KR20060134217A

KR20060134217A - Hdm2-inhibitor complexes and uses thereof

Info

Publication number: KR20060134217A
Application number: KR1020067024161A
Authority: KR
Inventors: 카르스텐 슈베르트; 브루스 그라스버거; 다이안 매과이어; 인그리드 덱크만; 존 스퍼리노
Original assignee: 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2004-04-22
Publication date: 2006-12-27

Abstract

The present invention includes crystallized HDM2 peptides as well as descriptions of the X-ray diffraction patterns of the crystals. The diffraction patterns allow the three dimensional structure of HDM2 to be determined at atomic resolution so that ligand binding sites on HDM2 can be identified and the interactions of ligands with HDM2 amino acid residues can be modeled. Models prepared using such maps permit the design of ligands which can function as active agents which include, but are not limited to, those that function as inhibitors of MDM2 and HDM2 oncoproteins.

Description

ＨＤＭ2-저해제 착물 및 이의 사용{HDM2-inhibitor complexes and uses thereof}HDD2-inhibitor complexes and uses thereof

관련된 출원에 대한 전후-참조Post-Reference to Related Applications

본 발명은 2002년 10월 16일 출원된 출원 번호 제 60/418,350호를 우선권으로 주장한다. The present invention claims priority to application number 60 / 418,350 filed October 16, 2002.

연방 후원 연구개발에 대한 진술Statement on federally sponsored research and development

적용할 수 없다.Not applicable

본 발명은 일반적으로 합리적인 약물 설계에 기반한 분자 생물학, 단백질 결정화, 엑스레이 회절 분석, 3차원 구조 결정, 분자 모델링 및 구조 분야에 관한것이다. 본 발명은 엑스레이 회절 패턴의 기술뿐만 아니라 결정화된 HDM2 펩티드를 제공한다. 문제의 결정의 엑스레이 회절 패턴은 HDM2의 3차원 구조가 원자 해상도에서 결정될 수 있고, HDM2상의 리간드 결합 부위가 확인될 수 있으며, 또한 HDM2 아미노산 잔기와 리간드의 상호작용이 모델화 될 수 있도록 충분한 해상도이다. 본 발명에 의해 제공된 고해상도 지도 및 이러한 지도를 사용하여 제조된 모델은 또한 활성 약제로 기능할 수 있는 리간드의 설계를 허용한다. 따라서, 본 발명은 제한없이, MDM2 및HDM2 종양단백질의 저해제로의 사용을 발견한 것을 포함하는 활성 약제의 설계에 대한 적용을 가진다. The present invention generally relates to the fields of molecular biology, protein crystallization, x-ray diffraction analysis, three-dimensional structure determination, molecular modeling and structure based on rational drug design. The present invention provides crystallized HDM2 peptides as well as the description of x-ray diffraction patterns. The X-ray diffraction pattern of the crystal in question is of sufficient resolution so that the three-dimensional structure of HDM2 can be determined at atomic resolution, the ligand binding site on HDM2 can be identified, and the interaction of the ligand with HDM2 amino acid residues can be modeled. The high resolution maps provided by the present invention and models made using such maps also allow the design of ligands that can function as active agents. Accordingly, the present invention has application to the design of active agents, including without limitation, the discovery of the use of MDM2 and HDM2 oncoproteins as inhibitors.

HDM2: 구조 및 기능 HDM2: Structure and Function

HDM2 (인간 더블미닛(double minute) 2 단백질)은 연조직 육종, 교모세포종 및 포유류 암종(Oliner, J.D. et al., Nature, 358(6381):80-83(1992); Reifenberger, G. et al., Cancer Res., 53:2736-2739(1993); Bueso-Ramos, C. E. et al., Breast Canc. Res. Treat., 37(2):179-188(1996))을 포함하는 인간종양의 부분집합중 발현하는 종양유전자, hdm2의 발현 산물이다. 이 종양유전자의 기능적 특성은 HDM2 및 p53 사이의 상호작용, 세포 성장 정지에 주요한 종양 억제제 및 세포자멸(Momand, G.P. et al., Cell, 69:1237 (1992))을 나타내었다. HDM2는 p53의 전사 표적이고, 이렇듯이, HDM2 및 p53은 간결히 정형화된 루프를 형성한다(Wu, X. et al., Genes and Dev., 7:1126-1132(1992)). HDM2는 추가로 유비퀴틴화에 의해서 및 핵소체에 대하여 HDM2를 격리시키는 아르프(Arf)와 복합체를 형성함으로써 조절된다(Tao, W. and Levine, A.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(12):6937-6941(1999); Weber, J.D. et al., Nat. Cell Biol., 1(1):20-26(1999)). HDM2 (human double minute 2 protein) is a soft tissue sarcoma, glioblastoma and mammalian carcinoma (Oliner, JD et al., Nature, 358 (6381): 80-83 (1992); Reifenberger, G. et al. , Cancer Res., 53: 2736-2739 (1993); Bueso-Ramos, CE et al., Breast Canc. Res. Treat., 37 (2): 179-188 (1996)) It is the expression product of the oncogene, hdm2, expressed in the aggregate. Functional properties of this oncogene showed interactions between HDM2 and p53, tumor suppressors and apoptosis major in cell growth arrest (Momand, G. P. et al., Cell, 69: 1237 (1992)). HDM2 is the transcriptional target of p53 and, as such, HDM2 and p53 form a concise stereotyped loop (Wu, X. et al., Genes and Dev., 7: 1126-1132 (1992)). HDM2 is further regulated by ubiquitination and by complexing with Arf, which sequesters HDM2 to the nucleolus (Tao, W. and Levine, AJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (12). ): 6937-6941 (1999); Weber, JD et al., Nat. Cell Biol., 1 (1): 20-26 (1999)).

HDM2가 또한 p53에 독립적으로 기능할 수 있다는 것을 제시하는 증거의 몇몇 방침들이 있다. p53-결합 영역을 함유하지 않는 HDM2의 스플라이스 변이가 인간 종 양중 발견되었고, 형질전환 능력을 가진 것으로 보여졌다(Sigalas, I. et al. Nat. Med. 2(8):912-917(1996)). 생체내 연구는 또한 HDM2가 과발현된 유전자삽입 쥐에서 발달된 종양의 스펙트럼은 p53이 없는 쥐에서 발견된 스펙트럼과 다르다는 것을 나타내었고, HDM2는 p53이 없는 동물에서 육종발생을 작동시킬 수 있다(Jones, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(26):15608-15612(1998)). 결국, HDM2의 다른 결합짝은 발암성 경로를 따라 HDM2 기능을 도와줄 수 있으며, 예를 들어, MTBP-유발 p53-독립적 G1 정지의 HDM2 저해이다(Boyd, M.T. et. al., J. Biol. Chem. 275(41):31883-31890(2000)). There are several policies of evidence suggesting that HDM2 can also function independently of p53. Splice variations of HDM2 that do not contain a p53-binding region were found in human tumors and were shown to have transformation capacity (Sigalas, I. et al. Nat. Med. 2 (8): 912-917 (1996). )). In vivo studies also showed that the spectrum of tumors developed in transgenic mice overexpressing HDM2 differed from the spectrum found in mice without p53, and HDM2 could trigger sarcoma in animals without p53 (Jones, SN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (26): 15608-15612 (1998). Eventually, other binding pairs of HDM2 can assist HDM2 function along a carcinogenic pathway, for example HDM2 inhibition of MTBP-induced p53-independent G1 arrest (Boyd, MT et. Al., J. Biol. Chem. 275 (41): 31883-31890 (2000).

안티센스 뉴클레오티드에 의한 hdm2 저해 후 증진된 종양 세포의 죽음에 대한 보고(Chen, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(1):195-200 (1998); Chen, L. et al., Mol. Med., 5(1):21-34(1999); Tortora, G. et al., Int. J. Cancer, 88(5):804-809(2000)) 및 HDM2-결합 미니-단백질(Bottger, A. et al., Curr. Biol., 7(11):860-869(1997))은 HDM2의 저해는 p53을 활성화하고 차례로 세포자멸을 유발한다는 예측을 입증한다. 이러한 생각에 따르면, p53 결합 홈에 대해 생성된 작은 분자 저해제는 두 단백질의 상호 작용을 방해하고 p53 활성을 유발할 것으로 기대된다. 이는 추가로, p53 및 HDM2 사이의 상호작용의 저해는 표준 화학치료약제와 신생물의 치료에서 부가적으로 또는 상승적으로 작용할 것이라는 것을 제시하며, 이는 또한 안티센스 hdm2 구성을 이용한 일에 의해 지지된다(Wang, H. et al., Clin. Canc. Res. 7(11):3613-3624 (2001)). Report of enhanced tumor cell death after hdm2 inhibition by antisense nucleotides (Chen, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (1): 195-200 (1998); Chen, L et al., Mol. Med., 5 (1): 21-34 (1999); Tortora, G. et al., Int. J. Cancer, 88 (5): 804-809 (2000)) and HDM2 -Binding mini-protein (Bottger, A. et al., Curr. Biol., 7 (11): 860-869 (1997)) demonstrates the prediction that inhibition of HDM2 activates p53 and in turn causes apoptosis . According to this idea, small molecule inhibitors produced against p53 binding grooves are expected to interfere with the interaction of two proteins and induce p53 activity. This further suggests that inhibition of the interaction between p53 and HDM2 will act additionally or synergistically in the treatment of standard chemotherapeutic agents and neoplasms, which is also supported by work with antisense hdm2 constructs (Wang , H. et al., Clin. Canc. Res. 7 (11): 3613-3624 (2001)).

MDM2: 구조 및 기능MDM2: Structure and Function

HDM2의 쥐 동족, mdm2는 쥐 더블미닛 염색체상에서 본래 발견되고, 이는 종양형성 세포주중 증폭되는 3개의 유전자중 하나인 것으로 초기에 확인되었다(Cahilly-Snyder., L. et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:235-244(1987)). 이의 단백질 산물은 이어서 앞서 온도 민감 쥐 p53 유전자와 형질전환된 쥐 섬유모세포 세포주(복제 6)중 처음 관찰되는 p53과 착물을 형성하는 것으로 발견되었다(Michalovitz, D. et al., Cell 62:671-680(1990)). 쥐 세포주는 37℃에서 잘 성장하였으나, 32℃로 낮아졌을 때 G1 정지를 나타내고, 이는 전적으로 p53 구조 및 활성중 관찰된 온도 의존 스위치와 부합한다. 그러나, p53-MDM2 착물은 p53이 기능적으로 또는 "야생형" 형태에서 우세한 온도인 32℃에서 풍부한 것으로만 관찰되었다(Barak, Y. et al., EMBO J. 11:2115-2121(1992) and Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245(1992)). 쥐 세포주를 32℃로 낮게 이동시키고 새로(de novo) 단백질 합성을 막음으로써, mdm2 유전자의 "야생형" p53 유발된 발현만을 나타내었고, 그때문에 p53 전사 활성에 의하여 차별된 풍부함에 대해 설명한다(Barak, Y. et al., EMBO J. 12: 461-468(1993)). 설명은 mdm2 유전자의 첫번째 인트론(intron)중의 야생형 p53에 대한 DNA 결합 부위의 확인에 의해 추가로 발전되었다(Wu, X. et al., Genes Dev. 7:1126-1132 (1993)). 보고자(Reporter)는 야생형 p53이 MDM2와 동시-발현될 때 불활성화되는 것을 나타낸 p53 DNA 결합 부위를 사용하여 구성하였다. The murine cognate of HDM2, mdm2, was originally found on the murine double minute chromosome, which was initially identified as one of three genes amplified in tumorigenic cell lines (Cahilly-Snyder., L. et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 235-244 (1987). Its protein product was then found to form a complex with p53, which was first observed in the temperature sensitive murine p53 gene and the transformed murine fibroblast cell line (replicate 6) (Michalovitz, D. et al., Cell 62: 671-). 680 (1990). Murine cell lines grew well at 37 ° C., but showed a G1 quiescence when lowered to 32 ° C., which is consistent with the temperature dependent switches observed during p53 structure and activity. However, the p53-MDM2 complex was only observed to be abundant at 32 ° C., where p53 was the predominant functional or "wild-type" form (Barak, Y. et al., EMBO J. 11: 2115-2121 (1992) and Momand , J. et al., Cell 69: 1237-1245 (1992). By moving the mouse cell line low to 32 ° C. and preventing de novo protein synthesis, only "wild-type" p53-induced expression of the mdm2 gene was shown, which explains the abundance differentiated by p53 transcriptional activity (Barak , Y. et al., EMBO J. 12: 461-468 (1993)). The explanation was further developed by identification of the DNA binding site for wild type p53 in the first intron of the mdm2 gene (Wu, X. et al., Genes Dev. 7: 1126-1132 (1993)). Reporter constructed using the p53 DNA binding site, which showed that wild type p53 was inactivated when co-expressed with MDM2.

p53의 전사적 활성의 저해는 p53의 활성 영역 및 또는 DNA 결합 부위의 MDM2 차단에 의해 야기될 수 있다. 결과적으로, mdm2 발현이 야생형 p52의 전사적 활성 에 대한 MDM2 단백질의 저해 효과를 통해 자동조절된다는 것이 제시되었다. 이러한 p53-mdm2 자동조절 피드백 루프는 세포 성장이 어떻게 p53에 의해 조절되는가에 대한 새로운 통찰력을 제공하였다. 인간 육종의 3분의 1은 mdm2 유전자의 증폭에 의해 p53-조절된 성장 조절을 극복하는 것으로 간주된다(Oliner, J.D. et al., Nature 358:80-83(1992)). 따라서, p53 및 MDM2 사이의 상호작용은 치료표적의 중요한 잠재성을 나타낸다. Inhibition of the transcriptional activity of p53 may be caused by MDM2 blocking of the active region of p53 and / or the DNA binding site. As a result, it was suggested that mdm2 expression is autoregulated through the inhibitory effect of MDM2 protein on the transcriptional activity of wild type p52. This p53-mdm2 autoregulatory feedback loop provided new insights into how cell growth is regulated by p53. One third of human sarcoma is considered to overcome p53-regulated growth regulation by amplification of the mdm2 gene (Oliner, J.D. et al., Nature 358: 80-83 (1992)). Thus, the interaction between p53 and MDM2 represents an important potential of therapeutic targets.

p53: HDM2 및 MDM2와의 상호작용 p53: interaction with HDM2 and MDM2

p53은 세포주기 정지 또는 세포자멸에 의한 세포 죽음, 예를 들어 p21, 14-3-3σ, 및 박스(bax)를 일으키는 다수의 단백질용 전사 인자이다. p53의 레벨 및 전사 활성은 세포 DNA에 대한 손상에 의해 증가된다. MDM2 단백질은 p53의 양친매성 N-종단 나선에 결합하고, 다른 단백질과 p53의 상호작용 및 그의 전이활성을 폐기함으로써 p53의 기능을 저해한다. p53 is a transcription factor for many proteins that causes cell death by cell cycle arrest or apoptosis, eg, p21, 14-3-3σ, and boxes. The level of p53 and transcriptional activity is increased by damage to cellular DNA. The MDM2 protein binds to the amphipathic N-terminus helix of p53 and inhibits the function of p53 by abolishing p53's interaction with other proteins and their metastatic activity.

MDM2와의 상호작용은 유비퀴틴 의존 단백질 분해를 위해 또한 p53을 표적으로 한다. MDM2는 아마도 pRB 및 EF2와 같은 어떤 하류 효과기와 직접적인 상호작용에 의해 세포주기 또한 마찬가지로 p53에 대한 독립 효과를 나타낸다(Reviewed in Zhang, R. and Wang, H., Cur. Pharm. Des. 6: 393-416 (2000)). Interaction with MDM2 also targets p53 for ubiquitin dependent proteolysis. MDM2 exerts an independent effect on the cell cycle as well as p53, possibly by direct interaction with some downstream effectors such as pRB and EF2 (Reviewed in Zhang, R. and Wang, H., Cur. Pharm. Des. 6: 393 -416 (2000)).

모든 인간 암의 50%에서 p53 단백질의 변이가 일어났다(reviewed in Agarwal, M.L. et al. J. Biol. Chem. 273:1-4(1998); Levine, A.J., Cell 88: 323-331(1997); and, references cited in Oren; M., J. Biol. Chem. 274: 36031- 36034(1999)). Mutations in the p53 protein occurred in 50% of all human cancers (reviewed in Agarwal, ML et al. J. Biol. Chem. 273: 1-4 (1998); Levine, AJ, Cell 88: 323-331 (1997) and, references cited in Oren; M., J. Biol. Chem. 274: 36031-36034 (1999).

보통의 환경하에서, p53은 잠재적이고, 수 분의 매우 짧은 반감기로 죽는 매우 불안정한 단백질이다(Rogel, A. et al., Mol. Cell. Biol.5:2851- 2855(1985)). DNA 손상 또는 스트레스는 p53의 안정성을 급격히 증가시킨다(Kastan, M.B. et al., Cancer Res. 51:6304-6311(1991)). 또한, 이들 신호는 p53의 기능(일반적으로 이것의 전이활성 영역의 자동조절 저해에 의해 억제되는 기능)을 세포자멸 기계의 전사적 활성기로 활성화한다. 세포중 존재하는 p53의 양은 p53 및 종양유전자 hdm2 사이의 음성 피드백 루프에 의해 엄격히 조절된다. p53은 세포핵중 위치하고, hdm2의 발현을 이것의 전이활성 영역을 통해 유도한다. 발현된 hdm2는 뒤이어 p53 전이활성 영역인 잔기 19-26에 결합하고, 그것을 불활성화하고(Chen, J. et al., Mol. Cell. Biol. 16:2445-2452(1996); Haupt, Y. et al., EMBO J. 15:1596-1606(1996); Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245(1992)), 유전자 발현에 필요한 전사 요소의 보충을 막는다(Lu, H. et al., PNAS 92:5154-5158(1995); Thut, C. J. et al., Science 267:00-104 (1995)). 또한, p53-hdm2-착물은 분해가 일어나는 세포질로 왕복된다. 음성 피드백을 통한 이러한 엄격한 조절은 유기체의 생존에 중요하다. hdm2-녹아웃(knockout) 쥐중 hdm2의 불활성은 이른 배아 치사율로 이끌지만, p53의 동시적인 불활성에 의해 완전히 예방될 수 있다(Jones, S. N. et al., Nature 378:206-208(1995); Montes de Oca Luna, R. et al., Nature 378:203-206 (1995)). 한편으로, hdm2의 과도한 발현은 p53의 구성적인 저해 및 암의 촉진을 이끌 수 있다. 과도한 HDM2는 또한 p53과는 독립적으로 암을 촉진할 수 있다(Lundgren, K. et al., Genes and Dev. 11:714-725(1997); Sun, P. et al., Science 282: 2270-2272(1998)). Under normal circumstances, p53 is a potentially unstable protein that dies with a very short half-life of minutes (Rogel, A. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 2851-2855 (1985)). DNA damage or stress drastically increases the stability of p53 (Kastan, M.B. et al., Cancer Res. 51: 6304-6311 (1991)). In addition, these signals activate the function of p53 (generally inhibited by inhibition of its autoregulatory region) by the transcriptional activator of the apoptosis machinery. The amount of p53 present in the cell is tightly regulated by the negative feedback loop between p53 and oncogene hdm2. p53 is located in the cell nucleus and induces expression of hdm2 through its transactive region. The expressed hdm2 then binds to and inactivates residues 19-26, the p53 transactivation region (Chen, J. et al., Mol. Cell. Biol. 16: 2445-2452 (1996); Haupt, Y. et al., EMBO J. 15: 1596-1606 (1996); Momand, J. et al., Cell 69: 1237-1245 (1992)), preventing supplementation of transcriptional elements required for gene expression (Lu, H. et al., PNAS 92: 5154-5158 (1995); Thut, CJ et al., Science 267: 00-104 (1995). In addition, the p53-hdm2-complex is reciprocated into the cytoplasm where degradation occurs. This tight control through negative feedback is important for the survival of the organism. Inactivation of hdm2 in hdm2-knockout mice leads to early embryonic lethality, but can be completely prevented by simultaneous inactivation of p53 (Jones, SN et al., Nature 378: 206-208 (1995); Montes de Oca Luna, R. et al., Nature 378: 203-206 (1995)). On the other hand, excessive expression of hdm2 can lead to constitutive inhibition of p53 and promotion of cancer. Excessive HDM2 can also promote cancer independently of p53 (Lundgren, K. et al., Genes and Dev. 11: 714-725 (1997); Sun, P. et al., Science 282: 2270-). 2272 (1998).

상기 논의되었듯이, HDM2 및 p53간의 상호작용의 저해는 암 치료에 매력적인 표적이다(Lane, D.P., TIBS 22: 372-374(1997)). p53 및 HDM2간의 착물 형성의 저해는 세포중 p53의 레벨을 상승시키는 것으로 나타났다(Bottger, A. et al., Current Biol. 7:860-869(1997)). 또한, HDM2를 p53에 결합하는 것으로부터 차단하는 것은 HDM2를 암치료의 최전선으로 과발현하는 세포에 세포주기 조절을 복원하는데 치료적으로 유용할 것이다. 보다 일반적으로, HDM2의 저해는 화학치료의 효과 및 p53 일반 암중 방사를 세포자멸 및 성장정지 신호 경로를 증진시킴으로써 증가시킬 것이다. 이러한 접근은 기능적 p53을 함유한 종양 세포를 화학치료 약제에 보다 감수성 있게 한다. As discussed above, inhibition of the interaction between HDM2 and p53 is an attractive target for cancer treatment (Lane, D.P., TIBS 22: 372-374 (1997)). Inhibition of complex formation between p53 and HDM2 has been shown to elevate the levels of p53 in cells (Bottger, A. et al., Current Biol. 7: 860-869 (1997)). In addition, blocking HDM2 from binding to p53 would be therapeutically useful in restoring cell cycle regulation in cells that overexpress HDM2 as the forefront of cancer therapy. More generally, inhibition of HDM2 will increase the effects of chemotherapy and radiation in p53 general cancer by enhancing apoptosis and growth arrest signaling pathways. This approach makes tumor cells containing functional p53 more susceptible to chemotherapeutic agents.

p53/HDM2 단백질 착물의 저해제를 확인하는 하나의 방법은, 상호작용에 대한 모델을 설립하기 위한 결정학으로 HDM2 결합 주머니의 아미노산 특이성을 결정하는 것이다. 이 방법을 사용하여, Kussie et al.은 p53 기반 펩티드 길항제를 확인했다(Kussie, P.H. et al., Science 274:948-953(1996)). Kussie et al.은 또한 HDM2(잔기 17-125)의 끝이 잘린 형태의 결정 구조 및 p53의 N-종단 전이활성 영역으로부터 유발된 15합체 펩티드를 Kussie et al.(Kussie et al., (1996))에 의해 공개하였다. Kussie et al.은 또한 HDM2에 대하여 71%의 서열 일치를 갖는 Xenopus laevis(잔기 13- 118)로부터 유발된 MDM2(Kussie et al., (1996))의 결정 구조를 공개하였다. 분자 모델링에 기반하여, Garcia-Echeverria et al.은 15합체 야생형 p53 펩티드로부터 유발되고, hdm2의 N-종단 영역에 결합된 8합체 펩티도유사체(peptidomimetic)의 모델을 공개하였다(Garcia-Echeverria, C. et al., J. Med. Chem. 43:3205-3208(2000)). 작은 분자 저해제와 같은 저해적 화합물을 가진 HDM2의 결정 구조는 없거나, 예를 들어 다른 펩티드는 개시된 것으로 믿어진다. One method of identifying inhibitors of the p53 / HDM2 protein complex is to determine the amino acid specificity of the HDM2 binding pocket in crystallography to establish a model for interaction. Using this method, Kussie et al. Identified p53 based peptide antagonists (Kussie, PH et al., Science 274: 948-953 (1996)). Kussie et al. Also described 15-merged peptides derived from the truncated crystal structure of HDM2 (residues 17-125) and the N-terminal transactivation region of p53 (Kussie et al., (1996)). ). Kussie et al. Also reported Xenopus with 71% sequence identity to HDM2. The crystal structure of MDM2 (Kussie et al., (1996)) derived from laevis (residues 13-118) was disclosed. Based on molecular modeling, Garcia-Echeverria et al. Published a model of the octahedral peptidomimetic derived from the 15 conjugate wild type p53 peptide and bound to the N-terminus region of hdm2 (Garcia-Echeverria, C). et al., J. Med. Chem. 43: 3205-3208 (2000). There is no crystal structure of HDM2 with inhibitory compounds such as small molecule inhibitors, or for example other peptides are believed to be disclosed.

게다가, 수요는 HDM2(및 이들의 유사체) 및 p53과 같은 자연 결합 리간드 간의 상호작용을 방해하는 잠재성 있는 작은 분자를 선택하고 설계하기 위한 모델링 시스템의 개발용으로 계속된다. In addition, the demand continues for the development of modeling systems for selecting and designing potentially small molecules that interfere with the interaction between HDM2 (and their analogs) and natural binding ligands such as p53.

발명의 요약Summary of the Invention

본 발명은 인간 MDM2 단백질(HDM2) 및 HDM2와 착물을 형성하고, HDM2가 p53 단백질과 상호작용하는 것을 예방하는 저해적 화합물로부터 유발된 3차원 구조 정보의 생성 및 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 저해제-HDM2 착물의 결정을 얻기위한 특이 결정화 조건을 포함한다. 결정은 이어서 착물의 3차원 구조를 얻기 위해 엑스레이 결정학(또는 NMR)에 사용되고, 얻어진 자료는 HDM2 및 저해제 사이의 착물 형성을 개선하기 위해, 또한 HDM2의 p53에의 결합의 저해를 개선하기 위한 목적으로 합리적인 약물 발견 설계에 사용된다.The present invention includes methods of generating and using three-dimensional structural information derived from inhibitory compounds that complex with human MDM2 protein (HDM2) and HDM2 and prevent HDM2 from interacting with the p53 protein. The invention also includes specific crystallization conditions for obtaining crystals of the inhibitor-HDM2 complex. The crystals are then used in X-ray crystallography (or NMR) to obtain the three-dimensional structure of the complex, and the data obtained are reasonable for the purpose of improving the complex formation between HDM2 and the inhibitor and also for the inhibition of the binding of HDM2 to p53. Used in drug discovery design.

본 발명은 HDM2를 포함한 결정, 또는 단편, 또는 표적 구조적 모티프(motif) 또는 이들의 유도체, 및 리간드(리간드는 작은 분자 저해제)를 포함한다. 다른 구체예에서, 결정은 P3₂21의 삼각형 공간그룹 및 사각형 공간그룹 P4₃2₁2을 구성하는 그룹으로부터 선택된 공간그룹을 갖는다. 본 발명은 또한 SEQ ID NO. 2에 적어도 95% 서열이 일치하는 펩티드를 포함하는 HDM2를 포함한 결정을 포함한다. The present invention includes crystals or fragments comprising HDM2, or target structural motifs or derivatives thereof, and ligands (ligands are small molecule inhibitors). In another embodiment, the crystal has a spatial group selected from the group consisting of a triangular spatial group of P3 ₂ 21 and a rectangular spatial group P4 ₃ 2 ₁ 2. The invention also relates to SEQ ID NO. A crystal comprising HDM2 comprising a peptide with at least 95% sequence matching 2;

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 (a) HDM2를 포함하는 결정, 또는 단편, 또는 표적 구조적 모티프 또는 이들의 유도체, 및 작은 분자 저해제인 리간드의 3차원 구조상에 정보를 함유하고, 컴퓨터로 읽을 수 있는 저장 매체에 저장한 데이터베이스, (b) 정보를 열람하는 사용자 인터페이스(interface)를 포함한 컴퓨터 시스템을 포함한다. In another aspect of the invention, the invention contains (a) information on a three-dimensional structure of a crystal, or fragment, comprising HDM2, or a target structural motif or derivative thereof, and a ligand that is a small molecule inhibitor and is readable by computer Computer system including a database stored in a storage medium, and (b) a user interface for viewing information.

본 발명은 또한, HDM2와 결합될 수 있는 약제의 잠재력을 평가하는 방법을 포함한다: (a) HDM2를 약제에 노출시키고; (b) 상기 약제의 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 결합을 검출함으로써 잠재력을 평가한다.The invention also includes a method of assessing the potential of a medicament capable of binding to HDM2: (a) exposing HDM2 to a medicament; (b) The potential is assessed by detecting the binding of the agent to the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ .

본 발명은 또한 aa¹⁶-SEQ ID NO:2를 갖는 펩티드와 결합하는 약제의 잠재력을 평가하는 방법을 포함하고:(a) aa¹⁶-SEQ ID NO:2를 약제에 노출시키고; (b) 약제의 aa¹⁶-SEQ ID NO:2와의 결합을 검출함으로써 잠재력을 평가하는 것을 포함한다. The invention also includes a method for assessing the potential of a drug to bind a peptide having aa ¹⁶ -SEQ ID NO: 2, comprising: (a) exposing aa ¹⁶ -SEQ ID NO: 2 to the drug; (b) assessing the potential by detecting the binding of the agent to aa ¹⁶ -SEQ ID NO: 2.

추가로 본 발명에 포함된 것은 HDM2에 대한 잠재력있는 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법이며: (a) 상기 잠재력있는 작용제 또는 길항제를 설계하거나 선택하기 위한 작은 분자 저해제와 동시결정화된 HDM2의 3차원 구조를 사용하는 것을 포함한다. Further included in the present invention are methods for identifying potential agonists or antagonists for HDM2: (a) to determine the three-dimensional structure of HDM2 co-crystallized with small molecule inhibitors for designing or selecting such potential agonists or antagonists. Including use.

본 발명은 저해제가 HDM2에 부착되는 부위를 위치시키는 방법을 포함하고: (a) HDM2의 결정에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻고; (b) HDM2 및 저해제 착물에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻으며; (c) (a)단계에서 얻은 엑스레이 회절 자료를 (b)단계에서 얻은 엑스레이 회절 자료로부터 차감하여 엑스레이 회절 자료의 차이를 얻고; (d) (a)단계에서 얻은 엑스레이 회절 자료에 대응하는 위상을 얻으며; (e) (d)단계에서 얻은 위상 및 (c)단계에서 얻은 엑스레이 회절 자료 차이를 사용하여 저해제의 푸리에 이미지의 차이를 계산하고; (f) (e)단계에서 얻은 계산에 기반하여 저해제가 HDM2에 부착하는 부위를 위치시키는 것을 포함한다. The present invention includes a method of locating a site where an inhibitor is attached to HDM2: (a) obtaining x-ray diffraction data for the determination of HDM2; (b) obtaining x-ray diffraction data for HDM2 and inhibitor complexes; (c) subtracting the x-ray diffraction data obtained in step (a) from the x-ray diffraction data obtained in step (b) to obtain a difference of the x-ray diffraction data; (d) obtaining a phase corresponding to the x-ray diffraction data obtained in step (a); (e) calculating the difference in the Fourier image of the inhibitor using the difference obtained in step (d) and the x-ray diffraction data obtained in step (c); (f) positioning the site where the inhibitor attaches to HDM2 based on the calculation obtained in step (e).

본 발명은 추가로 변형된 저해제를 얻는 방법을 포함하고: (a) HDM2를 포함하는 결정 및 저해제를 얻고; (b) 결정의 원자 좌표를 얻으며; (c) 원자 좌표 및 하나 이상의 분자 모델링 기술을 사용하여 저해제와 HDM2의 상호작용을 변형하는 방법을 결정하고; (d) (c)단계에서 얻은 결정에 기반하여 저해제를 변형시켜 변형된 저해제를 생성하는 것을 포함한다. The invention further includes a method of obtaining a modified inhibitor, comprising: (a) obtaining a crystal and inhibitor comprising HDM2; (b) obtaining atomic coordinates of the crystal; (c) determining how to modify the interaction of the HDM2 with the inhibitor using atomic coordinates and one or more molecular modeling techniques; (d) modifying the inhibitor based on the crystals obtained in step (c) to produce a modified inhibitor.

본 발명의 다른 측면에서, 본원은 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷의 구조 좌표에 의해 한정된 결합 주머니 또는 활성 부위를 포함하는 고립된 단백질 단편을 포함한다. In another aspect of the invention, the disclosure includes an isolated protein fragment comprising a binding pocket or active site defined by the structural coordinates of HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ .

본 발명의 다른 측면에서, 본원은 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷의 구조 좌표에 의해 한정된 결합 주머니 또는 활성 부위를 포함하는 단편을 코딩한 고립된 핵산 분자를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 HDM2와 결합하는 약제에 대한 스크리닝(screening) 방법을 포함하고: (a) 단백질 분자 단편 을 약제에 노출시키고; (b) 단편에 대한 약제의 결합의 레벨을 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 단백질 분자 단편을 포함하는 키트를 포함한다. In another aspect of the invention, the present disclosure includes an isolated nucleic acid molecule encoding a fragment comprising a binding pocket or active site defined by the structural coordinates of the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ . In another aspect of the invention, the present disclosure includes a screening method for a medicament that binds HDM2: (a) exposing a protein molecule fragment to a medicament; (b) detecting the level of binding of the agent to the fragment. In another aspect of the invention, the present disclosure includes a kit comprising a protein molecule fragment.

본 발명은 부가적으로 HDM2 폴리펩티드-리간드를 포함한 결정 착물의 생성에 대한 방법을 포함하고: (a) PEG 및 NaSCN을 포함한 적절한 용매에서 상기 리간드와 HDM2 폴리펩티드의 접촉; (b) 상기 용액으로부터 수득된 HDM2 폴리펩티드-리간드의 착물을 결정화하는 것을 포함한다. The invention additionally encompasses methods for the production of crystal complexes comprising HDM2 polypeptide-ligands: (a) contacting said ligand with HDM2 polypeptide in a suitable solvent, including PEG and NaSCN; (b) crystallizing the complex of HDM2 polypeptide-ligand obtained from said solution.

본 발명은 추가로, HDM2 및 리간드는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함한 펩티드의 결정화를 포함한 작은 분자 저해제인 리간드를 포함한 결정을 잠재력있는 저해제로 생성하는 방법을 포함한다. The present invention further provides a small molecule inhibitor comprising HDM2 and a ligand comprising crystallization of a peptide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Methods of producing crystals containing phosphorus ligands as potential inhibitors.

본 발명은 HDM2의 잠재력있는 저해제를 확인하는 방법을 포함하고: a) 표 1 또는 표 2에 따른 원자 좌표에 의해 한정된 HDM2의 3차원 구조를 사용하며; b) 상기 3차원 구조중 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷로부터 선택된 하나 이상의 HDM2 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여 변형된 HDM2를 생성하고; c) 상기 잠재력있는 저해제를 설계하거나 선택하기 위해 상기 3차원 구조를 사용하며; d) 상기 잠재력있는 저해제를 합성하고; 및 e) 기질의 존재중 상기 잠재력있는 저해제를 상기 변형된 HDM2와 접촉하여 상기 잠재력있는 저해제의 HDM2 또는 상기 변형된 HDM2의 저해 능력을 시험하는 것을 포함한다. 또한 본 발명에 포함된 것은 방법에 의해 확인된 저해제이다. The present invention includes a method of identifying potential inhibitors of HDM2: a) using the three-dimensional structure of HDM2 defined by atomic coordinates according to Table 1 or Table 2; b) replacing one or more HDM2 amino acids selected from Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ^{97 in} the three-dimensional structure with other amino acids to produce a modified HDM2; c) using the three-dimensional structure to design or select the potential inhibitors; d) synthesizing said potential inhibitors; And e) contacting said potent inhibitor in the presence of a substrate with said modified HDM2 to test the potent inhibitor's HDM2 or inhibitory ability of said modified HDM2. Also included in the present invention are inhibitors identified by the method.

도 1: 화합물 338437에 결합된 HDM2의 리본 표현.1: Ribbon representation of HDM2 bound to compound 338437.

도 2: 분자 표면으로 표현된 HDM2의 활성 부위로의 화합물 338437의 적합성(fit).Figure 2: Fit of compound 338437 to the active site of HDM2 represented by molecular surface.

도 3: 삼각형 결정 형태 및 사각형 형태의 결정 형태 사이에서의 중복의 리본 표현. C-알파 원자 위치간의 RMS 편차는 0.25Å이다. 3: Ribbon representation of the overlap between the triangular and square crystalline forms. The RMS deviation between C-alpha atomic positions is 0.25 ms.

정의Justice

생명공학 및 화학에서 일반적인 경우이듯이, 본 발명의 기술은 해당 분야의 다수의 용어를 사용하는 것이 요구되었다. 이렇게 철저히 하는 것이 실용적이지는 않지만, 이러한 용어의 일부에 대한 정의는 참고의 용이함을 위해 제공하였다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속한 분야의 숙련된 기술자가 일반적으로 이해하는 동일한 의미를 갖는다. 기타 용어에 대한 정의 또한 본원과 다른 경우에서 나타냈다. 그러나, 본원 및 본원과 다른 경우에 제공된 정의는 항상 정의된 용어의 의도된 범위 및 의미를 결정하는데 고려되어야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 상당하는 임의의 방법 및 물질도 본 발명의 실제에서는 사용될 수 있음에도, 바람직한 방법 및 물질을 기술하였다. As is common in biotechnology and chemistry, the technology of the present invention has been required to use a number of terms in the art. Although not exhaustive, this definition of some of these terms is provided for ease of reference. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Definitions for other terms are also shown in other cases than the present application. However, the definitions provided herein and elsewhere herein should always be considered in determining the intended scope and meaning of the defined terms. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the practice of the present invention, the preferred methods and materials have been described.

여기에서 사용된 용어 "원자 좌표" 또는 "구조 좌표"는 각 원자에 대한 X, Y, Z 및 B를 포함한 단백질 자료 은행(PDB)중 결정의 원자의 위치를 기술하는 수학적인 좌표를 의미한다. 결정으로부터 얻은 회절 자료는 결정의 반복 단위의 전자 밀도 지도를 계산하는데 사용된다. 전자 밀도 지도는 결정내 각 원자의 위치(즉, 좌표 X, Y 및 Z)를 확립하는데 사용될 수 있다. As used herein, the term “atomic coordinates” or “structural coordinates” refers to mathematical coordinates describing the position of atoms of a crystal in the Protein Data Bank (PDB), including X, Y, Z, and B for each atom. Diffraction data obtained from the crystals are used to calculate the electron density map of the repeat units of the crystals. The electron density map can be used to establish the position of each atom in the crystal (ie, coordinates X, Y and Z).

해당 분야의 숙련된 기술자는 엑스레이 결정학에 의해 결정된 구조 좌표의 셋트는 표준 에러가 없이는 존재하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치상에 중첩될 때, 비-수소 원자의 제곱 평균 편차가 1.5Å이하인 임의의 원으로부터의 HDM2용 구조 좌표의 임의의 셋트는 충분히 일치하거나 유사한 것으로 간주된다. 보다 바람직한 구체예에서, 비-수소 원자의 제곱 평균 편차가 0.75Å이하인 임의의 원으로부터의 HDM2용 구조 좌표의 임의의 셋트는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치상에 중첩될 때, 충분히 일치하거나 유사한 것으로 간주된다.One skilled in the art does not have a set of structural coordinates determined by X-ray crystallography without standard errors. For the purposes of the present invention, when superimposed on non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2, the structural coordinates for HDM2 from any circle whose square mean deviation of the non-hydrogen atoms is 1.5 μs or less Any set of is considered to be sufficiently consistent or similar. In a more preferred embodiment, any set of structural coordinates for HDM2 from any circle whose square mean deviation of the non-hydrogen atoms is 0.75 mm 3 or less is placed on the non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2. When overlapped, they are considered sufficiently identical or similar.

용어 "원자 유형"은 좌표가 측정된 화학 원소를 의미한다. 표 1의 컬럼의 첫번째 글자가 원소를 나타낸다. The term "atomic type" means a chemical element whose coordinate is measured. The first letter of the column in Table 1 represents the element.

용어 "X," "Y" 및 "Z"는 선택된 결정학적 기원에 관하여 측정된 결정학적으로 정의된 원소의 원자 위치를 의미한다. The terms "X," "Y" and "Z" refer to the atomic positions of crystallographically defined elements measured with respect to the selected crystallographic origin.

용어 "B"는 원자 위치의 평균 변화를 이의 평균 위치에 관하여 측정한 열적 요인을 의미한다. The term "B" means a thermal factor in which the average change in atomic position is measured with respect to its average position.

여기에서 사용된 용어 "결정"은 엑스레이를 회절시키는 분자의 임의의 3차원 정렬된 배열을 의미한다. As used herein, the term “crystal” means any three-dimensional aligned arrangement of molecules that diffract x-rays.

여기에서 사용된 조성물중의 용어 "담체"는 제품에 혼합되는 희석제, 항원보강제, 부형제, 또는 운반체를 의미한다. The term "carrier" in a composition as used herein means a diluent, adjuvant, excipient, or carrier mixed with the product.

여기에서 사용된 용어 "조성물"은 전체를 형성하기 위한 구분된 원소 또는 성분을 의미한다. 조성물은 하나 이상의 원소 또는 성분을 포함한다. 본 발명의 목적을 위하여, 조성물은 항상은 아니지만 자주 담체를 포함한다. The term "composition," as used herein, means a discrete element or component to form the whole. The composition comprises one or more elements or components. For the purposes of the present invention, the composition often but not always comprises a carrier.

여기에서 사용된 "mdm2"는 쥐 더블미닛 2 유전자(murine double minute 2 gene)을 의미하는데 쓰이며, 다른 동물에서 발견된 유사 유전자이다. As used herein, "mdm2" is used to mean the murine double minute 2 gene, a similar gene found in other animals.

여기에서 사용된 "MDM2"는 mdm2 종양유전자의 발현된 결과로 얻어진 단백질을 의미하는데 쓰인다. 이 용어의 의미내에서, MDM2는 mdm2에 의해 코딩된 모든 단백질, 이들의 돌연변이, 보존성 아미노산 치환, 이들의 대안 스플라이스 단백질 및 이들의 인함유 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 부가적으로, 본원에서 사용되었듯이, 용어 "MDM2"는 다른 동물의 MDM2 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. As used herein, "MDM2" is used to mean a protein resulting from the expression of an mdm2 oncogene. Within the meaning of this term, MDM2 should be understood to include all proteins encoded by mdm2, their mutations, conservative amino acid substitutions, their alternative splice proteins and their phosphorus containing proteins. In addition, as used herein, the term “MDM2” should be understood to include MDM2 analogs of other animals.

여기에서 사용된 "hdm2"는 쥐 mdm2 유전자와 유사한 인간 유전자를 의미하도록 사용되었다. As used herein, "hdm2" was used to mean a human gene similar to the murine mdm2 gene.

여기에서 사용된 "HDM2"는 hdm2 종양유전자의 발현의 결과로 얻어진 단백질을 의미하도록 사용되었다. 이 용어의 의미내에서, HDM2는 hdm2, 이들의 돌연변이, 보존성 아미노산 치환, 이들의 대안 스플라이스 단백질, 및 이들의 인함유 단백질에 의해 코팅된 모든 단백질을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예로써, HDM2는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 2와 적어도 70% 아미노산 서열이 일치하고, 또는 바람직하게 SEQ ID NO: 2와 80%, 85%, 90% 및 95% 서열이 일치하며, 보다 바람직하게 SEQ ID NO: 2와 적어도 95% 이상의 서열이 일치하는 변이체를 포함하는 단백질을 포함한다. As used herein, "HDM2" was used to mean a protein obtained as a result of expression of the hdm2 oncogene. Within the meaning of this term, it should be understood that HDM2 includes all proteins coated by hdm2, their mutations, conservative amino acid substitutions, their alternative splice proteins, and their phosphorus containing proteins. By way of example, HDM2 matches at least 70% amino acid sequence with SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 2, or preferably with 80%, 85%, 90% and 95% sequence with SEQ ID NO: 2 and And more preferably a protein comprising a variant in which at least 95% or more of the sequences match SEQ ID NO: 2.

여기에서 사용된, 용어 "SAR"는, 구조-활성 관계(Structure-Activity Relationship)의 축약이고, 화합물의 활성/특성 및 이의 화학적 구조간의 관계에 관련한 구조-활성/구조 특성 관계를 집합적으로 의미한다. As used herein, the term “SAR” is an abbreviation of Structure-Activity Relationship and collectively means a structure-activity / structural property relationship relating to the relationship between the activity / characteristic of a compound and its chemical structure. do.

여기에서 사용된, 용어 "분자 구조"는 특별한 화합물의 분자 또는 분자의 착물(예를 들어, HDM2 및 HDM2와 상호작용하는 리간드의 3차원 구조)의 3차원 배열을 의미한다. As used herein, the term “molecular structure” means a three-dimensional arrangement of molecules of a particular compound or complexes of molecules (eg, three-dimensional structures of HDM2 and ligands that interact with HDM2).

여기에서 사용된, 용어 "분자 모델링"은, 분자가 어떻게 보이는지를 실제적인 모델을 그리기 위해서 및 리간드의 구조 활성 관계를 예측하기 위해서 바람직하게는 컴퓨터 보조 방법인 계산 방법의 사용을 의미한다. 분자 모델링에서 사용되는 방법은 분자 그래픽에서 계산 화학까지 연해있다. As used herein, the term "molecular modeling" refers to the use of computational methods, which are preferably computer-aided methods, for drawing a realistic model of how a molecule looks and for predicting the structure activity relationships of ligands. The methods used in molecular modeling extend from molecular graphics to computational chemistry.

여기에서 사용된, 용어 "분자 모델"은 공유 결합으로 연결된 분자의 원자의 3차원 배열 또는 하나 이상의 분자를 포함한 착물 원자의 3차원 배열을 의미한다(예를 들어, 단백질-리간드 착물). As used herein, the term “molecular model” means a three-dimensional array of atoms of a molecule of covalently linked molecules or a three-dimensional array of complex atoms comprising one or more molecules (eg, protein-ligand complexes).

여기에서 사용된, 용어 "분자 그래픽"은 예를 들어, 컴퓨터 보조의 계산법을 사용하여 얻은 3D 표현과 같은 분자의 3D 표현을 의미한다. As used herein, the term “molecular graphic” means a 3D representation of a molecule, such as, for example, a 3D representation obtained using computer aided calculations.

여기에서 사용된, 용어 "계산 화학"은 분자의 물리 및 화학적 특성의 계산을 의미한다. As used herein, the term “computational chemistry” refers to the calculation of the physical and chemical properties of a molecule.

여기에서 사용된, 용어 "분자 치환"은 본 발명에 기술된 상기 원자 좌표를 방위를 확정하거나 위치를 결정함으로써 알려지지 않은 결정의 관찰된 회절 패턴에 대한 최선의 설명이 가능하도록 좌표가 알려지지 않은 HDM2의 결정의 예비적 모델을 생성하는 것을 포함하는 방법을 의미한다. 위상은 이 모델로부터 계산될 수 있고, 관찰된 진폭과 결합하여 좌표가 알려지지 않은 구조의 대략적인 푸리에 합성을 나타낼 수 있다(Rossmann, M.G., ed., "The Molecular Replacement Method", Gordon & Breach, New York, 1972). As used herein, the term “molecular substitution” refers to the definition of HDM2 where the coordinates are unknown so that the best explanation for the observed diffraction pattern of unknown crystals is made by determining or positioning the atomic coordinates described herein. A method comprising generating a preliminary model of the decision. The phase can be calculated from this model and, in combination with the observed amplitude, can represent an approximate Fourier synthesis of a structure whose coordinates are unknown (Rossmann, MG, ed., "The Molecular Replacement Method", Gordon & Breach, New York, 1972).

여기에서 사용된, 용어 "동족체"는 HDM2 단백질 분자, 또는 단백질 또는 적어도 30%, 40% 또는 50% 서열이 일치하고, 또는 적어도 60%, 70% 또는 75% 서열이 일치하며, 또는 적어도 80% 서열이 일치하고, 또는 바람직하게는 90% 서열이 일치하며, 및 가장 바람직하게는 95%, 97% 또는 99% 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 일치하는 제일 원으로부터의 상기 단백질로부터의 기능 영역과, 제이 원으로부터 핵산 분자 또는 이들의 임의의 기능 영역을 코딩한 단백질과 코딩한 핵산 분자를 의미한다. 제이 원은 일차 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 바꾸기 위한 임의의 가능한 방법으로 유전적으로 변경된 제일 원으로부터의 분자의 이형(version)이거나, 제일 원과 동일하거나 다른 종일 수 있다. As used herein, the term “homolog” refers to an HDM2 protein molecule, or protein or at least 30%, 40% or 50% sequence consistent, or at least 60%, 70% or 75% sequence consistent, or at least 80% A functional region from said protein from the first source that matches the sequence, or preferably the 90% sequence matches, and most preferably the 95%, 97% or 99% amino acid or nucleotide sequence matches Refers to a protein encoding a nucleic acid molecule or any functional region thereof and a nucleic acid molecule encoded. The second circle may be a version of the molecule from the first source that is genetically altered in any possible way to alter the primary amino acid or nucleotide sequence, or may be the same or different species as the first circle.

여기에서 사용된, 용어 "활성 부위"는 HDM2상의 영역 또는 HDM2의 기능 또는 활성에 직접 연관된 HDM2의 구조적 모티프를 의미한다. As used herein, the term “active site” refers to a structural motif of HDM2 that is directly related to a region on HDM2 or to the function or activity of HDM2.

여기에서 사용된, 용어 "결합 부위" 또는 "결합 주머니"는 HDM2의 일차 아미노산 서열 및/또는 이의 3차원 모양의 결과로, 리간드 또는 저해제를 포함한 다른 화학적 실체와 결합하는 HDM2의 영역 또는 HDM2를 포함한 분자 착물을 의미한다. As used herein, the term “binding site” or “binding pocket” includes regions of HDM2 or HDM2 that bind to other chemical entities, including ligands or inhibitors, as a result of the primary amino acid sequence of HDM2 and / or its three-dimensional shape. It means a molecular complex.

본 발명의 목적을 위하여, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 임의의 원으로부터의 HDM2의 동족체 또는 HDM2에 대한 구조 좌표의 셋트에 의해 한정된 임의의 활성부위, 결합부위 또는 결합주머니는 표 1 또는 표 2의 상당하는 원자 좌표의 비-수소 원자 위치에 중첩될 때, 상당히 일치하거나 동족인 것으로 간주된다. 보다 바람직한 구체예에서, 약 0.75Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 임의의 원으로부터의 HDM2의 동족체 또는 HDM2에 대한 구조 좌표의 셋트는 표 1 또는 표 2의 상당하는 원자 좌표의 비-수소 원자 위치에 중첩될 때, 상당히 일치하거나 동족인 것으로 간주된다. For the purposes of the present invention, any active site, binding site, or bond defined by the homologue of HDM2 from any circle having a mean square deviation of non-hydrogen atoms less than about 1.5 μs or a set of structural coordinates for HDM2 Pouches are considered to be substantially coincident or homologous when they overlap at non-hydrogen atom positions of the corresponding atomic coordinates of Table 1 or Table 2. In a more preferred embodiment, the set of structural coordinates for HDM2 or the homologue of HDM2 from any circle with a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than about 0.75 mm 3, the ratio of the corresponding atomic coordinates of Table 1 or Table 2 When superimposed at a hydrogen atom position, they are considered to be fairly consistent or homologous.

용어 "제곱 평균 편차(root mean square deviation)"는 평균으로부터의 편차의 제곱의 산술적인 평균의 제곱근을 의미한다. The term "root mean square deviation" means the square root of the arithmetic mean of the square of the deviations from the mean.

여기에서 사용된, 용어 "아미노산"은 자연 발생하는 아미노산의 L-이성질체를 의미한다. 자연 발생하는 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 메티오닌, 트레오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 시스테인, 프롤린, 히스티딘, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, γ-카복실글루탐산, 아르기닌, 오미틴, 및 리신이다. 특별히 언급되지 않는 한, 본원의 모든 아미노산은 L-형태를 의미한다. As used herein, the term "amino acid" means the L-isomer of a naturally occurring amino acid. Naturally occurring amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, γ-carboxyglutamic acid, arginine, Tin, and lysine. Unless specifically stated, all amino acids herein refer to the L-form.

여기에서 사용된, 용어 "비자연 아미노산"은 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 셀레노메티오닌이다. As used herein, the term "unnatural amino acid" means a protein that is not found naturally. For example, selenomethionine.

여기에서 사용된, 용어 "양성 하전된 아미노산"은 일반적인 생리적 조건하에서 양성으로 하전된 곁사슬을 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 양성으로 하전된 자연 발생 아미노산의 예는, 아르기닌, 리신, 및 히스티딘이다. As used herein, the term “positively charged amino acid” includes any amino acid having a side chain that is positively charged under normal physiological conditions. Examples of naturally charged amino acids that are positively charged are arginine, lysine, and histidine.

여기에서 사용된, 용어 "음성 하전된 아미노산"은 일반적인 생리적 조건하에서 양성으로 하전된 곁사슬을 갖는 임의의 아미노산을 포함한다. 음성으로 하전된 자연 발생 아미노산의 예는, 아스파르트산 및 글루탐산이다. As used herein, the term “negatively charged amino acid” includes any amino acid having a side chain that is positively charged under normal physiological conditions. Examples of negatively charged naturally occurring amino acids are aspartic acid and glutamic acid.

여기에서 사용된, 용어 "소수성 아미노산"은 상대적으로 물에 불용해적인 하전되지 않은 비극성 곁사슬을 가진 임의의 아미노산을 포함한다. 자연 발생하는 소수성 아미노산의 예는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌이다. As used herein, the term “hydrophobic amino acid” includes any amino acid having an uncharged nonpolar side chain that is relatively insoluble in water. Examples of naturally occurring hydrophobic amino acids are alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan, and methionine.

여기에서 사용된, 용어 "친수성 아미노산"은 상대적으로 물에 용해적인 하전되지 않은 극성 곁사슬을 갖는 임의의 아미노산을 의미한다. 자연 발생하는 친수성 아미노산은 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 및 시스테인이다.As used herein, the term “hydrophilic amino acid” means any amino acid having an uncharged polar side chain that is relatively soluble in water. Naturally occurring hydrophilic amino acids are serine, threonine, tyrosine, asparagine, glutamine and cysteine.

여기에서 사용된, 용어 "수소결합"은 나머지와 상호작용은 하지만, 오직 하나의 원자에 공유적으로 결합한 수소를 공유한 두개의 친수성 원자(O 또는 N)을 의미한다. As used herein, the term "hydrogen bond" refers to two hydrophilic atoms (O or N) that share hydrogen covalently bound to only one atom, but interact with the rest.

여기에서 사용된, 용어 "소수성 상호작용"은 두개의 소수성 잔기 또는 원자(예를 들어 C)에 의해 만들어지는 상호작용을 의미한다. As used herein, the term “hydrophobic interaction” means an interaction made by two hydrophobic residues or atoms (eg C).

여기에서 사용된, 용어 "공액(conjugated) 시스템"은 전체 시스템에 전자가 완전히 비편재화된, 둘 이상의 이중 결합이 서로 인접한 것을 의미한다. 이는 또한 방향족 잔기를 포함한다. As used herein, the term “conjugated system” means that two or more double bonds are adjacent to each other, with electrons fully delocalized throughout the system. It also includes aromatic moieties.

여기에서 사용된, 용어 "방향족 잔기"는 비편재화된 공액 시스템을 갖는 곁사슬을 가진 아미노산을 의미한다. 방향족 잔기의 예는 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신이다. As used herein, the term "aromatic moiety" refers to an amino acid having a side chain with an unlocalized conjugated system. Examples of aromatic moieties are phenylalanine, tryptophan, and tyrosine.

여기에서 사용된, 문구 "결합 저해"는 하나 이상의 분자, 펩티드, 단백질, 효소, 및 수용체의 직접 또는 간접 결합을 막거나 감소시키는 것 또는 하나 이상의 분자, 펩티드, 단백질, 효소, 및 수용체의 일반적인 활성을 막거나 감소시키는 것을 의미하며, 예를 들면, HDM2 및 p53의 직접 또는 간접적인 결합을 막거나 감소시키는 것이다. As used herein, the phrase “binding inhibition” refers to preventing or reducing the direct or indirect binding of one or more molecules, peptides, proteins, enzymes, and receptors or the general activity of one or more molecules, peptides, proteins, enzymes, and receptors. To prevent or reduce, for example, to prevent or reduce the direct or indirect binding of HDM2 and p53.

여기에서 사용된, 용어 "경쟁 억제제"는 그의 결합 파트너(들)(예: p53)와 같은 부위에 결합하여, 그들과 직접적으로 경쟁하는 저해제를 의미한다. 경쟁 저해제는, 일부 경우에, 기질 농도를 증가시켜 완전히 역전될 수 있다. As used herein, the term “competition inhibitor” means an inhibitor that binds to and competes directly with the same site as its binding partner (s) (eg p53). Competition inhibitors may in some cases be fully reversed by increasing substrate concentration.

여기에서 사용된, 용어 "비경쟁(uncompetitive) 억제제"는 그의 기질(들)(예: p53)에 결합하는 것보다 다른 부위에 결합함으로써 HDM2의 기능 활성을 억제하는 것을 의미한다. As used herein, the term “uncompetitive inhibitor” means inhibiting the functional activity of HDM2 by binding to a site other than to its substrate (s) (eg p53).

여기에서 사용된, 용어 "무경쟁(non-competitive) 억제제"는 HDM2의 유리된 형태 또는 p53 결합 형태로 결합할 수 있는 것을 의미한다. As used herein, the term "non-competitive inhibitor" means that it is able to bind in the free or p53 binding form of HDM2.

해당분야의 숙련된 기술자는 표준 방법을 사용한 컴퓨터 적합 효소 운동성 자료에 의해 경쟁, 비경쟁 또는 무경쟁을 확인할 것이다. 예를 들어, Segel, I.H., Enzyme Kinetics, J. Willey & Sons, (1975)를 참조할 수 있다. Those skilled in the art will identify competition, non-competition or no competition by computer-compatible enzyme kinetic data using standard methods. See, eg, Segel, I. H., Enzyme Kinetics, J. Willey & Sons, (1975).

여기에서 사용된, 용어 "R 또는 S-이성질체"는 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)에 의해 채택된 Cahn-Ingold-Prelog 시스템에 따른 키랄 탄소의 두개의 가능한 입체이성질체를 의미한다. 키랄 탄소에 부착된 각 그룹은 우선, 키랄 탄소에 직접 부착된 원소의 원자 번호에 기반하여 선호 또는 우선의 a, b, c 또는 d를 할당하였다. 가장 높은 원자 번호를 가진 그룹은 가장 높은 선호인 a, 그 다음으로 높은 원자 번호를 가진 그룹은 다음으로 높은 선호 b; 등등이다.가장 낮은 선호 (d)를 가진 그룹은 그 후, 관찰자로부터 먼 쪽으로 위치시킨다. 만약, a에서 b에서 c로의 경로의 자취가 반시계 방향이면, 이성질체는 (S)로 표시되고; 반대 방향, 즉 시계방향이면 이성질체는 (R)로 표시된다. As used herein, the term “R or S-isomer” refers to two possible stereoisomers of chiral carbon according to the Cahn-Ingold-Prelog system adopted by the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC). Each group attached to the chiral carbon first assigned a, b, c or d of preference or preference based on the atomic number of the element directly attached to the chiral carbon. The group with the highest atomic number is the highest a, the group with the next highest atomic number the next highest b; The group with the lowest preference (d) is then placed away from the observer. If the trace of the path from a to b to c is counterclockwise, the isomer is represented by (S); In the opposite direction, ie clockwise, the isomer is represented by (R).

여기에서 사용된, 용어 "리간드"는 HDM2, HDM2의 소단위, HDM2의 영역, HDM2의 표적 구조 모티프 또는 HDM2의 단편과(또는 이들에) 결합하는 임의의 분자 또는 화학적 실체를 의미한다. 따라서, 리간드는, 제한없이, 예를 들면 작은 분자 저해제를 포함한다. As used herein, the term “ligand” refers to any molecule or chemical entity that binds to (or to) HDM2, a subunit of HDM2, a region of HDM2, a target structural motif of HDM2, or a fragment of HDM2. Thus, ligands include, without limitation, small molecule inhibitors, for example.

여기에서 사용된, 용어 "작은 분자 저해제"는 상당한 MDM2 또는 HDM2 저해 활성을 갖는 본 발명에서 유용한 화합물을 의미한다. 작은 유기 분자외에, 펩티드, 항체, 시클릭 펩티드 및 펩티도유사체(peptidomimetics)는 개시된 방법에서 유용할 것으로 예상된다. Kussie et al., Garcia-Echeverria et al.에서 개시된 p53 펩티드 및 mdm2의 p53에의 결합을 저해하는 파지 디스플레이로부터 유발된 펩티드(Bottger, V.A.,et al., Oncogene 13(10):2141-2147(1996))는 본 발명에서 배제되었다. 바람직한 저해제는 작은 분자로, 바람직하게는 700 Daltons이하이고, 보다 바람직하게는 450 Daltons 이하이다. 이러한 특성을 갖는 화합물 분류의 예는 본원에 전체가 포함된 미국 가출원 제 60/275,629; 미국 가출원 제 60/331,235; 미국 가출원 제 60/379,617; 및 미국 출원 10/097,249호에 개시된 화합물을 포함한다. As used herein, the term "small molecule inhibitor" means a compound useful in the present invention having significant MDM2 or HDM2 inhibitory activity. In addition to small organic molecules, peptides, antibodies, cyclic peptides and peptidomimetics are expected to be useful in the disclosed methods. Peptides Derived from Phage Display Inhibiting Binding of pdm Peptides and Mdm2 to p53 as disclosed in Kussie et al., Garcia-Echeverria et al. (Bottger, VA, et al., Oncogene 13 (10): 2141-2147 (1996) )) Is excluded from the present invention. Preferred inhibitors are small molecules, preferably 700 Daltons or less, more preferably 450 Daltons or less. Examples of compound classes having such properties are described in US Provisional Application No. 60 / 275,629, which is incorporated herein in its entirety; US Provisional Application No. 60 / 331,235; US Provisional Application No. 60 / 379,617; And compounds disclosed in US Application 10 / 097,249.

여기에서 사용된 용어 "묶음(bind)," "묶임(binding)," "결합(bond)," 또는 "결합된(bonded)"은 원자, 분자 또는 화학적 그룹의 결합에 관하여 사용될 때, 둘 이상의 원자, 분자 또는 화학적 그룹의 임의의 물리적 접촉 또는 결합을 의미한다. As used herein, the terms "bind," "binding," "bond," or "bonded" are used when referring to a bond of an atom, molecule, or chemical group. By any physical contact or bond of atoms, molecules or chemical groups.

여기에서 사용된 용어 "공유결합" 또는 "원자가 결합"은 전자의 공유에 의해, 보통 쌍으로, 결합된 원자에 의해 생성되는 분자중의 두 원자 사이의 화학적 결합을 의미한다. As used herein, the term "covalent bond" or "atomic bond" refers to a chemical bond between two atoms in a molecule produced by a bonded atom, usually by pairing of electrons, usually in pairs.

여기에서 사용된 "비공유결합"은 원자 및/또는 분자 간의 공유 결합의 형성에 포함되지 않는 이들간의 상호작용을 의미한다. As used herein, "non-covalent bond" means an interaction between them that is not involved in the formation of covalent bonds between atoms and / or molecules.

여기에서 사용된 용어 "자연 단백질"은 이의 자연 원 또는 유기체로부터 분리된 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한 단백질을 의미한다. As used herein, the term "natural protein" refers to a protein comprising an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of a protein isolated from its natural source or organism.

특정 certain 구체예Embodiment

상세한 detailed 구체예Embodiment

본 발명은 HDM2, 또는 단편, 또는 표적 구조적 모티프 또는 이의 유도체, 및 작은 분자 저해제인 리간드를 포함하는 결정을 포함한다. 일 구체예에서, 단편 또는 이의 유도체는 SEQ ID NO: 1(전체 길이 HDM2의 아미노산 서열), SEQ ID NO: 2(SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 17-111), SEQ ID NO. 3(SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 23-114) 및 SEQ ID NO. 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩티드이다. The present invention includes crystals comprising HDM2, or a fragment, or a target structural motif or derivative thereof, and a ligand that is a small molecule inhibitor. In one embodiment, the fragment or derivative thereof comprises SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of full length HDM2), SEQ ID NO: 2 (amino acid residues 17-111 of SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO. 3 (amino acid residues 23-114 of SEQ ID NO: 1) and SEQ ID NO. Peptides selected from the group consisting of 4 (Gly ^16- SEQ ID NO: 2).

다른 구체예에서, 결정은 P3₂21의 삼각형 공간그룹 및 P4₃2₁2의 사각형 공간그룹으로 구성된 그룹으로부터 선택된 공간그룹을 갖는다. 다른 구체예에서, 결정은 적어도 약 3.0Å의 해상도에서 원자 좌표의 결정용 엑스레이를 효과적으로 회절시킨다. 바람직한 구체예에서, 리간드는 결정 형태이다. 매우 바람직한 구체예에서, 리간드는 (4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산; [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산, 및 이의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택된다. In another embodiment, the crystal has a spatial group selected from the group consisting of a triangular spatial group of P3 ₂ 21 and a rectangular spatial group of P4 ₃ 2 ₁ 2. In another embodiment, the crystal effectively diffracts the crystallographic X-ray of atomic coordinates at a resolution of at least about 3.0 GPa. In a preferred embodiment, the ligand is in crystalline form. In a very preferred embodiment, the ligand is (4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro- Benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid; [8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepine- 4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid, and derivatives thereof.

본 발명은 또한 SEQ ID NO. 2와 적어도 95% 서열이 일치하는 펩티드를 포함하는 HDM2를 포함하는 결정을 포함한다. 바람직한 구체예에서, SEQ ID NO: 2를 포함하는 결정은 표 1 또는 표 2의 좌표에 의해 특성화된 원자 구조를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 결정은 약 98.6Å, 98.6Å 및 74.7Å, 및 약 알파=90°, 베타=90° 및 감마=120°의 치수를 갖는 셀(cell); 및, 54.3Å, 54.3Å, 83.3Å 및 약 알파=90°, 베타= 90° 및 감마=90°의 치수를 갖는 셀로 구성된 그룹으로부터 선택된 단위 셀을 포함한다. The invention also relates to SEQ ID NO. A crystal comprising HDM2 comprising a peptide that is at least 95% identical in sequence to 2. In a preferred embodiment, the crystal comprising SEQ ID NO: 2 comprises an atomic structure characterized by the coordinates of Table 1 or Table 2. In another preferred embodiment, the crystals comprise cells having dimensions of about 98.6 Hz, 98.6 Hz and 74.7 Hz, and about alpha = 90 °, beta = 90 ° and gamma = 120 °; And unit cells selected from the group consisting of cells having dimensions of 54.3 ms, 54.3 ms, 83.3 ms and about alpha = 90 °, beta = 90 ° and gamma = 90 °.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 (a) HDM2 또는 단편 또는 표적 구조적 모티프 또는 이의 유도체 및 작은 분자 저해제인 리간드를 포함하는 결정의 3차원 구조에 정보를 함유하고, 컴퓨터로 판독되는 저장 매체에 저장된 데이터베이스; 및 (b) 정보를 보기 위한 사용자 인터페이스를 포함한 컴퓨터 시스템을 포함한다. 일 구체예에서, 정보는 SEQ ID NO:2를 포함하는 결정에서 얻어진 회절 자료를 포함한다. 다른 구체예에서, 정보는 SEQ ID NO:2를 포함하는 결정형의 전자 밀도 지도를 포함한다. 다른 구체예에서, 정보는 표 1 또는 표 2의 구조 좌표 또는 표 1 또는 표 2에 상당하는 원자 좌표의 비-수소 원자 위치에 중첩될 때 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 동족체적인 구조 좌표를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 정보는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩될 때 0.75Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 구조 좌표를 포함한다. 매우 바람직한 구체예에서, 정보는 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 구조 좌표 또는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 상기 아미노산에 대한 유사한 구조 좌표를 포함한다. 다른 구체예에서 정보는 추가로 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Val⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶², Tyr⁶⁷, Gln⁷², His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰, Ile¹⁰³ 또는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 상기 아미노산에 대한 구조 좌표를 포함한다.In another aspect of the invention, the invention contains information in a three-dimensional structure of a crystal comprising (a) a HDM2 or fragment or a target structural motif or derivative thereof and a ligand that is a small molecule inhibitor, the computer-readable storage medium Stored database; And (b) a computer system including a user interface for viewing information. In one embodiment, the information comprises diffraction data obtained from the crystal comprising SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the information comprises an electron density map of the crystalline form comprising SEQ ID NO: 2. In another embodiment, the information has a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 μs when superimposed on the structural coordinates of Table 1 or Table 2 or the non-hydrogen atom positions of the atomic coordinates corresponding to Table 1 or Table 2. Contains homologous structural coordinates. In a preferred embodiment, the information comprises structural coordinates having a mean square deviation of the non-hydrogen atoms of less than 0.75 μs when superimposed at non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2. In a very preferred embodiment, the information is superimposed on the structural coordinates for the amino acids Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ^{97 according} to Table 1 or Table 2 or non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 When included, similar structural coordinates for the amino acid with a mean square deviation of non-hydrogen atoms of less than about 1.5 ms. In another embodiment the information further comprises amino acids Val ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His ⁷³ , Ile according to Table 1 or Table 2. ^{Overlap at 74} , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ , Ile ¹⁰³ or non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 When included, the structural coordinates for the amino acid having a mean square deviation of non-hydrogen atoms of less than about 1.5 ms.

본 발명은 또한 (a) HDM2를 약제에 노출시키고; (b) 상기 약제의 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에의 결합을 검출하여 잠재력을 평가하는 것을 포함하는, HDM2와 잠재력 있는 약제를 평가하는 방법을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 약제는 실질적인 화합물이다. 본 발명의 다른 구체예에서 단계 (a)는 화합물의 원자 구조를 HDM2의 3차원 구조에 비교하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 비교는 화합물 및 HDM2의 적어도 하나의 결합 부위간의 적합성 작동(fitting operation)을 수행하는 계산적 수단을 사용하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 결합 부위는 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷ 에 대한 구조 좌표 및 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 상기 아미노산에 대한 구조 좌표에 의해 한정된다. 기타 다른 구체예에 있어서, 결합 부위는 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Val⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶², Tyr⁶⁷, Gln⁷², His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰, Ile¹⁰³ 에 대한 구조 좌표 및 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 상기 아미노산에 대한 구조 좌표에 의해 한정된다. 매우 바람직한 구체예에서, 약제는 결정성 SEQ ID NO: 2에 노출되었고 단계 (b)의 검출은 약제-SEQ ID NO: 2 착물의 3차원 구조를 결정하는 것을 포함한다. The invention also relates to (a) exposing HDM2 to a medicament; (b) evaluating HDM2 and potential agents, comprising detecting the binding of HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ to the potential of the agent. In one embodiment of the invention, the medicament is a substantial compound. In another embodiment of the present invention step (a) comprises comparing the atomic structure of the compound to the three-dimensional structure of HDM2. In another embodiment, the comparison comprises using computational means to perform a fitting operation between the compound and at least one binding site of HDM2. In a preferred embodiment, the binding site overlaps the structural coordinates for the amino acids Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ^{97 according} to Table 1 or Table 2 and the non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 When defined, it is defined by the structural coordinates for the amino acid having a mean mean deviation of squares of non-hydrogen atoms of less than about 1.5 ms. In other embodiments, the binding sites are amino acids Val ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His ⁷³ according to Table 1 or Table 2. , Structural coordinates for Ile ⁷⁴ , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ , Ile ¹⁰³ and the ratios corresponding to atomic coordinates in Table 1 or Table 2 When superimposed on a hydrogen atom position, it is defined by the structural coordinates for the amino acid having a mean square deviation of the non-hydrogen atom of less than about 1.5 ms. In a very preferred embodiment, the agent has been exposed to crystalline SEQ ID NO: 2 and the detection of step (b) comprises determining the three-dimensional structure of the drug-SEQ ID NO: 2 complex.

본 발명은 추가로, (a) aa¹⁶-SEQ ID NO: 2를 약제에 노출시키고; (b) 약제의 aa¹⁶-SEQ ID NO: 2에의 결합의 레벨을 검출하여 잠재력을 평가하는 것을 포함하는, 가능성 있는 약제와 aa¹⁶-SEQ ID NO: 2를 갖는 펩티드와의 결합을 평가하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서 약제는 실질적인 화합물이다. The invention further comprises (a) exposing aa ¹⁶ -SEQ ID NO: 2 to a medicament; method for evaluating the binding of the peptide having 2 to, potential drugs and aa ¹⁶ -SEQ ID NO, which comprises detecting the level of the second coupling to the evaluating potential: (b) ¹⁶ -SEQ ID NO aa of a medicament It includes. In one embodiment the medicament is a substantial compound.

본 발명은 HDM2에 대한 잠재력있는 작용제 또는 길항체를 확인하는 방법 (a) HDM2의 3차원 구조를 작은 분자 저해제와 같이 동시결정화하여 상기 작용제 또는 길항제를 설계하거나 선택하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 3차원 구조는 표 1의 좌표 또는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표에 상당하는 비-수소 원자 위치에 중첩시켰을 때, 약 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 갖는 유사한 구조 좌표에 의해 특성화되는 원자 구조에 상당한다. 다른 구체예에서, 방법은 (b) 잠재력 있는 작용제 또는 길항제의 합성; 및 (c) HDM2와 잠재력있는 작용제 또는 길항제의 접촉을 추가로 포함한다. The present invention includes methods for identifying potential agonists or antagonists for HDM2 (a) designing or selecting such agents or antagonists by co-crystallizing the three-dimensional structure of HDM2 like small molecule inhibitors. In one embodiment, the three-dimensional structure has a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than about 1.5 μs when superimposed on the coordinates of Table 1 or non-hydrogen atom positions corresponding to the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 Corresponds to the atomic structure characterized by similar structural coordinates. In another embodiment, the method comprises (b) the synthesis of a potential agent or antagonist; And (c) contacting HDM2 with a potential agent or antagonist.

본 발명은 (a) HDM2의 결정에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻음; (b) HDM2 및 저해제의 착물에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻고; (c) 단계 (a)에서 얻은 엑스레이 회절 자료를 단계 (b)에서 얻은 엑스레이 회절 자료로부터 차감하고; (d) 단계 (a)에서 얻은 엑스레이 회절 자료에 상당하는 위상을 얻으며; (e) 단계 (d)에서 얻은 위상 및 단계 (c)에서 얻은 엑스레이 회절 자료의 차를 이용하여 저해제의 푸리에 이미지의 차이를 계산하고; (f) (e)단계에서 얻은 계산에 기반하여 저해제가 HDM2에 부착하는 부위를 위치시키는 것을 포함하는, 저해제의 HDM2에 대한 결합 부위를 위치시키는 방법을 포함한다. The present invention (a) to obtain X-ray diffraction data for the crystal of HDM2; (b) obtaining x-ray diffraction data for the complexes of HDM2 and the inhibitor; (c) subtract the x-ray diffraction data obtained in step (a) from the x-ray diffraction data obtained in step (b); (d) obtain a phase corresponding to the x-ray diffraction data obtained in step (a); (e) calculating the difference in the Fourier image of the inhibitor using the difference between the phase obtained in step (d) and the x-ray diffraction data obtained in step (c); (f) positioning the binding site of the inhibitor to HDM2, comprising positioning the site where the inhibitor attaches to HDM2 based on the calculation obtained in step (e).

본 발명은 추가로, (a) HDM2 및 저해제를 포함하는 결정을 얻고; (b) 결정의 원자 좌표를 얻으며; (c) 원자 좌표 및 하나 이상의 분자 모델링 기술을 사용하여 저해제와 HDM2의 상호작용을 변형하는 방법을 결정하고; 및 (d) (c)단계에서 얻은 결정에 기반하여 저해제를 변형시켜 변형된 저해제를 생성하는 것을 포함하는, 변형된 저해제를 얻는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 결정은 SEQ ID NO: 2를 가진 펩티드; SEQ ID NO: 3를 가진 펩티드 및 SEQ ID NO: 4를 가진 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택된 펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 분자 모델링 기술은 그래픽 분자 모델링 및 계산화학으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 단계 (a)는 저해제의 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 상호작용을 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명은 이 방법에 의해 확인된 HDM2 저해제를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 결합 주머니 또는 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷의 구조 좌표에 의해 한정된 활성 부위를 포함하는 분리된 단백질 단편을 포함한다. 일 구체예에서, 분리된 단편은 고체 지지대에 연결되었다. The present invention further provides (a) obtaining a crystal comprising HDM2 and an inhibitor; (b) obtaining atomic coordinates of the crystal; (c) determining how to modify the interaction of the HDM2 with the inhibitor using atomic coordinates and one or more molecular modeling techniques; And (d) modifying the inhibitor based on the crystals obtained in step (c) to produce a modified inhibitor. In one embodiment, the crystal comprises a peptide having SEQ ID NO: 2; A peptide selected from the group consisting of a peptide having SEQ ID NO: 3 and a peptide having SEQ ID NO: 4. In other embodiments, one or more molecular modeling techniques are selected from the group consisting of graphical molecular modeling and computational chemistry. In a preferred embodiment, step (a) comprises detecting the interaction of the inhibitor against the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ . In another embodiment of the invention, the invention comprises an HDM2 inhibitor identified by this method. In another aspect of the invention, an application includes an isolated protein fragment comprising an active site defined by a binding pocket or the structural coordinates of the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ . In one embodiment, the separated fragments are connected to a solid support.

본 발명의 다른 측면에서, 본원은 결합 주머니 또는 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷의 구조 좌표에 의해 한정된 활성 부위를 포함하는 단편을 코딩한 분리된 핵산 분자를 포함한다. 일 구체예에서, 벡터(vector)는 핵산 분자를 포함한다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 벡터를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 단편이 발현하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 단백질 단편을 생성하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 (a) 단백질 분자 단편을 약제에 노출시키고; (b) 약제가 단편에 결합하는 레벨을 검출하는 것을 포함하고, HDM2와 결합하는 약제에 대하여 스크리닝 하는 방법을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 본원은 단백질 분자 단편을 포함하는 키트를 포함한다. In another aspect of the invention, an application includes an isolated nucleic acid molecule encoding a fragment comprising an active site defined by a binding pocket or structural coordinates of the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ . In one embodiment, the vector comprises a nucleic acid molecule. In other embodiments, the host cell comprises a vector. In another aspect of the invention, the invention includes a method of producing a protein fragment comprising culturing a host cell under conditions in which the fragment is expressed. In another aspect of the invention, the present application provides a kit comprising (a) exposing a protein molecule fragment to a medicament; (b) detecting the level of binding of the agent to the fragment, and the method for screening for the agent binding to HDM2. In another aspect of the invention, the present disclosure includes a kit comprising a protein molecule fragment.

본 발명의 다른 측면에서, 본원은 (a) 상기 리간드와 HDM2 폴리펩티드를 PEG 및 NaSCN을 포함하는 적절한 용매중에서 접촉시키고; (b) 상기 용액으로부터 얻어진 HDM2 폴리펩티드-리간드의 수득된 착물을 결정화하는 것을 포함하고, HDM2 폴리펩티드-리간드를 포함한 결정 착물의 생성 방법을 포함한다. 일 구체예에서, HDM2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2를 가진 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, PEG는 100-1000 범위의 평균 분자량을 가지고, 여기에서 상기 PEG는 약 0.5% w/v에서 10% w/v의 범위로, 상기 NaSCN은 약 50mM에서 150mM의 범위로 용액중 존재한다. 바람직한 구체예에서, PEG는 약 400의 평균 분자량을 가지고, 약 2% w/v로 용액중 존재하고, 상기 NaSCN은 약 100mM로 용액중 존재한다. 바람직한 구체예에서, 용액은 추가로 1.8-2.4M(NH₄)₂SO₄ 및 약 100mM 완충제를 포함한다. In another aspect of the present invention, the present application provides a method for the preparation of (a) contacting said ligand with an HDM2 polypeptide in a suitable solvent including PEG and NaSCN; (b) crystallizing the obtained complex of HDM2 polypeptide-ligand obtained from said solution, and comprising a method of producing a crystal complex comprising an HDM2 polypeptide-ligand. In one embodiment, the HDM2 polypeptide is a polypeptide having SEQ ID NO: 2. In another embodiment, PEG has an average molecular weight in the range of 100-1000, wherein the PEG is in the range of about 0.5% w / v to 10% w / v and the NaSCN is in solution in the range of about 50mM to 150mM exist. In a preferred embodiment, PEG has an average molecular weight of about 400 and is present in solution at about 2% w / v and the NaSCN is present in solution at about 100 mM. In a preferred embodiment, the solution further comprises 1.8-2.4M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ and about 100mM buffer.

본 발명은 추가로 잠재력 있는 저해제와 HDM2 및 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한 펩티드를 결정화하는 것을 포함한 작은 분자저해제를 포함한 리간드를 포함한 결정의 생성을 위한 방법을 포함한다. The invention further comprises small molecules comprising crystallizing a peptide comprising a potential inhibitor and a sequence selected from the group consisting of HDM2 and SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 Methods for producing crystals comprising ligands comprising inhibitors.

본 발명은 a) 표 1에 따른 원자 좌표에 의해 한정되는 HDM2의 3차원 구조를 사용하고; b) 다른 아미노산으로 상기 3차원 구조중 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷로부터 선택한 하나 이상의 HDM2 아미노산을 치환하며; c) 상기 잠재력있는 저해제를 설계하거나 선택하기 위해 상기 3차원 구조를 사용하고; d) 잠재력있는 저해제를 합성하며; 및 e) 기질 존재하에서 상기 잠재력있는 저해제가 HDM2 또는 상기 변형된 HDM2를 저해하는 것을 시험하기 위해 상기 잠재력있는 저해제를 상기 변형된 HDM2와 접촉시키는 것을 포함하고, HDM2의 잠재력있는 저해제를 확인하는 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환은 추가로 아미노산 Val⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶² , Tyr⁶⁷, Gln⁷² , His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰ 및 Ile¹⁰³ 로 구성된 그룹으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 2 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 잠재력있는 저해제는 데이터베이스로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 잠재력있는 저해제는 새로 설계된다. 다른 바람직한 구체예에서, 잠재력있는 저해제는 알려진 저해제로부터 설계된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 잠재력있는 저해제를 설계하거나 선택하기 위해 상기 3차원 구조를 사용하는 단계는 a) 변형된 HDM2와 결합할 수 있는 화학적 실체 또는 단편의 확인하고; b) 확인된 화학적 실체 또는 단편을 단일 분자 내로 모아 상기 잠재력있는 저해제의 구조를 제공하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 잠재력있는 저해제는 SEQ ID NO: 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)의 경쟁 억제제이다. 다른 구체예에서, 잠재력있는 저해제는 SEQ ID NO: 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)의 비-경쟁 또는 무경쟁이다. 다른 구체예에서, 저해제는 방법에 의해 확인된다. The invention uses a) a three-dimensional structure of HDM2 defined by atomic coordinates according to Table 1; b) replacing another amino acid with at least one HDM2 amino acid selected from Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ in the three-dimensional structure; c) using the three-dimensional structure to design or select the potential inhibitors; d) synthesize potential inhibitors; And e) contacting the potential inhibitor with the modified HDM2 to test that the potential inhibitor inhibits HDM2 or the modified HDM2 in the presence of a substrate, and wherein the potential inhibitor of HDM2 is identified. Include. In one embodiment, the substitution of the one or more amino acid residues further comprises amino acids Val ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His ⁷³ , Ile ⁷⁴ , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ and Ile ¹⁰³ . In other embodiments, the potent inhibitor is selected from a database. In a preferred embodiment, the potential inhibitor is newly designed. In another preferred embodiment, the potential inhibitor is designed from known inhibitors. In a very preferred embodiment, the step of using the three-dimensional structure to design or select the potential inhibitor comprises the steps of: a) identifying a chemical entity or fragment capable of binding to modified HDM2; b) gathering the identified chemical entities or fragments into a single molecule to provide the structure of said potential inhibitor. In one embodiment, the potent inhibitor is a competition inhibitor of SEQ ID NO: 4 (Gly ¹⁶ -SEQ ID NO: 2). In another embodiment, the potential inhibitor is the non-competition or no competition of SEQ ID NO: 4 (Gly ¹⁶ -SEQ ID NO: 2). In another embodiment, the inhibitor is identified by the method.

A. A. HDM2HDM2 의 3차원 구조 Three-dimensional structure 모델링modelling

표 1, 표 2에서 제공된 원자 좌표 자료 또는 동족제적인 단백질로부터 유발된 좌표 자료는 HDM2의 3차원 모델을 구성하는데 사용될 수 있다. 임의의 가능한 계산 방법이 3차원 모델을 구성하는데 사용될 수 있다. 개시점으로, HDM2또는 HDM2 동족체의 결정형 이형중 분자 또는 원자의 조립에서 얻어진 엑스레이 회절 패턴은 결정학 및 엑스레이 회절 기술 분야의 숙련자에게 공지된 도구를 사용하여 전자 밀도 지도를 구성하는데 사용될 수 있다. 회절 자료 및 공개된 문서중 가능한 문서로부터 및/또는 보충 실험으로부터 추출된 부가적인 위상 정보는 그 후 재구성의 완성에 사용되었다. The atomic coordinate data provided in Table 1, Table 2 or the coordinate data derived from the homologous proteins can be used to construct a three-dimensional model of HDM2. Any possible calculation method can be used to construct a three-dimensional model. As a starting point, X-ray diffraction patterns obtained from the assembly of molecules or atoms in the crystalline heteromorphism of HDM2 or HDM2 homologues can be used to construct electron density maps using tools known to those skilled in the art of crystallography and X-ray diffraction. Additional phase information extracted from diffraction data and possible documents in published documents and / or from supplementary experiments was then used to complete the reconstruction.

전자 밀도의 구성용 엑스레이 회절 자료의 수집, 분석 및 사용의 기본 개념 및 방법은, 예를 들어, Campbell et al., 1984, Biological Spectroscopy, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA; Cantor et al., 1980, Biophysical Chemistry, Part II: Techniques for the study of biological structure and function, W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA; A.T. Brunger, 1993, X-Flor Version 3.1: A system for X-ray crystallography and NMR, Yale Univ. Pr., New Haven, CT; M.M. Woolfson, 1997, An Introduction to X-ray crystallography, Cambridge Univ. Pr., Cambridge, UK; J. Drenth, 1999, Principles of Protein X-ray Crystallography(Springer Advanced Texts in Chemistry), Springer Verlag; Berlin; Tsirelson et al., 1996, Electron Density and Bonding in Crystals: Principles, Theory and X-ray Diffraction Experiments in Solid State Physics and Chemistry, Inst. of Physics Pub.; U.S. Patent No. 5,942,428; U.S. Patent No. 6,037,117; U.S. Patent No. 5,200,910 and U.S. Patent No. 5,365,456("Method for Modeling the Electron Density of a Crystal")를 참고하고, 각 문헌은 본원에서 전체가 본원에 참고문헌으로 포함되었다. Basic concepts and methods of collection, analysis and use of x-ray diffraction data for the construction of electron density are described, for example, in Campbell et al., 1984, Biological Spectroscopy, The Benjamin / Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, CA ; Cantor et al., 1980, Biophysical Chemistry, Part II: Techniques for the study of biological structure and function, W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA; A.T. Brunger, 1993, X-Flor Version 3.1: A system for X-ray crystallography and NMR, Yale Univ. Pr., New Haven, CT; M.M. Woolfson, 1997, An Introduction to X-ray crystallography, Cambridge Univ. Pr., Cambridge, UK; J. Drenth, 1999, Principles of Protein X-ray Crystallography (Springer Advanced Texts in Chemistry), Springer Verlag; Berlin; Tsirelson et al., 1996, Electron Density and Bonding in Crystals: Principles, Theory and X-ray Diffraction Experiments in Solid State Physics and Chemistry, Inst. of Physics Pub .; U.S. Patent No. 5,942,428; U.S. Patent No. 6,037,117; U.S. Patent No. 5,200,910 and U.S. Patent No. 5,365,456 ("Method for Modeling the Electron Density of a Crystal"), each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

분자 모델링의 기본 정보를 위해서는, 예를 들어, M. Schlecht, Molecular Modeling on the PC, 1998, John Wiley & Sons; Gans et al., Fundamental Principals of Molecular Modeling, 1996, Plenum Pub. Corp.; N. C. Cohen(editor), Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, 1996, Academic Press; and W.B. Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling, 1996을 참고한다. 분자 모델링의 상세한 정보를 제공하는 미국 특허는 특허 번호 제 6,093,573; 6,080,576; 6,075,014; 6,075,123; 6,071,700; 5,994,503; 5,612,894; 5,583,973; 5,030,103; 4,906,122; 및 4,812,12호를 포함하고, 각각은 본원에서 전체가 참고문헌으로 포함되었다. For basic information on molecular modeling, see, for example, M. Schlecht, Molecular Modeling on the PC, 1998, John Wiley &Sons; Gans et al., Fundamental Principals of Molecular Modeling, 1996, Plenum Pub. Corp .; N. C. Cohen (editor), Guidebook on Molecular Modeling in Drug Design, 1996, Academic Press; and W.B. See Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling, 1996. US patents providing detailed information on molecular modeling are described in US Pat. No. 6,093,573; 6,080,576; 6,075,014; 6,075,123; 6,071,700; 5,994,503; 5,612,894; 5,583,973; 5,030,103; 4,906,122; And 4,812,12, each of which is incorporated herein by reference in its entirety.

B. 원자 좌표를 사용한 중요한 B. Important using atomic coordinates 리간드의Ligand 확인 및 설계 방법. Confirmation and design method.

표 1, 표 2, 표 3 또는 표 1, 표 2, 표 3과 상당히 일치하거나 동족체적인 좌표인 본 발명의 원자 좌표는, HDM2 리간드, 저해제 또는 길항제 또는 작용제 분자를 확인하거나 설계하는 것뿐만 아니라, HDM2의 3차원 모델을 제조하는 임의의 가능한 방법과 같이 사용될 수 있다. The atomic coordinates of the present invention, which are coordinated or homologous significantly in accordance with Table 1, Table 2, Table 3 or Table 1, Table 2, Table 3, may not only identify or design HDM2 ligands, inhibitors or antagonists or agonist molecules, It can be used with any possible method of making a three-dimensional model of HDM2.

예를 들면, 3차원 모델링은, 표 1 또는 표 2에서와 같이 엑스레이 회절 패턴으로부터 유발된 실험적으로 결정된 좌표를 사용하여 수행될 수 있고, 예를 들면, 이러한 모델링은 제한없이, 좌표를 사용하여 실제 구조의 도식도, 실제 구조의 물리적 모델 구성, 및 연관된 소단위 및 HDM2/리간드 및 HDM2 소단위/리간드 착물의 구조를 결정하는 것을 포함한다. 이러한 분자 모델링은 알려진 엑스레이 회절 분자 모델링 알고리즘 또는 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 HDM2의 3차원 구조에 상당하는 원자 좌표를 생성할 수 있다. For example, three-dimensional modeling can be performed using experimentally determined coordinates derived from an x-ray diffraction pattern as in Table 1 or Table 2, for example, such modeling can be performed using coordinates without limitation. Schematic diagram of the structure, physical model construction of the actual structure, and determining associated subunits and structures of the HDM2 / ligand and HDM2 subunit / ligand complex. Such molecular modeling can generate atomic coordinates corresponding to the three-dimensional structure of HDM2 using known x-ray diffraction molecular modeling algorithms or molecular modeling software.

상기 기술되었듯이, 분자 모델링은 바람직하게는, 컴퓨터 보조 방법인 계산 방법의 사용을 포함하고, 알려진 결정 구조에 대한 서열과 확인할 수 있을 정도로 연관되어 실제적인 분자 모델을 구성한다. 이는 또한 HDM2에 부착되어 HDM2의 구조 및/또는 알려진 리간드 또는 저해제와 HDM2 착물화된 것에서 시작되는 새로운 작은 분자 저해제의 모델링을 포함한다. 리간드의 결합 또는 리간드의 활성에 대한 예측이 가능하게 하는 분자 그래픽(즉, 3D 표현)에서 계산 화학(즉, 물리 및 화학적 특성의 계산)에 걸친 리간드 모델링에서 사용되는 방법은; 새로운 리간드의 설계; 및 화학적 합성을 위해 약과 같은 리간드를 포함한 새로운 분자의 예측은 집합적으로 합리적인 약물 설계를 의미한다. As described above, molecular modeling preferably involves the use of computational methods, which are computer assisted methods, and constitutes a practical molecular model that is identifiably associated with sequences for known crystal structures. It also includes the modeling of novel small molecule inhibitors that attach to HDM2 and begin with HDM2 complexes with the structures and / or known ligands or inhibitors of HDM2. Methods used in ligand modeling across computational chemistry (ie, calculation of physical and chemical properties) in molecular graphics (ie, 3D representations) that allow prediction of ligand binding or activity of ligands; Design of new ligands; And the prediction of new molecules, including ligands such as drugs for chemical synthesis, collectively means rational drug design.

합리적인 약물 설계에 대한 하나의 접근은 활성 부위에 결합할 수 있는 알려진 분자 구조를 찾는 것이다. 분자 모델링을 사용하여, 합리적인 약물 설계 프로그램은 효소의 활성 부위에 맞을 수 있는 약물의 다른 분자구조의 범위를 볼 수 있고, 이들을 3차원 환경에서 옮김으로써 실제적으로 부위에 잘 맞는 구조를 결정할 수 있다. 예를 들면, 미국 출원 제 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617호; 및 10/097,249호를 참고한다. 또한 예를 들어, 표 1, 2 및 3의 자료를 참고한다. One approach to rational drug design is to find known molecular structures that can bind to active sites. Using molecular modeling, rational drug design programs can see a range of different molecular structures of the drug that can fit into the active site of the enzyme, and by moving them in a three-dimensional environment to determine the structure that actually fits well. See, for example, US Application No. 60 / 275,629; 60 / 331,235; 60 / 379,617; And 10 / 097,249. See also the data in Tables 1, 2 and 3, for example.

택일적이지만 연관된 합리적인 약물 설계 접근은 HDM2와의 부가적이고 유리한 상호작용을 만들기 위한 노력에서, 분자 리간드와의 착물의 알려진 구조 및 작은 분자의 모델 변형으로 시작한다. An alternative but relevant rational drug design approach begins with known modifications of complexes with molecular ligands and model modifications of small molecules in an effort to create additional and advantageous interactions with HDM2.

본 발명은 설계 및 선택을 위한 분자 및 컴퓨터 모델링 기술의 사용 및 작은 분자 작용제 또는 길항제 또는 HDM2와 상호작용하는 다른 치료 약제와 같은 리간드의 설계를 포함한다. 이러한 약제는 제한없이, 1,4 벤조디아제핀 및 이들의 유도체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 기재되었듯이, HDM2의 활성 부위 또는 기타 영역의 전체 또는 부분에 결합함으로써 적어도 하나의 HDM2 기능의 경쟁 저해제로 활동하는 리간드의 설계를 포함한다.The present invention includes the use of molecular and computer modeling techniques for design and selection and the design of ligands such as small molecule agents or antagonists or other therapeutic agents that interact with HDM2. Such agents include, without limitation, 1,4 benzodiazepines and derivatives thereof. For example, the present invention encompasses the design of ligands that act as competitive inhibitors of at least one HDM2 function by binding to all or a portion of an active site or other region of HDM2, as described herein.

본 발명은 또한 HDM2의 적어도 하나의 기능의 비경쟁 저해제로 활동하는 화합물의 설계를 포함한다. 이들 저해제는 그의 기질에 이미 결합된 HDM2의 활성부위 또는 기타 영역의 전체 또는 일부에 결합할 수 있고, HDM2 활성부위에 대해 경쟁하는 경쟁 저해제보다 더 잠재력 있고 덜 특이적일 수 있다. The invention also includes the design of compounds that act as noncompetitive inhibitors of at least one function of HDM2. These inhibitors may bind to all or some of the active or other regions of HDM2 already bound to its substrate and may be more potential and less specific than competing inhibitors competing for HDM2 active sites.

유사하게, HDM2의 적어도 하나의 기능에 결합하고 저해하는 무-경쟁 저해제는 다른 화학적 실체에 결합되었거나 결합되지 않았거나, HDM2의 원자 좌표 또는 본 발명의 HDM2를 포함하는 착물을 사용하여 설계될 수 있다. Similarly, a non-competitive inhibitor that binds to and inhibits at least one function of HDM2, may or may not be bound to another chemical entity, or may be designed using atomic coordinates of HDM2 or a complex comprising the HDM2 of the present invention. .

본 발명의 원자 좌표는 또한 다양한 화학적 특성의 종류로 구성된 분자와 HDM2의 결정을 프루브(prove)하여 후보 저해제 및/또는 작동기 및 HDM2 사이의 상호작용에 대한 최적 부위를 결정하는데 필요한 정보를 제공한다. 예를 들면, 결정으로부터 수집된 고해상도 엑스레이 회절 자료는 용매 분자가 부착하는 위치의 결정을 허용한다. 이들 부위에 결합하는 작은 분자는 그 후, 설계 및 합성될 수 있고, 이들의 저해제적 활성을 시험할 수 있다(Travis, J., Science 262:1374(1993)). The atomic coordinates of the present invention also provide the information necessary to probe the determination of HDM2 with molecules consisting of various types of chemical properties to determine the optimal site for interaction between candidate inhibitors and / or actuators and HDM2. For example, high resolution x-ray diffraction data collected from the crystals allows for the determination of where the solvent molecules attach. Small molecules that bind to these sites can then be designed and synthesized and tested for their inhibitory activity (Travis, J., Science 262: 1374 (1993)).

본 발명은 또한 계산적으로 작은 분자 데이터베이스 및 HDM2에 전체적으로 또는 부분적으로 결합하는 화학적 실체, 약제, 리간드 또는 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함한다. 이 스크리닝에서, 결합 부위 또는 위치의 적합성의 질은 모양 상보성에 의해 또는 추정되는 상호작용 에너지에 의해 판단될 수 있다(Meng, E.C. et al., J. Coma. Chem. 13:505-524(1992)). The present invention also encompasses methods for screening chemical entities, agents, ligands or compounds that computationally or wholly or partially bind to HDM2. In this screening, the quality of suitability of binding sites or positions can be judged by shape complementarity or by estimated interaction energy (Meng, EC et al., J. Coma. Chem. 13: 505-524 (1992). )).

본 발명에 따른 결합하여 HDM2의 기능적 활성을 증진하거나 저해하는 화합물의 설계는 일반적으로 두가지 인자의 고려를 포함한다. 첫번째, 화합물은 물리적 및 구조적으로 HDM2와 결합할 수 있어야 한다. HDM2와 화합물의 결합에서 중요한 비-공유 분자 상호작용은 수소결합, 반 덴 발스 및 소수성 상호작용을 포함한다. 둘째, 화합물은 형식이 HDM2와 결합하는 것을 허용한다는 것을 추정할 수 있어야 한다. 화합물의 임의의 부분이 HDM2와의 결합에 직접적으로 참여하지 않더라도, 이들 부분은 여전히 분자의 전체 형식에 영향을 준다. 차례로, 이것은 결합 친화도, 치료 효능, 약물-유사 특성 및 잠재성에 중요한 영향을 갖는다. 이러한 형식적인 요구사항은 전체적인 3차원 구조 및 HDM2의 활성 부위 또는 다른 영역의 전체 또는 일부에 관한 화학적 실체 또는 화합물의 방향, 또는 HDM2와 직접 상호작용하는 수개의 화학적 실체를 포함하는 화합물의 작용기간의 공간을 포함한다. The design of compounds that bind to or enhance the functional activity of HDM2 in accordance with the present invention generally involves the consideration of two factors. First, the compound must be able to bind HDM2 physically and structurally. Non-covalent molecular interactions important in the binding of HDM2 to compounds include hydrogen bonding, van denwald and hydrophobic interactions. Second, the compound must be able to assume that the format allows binding with HDM2. Even if any part of the compound does not directly participate in binding to HDM2, these parts still affect the overall form of the molecule. In turn, it has a significant impact on binding affinity, therapeutic efficacy, drug-like properties and potential. This formal requirement is based on the overall three-dimensional structure and orientation of the chemical entity or compound with respect to all or part of the active site or other region of HDM2, or the duration of the compound's duration of action, including several chemical entities that interact directly with HDM2. Include space.

잠재력있고, 예측되는 저해제적 작용제, 길항제 또는 리간드 또는 다른 화합물의 HDM2에 대한 결합 효과는 이의 실제 합성에 앞서 컴퓨터 모델링 기술의 사용으로 분석되고 시험 될 수 있다. 만약, 주어진 화합물의 이론적인 구조가 이것과 HDM2 사이의 불충분한 상호작용 및 결합을 제시한다면, 화합물의 합성 및 시험은 생략될 수 있다. 그러나, 만약 컴퓨터 모델링이 강한 상호작용을 나타낸다면, 분자는 그 후, HDM2와의 상호작용 능력에 대하여 합성되고 시험 될 수 있다. 이러한 방법으로 효력이 없는 화합물의 합성은 피할 수 있다. 어떤 경우, 비활성 화합물이 모델링에서 예측되어 합성되고, 그 후, 시험되어 HDM2의 특이 영역과 상호작용하는 화합물에 대한 SAR(구조-활성 관계)를 개발할 수 있다. The binding effects of potential and predicted inhibitory agents, antagonists or ligands or other compounds on HDM2 can be analyzed and tested using computer modeling techniques prior to their actual synthesis. If the theoretical structure of a given compound suggests insufficient interaction and binding between it and HDM2, the synthesis and testing of the compound can be omitted. However, if computer modeling shows strong interactions, the molecules can then be synthesized and tested for their ability to interact with HDM2. In this way the synthesis of ineffective compounds can be avoided. In some cases, inactive compounds can be predicted and synthesized in modeling, and then tested to develop SAR (structure-activity relationships) for compounds that interact with specific regions of HDM2.

해당 분야의 숙련자는 화학적 실체 단편, 화합물 또는 약제의 HDM2와, 보다 바람직하게는 각각의 결합주머니 또는 HDM2의 활성 부위와 결합하는 능력에 대하여 스크린하는 몇몇 방법을 사용할 수 있다. 이 방법은 예를 들면, HDM2 또는 리간드와 착물화한 HDM2의 원자 좌표에 기반한 컴퓨터 스크린의 시각적 검사에 의해 시작될 수 있다. 선택된 화학적 실체, 화합물 또는 약제는 그 후, 다양한 방향으로 위치되거나, HDM2의 각각의 결합주머니 내에 도킹된다(dock). 도킹은 Quanta 및 Sybyl과 같은 소프트웨어, 이어서 에너지 최소화 및 표준 분자 기계 포스필드(forcefield), 예를 들어 CHARMM 및 AMBER을 사용하여 달성될 수 있다. One skilled in the art can use several methods of screening for the ability to bind HDM2 of a chemical entity fragment, compound or medicament with more preferably each binding bag or active site of HDM2. This method can be initiated by visual inspection of a computer screen, for example, based on the atomic coordinates of HDM2 or HDM2 complexed with a ligand. The selected chemical entity, compound or medicament is then placed in various directions or docked in each binding bag of HDM2. Docking can be accomplished using software such as Quanta and Sybyl, followed by energy minimization and standard molecular mechanical forcefields such as CHARMM and AMBER.

특화된 컴퓨터 프로그램도 또한 화학적 실체를 선택하는 방법에서 보조할 수 있다. 이들은 제한없이: GRID(Goodford, P.J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules," J. Med. Chem. 28:849-857(1985), available from Oxford University, Oxford, UK); MCSS(Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34(1991), available from Molecular Simulations, Burlington, Mass); AUTODOCK (Goodsell, D.S. and A.J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics 8:195-202(1990), available from Scripps Research Institute, La Jolla, CA); and DOCK (Kuntz, I.D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions," J. Mol. Biol. 161:269-288(1982), available from University of California, San Francisco, CA)을 포함한다. Specialized computer programs can also assist in selecting chemical entities. These are without limitation: GRID (Goodford, PJ, "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules," J. Med. Chem. 28: 849-857 (1985), available from Oxford University, Oxford, UK) ; Ranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics 11: 29-34 (1991), available from Molecular Simulations, Burlington, Mass. ); AUTODOCK (Goodsell, D.S. and A.J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure.Function, and Genetics 8: 195-202 (1990), available from Scripps Research Institute, La Jolla, CA); and DOCK (Kuntz, ID et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions," J. Mol. Biol. 161: 269-288 (1982), available from University of California, San Francisco, CA). .

다양한 작용기 특성을 가진 프루브와 고분자 표면 사이의 가능한 상호작용 부위를 결정하는 프로그램인 GRID와 같은 소프트웨어의 사용은 유사한 저해 단백질 또는 화합물의 구조를 결정하는 표면 부위를 분석도록 사용된다. 분자상의 적절한 저해 그룹(예를 들어, 양자화된 일차 아민)을 프루브로 가진 GRID 계산은, 접근 가능한 적절한 에너지 등고선 레벨에 있는 접근 가능한 위치에서 잠재력 있는 핫스폿(hotspot)을 확인하도록 사용되었다. 프로그램 DOCK는 활성 부위 또는 리간드 결합 부위를 분석하고, 보완적인 입체적 특성을 가진 리간드를 제시하도록 사용될 수 있다. The use of software such as GRID, a program for determining possible interaction sites between probes with various functional properties and polymer surfaces, is used to analyze surface sites that determine the structure of similar inhibitory proteins or compounds. GRID calculations with probes with appropriate inhibitory groups on the molecule (eg, quantized primary amines) were used to identify potential hotspots at accessible locations at the appropriate energy contour levels accessible. Program DOCK can be used to analyze active sites or ligand binding sites and to present ligands with complementary steric properties.

적절한 화학적 실체, 화합물 또는 약제가 한번 선택되면, 이들은 단일 리간드 또는 화합물 또는 저해제 또는 작동기로 조립될 수 있다. 집합체(assembly)는 단편들의 각각의 3차원 이미지에 대한 관계의 시각적 검사로 진행될 수 있다. 이후, Quanta 또는 Sybyl과 같은 소프트웨어를 사용하여 수동 모델을 형성하였다. Once the appropriate chemical entity, compound or agent is selected, they can be assembled into a single ligand or compound or inhibitor or effector. The assembly may proceed to visual inspection of the relationship to each three-dimensional image of the fragments. The manual model was then formed using software such as Quanta or Sybyl.

각각의 화학적 실체, 화합물 또는 약제를 연결하는 것을 돕는 유용한 프로그램은 제한없이, CAVEAT.을 포함한다(Bartlett, P.A. et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules." In Molecular Recognition in Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 82-196 (1989)); 3D Database systems such as MACCS-3D(MDL Information Systems, San Leandro, CA and Martin, Y.C., "3D Database Searching in Drug Design", J Med. Chem. 35: 2145-2154(1992); and HOOK(available from Molecular Simulations, Burlington, Mass.). Useful programs that help link each chemical entity, compound, or agent include, without limitation, CAVEAT. (Bartlett, PA et al., "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules." In Molecular Recognition in Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 82-196 (1989)); 3D Database systems such as MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA and Martin, YC, "3D Database Searching in Drug Design", J Med. Chem. 35: 2145-2154 (1992); and HOOK (available from Molecular Simulations, Burlington, Mass.).

스크리닝을 위해 약물작용발생단 가설을 시험하고 화합물을 선택하기 위해 3차원 데이터베이스를 찾는 몇가지 방법이 가능하다. 이는 프로그램 CAVEAT(Bacon et al., J. Mol. Biol. 225:849-858(1992))을 포함한다. 예를 들어, CAVEAT은 활성 부위에 이미 위치한 화학적 단편이 어떤 갯수라도 연결하는 "스페이서(spacer)"로 활동할 수 있는 고리 화합물의 데이터베이스를 사용한다. 이는 해당 분야의 숙련자가 단단한 결합에 필요하다고 알려지거나 그렇게 생각되는 단편을 연결하는 가능한 수백가지의 방법을 재빨리 생성할 수 있도록 한다. Several methods are available to test the drug-generating hypothesis for screening and to find a three-dimensional database to select compounds. This includes the program CAVEAT (Bacon et al., J. Mol. Biol. 225: 849-858 (1992)). For example, CAVEAT uses a database of cyclic compounds that can act as "spacers" that connect any number of chemical fragments already located at the active site. This allows those skilled in the art to quickly create hundreds of possible ways of linking fragments that are known or thought to be needed for tight coupling.

HDM2의 저해제 작동기, 작용제 또는 길항제를 형성하는 것을 상기 기술되었듯이 한번에 하나의 화학적 실체인 단계적 방법으로 진행하는 대신, 이러한 화합물은 빈 활성 부위 또는 알려진 분자의 일부 부분(들)을 임의로 포함하는 전체 또는 "새로(de novo)"로 설계될 수 있다. 이러한 방법은: LUDI(Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78(1992), available from Biosym Technologies, San Diego, CA); LEGEND(Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron 47:8985(1991), available from Molecular Simulations, Burlington, Mass); and LeapFrog(available from Tripos Associates, St. Louis, Mo.)을 포함한다. Instead of proceeding to form an inhibitor agonist, agonist or antagonist of HDM2 in a stepwise manner, one chemical entity at a time as described above, these compounds are entirely or optionally comprising empty active sites or some part (s) of known molecules. It can be designed "de novo". Such methods include: Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992), available from Biosym Technologies, San Diego, CA; LEGEND (Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron 47: 8985 (1991), available from Molecular Simulations, Burlington, Mass); and Leap Frog (available from Tripos Associates, St. Louis, Mo.).

예를 들어, 프로그램 LUDI는 수소결합 및 소수성 단편 모두를 위치시키는 상호작용 부위의 목록을 결정할 수 있다. LUDI는 그 후, 단편중으로 4개의 다른 상호작용 부위를 접속시키는 연계기(linker)의 목록을 사용한다. 그후, 더 작은 "브릿징(bridging)" 기, 예를 들어, - CH2- 및 -COO-는 이러한 단편을 연결하는데 사용된다. 예를 들어. 효소 DHFR에 대하여, 잘 알려진 저해제 메토트렉세이트중 중요 작용기의 위치를 LUDI에 의해 재생성하였다. 또한 Rotstein and Murcko, J. Med. Chem. 36: 1700-1710(1992)을 참고한다.For example, the program LUDI can determine a list of interaction sites that locate both hydrogen bonds and hydrophobic fragments. LUDI then uses a list of linkers that connect four different interaction sites into the fragment. Smaller "bridging" groups, such as -CH2- and -COO-, are then used to link these fragments. E.g. For enzyme DHFR, the location of important functional groups in the well known inhibitor methotrexate was regenerated by LUDI. See also Rotstein and Murcko, J. Med. Chem. 36: 1700-1710 (1992).

다른 분자 모델링 기술도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어 Cohen, N.C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem. 33:883-894(1990)을 참고한다. 또한 Navia, M.A. and M.A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design," Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210(1992)를 참고한다. Other molecular modeling techniques can also be used in accordance with the present invention. For example, Cohen, N.C. et al., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem. 33: 883-894 (1990). See also Navia, MA and MA Murcko," The Use of Structural Information in Drug Design, See Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992).

상기 방법에 의해 설계되거나 선택된 화합물은, 화합물이 HDM2와 결합하거나 또는 결합하는 친화도가 계산적 평가 및/또는 화합물 합성 후 생물학적 활성을 시험하고 최적화될 수 있다. 저해제 또는 화합물은 전체 결합 에너지에서 유사한 하나 이상의 형식으로 HDM2와 상호작용할 수 있다. 이런 경우, 결합의 분해 에너지는 유리 화합물의 에너지 및 화합물이 HDM2에 결합할 때 관찰되는 형성 평균 에너지 사이의 차이로 취해진다. Compounds designed or selected by the method can be tested and optimized for biological activity after compound evaluation and / or compound synthesis, with the affinity that the compound binds or binds to HDM2. Inhibitors or compounds may interact with HDM2 in one or more formats similar in overall binding energy. In this case, the decomposition energy of the bond is taken as the difference between the energy of the free compound and the formation average energy observed when the compound binds to HDM2.

HDM2와 결합 또는 결합하기 위해 설계되거나 선택된 화합물은 이의 경계 상태에서 바람직하게 HDM2와의 반발 정전기 상호작용이 부족하게 되도록 추가로 계산적으로 최적화된다. 이러한 비-보완적(예를 들어 정전기적) 상호작용은 반발 전하-전하, 쌍극자-쌍극자 및 전하-쌍극자 상호작용을 포함한다. 특별히, 저해제 및 HDM2간의 모든 정전기 상호작용의 합은 저해제가 결합되었을 때, 바람직하게 결합 엔탈피에 대한 중성적 또는 호의적인 기여를 한다. 약한 결합 화합물은 또한 SAR를 결정하기 위해 이들 방법으로 설계되었다. 예를 들어, 미국 출원 제 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617; 및 10/097,249을 참고한다.Compounds designed or selected to bind or bind to HDM2 are further computationally optimized to, at their boundary state, preferably lack a rebound electrostatic interaction with HDM2. Such non-complementary (eg electrostatic) interactions include repulsive charge-charge, dipole-dipole and charge-dipole interactions. In particular, the sum of all electrostatic interactions between the inhibitor and HDM2, when the inhibitor is bound, preferably makes a neutral or favorable contribution to the binding enthalpy. Weak binding compounds are also designed in these ways to determine SAR. See, eg, US application 60 / 275,629; 60 / 331,235; 60 / 379,617; And 10 / 097,249.

화합물 분해 에너지 및 정전기 상호작용을 평가할 수 있는 구체적인 컴퓨터 소프트웨어는 해당분야에서 입수할 수 있다. 이러한 방법을 위해 설계된 프로그램의 예는: Gaussian 92, revision C(M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa., COPYRGT 1992); AMBER, version 4.0(P.A. Kollman, University of California at San Francisco, COPYRGT 1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. COPYRGT 1994); and Insight II/Discover(Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. COPYRGT 1994)를 포함한다. 기타 하드웨어 시스템 및 소프트웨어 팩키지는 해당 분야의 숙련자들에게 공지될 것이다. Specific computer software for evaluating compound decomposition energy and electrostatic interactions is available in the art. Examples of programs designed for this method are: Gaussian 92, revision C (M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa., COPYRGT 1992); AMBER, version 4.0 (P. A. Kollman, University of California at San Francisco, COPYRGT 1994); QUANTA / CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. COPYRGT 1994); and Insight II / Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. COPYRGT 1994). Other hardware systems and software packages will be known to those skilled in the art.

HDM2와 결합한 화합물이 상기 기술된 바와 같이 최적으로 선택되거나 설계되면, 치환은 그 후 그것의 결합 특성을 증가시키거나 변형하기 위해 그것의 원자 또는 곁그룹중 만들어질 수 있다. 일반적으로 초기 치환은 보존적, 즉, 치환기가 원래의 기와 대략 같은 크기, 모양, 소수성 및 전하를 갖는다. 물론 이것은 해당 분야에서 형태를 바꾸기 위해 공지된 성분을 피하기 위한 것임을 이해하여야 한다. 이러한 치환된 화학적 화합물은 그 후, HDM2에의 적합성의 효능을 상기 상세히 기술된 동일한 컴퓨터 방법으로 분석한다. If the compound bound to HDM2 is optimally selected or designed as described above, substitutions can then be made in its atoms or side groups to increase or modify its binding properties. Generally, initial substitutions are conservative, ie, the substituents have approximately the same size, shape, hydrophobicity and charge as the original group. Of course, it is to be understood that this is to avoid the known ingredients to change form in the art. These substituted chemical compounds are then analyzed by the same computer method described above in detail for the efficacy of conformity to HDM2.

C. C. HDM2HDM2 에 대한 변형된 결합 또는 활성을 가진 With modified binding or activity on 리간드를Ligand 설계하기 위한 동족체적 구조 Homogeneous Structure for Design 모델링의Modeling 사용. use.

본 발명은 표적 효소에 더욱 강하게 결합하거나 더욱 특이적으로 상호작용하는 (4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산; [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산; 및 이들의 유도체와 같은 개시 화합물에 대한 변형을 설계하기 위한 원자 좌표의 사용 및 HDM2 및/또는 저해제와 착물화한 HDM2의 구조를 포함한다. 화합물 1 및 2 및 이들의 유도체를 개시한 미국 출원 제 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617; 및, 10/097,249는 전체가 본원에 포함되었다. The present invention relates to (4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1, which binds more strongly or more specifically to a target enzyme, 2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid; [8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepine- 4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid; And the use of atomic coordinates to design modifications to starting compounds, such as derivatives thereof, and the structure of HDM2 complexed with HDM2 and / or inhibitors. US Application No. 60 / 275,629, which discloses Compounds 1 and 2 and derivatives thereof; 60 / 331,235; 60 / 379,617; And 10 / 097,249 are incorporated herein in their entirety.

화합물 1(338437): (4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산 Compound 1 (338437): (4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [ e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid

화합물 2(876273): [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5- 테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산 Compound 2 (876273): [8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1 , 4] diazepin-4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid

HDM2 및 개시 화합물 착물의 구조는 응용 산업 및 기타 사용(예: 제약학), 예를 들어 화학적 안정, 용해성 또는 막 투과성과 같은 새로운 원하는 특성을 가진 새로운 화합물을 생성할 수 있는 화합물의 변형을 가리키도록 사용될 수 있다(Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3(1997)). The structure of the HDM2 and the starting compound complex is intended to refer to the modification of a compound that can produce new compounds with new desired properties such as application stability and solubility or solubility or membrane permeability, for example in the application industry and other uses (eg pharmaceuticals) Lipinski et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 23: 3 (1997).

해당 분야에 공지된 결합 화합물, 작용제, 길항제 및 이러한 것은 제한 없이, p53 펩티드 및 작은 분자 길항제를 포함한다. 예를 들어, 본원에 전체가 참고문헌으로 포함된 미국 출원 제 60/275,629; 60/331,235; 60/379,617; 및, 10/097,249호를 참고한다. 이러한 화합물은 HDM2의 안정화된 결정내로 확산되거나 또는 젖어들어 엑스레이 회절 자료를 수집하기 위한 착물을 형성할 수 있다. 택일적으로, 해당분야에 공지되었거나 공지가 되지 않은 화합물이거나 HDM2와 침전전 혼합됨으로써 HDM2와 동시결정화될 수 있다. Binding compounds, agents, antagonists and the like known in the art and include, without limitation, p53 peptides and small molecule antagonists. See, for example, US Application No. 60 / 275,629, which is incorporated herein by reference in its entirety; 60 / 331,235; 60 / 379,617; And 10 / 097,249. Such compounds may diffuse or wet into the stabilized crystals of HDM2 to form a complex for collecting X-ray diffraction data. Alternatively, compounds known or unknown in the art can be co-crystallized with HDM2 by mixing prior to precipitation with HDM2.

관습적인 높은 친화도 및 매우 특이적인 화합물을 생성하기 위해, HDM2의 구조는 선택된 비-표적화된 분자 및 비-표적 분자의 동일한 위치에 있는 잔기에 대한 리간드가 결합할 부위에 있는 잔기의 구조를 변경함으로써 구성된 혼성체를 비교할 수 있다. 이 모델링이 달성되는 본 방법은 동족체적 구조 모델링으로 나타내어진다. 이는 분자 또는 알려진 구조의 표적으로부터 곁사슬을 제거하고, 입체적으로 그럴듯한 위치에 놓여진 알려지지 않은 구조의 곁사슬로 대체함으로써 계산적으로 수행된다. 이러한 방법으로, 표적화된 분자 및 비-표적화된 분자의 활성 부위 공동의 모양이 어떻게 다른지를 이해할 수 있다. 이 방법은, 따라서, 결합된 리간드가 원하는 표적에 단단하게 및 특이적으로 결합하지만 자발적으로 비-표적화된 분자에 결합하는 것은 입체적으로 차단되는 화합물을 생성하기 위해 화학적으로 변형될 수 있는지에 대한 정보를 제공한다. 유사하게, 결합된 분자의 용매에 면한 결합된 리간드의 일부에 대한 숙지는 부가적인 제약학적 목적을 위한 기타 작용기의 도입을 허용할 것이다. 비-표적 효소보다 표적 효소에 보다 단단히 결합하는 분자(리간드)의 설계를 위한 동족체적 구조 모델링의 사용은 널리 분포된 응용성을 갖는다. In order to produce customary high affinity and very specific compounds, the structure of HDM2 alters the structure of the residue at the site where the ligand will bind to the residue at the same position of the selected non-targeted molecule and the non-target molecule. By doing this, the hybrids constructed can be compared. The present method by which this modeling is achieved is represented by homogeneous structural modeling. This is done computationally by removing the side chain from the target of the molecule or known structure and replacing it with the side chain of an unknown structure placed in a stereoscopically plausible position. In this way, one can understand how the shapes of the active site cavities of the targeted and non-targeted molecules differ. This method thus provides information on whether the bound ligand binds tightly and specifically to the desired target but which spontaneously binds to a non-targeted molecule can be chemically modified to produce a compound that is stericly blocked. To provide. Similarly, knowledge of some of the bound ligands facing the solvent of the bound molecule will allow the introduction of other functional groups for additional pharmaceutical purposes. The use of homologous structural modeling for the design of molecules (ligands) that bind more tightly to target enzymes than non-target enzymes has widely distributed applications.

D. 높은 처리량 분석.D. High Throughput Analysis.

HDM2와의 상호작용 능력에 대해 확인되거나 설계된 새로운 화합물의 시험을 위해 임의의 높은 처리량 스크리닝이 사용될 수 있다. 높은 처리량 스크리닝에 대한 일반적인 정보를 위해, 예를 들어 Devlin, 1998, High Throughput Screening, Marcel Dekker; 및 미국 특허 제 5,763,263호를 참고한다. 높은 처리량 분석은 하나 이상의 다른 분석 기술을 사용하는데, 제한 없이 하기 기술된 것을 포함한다. Any high throughput screening can be used for testing new compounds identified or designed for their ability to interact with HDM2. For general information on high throughput screening, see, for example, Devlin, 1998, High Throughput Screening, Marcel Dekker; And US Pat. No. 5,763,263. High throughput analysis uses one or more other analysis techniques, including but not limited to those described below.

면역진단 및 면역분석. 생물학적 액체와 같은 착물 혼합물중 보통 낮은 농도에서 특이 생화학 물질의 측정에 사용되는 기술 집단은 그의 보완적인 항원용으로 적절하게 제조되고 선택된 항체에 의해 보여지는 특이성 및 높은 친화성에 의존한다. 측정될 물질은, 필연적으로, 항원-면역원성 고분자 또는 합텐계(haptenic) 작은 분자여야 한다. 각 시료에 알려진, 제한된 양의 항체가 첨가되고 결합:유리 비율로 종종 표시되는 그것과 결합한 항체의 분율은 방사성동위원소로 표시된 항체(방사성면역측정법), 형광 분자(형광면역측정법), 안정한 자유 라디칼(스핀면역측정법), 효소(효소면역분석법) 또는 기타 즉각적으로 구분이 가능한 표지를 지표로 사용하여 추정된다. Immunodiagnosis and Immunoassay. The technical population used for the determination of specific biochemicals, usually at low concentrations in complex mixtures such as biological liquids, depends on the specificity and high affinity shown by the antibodies selected and prepared appropriately for their complement antigen. The substance to be measured must necessarily be an antigen-immunogenic polymer or a haptenic small molecule. A limited amount of antibody known to each sample is added and the fraction of antibody bound to it, often expressed in the binding: free ratio, is indicated by radioisotope antibodies (radioimmunoassay), fluorescent molecules (fluorescence immunoassay), stable free radicals. (Spin-Immunoassay), Enzyme (Enzyme-Immunoassay) or other readily distinguishable label is estimated.

항체는: 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay); 방사성면역측정법(RIA, radioimmuno assay); 형광면역측정법(FIA, fluorescent immunoassay); 화학발광면역측정법(CLIA, chemiluminescent immunoassay); 및 항체를 현탁성금입자(colloidal gold particles)로 표지하는 것(immunogold)을 포함하는 다양한 방법으로 표지될 수 있다. Antibodies include: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); Radioimmuno assay (RIA); Fluorescent immunoassay (FIA); Chemiluminescent immunoassay (CLIA); And labeling the antibody with colloidal gold particles (immunogold).

보통 측정 형식은 샌드위치 측정, 경쟁적(competitive) 또는 경쟁(competition) 측정, 라텍스 응집 측정, 균일 측정, 마이크로티트레 플레이트(microtitre plate) 형식 및 미세입자계 측정을 포함한다. Common measurement formats include sandwich measurements, competitive or competition measurements, latex agglomeration measurements, homogeneous measurements, microtitre plate formats and microparticle field measurements.

효소면역측정법(ELISA). ELISA는 방사성화학물질의 위험 및 형광 검출 시스템의 비용을 피한 면역화학 기술이다. 대신, 측정은 표지로 효소를 사용한다. ELISA는 불용성 담체 표면에 연결된 항체(또는 항원)의 사용에 기반한 정량적인 면역측정법의 형태이고, 이는 그 후, 시험 용액내에서 연관된 항원(또는 항체)를 "잡도록(capture)" 사용된다. 항원-항체 착물은 그 후, 이전에 항원(또는 항체)에 공유적으로 결합된 적절한 효소의 활성을 측정함으로서 검출된다. Enzyme Immunoassay (ELISA). ELISA is an immunochemical technique that avoids the risk of radiochemicals and the cost of fluorescence detection systems. Instead, the measurements use enzymes as labels. ELISA is a form of quantitative immunoassay based on the use of an antibody (or antigen) linked to an insoluble carrier surface, which is then used to "capture" the associated antigen (or antibody) in a test solution. Antigen-antibody complexes are then detected by measuring the activity of the appropriate enzyme previously covalently bound to the antigen (or antibody).

ELISA 기술에 관한 정보를 위해, 예를 들면 Crowther,(1995) ELISA- Theory and Practice(Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe & Kemeny,(1998) ELISA and Other Solid Phase Immunoassays- Theoretical and Practical Aspects, John'Wiley; Kemeny,(1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press; Ishikawa,(1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay(Laboratory Techniques in Biochemistry and Moleucular Biology) Elsevier를 참고한다. For information on ELISA techniques, see, eg, Crowther, (1995) ELISA-Theory and Practice (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe & Kemeny, (1998) ELISA and Other Solid Phase Immunoassays-Theoretical and Practical Aspects, John 'Wiley; Kemeny, (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press; See Ishikawa, (1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Moleucular Biology) Elsevier.

효소용 비색측정. 비색법은 종종 비색계를 사용하여 화합물의 양 또는 농도가 화합물의 시험양 및 표준양 모두와 시약이 반응함으로써 생성된 색의 비교에 의해 결정되는 임의의 정량적 화학측정법이다. 비색계는 색의 강도 또는 색의 강도의 차이를 시각적으로 또는 광전기적으로 측정하는 기기이다. Colorimetric measurement for enzymes. Colorimetric methods are often any quantitative chemistry that uses a colorimeter to determine the amount or concentration of a compound by comparison of the color produced by reacting the reagent with both the test and standard amounts of the compound. Colorimeters are instruments that visually or photoelectrically measure the intensity of a color or the difference in the intensity of a color.

베타-갈락토시다아제 효소 활성의 표준 비색측정은 해당분야의 숙련자에게 공지되었다(예: 참고로, Norton et al., Mol.Cell. Biol. 5:281-290 (1985)). 비색측정법은 ONPG(O-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노시드, Sigma)를 표준 비색 베타-갈락토시다아제 측정에서(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 기질로 사용하여 전체 세포 용해질상에 수행될 수 있다. 자동화된 비색측정법은 또한 미국 특허 제 5,733,720호에 기술되었듯이 베타-갈락토시다아제 활성의 감지를 위해 사용할 수 있다. Standard colorimetric measurements of beta-galactosidase enzyme activity are known to those skilled in the art (e.g., Norton et al., Mol. Cell. Biol. 5: 281-290 (1985)). Colorimetric analysis was performed using ONPG (O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside, Sigma) in standard colorimetric beta-galactosidase assay (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) can be performed on the whole cell lysate. Automated colorimetry can also be used for the detection of beta-galactosidase activity, as described in US Pat. No. 5,733,720.

면역형광측정법. 면역형광 또는 면역형광현미경검사는 여기에서 항원 또는 항체가 형광 염료와 접합하여 형광을 만들어내고 그 후, 조직 단편 또는 바른표본중의 보완적인 항체 또는 항원과 반응하는 것을 허용하는 기술이다. 항원 또는 항체의 위치는 자외선하에서 현미경에 의해 형광을 관찰함으로써 그 후 결정될 수 있다. Immunofluorescence. Immunofluorescence or immunofluorescence microscopy is a technique wherein the antigen or antibody is conjugated with a fluorescent dye to generate fluorescence and then react with complementary antibodies or antigens in tissue fragments or right samples. The location of the antigen or antibody can then be determined by observing the fluorescence under a microscope under ultraviolet light.

면역형광 기술에 관한 일반적인 정보는, 예를 들어 Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy-A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press를 참고한다. 본 발명에 적용가능한 면역형광 기술의 상세한 설명은 미국 특허 제 5,912,176; 5,869,264; 5,866,319; 5,861,259호를 참고한다. General information on immunofluorescent techniques is described, for example, in Knapp et al., (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techniques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy-A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; See Caul, (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press. Details of immunofluorescent techniques applicable to the present invention are described in US Pat. No. 5,912,176; 5,869,264; 5,866,319; See 5,861,259.

E. 데이터베이스 및 컴퓨터 시스템.E. Databases and Computer Systems.

HDM2 또는 이의 일부의 컴퓨터 분자 모델링에 유용한 HDM2의 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 및/또는 엑스레이 회절 자료는 그것의 사용을 용이하게 하기 위해 다양한 매체로부터 "제공"될 수 있다. 여기에서 사용된 "제공"은, 예를 들어, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열 및/또는 본 발명의 엑스레이 회절 자료로부터 유래된 원자 좌표, 예를 들면, HDM2의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열, 이들의 대표적인 단편, 또는 이들의 동족체를 포함하는 제품을 의미한다. 이러한 방법은 숙련된 기술자가 HDM2 또는 연관된 분자(이들의 서브도메인을 포함한)의 3차원 구조를 분석하고 분자 모델 하는 것을 허용하는 형태로 아미노산 서열 및/또는 엑스레이 회절 자료를 제공한다. The amino acid sequence or nucleotide sequence and / or x-ray diffraction material of HDM2 useful for computer molecular modeling of HDM2 or a portion thereof may be “provided” from various media to facilitate its use. As used herein, “providing” refers to, for example, amino acid sequences or nucleotide sequences and / or atomic coordinates derived from the x-ray diffraction data of the invention, eg, amino acid or nucleotide sequences of HDM2, representative fragments thereof, or It means the product containing these homologues. This method provides amino acid sequence and / or x-ray diffraction data in a form that allows a skilled technician to analyze and molecular model the three-dimensional structure of HDM2 or related molecules (including their subdomains).

본 구체예의 하나의 응용은, HDM2에 속하는 자료, 또는 이의 적어도 하나의 서브도메인, 아미노산 및 핵산 서열 및/또는 본 발명의 엑스레이 회절 자료를 포함하는 데이터베이스는 컴퓨터 판독이 가능한 매체상에 기록되었다. 여기에서 사용된 "컴퓨터 판독이 가능한 매체"는 컴퓨터에 의해 읽힐 수 있고 직접적으로 접근이 가능한 임의의 매체를 의미한다. 이러한 매체는, 제한 없이: 자기저장 매체, 예를 들어 플로피디스크, 하드디스크 저장 매체, 및 자기테이프; 광학 저장 매체, 예를 들어 광학디스크 또는 CD-ROM; 전기저장매체, 예를 들어 RAM 및 ROM; 및 이들 범위의 혼성, 예를 들어 자기/광학 저장 매체를 포함한다. 숙련된 기술자는 현재 공지된 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 엑스레이 회절 자료를 기록한 것을 가진 컴퓨터 판독가능한 매체가 어떻게 제품을 창조하는데 사용되는지 즉각 인식할 수 있다. One application of this embodiment is a database comprising material belonging to HDM2, or at least one subdomain, amino acid and nucleic acid sequence thereof, and / or x-ray diffraction data of the present invention, recorded on a computer readable medium. As used herein, “computer readable medium” means any medium that can be read by a computer and directly accessible. Such media include, without limitation: magnetic storage media such as floppy disks, hard disk storage media, and magnetic tape; Optical storage media such as optical disks or CD-ROMs; Electrical storage media such as RAM and ROM; And hybrids in these ranges, for example magnetic / optical storage media. The skilled artisan can readily recognize how computer readable media having recorded amino acid sequences and / or x-ray diffraction data of the presently known invention are used to create the product.

여기에서 사용된, "기록된(recorded)"은 컴퓨터 판독 가능한 매체상에 정보를 저장하는 방법을 의미한다. 숙련된 기술자는 컴퓨터 판독 가능한 매체상에 정보를 기록하는 현재 알려진 방법을 임의로 즉각 채택하여, 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 원자 좌표/엑스레이 회절 자료 정보를 포함하는 제품을 생성할 수 있다. As used herein, "recorded" means a method of storing information on a computer readable medium. The skilled artisan can optionally immediately adopt a currently known method of recording information on a computer readable medium to produce a product comprising the amino acid sequence and / or atomic coordinates / X-ray diffraction data information of the present invention.

다양한 자료 저장 구조는 숙련된 기술자에게 본 발명의 아미노산 서열 및/또는 원자 좌표/엑스레이 회절 자료를 가진 컴퓨터 판독가능한 매체를 만드는 것에 유용하다. 자료 저장 구조의 선택은 일반적으로 저장된 정보에 접근하기 위해 선택된 수단에 기반한다. 추가로, 다양한 자료 처리 프로그램 및 형식이 본 발명의 서열 및 엑스레이 자료 정보를 컴퓨터 판독 가능한 매체상에 저장하는데 사용될 수 있다. 서열 정보는 WordPerfect 및 MICROSOFT Word과 같은 상업적으로 구입할 수 있는 소프트웨어로 포맷되었거나, ASCII 파일의 형태로 존재하거나, 또는 DB2, Sybase, Oracle 또는 유사한 데이터베이스에 저장된 단어 처리 텍스트 파일중 존재할 수 있다. 숙련된 기술자는 본 발명의 정보를 기록한 것을 가진 컴퓨터 판독가능한 매체를 얻기 위해 임의의 개수의 자료처리 구조화 형식(예: 텍스트 파일 또는 데이터베이스)을 개작할 수 있다. Various data storage structures are useful to those skilled in the art to make computer readable media having amino acid sequences and / or atomic coordinates / X-ray diffraction data of the present invention. The choice of data storage structure is generally based on the means chosen to access the stored information. In addition, various data processing programs and formats may be used to store the sequence and x-ray data information of the present invention on a computer readable medium. The sequence information may be formatted with commercially available software such as WordPerfect and MICROSOFT Word, or may exist in the form of an ASCII file, or in a word processing text file stored in DB2, Sybase, Oracle or similar database. The skilled artisan can adapt any number of data processing structured formats (eg, text files or databases) to obtain a computer readable medium having recorded information of the present invention.

서열 및/또는 엑스레이 회절 자료에 기반한 원자 좌표를 가진 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공함으로써, 숙련된 기술자는 연관된 분자, 서브도메인, 유사체 또는 이들의 리간드를 모델링 하기 위해 일상적으로 서열 및 원자 좌표 또는 엑스레이 회절 자료를 평가할 수 있다. 컴퓨터 알고리즘은 공개적으로 및 상업적으로 구입할 수 있고, 이것은 숙련자가 컴퓨터 판독가능한 매체로 제공되는 이러한 자료에 접근하는 것 및 분자 모델링 및/또는 RDD(합리적인 약물 설계, rational drug design)을 위해 분석하는 것을 허용한다. 예를 들면, Biotechnology Software Directory, MaryAnn Liebert Publ., New York(1995)를 참고한다. By providing computer readable media having atomic coordinates based on sequence and / or x-ray diffraction data, the skilled artisan routinely uses sequence and atomic coordinates or x-ray diffraction data to model associated molecules, subdomains, analogs or ligands thereof. Can be evaluated. Computer algorithms are available both publicly and commercially, which allows the skilled person to access these materials provided in computer readable media and to analyze them for molecular modeling and / or rational drug design (RDD). do. See, for example, Biotechnology Software Directory, Mary Ann Liebert Publ., New York (1995).

본 발명은 추가로 시스템, 특히 본원에서 기술된 서열 및/또는 회절 자료를 포함하는 컴퓨터-기반 시스템을 제공한다. 이러한 시스템은 HDM2용 구조 결정 및 RDD 또는 이들의 적어도 하나의 서브도메인을 수행하도록 설계되었다. 비-제한적인 예는 UNIX 기반의 Windows NT 또는 IBM OS2 작동 시스템을 구동하는 Silicon Graphics Incorporated 및 Sun Microsystems으로부터 이용가능한 마이크로컴퓨터 워크스테이션이다. The invention further provides a system, in particular a computer-based system comprising the sequence and / or diffraction data described herein. Such a system is designed to perform structural determination and RDD or at least one subdomain thereof for HDM2. Non-limiting examples are microcomputer workstations available from Silicon Graphics Incorporated and Sun Microsystems running a Windows NT or IBM OS2 operating system based on UNIX.

여기에서 사용된, "컴퓨터-기반 시스템"은 본 발명의 서열 및/또는 엑스레이 회절 자료를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단, 및 자료 저장 수단을 의미한다. 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템의 최소한의 하드웨어 수단은 중앙처리단위(CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 자료 저장 수단을 포함한다. 숙련자는 본 발명에 적합한 현재 가능한 컴퓨터-기반 시스템을 즉각 인식할 수 있다. 모니터와 같은 시각화 기기는 구조 자료를 시각화하기 위해 임의로 제공된다. As used herein, "computer-based system" means hardware means, software means, and data storage means used to analyze the sequence and / or x-ray diffraction material of the present invention. The minimum hardware means of the computer-based system of the present invention includes a central processing unit (CPU), input means, output means and data storage means. The skilled person can immediately recognize currently available computer-based systems suitable for the present invention. Visualization devices, such as monitors, are optionally provided for visualizing structural data.

상기 언급되었듯이, 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템은 그 안에 본 발명의 서열 및/또는 원자 좌표/엑스레이 회절 자료를 저장한 자료 저장 수단 및 필요한 하드웨어 수단 및 분석 수단을 지원하고 도구화한 소프트웨어 수단을 포함한다. 여기에서 사용된, "자료 저장 수단(data storage means)"은 본 발명의 서열 또는 원자 좌표/엑스레이 회절 자료를 저장할 수 있는 메모리 또는 본 발명의 서열 또는 엑스레이 자료를 기록한 제품에 접근할 수 있는 메모리 접근 수단을 의미한다. 여기에서 사용된, "조사 수단(search means)" 또는 "분석 수단(analysis means)"는 자료 저장 수단에 저장된 서열 또는 엑스레이 자료를 표적 서열 또는 표적 구조적 모티프와 비교하기 위해 컴퓨터-기반 시스템에 도구화된 하나 이상의 프로그램을 의미한다. 조사 수단은 특별한 표적 서열 또는 표적 모티프에 맞는 단백질의 단편 또는 영역을 확인하는데 사용된다. 갖가지 공지된 알고리즘이 공개적으로 개시되었고, 조사 수단을 수행하기 위해 상업적으로 가능한 갖가지 소프트웨어가 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템에서 사용되었고, 사용될 수 있다. 숙련자는 컴퓨터 분석을 수행하기 위한 가능한 알고리즘 또는 도구화된 소프트웨어 패키지가 본 컴퓨터-기반 시스템에 사용되도록 개조할 수 있다. As mentioned above, the computer-based system of the present invention includes data storage means storing the sequence and / or atomic coordinates / X-ray diffraction data of the present invention therein and software means supporting and instrumenting necessary hardware and analysis means. do. As used herein, "data storage means" refers to a memory capable of storing the sequence or atomic coordinates / X-ray diffraction data of the present invention or a memory access to access a product having recorded the sequence or x-ray data of the present invention. Means means. As used herein, “search means” or “analysis means” are instrumented in a computer-based system to compare sequence or x-ray data stored in a data storage means with a target sequence or target structural motif. Means one or more programs. Investigation means are used to identify fragments or regions of the protein that fit a particular target sequence or target motif. Various known algorithms have been disclosed publicly, and a variety of commercially available software has been used in the computer-based system of the present invention and may be used to perform the survey means. The skilled person can adapt any algorithm or tooled software package for performing computer analysis to be used in the present computer-based system.

여기에서 사용된, "표적 구조적 모티프," 또는 "표적 모티프,"는 표적 모티프의 폴딩으로 형성된 3차원 배열 또는 전자 밀도 지도에 기반하여 선택된 서열중 임의로 합리적으로 선택된 서열 또는 서열의 조합을 의미한다. 해당분야에는 공지된 갖가지 표적 모티프가 있다. 단백질 표적 모티프는, 제한 없이 효소적 활성 부위, 저해제 결합 부위, 구조적 서브도메인, 항원결정인자, 기능 영역 및 신호 서열을 포함한다. 유사한 모티프는 RNA에 대하여 알려져있다. 입력 및 출력 수단을 위한 갖가지 구조적 형식은 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템에서 정보의 입력 및 출력에 사용될 수 있다. As used herein, “target structural motif,” or “target motif,” means a sequence or combination of sequences that is rationally selected from a sequence selected based on a three-dimensional array or electron density map formed by folding of a target motif. There are a variety of target motifs known in the art. Protein target motifs include, without limitation, enzymatic active sites, inhibitor binding sites, structural subdomains, epitopes, functional regions, and signal sequences. Similar motifs are known for RNA. Various structural forms for input and output means can be used for input and output of information in the computer-based system of the present invention.

갖가지 비교 수단이 원자 좌표/엑스레이 회절 자료로부터 부분적으로 파생된 구조적 모티프 또는 전자 밀도 지도를 확인하기 위해, 표적 서열 또는 표적 모티프와 자료 저장 수단을 비교하는데 사용될 수 있다. 숙련자는 임의의 공개적으로 가능한 컴퓨터 모델링 프로그램의 하나는 본 발명의 컴퓨터-기반 시스템용 조사 수단으로 사용될 수 있다는 것을 즉각 인식할 수 있다. Various comparison means can be used to compare the data storage means with a target sequence or target motif to identify structural motifs or electron density maps partially derived from atomic coordinates / X-ray diffraction data. The skilled person can readily recognize that any one of the publicly available computer modeling programs can be used as a research means for the computer-based system of the present invention.

F. 표적 분자 단편 및 분할.F. Target Molecule Fragments and Cleavage.

HDM2의 단편, 예를 들면, Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷로 구성된 그룹에서 선택된 둘 이상의 아미노산으로 한정된 활성부위를 포함하는 단편은 합성 또는 재조합 수단을 포함한 임의의 가능한 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 단편은 그 후, 상기 기술된 것과 같이 측정시, 예를 들어, 유망한 약제와 단편내의 활성부위간의 상호작용을 검출하는 높은 처리량 측정에 사용될 수 있다. Fragments of HDM2, eg, fragments comprising an active site defined by two or more amino acids selected from the group consisting of Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ can be prepared by any possible method including synthetic or recombinant means. have. Such fragments can then be used for high throughput measurements upon measurement as described above, for example, to detect interactions between promising agents and active sites in the fragments.

본 발명의 단편의 재조합 발현 또는 생산을 위해, 단편을 코딩한 핵산 분자를 제조할 수 있다. 여기에서 사용된, "핵산"은 상기 한정되었듯이 단백질 또는 펩티드를 코딩한 RNA 또는 DNA로 한정되거나, 이러한 펩티드를 코딩한 핵산 서열에 대하여 보완적이거나, 또는 이러한 핵산에 혼성화하고, 또한 적절히 엄격한 조건하에서 안정적으로 결합되어 남아있다. For recombinant expression or production of fragments of the invention, nucleic acid molecules encoding the fragments can be prepared. As used herein, “nucleic acid” is defined as RNA or DNA encoding a protein or peptide as defined above, complementary to, or hybridizing to, such nucleic acid sequences encoding such peptides, and also suitably stringent conditions. Under stable bonding.

본 발명의 단편을 코딩한 핵산 분자는 유전자 암호중 축퇴때문에 서열이 다를 수 있거나, 아미노산 서열중 다른 단백질 또는 단백질 단편을 코딩함에 따라 서열중 다를 수 있다. Nucleic acid molecules encoding fragments of the invention may differ in sequence due to degeneracy in the genetic code, or may differ in sequence as they encode other proteins or protein fragments in the amino acid sequence.

이러한 핵산 분자의 둘 이상의 사이에서 동족체성 또는 서열일치는 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx(Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268(1990) and Altschul, et al., J. Mol. Evol. 36: 290-300(1993), 참고문헌으로 완전히 포함되었음)에 의해 쓰이는 알고리즘을 사용한 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 분석에 의해 결정된다. Homologous or sequence matching between two or more of these nucleic acid molecules is the program blastp, blastn, blastx, tblastn and tblastx (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268 (1990) and Altschul, et al., J. Mol. Evol. 36: 290-300 (1993), which is incorporated by reference in its entirety) and determined by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analysis using an algorithm.

BLAST 프로그램을 사용한 접근은, 우선, 조회된 서열 및 데이터베이스 서열간의 유사한 조각을 고려하고, 그 후, 확인된 모든 짝지음의 통계적인 중요성을 평가하고, 최종적으로 중요한 미리 선택된 역치를 만족시키는 짝지음만 요약한다. 서열 데이터베이스의 유사성 조사의 기본적인 결과의 논의를 위해, 참고문헌으로 완전히 포함된 Altschul et al.(Nat. Genet. 6, 119-129(1994))를 참고한다. 히스토그램, 설명, 정렬, 기대치(즉, 데이터베이스 서열에 대한 일치를 보고할 통계적으로 중요한 역치), 차단, 매트릭스(matrix) 및 여과기에 대한 조사 변수는 디폴트(default) 셋팅에 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 의해 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 BLOSUM62 매트릭스이다(Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919(1992), 본원에 참고문헌으로 완전히 포함되었음). 4개의 blastn 변수를 하기와 같이 조정하였다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10(갭 확장 페널티); wink=1(질문에 따라 매 윙크번째 위치에서 워드 힛트를 생성한다); 및 gapw=16(윈도우 폭을 갭 배열이 생성되는 내에서 설정한다). 당량의 Blastp 변수 셋팅은 Q=9; R=2; wink=1; 및 gapw=32이다. GCG 패키지 버전 10.0에서 가능한 서열간의 베스트핏(Bestfit) 비교는 DNA 변수 GAP=50(갭 생성 페널티) 및 LEN=3(갭 확장 페널티)를 사용하고 또한 단백질 비교에서의 당량의 셋팅은 GAP=8 및 LEN=2이다.The approach using the BLAST program first considers similar fragments between the queried and database sequences, then evaluates the statistical significance of all identified pairs, and finally only pairs that meet the critical preselected thresholds. Summarize. For a discussion of the basic results of investigating the similarity of sequence databases, see Altschul et al. (Nat. Genet. 6, 119-129 (1994)), which is fully incorporated by reference. The survey variables for histograms, descriptions, alignments, expectations (ie, statistically significant thresholds to report matches against database sequences), blocking, matrix, and filters are in the default settings. The default scoring matrix used by blastp, blastx, tblastn, and tblastx is the BLOSUM62 matrix (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 (1992), incorporated herein by reference in its entirety. ). Four blastn parameters were adjusted as follows: Q = 10 (gap creation penalty); R = 10 (gap expansion penalty); wink = 1 (produce a word hit at every wink position according to the question); And gapw = 16 (sets the window width within the gap array is created). The equivalent Blastp variable setting was Q = 9; R = 2; wink = 1; And gapw = 32. Bestfit comparisons between sequences possible in the GCG package version 10.0 use the DNA variables GAP = 50 (gap creation penalty) and LEN = 3 (gap expansion penalty) and the setting of equivalents in protein comparison is GAP = 8 and LEN = 2.

"엄격한 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온강도 및 고온을 사용하고, 예를 들면, 50℃에서 0.015M NaCl/0.0015M 소듐 시트레이트/0.1% SDS 또는 (2) 혼성화중 포름아미드와 같은 변성제, 예를 들어, 42℃에서 0.1% 소혈청알부민과 50% 포름아미드/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/pH 6.5에서 750 mM NaCl, 75 mM 소듐시트레이트과 50mM 소듐 포스페이트 완충제를 사용한다. 다른 예는 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC, 50mM 소듐 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 소듐 피로포스페이트, 5×Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50mg/ml),0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트의 42℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS중 세척하면서 사용하는 것이다. 숙련자는 깨끗하고 검출할 수 있는 혼성화 신호를 적절히 얻기 위해 엄격한 조건을 즉각적으로 결정하고 다양화할 수 있다. "Strict conditions" use (1) low ionic strength and high temperature for washing, for example, 0.015 M NaCl / 0.0015 M sodium citrate / 0.1% SDS at 50 ° C. or (2) formamide during hybridization. Denaturant using, for example, 750 mM NaCl, 75 mM sodium citrate and 50 mM sodium phosphate buffer at 0.1% bovine serum albumin and 50% formamide / 0.1% picol / 0.1% polyvinylpyrrolidone / pH 6.5 at 42 ° C. do. Other examples include 50% formamide, 5 × SSC, 50 mM sodium phosphate (pH 6.8), 0.1% sodium pyrophosphate, 5 × Denhardt's solution, sonicated salmon sperm DNA (50 mg / ml), 0.1% SDS at 42 ° C. and 10% dextran sulfate is used at 42 ° C. while washing in 0.2 × SSC and 0.1% SDS. The skilled person can immediately determine and diversify strict conditions to properly obtain a clean and detectable hybridization signal.

여기에서 사용된, 핵산 분자는 핵산 분자가 핵산 원으로부터 다른 폴리펩티드를 코딩한 오염균 핵산에서 실질적으로 분리되었을 때 "분리"되었다고 말해진다. As used herein, a nucleic acid molecule is said to be “isolated” when the nucleic acid molecule has been substantially separated from contaminant nucleic acid encoding another polypeptide from a nucleic acid source.

본 발명의 코딩 핵산 분자(즉, 합성 올리고뉴클레오티드) 및 PCR(polymerase chain reaction)용 특이 프라이머 또는 프루브로, 또는 본 발명의 단백질을 코딩한 유전자 서열의 합성에 사용되는 것은 화학적 기술, 예를 들어, Matteucci et al.(J. Am. Chem. Soc. 103: 185-3191(1981))의 포스포트리에스테르법에 의해, 또는 자동화된 합성법을 사용하여 쉽게 합성될 수 있다. 추가로, 더 큰 DNA 조각은 유전자의 다양한 모듈 조각을 한정하는 올리고뉴클레오티드의 그룹의 합성과 같은 공지된 방법에 의해 즉각 제조될 수 있고, 이 후, 올리고뉴클레오티드의 결찰술로 완전한 변형된 유전자를 구성한다. As specific primers or probes for encoding nucleic acid molecules of the present invention (ie, synthetic oligonucleotides) and polymerase chain reactions (PCRs), or for the synthesis of gene sequences encoding proteins of the present invention, chemical techniques, for example, It can be easily synthesized by the phosphoester ester method of Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103: 185-3191 (1981)) or using automated synthesis. In addition, larger DNA fragments can be prepared immediately by known methods, such as the synthesis of groups of oligonucleotides that define various modular fragments of a gene, which then constitutes a fully modified gene by ligation of the oligonucleotides. .

본 발명의 코딩 핵산분자는 진단 및 프루프 목적을 위해 검출할 수 있는 표지를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이러한 표지의 다양함은 해당분야에 공지되었고 본원에 기술된 코딩 분자와 같이 사용될 수 있다. 적절한 표지는 제한없이, 비오틴, 방사성표지 뉴클레오티드 및 기타 동종의 것을 포함한다. 숙련자는 표지된 코딩 핵산 분자를 얻기 위해 해당분야의 공지된 표지를 사용할 수 있다. Coding nucleic acid molecules of the present invention may be further modified to contain a detectable label for diagnostic and proof purposes. Various such labels are known in the art and can be used with the coding molecules described herein. Suitable labels include, without limitation, biotin, radiolabeled nucleotides, and the like. The skilled person can use known labels in the art to obtain labeled coding nucleic acid molecules.

본 발명은 추가로 상기 기술된 단백질 단편에 대한 코딩 서열을 함유한 재조합 DNA 분자(rDNA)를 제공한다. 여기에서 사용된, rDNA 분자는 분자 조작을 당하는 것이다. rDNA 분자를 생성하는 방법은 해당분야에 공지되었고, 예를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)를 참고한다. 바람직한 rDNA 분자에서, 코딩 DNA 서열은 발현 조절 서열 및/또는 벡터 서열에 실시가능하게 연결되었다. The invention further provides a recombinant DNA molecule (rDNA) containing the coding sequence for the protein fragments described above. As used herein, rDNA molecules are subject to molecular manipulation. Methods for generating rDNA molecules are known in the art and are described, for example, in Sambrook et al. See Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). In a preferred rDNA molecule, the coding DNA sequence is operably linked to expression control sequences and / or vector sequences.

본 발명의 단백질 코딩 서열의 하나가 벡터 및 발현 조절 서열의 어느 것에 실시가능하게 연결될 것인지의 선택은 해당 분야에 공지되었듯이, 직접적으로 원하는 기능적 특성(예: 단백질 발현, 및 형질전환될 숙주 세포)에 의존한다. 본 발명의 벡터는 rDNA 분자중 포함된 구조적 유전자의 복제 또는 숙주 염색체내로의 삽입 및 바람직하게는 또한 발현을 지시할 수 있을 것이다. The choice of which one of the protein coding sequences of the present invention will be operatively linked to a vector and an expression control sequence, as is known in the art, directly leads to the desired functional properties (eg, protein expression, and host cells to be transformed). Depends on The vectors of the invention may direct the replication or insertion into the host chromosome and preferably also the expression of the structural genes contained in the rDNA molecule.

실시가능하게 연결된 단백질 코딩 서열의 발현을 조절하는데 사용되는 발현 조절 원소는 해당분야에 공지되었고, 제한없이, 유발가능 촉진제, 구성적 촉진제, 분비 신호 및 기타 조절성 원소를 포함한다. 바람직하게, 유발가능 촉진제는 숙주 세포의 배지중 영양소에 반응하듯이 즉각 조절된다.Expression control elements used to control the expression of protein coding sequences that are operably linked are known in the art and include, without limitation, inducible promoters, constitutive promoters, secretion signals, and other regulatory elements. Preferably, the inducible promoter is modulated immediately as it responds to nutrients in the medium of the host cell.

본 발명은 추가로 본 발명의 단백질 단편을 코딩한 핵산 분자와 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성일 수 있다. 본 발명의 단백질의 발현에 유용한 진핵성 세포는 세포주가 세포 배양법과 양립하고, 발현 벡터 및 유전자 산물의 발현의 전파와 양립하는 한 제한 없다. 바람직한 진핵성 숙주 세포는 제한 없이, 효모, 곤충 및 포유류 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 예를 들어 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 세포주를 포함한다. 바람직한 진핵성 숙주 세포는 ATCC로부터 CCL61로 가능한 CHO(Chinese hamster ovary) 세포, ATCC로부터 CRL1658로 가능한 NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH 3T3, BHK(baby hamster kidney cell) 및 진핵성 조직 배양 세포주를 포함한다. The invention further provides a host cell transformed with a nucleic acid molecule encoding a protein fragment of the invention. Host cells can be prokaryotic or eukaryotic. Eukaryotic cells useful for the expression of the proteins of the invention are not limited so long as the cell line is compatible with cell culture and compatible with the propagation of expression of expression vectors and gene products. Preferred eukaryotic host cells include, without limitation, yeast, insect and mammalian cells, preferably vertebrate cells, such as mouse, rat, monkey or human cell lines. Preferred eukaryotic host cells include Chinese hamster ovary (CHO) cells capable of CCL61 from ATCC, NIH Swiss mouse embryonic cells NIH 3T3, baby hamster kidney cells (BHK) and eukaryotic tissue culture cell lines available from CCC1658 from ATCC.

본 발명의 형질전환된 숙주 세포는 재조합 단백질의 생성을 허용하는 조건하에서 배양될 것이다. 임의로 재조합 단백질은 배지로부터 또는 세포로부터 분리되고; 단백질의 회수 및 정제는 일부 불순물이 허용되는 일부 경우에서 필요하지 않을 수도 있다. Transformed host cells of the invention will be cultured under conditions that allow the production of recombinant proteins. Optionally the recombinant protein is isolated from the medium or from the cells; Recovery and purification of the protein may not be necessary in some cases where some impurities are acceptable.

키트는 상기 기술된 특이 측정을 위해 필요한 시약과 임의로 포장된 상기 기술된 핵산 분자, 단백질 단편, 벡터 및/또는 숙주 세포의 어떤 것 하고도 함께 제조될 수 있다. 이러한 키트에서 단백질 단편 또는 다른 시약은 고체 지지체, 예를 들어 유리 또는 플라스틱 구슬에 부착될 수 있다. Kits can be prepared with any of the nucleic acid molecules, protein fragments, vectors and / or host cells described above optionally packaged with the reagents required for the specific measurements described above. Protein fragments or other reagents in such kits may be attached to a solid support, such as glass or plastic beads.

G. 본 발명을 사용한 집적화된 과정.G. Integrated Procedures Using the Invention.

분자 모델링은 HDM2의 유사체 및 리간드의 합리적 약물 설계(RDD)를 위해 본 발명에 의해 제공되었다. 상기 기술되었듯이, 약물 설계 패러다임은 컴퓨터 모델링 프로그램을 사용하여 단백질의 부위와 상호작용할 것으로 기대되는 잠재력있는 유사체 및 리간드를 결정한다. 잠재력있는 유사체 또는 리간드는 그 후, 활성 및/또는 결합 및/또는 상호작용을 위해 스크리닝된다. HDM2 연관 유사체 또는 리간드를 위해, 스크리닝 방법이 HDM2의 적어도 하나의 생물학적 활성으로부터 선택될 수 있고, 예를 들어, 공지된 방법의 단계에 따른 p53 결합 차단이 있다. 예를 들어, Kussie et al., Science 274:948-953(1996); Bottger et al., J. Mol. Biol. 269: 744-756(1997)를 참고한다. Molecular modeling has been provided by the present invention for rational drug design (RDD) of analogs and ligands of HDM2. As described above, the drug design paradigm uses computer modeling programs to determine potential analogs and ligands that are expected to interact with the site of the protein. Potential analogs or ligands are then screened for activity and / or binding and / or interaction. For HDM2 associated analogs or ligands, the screening method can be selected from at least one biological activity of HDM2, for example p53 binding blocking according to the steps of known methods. See, eg, Kussie et al., Science 274: 948-953 (1996); Bottger et al., J. Mol. Biol. 269: 744-756 (1997).

따라서, 본 발명에 의해 제공되는 도구 및 방법론은 표적과 원하는 방향으로 결합하는 리간드를 확인하고 설계하는 과정에 사용될 것이다. 이러한 과정은 리간드가 합성되고, 시험되고 특성화되는 반복적인 방법을 이용한다. 새로운 리간드는 초기 리간드의 시험 및 특성화에서 얻은 정보에 기반하여 설계될 수 있고, 그 후 이러한 새로이 확인된 리간드 자체를 시험하고 특성화할 수 있다. 일련의 방법은 원하는 결합 특성을 가진 리간드를 수득하기 위해 필요한대로 몇번이고 반복될 것이다. Thus, the tools and methodologies provided by the present invention will be used in the process of identifying and designing ligands that bind the target in the desired direction. This process utilizes an iterative method in which ligands are synthesized, tested and characterized. The new ligand can be designed based on the information obtained from the testing and characterization of the initial ligand, and then these newly identified ligands can be tested and characterized. The series of methods will be repeated as many times as necessary to obtain a ligand with the desired binding properties.

하기 단계는 전체 과정의 예로 쓰인다: The following steps serve as an example of the whole process:

1. 표적의 생물학적 활성이 선택된다(예: p53에의 결합).1. The biological activity of the target is selected (eg binding to p53).

2. 선택된 생물학적 활성과 일부 결합되는 것으로 보이는 리간드를 확인한다(예: 리간드는 공지된 활성의 저해제일 수 있다). 2. Identify the ligands that appear to bind in part to the selected biological activity (eg, the ligand may be an inhibitor of known activity).

리간드의 활성은 생체내 및/또는 시험관내 시험될 수 있다. The activity of the ligand can be tested in vivo and / or in vitro.

본 발명의 리간드는 제한없이, 항체의 표지화에 관하여 검출가능하게 표지될 수 있는 지질, 핵산, 화합물, 단백질, 원소, 항체, 사카라이드, 동위원소, 카보하이드레이트, 영상제(imaging agent), 지질단백질, 글리코단백질, 효소, 검출 프루브, 및 항체 또는 이의 단편, 또는 이의 임의의 조합에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다. 이러한 표지는 제한 없이, 효소적 표지, 방사성 동위원소 또는 방사성활성 화합물 또는 원소, 형광 화합물 또는 금속, 화학발광 화합물 및 생물발광 화합물을 포함한다. 대체적으로, 본 발명의 방법에서, 임의의 다른 공지된 진단 또는 치료 약제가 사용될 수 있다. 적절한 화합물은 그 후 표적에 대한 관계에서의 활성에 대해 시험된다. Ligands of the invention include, without limitation, lipids, nucleic acids, compounds, proteins, elements, antibodies, saccharides, isotopes, carbohydrates, imaging agents, lipoproteins, which can be detectably labeled with respect to labeling of antibodies. At least one selected from glycoproteins, enzymes, detection probes, and antibodies or fragments thereof, or any combination thereof. Such labels include, without limitation, enzymatic labels, radioisotopes or radioactive compounds or elements, fluorescent compounds or metals, chemiluminescent compounds and bioluminescent compounds. Alternatively, in the methods of the present invention, any other known diagnostic or therapeutic agent may be used. Suitable compounds are then tested for activity in relation to the target.

HDM2 및 리간드 사이의 착물은 동시-결정화 또는 보다 일반적으로는 작은 분자 리간드를 결정내로 확산시킴으로써 만들어진다. 착물 결정으로부터의 엑스레이 회절 자료가 측정되고 전자 밀도 지도 차이가 계산된다. 이 방법은 표적 분자상에 결합된 리간드의 정확한 위치를 제공한다. 좌표로부터 계산된 측정 회절 진폭 및 이들 반사 위상을 사용하여 푸리에 차이(difference Fourier)를 계산한다. Complexes between HDM2 and ligands are made by co-crystallization or, more generally, by diffusing small molecular ligands into the crystals. X-ray diffraction data from the complex crystals are measured and the electron density map difference is calculated. This method provides the exact location of the ligand bound on the target molecule. The measured diffraction amplitudes calculated from the coordinates and these reflection phases are used to calculate the Fourier difference.

본 발명의 방법을 사용하여, 엑스레이 결정학은 전자 밀도 지도 및/또는 표적 분자와 리간드의 상호작용의 분자 모델을 생성하는데 사용된다. Using the method of the present invention, x-ray crystallography is used to generate molecular density models of electron density maps and / or interactions of ligands with target molecules.

상기 논의된 컴퓨터 프로그램내로의 표적 좌표의 도입은 고분자의 가장 가능성 있는 구조의 계산을 나타내었다. 이들 구조는 이러한 프로그램을 사용한 추가적인 계산에 의해 결합되고 정제되어 리간드의 잠재적인 또는 실제 활성 또는 결합부위를 포함한 표적의 가능하거나 실제의 3차원 구조를 결정한다. 리간드 또는 유사체의 합리적 약물 설계에 유용한 이러한 분자 모델링(및 연관된) 프로그램은 또한 본 발명에 의해 제공되었다. The introduction of target coordinates into the computer program discussed above represented the calculation of the most likely structure of the polymer. These structures are bound and purified by additional calculations using this program to determine the possible or actual three-dimensional structures of the target, including the potential or actual activity or binding site of the ligand. Such molecular modeling (and associated) programs useful for rational drug design of ligands or analogs have also been provided by the present invention.

4. 단계 3에서 얻어진 전자 밀도 지도 및/또는 분자 모델은 표적을 함유한 비-리간드의 전자 밀도 지도 및/또는 분자모델과 비교되고, 관찰된/계산된 차이는 표적 또는 소단위상의 결합을 특이적으로 위치시키는데 사용된다. 4. The electron density map and / or molecular model obtained in step 3 is compared with the electron density map and / or molecular model of the non-ligand containing the target, and the observed / calculated differences are specific for binding on the target or subunit. Used to locate

5. 모델링 도구, 예를 들어 계산 화학 및 컴퓨터 모델링은 리간드의 구조가 표적과 부가적 또는 다른 상호작용을 만들 수 있도록 리간드의 구조를 조절 또는 변형하는데 사용된다. 5. Modeling tools, such as computational chemistry and computer modeling, are used to modulate or modify the structure of the ligand such that the structure of the ligand can create additional or other interactions with the target.

리간드 설계는 표적의 다양한 부위와 다른 분자가 어떻게 상호작용하는지 계산하는 컴퓨터 모델링 프로그램을 사용한다. 이 과정은 잠재력있는 리간드 또는 리간드(들)의 유사체를 결정한다. Ligand design uses a computer modeling program that calculates how different molecules interact with various sites on the target. This process determines potential ligands or analogs of ligand (s).

리간드 설계는 표적, 소단위 또는 이들의 단편의 다양한 부위와 다른 분자가 어떻게 상호작용하는지 계산하는 컴퓨터 모델링 프로그램을 사용한다. 따라서, 이 방법은 잠재력있는 리간드 또는 피간드 유사체를 결정한다. Ligand design uses a computer modeling program that calculates how different molecules interact with various sites of a target, subunit or fragment thereof. Thus, this method determines potential ligands or pigand analogs.

단계 5에서 새로 설계된 리간드는 상기 논의된 높은 처리량 스크리닝법을 포함한 적절한 생체내 또는 시험관내 시험을 사용하여 그것의 생물학적 활성을 시험할 수 있다. The newly designed ligand in step 5 can be tested for its biological activity using appropriate in vivo or in vitro tests, including the high throughput screening methods discussed above.

잠재력있는 리간드 또는 유사체는 그 후, HDM2 또는 적어도 이들의 단편과 연관된 활성에 대하여 스크리닝된다. 이러한 스크리닝 방법은 자연 표적의 적어도 하나의 생물학적 활성에 대한 측정에서 선택된다. Potential ligands or analogs are then screened for activity associated with HDM2 or at least fragments thereof. Such screening methods are selected in the determination of at least one biological activity of a natural target.

본 발명의 방법에 의해 제공된 수득된 리간드 또는 유사체는 포유류(인간 포함) 및 조류와 같은 동물중 질병을 처리, 스크리닝 또는 예방하는데 유용하다. The ligands or analogs obtained by the methods of the invention are useful for treating, screening or preventing diseases in animals such as mammals (including humans) and birds.

7. 물론, 각각의 상기 단계는 해당 분야의 숙련자에 의해 생각하는 특별한 목적을 위한 방법을 개량하기 위해 원하는 대로 변형될 수 있다. 또한, 부가적인 엑스레이 회절 자료는 HDM2, HDM2/리간드 착물, HDM2 구조적 표적 모티프 및 HDM2 소단위/리간드 착물에 대해 방법의 임의의 단계 또는 상태에서 수집될 수 있다. 이러한 추가적인 회절 자료는 원하는 결합의 특성을 가진 리간드의 설계 및 선택을 추가로 보조하는 전자 밀도 지도 및 분자 모델의 재구성에 사용될 수 있다. 7. Of course, each of the above steps can be modified as desired to improve the method for a particular purpose contemplated by one skilled in the art. In addition, additional x-ray diffraction data can be collected at any step or state of the method for HDM2, HDM2 / ligand complexes, HDM2 structural target motifs, and HDM2 subunit / ligand complexes. These additional diffraction data can be used for the reconstruction of electron density maps and molecular models that further aid in the design and selection of ligands with the desired binding properties.

본 발명은 광학 이성질체뿐만 아니라 입체 이성질체, 예를 들어 본 일련의 선택된 화합물, 리간드 또는 유사체의 구조적 비대칭성의 결과로 나타나는 개별적인 에난티오머 및 디아스테레오머뿐만 아니라 에난티오머의 혼합물도 포함하는 것으로 간주된다는 점을 이해하여야 한다. The present invention is considered to include not only optical isomers but also mixtures of enantiomers as well as individual enantiomers and diastereomers resulting from the structural asymmetry of stereoisomers such as the selected series of selected compounds, ligands or analogs. It should be understood.

본원의 방법에 의해 개시되거나 발견된 화합물 또는 약제의 일부는 하나 이상의 비대칭 중심을 포함하고, 따라서 에난티오머, 디아스테레오머, 및 기타 입체 이성질체적 형태의 증가를 나타낸다. 본 발명은 또한 이들의 라세미 및 용해된 형태 및 이들의 혼합물뿐만 아니라 이러한 가능한 형태를 포함하는 것으로 되어있다. 본원에 기술되거나 발견된 화합물은 올레핀계 이중 결합 또는 기하학적 비대칭의 다른 중심을 포함하고, 달리 명기되지 않는 한, 이는 E 및 Z 기하학적 이성질체를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 모든 토우토머는 또한 본 발명에 의해 포함되는 것으로 의도된다. Some of the compounds or medicaments disclosed or found by the methods herein include one or more asymmetric centers and thus exhibit an increase in enantiomers, diastereomers, and other stereoisomeric forms. The present invention is also intended to include such racemic and dissolved forms and mixtures thereof as well as such possible forms. The compounds described or found herein include olefinic double bonds or other centers of geometric asymmetry, and unless otherwise specified, it is intended to include both E and Z geometric isomers. All tautomers are also intended to be encompassed by the present invention.

여기에서 사용된, 용어 "입체이성질체"는 공간에서 이들의 원자 방향만 다른 개별적인 분자의 모든 이성질체에 대한 일반적인 용어이다. 이는 서로 거울상이 아닌 하나 이상의 키랄 중심을 가진 화합물의 에난티오머 및 이성질체를 포함한다(디아스테레오머). As used herein, the term “stereoisomers” is a generic term for all isomers of individual molecules that differ only in their atomic direction in space. This includes enantiomers and isomers of compounds having one or more chiral centers that are not mirror images of each other (diastereomers).

여기에서 사용된, 용어 "키랄 중심"은 4개의 다른 그룹이 부착된 탄소 원자를 의미한다. As used herein, the term “chiral center” means a carbon atom to which four other groups are attached.

여기에서 사용된, 용어 "에난티오머" 또는 "에난티오머적인"은 그의 거울상에 중첩되지 않고 광학적으로 활성인 분자를 의미하고, 여기에서 에난티오머는 편광된 빛의 면을 한 방향으로 회전하고, 이의 거울상은 반대 방향으로 편광된 빛의 면을 회전한다. As used herein, the term “enantiomer” or “enantiomer” means an optically active molecule that does not overlap on its mirror image, where the enantiomer rotates the plane of polarized light in one direction and Its mirror image rotates the plane of polarized light in the opposite direction.

여기에서 사용된, 용어 "라세미(racemic)"는 광학적으로 활성인 에난티오머의 동등한 부분의 혼합물을 의미한다. As used herein, the term "racemic" refers to a mixture of equivalent portions of optically active enantiomers.

여기에서 사용된, 용어 "해상도(resolution)"는 분자의 두개의 에난티오머 형태의 하나의 분리 또는 농축 또는 고갈을 의미한다. 본원의 본문에서 용어 "해상도"는 또한 회절 실험에 의해 용해될 수 있는 디테일(detail)의 양을 의미한다. 또는 기타 용어에서, 단백질 결정 회절 패턴의 타고난 이상은 어떤 회절 각도 Θ_max에서 사라지고, 역격자의 상당하는 거리 d_min은 브라그(Bragg)의 법칙에 의해 결정된다.As used herein, the term "resolution" refers to the separation or concentration or depletion of one of the two enantiomeric forms of the molecule. The term "resolution" in the present text also refers to the amount of detail that can be dissolved by diffraction experiments. Or in other terms, the innate abnormality of the protein crystal diffraction pattern disappears at some diffraction angle Θ _max , and the corresponding distance d _min of the inverse lattice is determined by Bragg's law.

단백질 결정학에서 실제로, 지도의 계산에서 자료가 포함되는 최소 격자 거리 d_min의 용어로 단백질 전자 밀도의 근소한 해상도를 인용하는 것이 보통이다. In protein crystallography, in practice, it is common to cite the slight resolution of the protein electron density in terms of the minimum lattice distance d _min in which data are included in the calculation of the map.

본 발명의 화합물은 또한 p53 및 MDMX간 상호작용을 저해하는데 유용하다. 또한 MDM4로 알려진 MDMX는 세포 주기의 조절에 포함되는 세포성 단백질이다. 예를 들어, Riemenschneider et al., Cancer Res. 59(24):6091-6096(1999)를 참고한다. Compounds of the invention are also useful for inhibiting the interaction between p53 and MDMX. MDMX, also known as MDM4, is a cellular protein involved in the regulation of the cell cycle. See, eg, Riemenschneider et al., Cancer Res. 59 (24): 6091-6096 (1999).

추가의 설명없이, 해당 분야의 일반적인 기술의 하나는 상기 설명 및 하기 설명적인 실시예를 사용하여, 본 발명의 화합물 제조하고 사용할 수 있고, 청구된 방법을 실습할 수 있다고 믿어진다. 하기 작용 실시예는, 본 발명의 바람직한 구체예를 구체적으로 지적하며, 이는 개시물의 나머지를 어떤 방법으로도 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. Without further elaboration, it is believed that one of ordinary skill in the art can make and use the compounds of the present invention and practice the claimed methods, using the above description and the following illustrative examples. The following working examples specifically point to preferred embodiments of the invention, which should not be construed as limiting the rest of the disclosure in any way.

실시예 1.Example 1.

GST HDM2 융합 단백질 구성 및 발현GST HDM2 Fusion Protein Composition and Expression

HDM2의 cDNA 코딩 잔기 17-125를 하기와 같이 복제하고 발현하였다: 하기 프 라이머 및 주형으로 부분적 인간 MDM2 서열을 함유한 ATCC 아이템 번호 384988을 사용하여 PCR을 수행하였다: The cDNA coding residues 17-125 of HDM2 were cloned and expressed as follows: PCR was performed using ATCC item number 384988 containing partial human MDM2 sequences as the following primers and templates:

전방:Forward:

후방:rear:

PCR 생성물을 그 후, BamHI 및 Xhol(프라이머중 나타내어진 서열 인식 부위)로 소화시키고, 겔(gel) 정제하고, 역시 BamHI 및 Xhol으로 소화되는 pGEX4t-3으로 결찰하였다. 정제된 플라스미드를 E. coli 균주 BL21로 형질전환하였다. 37℃, 800mL LB(Laura Bertani 배지) + 100μg/ml 암피실린을 함유한 2L 진탕 플라스크에서 단백질을 생성하고, 0.2% 글리세롤을 보충하였다. 간략히, 배지를 16ml의 밤새 배양으로 접종하고, 600에서의 흡광도가 0.6-0.8 OD에 도달했을 때 1mM IPTG로 유도하였다. 세포를 유도 5시간 후, 수집하였다. PCR products were then digested with BamHI and Xhol (sequence recognition sites shown in primers), gel purified, and ligated with pGEX4t-3, which was also digested with BamHI and Xhol. Purified plasmids were transformed with E. coli strain BL21. Protein was generated in a 2 L shake flask containing 37 ° C., 800 mL LB (Laura Bertani medium) +100 μg / ml ampicillin and supplemented with 0.2% glycerol. Briefly, the medium was inoculated in 16 ml overnight culture and induced with 1 mM IPTG when the absorbance at 600 reached 0.6-0.8 OD. Cells were harvested 5 hours after induction.

HDM2 23-114용으로, 사용된 프라이머는 하기와 같다:For HDM2 23-114, the primers used are as follows:

HDM2 17-111용으로, 사용된 프라이머:For HDM2 17-111, primers used:

PCR 단편을 복제하고, 일부 예외는 있으나 상기와 같이 발현하였다. E. coli 균주 BL21 RIL을 발현에 사용하였다. 세포를 37℃에서 0.2의 A₆₀₀까지 성장시키고, 그 후, 실온으로 옮겨 0.1mM IPTG와 0.6-0.8의 A₆₀₀에서 유도하였다. 세포를 유도 5시간 후 수집, 원심분리 및 PBS에서 10ml/g 세포 페이스트(paste)로 재현탁시켰다. PCR fragments were cloned and expressed as above with some exceptions. E. coli strain BL21 RIL was used for expression. Cells were grown at 37 ° C. up to A ₆₀₀ of 0.2, then transferred to room temperature and induced at 0.1 mM IPTG and A ₆₀₀ of 0.6-0.8. Cells were collected 5 hours post induction, centrifuged and resuspended in 10 ml / g cell paste in PBS.

단백질 생성Protein production

세포를 아베스틴 미세유체화기(Avestin microfluidizer)로 용해시키고, 원심분리하고, 상청액을 글루타티온 세파로스 4B 수지(Pharmacia)에 결합시켰다. 수지를 PBS로 세척하고, 중요한 HDM2 구성을 2μg/ml 트롬빈(Enzyme Research Labs)의 첨가로 GST-수지로부터 분리시켰다. 분리된 HDM2를 세파로스 SP 급속 수지(Pharmacia)상에 실어 20mM 헤페스(HEPES) pH 7.5, 150mM NaCl로 용리하였다. 글루타티온을 5mM로 첨가하고, 단백질을 -70℃에서 저장하였다. 수득된 단백질은 아미노산 17(세린) 앞의 N-종단 글리신을 가졌다. Cells were lysed with an Avestin microfluidizer, centrifuged and the supernatant bound to glutathione Sepharose 4B resin (Pharmacia). The resin was washed with PBS and important HDM2 constructs were separated from GST-resin with the addition of 2 μg / ml thrombin (Enzyme Research Labs). The isolated HDM2 was loaded onto Sepharose SP Rapid Resin (Pharmacia) and eluted with 20 mM Hepes pH 7.5, 150 mM NaCl. Glutathione was added at 5 mM and the protein was stored at -70 ° C. The protein obtained had an N-terminal glycine before amino acid 17 (serine).

결정학용 단백질 제조Manufacture of Protein for Crystallography

HDM2 17-111을 농도 0.7mg/ml에서 투석함으로써 중요한 화합물과 착물화하고, 완충제는 20mM HEPES pH. 7.4, 100mM NaCl, 5mM DTT로 조절되고, 0.02μm 필터를 통해 여과하고, 10mg/ml까지 농축시켰다. HDM2 17-111 was complexed with important compounds by dialysis at a concentration of 0.7 mg / ml, and the buffer was 20 mM HEPES pH. 7.4, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, filtered through 0.02 μm filter and concentrated to 10 mg / ml.

실시예 2.Example 2.

결정화 및 자료 수집Crystallization and Data Collection

전형적인 결정화 실험에서, 화합물과 착물화되고 약 10mg/ml로 농축된 1-2μ l의 HDM2 단백질을 웰(well) 용액(1.8-2.4M(NH₄)₂SO₄, 100mM 완충제 pH. 6.5-9.0, 2% PEG 400, 100mM NaSCN)과 1:1 비율로 혼합하고 덮개 유리상에 두었다. 덮개 유리를 뒤집고 웰 용액 500-1000μl의 저장소를 봉하고 4℃에서 항온처리하였다. 결정은 보통 밤새 나타나거나 3-7일 후 수확할 수 있었다. 결정을 나일론 루프(loop)로 수확하고 냉동 용액(2.2M(NH₄)₂S0₄, 100mM 비스-트리스-프로판 pH. 7.5, 2% PEG 400, 100mM NaSCN, 15% 글리세롤)에서 30초 이하로 두고, 액체 질소 또는 액체 프로판에 침수시켜 냉각시켰다. 자료를 120K에서 Bruker AXS M06XCE 회전 음극 및 SMART 6000 CCD 검출기에서 수집하였다. 회절 자료는 프로테움 수트(Proteum suite, Bruker AXS)로 처리하였다. In a typical crystallization experiment, 1-2 μl of HDM2 protein complexed with the compound and concentrated to about 10 mg / ml was added to a well solution (1.8-2.4 M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 100 mM buffer pH. 6.5-9.0 , 2% PEG 400, 100 mM NaSCN) in a 1: 1 ratio and placed on a cover glass. The cover glass was turned upside down and a reservoir of 500-1000 μl of well solution was sealed and incubated at 4 ° C. Crystals usually appeared overnight or could be harvested after 3-7 days. The crystals were harvested in a nylon loop and used for 30 seconds or less in a frozen solution (2.2M (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 100 mM bis-tris-propane pH.7.5, 2% PEG 400, 100 mM NaSCN, 15% glycerol) And cooled by immersion in liquid nitrogen or liquid propane. Data was collected at 120K on a Bruker AXS M06XCE rotary cathode and SMART 6000 CCD detector. Diffraction data were processed with Proteum suite (Bruker AXS).

실시예 3.Example 3.

분석법: 펩티드 결합 분석Assay: Peptide Binding Assay

MDM2의 p53에 대한 결합 저해를 MDM2 잔기 17-125에 결합하는 p53 펩티드 유사체를 사용하여 측정하였다. 이 착물의 공개된 결정 구조(Kussie, P.H., et al., Science 274:948-953(1996))는 이 단편이 p53 결합 부위를 함유하는 것으로 확증했고, p53 펩티드 유사체 MPRFMDYWEGLN의 엑스레이 구조를 풀었으며, MDM2 p53 상호작용(Bottger, A., et al., J Mol Biol 269: 744-756(1997))의 펩티드 저해제로 기술하였다. 분석은 N 종단 형광물질 RFMDYWEGL 펩티드(Fl 9mer)를 사용하였다. 화합물을 15분간 50mM HEPES pH. 7.5, 150mM NaCl, 3mM 옥틸 글루코시드중 30nM 형광물 질 펩티드 Fl 9mer 및 120nM HDM2 17-125로 항온처리하였다. 형광물질 표시의 편광을 485nm에서의 들뜸 및 530nm에서의 방출로 측정하였다. MDM2 없는 Fl 9mer를 배경으로 사용하여, 편광을 화합물 조절이 없는 것의 백분율로 표시하였다.Inhibition of binding of MDM2 to p53 was measured using p53 peptide analogues that bind to MDM2 residues 17-125. The published crystal structure of this complex (Kussie, PH, et al., Science 274: 948-953 (1996)) confirmed that the fragment contained a p53 binding site and solved the x-ray structure of the p53 peptide analog MPRFMDYWEGLN. , A peptide inhibitor of MDM2 p53 interaction (Bottger, A., et al., J Mol Biol 269: 744-756 (1997)). The analysis used N-terminal fluorescent RFMDYWEGL peptide (Fl 9mer). The compound was stirred for 15 minutes at 50 mM HEPES pH. Incubated with 7.5, 150 mM NaCl, 30 nM fluorescent peptide Fl 9mer and 120 nM HDM2 17-125 in 3 mM octyl glucoside. The polarization of the phosphor markings was measured by excitation at 485 nm and emission at 530 nm. Fl 9mer without MDM2 was used as background, and polarization was expressed as a percentage of no compound control.

실시예 4.Example 4.

HDM2 원자 좌표(Atomic Coordinates): 표 1(화합물 1)HDM2 Atomic Coordinates: Table 1 (Compound 1)

표 1은 표준 pdb-형식중 화합물 1(338437) ((4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산) 및 결합된 물과 착물을 형성한 HDM2의 3차원 원자 좌표를 기술하였다. 연관된 결정학적 자료는 표 1의 화합물의 부분에 포함되었다. 비-결정학적 대칭에 의해 연관된 HDM2의 두 분자는, 비대칭 단위로 존재하고, 제일 분자에 대하여는 CHAINID의 A 및 제이 분자에 대하여는 B로 확인하였다. 화합물(화합물 1)은 DCB라는 이름의 잔기하에서 존재하였다. 동일한 CHAINID를 공유하는 화합물 1 및 HDM2 분자는 착물을 형성한다. Table 1 shows compound 1 (338437) ((4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3 in standard pdb-form. , 5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid) and three-dimensional atomic coordinates of HDM2 complexed with bound water. Associated crystallographic data was included in the parts of the compounds of Table 1. Two molecules of HDM2, associated by non-crystallographic symmetry, exist in asymmetric units, identified as A for CHAINID and B for J. molecules for the first molecule. Compound (Compound 1) was present under a residue named DCB. Compound 1 and HDM2 molecules that share the same CHAINID form a complex.

실시예 5.Example 5.

HDM2 원자 좌표: 표 2(화합물 2)HDM2 atomic coordinates: Table 2 (Compound 2)

화합물 2 [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산(876273) 및 HDM2 단백질을 상기 실시예 2에 기재하였듯이 동시결정화하였다. 표 2는 화합물 2(876273) ([8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산)과 착물을 형성한 HDM2의 3차원 원자 좌표를 기술하였다. 연관된 결정학적 자료는 표 2의 화합물의 부분에 포함하였다. 자료를 상기 기술하였듯이 수집하였다. 다른 결정 형태가 삼각형 결정 형태를 얻기 위해 사용한 동시결정화 조건하에서 관찰될 수 있다. Compound 2 [8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] dia Zepin-4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid (876273) and HDM2 protein were co-crystallized as described in Example 2 above. Table 2 shows Compound 2 (876273) ([8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e ] [1,4] diazepin-4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid) describes three-dimensional atomic coordinates of HDM2 complexed. Associated crystallographic data was included in the parts of the compounds of Table 2. Data was collected as described above. Other crystal forms can be observed under the co-crystallization conditions used to obtain triangular crystal forms.

실시예 6.Example 6.

HDM2 원자 좌표: 표 3HDM2 atomic coordinates: Table 3

표 3은 4차원 공간그룹에서 화합물 1(화합물 338437 ((4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산)과 착물을 형성한 HDM2의 구조에 정렬된 화합물 2(화합물 876273: [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산)과 동시결정화된 HDM2의 3차원 원자 좌표를 기술하였다. 연관된 결정학적 자료는 표 3의 화합물의 부분에 포함되었다. 자료를 상기 기술하였듯이 수집하였다.Table 3 shows compound 1 (compound 338437 ((4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3) in a four-dimensional space group. , 5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid) aligned to the structure of HDM2 complexed with Compound 2 (compound 876273: [8-chloro-3- ( 4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl]-(4- Three-dimensional atomic coordinates of HDM2 co-crystallized with chloro-phenyl) -acetic acid) The associated crystallographic data was included in the parts of the compounds of Table 3. The data were collected as described above.

pdb-형식은 웹(web)상에서 다양한 사이트에서 기술되었다. 프로그램에 따라 이러한 형식에 대한 결정학적 적용의 사소한 변형을 발견할 수 있다. The pdb-form has been described at various sites on the web. Depending on the program, minor variations in the crystallographic application of these forms can be found.

우수한 프라이머는 CCP4의 하기 링크에 의해 제공된다"www.ccp4.ac.uk/html/pdbformat.html". 보다 확장된 기술은 RCSB 홈페이지에서 찾을 수 있다. Excellent primers are provided by the following link to CCP4 "www.ccp4.ac.uk/html/pdbformat.html". More extended technologies can be found on the RCSB homepage.

실시예 7.Example 7.

상배열(Phasing): 모델 제작 및 정제Phasing: Modeling and Refining

CNX(Brunger, A.T., et al., P.D.. Acta Cryst D54:905-921(1998); Accelrys Inc.)의 조사 모델과 같이 공개된 HDM2-구조를 사용한 분자 치환에 의해 위상을 얻었다. 구조 정제 및 모델 제작의 교차 순환을 CNX 및 O(Jones, T.A., et al., Acta Cryst A47: 110-119(1991))를 사용한 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. Phases were obtained by molecular substitution using published HDM2-structures, such as the investigation model of CNX (Brunger, A.T., et al., P.D .. Acta Cryst D54: 905-921 (1998); Accelrys Inc.). Cross-circulation of structural purification and model construction was performed according to standard protocol using CNX and O (Jones, T.A., et al., Acta Cryst A47: 110-119 (1991)).

실시예 8.Example 8.

HDM2의 구조적 특징Structural Features of the HDM2

도 1. 화합물 1 (화합물 338437: ((4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산)에 결합한 HDM2의 리본 표현.Compound 1 (Compound 338437: ((4-Chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetra) Ribbon representation of HDM2 bound to hydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid.

도 2. 분자 표면으로 존재하는 HDM2의 활성 부위로의 화합물 1 (화합물 338437: ((4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산)의 적합성(fit).2. Compound 1 (Active 338437: ((4-Chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-di) to the active site of HDM2 present as molecular surface Oxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid).

본 발명이 상기 실시예에 관하여 상세히 기술하였으나, 본 발명의 정신에서 벗어나지 않고 다양한 변형이 가능함을 이해하여야 한다. 모든 인용된 특허, 특허출원 및 공보 및 본원에서 언급되는 기타 문서는 그들의 전체가 본원에서 참고문헌으로 포함된다. Although the invention has been described in detail with respect to the above embodiments, it should be understood that various modifications may be made without departing from the spirit of the invention. All cited patents, patent applications and publications and other documents mentioned herein are incorporated by reference in their entirety.

표 1: 화합물 338437 ((4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산 Table 1: Compound 338437 ((4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [ e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid

표 2: 화합물 876273((8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산)Table 2: Compound 876273 ((8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1 , 4] diazepin-4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid)

표 3. 중첩된: 삼각형 및 사각형 결정 형태.Table 3. Nested: triangular and square crystal forms.

서열목록Sequence Listing

Claims

HDM2, 또는 그의 단편, 표적 구조적 모티프 또는 유도체, 및 작은 분자 저해제인 리간드를 포함하는 결정.A crystal comprising HDM2, or a fragment thereof, a target structural motif or derivative, and a ligand that is a small molecule inhibitor.

제 1항에 있어서, 상기 단편 또는 이의 유도체는 SEQ ID NO: 1(전체 길이 HDM2의 아미노산 서열), SEQ ID NO: 2(SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 17-111), SEQ ID NO. 3(SEQ ID NO: 1의 아미노산 잔기 23-114) 및 SEQ ID NO. 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)로 구성된 그룹에서 선택된 리간드인 결정. The method of claim 1, wherein the fragment or derivative thereof is SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of full length HDM2), SEQ ID NO: 2 (amino acid residues 17-111 of SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO. 3 (amino acid residues 23-114 of SEQ ID NO: 1) and SEQ ID NO. A crystal that is a ligand selected from the group consisting of 4 (Gly ¹⁶ -SEQ ID NO: 2).

제 1항에 있어서, 상기 결정은 P3₂21의 삼각형 공간그룹 및 P4₃2₁2의 사각형 공간그룹으로 구성된 그룹에서 선택된 공간그룹을 갖는 결정.The crystal of claim 1, wherein the crystal has a spatial group selected from the group consisting of a triangular spatial group of P3 ₂ 21 and a rectangular spatial group of P4 ₃ 2 ₁ 2.

제 1항에 있어서, 결정은 원자 좌표의 결정을 위해 적어도 약 3.0Å의 해상도에서 엑스레이를 효과적으로 회절시키는 결정. The crystal of claim 1, wherein the crystal effectively diffracts x-rays at a resolution of at least about 3.0 Hz for determination of atomic coordinates.

제 1항에 있어서, 리간드는 결정형 형태인 결정. The crystal of claim 1, wherein the ligand is in crystalline form.

제 1항에 있어서, 상기 리간드는 (4-클로로-페닐)-[3-(4-클로로-페닐)-7-아 이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-,테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-아세트산; [8-클로로-3-(4-클로로-페닐)-7-아이오도-2,5-디옥소-1,2,3,5-테트라히드로-벤조[e][1,4]디아제핀-4-일]-(4-클로로-페닐)-아세트산); 및 이의 유도체로 구성된 그룹에서 선택된 결정. The compound of claim 1, wherein the ligand is (4-chloro-phenyl)-[3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-, Tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepin-4-yl] -acetic acid; [8-chloro-3- (4-chloro-phenyl) -7-iodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahydro-benzo [e] [1,4] diazepine- 4-yl]-(4-chloro-phenyl) -acetic acid); And a crystal selected from the group consisting of derivatives thereof.

제 1항에 있어서, 상기 HDM2는 SEQ ID NO. 2와 적어도 95% 서열이 일치하는 펩티드를 포함하는 결정. The method of claim 1, wherein the HDM2 is SEQ ID NO. A crystal comprising a peptide that is at least 95% identical in sequence to 2.

표 1 또는 표 2의 좌표에 의해 특성화된 원자 구조를 포함하는 SEQ ID NO: 2를 포함하는 결정.A crystal comprising SEQ ID NO: 2 comprising an atomic structure characterized by the coordinates of Table 1 or Table 2.

제 1항에 있어서, 단위 세포는: 약 98.6Å, 98.6Å 및 74.7Å, 및 약 알파=90, 베타=90 및 감마=120의 치수; 및, 약 54.3Å, 54.3Å, 83.3Å 및 약 알파=90, 베타=90 및 감마=90의 치수로 구성된 그룹에서 선택된 치수를 갖는 결정. The cell of claim 1, wherein the unit cells have dimensions of about 98.6 Hz, 98.6 Hz and 74.7 Hz, and about alpha = 90, beta = 90 and gamma = 120; And, a crystal having dimensions selected from the group consisting of about 54.3 ms, 54.3 ms, 83.3 ms and about alpha = 90, beta = 90 and gamma = 90.

(a) HDM2 또는 그의 단편 또는 표적 구조적 모티프 또는 유도체, 및 작은 분자 저해제인 리간드를 포함하는 결정의 3차원 구조상에 정보를 함유하고, 컴퓨터 판독가능한 저장 매체에 저장된 데이터베이스; 및(a) a database containing information on a three-dimensional structure of a crystal comprising HDM2 or a fragment or target structural motif or derivative thereof, and a ligand that is a small molecule inhibitor, and stored in a computer readable storage medium; And

(b) 정보를 열람하기 위한 사용자 인터페이스(b) user interface for viewing information

를 포함하는 컴퓨터 시스템. Computer system comprising a.

제 10항에 있어서, 정보는 SEQ ID NO:2를 포함하는 결정에서 얻어진 회절 정보를 포함하는 컴퓨터 시스템.The computer system of claim 10, wherein the information comprises diffraction information obtained from a crystal comprising SEQ ID NO: 2.

제 10항에 있어서, 정보는 SEQ ID NO:2를 포함하는 결정형태의 전자 밀도 지도를 포함하는 컴퓨터 시스템.The computer system of claim 10, wherein the information comprises an electron density map of the crystalline form comprising SEQ ID NO: 2.

제 10항에 있어서, 정보는 표 1 또는 표 2의 구조 좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비-수소 원자에 중첩되었을 때 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 동족체적인 구조 좌표를 포함하는 컴퓨터 시스템. The method of claim 10, wherein the information comprises a mean square deviation of the non-hydrogen atoms of less than 1.5 μs when superimposed on the non-hydrogen atoms of the structural coordinates of Table 1 or Table 2 or the corresponding atomic coordinates of Table 1 or Table 2. A computer system comprising homologous structural coordinates.

제 13항에 있어서, 정보는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때 0.75Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 아미노산 잔기에 대한 구조 좌표를 포함하는 컴퓨터 시스템.The method of claim 13, wherein the information comprises structural coordinates for amino acid residues comprising a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than 0.75 μs when superimposed on the corresponding non-hydrogen atoms of the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 Computer system.

제 10항에 있어서, 정보는 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 구조 좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하 는 상기 아미노산에 대한 유사한 구조 좌표를 포함하는 컴퓨터 시스템. The method according to claim 10, wherein the information is superimposed on the non-hydrogen atoms of the structural coordinates for the amino acids Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ according to Table 1 or 2 or the corresponding atomic coordinates of Table 1 or 2 A computer system comprising similar structural coordinates for the amino acid that includes a mean square deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 ms.

제 15항에 있어서, 정보는 추가로 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Va1⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶², Tyr⁶⁷, Gln⁷², His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰, Ile¹⁰³에 대한 구조좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때, 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 상기 아미노산에 대한 유사한 구조 좌표를 포함하는 컴퓨터 시스템. The method of claim 15, wherein the information further comprises amino acids Va1 ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His ⁷³ according to Table 1 or 2. , Structural coordinates for Ile ⁷⁴ , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ , Ile ¹⁰³ or the ratio of the atomic coordinates of Table 1 or Table 2 corresponding thereto. A computer system comprising similar structural coordinates for the amino acid, when superimposed on a hydrogen atom, comprising a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 kPa.

(a) HDM2를 약제에 노출시키고; (a) exposing HDM2 to a medicament;

(b) 상기 약제가 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 결합하는 것을 검출하여 잠재력을 평가하는 것을 포함하는 약제가 HDM2에 결합하는 잠재력을 평가하는 방법.(b) assessing the potential for binding of the agent to HDM2 by detecting the binding of the agent to HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ^82, and Arg ⁹⁷ .

제 17항에 있어서, 약제는 실질적인 화합물인 방법. The method of claim 17, wherein the medicament is a substantial compound.

(a) aa¹⁶-SEQ ID NO: 2를 약제에 노출시키고;(a) exposing aa ¹⁶ -SEQ ID NO: 2 to the agent;

(b) 약제가 aa¹⁶-SEQ ID NO: 2에 결합하는 레벨을 검출하여 잠재력을 평가하는 것을 포함하는 약제가 펩티드 aa¹⁶-SEQ ID NO: 2에 결합하는 잠재력을 평가하는 방법. method of assessing the potential for binding to 2: (b) the medicament is aa ¹⁶ -SEQ ID NO: ¹⁶ -SEQ ID NO medicament is a peptide aa, comprising assessing the potential to detect the level of binding to the second.

제 19항에 있어서, 약제는 실질적인 화합물인 방법. The method of claim 19, wherein the medicament is a substantial compound.

제 17항에 있어서, 단계 (a)는 화합물의 원자 구조를 HDM2의 3차원 구조에 비교하는 것을 포함하는 방법. 18. The method of claim 17, wherein step (a) comprises comparing the atomic structure of the compound to the three-dimensional structure of HDM2.

제 17항에 있어서, 비교는 컴퓨터적 수단을 사용하여 화합물과 HDM2의 적어도 하나의 결합 부위간의 적합성 조절을 수행하는 것을 포함하는 방법. 18. The method of claim 17, wherein the comparing comprises performing suitability control between the compound and at least one binding site of HDM2 using computer means.

제 22항에 있어서, 결합 부위는 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 구조 좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때, 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 상기 아미노산에 대한 유사한 구조 좌표에 의해 한정되는 방법.The binding site of claim 22, wherein the binding site has been superimposed on the non-hydrogen atom of the structural coordinates for the amino acids Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ according to Table 1 or Table 2 or corresponding atomic coordinates of Table 1 or Table 2 When defined by similar structural coordinates for the amino acid, including the mean square deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 ms.

제 23항에 있어서, 결합부위는 추가로 표 1 또는 표 2에 따른 아미노산 Va1⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶², Tyr⁶⁷, Gln⁷², His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰, Ile¹⁰³에 대한 구조 좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때, 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 상기 아미노산에 대한 유사한 구조 좌표에 의해 추가로 한정되는 방법.The method of claim 23, wherein the binding site is further amino acid Va1 ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His according to Table 1 or Table 2 Structural coordinates for ⁷³ , Ile ⁷⁴ , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ , Ile ¹⁰³ or their corresponding atomic coordinates in Table 1 or Table 2. And is further defined by similar structural coordinates for said amino acid, when superimposed on a non-hydrogen atom, comprising a square mean deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 ms.

제 17항에 있어서, 약제는 결정성 SEQ ID NO: 2에 노출되고 단계 (b)의 검출은 약제-SEQ ID NO: 2 착물의 3차원 구조를 결정하는 것을 포함하는 방법. The method of claim 17, wherein the medicament is exposed to crystalline SEQ ID NO: 2 and the detection of step (b) comprises determining the three-dimensional structure of the drug-SEQ ID NO: 2 complex.

(a) 작은 분자 저해제와 동시결정화된 HDM2의 3차원 구조를 사용하여 상기 잠재력있는 작용제 또는 길항제를 설계하거나 선택하는 것을 포함하는 HDM2에 대한 잠재력있는 작용제 또는 길항제를 확인하는 방법. (a) A method for identifying potential agonists or antagonists for HDM2 comprising designing or selecting the potential agonists or antagonists using the three-dimensional structure of HDM2 co-crystallized with small molecule inhibitors.

제 26항에 있어서, 3차원 구조는 표 1 또는 표 2의 좌표 또는 상당하는 표 1 또는 표 2의 원자 좌표의 비수소 원자에 중첩되었을 때, 1.5Å보다 작은 비-수소 원자의 제곱 평균 편차를 포함하는 유사한 구조 좌표에 의해 특성화된 원자 구조에 상당하는 방법. 27. The method of claim 26, wherein the three-dimensional structure, when superimposed on the non-hydrogen atoms of the coordinates of Table 1 or Table 2 or the corresponding atomic coordinates of Table 1 or Table 2, exhibits a squared mean deviation of non-hydrogen atoms of less than 1.5 ms. A method corresponding to an atomic structure characterized by similar structural coordinates comprising.

제 26항에 있어서, 추가로27. The method of claim 26, further

(b) 잠재력있는 작용제 또는 길항제를 합성하고;(b) synthesize a potential agent or antagonist;

(c) 잠재력있는 작용제 또는 길항제와 HDM2의 접촉 단계를 포함하는 방법. (c) contacting HDM2 with a potential agent or antagonist.

(a) HDM2의 결정에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻고;(a) obtaining x-ray diffraction data for the crystals of HDM2;

(b) HDM2 및 저해제의 착물에 대한 엑스레이 회절 자료를 얻으며;(b) obtaining x-ray diffraction data for the complexes of HDM2 and the inhibitor;

(c) 단계 (a)에서 얻은 엑스레이 회절 자료를 단계 (b)에서 얻은 엑스레이 회절 자료에서 차감하여 엑스레이 회절 자료의 차이를 얻고;(c) subtract the x-ray diffraction data obtained in step (a) from the x-ray diffraction data obtained in step (b) to obtain a difference in the x-ray diffraction data;

(d) 단계 (a)에서 얻은 엑스레이 회절 자료에 상당하는 위상을 얻으며;(d) obtain a phase corresponding to the x-ray diffraction data obtained in step (a);

(e) 단계 (d)에서 얻은 위상 및 단계 (c)에서 얻은 엑스레이 회절 자료의 차를 사용하여 저해제의 푸리에 이미지 차이를 계산하고;(e) calculating the Fourier image difference of the inhibitor using the difference between the phase obtained in step (d) and the x-ray diffraction data obtained in step (c);

(f) 단계 (e)에서 얻은 계산에 기반하여 HDM2에 대한 저해제의 부착 부위를 위치시키는 것을 포함하는 HDM2에 대하여 저해제의 부착 부위를 위치시키는 방법. (f) positioning the site of attachment of the inhibitor to HDM2 comprising positioning the site of attachment of the inhibitor to HDM2 based on the calculation obtained in step (e).

(a) HDM2 및 저해제를 포함하는 결정을 얻고;(a) obtaining a crystal comprising HDM2 and an inhibitor;

(b) 결정의 원자 좌표를 얻으며;(b) obtaining atomic coordinates of the crystal;

(c) 원자 좌표와 하나 이상의 분자 모델링 기술을 사용하여 HDM2와 저해제의 상호작용을 어떻게 변형할지를 결정하고;(c) determine how to modify the interaction of HDM2 with the inhibitor using atomic coordinates and one or more molecular modeling techniques;

(d) 단계 (c)에서 얻은 결정에 기반하여 저해제를 변형하여 변형된 저해제를 생성하는 것을 포함하는 변형된 저해제를 얻는 방법. (d) modifying the inhibitor based on the crystals obtained in step (c) to produce a modified inhibitor.

제 30항에 있어서, 상기 결정은 SEQ ID NO: 2를 가진 펩티드; SEQ ID NO: 3을 가진 펩티드; 및 SEQ ID NO: 4를 가진 펩티드로 구성된 그룹에서 선택된 펩티드를 포함하는 방법. 31. The method of claim 30, wherein said crystal is selected from the group consisting of a peptide having SEQ ID NO: 2; Peptide with SEQ ID NO: 3; And a peptide selected from the group consisting of peptides having SEQ ID NO: 4.

제 30항에 있어서, 상기 하나 이상의 분자 모델링 기술은 그래픽 분자 모델링 및 계산화학으로 구성된 그룹에서 선택되는 방법. 31. The method of claim 30, wherein the one or more molecular modeling techniques are selected from the group consisting of graphical molecular modeling and computational chemistry.

제 30항에 있어서, 단계 (a)는 저해제의 HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에 대한 상호작용을 검출하는 것을 포함하는 방법. The method of claim 30, wherein step (a) comprises detecting the interaction of the inhibitor against the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ^82, and Arg ⁹⁷ .

제 30항의 방법에 의해 확인되는 HDM2 저해제. An HDM2 inhibitor identified by the method of claim 30.

HDM2 아미노산 잔기 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷의 구조 좌표에 의해 한정된 활성부위 또는 결합주머니를 포함하는 분리된 단백질 단편.An isolated protein fragment comprising an active site or a binding bag defined by the structural coordinates of the HDM2 amino acid residues Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ .

고체 지지대에 연결된 제 35항의 분리된 단편. The isolated fragment of claim 35 connected to a solid support.

제 35항의 단편을 코딩한 분리된 핵산 분자.An isolated nucleic acid molecule encoding the fragment of claim 35.

제 37항의 핵산 분자를 포함하는 벡터. A vector comprising the nucleic acid molecule of claim 37.

제 38항의 벡터를 포함하는 숙주 세포. A host cell comprising the vector of claim 38.

단편이 발현되는 조건하에서 제 39항의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 단백질 단편을 제조하는 방법. A method of making a protein fragment, comprising culturing the host cell of claim 39 under conditions in which the fragment is expressed.

(a) 제 35항의 단백질 분자 단편을 약제에 노출시키고;(a) exposing the protein molecule fragment of claim 35 to a medicament;

(b) 단편에 대한 약제의 결합 레벨을 검출하는 것을 포함하는, HDM2와 결합하는 약제에 대한 스크리닝 방법. (b) A method for screening for a drug that binds to HDM2, comprising detecting the level of binding of the drug to the fragment.

제 35항의 단백질 분자 단편을 포함하는 키트. A kit comprising the protein molecule fragment of claim 35.

(a) HDM2 폴리펩티드와 상기 리간드를 PEG 및 NaSCN을 포함하는 적절한 용액중 접촉시키고;(a) contacting the HDM2 polypeptide with the ligand in a suitable solution comprising PEG and NaSCN;

(b) 상기 용액에서 수득된 상기 HDM2 폴리펩티드-리간드의 착물을 결정화하는 것을 포함하는 HDM2 폴리펩티드-리간드의 결정 착물을 제조하는 방법. (b) crystallizing the complex of the HDM2 polypeptide-ligand obtained in the solution.

제 43항에 있어서, 상기 HDM2 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2를 갖는 폴리펩티드인 방법. 44. The method of claim 43, wherein said HDM2 polypeptide is a polypeptide having SEQ ID NO: 2.

제 43항에 있어서, 상기 PEG는 100-1000 범위의 평균 분자량을 갖고, 여기에서 상기 PEG는 약 0.5% w/v - 약 10% w/v 범위로 용액에서 존재하고, 상기 NaSCN은 약 50mM - 약 150mM 범위로 용액에서 존재하는 방법. The method of claim 43, wherein the PEG has an average molecular weight in the range of 100-1000, wherein the PEG is present in solution in the range of about 0.5% w / v-about 10% w / v, and the NaSCN is about 50 mM- Present in solution in the range of about 150 mM.

제 45항에 있어서, 상기 PEG는 약 400의 평균 분자량을 갖고, 용액에서 약 2% w/v에 존재하고 상기 NaSCN은 용액에서 약 100mM에 존재하는 방법. 46. The method of claim 45, wherein the PEG has an average molecular weight of about 400, at about 2% w / v in solution and the NaSCN is at about 100 mM in solution.

제 46항에 있어서, 상기 용액은 추가로 1.8 - 2.4M (NH₄)₂S0₄ 및 약 100mM 완충제를 포함하는 방법. The method of claim 46, wherein the solution further comprises 1.8-2.4M (NH ₄ ) ₂ SO ₄ and about 100 mM buffer.

잠재력있는 저해제에 의해 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO:4로 구성된 그룹에서 선택된 서열을 포함하는 펩티드를 결정화하는 것을 포함하는 제 1항의 결정을 제조하는 방법. Preparing a crystal of claim 1 comprising crystallizing a peptide comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 by a potential inhibitor How to.

a) 표 1 또는 표 2에 따른 좌표 구조에 의해 한정된 HDM2의 3차원 구조를 사용하고;a) using the three-dimensional structure of HDM2 defined by the coordinate structure according to Table 1 or Table 2;

b) 상기 3차원 구조중의 Ser¹⁷, Ile¹⁹, Leu⁸² 및 Arg⁹⁷에서 선택된 하나 이상의 HDM2 아미노산을 다른 아미노산과 대체하여 변형된 HDM2를 생성하며;b) replacing one or more HDM2 amino acids selected from Ser ¹⁷ , Ile ¹⁹ , Leu ⁸² and Arg ⁹⁷ in the three-dimensional structure with other amino acids to produce a modified HDM2;

c) 상기 3차원 구조를 사용하여 상기 잠재력있는 저해제를 설계하거나 선택하고;c) design or select the potent inhibitor using the three-dimensional structure;

d) 상기 잠재력있는 저해제를 합성하며;d) synthesizing said potential inhibitors;

e) 상기 잠재력있는 저해제의 능력을 시험하기 위한 기질의 존재중 상기 잠재력있는 저해제를 변형된 HDM2와 접촉시켜 HDM2 또는 상기 변형된 HDM2를 저해하는 것을 포함하는 HDM2의 잠재력있는 저해제를 확인하는 방법. e) identifying a potential inhibitor of HDM2 comprising contacting the potential inhibitor with modified HDM2 in the presence of a substrate to test the ability of the potential inhibitor to inhibit HDM2 or the modified HDM2.

제 49항에 있어서, 상기 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하는 것은 추가로 Val⁵³, Leu⁵⁴, Phe⁵⁵, Leu⁵⁷, Gly⁵⁸, Gln⁵⁹, Ile⁶¹, Met⁶², Tyr⁶⁷, Gln⁷², His⁷³, Ile⁷⁴, Val⁷⁵, Phe⁸⁶, Phe⁹¹, Val⁹³, Lys⁹⁴, Glu⁹⁵, His⁹⁶, Ile⁹⁹, Tyr¹⁰⁰, 및 Ile¹⁰³로 구성된 그룹에서 선택되는 SEQ ID NO: 2 아미노산을 대체하는 것을 포함하는 방법. 50. The method of claim 49, wherein replacing the one or more amino acid residues further comprises Val ⁵³ , Leu ⁵⁴ , Phe ⁵⁵ , Leu ⁵⁷ , Gly ⁵⁸ , Gln ⁵⁹ , Ile ⁶¹ , Met ⁶² , Tyr ⁶⁷ , Gln ⁷² , His ⁷³ , And replacing SEQ ID NO: 2 amino acids selected from the group consisting of Ile ⁷⁴ , Val ⁷⁵ , Phe ⁸⁶ , Phe ⁹¹ , Val ⁹³ , Lys ⁹⁴ , Glu ⁹⁵ , His ⁹⁶ , Ile ⁹⁹ , Tyr ¹⁰⁰ , and Ile ¹⁰³ . How to.

제 49항에 있어서, 상기 잠재력있는 저해제는 데이터베이스에서 선택되는 방법. The method of claim 49, wherein the potent inhibitor is selected from a database.

제 49항에 있어서, 상기 잠재력있는 저해제는 새로(de novo)로 설계되는 방법. The method of claim 49, wherein the potent inhibitor is designed de novo.

제 49항에 있어서, 상기 잠재력있는 저해제는 공지된 저해제로부터 설계되는 방법. The method of claim 49, wherein the potent inhibitor is designed from known inhibitors.

제 49항에 있어서, 잠재력있는 저해제를 설계하거나 선택하기 위해 상기 3차원 구조를 사용하는 상기 단계는:The method of claim 49, wherein using the three-dimensional structure to design or select potential inhibitors comprises:

a) 변형된 HDM2와 결합할 수 있는 화학적 실체 또는 단편을 확인하고;a) identifying chemical entities or fragments capable of binding to the modified HDM2;

b) 확인된 화학적 실체 또는 단편을 단일 분자내로 조립하여 상기 잠재력있는 저해제의 구조를 제공하는 단계를 포함하는 방법. b) assembling the identified chemical entity or fragment into a single molecule to provide the structure of said potential inhibitor.

제 49항에 있어서, 잠재력있는 저해제는 SEQ ID NO: 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)의 경쟁 억제제인 방법. The method of claim 49, wherein the potent inhibitor is a competition inhibitor of SEQ ID NO: 4 (Gly ¹⁶ -SEQ ID NO: 2).

제 49항에 있어서, 상기 잠재력있는 저해제는 SEQ ID NO: 4(Gly¹⁶-SEQ ID NO: 2)의 무경쟁 또는 비경쟁 억제제인 방법. 50. The method of claim 49, wherein the potent inhibitor is a non-competitive or non-competitive inhibitor of SEQ ID NO: 4 (Gly ¹⁶ -SEQ ID NO: 2).

제 49항의 방법에 의해 확인되는 저해제.Inhibitors identified by the method of claim 49.