KR20060058830A - 개별시료 주입구가 없는 다중채널 전기영동장치에 의한분리방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 시료가 채취장치에서 칩의 분리관으로 직접도입 됨으로써, 종래의 전기영동장치에서 필요한 별도의 유로나 개별 시료저장장치가 필요 없이, 칩의 구조가 극히 단순해져 제조가 용이하고 분리관의 고밀도 배치가 가능하며, 나아가 시료저장조의 용매로 비극성용매를 사용하는 것에 의해 유전자, 단백질 등의 화합물을 저장조에서 확산에 의한 간섭 없이 매우 정밀하게 분석할 수 있는 전기영동에 의한 분리방법을 제공한다.
비극성용매, 전기영동장치, 다중채널, 단백질, 분리
Description
도 1은 본 발명이 적용하는 개별 시료 주입구가 생략된 다중채널 초소형 전기영동장치.
도 2는 종래의 시료도입 기술에서 요구되는 개별 시료투입구 및 십자유로 형성용 가지관을 구비한 전기영동칩 상의 전형적인 시료주입용 십자유로.
도3은 본 발명에 따른 전기영동칩을 고정하는 장치.
도4는 본 발명에 따른 자동간격 조정형 시료흡입 및 토출기구.
도5는 본 발명의 비극성 용매 내에서 시료가 토출되는 동안 확산되거나 흩어지지 않음을 보이는 사진.
도6은 본 발명의 전기장의 인가에 따라 시료가 분리관 안으로 도입되는 과정을 나타내는 사진.
도7은 본 발명에 따른 시료주입에서 먼저 도입된 DNA가 후속되는 이웃 분리관에 시료를 주입하는 것에 영향을 받지 않음을 나타내 보이는 사진.
도8은 본 발명의 전기장으로 주입된 시료가 계속되는 전기영동을 통해 성공 적으로 분리되는 과정을 나타내 보인 사진.
- 도면의 부호설명 -
1 : 모세분리관 2: 전기영동칩 3: 저장조
4 : 고정판 5: 좌축고정장치 6: 우측고정장치
7: 탄성체판(실리콘판) 8: 전기영동채널 10: 전기영동장치
본 발명은 초소화 다중채널 전기영동장치를 이용하여 전기영동 분석을 수행하는 기술에 관한 것이다.
초소화 다중채널 전기영동장치 기술은 화학물질, 유전자, 또는 단백질 등의 고속 전기영동분석을 빠르고 간편하게 수행할 수 있도록 하는 유용한 분석도구로 개발되고 있다.
종래의 전기영동칩은 도2와 같이 시료주입을 위한 별도의 시료투입구를 두고 이 시료투입구와 분리관 사이의 연결부의 십자로를 이용, 정교하게 시료를 분리관으로 주입하는 방식을 사용한다. [Seiler, K., etc., Anal. Chem. 1993, 65,1481-1488]. 시료도입용 십자유로를 사용한 종래의 시료주입 기술은 개별 시료주입구와 십자로의 형성을 요구하기 때문에 분리관의 배열이 복잡해지고 나아가 분리관의 배 열밀도를 높이는데 제약을 가한다. 이러한 이유로 현재 시판되고 있는 Agilent사의 DNA/RNA 전기영동칩의 경우, 칩 당 분리관은 하나 밖에 없으며, 시료도입구가 12개 설치되어 단일분리관을 사용해 12개의 시료가 차례로 분석된다. 최근 B. M. Paegel 등이 96채널 전기영동 칩을 발표한 바 있으나 [Paegel,P.M., etc., PNAS 2002, 99,574~579] 이 경우에도 각 채널에 요구되는 개별 시료투입구와 십자유로 때문에 칩의 구조가 방사형으로 설계되었다. 방사형 설계는 칩의 제조 및 절단에 기술적 어려움 또는 비경제성을 더할 뿐 아니라 회전하면서 동작하는 고도의 검출기술이 요구된다.
상기와 같은 문제점을 해결하고자, 이러한 시료도입용 십자유로를 제거하고 분리관 상에 시료저장조를 직접 설치하는 기존의 십자유로를 제거한 다중채널 칩들이 발표된 바 있으나 [Backhouse,J.W., etc., Electrophoresis 2000, 21, 150~156, Simpson,J.W., etc., Electrophoresis 2000, 21, 135~149], 이 경우에도 분리관 보다 상대적으로 매우 큰 개별 시료투입구가 분리관 상에 설치되기 때문에 분리관 간의 간격이 넓어지고, 또한 투입구의 가공이 비용이 많이 들고 기술적으로 쉽지 않은 문제점들이 지적될 수 있다.
본 연구그룹에서는 선행연구에서 이러한 문제점을 극복하기 위해 도 1과 같이 개별 시료저장조가 제거된 하나의 시료저장조로만 된 단순구조의 전기영동장치가 제안되었는데 [한국특허출원번호 2004-40408], 이 경우 시료를 투입할 경우 하나의 시료저장조에서 시료를 투입할 때, 시료의 확산에 의해 다른 모세관으로 시료가 흘러들어가서 전기영동 되는 현상이 발생하여 분석의 정확도를 저해할 수 있는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기한 바와 같은 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 본 발명의 목적은 개별 시료주입구나 시료도입용 십자로가 원천적으로 제거된 단순한 구조의 초소화 다중채널 전기영동장치를 실용화하는데 필요한 독창적 시료도입기술을 구현하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명자가 기 발명하여 출원한 선행발명[한국특허출원번호 2004-40408]에 따른 고밀도의 분리관을 설치가능하고, 저렴한 비용으로 장치를 제작될 수 있는 단순한 구조의 전기영동장치를 이용하여 시료를 더욱 효과적으로 주입할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 분리관이 평행직선형으로 배열되는 장점을 살려 칩의 길이를 필요에 따라 다양하게 변화시킬 수 있도록 하는 시료의 효과적 분리방법 및 그 장치를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기와 같이 조절가능한 칩을 사용하고, 효과적 주입방법을 개발하는 것에 따라, 서로 다른 분리능을 요구하는 다양한 종류의 유전자분석에 모두 적용될 수 있는 전기영동장치를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기와 같이 하나의 시료저장조로만 된 단순구조의 전기영동장치 에서 확산에 의해 야기되는 분리의 정확도를 저해하는 현상을 방지하기 위하여, 비극성 용매를 시료저장조에 저장하여 투입하고, 해당 시료토출관에 의해 시료를 비극성용매 중에 투입하고 해당 분리관 전면에 토출된 각 시료들은 각 토출관의 종단부 금속부에 걸리는 음의 전장 (또는 양의 전장)에 의해 해당분리관으로 도입하여 전기영동함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 시료저장조에 비극성용매를 저장하고, 이 비극성 용매 저장조에 시료를 투입하여 확산을 방지하는 단계를 포함하는 것을 본 발명의 하나의 특징부로 한다. 본 발명에 사용한 비극성 용매는 점도를 가지는 실리콘오일, 광유 등의 비극성 오일을 사용하는 것이 바람직하며, 좋게는 실리콘오일을 사용하는 것이 가장 좋다. 사용하는 비극성 용매의 점도는 크게 제한을 받지 않으므로 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
이하는 본 발명에 따른 유전자 또는 단백질 등을 고속으로 분리가능한 다중채널 전기영동장치를 이용한 분리단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
1) 다중채널 전기영동칩의 구조 및 설치
다중채널 전기영동칩의 제작은 본 출원인이 출원한 한국특허출원번호 2004-40408호에 기재된 방식으로 제조할 수 있다. 이를 간략히 설명하면, 본 발명은 도 1에서 도식한 바와 같이, 내경 10 ~ 200㎛, 외경이 300 ~ 400㎛의 용융실리카 모세관이 상기 모세관을 배열할 수 있는 길이방향으로 적당한 폭과 깊이로 홈이 형성된 플라스틱기저판의 홈에 여러 줄의 모세관을 배열하고 에폭시수지, 우레탄수지, 페 놀수지, 실리콘수지 또는 아크릴수지와 같은 침적용 수지를 경화제에 의해 경화하여 생성할 수 있는 단량체 또는 올리고머를 충진하여 상기 수지가 형성되도록 경화하여 제조한 다중채널 전기영동칩(2)을 전기영동장치(10)의 저면에 삽입함으로써 비극성용매가 저장되는 저장조(3)를 형성하는 다중채널전기영동칩(2)을 설치한 전기영동장치(10)를 완성한다.
본 발명의 다중채널 전기영동칩은 실제 응용에 맞게 칩의 길이를 알맞게 다이아몬드-휠 톱으로 절단하여 길이를 가변 할 수 있도록 하여 제작할 수 있다. 따라서, 분리할 시료에 따라 다중채널전기영동칩의 길이가 서로 상이한 것을 채택하여 사용하기도 한다.
이를 더욱 구체적으로 설명하면, 상기의 전기영동장치(10)는 도 3과 같이 방식으로 다중모세분리관(1)이 형성된 전기영동 칩(2)을 시료의 도입 및 전기영동을 위해 좌우측 고정장치(5,6)의 저면에 올려놓고, 좌우측 고정장치(5,6)의 간격을 줄이면서 칩(2)을 압박하면 칩이 저면에 수직인 단부에 적층되어 있는 탄성 실리콘(7)에 압착되어 단단하게 고정됨과 동시에 새지 않는 두개의 완충용액 저장조가 형성된다.
2) 전기영동 채널의 준비
칩 상의 모세분리관(1)인 전기영동채널(8)은 사용 전 전기영동용 완충용액 또는 분리용 매질로 미리 채워진다. 한 쪽 저장조(3)에 충진할 용액 또는 매질을 채우고 반대쪽 저장조에서 음의 압력을 가하여 채널내로 용액 또는 분리매질을 빨아들인다. 또는 이와 반대로 양의 압력을 가하여 밀어 넣는 방식으로 채널들을 채 울 수도 있다. 채워진 채널에서 충진물질이 마르는 것을 막기 위해 충진 직후 양쪽 저장조를 적절한 용액으로 채운다.
3) 모세관 시료전달 장치
전기영동될 시료는 시료채취용 관 세트에 의해 보통 96-well 형태의 저정조에 보관된 시료용기로부터 음의 압력에 의해 빨아들여졌다가 각각의 해당 분리관 앞으로 이송된 후 양압에 의해 소량 (1 μL 이하) 토출되게 된다. 이 분리관 세트는 본 출원인이 선 출한한 우리나라 특허출원2004-28405호에서 고안된 자동간격조정형시료흡입/토출기구(도4)에 탑재될 수 있다.
4) 시료확산 방지를 위한 비극성용매의 사용
이렇게 토출된 시료들이 분리관으로의 시료도입 과정에서 분산되는 것을 막기 위해 시료도입부 측의 완충용액 저장조는 사전에 비극성 용매(예: 실리콘 유, 광유, 폴리올레핀올리고머 등)로 채워진다. 비극성 용매를 사용하는 경우에는 단백질이나 DNA의 분리 시 이들이 저장조 내의 용매에서 시간의 경과에 따라 확산되지 않는 사실을 발견하고, 이러한 사실은 기존의 복잡한 십자유로나 개별 저장조와 같은 시료주입장치가 불필요하게 되고, 또한 그 개별 저장조 내의 확산과 같은 문제를 원천적으로 차단함으로써 시료의 분리를 더욱 정밀하게 하는 장점이 있는 놀라운 효과를 얻을 수 있었다. 도5는 본 발명에 따라 토출된 시료가 시간이 경과해도 분산되지 않고 그 모습을 유지하는 것을 보여 주는 일례를 든 것이다. 도 5에서 나타난 바와 같이, 토출된 시료는 시간의 경과에 따라 전혀 확산되거나 그 형태의 변화가 없는 것을 알 수 있어 본 발명의 실리콘 유 등의 비극성용매를 사용한 경우 매우 정밀한 분리작업이 가능한 것임을 알 수 있다.
5) 시료 토출관 종단부를 전극으로한 시료의 전기적 주입
해당 분리관 전면에 토출된 각 시료들은 각 토출관의 종단부 금속부에 걸리는 음의 전장 (또는 양의 전장)에 의해 해당분리관으로 도입된다. 토출된 시료가 분리관 입구와 직접 닿았을 경우, 시료가 원활히 도입된다. 도6은 시료가 도입되는 과정을 보인 것이다. 특정시료가 토출되는 과정에서 확산등에 의하여 이웃하는 분리관에 주입되지 않음을 명백히 알 수 있다. 도 7은 시료를 순차적으로 이웃하는 분리관으로 도입하는 것을 보여주는 사진이다. 먼저 주입된 시료가 이웃 분리관에의 시료도입에 의해 영향 받지 않고 각각이 간섭없이 매우 정확하게 시료의 분리관으로 시료가 도입되는 것임을 알 수 있다.
6) 시료의 자동응축 및 전기영동
위 5)의 방법으로 시료를 분리관에 도입한 후, 비극성 용매를 전기영동 완충용액으로 교체하고 고정장치에 부착된 선형전극에 전장을 가해 전기영동을 시작하면 도8에 보인 바와 같이 일단 시료밴드가 자동으로 응축되다가, 이어 전기영동에 의한 DNA 밴드의 분리가 시작된다. 도8은 혼합된 8종의 DNA가 모두 잘 분리됨을 보이고 있다.
7) 후속 전기영동을 위한 준비
위와 같이 전기영동이 끝나면 후속되는 DNA분석을 위해 완충용액, 분리용 폴리머매질, 비극성용매 등이 바꾸어 채워지는데, 이 조작은 이러한 용액의 각 저장용기, 저장조, 그리고 폐액 저장용기 사이를 이동하는 파이펫에 의해 자동으로 이 루어진다.
8) 분석시스템의 운영
이상의 일련의 조작은 유체역학과 로보틱스 조작에 의해 프로그램에 정해진 순서대로 자동으로 이루어진다.
이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 통하여 본 발명을 구체적으로 설명하며, 본 발명은 그 기술사상의 범위 내로서 하기의 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
다중채널 전기영동장치를 사용한 DNA시료의 주입 및 분리
다음의 조건을 적용하여 이상에서 기술된 방법들의 실현가능성을 실험하였다.
전기영동 칩은 24개의 모세관채널을 가지는 칩으로서, 내경이 100 ㎛이고 채널의 길이는 30 mm의 모세관을 가지는 전기영동칩을 사용하였으며, 채널내에는 먼저 3% PEO (polyethylene oxide, Aldrich co.)로 충진하였다.
전기영동 완충액은 통상의 완충액에 해당하는 0.5 X TBE buffer (45 mM Tris-borate, 1mM EDTA, pH 8.0)를 사용하였으며, 분리될 시료는 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 및 1000 bp DNA혼합액을 사용하였다.
전기영동장치의 저장조에는 비극성용매로 실리콘오일을 주입하였으며, 시료의 주입은 시료의 토출관끝에 200 V를 가하여 20 초 간 인가하여 시료를 분석관인 모세관으로 시료를 주입하였다. 시료를 주입한 후, 전기영동장치의 저장조에 있는 실리콘 오일을 완충용액으로 바꾼 후, 200 V의 전압을 인가하여 전기영동하여 시료를 분리하였다. 분리된 DNA는 10 x SybrGreen I과 혼합된 DNA를 Ar ion laser의 488 nm로 여기시켜 나온 형광을 현미경에 장착된 디지털 카메라로 촬영하여 DNA밴드를 검출하여 분리하였다.
그 결과를 도 7 및 도 8에 기재하였다. 도 7과 같이 이웃하는 분리관에 투입된 시료에 간섭없이 순차적인 투입에 의해서도 분리관으로 용이하게 확산 없이 시료가 잘 투입되었으며, 도 8에서와 같이 투입된 시료가 잘 분리되어 검출됨을 확인할 수 있었다.
본 발명은 기존의 전기영동장치에서 분리관마다 별도의 시료투입저장조의 필요 없이 버퍼 저장조에 비극성용매를 투입하여 시료를 분리관으로 주입함으로서, 시료의 확산에 의한 간섭없이 복수의 시료를 분리관으로 유도할 수 있어, 초소형 다중채널 전기영동장치를 간단하게 제작하여 실용화할 수 있고, 그 구조의 단순화로 인하여 칩 제조가 용이하며 제조비용을 절감할 수 있다.
또한, 칩 구조에서 기존의 개별 시료투입구와 시료 주입용 가지채널을 제거함으로서, 전기영동 채널의 고밀도화를 실현할 수 있고, 길이 가변형 칩 개념의 도입으로 다중채널 전기영동 칩 기반 유전자 분석시스템의 적용범위를 확장가능하게 하였다.
본 발명의 또 다른 효과는, 본 발명의 거리 가변형 다중채널 시료 흡입/토출 장치의 실용화에 있어서 위치설정 상에 다소의 여유를 준다. 즉 토출된 시료가 퍼지지 않을 뿐 아니라 해당 분리관을 향해 전기적으로 유도, 도입되므로 토출관의 분리관에 대한 상대적 위치가 다소 불균질한 경우에도 시료를 정확히 주입할 수 있도록 하며, 이러한 시료도입기술은 시스템의 자동운영에 적합하여 분석시스템이 전체적으로 완전자동화 될 수 있도록 하는 기능을 할 수도 있다.
Claims (13)
- 다중채널 전기영동장치에 의해 유전자를 분리하는 방법에 있어서,다중채널 전기영동장치는 두 개의 조각으로 이루어진 좌우측 고정장치, 2이상의 분리모세관인 전기영동채널이 설치된 전기영동칩, 좌우측고정장치를 양쪽에서 이동시켜 전기영동칩을 압착하여 고정하는 것에 의해 형성되는 저장조를 포함하며, 상기 저장조에는 비극성용매를 충진하여 시료토출관으로부터 토출되는 시료가 확산되지 않고 전기영동칩의 모세 분리관으로 주입하는 단계를 가지는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 제 1항에 있어서,저장조에 있는 시료 토출관의 종단부의 금속부를 전극으로 사용하여 이에 전압을 거는 방법으로 토출관에서 토출된 시료를 개별 시료투입구가 없는 2개 이상의 다중채널 전기영동장치의 해당 모세 분리관에 직접 주입하는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 제 2항에 있어서,상기 저장조는 실리콘오일, 광유 및 폴리올레핀 올리고머에서 선택되는 어느 하나의 비극성용액으로 채워 시료토출관으로부터 토출된 시료가 확산되거나 흩어지는 것 없이 분리관으로 주입되는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 제 3항에 있어서,비극성용매는 실리콘오일을 사용하는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 제 4항에 있어서,시료토출관들은 단일 또는 다중채널로 구성되며 해당 모세 분리관 채널과 1:1 대응이 되도록 배열되는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 제 1항 내지 제 5항에서 선택되는 어느 한 항에 있어서,상기 화학물질이 DNA 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치를 이용한 화학물질의 분리방법.
- 전기영동장치의 저장조를 실리콘오일, 광유 및 폴리올레핀 올리고머에서 선택되는 어느 하나의 비극성용액으로 채워 시료토출관으로부터 토출된 시료가 확산되거나 흩어지는 것 없이 분리관으로 주입되는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치.
- 제 7항에 있어서,저장조에 있는 시료 토출관의 종단부의 금속부를 전극으로 사용하여 이에 전압을 거는 방법으로 토출관에서 토출된 시료를 개별 시료투입구가 없는 2개 이상의 다중채널 전기영동장치의 해당 분리관에 직접 주입하는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치.
- 제 8항에 있어서,비극성용매는 실리콘오일을 사용하는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치.
- 제 9항에 있어서,시료토출관들은 단일 또는 다중채널로 구성되며 해당 분리관 채널과 1:1 대응이 되도록 배열되는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치.
- 두 개의 조각으로 이루어진 좌우측 고정장치, 2이상의 분리모세관인 전기영동채널이 설치된 전기영동칩, 좌우측고정장치를 양쪽에서 이동시켜 전기영동칩을 탄성체에 압착하여 고정하는 것에 의해 형성되는 저장조로 구성되는 칩고정장치를 가지는 다중채널 전기영동장치.
- 제 11항에 있어서,좌우측 고정장치는 간격을 임으로 조절할 수 있어, 다양한 길이의 전기영동칩을 고정할 수 있는 것을 특징으로 하는 다중채널 전기영동장치.
- 내경 10 ~ 200㎛, 외경이 300 ~ 400㎛의 용융실리카 모세관을 길이방향으로 배열하여 다중채널을 형성되도록 경화형 수지가 피복되고 가변적으로 절단하여 다양한 길이의 전기영동장치에 수용 가능한 가변길이의 다중채널 전기영동칩.
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