KR20060108284A - 장구채 추출물을 포함하는 간 기능 개선 및 간질환 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선 및 간질환 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 본 발명의 장구채 또는 울릉 장구채 추출물은 AST 및 ALT 활성을 저해할 뿐만 아니라 간 조직내의 섬유화로 인하여 축적된 콜라겐, 알파 스므스 머슬 액틴(alpha-smooth-muscle actin) 및 TGF-β의 양을 유의성 있게 억제하여 간질환의 예방 및 치료에 유용한 약제 및 건강기능 식품으로서 이용할 수 있다.
장구채, 울릉장구채, 추출물, 간기능, 간섬유증, 간경화, 의약품, 건강보조식품
Description
도 1은 본 발명의 장구채 추출물의 간 기질세포 및 간 섬유화 유발세포에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 2는 본 발명의 울릉 장구채 추출물의 간 기질세포 및 간 섬유화 유발세포에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 3은 본 발명의 장구채 추출물의 알파 스므스 머슬 액틴에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 4는 실험예 2-1에서의 본 발명의 추출물의 GOT 및 GPT에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 5는 실험예 2-2에서의 본 발명의 추출물의 조직내 콜라겐 축적에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 6은 실험예 2-2에서의 본 발명의 추출물의 간 조직 섬유화도에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 7은 실험예 2-3에서의 본 발명의 추출물의 알파 스므스 머슬 액틴에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 8은 실험예 3-2에서의 본 발명의 추출물의 간 조직 섬유화도에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 9는 실험예 3-2에서의 본 발명의 추출물의 콜라겐의 발현에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 10은 실험예 3-3에서의 본 발명의 추출물의 알파 스므스 머슬 액틴에 대한 영향을 나타낸 도면이고,
도 11은 실험예 3-4에서의 본 발명의 추출물의 TGF-β mRNA에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 간 기능 개선 및 간질환의 치료용 의약조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 보다 상세하게는 AST와 ALT 활성 저해 및 콜라겐, 알파 스므스 머슬 액틴 및 TGF-β에 대한 억제효과를 갖는 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선 및 간 질환 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.
[종래기술]
간은 지속적으로 효소반응 및 에너지 대사가 일어나는 생체기관으로 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질 대사과정에서 중추적인 역할을 담당한다. 또한, 간 은 인체 내 소화기계와 전신순환계 사이에 위치함으로써 외부로부터 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있다. 따라서 일단 생체 내로 들어온 생체 외 물질이 간을 통과하는 까닭에 간은 영양소 이외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 그만큼 손상될 확률도 다른 장기에 비해 높다. 간은 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상의 경우에는 충분히 정상으로 회복된다. 그러나 지속적으로 손상될 경우 간 조직의 일부가 완전히 파괴되면서 파괴된 부분이 정상으로 회복되지 못하고 결합조직이 과다 축적되게 된다. 이에 따라 간 조직에 흉터가 형성되고 간 기능이 정상으로 회복되지 못하는 상태가 된다. 간 손상이 만성이 되면 그 원인에는 상관없이 결국에 간 섬유화 및 경화가 초래된다.
간 섬유화 또는 간경화는 알코올의 과다섭취, 화학물질의 남용, 바이러스성 간염, 답즙 분비 정지 등에 의해 발생되는데, 초기단계에는 통증이나 자각증세가 나타나지 않고 말기에서야 발견되기 때문에 그 치료가 쉽지 않으며, 사망률이 높아 사회적인 문제가 되고 있다.
간 섬유화는 간염 등 만성 간염에 수반되는 생체적응 반응의 일부로서 손상된 간 조직이 정상적인 간 세포로 복구되는 것이 아니라 콜라겐과 같은 섬유조직으로 변형되는 상태를 말한다. 간 섬유화는 조직손상의 복구과정에서 발생하는 생체 적응 반응이지만 물질 대사 및 담즙 분비 등의 고유 기능을 전혀 수행할 수 없는 섬유조직으로 간 조직을 대체시키므로 필연적으로 간 기능 저하가 나타난다. 또한 이 같은 간 섬유화는 결합조직의 합성 및 분해과정의 균형이 상실된 상태로서 그 결과 간 조직 내에 결합조직이 과다하게 축적되어 발생하며, 괴사나 염증이 동반된 다(Popper, Leber Magen Darm, 8, 65, 1978; Schuppan et al., Z. Gastro., 26 Suppl. 3, 28, 1988). 성상세포의 발현은 모든 형태의 간 손상 시에 나타나는 중요한 특징이다. 특히 간 섬유화 시 성상세포가 활성화되어 알파 스므스 머슬 액틴(α-smooth muscle actin: α-SMA)의 발현을 증가시킨다. 현재 간 섬유화 치료제의 개발에 관한 약물은 성상세포의 활성을 억제하는데 초점을 두고있다.
간 섬유화를 억제하는 약물로 페니실라민, 16,16-디메틸프로스타글라딘 E2, 비페닐 디메틸 디카르복실산, 콜키친, 글루코코르티코이드, 말로틸레이트(malotilate), 감마 인터페론, 펜톡시필린, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디에틸아미드, 피리딘-2,4-디카르복실릭-디(2-메톡시에틸)아미드 등이 보고되었으나, 임상에 적용 시 작용이 미약하거나 부작용이 심하다.
최근 간 조직내의 대식 쿠퍼(Kupffer) 세포와 이토세포에서 유리되는 사이토카인인 TGF-β(transforming growth factor-beta)가 간 섬유화의 중요 매개물로 밝혀졌다. 또한 TGF-β의 항체, 안티센스 RNA, 세포 TGF-β 수용체 변형을 통하여 TGF-β의 작용을 차단하였을 때에는 간 섬유화 과정이 현저하게 억제되는 것으로 보고되었다. 그러나 이러한 연구는 실험적 차원에서 수행된 것일 뿐 현재까지 실제로 임상적으로 활용되는 약물은 없는 실정이다.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 간 보호 및 간 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있으면서 간 독성은 없는 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식 품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 AST와 ALT 활성 저해 및 콜라겐, 알파 스므스 머슬 액틴 및 TGF-β에 대한 억제효과를 나타내어 간 기능 개선 및 간 질환의 치료제로 사용 가능한 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물에 관한 것이다.
상기 장구채(Melandryum firmum)는 석죽과 식물로 2년생 약초로 꽃필 무렵 (봄, 여름)에 잎과 줄기를 사용한다. 한방에서는 왕불류행으로 불리며, 혈액순환에 효능이 있고, 생리불순, 생리통, 유즙분비 부족 등에 사용되어 왔다. 특별히 여성호르몬의 분비 문제로 월경이 안 되거나, 월경통이 심할 때 효과가 있으며, 천산갑과 함께 쓰면 여성의 유즙분비를 촉진하는 것으로 알려져 있다(본초강목).
울릉장구채(Silene takesimensis)는 상기 장구채와 동일한 석죽과에 속하는 식물로, 우리나라 울릉도의 바위에 나는 다년초이다. 울릉 장구채에 관해서 현재까지 밝혀진 약효는 없으며, 원예용과 관상용으로만 사용되고 있다(인용 문헌: 이창복, 1797, 대한 식물 도감, 향문사; 이우철,1996, 원색기준식물도감, 아카데미 서 적).
본 발명의 생약 추출물은 애기 장구채 및 털 장구채와 같은 장구채 및 울릉장구채 각각의 동속 식물로부터 유래된 생약 추출물도 포함할 수 있다.
본 발명에서의 장구채 또는 울릉장구채 추출물은 통상의 식물 추출물 제조방법으로 하여 제조되며, 바람직하게는 열수 추출, 용매 추출 또는 초음파 추출 등의 방법에 의해 제조된다.
장구채 또는 울릉 장구채의 추출부위는 식물체 전체, 줄기 또는 잎일 수 있으며, 바람직하게는 잎과 줄기이다. 상세하게는 장구채 또는 울릉 장구채 추출물은, 각각의 생약을 원료 그대로 또는 건조한 후, 세절 또는 분쇄하여 사용한다. 건조 시 장구채 또는 울릉장구채는 수분함량이 5% 이하가 되도록 건조하는 것이 바람직하며, 이를 세절 또는 분쇄하여 장구채 분말을 얻은 다음, 입자크기가 0.6mm 이하인 것을 선별하여 사용한다.
추출 시 추출용매로는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 상기 유기용매로는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 에틸아세테이트 등을 들 수 있으며, 알콜의 예로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 이소프로판올 및 프로판올을 들 수 있다.
보다 상세하게는, 장구채 또는 울릉 장구채 추출물은, 각각의 생약을 원료 그대로 또는 건조한 후, 세절 또는 분쇄한 후 세절물 또는 분쇄물의 총 중량의 약 5 내지 25배, 바람직하게는 5 내지 10배의 물, 유기용매 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(kg/L)로 혼합된 혼합용매로 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 1일 동안 용매추출 또는 초음파 추출 등의 방법에 의하여 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매에 따른 가용추출물을 추출하고, 감압농축 및 동결 건조하여 수득할 수 있다.
또한, 열수 추출할 경우 각각의 생약을 원료 그대로 또는 건조한 후, 세절 또는 분쇄한 후 세절물 또는 분쇄물 총 중량에 대해 약 5 내지 10배의 물을 첨가하고 90 내지 100℃, 바람직하게는 90 내지 95℃ 의 온도에서 1 내지 5 시간, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 추출하는 것이 바람직하다.
상기한 방법으로 제조된 것을 장구채 또는 울릉장구채 추출물이라 할 수 있으며, 이후 이들 추출물에 유기용매를 가하여 더욱 분획하여 분획물 형태로 제조할 수도 있다.
상기 장구채와 울릉장구채의 혼합 추출물의 경우, 장구채와 울릉장구채의 세절물 또는 분쇄물을 혼합한 후 추출하여 제조하여도 되고, 각각의 세절물 또는 분쇄물로부터 추출물을 추출한 후 혼합하여도 무방하다. 혼합비에 있어서도 특별히 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 제법으로 얻어지고 간 기능 개선 및 간 질환의 치료에 효과적인 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물을 제공한다.
본 발명에서는 일 실시 예로 장구채 및 울릉장구채 추출물을 열수 추출 및 에탄올 추출에 의해 제조하였으며, 간 질환 모델 동물을 사용하여 본 발명의 추출물에 의한 효능을 확인하였다.
실험결과, 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물은 사 염화탄소에 의해 손상되어 섬유화된 간에서의 ALT 및 AST 효소 활성을 억제하여 손상된 간을 회복시켰으며, 간 기질세포에는 영향을 주지 않으면서 간 섬유화 세포만을 억제하고, 또한 간 조직내의 섬유화로 인하여 축적된 콜라겐, 알파 스므스 머슬 액틴 및 TGF-β 양의 감소를 통해 섬유화를 회복시켰다. 또한 이 같은 효과는 농도 의존적으로 향상되었다.
또한 간염 유발 마우스의 간에 있어서도 GOT 및 GPT 함량을 현저히 감소시키고, 조직 내 섬유화 세포의 분포 및 성장을 억제하였다.
이에 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물은 간 기능 개선 및 간질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 이러한 간 질환으로는 급만성 간염, 간 섬유화, 간경화, 간암이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하고, 간 질환 치료 및 예방에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나의 추출물을 0.1 내지 80중량%, 바람직하게는 1 내지 50중량%로 포함한다. 추출물의 함량이 0.1중량% 미만일 경우 상기 추출물에 의한 간 질환 치료 및 예방 효과가 미비하여 다량의 투여량을 처리하여야 하며, 80중량%를 초과할 경우 효과 대비 비경제적일 수 있다. 그러나 가장 바람직한 추출물의 유효함량은 조성물의 사용방법 및 목적에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물 외에 약학적으로 허용 가능한 다른 생약 추출물을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 간 기능 개선 효과를 갖는 것으로 알려진 마과, 옻나무, 고들빼기, 헛개나무, 호깨나무, 칡꽃, 팥꽃, 쥐눈이콩, 뽕잎, 오디, 팥, 녹두, 창포 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 장구채 또는 울릉 장구채 추출물을 포함하는 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 좌제 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물을 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 사용할 수 있다. 또한 제형이 연질 캡슐제의 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올이 사용 가능 하다. 용액 또는 시럽 형태의 경우에는 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등이 사용될 수 있다. 좌약용 담체로는 천연 오일 또는 경화된 오일, 왁스, 지방, 액체 폴리올 등이 사용 가능 하다.
본 발명의 약학 조성물은 상기의 담체외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여 될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여경로에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 5 내지 500mg/kg의 양, 바람직하게는 100 내지 250mg/kg의 양을 일일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 장구채 추출물, 울릉장구채 추출물 또는 이들의 혼합 추출물의 우수한 간 섬유화 억제 및 간 조직 보호효과로 간 섬유화 및 간경화의 진행 억제 효과를 제공할 뿐만 아니라 약물에 의한 독성 및 부작용도 거의 없어 치료 목적뿐만 아니라 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기재된 간 기능 개선 효과를 갖는 장구채 및 울릉 장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 추출물을 포함하는 건강기능식품으로는 간 기능 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등을 들 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민복합체, 건강보조 식품류 등을 들 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태로 사용할 수 있다.
이때, 식품 또는 음료중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 50중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 본 발명의 추출물과 함께 식품학적으로 허용가능한 식 품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 건강음료 조성물은 지시된 비율로 필수성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체 성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당 등의 모노사카라이드; 과당 등의 디사카라이드; 말토오스, 슈크로오스 등의 폴리사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 당; 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 들 수 있다. 상술한 것 외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 바우디오시드A, 글리시르히진(glycyrrhizin) 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스프르탐 등)을 사용할 수도 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
또한 상기 외 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그다지 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 100중량부당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택하는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위 한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 장구채 추출물 제조
장구채 분말 10g에 에탄올 100mL를 첨가 후 실온에서 24시간 유기 용매 추출 후 여과하고, 동결 건조하여 분말 상태의 장구채 추출물 120mg을 수득하였다.
실시예
2.
울릉장구채
추출물 제조
울릉 장구채 분말 10g에 증류수 100mL를 가하고 95℃에서 3시간 열수 추출 후 여과하고 동결 건조하여 분말 상태의 울릉 장구채 추출물 240mg을 수득하였다.
실시예
3. 장구채와
울릉장구채의
혼합 추출물 제조
장구채 분말 5g에 울릉장구체 분말 5g을 혼합하고 에탄올 100mL를 첨가 후 실온에서24 시간 유기 용매 추출 후 여과한 뒤 동결 건조하여 분말 상태의 혼합 추출물 100mg을 수득하였다.
참조예
1. 실험동물 및 처리
1) 시약
사염화탄소 (CCl4), 올리브유, 시리우스-레드(Sirius-red) 염색 및 페스트 그린(Fast Green) FCF 시약은 씨그마(Sigma Chemical co)사의 제품을 사용하였으며, 알파 스므스 머슬 액틴 항체는 산타크루즈사(Santa Cruz사) 제품을 사용하였다. 또한 혈청 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT)와 아스파레이트 아미노 트랜스퍼라제 (AST)의 측정을 위하여 영동제약의 ALT, AST 혈청 분석용 키트를 사용하였다.
2) 동물
실험동물은 생후 8-10주된 25-30g의 실험용 마우스 (BAlb/c)를 사용하였다. 사료(폴라스, 한라 사료)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21-24℃, 상대습도는 40-80%로 유지하였다. 또한 12시간마다 낮과 밤이 반복되도록 빛을 조절하였다.
각 실험군당 마우스는 8-10마리를 사용하였다.
실험예
1. In
vitro 에서의
장구채 또는
울릉장구채
추출물의 간 섬유화 치유 효능
상기 실시예 1및 2에서 제조된 추출물의 간 섬유화 치유 효능을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.
1-1) 간 섬유화 유발세포의 성장 억제 효능
간 기질 세포(Chang cell, ATCC) 및 간 섬유화 세포(Ito cell, Health Science Research Resourse Bank, Japan))에 상기 실시예 1의 추출물을 20㎍/ml 처리한 후 본 발명의 추출물의 간 기질세포 및 간 섬유화 유발세포에 미치는 영향을 실험하였다. 간 기질세포를 대조군 1로서 사용하였다. 실험결과는 도 1에 나타내었다.
도 1의 a)는 아무 처치도 하지 않은 대조군 1에서의 실험결과이며, b)는 본 발명의 실시예 1의 추출물을 처리한 실험군 1에서의 간 기질 세포 및 간 섬유화 세포의 변화를 나타낸 것이다.
실험결과 대조군 1과 비교하여 본 발명의 추출물을 처리한 실험군 1은 간 기질 세포에 아무런 영향을 주지 않지만 이미 섬유화가 진행된 세포인 간 섬유화 세 포에 처리한 경우 섬유화된 세포의 변화가 유도되었다. 이로부터 본 발명의 추출물은 간 섬유화 세포의 성장만을 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, 정상적인 간 기질 세포에 추출물을 다량 처리하여도 정상세포의 죽음이나 기타 다른 변화가 관찰되지 않은바, 이로부터 본 발명의 추출물이 세포독성이 없다는 확인할 수 있었다.
실시예 2의 추출물을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 처리하여 본 발명의 울릉 장구채 추출물의 간 기질세포 및 간 섬유화 유발세포에 미치는 영향을 실험하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2의 a)는 아무 처치도 하지 않은 대조군 2에서의 실험결과이며, b)는 본 발명의 실시예 2의 추출물을 처리한 실험군 2에서의 간 기질 세포 및 간 섬유화 세포의 변화를 나타낸 것이다.
장구채 추출물 처리시와 동일한 결과를 확인할 수 있었다.
1-2) 간 섬유화 유발 세포(
HSC
)의 변형 효과
간 섬유화 세포는 알파 스므스 머슬 액틴 단백질을 발현한다. 본 발명의 추출물이 간 섬유화 유발물질인 알파 스므스 머슬 액틴에 미치는 영향을 실험하였다.
상기 1-1)의 실험에서 실험된 세포로부터 단백질 샘플을 얻고 웨스턴 블라팅을 실시하여 알파 스므스 머슬 액틴을 확인 하였습니다. 현재 섬유화를 억제하는 물질로 알려져 있는 피르페리돈(pirferidone)을 각각 0.1μM 및 1μM 처리한 경우를 각각 비교군 1 및 2로 하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 a)는 아무 처리도 하지 않은 대조군 1을, b)는 피르페리돈 0.1μM을 처리한 비교군 1을, c)는 피르페리돈 1μM을 처리한 비교군 2를, d)는 실시예 1 의 추출물 20ug/ml 을 처리한 실험군 1에서의 알파 스므스 머슬 액틴에 대한 영향을 나타낸 결과이다.
도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실험결과로부터 본 발명의 추출물 처리에 의하여 알파 스므스 머슬 액틴의 발현이 감소한 것은 이들 추출물이 섬유화 세포 사멸을 유발한 것이 아니라 세포성질의 전환분화(trans-differentiation)을 유도한 것임을 알 수 있다.
실험예
2. 장구채 또는
울릉장구채
추출물의 간염 및 간 섬유화 치유 효능
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 추출물의 간염 및 간섬유화 치유 효능을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 하였다
Balb/c 8-10 주령 수컷 마우스 실험군 당 8-10마리에 간 독성 물질인 사염화탄소(CCl4)를 2주간 주 일회씩 2회 투여하여 간염 및 간 섬유화를 유도하였으며, 투여 후 2일째에 증류수, 실시예 1의 추출물, 및 실리마린(silymarin) 용액을 각각 12일간 경구 투여한 후 12일째 오후에 치상하여 혈액 및 간 조직 샘플을 제작하고, 혈액 및 간 조직 샘플을 제작하고 간염 및 간 섬유화 정도를 분석하였다.
2-1) GOT 및 GPT 측정
혈청중에서의 GOT(Glutamyl oxaloacetic transminase) 및 GPT(Glutamyl pyruvic transminase) 수치변화를 측정하여 간염의 징후 변화를 측정하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
아무것도 투여하지 않은 군을 음성 대조군 3으로 하였으며, 사염화탄소 (CCl4) 처리후 증류수를 처리한 군을 양성 대조군 3으로 하였다. 또한 실시예 1의 추출물을 40mg/mouse의 농도로 투여한 군을 실험군 3로 하였으며, 비교군 3으로는 현재 감염치료제로 사용되고 있는 실리마린(silymarine)을 마우스당 30mg/kg의 농도로 처리하였다.
GOT 및 GPT는 각각 아스파라긴산 분해효소와 알라닌 분해효소의 수치를 의미하며, 간에 문제가 생겨 간 세포가 파괴되면 이 성분이 혈액속으로 많이 유입되어 검출됨으로써 간 세포 괴사를 민감하게 반영해준다. 0 내지 40UI는 정상을 나타내며, 40 내지 60UI는 정상 범위이며, 60 내지 300UI는 만성염증을, 300UI는 간세포가 파괴되었음을 나타낸다.
실험결과 도 4 에 나타난 바와 같이, 본 발명의 추출물을 처리한 마우스(실험군 3)에서는 현저하게 GOT 및 GPT 수치가 감소되어 효과적으로 간염에 사용될 수 있음을 확인하였다.
2-2) 조직 내 콜라겐 함량의 비교 및 조직 염색
간 조직을 시리우스 레드(sirius red)로 염색하여 콜라겐의 축적을 분석하고 간염 및 간 섬유화도의 치유정도를 확인하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5는 간염 유발 마우스에서의 본 발명의 추출물의 조직내 콜라겐 축적에 대한 영향을 나타낸 도면으로, a)는 음성 대조군 3의 조직사진, b)는 사염화탄소를 처리한 직후의 조직사진, c)는 사염화탄소 처리 후 증류수를 처리한 양성 대조군 3 의 조직사진, d) 비교군 3의 조직사진 및 e)는 실험군 3의 조직사진이다.
또한, 도 6는 간염 및 간섬유화 유발 마우스에서의 본 발명의 추출물의 간 조직 섬유화도(콜라겐 함량)에 대한 영향을 나타낸 도면이다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이 실험결과, 콜라겐 염색에 의한 마우스 간 조직의 섬유화를 살펴보았을 때에도 양성 대조군 3 및 비교군 3에 비해 실시예 1의 추출물을 투여한 실험군 3에서는 간 섬유화가 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
2-3) 조직 내 알파
스므스
머슬
액틴
양의 비교
알파 스므스 머슬 액틴의 양은 웨스턴 블럿을 실시하여 감광필름의 감광도를 비교하여 확인하였다. 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7은 간염 및 간섬유화 유발 마우스에서의 본 발명의 추출물의 알파 스므스 머슬 액틴에 대한 영향을 나타낸 도면으로, 도 7에 나타난 바와 같이, 사염화탄소 처리군(양성 대조군 3)과 실시예 1의 추출물을 처리한 실험군 3에서의 알파 스므스 머슬 액틴의 양을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과 실험군 3에서는 밴드가 거의 확인되지 않았다.
실험예
3. 장구채 또는
울릉장구채
추출물의 간 섬유화 치유 효능
Balb/c 8-10 주령 수컷 마우스(실험군 당 8-10마리)에 간 독성 물질인 사염화탄소(CCl4)를 올리브오일과 1:1로 혼합하여 마우스 당 100μl씩 1주 간격으로 5회 경구 투여하여 간 섬유화를 유도하였다. 사염화탄소의 투여완료 후, 하기 표 1에 기재된 용량으로 증류수, 실시예 1 또는 2의 추출물, 및 실리마린(silymarin) 용액을 각각 5일간 경구 투여하였다. 5일째 오후에 치상하여 혈액 및 간 조직 샘플을 제작하고 간 섬유화 정도를 분석하였다.
3-1) 혈중 ALT 및
AST
의 비교
혈청 중에서는 ALT(Alanine aminotransferase) 및 AST(Aspartate aminotransferase) 효소를 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
이때 아무것도 투여하지 않은 군을 음성 대조군 4으로 하였으며, 사염화탄소(CCl4) 처리후 증류수를 처리한 군을 양성 대조군 4로 하였다. 또한 실시예 1 및 2에서의 추출물을 각각 10mg/mouse 및 40mg/mouse의 농도로 투여한 군을 실험군 4 내지 7로 하였으며, 비교군 4로는 현재 감염치료제로 사용되고 있는 실리마린(silymarine)을 마우스 당 50mg/kg의 농도로 처리하였다.
처리시약 | 혈중 AST | 혈중 ALT | |
음성대조군 4 | - | 22.1±7.7 | 14.3±3.8 |
양성대조군 4 | CCl4 + 증류수 | 71.2±5.9 | 109.2±10.6 |
실험군 4 | CCl4 + 실시예1 추출물 (10mg/mouse) | 63.2±10.2 | 101.3±7.8 |
실험군 5 | CCl4 + 실시예1 추출물 (40mg/mouse) | 58.5±9.7 | 79.2±13.2 |
실험군 6 | CCl4 + 실시예2 추출물 (10mg/mouse) | 69.3±8.9 | 102.8±10.2 |
실험군 7 | CCl4 + 실시예2 추출물 (40mg/mouse) | 58.2±9.8 | 88.2±5.8 |
비교군 4 | CCl4 + 실리마린(50mg/kg) | 66.7±8.4 | 90.1±6.9 |
실험결과, 상기 표 1에 나타난 바와 같이 실시예 1 및 2의 추출물을 처리한 실험군 4 내지 7은 모두 양성대조군 4에 비하여 혈중 AST 및 ALT 양이 감소되었으며, 그 감소량은 처리된 추출물의 양에 농도의존적이었다.
3-2) 조직 내 콜라겐 함량의 비교 및 조직 염색
간 조직을 시리우스 레드(sirius red)로 염색하여 조직내 콜라겐을 정량하고, 이로부터 간 섬유화 치유 정도를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 8에 나타내었다.
처리시약 | 조직 내 콜라겐 함량 (㎍)/총 단백질량(mg) | |
음성대조군 4 | - | 15±3.3 |
양성 대조군 4 | CCl4 +증류수 | 29±3.2 |
실험군 4 | CCl4 + 실시예1 추출물 (10mg/mouse) | 23±4.7 |
실험군 5 | CCl4 + 실시예1 추출물 (40mg/mouse) | 17±2.5 |
실험군 6 | CCl4 + 실시예2 추출물 (10mg/mouse) | 26±4.3 |
실험군 7 | CCl4 + 실시예3 추출물 (40mg/mouse) | 19±3.2 |
비교군 4 | CCl4 + 실리마린 (50mg/kg) | 27±4.0 |
표 2 및 도 8로부터 알 수 있듯이 양성 대조군 4에서는 29㎍/mg의 조직 내 콜라겐 침착이 확인되었다. 반면에 실시예 1 또는 2의 추출물을 투여한 실험군 4 내지 7에서는 간 조직 내 침착된 콜라겐 함량이 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다.
도 9는 간 섬유화 유발 마우스에서의 본 발명의 추출물의 콜라겐의 발현에 대한 영향을 나타낸 도면으로, a)는 정상 마우스 간 세포조직(음성대조군 4), b)는 양성 대조군 4, c)는 실험군 4, d)는 실험군 5, e)는 실험군 6, 및 f)는 실험군 7에서의 실험 결과를 나타낸다.
도 9로부터 알 수 있듯이, 콜라겐 염색에 의한 마우스 간 조직의 섬유화를 살펴보았을 때에도 양성 대조군 4에 비해 실시예 1 또는 2의 추출물을 투여한 실험군 4 내지 7에서는 간 섬유화가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.
3-3) 조직 내 알파
스므스
머슬
액틴
양의 비교
웨스턴 블럿을 실시하여 알파 스므스 머슬 액틴의 양을 측정하였다.
이때 알파 스므스 머슬 액틴의 양은 감광필름의 감광도를 비교하여 확인하였다. 결과를 하기 표 3 및 도 10에 나타내었다.
이때 조직내 알파 스므스 머슬 액틴의 양은 사염화탄소를 처리하지 않은 정상 마우스(음성대조군 4)와 사염화탄소 처리군(양성 대조군 4), 및 다양한 농도의 추출물을 처리한 실험군 4 내지 7의 알파 스므스 머슬 액틴의 양을 웨스턴 블럿으로 확인한 후 그 필름상의 밴드의 강도를 상대 비교하여 나타낸 값이다.
처리시약 | 조직내 알파 스므스 머슬 액틴의 상대적 양 | |
음성 대조군 4 | - | 439±49.8 |
양성 대조군 4 | CCl4 + 증류수 | 695±79.3 |
실험군 4 | CCl4 + 실시예 1 추출물 (10mg/mouse) | 506±58.3 |
실험군 5 | CCl4 + 실시예 1 추출물 (40mg/mouse) | 454±57.4 |
실험군 6 | CCl4 + 실시예 2 추출물 (10mg/mouse) | 534±63.2 |
실험군 7 | CCl4 + 실시예 2 추출물 (40mg/mouse) | 468±54.3 |
비교군 4 | CCl4 + 실리마린(50mg/kg) | 620±70.3 |
표 3 및 도 10에 나타난 바와 같이, 음성 대조군 4의 값은 439이며, 이는 사염화탄소의 처리(양성 대조군 4)에 의해 695로 증가되었다. 이 증가된 수치는 추출물의 처리에 의하여 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다. 특히 실험군 5에서의 실시예 1의 추출물 40mg 처리시 정상 수치(439)와 거의 동등한 수치(454)로 회복됨을 확인하였다.
3-4)
조직내
TGF
-β
mRNA
양의 비교
간 조직에서 mRNA를 취하고, RT-PCR을 수행하여 TGF-β양을 조사하였다. 결과를 하기 표 4 및 도 11에 나타내었다.
처리시약 | 조직내 TGF-β mRNA 상대적 양 | |
음성대조군 4 | - | 0.24±0.02 |
양성 대조군 4 | CCl4 + 증류수 | 4.83±0.05 |
실험군 4 | CCl4 + 실시예 1 추출물 (10mg/mouse) | 2.2±0.04 |
실험군 5 | CCl4 + 실시예 1 추출물 (40mg/mouse) | 1.5±0.04 |
실험군 6 | CCl4 + 실시예 2 추출물 (10mg/mouse) | 3.5±0.05 |
실험군 7 | CCl4 + 실시예 2 추출물 (40mg/mouse) | 2.4±0.03 |
비교군 4 | CCl4 + 실리마린 (50mg/kg) | 4.61±0.06 |
표 4 및 도 11에서의 결과와 같이 조직 내 mRNA양이 추출물의 투여시에 공히 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실험예
4. 독성실험
상기 실시예 1 내지 3에서 제조된 추출물의 독성을 시험하기 위하여 동물실험을 수행하였다.
25±5g의 ICR계 마우스(중앙실험동물)와 235±10g의 특정병원부재(SPF) 스프라그-도올리(Biogenomics사) 래트를 각각 3마리씩 3군으로 나누어 실시예 1 내지 3의 추출물을 각각 20mg/kg, 10mg/kg 및 1mg/kg의 용량으로 복강 투여한 후 24시간동안 독성 여부를 관찰하였다.
실험결과 9군 모두에서 사망한 예는 없었으며, 체중증가, 사료섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 이로부터 본 발명의 장구채 추출물이 안전한 것임을 확인할 수 있었다.
본 발명의 추출물은 하기 제형으로 투여할 수 있으며, 하기 제제예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
제제예
1. 정제의 제조
실시예 1의 추출물 200mg
유당 100mg
전분 100mg
스테아린산 마그네슘 적량
통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예
2. 캡슐제의 제조
실시예 2의 추출물 100mg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산 마그네슘 적량
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 갭슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예
3.
액제의
제조
실시예 1의 추출물 500mg
실시예 2의 추출물 500mg
설탕 20mg
이성화당 20mg
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000ml로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예
4. 주사제의 제조
실시예 2의 추출물 100mg
소듐 메타비설파이트 3.0mg
메틸파라벤 0.8mg
프로필파라벤 0.1mg
주사용 명균증류수 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종부피가 2ml가 되도록 제조한 후 2ml 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
제제예
5.
건강음료의
제조
실시예 1의 추출물 1000mg
구연산 1000mg
올리고당 100g
메실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900ml
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용하였다.
제제예
6. 건강 식품의 제조
실시예 2의 추출물 1000mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70μg
비타민 E 1.0mg
비타민 B1 0.13mg
비타민 B2 0.15mg
비타민 B6 0.5mg
비타민 B12 0.2μg
비타민 C 10mg
비오틴 10μg
니코틴산아미드 1.7mg
엽산 50μg
판토텐산칼슘 0.5mg
비타민 E 1.0mg
무기질 혼합물 적량
황산 제1철 1.75mg
산화아연 0.82mg
탄산 마그네슘 25.3mg
제1인산칼륨 15mg
제2인산칼슘 55mg
구연산칼륨 90mg
탄산칼슘 100mg
염화마그네슘 24.8mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립 제형의 건강식품을 제조하였다.
본 발명의 장구채 또는 울릉 장구채 추출물은 AST 및 ALT 활성을 저해할 뿐만 아니라 간 조직내의 섬유화로 인하여 축적된 콜라겐, 알파 스므스 머슬 액틴 및 TGF-β의 양을 유의성 있게 억제하여 간기능 개선, 간질환의 예방 및 치료에 유용한 약제 및 건강기능 식품으로서 이용할 수 있다.
Claims (9)
- 장구채 및 울릉장구채 추출물 중 적어도 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 80 중량%로 포함되는 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 장구채 및 울릉 장구채 중 적어도 어느 하나에 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 가하여 추출하여 제조된 것인 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 용매인 것인 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 장구채 및 울릉 장구채 중 적어도 어느 하나를 열수 추출하여 제조된 것인 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 간 질환은 급만성 간염, 간 섬유화, 간경화 및 간암 으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제 및 좌제로 이루어지는 군에서 선택된 제제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 간 질환 치료 및 예방용 약학 조성물.
- 장구채 및 울릉장구채 중 적어도 어느 하나의 추출물을 유효성분으로 포함하는 간 기능 개선용 건강기능식품.
- 제 8 항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료로 이루어진 군에서 선택된 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 간 기능 개선용 건강기능식품.
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2005
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2006
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KR20150024605A (ko) * | 2013-08-27 | 2015-03-09 | 영남대학교 산학협력단 | 장구채 추출물 또는 이로부터 분리된 보르네시톨을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물 |
WO2016047823A1 (ko) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | 영남대학교 산학협력단 | 장구채 추출물 또는 이로부터 분리된 보르네시톨을 유효성분으로 함유하는 세포 노화 억제용 조성물 |
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