로인 분자는 산성 상태라고 기술하였다. 산은 양성자 펌프에 의해 제거된다. 실크 가공에 산성 용매를 이용할 때의 장점은 누에의 방사와 정확하게 일치한다. 기술적으로 설명하면, 산 가수분해에 의해 열화를 일으키는 용매에 포함된 물 성분으로 인해 더 안정적이고 균질하다는 점에서 TFA에 용해된 피브로인 진액은 개미산에 용해된 것보다 가공성이 더 우수하다. 압출 중에는 TFA에 용해된 피브로인 진액으로부터 더 미세한 데니어를 가진 재생 피브로인 섬유를 얻었다. 이러한 사실은 용매의 산도가 높을수록 가공성이 더 우수하다는 것을 말해준다.

(3) 개미산에 용해된 누에 실크 피브로인의 습식 방사(Wet Spinning)

1) 확산 계수

Stoke-einstein 방정식을 이용하여 피브로인 진액에 대한 메탄올의 확산 계수를 계산하였다(개미산에 용해된 동결 건조된 피브로인; 13%w/v);

여기서 D는 확산 계수, kB는 볼츠만 상수(1.381x10^-23JK^-1), T는 온도, η는 용매의 점도, Ro는 용질 분자의 반경을 나타낸다. 이 방정식은 용매로 확산되는 작고 단단한 구형 용질에 적용할 수 있다. Lie et al.은 셀룰로오즈 용액을 사용하여, Knaul과 Creber은 키토산 용액을 사용하여 응고제와 고분자 용액 시스템에 대한 Stoke-einstein 방정식의 신뢰도를 조사하기 위한 방정식을 개발하였다;

여기서 ε는 경계 거리, t는 시간, V는 응고제의 분자크기, A와 B는 조절가능한 상수이다. ln(ε²/t)과 lnV이 부피가 서로 다른 여러 가지 침투 분자에 대한 선형 회귀를 나타낼 때 Stoke-einstein 방정식을 적용할 수 있다. 여러 가지 응고제(메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, Tertiary-butanol)를 실험하여 응고제와 메탄올 시스템에 대한 Stoke-einstein 방정식의 적용 가능성을 확인하였다. 표 5는 실험 데이터를 보여주며, 도 12는 ln(ε²/t)과 lnV 사이의 선형적인 관계를 보여준다.

고분자 용액의 점성은 100s-¹ 이하의 낮은 전단 변형율 구간에서는 전단 변형율에 선형적으로 비례하며, 데이터에 외사법(Extrapolation)을 적용하여 구한 전단 변형율이 0일때 25℃에서 피브로인 진액의 점도는 5,399cP였다(표 6). 메탄올의 반경(Ro=2.05x10^-8cm)은 메탄올 분자가 구형이라고 가정하여 메탄올의 반데르발스(Van der Waals) 부피로부터 구하였다. 개미산(13% w/v)에 용해된 피브로인 진액에 대해 계산한 메탄올의 확산 계수는 1.976x10-9cmㅂ/sec였다. 도 13은 시간에 따른 모세관에 침전된 피브로인의 경계 이동을 보여준다. 경계 거리는 시간의 제곱근에 선형적으로 비례한다. 시간 0(시차)에서 발생하는 불일치는 실험을 시작하기 전에 모세관 끝에서 용매가 휘발하기 때문인 것으로 보인다.

2) 재생 피브로인 섬유의 기계적 특성 및 연신(Drawing) 효과

지금까지의 재생 피브로인 섬유는 유용한 성질을 보이지 못하였으며, 천연 실크 섬유에 비해 부서지기 쉽고 장력 특성이 나빴다. 이 연구에서는 종전의 연신 기법과는 약간 다른 간단한 방법을 적용하였다. 수동 연신(연신율은 약 3.0x)을 적용하여 재생 피브로인 섬사의 섬유 표면을 행해(섬유 축과 수직)측면 압축력을 가하였다(도 14). 표 7과 표 8은 재생 피브로인 섬유에 대해 측정한 데니어와 장력 특성을 보여주며, 도 15는 응력-변형 곡선을 보여준다. 도 15에 나타낸 바와 같이 방사 상태의 피브로인 섬유는 매우 약하고 부서주기 쉽다. 그러나 연신 후에는 장력 특성이 엄청나게 향상된다. 놀랍게도 습식 방사 및 연신된 재생 섬유는 천연 섬유(5.25g/den)보다 더 우수한 점착성(TFA 진액의 경우 8.04g/den, 개미산 진액의 경우 8.53g/den)을 보였다. 표 9는 전통적인 습식 연신 방식을 이용한 재생 피브로인 섬유의 장력 데이터를 보여준다(다른 공정은 이 연구에서 적용한 것과 동일). 연신율이 이 연구보다 큰 데도 불구하고 장력 특성은 개선되지 않았는데, 이러한 차이는 섬유 표면을 향한 측면 압축력에 의한 결과이다. 이것은 누에의 방적 돌기와 같이 결정화 중에 β-시트의 3차원적 구조에 영향도 을 미칠 수도 있다.

(4) 재생 피브로인 재질의 특성 분석

1) 재생 피브로인 필름

재생 피브로인 필름의 구조를 FTIR 분광법으로 조사하였다. 도 16은 피브로인 재질의 FTIR 스펙트럼을 보여준다. 단백질 물질은 아미드 I(C=O 신장)의 경우 1630cm^-1~1650cm^-1, 아미드 II(이차 NH 굴곡)의 경우 1540cm^-1~1520cm^-1, 아미드 III(C-Cα-N 굴곡/C-N 신장)의 경우 1270cm^-1~1230cm^-1에서 특징적인 대역을 가진다. 또한 대역 위치는 단백질 물질의 배열을 말해준다; 아미드 I의 경우 1650cm^-1(불규칙 코일), 1630cm^-1(β-시트), 아미드 II의 경우 1540cm^-1(불규칙 코일), 1520cm^-1(β-시트), 아미드 III의 경우 1270cm^-1(β-시트), 1230cm^-1(불규칙 코일). 이러한 대역 편이는 단백질 시료의 수소 결합 상태로 인해 발생한다. 천연 실크 섬유 및 동결 건조한 피브로인은 각각 전형적인 β-시트 및 불규칙 코일 구조를 보여준다. 투석한 피브로인 용액에서 만든 재생 피브로인 필름은 불규칙 코일 배열을 나타내는 동결 건조한 피브로인과 매우 유사한 FTIR 스펙트럼을 가진다. 10분간 75% w/v 메탄올로 처리한 후 시료의 구조는 β-시트로 바뀌는데, 이것은 메탄올이 실크 피브로인의 β-시트 형성을 유도함을 나타낸다. 흥미로운 사실은 개미산을 이용한 주조 상태의 필름이 β-시트 구조를 보이는 반면에 메탄올 처리를 하지 않은 TFA를 이용한 필름은 불규칙 코일과 β-시트 구조 양쪽 모두를 나타낸다는 것이다. 액체 C NMR 연구로 개미산과 TFA에 용해된 피브로인의 규칙적인 구조에 대한 증거를 밝혀내었다. 이것은 산성 용매에 용해된 피브로인은 건조 과정에서 불규칙 코일에서 β-시트 또는 나선에서 β-시트로의 구조 천이가 더 진행함을 나타낸다. 물에 용해한 피브로인은 건조 과정에서 어떠한 구조 천이도 일으키지 않음에 유의해야 한다. 따라서 이러한 산성 용매는 용액 상태 및/또는 건조 과정에서 피브로인의 β-시트 형성을 도와준다. 피브로인 측 사슬의 수산기 그룹과 작용하는 산성 용매 분자는 건조 과정에서 이러한 실크-산 용매 시스템에서 제거되므로 피브로인 분자는 자발적으로 β-시트 구조로 결합한다(규칙적인 구조로 자발적인 분자 결합). 이러한 결과는 실크 피브로인 재생에서 용매 시스템의 선택이 중요함을 뜻한다.

도 17은 재생 피브로인 필름의 X선 회절 곡선을 보여준다. X선 결과는 FTIR 데이터와 정확하게 일치한다. 메탄올 처리한 모든 재생 필름은 2θ≒21°(실크 II)에서 특징적인 피크를 보임으로써 β-시트 구조를 나타낸다. 수용액으로 주조한 재생 피브로인 필름은 완전히 비정질 상태이다. TFA 용액에서 얻은 주조 상태의 필름도 2θ≒21°에서 특징적인 피크를 보이지만 강도는 메탄올 처리한 재생 피브로인 필름 또는 개미산 용액에서 얻은 주조 상태의 필름만큼 높지 않은데, 이것은 TFA가 메탄올 또는 개미산보다 실크 피브로인의 β-시트 형성에 덜 효과적임을 나타낸다. 이것은 TFA에 용해된 피브로인의 액체 13C NMR 및 스펙트럼 강도로 규칙적인 구조의 양을 보여주는 FTIR 스펙트럼을 확인해 준다. 액체 13C NMR, FTIR 및 X선 연구 결과로부터 개미산이 TFA보다 실크 피브로인의 β-시트 형성에 더 효과적임을 알 수 있다. 방사 전 누에의 견사선에 들어있는 피브로인 분자는 실크 I구조이며 방사 후에는 실크 II로 변한다. 가공성 관점에서 볼 때 불안정하며 전단 응력에 의해 실크 II로 구조 전이를 일으키기 쉬운 실크 I이 누에의 견사선에 들어있는 용체 상태로 처리하기가 더 쉬울 수도 있다. 실크 피브로인의 β-시트 구조를 유도하는 용매의 기능은 섬유 가공에서 그다지 중요하지 않은 것으로 보인다. 다시 말하면, 피브로인 분자는 용액 처리 중에는 β-시트(실크 II) 형성을 일으키지 않는 규칙적인 구조(실크 I)를 가지고 마지막으로 고체 상태의 실크 II를 형성하여 재질의 기계적 특성을 줄 필요가 있다. 이러한 이유로 인해 개미산보다는 TFA가 실크 가공을 위한 더 우수한 용매 시스템이 될 수 있다.

2) 재생 피브로인 섬유

도 18은 재생 피브로인 섬유의 X선 회절 곡선을 보여준다. 2θ≒21°에서 나타나는 피크는 실크 피브로인의 β-시트 결정의 특징을 보여준다. 어떠한 용매 시스템을 사용하더라도 연신된 섬유는 2θ≒21°에서 가장 강도가 크다. 그러나 방사 상태의 섬유는 2θ≒21°에서 또 다른 피크를 보여줌으로써 천연 실크 섬유에는 나타나지 않는 다른 형태의 결정 구조(실크 I일 수 있음)가 존재함을 나타낸다. 연신 전 방사 과정이 시작될 때 실크 I이 형성되는 것은 누에의 방사 과정과 정확하게 일치한다. 피브로인 분자는 진액이 응결함에 따라 산성 상태에서 안정되지 않은 결정 구조인 실크 I 결정을 형성하는 경향이 있는 것으로 보인다. 이 단계에서 방사 진액에 적당한 전단 응력과 측면 압축력을 가하면 피브로인 분자의 결정 구조는 더 효과적으로 실크 I에서 실크 II(일반적으로 β-시트)로 변한다.

또한 재생 피브로인 섬유의 구조를 고체 13C CP/MAS NMR 분광법으로 조사하였다(도 19). Saito et al.은 고체 상태에서 분자구조에 따른 실크 피브로인의 13C NMR 화학적 편이에관하여 연구하였다. Ala Cα과 Cβ의 화학적 편이는 β-시트 상태에서 각각 48.2ppm과 19.9ppm이고, 불규칙 코일 상태에서는 각각 49.8ppm과 16.7ppm이다. 천연 실크 섬유와 동결 건조한 피브로인의 고체 13C NMR 스펙트럼은 각각 실크 피브로인의 전형적인 β-시트(결정) 구조와 불규칙 코일(비정질) 구조를 보여준다. 방사 상태의 섬유는 양쪽 구조에서 피크를 보임으로써 응고제인 메탄올에 의해 불규칙 코일(진액 상태의 피브로인)에서 β-시트(방사 상태의 섬사)로 결합 천이가 어느 정도 일어났음을 나타낸다. 연신된 섬유는 천연 실크 섬유와 유사한 피크를 보이는데, 이것은 연신이 불규칙 코일에서 β-시트로의 구조 변경을 더 진행시킨다는 것을 의미한다. 개미산이 TFA 보다 피브로인 분자의 β-시트 형성에 더 효과적이기는 하지만 TFA 진액에서 얻은 재생 피브로인 섬유는 개미산 진액에서 얻은 것보다 불규칙 코일 성분이 더 적으며, 이것은 TFA가 개미산보다 피브로인 재생에 더 효과적인 용매임을 나타낸다. 이것은 TFA에 용해된 규칙적인 구조가 없는 피브로인 분자는 전단 응력과 측면 압축력에 더 잘 회전하기 때문일 수도 있다. 또한 용매의 산도가 강할수록 실크 피브로인의 산 가수분해를 줄이기 위한 무수 용매(Anhydrous Solvent)가 중요해진다.

Asakira et al.는 누에 실크 피브로인의 실크 II 구조는 이질성(Heterogeneous)이며, Ala Cβ에 대한 고체 13C NMR 스펙트럼의 피크 분리에서 3가지의 서로 다른 결정 상태 즉, 22.8ppm에서 23% β-시트(평행 Ala), 20.2ppm에서 45% β-시트(교번 Ala) 및 16.7ppm에서 32% 변형된 β-회전으로 구성된다고 제안하였다. 천연 실크 섬유와 동결 건조된 피브리온의 고체 13C NMR 스펙트럼은 각각 실크 피브로인의 전형적인 β-시트(결정) 구조와 불규칙 코일(비정질) 구조를 보여준다. 여기서 16.7ppm에서 나타나는 피크가 불규칙 코일 또는 β-시트 구조로 인한 것인지는 분명하지 않다. 왜냐하면 비정질 구조를 나타내는 동결 건조된 피브로인의 X선 회절 곡선에서 유추해 볼 때 고체 13C NMR 스펙트럼에서 나타나는 26.7ppm에서의 Ala Cβ 피크는 불규칙 코일로 볼 수 있고, 실크I과 같은 구조를 보이는 방사 상태 섬유의 X선 회절 곡선에서는 방사 상태의 섬유에 대한 16.7ppm에서의Ala Cβ 피크를 실크 I으로 볼 수 있기 때문이다. Ala Cα과 Ala Cβ의 불규칙 코일과 실크 I에 대한 구조에 따른 13C의 화학적 편이는 매우 유사하다; 불규칙 코일과 실크 I에서 Ala Cα에 대해 각각 50.1ppm과 50.5ppm이며, 불규칙 코일과 실크 I에서 Ala Cβ에 대해 각각 16.9ppm과 16.6ppm 이다.

3) Scanning Electron Microscopy(SEM)

천연 실크 섬유와 재생 피브로인 섬유의 표면 및 인장 파괴 단면 SEM 영상을 도 20에 나타내었다. 천연 실크 섬유의 표면 영상은 세섬유가 잘 발달되어 있음을 보여준다. 천연 실크 섬유에는 여러 가지 인장 장애 패턴이 나타나지만 부스러짐 장애가 가장 흔히 나타난다(도 20a 우측 상단). 모든 재생 섬유의 표면 영상은 매우 매끈하며, 이것은 농축된 수성 피브로인 진액에서 얻은 재생 피브로인 섬유의 표면에서 일어나는 Viscous Fingering 현상이 없음을 나타낸다. 방사 상태 섬유의 인장 파괴 단면 영상은 이러한 섬유가 매우 부서지기 쉬우며 서로 부빈 후에는 끊어짐을 보여준다. 연신된 섬유의 인장 파괴 단면 영상은 부서지기 쉬운 성질을 잘 보여준다. 세섬유는 연신 과정에서 발달할 수도 있으며 이러한 미세 세섬유 구조는 부서지기 쉬운 성질에도 불구하고 재생 피브로인 섬유의 탄성과 기계적 강도에 기여할 수 있다. 여기서 도 20a는 연 실크 섬유이고, 도 20b는 개미산 진액으로부터 얻은 방사 상태의 섬유이고, 도 20c는 개미산 진액에서 연신된 섬유이고, 도 20d는 개미산 진액에서 연신된 섬유의 단면에서 본 세섬유이고, 도 20e는 TFA 진액에서 얻은 방사 상태의 섬유이고, 도 20f는 TFA 진액에서 연신된 섬유이다.

(5) 누에 중쇄 구조 연구

1) 피브로인 중쇄의 아미노산 서열 구조 연구

누에 실크 피브로인의 아미노산 서열은 매우 반복적이다. X선 회절 연구로부터 6개 아미노산 서열 GSGAGA은 실크 피브로인의 전형적인 β-시트 결정의 주요 성분인 것으로 알려져 있으며, 이것은 실크 II의 균질한 단위 셀을 형성한다(a=9.40Å; 수소 결합 방향, b=6.97Å; 섬유 축, c=9.20Å; 시트간 간격, β=90°). Gen Bank에서 입수한 누에 실크 피브로인 중쇄의 아미노산 서열은 도 21에 주어져 있다. 서열은 아미노기 (N-terminus)로 시작하여 카르복실기(C-terminus)로 끝난다. 피브로인 중쇄 아미노산 서열의 재배열은 도 22에 나타내었다. 결정질 부분인 GAGAGS 부분은 네모로 표시하였다. 이 GAGAGS 서열 외에도 여러 가지 불규칙적인 서열이 있다. 중쇄에서 11번 나타나는 불규칙한 서열(GT~GT) 중 하나는 굵은 글씨로 표시하였다. GY를 포함하는 또 다른 불규칙한 서열은 어둡게 표시하였다. 짧은 부분인 GAAS는 보통 불규칙한 GT~GT 서열을 뒤따른다. 아미노기와 카르복실기의 아미노산 잔기도 불규칙적이며 밝은 회색 글자로 표시하였다. 다른 Cys 잔기와 이황화물로 공유결합을 할 수 있는 Cys 잔기는 각 사슬의 끝에 굵은 글씨로 나타내었다.

피브로인 중쇄의 아미노산 서열에는 규칙성이 있다:

- 카르복실기와 아미노기는 완전히 불규칙한 아미노산 잔기로 구성된다.

- 결정질 부분(GAGAGS)는 여러 가지 형태의 GY~GY 서열로 분리된다.

- GY~GY 서열 다음에는 보통 GAAG 단편이 뒤따른다.

- GAAS 부분은 항상 각 종단을 제외하고는 같은 위치에 나타난다.

- 결정질 GAGAGS 부분을 분리하는 60 GY~GY 서열이 있다. GY~GY 서열에는 13가지가 있다. 주로 나타나는 5개는 다음과 같다.

1) GY(GX)3GYGXGY(GX)3GY : 24회

2) GAGAGY : 7회

3) GYGXGY(GX)3GY(GX)3GY(GX)3GY : 7회

4) GY(GX)3GY : 6회

5) GYGXGY(GX)3GY : 6회

여기서 X는 보통 A잔기이며 때로는 V와 I 잔기이다. V와 I의 위치는 불규칙하다.

- 불규칙한 11개의 GT~GT 사이에 2~8개의 GAGAGS/GY~GY블럭이 나타난다.

- GAGAGS/GY~GY블럭은 보통 β-시트 결정의 주요 성분인 Gly, Ala, Ser 및 Tyr로 구성된다. val, Thr, Ile 및 Phe은 중요한 형태는 아니지만 GAGAGS/GY~GY블럭에 가끔 나타난다.

- 불규칙한 GT~GT 서열은 마지막을 제외하고는 GAGAGS 서열 바로 다음에 온다.

- 진화적으로 보존되는 불규칙한 GT~GT 서열은 처음(32 잔기)과 마지막(34 잔기)을 제외하고는 보통 31개의 잔기로 구성된다.

1) gtgssgfgpyvanggysrsdgyeyawss dfft

2) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

3) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

4) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

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8) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

9) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

10) gtgssgfgpyvahggys gyeyawssesdfgt

11) gtgssgfgpyvanggysrregyeyawssksdfet

- 불규칙한 GT~GT 서열은 주축 방향을 바꾸는 주요 인자인 Pro 잔기를 항상 포함한다.

피브로인 경쇄와 P25는 전혀 규칙성이 없는 아미노산 서열로 구성된다. 이것은 이러한 성분이 구형이며 실크 섬유의 비정질 구간의 일부일 수도 있음을 나타낸다. 피브로인 중쇄의 완전히 불규칙한 아미노기와 카르복실기는 몇 개의 Cys 잔기를 포함하는데(아미노기에 2개 카르복실기에 3개), 이것은 GAGAGS, GY~GY 또는 GT~GT 서열에는 나타나지 않는다. 두 개의 Cys 잔기는 이황화 결합을 이룰수 있다. Tanaka는 중쇄와 경쇄가 카르복실기와 각 미세 단위요소 사이의 이황화 결합에 의해 공유 결합한다는 것을 보여 주었다. 각 사슬의 끝에는 여러 개의 Cys 잔기를 포함되어 있으므로 아미노기와 카르복실기 사이에 분자 상호간 공유 결합과 중쇄 간에 분자 상호간 이황화 결합 가능성이 높아진다.

불규칙한 GY~GY 서열의 구조와 기능에 관해서는 많이 알려지지 않았다. Zhou et al.는 대부분의 GX(X는 A가 65%, S이 23%, Y가 10% 반복된다) 디펩타이드는 두 개의 헥사펩타이드인 GAGAGS(432회) 및 GAGAGY(120회)의 일부로 존재한다고 보고 하였다. GAGAGY 서열의 구조에 관한 자세한 보고는 없었지만 X선 섬유 패턴은 GAGAGS 서열이 형성하는 단위 결정 셀로부터 특히 시트 간 간격(c-축)이 다른 결정 구조가 존재한다는 것을 보여주었다. Askura et el,는 Tyr 잔기의 구조적 역할을 연구하고 실크 II의 β-시트 구조 및 실크 I의 불규칙 코일에 긍정적인 역할을 한다고 보고하였다. 최근 연구에서는 Tyr 잔기가 분자 간 사슬 배열에 상당히 영향을 미치며 이것은 실크 II의 반 결정질 구간에서 긴 거리 결합 효과를 준다는 것을 보여 주었다. 따라서 GY~GY 서열도 결정 형성 구간이 될 수도 있으며 이것은 GAGAGS 부분이 형성하는 결정 단위 셀과 일치하지 않는다. 이러한 서열은 GAGAGS 서열이 형성한 구조로부터 특히 시트 간 거리(c 축)에서 나타나는 단위 셀 구조와는 다른 구조를 가진 β-시트 결정을 형성할 수도 있다.

불규칙하지만 보존되는 GT~GT 서열은 항상 Pro 잔기를 포함하는데, 이것은 다섯 개가 한 개의 고리를 형성하여 역회전 하도록 지시한다(표 10). 가장 흔히 나타나는 불규칙한 GT~GT 서열의 화학적 구조는 도 23에 나타내었다. 이러한 GT~GT 서열은 불규칙한 서열로 인해 특히 흥미를 끄는데, 이러한 불규칙성은 이 서열이 피브로인 중쇄의 β-시트 결정의 일부가 아님을 나타낸다. GT~GT 서열은 β-시트 결정의 GAGAGS/GY~GY 블록 사이에서 중첩, 나선 또는 불규칙 코일을 형성할 수 있다. 회전 구조를 형성하는 경우 한 중쇄 분자는 분자 내 역평행 β-띠를 12개 포함할 수 있다(도 24).

2) 2차원 NMR 분광법

아미노산의 규칙성은 유전자 보존에서 비롯된다. 그 이유는 보존되는 아미노산 서열이 중요한 기능 또는 구조적 중요성을 가지기 때문이다. 실크 피브로인은 효소와 같은 기능성 단백질이 아니라 머리카락 또는 손톱에 함유된 케라틴과 같은 구조적 물질이다. Asakura et al.은 13C CP/MAS NMR 분광법과 WAXS를 이용하여 피브로인 중쇄에 포함된 작은 불규칙한 단위인 GAAS의 구조와 역할을 연구하였다. 저자들은 이 서열이 실크 섬유 형성을 위해 실크 I에서 실크 II로 구조적 천이를 유도하는 요인 중하나라는 사실을 발견하였다. 불규칙적이지만 보존되는 GT~GT 서열은 실크 피브로인 분자의 전체 배열에 중요한 역할을 한다.

이 연구에서는 가장 흔히 나타나는 불규칙한 GT~GT 서열(도 24)의 3차원 배열을 고 분해능 단종핵(1H-1H) 및 이종핵(1H-13C)에 대한 2-D NMR 실험(도 25 내지 도 32 VII.19-VII.26)으로 조사하였다. 2-D COSY 스펙트럼(도 27)에서 α-, β-, γ- 및 방향족(Aromatic) 탄소에 부착된 양자의 상관관계를 규명하였다. 그러나 2-D COSY 스펙트럼의 NH-CαH 영역(지문 영역, Fingerprint Region)에서는 피크가 잘 분석되지 않으므로 COSY 스펙트럼만으로 아미드 양자를 할당하기가 어렵다. 아미드 양자에 대한 정확한 화학적 편이 할당을 위해 이종핵 (1H-15N) 2-D NMR 실험을 실시하였지만 합성 펩타이드에는 15N(자연 상태에서는 풍부함)이 풍부하지 않으므로 Gly, Ser, Tyr 등과 같이 중복되는 잔기에 포함된 몇몇 아미드 양자만 밝혀졌다. 이 문제는 COSY 스텍트럼을 TOCSY 스펙트럼과 비교함으로써 해결되었다(도 28). TOCSY는 아미드 양자와 α-, β-, γ- 에 부착된 양자 사이의 1H-1H 상관관계(스칼라 결합)를 감지할 수 있기 때문에 일차원 1H NMR 또는 2-D COSY 스펙트럼으로는 잘 분석할 수 없는 아미드 양자의 화학적 편이를 할당할 수 있게 한다. α-, β-, γ- 및 방향족탄소에 부착된 양자에 대한 1H의 화학적 편이가 매우 유사하여 정확하게 할당하는 것이 어려운 경우도 있다. 이러한 경우에는 2-D 이종핵 실험(HMQC 및 HMBC)이 유용하다(도 33, 도 34). 이러한 네 가지 실험에서 화학적 편이를 비교함으로써 H 및 C의 화학적 편이를 정확하게 할당할 수 있었다. 할당된 1H 및 13C의 화학적 편이는 표 11과 표 12에 각각 나타내었다.

할당된 1H의 화학적 편이 값으로부터 도 31 및 도 32에 각각 나타낸 NOESY 및 ROESY 스펙트럼을 이용하여 공간 상호 작용(쌍극자 결합)을 통한 1H-1H을 파악하였다. NOE는 선형 펩타이드에서(서열을 가진 NOE) 최대 5개의 잔기로 분리된 공간(쌍극자-쌍극자 작용)을 통해 상호작용을 하는 양자를 감지할 수 있다. 2-D NMR 실험을 위한 합성 펩타이드는 자연 상태에서는 풍부하며(분해능이 낮음) 약간의 잔기를 포함한다(G의 경우 8개, S의 경우 6개, Y의 경우 4개, T의 경우 2개, F의 경우 2개, A의 경우 2개 및 F의 경우 2개). 이러한 이유로 인해 NOE가 발견되지 않음에도 불구하고 잔기가 많은 경우에는 어느 잔기가 어느 것과 작용하는지 규명하기가 어려웠다. 이러한 복잡성을 배제하기 위해 최대 3개의 잔기로 분리된 잔기에 대한 NOE는 서열을 가진 NOE로 간주하였다. 공간 작용을 통한 긴 범위 1H-1H를 할당하기 위한 첫 번째 단계는 펩타이드 서열에서 단 한번만 나타나는 잔기에 대한 NOE를 파악하는 것이며(예를 들면 N(Asn)과 W(Trp) 사이의 NOE; 도 35에서 NOESY 및 도 360에서 ROESY), 이로 인해 간단한 이차원적 겹침 구조를 얻을 수 있다(도 37). 이러한 간단한 이차원적 겹침 구조로부터 중복되는 잔기에 대해 더 긴 범위의 NOE를 할당할 수 있었다. 공간을 통한 1H-1H 작용은 NOESY에 대해서는 표 13에 ROESY에 대해서는 표 14에 나타내었다. NOESY 및 ROESY로 확인한 공간 작용을 통해 중복되는 1H-1H는 표에서 제외하였으며 공간 작용을 통한 긴 범위 1H-1H는 어둡게 표시하였다.

3) 실크 펩타이드의 3-D 모델

도 38a(텍스트 형태의 부속서X.1)은 아미노산 서열 만으로부터(NMR 구속이 없음) 형상화한 실크 펩타이드의 확장된 3차원 모델을 보여준다. 에너지 최소화 및 NMR 구속에 따른 분자 동역학으로부터 계산한 두 가지의 3차원 모델이 있는데, 하나는 어닐링 시뮬레이션 만으로부터 구한 것이고(텍스트 형태의 부속서 X.2) 다른 하나는 어닐링 시뮬레이션과 함께 기하학적 거리 계산으로 구한 것으로서(텍스트 형태의 부속서 X.3) 매우 유사한 3차원 구조를 보여주었다. 선형적인 펩타이드는 각각 도 38b와 도 38c에 나타낸 방법으로 중첩되었다. 계산 후에는 양쪽 모델에서(부속서) 어떠한 위반도 발견되지 않았으므로 NOE 데이터를 신뢰할 수 있음을 나타내었다.

대부분의 3-D 분자 구조 연구는 다차원 NMR 분광법 또는 X선 결정분석법으로 수행되었다. 다차원 다핵 NMR 분광법은 용액 시료를 이용하는 하는 반면 X선 결정분석법은 단결정 형태의 고체 시료를 이용한다. 그럼에도 불구하고 많은 경우에서 두 기술로부터 구한 3-D 구조가 매우 유사하다. 실크 피브로인의 경우에도 이것이 사실이라면 불규칙하지만 보존되는 서열의 구조는 고체 상태에서도 유사할 것이다. 각 사슬의 끝은 실제 분자와는 달리 유동적이고 아미노산과 카르복실 산 그룹을 포함하므로 각 사슬 끝의 골격 구조는 실제 분자와 다르다. 그러나 펩타이드 서열 내에서 아미노산에 대한 루프 구조는 분명하게 나타나며 불규칙하지만 보존되는 GT~GT 서열의 일반적인 특징은 회전 구조적인 기능을 한다. 이러한 불규칙한 GT~GT 서열은 도 24에 나타낸 고리 또는 회전 구조를 지시함으로써 피브로인 중쇄의 GAGAGS/GY~GT 결정 블록에 대한 β-시트 형성을 용이하게 할 수도 있다. 이러한 불규칙한 GT~GT 서열은 실크 피브로인의 결정 단위 셀(실크 II)에 일치하지 않는 긴 측사슬(Side Chain)과 서열의 불규칙성(특히 Pro 잔기)으로 인해 실크 피브로인의 β-시트 결정에 포함될 가능성은 희박하다.

11개의 불규칙한 GT~GT 서열에 포함된 Asn(N13) 잔기 중 3개는 His(H13)으로 교체되어 처음과 마지막 불규칙 GT~GT 서열은 측사슬에 각각 1개와 3개의 잔기를 더 많이 가지게 된다. 이것은 이러한 불규칙한 GT~GT 서열이 서로 작용하여 판과 같은 단일 시트 구조가 아니라 단일 피브로인 분자에 대해 3차원으로 쌓아올린 시트 구조를 형성할 수도 있음을 뜻한다.

상술한 바와 같이 본 발명의 실시예에 따른 실크 피브로인 재생방법은 습식방사가 가능한 점도를 보유하면서 재생실크와 천연실크의 물성을 대등한 수준까지 확보할 수 있는 효과가 있다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

Claims (2)

1. 실크 피브로인의 재생방법에 있어서,

   뜨거운 물(80℃)에서 10분간(항온조에 대한 실크의 욕비(Bath Ratio)는 1:100 w/v (g/mL)였다) 0.25% w/v Sodium Lauryl Sulfate 및 0.25 % w/v Sodium Carbonate을 사용하여 생사를 실크 피브로인을 얻기 위해 정련 과정을 통해 세리신을 제거하고 하고, 정련 후 탈이온수로 30분간 피브로인을 철저히 세척하여 잔여 세리신과 계면 활성제를 제거하고 공기 중에서 건조시키는 정련단계;

   메탄올(MeOH)에 Tetrahydrate Calcium Nitrate(Ca(NO₃)₂.4H₂O)를 용해하는 용매준비단계(Ca:H₂O: MeOH의 몰 비는 1;4:2);

   정련된 실크와 Ca(NO₃)₂.4H₂O-2MeOH 용액을 혼합하고, 60℃~65℃ 사이에 유지하여 피브로인을 용해하며, 용해되지 않은 입자는 원심분리와 정제하는 용해단계;

   10% w/v 피브로인-염 용액을 탈이온수로 투석하여 피브로인 용액(MWCO: 6,000~8,000Da)의 칼슘 농도를 줄이고, 젤화를 방지하기 위해 투석된 피브로인 용액을 바로 동결 건조 또는 필름 주조용으로 사용하는 투석 및 동결건조단계;

   습식방사를 위해 실온에서 동결 건조된 실크 피브로인을 95% (v/v) 개미산과 13% w/v까지의 TFA(Tetrafluoroacetic Acid)에 완전히 용해하는 진액준비;

   개미산과 TFA(각각 13% w/v)에 용해된 피브로인 진액을 압출하고, 조직학적 등급의 메탄올을 응고제를 사용하되, 압출율은 각각 2.0mL/min과 1.5mL/min이었으며, 개미 산 진액에 대해 8m/min, TFA 진액에 대해 10m/sec의 일정한 속도로 섬사를 권취하는 방사단계를 포함함을 특징으로 하는 누에실크 피브로인의 재생방법.
2. 제1항에 있어서,

   피브로인 섬사는 용매와 응고제가 완전히 교환되도록 4시간 동안 방치되며 용매와 응고제가 완전히 교환된 후 젖은 상태에서 약 3.0x의 비율로 방사된 섬유를 연신하는 연신단계를 더 포함함을 특징으로 하는 재생방법.

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