KR20060100311A - Thermosensitive heparin conjugate, preparing method and use thereof - Google Patents

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KR20060100311A
KR20060100311A KR1020060075942A KR20060075942A KR20060100311A KR 20060100311 A KR20060100311 A KR 20060100311A KR 1020060075942 A KR1020060075942 A KR 1020060075942A KR 20060075942 A KR20060075942 A KR 20060075942A KR 20060100311 A KR20060100311 A KR 20060100311A
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박기동
이준우
배진우
고동현
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아주대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 온도감응성 헤파린 결합체, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 헤파린에 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자가 결합된 온도감응성 헤파린 결합체에 관한 것이다.  The present invention relates to a temperature-sensitive heparin binder, a method for producing the same, and a use thereof, and more particularly, to a temperature-sensitive heparin binder in which a temperature-sensitive polymer having a polyfunctional group including a biodegradable polymer is bound to heparin.

본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 향상된 헤파린의 생리활성 및 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 온도감응성과 생분해성을 동시에 가지며, 졸/겔 상전이 거동에 있어 주입형 약물전달체로 사용되기에 적합한 특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 주입형 약물전달체용 재료를 포함하여, 조직 공학과 관련된 다양한 산업 분야에서의 응용이 기대된다.The temperature-sensitive heparin conjugates of the present invention not only have improved physiological activity and biocompatibility of heparin, but also have both temperature sensitivity and biodegradability, and have properties suitable for use as an injectable drug carrier in sol / gel phase transition behavior. Therefore, the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention is expected to be applied in various industrial fields related to tissue engineering, including materials for injectable drug carriers.

헤파린, 결합체, 온도감응성, 생분해성, 다관능기, 고분자 Heparin, Binder, Temperature Sensitive, Biodegradable, Polyfunctional, Polymer

Description

온도감응성 헤파린 결합체, 그의 제조방법 및 용도{THERMOSENSITIVE HEPARIN CONJUGATE, PREPARING METHOD AND USE THEREOF}Thermosensitive heparin conjugate, manufacturing method and use thereof {THERMOSENSITIVE HEPARIN CONJUGATE, PREPARING METHOD AND USE THEREOF}

도 1은 본 발명의 실시예 1.1에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.1 shows the 1 H-NMR spectrum of the Tetronic ® -polylactide copolymer prepared in Example 1.1 of the present invention.

도 2는 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 1 H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 2 shows the 1 H-NMR spectrum of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention.

도 3은 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the FT-IR spectrum of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention.

도 4는 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 졸-겔 거동을 보여주는 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the sol-gel behavior of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention.

도 5는 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 온도, 농도에 따른 졸-겔 상전이 거동을 나타낸 그래프이다. Figure 5 is a graph showing the sol-gel phase transition behavior according to the temperature, concentration of Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention.

도 6은 헤파린 표준용액의 농도에 따른 흡광도를 나타낸 그래프이다. 6 is a graph showing the absorbance according to the concentration of heparin standard solution.

도 7은 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체, 비교예 1의 선형 폴리락타이드-헤파린 결합체, 비교예 2의 스타형 폴리락타이드-헤파린 결합체의 항혈전 활성을 측정한 그래프이다. 7 is an antithrombosis of a Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention, a linear polylactide-heparin conjugate of Comparative Example 1, a star polylactide-heparin conjugate of Comparative Example 2 It is a graph measuring activity.

도 8은 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체, 실시예 1.1에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드의 시간에 따른 bFGF의 방출량을 나타낸 그래프이다. 8 is a graph showing the release amount of bFGF over time of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention, the Tetronic ® -polylactide prepared in Example 1.1.

본 발명은 온도감응성 헤파린 결합체, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 향상된 헤파린의 생리활성 및 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 온도감응성과 생분해성을 동시에 가지며, 졸/겔 상전이 거동에 있어서 주입형 약물전달체로 사용되기에 적합한 특성을 갖는 온도감응성 헤파린 결합체, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a temperature sensitive heparin conjugate, a method and a use thereof, and more particularly, not only has improved physiological activity and biocompatibility of heparin, but also has both temperature sensitivity and biodegradability, and is injected in sol / gel phase transition behavior. It relates to a temperature-sensitive heparin conjugate having properties suitable for use as a type drug carrier, a method for preparing and use thereof.

본 발명에서 온도감응성이라 함은 물질이 낮은 온도에서는 물에 용해되고 특정 임계온도 이상이 되면 용해도가 급격히 감소하여 겔 상태로 변하여 고형화되며 다시 온도가 낮아지면 물에 용해되는 가역적인 현상을 말하는데, 이는 일반적인 물질이 높은 온도에서 용해도가 증가하는 성질과 상반된다. 이는 주로 물에 녹는 고분자에서 관찰되며 이러한 특정 온도 이하에서는 용해되어 있고, 그 온도 이상에서 는 물과 함께 겔 상태로 변하여 고형화될 때 이때의 온도를 하한임계용액온도(lower critical solution temperature, LCST)라고 한다. 하한임계용액온도(LCST) 이하에서는 고분자-물분자들의 수소결합에 의한 상호작용이 고분자-고분자들 사이의 소수성 상호작용보다 크다. 따라서 고분자는 물에 용해되어 있다. 그러나 수용액의 온도가 증가하면 고분자-물분자들의 수소결합 상호작용이 약해지며 고분자-고분자의 소수성 상호작용이 증가한다. 수용액의 온도가 하한임계용액온도(LCST)에 도달하면 이러한 소수성 상호작용은 고분자-물분자들의 수소결합 상호작용보다 훨씬 커지며 결국 고분자 수용액은 겔이 되어 고형화된다. 온도감응성은 주로 수용성의 고분자와 올리고머형 비이온성 계면활성제에서 발견되었다. 온도감응성을 나타내는 수용성 고분자는 다시 폴리(에틸렌글리콜) 및 소수성기와 친수성기가 함께 결합되어 있는 유기고분자계로 나누어진다. 수용성 폴리(에틸렌글리콜) 자체의 하한임계용액온도는 분자량에 따라서 변하는데 분자량이 200,000 이하에서는 나타나지 않고 (Bailey, F. E. 외,Poly(ethyleneoxide), Academic Press, New York, 1976), 그 이상의 경우에는 분자량이 증가함에 따라 하한임계용액온도가 낮아진다. 또한 수용성 유기고분자들의 하한임계용액온도는 소수성기와 친수성기의 균형에 따라 변하는데 일반적으로 친수성기의 함량이 증가하면 상전이 온도가 올라가고, 소수성기가 증가하면 반대로 상전이 온도가 내려가며 비이온성 계면활성제의 온도감응성도 이와 유사한 형태이다.In the present invention, the temperature sensitivity refers to a reversible phenomenon in which a substance is dissolved in water at a low temperature, and when the temperature is higher than a certain threshold temperature, the solubility is rapidly reduced to a gel state and solidified. Contrary to the nature of common materials increasing solubility at high temperatures. This is mainly observed in water-soluble polymers, which are dissolved below this specific temperature, and above that temperature, the temperature at which it gels and solidifies with water is referred to as the lower critical solution temperature (LCST). do. Below the lower critical solution temperature (LCST), the hydrogen-bond interaction of polymer-water molecules is greater than the hydrophobic interaction between polymer-polymers. Therefore, the polymer is dissolved in water. However, increasing the temperature of the aqueous solution weakens the hydrogen-bonding interaction of the polymer-water molecules and increases the hydrophobic interaction of the polymer-polymer. When the temperature of the aqueous solution reaches the lower critical solution temperature (LCST), this hydrophobic interaction is much larger than the hydrogen-bonding interaction of the polymer-water molecules, and the polymer aqueous solution becomes a gel and solidifies. Temperature sensitivity was found primarily in water-soluble polymers and oligomeric nonionic surfactants. Water-soluble polymers exhibiting temperature sensitivity are further divided into an organic polymer system in which poly (ethylene glycol) and a hydrophobic group and a hydrophilic group are bonded together. The lower critical solution temperature of the water-soluble poly (ethylene glycol) itself varies depending on the molecular weight, but the molecular weight does not appear below 200,000 (Bailey, FE et al., Poly (ethyleneoxide), Academic Press, New York, 1976). As this increases, the lower critical solution temperature is lowered. In addition, the lower critical solution temperature of water-soluble organic polymers changes depending on the balance of hydrophobic and hydrophilic groups. Generally, when the content of hydrophilic groups increases, the phase transition temperature increases, and when the hydrophobic groups increase, the phase transition temperature decreases, and the temperature sensitivity of the nonionic surfactant is increased. It is in a similar form.

이러한 온도감응성 고분자와 계면활성제들은 약물전달시스템을 중심으로 하는 의료용 재료, 박막, 생화학적 반응에서의 분리, 화장품, 광학 등 다양한 분야에 서 응용연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 온도감응성 물질이 갖는 특징 중의These thermosensitive polymers and surfactants are being actively researched in various fields such as medical materials, thin films, biochemical reactions, cosmetics, and optics. Among the characteristics of such a temperature sensitive material

하나는 약물을 담지시킬 때 유기용매를 쓸 필요가 없다는 것이다. 대부분의 생체활성을 나타내는 물질들은 온도나 유기용매에 노출되었을 때 부분적으로 그들의 활성을 잃어버리는 경우가 많다. 그러나 온도감응성 물질을 이용하면 낮은 온도의 순수한 수용액에서 약물을 담지시킨 후 온도를 하한임계용액온도 이상으로 올려 겔화를 유도하면 간단히 약물을 담지시킬 수 있다. 온도감응성을 이용한 의약전달체에 관한 연구는 하한임계용액온도가 33.2℃인 폴리(N-이소프로필 아크릴아미드)계가 가장 널리 연구되고 있다. 예컨대, 온도감응성을 나타내는 고분자 표면으로부터 항응고작용을 하는 물질로 알려진 헤파린의 방출 거동에 관한 연구(Gutowska, A. 외,J. Biomedical materials Research,29, 811(1995)), 온도감응성 겔에 효소를 담지시켜 하한임계용액온도를 전후한 촉매의 활성 정도에 관한 연구(Chang, L. 외,J. Controlled Release,4, 223(1986)) 등이다. 온도감응성 고분자를 이용한 약물의 막투과성에 관한 연구도 수행되었는데 온도감응성 고분자막으로부터의 인슐린 투과성 변화가 관찰된 바 있다 (Bae, Y.H. 외,J. Controlled Release,9, 271(1989)). 이 밖에도 폴리(에틸렌글리콜) 공중합체, 히드록시계 고분자, 그리고 무기고분자인 폴리포스파젠계 (Tanigami, T. 외,Macromolecules,22, 1397 (1989), Allock, H.R. 외,Macromolecules,25, 5573(1992), Allock, H.R. 외,Macromolecules,29, 1313(1996)) 고분자에서도 보고되었다.One is that there is no need to use organic solvents to carry the drug. Most bioactive materials often lose their activity in part when exposed to temperature or organic solvents. However, by using a temperature sensitive material, the drug can be simply supported by inducing gelation by lowering the temperature above the lower limit solution temperature after supporting the drug in a pure aqueous solution at low temperature. In the study of drug carriers using temperature sensitivity, the poly (N-isopropyl acrylamide) system having a lower limit solution temperature of 33.2 ° C. is most widely studied. For example, studies on the release behavior of heparin, known as an anticoagulant, from the surface of polymers exhibiting temperature sensitivity (Gutowska, A. et al., J. Biomedical materials Research, 29, 811 (1995)), enzymes on thermosensitive gels A study on the degree of activity of the catalyst before and after the lower critical solution temperature by supporting (Chang, L. et al, J. Controlled Release, 4, 223 (1986)). Studies on the membrane permeability of drugs using temperature sensitive polymers have also been conducted, and changes in insulin permeability from temperature sensitive polymer membranes have been observed (Bae, Y. H. et al., J. Controlled Release, 9, 271 (1989)). In addition, poly (ethylene glycol) copolymers, hydroxy polymers, and polyphosphazenes of inorganic polymers (Tanigami, T. et al., Macromolecules, 22, 1397 (1989), Allock, HR et al., Macromolecules, 25, 5573 ( 1992, Allock, HR et al., Macromolecules, 29, 1313 (1996)) polymers.

그러나, 상기 종래기술의 거의 대부분은 비분해성 고분자형으로서 약물전달 시스템용 재료로서의 응용에 한계가 있다는 지적을 받고 있다. 그 이유는 비분해성 고분자를 인체에 투여했을 경우 분해되지 않고 인체에 축적됨으로써 독성을 나타낼 가능성이 있으며 분해되는 경우에도 독성 부산물을 생산해 낼 수 있기 때문이다. 또한, 고분자의 고분자량으로부터 나타나는 생체부적합성도 이들 고분자들에 대한 약물전달체로서의 이용가능성을 제한하고 있다. However, most of the prior art has been pointed out as a non-degradable polymer type has a limitation in its application as a material for drug delivery systems. The reason is that when the non-degradable polymer is administered to the human body, it is not decomposed but accumulates in the human body, which may be toxic, and when it is decomposed, it can produce toxic byproducts. In addition, biocompatibility resulting from the high molecular weight of the polymers also limits their availability as drug carriers for these polymers.

한편, 헤파린(heparin)은 항응고제 및 항혈전제로서 임상적으로 연구되어 왔다. 헤파린은 글리코사미노글리칸(GAG)으로서 알려진 다당류에 속하며, 서로 교대하는 1-4-결합된 헥사우론산과 D-글루코사민으로 이루어져 있다. 헥사우론산과 글루코사민 잔기 둘 다 복잡한 양식으로 황산화되어 그 구조가 매우 다양하게 변한다. 헤파린은 높은 음전하 밀도를 갖기 때문에 수많은 단백질 및 세포막상의 염기성 아미노산들, 예를 들면 응고 프로테이나제, 세린 프로테아제 저해제, 성장 인자, 지단백질 및 간 리파제, 아포리포단백질 B 및 E, 접착 기질 단백질, 혈소판 및 내피세포와 상호작용할 수 있다. 이러한 헤파린을 생체용 고분자에 도입한 헤파린 결합체를 이용하여 혈액 적합성(blood compatibility)과 조직 적합성(cell compatibility)을 비롯한 생체 적합성(biocompatibility)을 개선하기 위해 많은 연구가 진행되고 있다. Heparin, on the other hand, has been clinically studied as an anticoagulant and an antithrombotic agent. Heparin belongs to a polysaccharide known as glycosaminoglycan (GAG) and consists of alternating 1-4-linked hexauronic acid and D-glucosamine. Both hexauronic acid and glucosamine residues are sulfated in a complex fashion, varying in structure. Because heparin has a high negative charge density, many proteins and basic amino acids on cell membranes such as coagulation proteins, serine protease inhibitors, growth factors, lipoproteins and hepatic lipases, apolipoproteins B and E, adhesion matrix proteins, platelets And endothelial cells. Many studies have been conducted to improve biocompatibility including blood compatibility and cell compatibility using heparin conjugates in which heparin is introduced into a biopolymer.

이러한 헤파린의 결합체의 예를 들면, 대한민국 공개특허공보 제10-2002-0031894호 '소수성 다중복합 헤파린 결합체, 그의 제조방법 및 용도'는 특정 유기 용매에는 용해되나 수용액 상에서는 용해되지 않는 소수성 다중복합 헤파린 결합체가 개시되어 있다. 그러나, 헤파린의 항혈전성을 이용한 의료기기 또는 인공장기의 표면개질을 위한 코팅제로서의 활용에 대해 예시하고 있을 뿐 온도감응성, 헤파린의 생리활성 및 생체적합성을 개선하기 위한 방안에 대해 제시하고 있지 않다. Examples of such a conjugate of heparin, Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2002-0031894 'hydrophobic multi-complex heparin conjugates, a method and use thereof' is a hydrophobic multi-complex heparin conjugate dissolved in a specific organic solvent but not dissolved in an aqueous solution Is disclosed. However, the application of heparin as a coating agent for surface modification of a medical device or an artificial organ using antithrombogenicity is not illustrated, and there is no suggestion for a method for improving temperature sensitivity, physiological activity and biocompatibility of heparin.

본 발명의 목적은 온도감응성과 생분해성을 동시에 가질 뿐만 아니라 헤파린의 생리활성이 증가된 온도감응성 헤파린 결합체를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a temperature-sensitive heparin conjugate having not only both temperature sensitivity and biodegradability but also increased physiological activity of heparin.

본 발명의 다른 목적은 상기 물성을 갖는 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate having the above properties.

본 발명의 또 다른 목적은 생체와 접촉하는 주입형 생체재료로서 생체 적합성이 향상되고, 온도에 따라 졸/겔 상전이 거동을 보이는 주입형 약물전달체로서의 온도감응성 헤파린 결합체의 용도를 제공하는 것이다. It is still another object of the present invention to provide a use of a temperature-sensitive heparin conjugate as an injectable drug carrier which improves biocompatibility as an injectable biomaterial in contact with a living body and exhibits a sol / gel phase transition behavior with temperature.

상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤파린에 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자가 결합된 온도감응성 헤파린 결합체를 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a temperature-sensitive heparin conjugate is combined with a temperature-sensitive polymer having a polyfunctional group containing heparin biodegradable polymer.

또한, 본 발명은 (1) 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자를 제조하는 단계; (2) 상기 온도감응성 고분자의 다관능기를 활성화시키는 단계; 및, (3) 상기 활성화된 온도감응성 고분자의 다관능기에 헤파린을 결합시키는 단계를 포함하는 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of (1) preparing a temperature-sensitive polymer having a multi-functional group containing a biodegradable polymer; (2) activating the multifunctional group of the temperature sensitive polymer; And, (3) provides a method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate comprising the step of binding heparin to the multifunctional group of the activated temperature-sensitive polymer.

아울러, 본 발명은 상기 온도감응성 헤파린 결합체의 주입형 약물전달체로서의 용도를 제공한다.In addition, the present invention provides a use of the temperature-sensitive heparin conjugate as an injectable drug carrier.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 안정된 헤파린의 활성을 갖고, 온도감응성과 생분해성을 동시에 갖는 헤파린 결합체를 개발하고자 예의 연구한 결과, 생분해성 고분자가 포함된 다관능성 온도감응성 고분자를 제조하고, 이에 헤파린을 결합시킴으로써, 헤파린의 생리활성 및 생체적합성이 증가되고, 졸/겔 상전이 거동에 있어 주입형 약물전달체로 사용되기에 적합한 특성을 가짐을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors earnestly researched to develop a heparin conjugate having stable heparin activity and having both temperature sensitivity and biodegradability. As a result, a multifunctional temperature-sensitive polymer containing a biodegradable polymer is prepared, and heparin is bound thereto. It was confirmed that the physiological activity and biocompatibility of the sol / gel phase change has the characteristics that are suitable for use as an injectable drug carrier in the behavior, to complete the present invention based on this.

본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자에 헤파린이 결합되어 있다. In the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention, heparin is bound to a temperature-sensitive polymer having a multifunctional group containing a biodegradable polymer.

본 발명에 따른 온도감응성 헤파린 결합체는 생분해성 고분자를 포함하는 다수 개의 관능기를 갖는 온도감응성 고분자를 제조한 후 각 관능기에 헤파린을 화학 적으로 결합시킨 것이다. 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자는 기존의 온도감응성 고분자에 생분해성 고분자를 결합시키거나, 생분해성 고분자를 소수성 블록으로 하여 이에 다른 소수성 블록, 친수성 블록을 결합시켜 제조하는 방법이 사용될 수 있으며, 여기서 온도감응성 고분자는 모두 다수 개의 관능기를 가지고 있어야 한다. The temperature-sensitive heparin conjugate according to the present invention is to prepare a temperature-sensitive polymer having a plurality of functional groups including a biodegradable polymer and then chemically binds heparin to each functional group. Thermosensitive polymers having a multifunctional group containing a biodegradable polymer are prepared by combining a biodegradable polymer with an existing thermosensitive polymer or by combining another hydrophobic block and a hydrophilic block with the biodegradable polymer as a hydrophobic block. It can be used, wherein the temperature sensitive polymer should all have a plurality of functional groups.

여기서, 온도감응성 고분자는 친수성 블록과 소수성 블록을 갖는 블록공중합체인 것이 적절하다. 이때, 온도감응성 고분자는 바람직하게 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 블록공중합체이고, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 1의 구조를 갖는다. 또한, 온도감응성 고분자는 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록과 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 블록공중합체인 것이 바람직하고, 하기 화학식 2, 하기 화학식 3, 하기 화학식 4 및 하기 화학식 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것이 더욱 바람직하다. 이때 온도감응성 고분자의 분자량 및 친수성/소수성 비는 다양하게 조절될 수 있다. Here, the temperature sensitive polymer is preferably a block copolymer having a hydrophilic block and a hydrophobic block. In this case, the temperature-sensitive polymer preferably comprises a first hydrophobic block composed of poly (ester), a second hydrophobic block composed of poly (propylene oxide), and a hydrophilic block composed of poly (ethylene oxide). It is a block copolymer, More preferably, it has a structure of following formula (1). In addition, the temperature-sensitive polymer is preferably a block copolymer comprising a hydrophobic block consisting of a hydrophobic block and a poly (ethylene oxide), which is a biodegradable polymer consisting of poly (ester), the following formula (2), (3) It is more preferable that it is one selected from the group consisting of 4 and the following formula (5). At this time, the molecular weight and hydrophilic / hydrophobic ratio of the temperature-sensitive polymer can be adjusted in various ways.

Figure 112006057411514-PAT00001
Figure 112006057411514-PAT00001

Figure 112006057411514-PAT00002
Figure 112006057411514-PAT00002

Figure 112006057411514-PAT00003
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Figure 112006057411514-PAT00005
Figure 112006057411514-PAT00005

(상기 화학식 1 내지 5에서,(In Chemical Formulas 1 to 5,

a는 중합도로서 61 내지 62의 값을 갖고,a has a value of 61 to 62 as the degree of polymerization,

b는 중합도로서 19 내지 20의 값을 갖고,b has a value of 19 to 20 as the degree of polymerization,

c는 중합도로서 7 내지 8의 값을 갖고,c has a value of 7 to 8 as the degree of polymerization,

d는 중합도로서 10 내지 105의 값을 갖고,d has a value of 10 to 105 as the degree of polymerization,

e는 중합도로서 25 내지 385의 값을 갖고,e has a value of 25 to 385 as the degree of polymerization,

f는 중합도로서 10 내지 105의 값을 갖고,f has a value of 10 to 105 as the degree of polymerization,

g는 중합도로서 12 내지 193의 값을 갖고,g has a value of 12 to 193 as the degree of polymerization,

h는 중합도로서 16 내지 65의 값을 갖고,h has a value of 16 to 65 as the degree of polymerization,

i는 중합도로서 20 내지 105의 값을 갖고,i has a value of 20 to 105 as the degree of polymerization,

j는 중합도로서 16 내지 33의 값을 갖고,j has a value of 16 to 33 as the degree of polymerization,

k는 중합도로서 20 내지 105의 값을 갖는다.)k has a value of 20 to 105 as the degree of polymerization.)

헤파린에 결합되는 온도감응성 고분자는 일정 농도의 수용액을 제조했을 때 상온에서는 졸(sol) 상태로, 체온에서는 겔(gel) 상태로 자유롭게 상전이가 가능하고, 헤파린이 도입된 이후에도 적절한 온도감응성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 온도감응성 고분자는 저온에서 졸(sol)상태이고, 온도를 높여 체온 부근에서는 겔(gel)상태가 되는 졸/겔 상전이 형상을 나타내어, 저온의 졸(sol)상태에서 약물과 혼합하여 체내에 주입하면 겔(gel)을 형성하여 약물을 서서히 방출시킬 수 있다. The thermosensitive polymer bound to heparin can be freely phase-transformed into a sol state at room temperature and a gel state at body temperature when an aqueous solution of a certain concentration is prepared, and has an appropriate temperature sensitivity even after heparin is introduced. Therefore, the temperature-sensitive polymer of the present invention exhibits a sol / gel phase transition shape in which it is in a sol state at a low temperature and becomes a gel in the vicinity of body temperature by increasing the temperature, and is mixed with a drug in a low temperature sol state. When injected into the body to form a gel (gel) can release the drug slowly.

상기 생분해성 고분자는 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리 코리드) 및 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. The biodegradable polymer may be polylactide, poly (ε-caprolactone), poly (lactide-co-glycolide), poly (lactide-co-ε-caprolactone), poly (ε-caprolactone-co- Glycolide) and poly (ε-caprolactone-co-glycolide-co-lactide).

본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 헤파린의 관능기 중 아민기(amine group)와 하이드록실기(hydroxyl group)를 이용하여 온도감응성 고분자와의 결합체를 형성한다. 헤파린은 카르복실기(carboxyl group), 하이드록실기(hydroxyl group), 술폰산기(sulfonic acid group) 및 아민기(amine group)의 관능기를 가지고 있는데, 이 중 음이온의 성질을 가지는 카르복실기와 술폰산기는 헤파린의 활성을 나타내는데 중요한 역할을 하기 때문에, 만약 이들 관능기를 고분자 물질과의 화학결합에 이용하게 되는 경우, 항혈전특성을 비롯한 헤파린의 생리활성이 크게 저하되는 문제점이 있다. The temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention forms a conjugate with a temperature-sensitive polymer by using an amine group and a hydroxyl group among functional groups of heparin. Heparin has functional groups of carboxyl group, hydroxyl group, sulfonic acid group and amine group, of which the carboxyl group and sulfonic acid group have the properties of heparin Because it plays an important role in indicating, if these functional groups are used in the chemical bonding with the polymer material, there is a problem that the physiological activity of heparin, including antithrombotic properties is greatly reduced.

상기 헤파린은 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하다. The heparin is preferably selected from the group consisting of heparin, recombinant heparin, heparin derivative and heparin analogue.

본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 3개 이상의 관능기를 가지는 다관능성 온도감응성 고분자의 각 관능기에 헤파린이 공유결합되어 제조되는 것이 바람직하다. 이때, 3개 이상의 관능기를 갖는 온도감응성 고분자는 팔(arm)이 3개 내지 8개인 스타형 고분자인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 온도감응성 고분자의 증가된 관능기의 수에 따라 결합되는 헤파린의 양은 증가되며, 이에 따라 향상된 헤파린의 생리활성을 갖는 온도감응성 헤파린 결합체를 제조할 수 있다. The temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention is preferably prepared by covalently bonding heparin to each functional group of the multifunctional temperature-sensitive polymer having three or more functional groups. At this time, the temperature-sensitive polymer having three or more functional groups is more preferably a star-shaped polymer having 3 to 8 arms. According to the increased number of functional groups of the thermosensitive polymer, the amount of heparin bound is increased, thereby making it possible to prepare a thermosensitive heparin conjugate having improved physiological activity of heparin.

또한, 본 발명은 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법을 제공한다. The present invention also provides a method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate.

본 발명에 따른 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법은 단순한 혼합에 의해 생리활성물질인 헤파린이 온도감응성 고분자에 도입되는 기존의 방법과는 달리 공유결합을 통해 헤파린을 직접 고분자 주쇄 내에 도입시킨다. In the method for preparing a temperature-sensitive heparin conjugate according to the present invention, unlike conventional methods in which heparin, a bioactive substance, is introduced into a temperature-sensitive polymer by simple mixing, heparin is directly introduced into the polymer main chain through covalent bonding.

이하, 본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the method for preparing the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention will be described in detail for each step.

(1) 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자의 제조(1) Preparation of temperature sensitive polymer having a multifunctional group containing a biodegradable polymer

생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자는 기존의 온도감응성 고분자에 생분해성 고분자를 결합시키거나, 생분해성 고분자를 소수성 블록으로 하여 이에 다른 소수성 블록, 친수성 블록을 결합시켜 제조하는 방법이 사용될 수 있으며, 여기서 온도감응성 고분자는 모두 다수 개의 관능기를 가지고 있어야 한다. 상기 온도감응성 고분자는 헤파린이 결합된 이후에도 적절한 온도감응성을 유지할 수 있도록 제조되는 것이 바람직하다. Thermosensitive polymers having a multifunctional group containing a biodegradable polymer are prepared by combining a biodegradable polymer with an existing thermosensitive polymer or by combining another hydrophobic block and a hydrophilic block with the biodegradable polymer as a hydrophobic block. It can be used, wherein the temperature sensitive polymer should all have a plurality of functional groups. The temperature sensitive polymer is preferably prepared to maintain a proper temperature sensitivity even after heparin is bonded.

본 발명의 온도감응성 고분자의 바람직한 실시예로서, 4개의 팔(arm)을 갖는 온도감응성 고분자인 테트로닉®(Tetronic®)에 생분해성 고분자인 폴리(락타이드)(Poly(L-lactide))를 결합시킨 상기 화학식 1, 4개의 팔(arm)을 갖는 폴리(에틸렌옥사이드) (multi-arm PEO)에 선형의 폴리(락타이드)를 결합시킨 상기 화학식 2, 8개의 팔(arm)을 갖는 폴리(에틸렌옥사이드) (multi-arm PEO)에 선형의 폴리(락타이드)를 결합시킨 상기 화학식 3, 4개의 팔(arm)을 갖는 폴리(락타이드) (multi-arm PLA)에 선형의 폴리(에틸렌옥사이드)를 결합시킨 상기 화학식 4, 8개의 팔(arm)을 갖는 폴리(락타이드) (multi-arm PLA)에 선형의 폴리(에틸렌옥사이드)를 결합시킨 상기 화학식 5의 화합물을 들 수 있다. In a preferred embodiment of a thermosensitive polymer of this invention, four arms (arm) the temperature-sensitive polymer, Tetronic ® poly (lactide) (Poly (L-lactide) ) biodegradable polymer in (Tetronic ®) having Formula (2), Poly (lactide) having a linear poly (lactide) bonded to the poly (ethylene oxide) (multi-arm PEO) having four arms to the formula (2), Linear poly (ethylene oxide) to the poly (lactide) having four arms (Formula 3) in which linear poly (lactide) is bound to multi-arm PEO And a compound of formula (5) in which a linear poly (ethylene oxide) is bonded to the poly (lactide) having eight arms and the poly (lactide) having 8).

(2) 온도감응성 고분자의 다관능기 활성화(2) Multifunctional group activation of temperature sensitive polymer

제1단계에서 얻은 생분해성 고분자가 포함된 온도감응성 고분자의 다관능기를 숙신산무수물(Succinicanhydride), 디메틸아미노피리딘 (Dimethylaminopyridine, DMAP), 또는 트리에틸아민(Triethylamine, TEA)을 사용하여 온도감응성 고분자의 각 말단 하이드록실기(-OH)를 카르복실기(-COOH)로 개질하고, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 [1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC]를 사용하여 고분자의 말단 카르복실기(-COOH)를 활성화한다. 이외에도 N,N-디싸이클로헥실카보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 또는 4-p-아지도살리실아민-부틸아민 [4-(p-azidosalicylamido)-butylamine, ASBA] 등이 카르복실기(-COOH)를 활성화하기 위하여 사용될 수 있다. The polyfunctional group of the thermosensitive polymer containing the biodegradable polymer obtained in the first step was used for each of the thermosensitive polymers using succinic anhydride, dimethylaminopyridine (DMAP), or triethylamine (TEA). The terminal hydroxyl group (-OH) is modified with a carboxyl group (-COOH) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride [1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride , EDC] to activate the terminal carboxyl group (-COOH) of the polymer. In addition, N, N-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) or 4-p-azidosalicylamine-butylamine [4- (p-azidosalicylamido) -butylamine, ASBA] is a carboxyl group (- COOH) can be used to activate.

(3) 활성화된 온도감응성 고분자의 다관능기에 헤파린을 결합(3) binding heparin to the polyfunctional group of the activated thermosensitive polymer

헤파린과 활성화된 고분자를 결합시키는 방법은 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 아민기(amine group), 티올기(thiol group) 및 아지드기(azide group)을 이용한 공유결합을 이용한다. 상기 공유결합은 아미드 결합(amide bond) 및 우레탄 결합(urethane bond)과 같은 비분해성 결합 (non-degradable bond) 또는 에스테르 결합(ester bond), 안하이드라이드 결합(anhydride bond)과 같은 분해성 결합(degradable bond)인 것이 바람직하다.The method of combining the heparin and the activated polymer is a covalent bond using a hydroxyl group, a carboxyl group, an amine group, a thiol group, and an azide group. I use it. The covalent bonds are non-degradable bonds such as amide bonds and urethane bonds, or degradable bonds such as ester bonds and anhydride bonds. bond).

이때, 헤파린의 분자량은 1,000 내지 1,000,000 달톤인 것이 바람직하며, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)가 사용될 수 있다. At this time, the molecular weight of heparin is preferably 1,000 to 1,000,000 Daltons, recombinant heparin (recombinant heparin), heparin derivative (heparin derivative) and heparin analogue (heparin analogue) can be used.

본 발명에 따른 온도감응성 헤파린 결합체는 다음의 방법에 의해 제조될 수 도 있다. 생분해성 고분자를 포함하는 다관능기를 갖는 화합물을 제조하고, 각 관능기에 말단이 카복실기로 개질화된 친수성 고분자를 결합시켜 생분해성 고분자를 포함하는 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자를 제조한 다음, 개질화된 카르복실기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 [1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC] 등을 이용하여 활성화한 후, 활성화된 온도감응성 고분자의 다관능기에 헤파린을 결합시킨다. The temperature sensitive heparin conjugate according to the present invention may be prepared by the following method. A compound having a multifunctional group including a biodegradable polymer is prepared, and a temperature-sensitive polymer having a multifunctional group including a biodegradable polymer is prepared by combining a hydrophilic polymer having a terminal modified with a carboxyl group at each functional group, and then modifying the polymer. Activated carboxyl group using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride [1-ethyl-3- (dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride, EDC] Heparin is bound to the polyfunctional group of the polymer.

마지막으로 본 발명은 상기 온도감응성 헤파린 결합체의 주입형 약물전달체로서의 용도를 제공한다. Finally, the present invention provides the use of the temperature sensitive heparin conjugate as an injectable drug carrier.

본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자에 헤파린이 결합됨으로 인하여 그에 따른 헤파린의 결합량 증가에 의해 주입형 생체재료에 필수적인 생체 적합성(biocompatibility) 및 헤파린의 생리활성이 향상되고, 헤파린과 특이적으로 결합하는 단백질의 안정적 함유가 가능하다. The temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention improves the biocompatibility and the physiological activity of heparin essential for the implantable biomaterial by increasing the amount of heparin binding to the temperature-sensitive polymer having a multi-functional temperature-sensitive polymer. It is possible to stably contain a protein that specifically binds to heparin.

또한, 수용액 중에서 온도감응성과 생분해성을 동시에 가질 뿐 아니라, 겔화 온도, 졸/겔 상전이 거동에 있어서 주입형 약물전달체로 사용되기에 적합한 특성을 갖는다.In addition to having both temperature sensitivity and biodegradability in aqueous solution, it also has properties suitable for use as an injectable drug carrier in gelation temperature and sol / gel phase transition behavior.

따라서, 본 발명의 고분자는 주입형 약물전달체로서 유용하게 사용될 수 있다. Therefore, the polymer of the present invention can be usefully used as an injectable drug carrier.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다.  Hereinafter, preferred examples and comparative examples of the present invention are described.

그러나 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are only one preferred embodiment of the present invention and the present invention is not limited to the following examples.

(실시예)(Example)

(실시예 1)(Example 1)

(테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조)(Preparation of Tetronic ® -Polylactide-Heparin Binder)

1.1 테트로닉-폴리락타이드 공중합체의 제조1.1 Preparation of Tetronic-Polylactide Copolymer

앰플에 L-락타이드(L-Lactide) 1.008g과 테트로닉®(tetronic®) 10.800g을 넣었다. 톨루엔(toluene) 5ml에 옥토산 제일주석(stannous octoate) 0.345g을 용해시킨 다음, 이 중 1ml를 취하여 앰플에 첨가하였다. 상기 앰플을 섭씨 60℃의 반응조에서 30분 동안 질소충전과 감압을 반복하여 내부의 수분과 공기를 완전히 제거한 후 앰플의 입구를 봉하였다. 봉해진 앰플을 섭씨 110℃의 반응조에서 20 시간 동안 반응시켜 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체를 얻었다. L- lactide (L-Lactide) 1.008g was placed into ampoules and Tetronic ® (tetronic ®) 10.800g. 0.345 g of stannous octoate was dissolved in 5 ml of toluene, 1 ml of which was added to the ampoule. The ampoule was repeatedly charged and depressurized for 30 minutes in a reactor at 60 ° C. to completely remove moisture and air therein, and then sealed the inlet of the ampoule. The sealed ampoules were reacted in a reactor at 110 ° C. for 20 hours to obtain a Tetronic ® -polylactide copolymer.

반응 종료 후 앰플을 파괴하고, 클로로포름(CHCl3)에 녹인 다음 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후 상온에서 60 시간 동안 진공건조시켜 잔여 용매를 제거하여 백색의 분말상을 갖는 다관능기를 갖는 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체를 얻었다.After completion of the reaction, the ampoule was destroyed, dissolved in chloroform (CHCl 3 ), and then filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether and then filtered through a membrane having a pore of 0.2 μm to obtain a reaction product. The above procedure was repeated twice, followed by vacuum drying at room temperature for 60 hours to remove residual solvent, thereby obtaining a Tetronic ® -polylactide copolymer having a multifunctional group having a white powdery form.

1.2 테트로닉-폴리락타이드 공중합체 말단의 활성화1.2 Activation of Tetronic-polylactide copolymer ends

250ml 둥근바닥 플라스크를 질소분위기로 준비한 다음 다이옥산(dioxane) 용매 150ml를 넣고, 상기 실시예 1.1로부터 얻은 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체 10g을 용해시켰다. 30분 동안 교반하여 완전히 용해시킨 후, 숙신산무수 물(Succinicanhydride) 0.250g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 0.244g, 트리에틸아민(Triethylamine, TEA) 0.203g이 각각 용해된 다이옥산 용액을 다시 첨가하였다. 질소분위기를 유지하며 섭씨 30℃의 반응조에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응종료 후 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 다음 클로로포름에 용해시킨 후 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후, 공극 0.2㎛의 막으로 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60 시간 동안 상온 진공건조시켜 잔여 용매를 제거하여 말단이 카르복실기로 개질된 테트로닉®- 폴리락타이드 공중합체를 얻었다. A 250 ml round bottom flask was prepared in a nitrogen atmosphere, and then 150 ml of dioxane solvent was added and 10 g of the Tetronic ® -polylactide copolymer obtained from Example 1.1 was dissolved. After stirring for 30 minutes to completely dissolve, a dioxane solution in which 0.250 g of succinic anhydride, 0.244 g of dimethylaminopyridine (DMAP) and 0.203 g of triethylamine (TEA) was added was added again. . The reaction was carried out for 24 hours in a reactor at 30 ° C. while maintaining a nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, a suitable amount of the solvent was blown using a rotary evaporator, dissolved in chloroform, and filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether, filtered through a membrane having a pore of 0.2 μm, and then the procedure was repeated twice. Vacuum drying at room temperature in a reduced pressure drier for 60 hours to remove residual solvent to obtain a Tetronic ® -polylactide copolymer whose ends are modified with carboxyl groups.

증류수 1000ml에 2-(3-모르포리노)에탄술폰산 (2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid, MES) 4.88g을 녹여 0.05 MES 완충용액을 제조하였다. 상기 카르복실화된 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체 5g을 50ml의 MES 완충용액에 가하여 완전히 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC) 0.156g와 N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxylsuccinimide, NHS) 0.047g을 15분 간격으로 첨가하여 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 말단(카르복실기)를 활성화하였다. A 0.05 MES buffer was prepared by dissolving 4.88 g of 2- (3-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) in 1000 ml of distilled water. 5 g of the carboxylated Tetronic ® -polylactide copolymer was added to 50 ml of MES buffer and completely dissolved. 0.156 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide (N- 0.047 g of hydroxylsuccinimide (NHS) was added at 15 minute intervals to activate the terminals (carboxyl groups) of the Tetronic ® -polylactide copolymer.

1.3 테트로닉-폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조1.3 Preparation of Tetronic-polylactide-heparin conjugates

상기 실시예 1.2로부터 얻은 활성화 용액을 헤파린 4.8g이 녹아있는 MES 완충용액 150ml에 5분간에 걸쳐 적하하면서 혼합한 후, 질소 분위기 하 섭씨 30 ℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 상기 결합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72 시간 동안 증류수를 흘려주어 분자량이 낮은 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 이로부터 얻어진 용액을 동결건조기 내에서 잔여 수분을 제거하여 흰색의 스펀지상의 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체를 얻었다.The activation solution obtained in Example 1.2 was added dropwise to 150 ml of MES buffer in which 4.8 g of heparin dissolved over 5 minutes, followed by reaction at 30 ° C. for 24 hours under nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the binder solution was placed in a dialysis membrane (dialysis limiting molecular weight 15000), and distilled water was flowed for 72 hours to remove unreacted substances having low molecular weight and residual chemicals. The solution obtained therefrom to remove the residual moisture in the freeze dryer and Tetronic ® on a white sponge-polylactide-heparin conjugate was obtained.

(실시예 2)(Example 2)

(폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조)(Preparation of polyethylene oxide-polylactide-heparin conjugate)

2.1 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체의 제조2.1 Preparation of Hexavalent Polyethyleneoxide-Polylactide Copolymer

건조된 삼구 둥근바닥플라스크에 8가 폴리에틸렌옥사이드(미국 shearwater社) 2g과 락타이드 5g, 및 옥토산 제일주석(stannous octoate) 0.3g을 80ml의 톨루엔(toluene)에 첨가하여 용해시켰다. 상기 반응용액에 컨덴서를 연결한 후 질소를 충전하여 질소분위기로 만든 다음 섭씨 110℃의 반응조에서 60 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 상기 반응 용액을 클로로포름(CHCl3)에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후, 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후, 상온에서 60 시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 8 개의 관능기를 갖는 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체를 얻었다.In a dried three-neck round bottom flask, 2 g of octavalent polyethylene oxide (US Shearwater Co., Ltd.), 5 g of lactide, and 0.3 g of stannous octoate were added to 80 ml of toluene to dissolve. After connecting the condenser to the reaction solution was filled with nitrogen to make a nitrogen atmosphere and reacted for 60 hours in a reactor of 110 ℃. After completion of the reaction, the reaction solution was dissolved in chloroform (CHCl 3 ) and impurities were removed by filtration. After the reaction solution was precipitated in diethylether, a reaction product was obtained by filtration with a membrane having a pore of 0.2 μm. After repeating the above twice, vacuum drying at room temperature for 60 hours to remove the residual solvent to obtain a polyethylene oxide-polylactide copolymer having eight functional groups.

2.2 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체 말단의 활성화2.2 Activation of Tetravalent Polyethyleneoxide-Polylactide Copolymer Termination

250ml 둥근바닥플라스크를 질소분위기로 준비한 다음 다이옥산(dioxane) 용매 150ml를 넣고, 상기 실시예 2.1로부터 얻은 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체 10g을 용해시켰다. 30분 동안 교반하여 완전히 용해시킨 후 숙신산무수물(Succinicanhydride) 0.500g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 0.488g, 트리에틸아민(Triethylamine, TEA) 0.406g이 각각 용해된 다이옥산 용액을 다시 첨가하였다. 질소분위기를 유지하며 섭씨 30℃의 반응조에서 24 시간동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 후클로로포름에 녹이고 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60 시간 동안 상온 진공건조시켜 잔여 용매를 제거하여 말단이 카르복실기로 개질된 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체를 얻었다. A 250 ml round bottom flask was prepared in a nitrogen atmosphere, and then 150 ml of a dioxane solvent was added thereto, and 10 g of the octavalent polyethylene oxide-polylactide copolymer obtained in Example 2.1 was dissolved. After stirring for 30 minutes to completely dissolve, a dioxane solution in which 0.500 g of Succinicanhydride, 0.488 g of dimethylaminopyridine (DMAP), and 0.406 g of triethylamine (TEA) were respectively added was added again. The reaction was carried out for 24 hours in a reactor at 30 ° C. while maintaining a nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, a suitable amount of the solvent was blown using a rotary evaporator, dissolved in chloroform, and filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether, filtered through a membrane having a pore size of 0.2 μm, and then the procedure was repeated twice. Vacuum drying at room temperature in a vacuum dryer for 60 hours to remove the residual solvent to obtain an octavalent polyethylene oxide-polylactide copolymer modified at the carboxyl end.

증류수 1000ml에 2-(3-모르포리노)에탄술폰산 (2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid, MES) 4.88g을 용해시켜 0.05 MES 완충용액을 제조하였다. 상기 카르복실화된 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체 5g을 50ml의 MES 완충용액에 가하여 완전히 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC) 0.312g와 N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxylsuccinimide, NHS) 0.094g을 15분 간격으로 첨가하여 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드 공중합체의 말단(카르복실기)를 활성화하였다. 0.05 MES buffer was prepared by dissolving 4.88 g of 2- (3-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) in 1000 ml of distilled water. 5 g of the carboxylated octavalent polyethyleneoxide-polylactide copolymer was added to 50 ml of MES buffer and completely dissolved. 0.312 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride and 0.32-g of N-hydroxysuccinimide (N- 0.094 g of hydroxylsuccinimide (NHS) was added at 15 minute intervals to activate the terminal (carboxyl group) of the polyethylene oxide-polylactide copolymer.

2.3 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조2.3 Preparation of Hexavalent Polyethyleneoxide-Polylactide-Heparin Binder

상기 실시예 2.2로부터 얻은 활성화 용액을 헤파린 9.6g이 녹아있는 MES 완충용액 150ml에 5분간에 걸쳐 적하하면서 혼합한 후 질소 분위기 하 섭씨 30℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응이 진행된 후 상기 결합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72시간동안 증류수를 흘려주어 분자량이 낮은 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 이로부터 얻어진 용액을 동결건조기 내에서 잔여 수분을 제거하여 흰색의 스펀지상의 8가 폴리에틸렌옥사이드-폴리락타이드-헤파린 결합체를 얻었다.The activation solution obtained in Example 2.2 was added dropwise to 150 ml of MES buffer in which 9.6 g of heparin dissolved over 5 minutes, followed by reaction at 30 ° C. for 24 hours under a nitrogen atmosphere. After the reaction was carried out, the binder solution was placed in a dialysis membrane (dialysis limiting molecular weight 15000), and distilled water was flowed for 72 hours to remove unreacted substances having low molecular weight and residual chemicals. The resulting solution was removed in the lyophilizer to remove residual water to obtain a white sponge-like tetravalent polyethylene oxide-polylactide-heparin conjugate.

(실시예 3)(Example 3)

(폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드-헤파린 결합체)(Polylactide-polyethylene oxide-heparin conjugate)

3.1.4가 폴리락타이드의 합성3.1.4 Synthesis of Hexavalent Polylactide

건조된 앰플에 락타이드(L-Lactide) 10g과 펜타에리쓰리톨(pentaerythritol) 0.236g를 넣었다. 이후 톨루엔 5ml에 옥토산 제일주석(stannous octoate) 1.406g을 녹인 다음, 이 중 1ml를 취하여 앰플에 첨가하였다. 상기 앰플을 섭씨 60℃의 반응조에서 30분 동안 질소충전과 감압을 반복하여 내부의 수분과 공기를 완전히 제거 한 후, 앰플의 입구를 봉하였다. 이렇게 봉해진 앰플을 섭씨 130℃의 반응조에서 10 시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 앰플을 파괴하고, 클로로포름에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후 상온에서 60 시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하고 백색의 분말상을 갖는 4가 폴리락타이드를 얻었다.Into the dried ampoules were added 10 g of lactide (L-Lactide) and 0.236 g of pentaerythritol. After dissolving 1.406 g of stannous octoate in 5 ml of toluene, 1 ml of this was added to the ampoule. The ampoule was repeatedly charged and depressurized for 30 minutes in a reactor at 60 ° C. to completely remove moisture and air therein, and then sealed the inlet of the ampoule. The sealed ampoules were reacted in a reactor at 130 ° C. for 10 hours. After the reaction was completed, the ampoule was destroyed, dissolved in chloroform, and then filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether and then filtered through a membrane having a pore of 0.2 μm to obtain a reaction product. The above procedure was repeated twice, followed by vacuum drying at room temperature for 60 hours to remove residual solvent and give a tetravalent polylactide having a white powdery form.

3.2 폴리에틸렌옥사이드 말단의 카르복실화3.2 Carboxylation of Polyethylene Oxide Terminals

250ml 둥근바닥플라스크를 질소분위기로 준비한 다음 다이옥산(dioxane) 용매 150ml를 넣고, 상기 실시예 3.1로부터 얻은 선형의 폴리에틸렌옥사이드 40g을 30분 동안 교반하여 완전히 용해됨을 확인한 후, 숙신산무수물(Succinicanhydride) 1.922g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 1.954g, 트리에틸아민(Triethylamine, TEA) 1.62g이 각각 용해된 다이옥산 용액을 다시 첨가하였다. 질소분위기를 유지하며 섭씨 30℃의 반응조에서 24 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 회전식 증발기를 이용하여 용매를 적당량 날린 후, 클로로포름에 녹이고 여과하여 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60 시간 동안 상온 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 말단이 카르복실기로 개질된 선형의 폴리에틸렌옥사이드 중합체를 얻었다.250 ml round bottom flask was prepared in a nitrogen atmosphere, and then 150 ml of dioxane solvent was added, and 40 g of linear polyethylene oxide obtained in Example 3.1 was stirred for 30 minutes to completely dissolve. Succinicanhydride 1.922 g, Dioxane solution in which 1.954 g of dimethylaminopyridine (DMAP) and 1.62 g of triethylamine (TEA) was dissolved was added again. The reaction was carried out for 24 hours in a reactor at 30 ° C. while maintaining a nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, an appropriate amount of solvent was blown off using a rotary evaporator, dissolved in chloroform, and filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether, filtered through a membrane having a pore size of 0.2 μm, and then the procedure was repeated twice. Vacuum drying at room temperature in a reduced pressure drier for 60 hours to remove the residual solvent to obtain a linear polyethylene oxide polymer modified at the carboxyl end.

3.3 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체의 제조3.3 Preparation of Tetrapolylactide-Polyethylene Oxide Copolymers

상기 실시예 3.2로부터 얻은 카르복실로 개질된 선형의 폴리에틸렌옥사이드 30.8g을 메틸렌클로라이드(methylene chloride, MC) 100ml에 넣고 교반을 통해 완전히 용해시킨 후 N,N-디싸이클로헥실카보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC) 1.246g, 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP) 0.148g을 각각 메틸렌클로라이드에 녹여 첨가하였다. 상기 실시예 3.1로부터 얻은 4가의 폴리락타이드 20g을 메틸렌클로라이드 100ml에 완전히 용해시킨 후 상기 혼합 용액에 1시간에 걸쳐 천천히 적하하여 혼합하였다. 반응이 진행됨에 따라 서서히 디싸이클로헥실카보디유리아(dicyclohexylcarbodiurea, DCU)가 생성되어 침전되었다. 24 시간 동안 질소 분위기 하에서 반응을 진행한 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과하여 부산물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 여과한 다음 상기 과정을 두 번 반복하였다. 감압 건조기 내에서 60 시간 동안 상온 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 4가 폴리락타이드 말단에 선형의 폴리에틸렌옥사이드가 결합된 형태의 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체를 얻었다.30.8 g of a linear polyethylene oxide modified with carboxyl obtained in Example 3.2 was added to 100 ml of methylene chloride (MC) and completely dissolved by stirring, followed by N, N-dicyclohexylcarbodiimide (N, N 1.246 g of -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) and 0.148 g of dimethylaminopyridine (DMAP) were added to methylene chloride, respectively. 20 g of the tetravalent polylactide obtained in Example 3.1 was completely dissolved in 100 ml of methylene chloride, and then slowly added dropwise to the mixed solution over 1 hour to mix. As the reaction proceeds, dicyclohexylcarbodiurea (DCU) is gradually formed and precipitated. The reaction was carried out in a nitrogen atmosphere for 24 hours, and then filtered by a membrane having a pore of 0.2㎛ to remove by-products. The reaction solution was precipitated in diethylether, filtered and the procedure repeated twice. Vacuum drying at room temperature in a vacuum dryer for 60 hours to remove the residual solvent to obtain a tetravalent polylactide-polyethylene oxide copolymer of a linear polyethylene oxide bonded to the end of the tetravalent polylactide.

3.4 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드-헤파린 결합체의 제조3.4 Preparation of Tetravalent Polylactide-Polyethyleneoxide-Heparin Binders

증류수 1000ml에 2-(3-모포리노)에탄술폰산 (2-(3-morpholino)ethanesulfonic acid, MES) 4.88g을 녹여 0.05 MES 완충용액을 제조하였다. 상기 실시예 3.3으로부터 얻은 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드 공중합체 5g을 50ml의 MES 완충용액에 가하여 완전히 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-디메틸아 미노프로필)-카보디이미드 하이드로클로라이드 (1-ethyl-3-(-3-dimethyl aminopropyl)carbodiimide, EDC) 0.156g와 N-하이드록시숙신이미드 (N-hydroxylsuccinimide, NHS) 0.047g을 15분 간격으로 첨가하여 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 말단을 활성화하였다. A 0.05 MES buffer was prepared by dissolving 4.88 g of 2- (3-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) in 1000 ml of distilled water. 5 g of the tetravalent polylactide-polyethylene oxide copolymer obtained from Example 3.3 was added to 50 ml of MES buffer and completely dissolved. 0.156 g of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide hydrochloride with N-hydroxysuccinimide (N 0.047 g of -hydroxylsuccinimide, NHS) was added at 15 minute intervals to activate the ends of the Tetronic ® -lactactide copolymer.

상기 제조된 활성화 용액을 헤파린 4.8g이 녹아있는 MES 완충용액 150ml에 5분간에 걸쳐 적하하면서 혼합한 후 질소 분위기 하 섭씨 30℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 반응 종료 후 상기 결합체 용액을 투석막(투석제한분자량 15000)에 담고 72 시간 동안 증류수를 흘려주어 분자량이 낮은 미반응 물질과 잔여 화학물질을 제거하였다. 이로부터 얻어진 용액을 동결건조기 내에서 잔여 수분을 제거하여 흰색의 스펀지상의 4가 폴리락타이드-폴리에틸렌옥사이드-헤파린 결합체를 얻었다.The prepared activating solution was added dropwise to 150 ml of MES buffer in which 4.8 g of heparin was dissolved for 5 minutes, followed by reaction at 30 ° C. for 24 hours under a nitrogen atmosphere. After completion of the reaction, the binder solution was placed in a dialysis membrane (dialysis limiting molecular weight 15000), and distilled water was flowed for 72 hours to remove unreacted substances having low molecular weight and residual chemicals. The solution obtained therefrom was removed residual water in a freeze dryer to obtain a white sponge tetralactic polylactide-polyethylene oxide-heparin conjugate.

(비교예)(Comparative Example)

(비교예 1) (Comparative Example 1)

(선형 폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조)(Preparation of linear polylactide-heparin conjugates)

2구 둥근바닥 플라스크에 락타이드(L-Lactide) 10g을 넣었다. 분말형태의 모노머인 락타이드를 섭씨 180℃, 질소 기류하에서 30분 동안 액체 상태가 되도록 녹이며 교반시켰다. 모노머가 완전히 녹은 후 톨루엔과 혼합한 옥토산 제일주석(stannous octoate) 0.01g을 주사기를 사용하여 반응용기 내부로 주입시켰 다. 이 반응 용액을 섭씨 150℃에서 30분간 교반시켰다. 생성된 고체를 클로로포름에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르 (Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후 상온에서 60시간동안 진공 건조시켜 선형의 폴리락타이드를 얻었다.10 g of L-Lactide was added to a two-neck round bottom flask. The lactide, a monomer in powder form, was dissolved in a liquid state for 30 minutes under a nitrogen stream at 180 ° C. and stirred. After the monomer was completely dissolved, 0.01 g of stannous octoate mixed with toluene was injected into the reaction vessel using a syringe. The reaction solution was stirred at 150 ° C. for 30 minutes. The resulting solid was dissolved in chloroform and then filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether and then filtered through a membrane having a pore of 0.2 μm to obtain a reaction product. After repeating the above two times vacuum dried at room temperature for 60 hours to obtain a linear polylactide.

포름아미드(formamide)와 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide)를 1:1로 섞은 용매 100ml에 선형의 폴리락타이드 0.5g과 헤파린 1.8g을 각각 용해시킨 후 2구 둥근바닥 플라스크에 먼저 헤파린 용액을 넣었다. 이 헤파린 용액에 N,N-디싸이클로헥실카보디이미드(N,N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC)와 디메틸아미노피리딘(Dimethylaminopyridine, DMAP)을 폴리락타이드 몰수의 두 배의 몰수가 되도록 넣고 10분 동안 교반하였다. 이 반응용액에 폴리락타이드 용액을 첨가하여 질소분위기, 섭씨 50℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후 반응 용액을 과량의 메탄올 용액에서 침전시킨 후 증류수로 세척하였다. 얻어진 침전물은 다시 클로로포름에 용해시킨 후 다시 과량의 메탄올 용액에서 침전시켰다. 이후 상온에서 24시간 동안 진공 건조시켜 선형의 폴리락타이드-헤파린 결합체를 얻었다.Two-necked round-bottomed flasks were dissolved 0.5 g of linear polylactide and 1.8 g of heparin in 100 ml of a 1: 1 mixture of formamide and N, N-dimethylformamide. First heparin solution was added. To this heparin solution, N, N-dicyclohexylcarbodiimide (N, N-dicyclohexylcarbodiimide, DCC) and dimethylaminopyridine (DMAP) were added to double the number of moles of polylactide and stirred for 10 minutes. . A polylactide solution was added to the reaction solution and reacted for 12 hours at 50 ° C in a nitrogen atmosphere. After the reaction was completed, the reaction solution was precipitated in an excess methanol solution and washed with distilled water. The obtained precipitate was again dissolved in chloroform and again precipitated in excess methanol solution. After vacuum drying at room temperature for 24 hours to obtain a linear polylactide-heparin conjugate.

(비교예 2) (Comparative Example 2)

(스타형 폴리락타이드-헤파린 결합체의 제조) (Preparation of Star Polylactide-Heparin Binder)

건조된 앰플에 락타이드 10g과 펜타에리쓰리톨(pentaerythritol) 0.236g를 넣었다. 이후 톨루엔 5ml에 옥토산 제일주석(stannous octoate) 1.406g을 용해시킨 다음, 이 중 1ml를 취하여 앰플에 첨가하였다. 상기 앰플을 섭씨 60℃의 반응조에서 30분 동안 질소충전과 감압을 반복하여 내부의 수분과 공기를 완전히 제거한 후, 앰플의 입구를 봉하였다. 이렇게 봉해진 앰플을 섭씨 130℃의 반응조에서 6 시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후 앰플을 파괴하고, 클로로포름에 녹인 다음 여과를 통해 불순물을 제거하였다. 상기 반응 용액을 디에틸에테르(Diethylether)에 침전시킨 후 공극 0.2㎛의 막으로 여과를 통해 반응물을 얻었다. 위의 과정을 두 번 반복한 후 상온에서 60 시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하고 백색의 분말상을 갖는 스타형 폴리락타이드를 얻었다.10 g of lactide and 0.236 g of pentaerythritol were added to the dried ampoules. After dissolving 1.406 g of stannous octoate in 5 ml of toluene, 1 ml of this was added to the ampoule. The ampoule was repeatedly charged and depressurized for 30 minutes in a reactor at 60 ° C. to completely remove moisture and air therein, and then sealed the inlet of the ampoule. The sealed ampoules were reacted in a reactor at 130 ° C. for 6 hours. After completion of the reaction, the ampoule was destroyed, dissolved in chloroform, and then filtered to remove impurities. The reaction solution was precipitated in diethylether and then filtered through a membrane having a pore of 0.2 μm to obtain a reaction product. The above procedure was repeated twice, followed by vacuum drying at room temperature for 60 hours to remove residual solvent and to obtain a star polylactide having a white powdery form.

1,1-카르보디이미다졸(1,1-carbodiimidazole, CDI) 7.6g을 클로로포름 200ml에 용해시킨 다음, 스타형 폴리락타이드 6g을 클로로포름 150ml에 용해시켜 10분에 걸쳐 적하하였다. 상온에서 4시간 동안 반응시켜 스타형 폴리락타이드의 말단을 활성화시켰다. 반응 종료 후 반응 용액을 과량의 디에틸에테르(Diethylether)에서 침전시킨 후 증류수로 세척하였다. 얻어진 침전물을 다시 클로로포름에 용해시킨 후 다시 과량의 디에틸에테르(Diethylether)에서 침전시켰다. 이후 상온에서 60 시간 동안 진공 건조시켜 말단이 CDI로 활성화된 스타형 폴리락타이드를 얻었다.7.6 g of 1,1-carbodiimidazole (CDI) was dissolved in 200 ml of chloroform, and then 6 g of star polylactide was dissolved in 150 ml of chloroform and added dropwise over 10 minutes. The reaction was performed at room temperature for 4 hours to activate the ends of the star polylactide. After completion of the reaction, the reaction solution was precipitated in an excess of diethylether and washed with distilled water. The obtained precipitate was dissolved again in chloroform and again precipitated in excess of Diethylether. After vacuum drying at room temperature for 60 hours to obtain a star-type polylactide terminal is activated by CDI.

3구 둥근바닥 플라스크에 100ml의 포름아미드(formamide)를 넣고 헤파린 1.6g을 첨가 후 교반하여 완전히 용해시켰다. N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide, DMF) 50ml에 CDI로 활성화된 스타형 폴리락타이드 4g을 넣은 후 질소분위기의 헤파린 용액에 10분에 걸쳐 적하하였다. 섭씨 40℃에서 24 시간 동안 반응을 진행 한 후 반응 용액을 과량의 메탄올 용액에서 침전시킨 후 증류수로 세척하였다. 얻어진 침전물을 다시 클로로포름에 용해시킨 후 다시 과량의 메탄올 용액에서 침전시켰다. 이후 상온에서 60 시간 동안 진공 건조시켜 잔여 용매를 제거하여 스타형 폴리락타이드-헤파린 결합체를 얻었다.100 ml of formamide was added to a three-neck round bottom flask, and 1.6 g of heparin was added thereto, followed by stirring to completely dissolve it. Into 50 ml of N, N-dimethylformamide (DMF), 4 g of star-type polylactide activated with CDI was added and then dropwise added to a heparin solution in a nitrogen atmosphere for 10 minutes. After the reaction was performed at 40 ° C. for 24 hours, the reaction solution was precipitated in an excess methanol solution and washed with distilled water. The precipitate obtained was dissolved in chloroform again and then precipitated in excess methanol solution. After vacuum drying at room temperature for 60 hours to remove the residual solvent to obtain a star polylactide-heparin conjugate.

(실험예 1)Experimental Example 1

(핵자기공명분석법을 이용한 구조분석)(Structure Analysis Using Nuclear Magnetic Resonance Analysis)

상기 실시예 1.1로부터 얻은 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체, 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 구조를 분석하기 위하여 각각 CDCl3, D2O에 용해시켜 1H-NMR 스펙트럼(Nuclear magnetic resonance spectroscopy, Bruker AMX-5) 피크를 분석하였다. 그 결과는 각각 도 1, 도 2와 같다. In order to analyze the structure of the Tetronic ® -polylactide copolymer obtained in Example 1.1 and the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3, it was dissolved in CDCl 3 and D 2 O, respectively. NMR spectra (Nuclear magnetic resonance spectroscopy, Bruker AMX-5) peaks were analyzed. The results are as shown in Figs. 1 and 2, respectively.

도 1에서 보듯이, 실시예 1.1에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체는 3.6ppm과 1.1ppm에서 테트로닉®의 특성 피크가, 5.1ppm과 1.6ppm에서 폴리락타이드(PLA)의 특성 피크가 확인되였으며, 4.1ppm과 3.9ppm에서 폴리락타이드의 말단 CH3의 수소와 폴리락타이드와 연결된 테트로닉®의 에틸렌 그룹의 수소 피크가 확인되었다. As shown in FIG. 1, prepared in Example 1.1 Tetronic ® - polylactide copolymer is a characteristic peak of Tetronic ® at 3.6ppm and 1.1ppm, Properties of poly lactide (PLA) at 5.1ppm and 1.6ppm The peaks were identified and the hydrogen peaks of the ethylene group of Tetronic ™ linked with polylactide and hydrogen at the end CH 3 of the polylactide at 4.1 ppm and 3.9 ppm.

또한, 도 2에서 보듯이, 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체는 2.0ppm, 2.8ppm, 3.1ppm, 4.1ppm 및 4.2ppm에서 헤파린의 특성 피크가 확인되었고, 테트로닉®, 폴리락타이드의 특성 피크도 확인되었다.In addition, as shown in Figure 2, the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 has a characteristic peak of heparin was confirmed at 2.0ppm, 2.8ppm, 3.1ppm, 4.1ppm and 4.2ppm, The characteristic peaks of tronic ® and polylactide were also identified.

(실험예 2)Experimental Example 2

(적외선분광분석법을 이용한 구조분석)(Structure Analysis Using Infrared Spectroscopy)

상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR 스펙트럼 (Infrared spectrum, , Nicolet Magma-IR 5) 피크를 분석하였다. 그 결과는 도 3과 같다. The FT-IR spectrum (Infrared spectrum,, Nicolet Magma-IR 5) peak was analyzed to analyze the structure of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3. The result is shown in FIG. 3.

도 3에서 보듯이, 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체는 폴리락타이드(PLA)와 헤파린의 카르보닐 그룹이 각각 1750cm-1과 1690cm-1에서, 헤파린의 하이드록시기는 3500cm-1에서, 테트로닉®과 폴리락타이드의 메틸기는 2850cm-1에서 흡수파장이 특이적으로 나타났다. Prepared in Example 1.3 in Figure 3 is, as shown Tetronic ® - polylactide-heparin conjugate is polylactide (PLA) and heparin of the carbonyl group at 1750cm -1 and 1690cm -1, respectively, of Hyde heparin hydroxy group at 3500cm -1, a methyl group of Tetronic ® and polylactide were specifically absorbed wavelengths from 2850cm -1 enemy.

(실험예 3)Experimental Example 3

(동적광산란 분석을 통한 미셀 크기 확인)(Micelle size confirmation through dynamic light scattering analysis)

상기 실시예 1.1에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체, 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체 각각 0.1g을 100ml의 3차 증류수에 용해시켜 1%의 수용액을 제조한 후, 동적광산란 분석(Dynamic light scattering, DLS) 방법을 이용하여 633nm의 파장을 갖는 레이저를 사용하여 90°각도에서 산란되는 빛을 측정함으로써 수용액 상에서의 미셀의 크기를 측정하였다.Example 1.1 a Tetronic ® manufactured by-polylactide copolymer, the Tetronic ® prepared in 1.3 polylactide-dissolved in the distilled water of the heparin conjugate 0.1g 100ml each prepared an aqueous solution of 1% Then, the size of the micelle in the aqueous solution was measured by measuring the light scattered at a 90 ° angle using a laser having a wavelength of 633 nm using a dynamic light scattering (DLS) method.

상기 실시예 1.1에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 미셀 구조의 지름은 17㎚ 내지 18㎚(17±0.377nm)이었으며, 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체는 101㎚ 내지 102㎚(101±0.885nm)의 지름을 가지고 있음이 확인되었다. 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체에 헤파린이 결합됨에 따라 미셀 지름의 크기가 증가되었으며, 미셀구조를 이용한 약물전달에 응용하기에 적합한 크기임을 확인할 수 있었다. Was poly diameter of the micelle structure of a lactide copolymer is 17㎚ to 18㎚ (17 ± 0.377nm), Tetronic ® - - Example prepared in 1.1 Tetronic ® polylactide-heparin conjugate to 102 101㎚ It was confirmed that it had a diameter of (nm) (101 ± 0.885 nm). As the heparin is bound to the Tetronic ® -polylactide copolymer, the size of the micelle diameter is increased, and the size of the micelle structure is suitable for drug delivery.

(실험예 4)Experimental Example 4

(졸/겔 상전이 거동 분석)(Sol / gel phase transition behavior analysis)

상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체를 섭씨 5 ℃에서 3차 증류수 5㎖에 녹여 30 중량%에서 50 중량% 사이의 다양한 농도로 수 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 각각의 수용액을 항온조 내에서 섭씨 1℃씩 올려가면서 기울임을 반복하였다. 일정 온도에서 90˚ 회전시킬 때 초기의 형태를 유지하며 흘러내림이 1분 동안 없는 경우에는 겔(gel) 상태로 판단하고, 유동이 일어나면 졸(sol) 상태로 결정하였다. 섭씨 5 ℃에서 섭씨 90 ℃까지 1 ℃씩 온도를 상승시키면서 상전이 거동을 관찰하였다. The Tetronic ™ -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 was dissolved in 5 ml of tertiary distilled water at 5 ° C. to prepare an aqueous solution at various concentrations between 30 wt% and 50 wt%. Each aqueous solution thus prepared was repeated while raising the temperature by 1 ° C in a thermostat. When rotating at a constant temperature 90˚ maintains the initial form, if no flow for 1 minute was determined as a gel (gel) state, when the flow occurs was determined to the sol (sol) state. The phase transition behavior was observed while increasing the temperature by 1 ° C. from 5 ° C. to 90 ° C.

도 4는 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 졸-겔 거동을 보여주는 사진이고, 도 5는 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 온도, 농도에 따른 졸-겔 상전이 거동을 나타낸 그래프이다. Figure 4 is a photograph showing the sol-gel behavior of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention, Figure 5 is a Tetronic ® -polylac prepared in Example 1.3 of the present invention It is a graph showing the sol-gel phase transition behavior according to the temperature, concentration of the tide-heparin conjugate.

도 5에서 보듯이, 생분해성 고분자가 포함된 온도감응성 고분자에 친수성을 갖는 헤파린이 결합되더라도 본 발명의 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체는 상온에서는 졸(sol) 상태이나 체온에서는 겔(gel)을 형성하므로 주사용 약물 수송 시스템으로의 사용 가능성을 보여주고 있다.As shown in Figure 5, even if the hydrophilic heparin is bonded to the temperature-sensitive polymer containing the biodegradable polymer Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 of the present invention is sol (sol) state at room temperature However, since the body forms a gel (gel), it shows the possibility of use as an injection drug delivery system.

(실험예 5)Experimental Example 5

(헤파린 정량)(Heparin quantification)

0.02% 염화나트륨(NaCl) 수용액에 염산(HCl)을 첨가하여 0.01N HCl 용액을 제조한 다음 상기 제조용액 500㎖에 톨루이딘 블루(Toluidine Blue) 25mg을 첨가하 여 교반을 통해 0.005 중량% 톨루이딘 블루 용액을 제조하였다. 0.01N HCl solution was prepared by adding hydrochloric acid (HCl) to 0.02% sodium chloride (NaCl) aqueous solution, and then 25 mg of toluidine blue was added to 500 ml of the solution. Prepared.

헤파린을 0.02% 염화나트륨 수용액에 녹여 각각 0.01㎍/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 1㎍/㎖, 1.5㎍/㎖, 2㎍/㎖, 2.5㎍/㎖, 3㎍/㎖, 4㎍/㎖, 5㎍/㎖ 및 6㎍/㎖ 용액 2ml씩을 제조하여 헤파린 표준용액을 준비하였다. Heparin was dissolved in 0.02% aqueous sodium chloride solution, and 0.01 µg / ml, 0.05 µg / ml, 0.1 µg / ml, 0.5 µg / ml, 1 µg / ml, 1.5 µg / ml, 2 µg / ml, 2.5 µg / ml, and 3, respectively. Heparin standard solution was prepared by preparing 2 μg / ml, 4 μg / ml, 5 μg / ml, and 2 ml of 6 μg / ml solutions.

상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체 20㎍을 2ml의 염화나트륨 수용액에 용해시켜 시료 용액을 제조하였다. 각각의 헤파린 표준 용액과 시료 용액에 상기 제조한 톨루이딘 블루 용액 500㎕을 첨가한 후 살짝 교반을 하여 헤파린-톨루이딘 블루 복합체가 이루어지도록 한 다음 n-헥산을 각각 3㎖씩 첨가하여 강하게 흔들어 주었다. 기포가 생긴 층이 안정화 되도록 1분 동안 방치한 다음 아래의 수용액 층에서 각각 200㎕씩 뽑아 자외선 분광기를 통해 630㎚ 파장에서 흡광도를 분석하였다. 앞서 준비한 도 6의 헤파린 표준 용액의 흡광도와 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 흡광도를 비교 분석하였다. 그 결과 헤파린의 함량이 0.61㎍/㎍로 높은 양의 헤파린이 도입되었음을 확인하였다.A sample solution was prepared by dissolving 20 μg of Tetronic ™ -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3 in 2 ml of aqueous sodium chloride solution. 500 μl of the toluidine blue solution prepared above was added to each heparin standard solution and the sample solution, followed by slight stirring to form a heparin-toluidine blue complex, followed by vigorous shaking by adding 3 ml of n-hexane. After standing for 1 minute to stabilize the bubbled layer was analyzed by the ultraviolet spectrophotometer 200μL each from the aqueous solution layer below the absorbance was analyzed at a wavelength of 630nm. The absorbance of the previously prepared heparin standard solution of FIG. 6 was compared with that of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3. As a result, it was confirmed that a high amount of heparin was introduced with a heparin content of 0.61 µg / µg.

(실험예 6)Experimental Example 6

(항혈전 특성을 이용한 헤파린의 활성 분석)Analysis of Heparin Activity Using Antithrombotic Properties

3차 증류수에 헤파린을 녹여 각각 2㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.5㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.05㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.005㎍/㎖의 헤파린 표준 용액을 준비하였다. 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체, 비교예 1의 선형 폴리락타이드-헤파린 결합체, 비교예 2의 스타형 폴리락타이드-헤파린 결합체는 1㎍/㎖의 농도로 준비하였다. Heparin was dissolved in tertiary distilled water to prepare heparin standard solutions of 2 μg / ml, 1 μg / ml, 0.5 μg / ml, 0.1 μg / ml, 0.05 μg / ml, 0.01 μg / ml and 0.005 μg / ml, respectively. The Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3, the linear polylactide-heparin conjugate of Comparative Example 1, the star polylactide-heparin conjugate of Comparative Example 2 at a concentration of 1 μg / ml Ready.

각각의 헤파린 용액을 먼저 시험관에 넣은 후 미리 섭씨 37℃로 예열해 놓은 Citracted standard plasma 100㎕와 Pathromtin®SL 100㎕을 첨가하였다. 37 ℃ 하에서 0.025M의 염화칼슘 용액을 100㎕ 첨가함과 동시에 시간을 재기 시작하여 응고 분석기(coagulation analyzer, SYSMEX CA50)를 통하여 혈액이 응고되는 시간을 측정하였다. Each heparin solution was first added to a test tube, and then 100 μl of Citracted standard plasma and 100 μl of Pathromtin ® SL, which were preheated to 37 ° C., were added. 100 μl of 0.025 M calcium chloride solution was added at 37 ° C. and time was measured. The time for blood coagulation was measured through a coagulation analyzer (SYSMEX CA50).

앞서 준비한 헤파린 표준 용액의 응고 시간과 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 흡광도를 비교하여, 헤파린의 고유한 항혈전 특성이 온도감응성 고분자가 결합되지 않은 헤파린에 비해 얼마나 나타나는 지를 확인함으로써 결합된 헤파린의 활성을 분석하였다. 그 결과는 도 7과 같다. By comparing the coagulation time of the previously prepared heparin standard solution with the absorbance of the Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate prepared in Example 1.3, the inherent antithrombotic properties of heparin were compared to heparin without the thermosensitive polymer. The activity of bound heparin was analyzed by checking how much appeared. The result is shown in FIG.

도 7에 보듯이, 본 발명의 실시예 1.3의 헤파린 결합체는 67.2%의 헤파린의 활성을 나타냄으로써 기존의 헤파린 함유 고분자인 비교예 1, 비교예 2에 비해 많은 양의 헤파린이 도입됨과 동시에 더 높은 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. As shown in Fig. 7, the heparin conjugate of Example 1.3 of the present invention exhibited 67.2% of heparin activity, and thus a large amount of heparin was introduced and higher than that of the conventional heparin-containing polymers of Comparative Examples 1 and 2, respectively. It was confirmed that it has activity.

(실험예 7)Experimental Example 7

(염기성 섬유아세포 성장인자의 부착 실험)(Adhesion Experiment of Basic Fibroblast Growth Factor)

섭씨 5℃에서 0.01M의 PBS(Phosphate buffer saline) 수용액에 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린을 녹여 40 중량%의 용액을 5ml 제조하였다. 제조된 용액을 섭씨 37℃의 항온조에 방치하여 겔(gel) 상태로 변화시킨 후 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 50ng를 포함한 PBS용액 2ml를 첨가하였다. 표면과 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 충분히 상호작용이 가능하도록 섭씨 37 ℃에서 두 시간 동안 방치한 후 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 포함된 상층부를 제거하고, 신선한 PBS 용액으로 2회 세척하여 표면에 부착되지 않은 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 제거하였다. 5 ml of a 40% by weight solution was prepared by dissolving the Tetronic ® -polylactide-heparin prepared in Example 1.3 in an aqueous solution of 0.01M PBS (Phosphate buffer saline) at 5 ° C. The prepared solution was placed in a thermostat at 37 ° C. to a gel state, and then 2 ml of PBS solution containing 50 ng of basic fibroblast growth factor (bFGF) was added. After allowing the surface and basic fibroblast growth factor (bFGF) to fully interact, leave it at 37 ° C for two hours, remove the upper layer containing basic fibroblast growth factor (bFGF), and wash twice with fresh PBS solution. Basic fibroblast growth factor (bFGF) that did not adhere to the surface was removed.

염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 흡착된 샘플은 다시 온도를 5 ℃로 낮추어 졸(sol) 상태로 변화시킨 후, PBS용액을 10ml 더 첨가하여 농도를 낮추었다. 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 정량 키트(Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R&D System)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 헤파린이 결합되지 않는 샘플과 비교하여 헤파린에 의한 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 도입 정도를 확인하였다. 그 결과를 아래 표 1에 나타내었다. The sample to which the basic fibroblast growth factor (bFGF) was adsorbed was lowered to 5 ° C. and then changed to a sol state, and then the concentration was lowered by adding 10 ml of PBS solution. Measurement of absorbance at 450 nm using a basic fibroblast growth factor (bFGF) quantitative kit (Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R & D System) of heparin-based basic fibroblast growth factor (bFGF) The degree of introduction was confirmed. The results are shown in Table 1 below.

흡광도(absorbance)  Absorbance 대조군Control 0.0904 0.0904 실시예 1.3Example 1.3 0.2016 0.2016

대조군에 비하여 상기 실시예 1.3의 헤파린 결합체가 두 배 이상의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)에 대한 친화력을 가짐을 확인하였다. 즉, 이러한 본 발명의 헤파린 결합체와 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 특이적인 결합은 조직공학이나 약물 수송 시스템으로의 사용 가능성을 보여주고 있다.It was confirmed that the heparin conjugate of Example 1.3 had affinity for more than two times basic fibroblast growth factor (bFGF) compared to the control group. That is, the specific binding of the heparin conjugate and basic fibroblast growth factor (bFGF) of the present invention shows the possibility of use in tissue engineering or drug transport system.

(실험예 8)Experimental Example 8

(섬유모세포 성장인자의 방출 실험)(Release Experiment of Fibroblast Growth Factor)

섭씨 5℃에서 0.01M의 PBS(Phosphate buffer saline) 수용액에 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체, 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체를 각각 녹여 40 중량%의 용액을 5ml 제조한 다음 50ng의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 첨가하였다. 이렇게 제조된 용액을 섭씨 37℃의 항온조에 방치하여 겔(gel) 상태로 변화시킨 후 신선한 PBS용액을 2ml 첨가하였다. 일정 시간마다 상층의 PBS 용액 부분을 1.5ml를 뽑아 냉장고에 따로 보관하고 새로운 PBS 용액을 1.5ml 첨가하였다. 시간대 별로 방출되는 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 포함한 PBS 용액들은 한꺼번에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 정량 키트(Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R&D System)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 시간에 따른 bFGF의 방출량을 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. A Tetronic ® prepared in Example 1.3 in PBS (Phosphate buffer saline) solution of 0.01M at 5 ° C ℃-polylactide-heparin conjugate, Tetronic ® - polylactide melt the copolymer, each solution of 40% by weight To prepare 5 ml of 50 ng basic fibroblast growth factor (bFGF) was added. The solution thus prepared was left in a constant temperature bath at 37 ° C. to a gel state, and 2 ml of fresh PBS solution was added thereto. Each time, 1.5 ml of the upper portion of the PBS solution was extracted and stored separately in the refrigerator, and 1.5 ml of the fresh PBS solution was added thereto. PBS solutions containing basic fibroblast growth factor (bFGF) released over time were absorbed at 450 nm using basic fibroblast growth factor (bFGF) quantitative kit (Quantikine Human FGF Basic Immunoassay, R & D System). The release amount of bFGF was compared. The results are shown in FIG.

헤파린이 포함되지 않은 시료인 실시예 1.1의 테트로닉®-폴리락타이드 공중합체의 경우에는 100 시간 이후에 90% 이상의 양의 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 방출되었음에 비해, 상기 실시예 1.3에서 제조한 테트로닉®-폴리락타이드-헤파린 결합체의 경우에는 100 시간 이후에도 60% 이상의 양을 가지고 있어 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 부착능력이 우수할 뿐만 아니라 안정적으로 보유하고 있을 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 세포친화성이 뛰어나며, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 약물로서 서서히 방출하는 시스템 또는 조직재생용 재료로서 응용가능성을 가지고 있음을 알 수 있었다. Example 1.3 of the Tetronic ® -polylactide copolymer of Example 1.1, which is a sample without heparin, compared with the release of more than 90% of basic fibroblast growth factor (bFGF) after 100 hours. In case of Tetronic ® -polylactide-heparin conjugate manufactured by the company, it has an amount of more than 60% even after 100 hours, so it is not only excellent in adhesion ability of basic fibroblast growth factor (bFGF) but also it can be stably retained. Confirmed. In other words, it was found that the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention has excellent cell affinity, and has applicability as a system for slowly releasing basic fibroblast growth factor (bFGF) as a drug or a material for tissue regeneration.

상술한 바와 같이, 본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 향상된 헤파린의 생리활성 및 생체적합성을 가질 뿐만 아니라 온도감응성과 생분해성을 동시에 가지며, 졸/겔 상전이 거동에 있어 주입형 약물전달체로 사용되기에 적합한 특성을 갖는다. 따라서 본 발명의 온도감응성 헤파린 결합체는 주입형 약물전달체용 재료를 포함하여, 조직 공학과 관련된 다양한 산업 분야에서의 응용이 기대된다. As described above, the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention not only has the enhanced physiological activity and biocompatibility of heparin, but also has both temperature sensitivity and biodegradability, and is suitable for use as an injectable drug carrier in sol / gel phase transition behavior. Has characteristics. Therefore, the temperature-sensitive heparin conjugate of the present invention is expected to be applied in various industrial fields related to tissue engineering, including materials for injectable drug carriers.

Claims (12)

헤파린에 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자가 결합된 온도감응성 헤파린 결합체.A thermosensitive heparin conjugate in which a thermosensitive polymer having a polyfunctional group containing heparin is contained in a biodegradable polymer. 제1항에서, 상기 온도감응성 고분자는 블록공중합체로서,The method of claim 1, wherein the temperature sensitive polymer is a block copolymer, 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 제1소수성 블록, 폴리(프로필렌옥사이드)로 구성되는 제2소수성 블록 및 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체.A thermosensitive heparin binder comprising a first hydrophobic block composed of poly (ester), a second hydrophobic block composed of poly (propylene oxide), and a hydrophilic block composed of poly (ethylene oxide) . 제1항에서, 상기 온도감응성 고분자는 블록공중합체로서,The method of claim 1, wherein the temperature sensitive polymer is a block copolymer, 폴리(에스테르)로 구성되는 생분해성 고분자인 소수성 블록과 폴리(에틸렌옥사이드)로 구성되는 친수성 블록을 포함하는 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체.A thermosensitive heparin conjugate comprising a hydrophobic block consisting of a hydrolyzable polymer comprising a poly (ester) and a hydrophilic block consisting of a poly (ethylene oxide). 제1항에서, 상기 온도감응성 고분자는,The method of claim 1, wherein the temperature sensitive polymer, 3 개 이상의 관능기를 갖는 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체.A temperature sensitive heparin conjugate characterized by having three or more functional groups. 제1항에서, 상기 온도감응성 고분자는,The method of claim 1, wherein the temperature sensitive polymer, 3 개 내지 8 개의 관능기를 갖는 스타형 고분자인 것을 특징으로 하는 온도 감응성 헤파린 결합체.A temperature sensitive heparin conjugate, characterized in that it is a star polymer having 3 to 8 functional groups. 제1항에서, 상기 온도감응성 고분자는,The method of claim 1, wherein the temperature sensitive polymer, 하기 화학식 1, 하기 화학식 2, 하기 화학식 3, 하기 화학식 4 및 하기 화학식 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체:A temperature-sensitive heparin conjugate, characterized in that one selected from the group consisting of the following formula (1), (2), (3), (4) and (5): [화학식 1][Formula 1]
Figure 112006057411514-PAT00006
Figure 112006057411514-PAT00006
 [화학식 2][Formula 2]
Figure 112006057411514-PAT00007
Figure 112006057411514-PAT00007
 [화학식 3][Formula 3]
Figure 112006057411514-PAT00008
Figure 112006057411514-PAT00008
 [화학식 4][Formula 4]
Figure 112006057411514-PAT00009
Figure 112006057411514-PAT00009
 [화학식 5][Formula 5]
Figure 112006057411514-PAT00010
Figure 112006057411514-PAT00010
 (상기 화학식 1 내지 5에서,(In Chemical Formulas 1 to 5, a는 중합도로서 61 내지 62의 값을 갖고,a has a value of 61 to 62 as the degree of polymerization, b는 중합도로서 19 내지 20의 값을 갖고,b has a value of 19 to 20 as the degree of polymerization, c는 중합도로서 7 내지 8의 값을 갖고,c has a value of 7 to 8 as the degree of polymerization, d는 중합도로서 10 내지 105의 값을 갖고,d has a value of 10 to 105 as the degree of polymerization, e는 중합도로서 25 내지 385의 값을 갖고,e has a value of 25 to 385 as the degree of polymerization, f는 중합도로서 10 내지 105의 값을 갖고,f has a value of 10 to 105 as the degree of polymerization, g는 중합도로서 12 내지 193의 값을 갖고,g has a value of 12 to 193 as the degree of polymerization, h는 중합도로서 16 내지 65의 값을 갖고,h has a value of 16 to 65 as the degree of polymerization, i는 중합도로서 20 내지 105의 값을 갖고,i has a value of 20 to 105 as the degree of polymerization, j는 중합도로서 16 내지 33의 값을 갖고,j has a value of 16 to 33 as the degree of polymerization, k는 중합도로서 20 내지 105의 값을 갖는다.)k has a value of 20 to 105 as the degree of polymerization.) 제1항에서, 상기 생분해성 고분자는, The method of claim 1, wherein the biodegradable polymer, 폴리락타이드, 폴리(ε-카프로락톤), 폴리(락타이드-co-글리코리드), 폴리(락타이드-co-ε-카프로락톤), 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드) 및 폴리(ε-카프로락톤-co-글리코리드-co-락타이드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체.Polylactide, poly (ε-caprolactone), poly (lactide-co-glycolide), poly (lactide-co-ε-caprolactone), poly (ε-caprolactone-co-glycolide) and poly (ε-caprolactone-co-glycolide-co-lactide). 제1항에서, 상기 헤파린은, The method of claim 1, wherein the heparin, 헤파린, 재조합 헤파린(recombinant heparin), 헤파린 유도체(heparin derivative) 및 헤파린 유사체(heparin analogue)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체.A temperature-sensitive heparin conjugate, characterized in that selected from the group consisting of heparin, recombinant heparin, heparin derivative and heparin analogue. (1) 생분해성 고분자가 포함된 다관능기를 갖는 온도감응성 고분자를 제조하는 단계;(1) preparing a temperature sensitive polymer having a multifunctional group containing a biodegradable polymer; (2) 상기 온도감응성 고분자의 다관능기를 활성화시키는 단계; 및,(2) activating the multifunctional group of the temperature sensitive polymer; And, (3) 상기 활성화된 온도감응성 고분자의 다관능기에 헤파린을 결합시키는 단계(3) binding heparin to the multifunctional group of the activated temperature sensitive polymer; 를 포함하는 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법.Method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate comprising a. 제9항에서, 상기 헤파린과 상기 온도감응성 고분자의 결합은,The method of claim 9, wherein the binding of the heparin and the temperature sensitive polymer, 하이드록실기(hydroxyl group), 카르복실기(carboxyl group), 아민기(amine group), 티올기(thiol group) 및 아지드기(azide group)로 이루어진 군으로부터 선택되는 반응기를 이용한 공유결합인 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법.Characterized in that it is a covalent bond using a reactor selected from the group consisting of a hydroxyl group (hydroxyl group), carboxyl group (carboxyl group), amine group (amine group), thiol group (thiol group) and azide group (azide group) Method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate to. 제9항에서, 상기 공유결합은,The method of claim 9, wherein the covalent bond, 아미드 결합(amide bond), 우레탄 결합(urethane bone)과 같은 비분해성 결합(non-degradable bond) 및 에스테르 결합(ester bond), 안하이드라이드(anhydride bond)과 같은 분해성 결합(degradable bond)로 이루어진 군으로부터 선택되는 결합인 것을 특징으로 하는 온도감응성 헤파린 결합체의 제조방법.A group consisting of amide bonds, non-degradable bonds such as urethane bones, and degradable bonds such as ester bonds and anhydride bonds. Method for producing a temperature-sensitive heparin conjugate, characterized in that the bond selected from. 제1항의 온도감응성 헤파린 결합체를 포함하는 주입형 약물전달체. Injectable drug delivery comprising the temperature-sensitive heparin conjugate of claim 1.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113226376A (en) * 2018-10-26 2021-08-06 内布拉斯加大学董事会 Thermosensitive injectable gels based on macromolecular prodrugs as novel drug delivery platform

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