KR20060032958A

KR20060032958A - 전구 세포의 분리 및 증식

Info

Publication number: KR20060032958A
Application number: KR20057023131A
Authority: KR
Inventors: 낸시. 엘 파렌테아우
Original assignee: 올간 리커버리 시스템즈, 인코포레이티드
Priority date: 2003-06-03
Filing date: 2004-06-03
Publication date: 2006-04-18
Also published as: CA2528115A1; EP1629089A1; CN1820069A; US20060121605A1; WO2004108910A1; US20120121553A1

Abstract

본 발명은 전구 세포 군락 및 전구 세포를 획득 및 배양하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 재생 약물 (조직 재생), 이식 및 암 연구를 포함하는 분야에서 유용할 수 있다.

Description

전구 세포의 분리 및 증식 {Selection and propagation of progenitor cells}

관련 출원에 대한 상호- 참증

본 출원은 2003년 6월 3일자로 출원된 미국 가출원 제60/475,553호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 여기에 참고문헌으로서 통합된다.

본 발명은 일반적으로, 전구 세포 분리, 증식 및 사용 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 인 비트로 (in vitro)에서 전구 세포 (progenitor cells)의 군락을 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

성체 및 배아 줄기 세포들은 세포 요법에 있어서의 그 잠재적인 역할 때문에 집중적인 과학적 관심 분야가 되고 있다. 잠재적인 줄기 세포 공급원은 성숙한 기관에 자연적으로 존재하는 줄기 및 전구 세포들이다. 그러나, 유조직 (parenchymal) 전구 세포들의 사용은 그 선택적 배양과 연관된 난점들로 인해서 많은 곤란을 겪고 있다. 예를 들어, 성인 췌장 (pancreas) 또는 성인 섬 조직 (islet tissue)으로부터 전구 세포 배양물을 확립하는데 있어서 주된 문제는, 오염 비-유조직 세포 유형의 과성장 및 분화-수행된 세포들 (differentiation-committed cells)의 지속적인 존재이다.

섬 전구 세포들의 배양은 특히 인슐린-의존성 당뇨병의 잠재적 치료법으로서 관심을 끌고 있다. 혈장-함유 배양액에서 분리된 췌장 조직으로부터 유도된 섬 세포들을 배양하고자 하는 시도들이 있어 왔다. 그러나, 일련의 증식된 섬 세포 군락들의 대부분은 단지 중간 정도의 번식 능력을 나타낼 뿐이며, 분화된 특성들을 보유한다. 소의 뇌 추출물을 이용하여 증식된 태아-유도 전구 세포들은, 섬 세포들뿐만 아니라, 포상 세포들 (acinar cells) 및 관상 세포들 (ductal cells)도 생산하는 세포 군락을 이루며, 섬 전구세포들에 반해서 초기 배아 췌장 전구세포들을 나타내기 쉽다. 더욱이, 이러한 방법은 전구 세포 숫자가 자연히 높은 배아 근원 세포들을 사용하지만, 이는 성인 조직들에서 전구 세포들을 특성화하고 조절하는 것을 더욱 어렵게 만든다. 인 비보 (in vivo)에서 인슐린을 생산할 수 있는 섬 세포 군락이 개시되었다. 상기 방법은 섬 전구 세포들의 번식을 어느 정도 가능하게 하지만, 상기 세포들은 관상 세포들과 같은 다른 조직 형태의 협막 세포 (stromal cells) 또는 "너스 (nurse)" 세포들의 동시적인 공동 증식을 필요로 하며, 이러한 세포들은 배양물 내의 세포들 대부분을 차지한다.

예를 들어 세포 표지자를 사용한 다른 기계적 분리 방법들이, 줄기 또는 전구 세포 군락을 분리하는 데에 사용되어 왔다. 그러나, 이러한 인공적 세포 분리는 줄기 및 전구 세포들이 일시적으로 풍부한 군락을 야기할 뿐이다.

어떠한 연구들도, 재생성 성분을 포함하는 증식성 상피 세포 군락을 얻기 위한 시도에 있어서, 전구 세포들과 그들의 자연적 후손을 구분하지 못하였다. 따라서, 이전의 방법들은 임시적 증폭을 통한 성장보다 전구 세포 풀의 유지를 선호하 지는 않는다. 일시적 증폭 세포들은 일련의 계대 (passages) 배양을 가능하게 하는 성장 능력을 보유하지만, 그들은 줄기 세포 활성화 및 지속적인 전구 세포들의 팽창을 자연히 억제하는 특성을 갖는다 (Hardin-Young at al. Current Neurovascular Research Ⅰ, (2004); Parenteau, Encyclopedia of Animal and Plant Cell Technology, 365-78 (1999)). 일시적 증폭 세포들의 발생 및 성장 또는 오염성 세포 유형들의 생존을 조절하면서, 전구 세포 활성화 및 성장을 유지하지 못한다는 사실은, 성체 줄기 세포들의 실질적으로 순수한 군락을 발생시키고 유지하는 것을 불가능하게 하였다. 이러한 난점은 인간 상피 세포 군락에 대한 실험에서 겪게 되는 다양성을 야기하였다.

따라서, 대부분의 세포들이 인 비트로에서 오랜 시간 팽창할 수 있고 인 비보에서 높은 신뢰성으로 기관 재생을 할 수 있는 유조직 전구 세포들인, 세포 배양물을 제조하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 더욱이, 그와 같은 세포들을 성숙한 (성인 및 신생아) 조직, 특히 유조직 조직들로부터의 제조할 필요성이 존재한다.

본 발명은 신생아 또는 성인 유조직 조직으로부터 유도된 전구 세포 군락을 분리하고, 번식시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 전구 세포 배양 군락은, 인 비보에서 이식되는 경우에, 질병을 앓거나, 파괴되거나, 유실되거나, 또는 달리 손상을 입은 조직 또는 기관을 보충하거나, 수리하거나, 회복시키거나, 또는 대체하는 데에 유용한 세포들의 용이하게 입수가능한 공급원이 된다.

본 발명의 방법은 진정 전구 세포들의 분리를 촉진하는 배양 조건을 제공한다. 본 발명에 따르면, 세포 배양 조건들은 더욱 분화된 세포들을 억제하는 세포 배양 조건들이 선택되며, 이에 의해서 더욱 분화된 세포들이 전구 세포들의 성장에 대해서 통상적으로 갖게 되는 억제 효과를 완화한다. 결과적으로, 세포 배양물의 대부분을 구성하는 자가-지지성, 미분화 전구 세포들의 콜로니 형성을 가능하게 하는 배양물이 제조된다. 본 발명은 더욱 분화된 세포들의 증식을 억제하면서 전구 세포 성장을 가능케 하기 위해서, 세포 배양물 중에서 스트레스 반응을 유도하는 임의의 무혈청 배양 조건들을 제시한다. 이상적으로, 일단 전구 세포들의 번식이 이루어진 후에는, 조직-특이적 분화가 인 비트로 또는 인 비보에서 유도될 수 있는 조건이 선택된다.

비록 전구 세포들의 성장을 촉진하는 배양 조건들에 대한 임의의 세트가 제시되지만, 전구 세포들을 증식시키기 위한 바람직한 방법은, 분화 중 및/또는 분화된 세포들에서 세포 자멸사 (apoptpsis) 또는 괴사 (necrosis)를 유도하는 무혈청 배지를 포함한다. 세포들은 초기에는, 배양액이 전구 세포 활성화 및 성장에 반하게 하기 위해서, 칼슘 및/또는 성장 인자들을 낮은 수준으로 포함하거나 아예 포함하지 않는, 엄격한 1차 배지 중에서 배양된다. 전구 세포 성장이 개시되고, 전구 세포들이 세포 군락의 대부분이 되도록 팽창한 이후에는, 1차 배지보다는 덜 엄격할 수 있는 2차, 최소 성장 배지 중에서 세포들이 증식된다. 최종적으로, 결과물인 전구 세포 배양물의 분화는 특정 성장 인자들의 존재 하에서, 3차 배지 중에 분화 인자들을 첨가함으로써 촉진될 수 있다.

다른 한편으로, 전구 세포들은 분화 이전에 사용되기 위해서 수집된다. 분화된 세포들의 성장을 억제하는 임의의 배지 조성물이, 본 발명에 따라서 전구 세포 군락을 제조하기 위한 수단으로서 제안된다. 성장 인자들의 농도 및/또는 효율성을 감소시키는 것은 이러한 목적을 달성하기 위한 하나의 방법이다. 세포 착생을 억제하는 것은 또 하나의 방법이다. 그러나, 통상적으로 분화된 세포들의 성장을 촉진하는 특정 이온들의 농도를 감소시키거나, 세포 착생을 억제하거나, 배양물의 pH를 변화시키거나, 또는 당업계에 공지된 다른 방법들도 사용될 수 있다. 물론, 이러한 개별적인 기술들의 조합도 사용가능하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법은 전구 세포 및 분화 중인 세포 및 분화된 세포 중 적어도 하나를 포함하는 1차 세포 배양물을 무혈청 배지 중에 제공하는 단계; 상기 1차 세포 배양물 중에서, 상기 전구 세포의 복제를 가능하게 하면서 상기 분화 중인 세포 및 분화된 세포 중 적어도 하나의 증식을 억제하는 스트레스 반응을 유도하는 단계; 및 상기 복제로부터 야기되고 상기 1차 세포 배양물 중 세포들의 대부분을 구성하는 전구 세포들의 군락을 동정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 1차 세포 배양물로부터 전구 세포들을 분리하는 단계 및 5회 이상의 연속적인 계대를 통하여 2차 세포 배양물을 제공하기 위해서 상기 분리된 전구 세포들을 배양하는 단계를 포함할 수도 있다. 상기 2차 세포 배양물은 글루타치온, 예를 들어, 0.01 내지 10 mM 글루타치온을 포함하는 한정된 배양 배지 중에서 보존될 수도 있다. 상기 방법은 전구 세포들의 군락의 분화를 촉진하는 단계를 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구현예에서, 일련의 단계들은 상기 2차 세포 배양물이 60% 내지 75%로 융합성 (confluent)인 경우에 수행된다. 상기 1차 세포 배양물 또는 상기 2차 세포 배양물은 콜라겐과 같은 매트릭스 성분의 존재 하에서 유지될 수도 있다.

바람직한 스트레스 반응은 상기 세포 배양물 중에서 세포 자멸사 및/또는 괴사를 유도한다. 또한, 바람직한 1차 배지는 실질적으로 어떠한 성장 인자 또는 기관 추출물도 포함하지 않으며, 칼슘도 전혀 없거나 또는 낮은 수준으로 포함한다. 상기 1차 배양물을 제조하기 위해서 임의의 세포 유형이 사용될 수 있지만, 예를 들어, 췌장 세포들, 간 세포들, 및 표피 세포들과 같은, 상피 세포들이 바람직하다. 바람직한 방법은 적어도 약 60%, 70%, 또는 80% 개수의 전구 세포들을 포함하는 세포 군락을 제조한다. 세포들은 전구 세포들의 군락을 제조하기에 충분한 시간동안 배양된다.

분화된 세포들의 자극은, 상기 배양물 중에서, 분화 인자들을 증가시키는 것과 같이, 배양 조건을 분화된 세포들의 형성을 촉진하는 방향으로 변화시킴으로써 달성된다.

본 발명은 비-태아 조직으로부터 인 비트로 증식된 포유류 전구 세포들의, 실질적으로 순수한 군락을 제공한다.

본 발명의 부가적인 방법들은 상기 서술된 방법들에 따라서 섬 전구 세포들을 배양하고; 상기 전구 세포들을 포유류 내로 이식함으로써 당뇨병을 예방하고 치료하는 것을 포함한다.

본 발명은, 부분적으로는, 인 비트로에서 자가-유지되고 장시간 증식할 수 있으며, 인 비보에서 기관 재생을 수행할 수 있는 유조직 전구 세포 군락을 얻기 위한 방법 및 결과물인 조성물을 제공한다. 상기 방법은 더욱 분화된 세포들의 보존을 지지하지 않으면서도, 기저 전구 세포 군락의 성장 및 증식을 가능하게 하는 배양 배지 중에서 1차 세포들을 배양하는 것을 포함한다. 결과물은 숫자로 대부분, 바람직하게는, 높은 백분율, 예를 들어 60, 70, 또는 80%의 세포 군락이 전구 세포들인 배양물이다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 실질적으로 순수한, 또는 균질한 전구 세포 군락이다. 일단 확립된 후에는, 상기 전구 세포 군락은 한정된 조건들 중에서 복수회 증식되며, 원하는 경우에는, 임상 처리를 위해서 증식될 수 있다. 본 발명의 방법들의 이점은 세포 치료에 사용될 수 있는 전구 세포들의 용이하게 구입가능한 공급원을 제공한다는 점이다.

본 발명의 전구 세포들은 재생이 가능한 유조직 세포들을 포함하는 임의의 기관 또는 조직으로부터 유도될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 췌장, 간, 장, 심장, 신장, 각막, 피부, 망막, 내이, 골격 근육, 뇌, 또는 선 (gland)을 포함하는 임의의 기관 또는 조직으로부터 유도될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 전구 세포들의 군락은 특정 유조직 계통, 예를 들어 췌장 섬 내분비 계통, 간 세포 계통, 또는 내피 세포 계통의 세포들을 야기할 수 있다.

도 1을 참조하면, 신생 (neogenesis), 즉 기능성 조직의 드 노보 (de novo) 생성을 달성하기 위해서, 본 발명의 방법은 인 비트로에서의 전구 세포 군락의 증식 및 활성화에 초점을 맞춘다. 일 구현예에서, 기관, 예를 들어 췌장으로부터 유도된 1차 세포 군락은, 복수개의 세포 유형들을 포함한다. 고유 줄기 세포들 (10)은 느리게 사이클링하는 세포들로서, 전구 세포들 (20)을 생성한다. 전구 세포들 (20)은 최소한으로 분화된 세포들이며, 기관 재생을 담당하는 증식 세포 부분을 구성한다. 느리게 사이클링하는 줄기 세포들 (10)은, 발생학적 연구, 유전자 발현 및 전사 인자들에 의한 명백한 조절에 기초하여, 전구 세포 부분 및 일시적 증폭 세포들과는 구별된다. 전구 세포들 (20)은, 일단 활성화되면, 일시적 증폭 세포들 (30)을 생성하며, 이는 다시, 유조직 세포들 (40)이 된다. 일시적 증폭 세포들 (30)은 계통 수행되고, 분화 중인 세포들이며, 제한된 복제 특성을 나타낸다. 유조직 세포들 (40)은 최대로 분화된 기능성 세포들이다.

본 발명의 일 태양에 따르면, 체외, 즉 인 비트로에서, 협막, 연결, 또는 지지 조직과 같은 비-유조직 조직들로부터의 세포들에 의존하지 않으면서, 전구 세포들의 실질적으로 순수하거나, 또는 균질한 군락을 배양할 수 있다. 달리 말하면, 본 발명의 전구 세포들은 그 자신의 조직 유형을 갖는 세포들로부터 자가-지속성 증식을 할 수 있다. 본 발명의 다른 태양에 따르면, 그와 같은 전구 세포들의 군락은, 분화 중인 세포들 및 분화된 세포들을 포함하는, 더욱 분화된 세포들을 제거하거나, 또는 적어도 억제하기 위해서 세포 배양물의 조건을 조절함으로써, 선택될 수 있다. 그와 같은 방법의 장점은 전구 세포가, 주어진 임의의 시간 또는 장소에서 표현할 수 있는 임의의 표지자에 의해서라기 보다는, 그 행동 및 그와 같은 행동의 결과물에 의해서 동정된다는 것이다. 또 다른 장점은, 세포 주기를 조절하기 위한 공지된 기작들, 예를 들어 세포 자멸사 및 괴사와 관련된 것들을 포함하는 기작들이 본 발명의 목적을 달성하기 위해서 사용될 수 있다는 점이다.

바람직한 일 구현예에서, 세포들 중에서 스트레스 반응을 유도하는 1차 배양 배지 중에서 상피 세포들의 1차 세포 배양물을 배양하여 성숙하고 분화된 유조직 세포들 및/또는 분화 중인 일시적 증폭 세포들을 고갈시킴으로써, 인 비트로에서 실질적으로 순수한 상피 전구 세포들의 군락이 제조된다. 이러한 반응은 배양물 중에서 세포 동역학을 변화시킴으로써, 전구 세포들이 복제하고 번식하게 한다. 상기 스트레스 반응은 더욱 분화된 세포들을 죽여서, 결과물인 세포 군락이 실질적으로 분화되거나 분화 중인 세포들, 및 다른 조직 유형들, 예를 들어 협막, 피브로블라스트 세포들로부터의 오염 세포들을 포함하지 않게 한다. 아직 확실한 것은 아니지만, 더욱 분화된 세포들의 억제는, 전구 세포들의 복제를 억제하는 세포-세포 간 신호전달을 억제하고, 및/또는 가능하게는, 전구 세포 증식을 활성화하는 신호를 제공할 수 있다. 결과적으로, 전구 세포들은 다른 조직 유형들로부터의 임의 형태의 "공급자 (feeder)" 또는 "너스 (nurse)" 세포들 없이도 증식한다.

시각적 관찰 이외에 스트레스 반응을 모니터하기 위한 다양한 다른 방법들이 존재한다. 예를 들어, 열 쇼크 단백질 (heat shock protein) 또는 급성 상 반응물 유전자 (acute phase reactant gene)의 발현이 스트레스 반응의 표지자로서 측정될 수 있다.

전구 세포들의 예비-융합성 콜로니 (pre-confluent colony)를 확인하는 하나의 방법은, 1차 배양 세포들이 활성 유사분열 (mitosis)을 겪는지 여부를 확인하는 것이다. 다른 방법들은 현미경 하에서 세포들을 관찰하는 것; 또는 세포 배양물에 티민 유사체인 5-브로모-디옥시유리딘 (BrdU)을 첨가하고 단클론 항-BrdU 항체를 사용하여 세포들 내로의 BrdU의 도입을 검출하는 것을 포함한다.

1차 배양물 중에서 전구 세포들의 예비-융합성 콜로니를 확인한 후에는, 이는 분리되어 실질적으로 균질한 전구 세포들을 포함하는 2차 세포 배양물을 제조하는데 사용될 수 있다. 2차 세포 배양물은 1차 배양물과 동일한 유형의 세포 배지를 사용하거나, 또는 덜 엄격한 배지를 사용할 수 있다. 2차 세포 배양물은 복수회 증식을 통하여 전구 세포들을 유지하며, 전구 세포들은 분화 또는 괴사를 겪게 되는 능력을 보유한다. 일 구현예에서, 상기 전구 세포들은 5회 이상의 증식을 겪는다.

본 발명은 전구 세포들이 분화 중인 세포들, 예를 들어 일시적 증폭 세포들, 및/또는 분화된 세포들, 예를 들어 유조직 세포들이 되도록 활성화시키는 단계들을 더 포함할 수도 있다.

명세서 전반에 걸쳐서, 조성물들이 특정 성분들을 가지거나 포함하는 경우, 또는 방법들이 특정 단계들을 가지거나 포함하는 경우에는, 본 발명의 조성물들이 또한 언급된 성분으로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 것도 포함하도록 의도된 것이며, 본 발명의 방법들이 또한 언급된 성분으로 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 것도 포함하도록 의도된 것이다.

단계들을 수행하는 순서 또는 특정 작업을 수행하는 순서는 본 발명이 수행가능한 한도 내에서는 결정적인 사항은 아니다. 더욱이, 둘 또는 그 이상의 단계들 또는 작업들이 동시에 수행될 수도 있다.

1차 세포 배양물

1차 세포 배양물은 다른 조직 유형들의 오염 세포들을 포함하는 분화 중인 세포들 및 분화된 세포들에서 스트레스 반응을 유도하지만, 전구 세포들이 증식하는 것을 가능케 하도록 고안된 것이다. 분화 중인 세포 군락 및 분화된 세포 군락이 일단 고갈되면, 전구 세포들이 활성화되어, 세포 주기로 들어가고, 증가된 속도로 분열을 시작하는 것으로 여겨진다. 전구 세포들에 대한 선택 과정을 개시하는 스트레스 반응은, 다양한 수단들을 통하여, 예를 들어 이러한 세포들의 세포 자멸사 및/또는 괴사를 유도함으로써, 유도될 수 있다. 일 구현예에서, 1차 배양 배지는 화학적으로 한정된 것이다. "화학적으로 한정된"이라는 용어는, 배양 배지가 필수적으로 어떠한 혈청 또는 기관 추출물도, 전혀 또는 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 특정 구현예들에서, 상기 배지는 낮은 수준으로, 또는 실질적으로 전혀 성장 인자들을 포함하지 않는다. 만일 성장 인자가 존재하는 경우에는, 바람직하게는 약 10 ng/ml 미만, 더욱 바람직하게는 약 5 ng/ml 미만, 예를 들어 약 1 ng/ml로 존재한다. 일 구현예에서, 배지는 전구 세포들의 활성화 및 증식을 지지하기 위해서, 콜레라 독소 및 포레스콜린 (foreskolin)과 같은 cAMP 상승제를, 바람직하게는 9 ng/ml의 농도로 포함한다.

1차 세포 배양물 배지는 세포-세포 착생을 저해하도록 고안될 수도 있다. 예를 들어, 배지는 세포 착생을 저해하고, 세포-매트릭스 작용을 방해하는 것으로 알려진 질산을 포함할 수도 있다. 다른 한편으로, 또는 부가적으로, 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α), 인터루킨 1-베타 (IL-1-β), 및 인터페론-감마 (IFN-γ)가, 질산-유도된 세포 자멸사를 촉진하기 위해서 첨가될 수도 있다. 세포들은 또한, 세포 착생을 방해하고, 더욱 분화된 세포들의 생존을 어렵게 하기 위해서, 희석 히드로콜로이드, 덱스트란 등 중에서 배양될 수도 있다.

일부 구현예들에서, 배지는 낮은 수준으로, 또는 전혀 칼슘을 포함하지 않을 수도 있다. 칼슘이 배양 배지 중에 존재한다면, 칼슘의 농도는 바람직하게는 약 1 mM 미만, 예를 들어 약 0.001 내지 약 0.9 mM이다. 일 예에서, 칼슘 농도는 약 0.01 내지 약 0.5 mM이며, 다른 예에서는, 약 0.08 mM이다. 이론에 의해서 제한되는 것을 의도한 것은 아니지만, 낮은 칼슘 환경은 더욱 분화된 세포들의 상호작용 및 보존에 필요한 세포-세포 접촉을 제한하는 것으로 생각된다. 화학적으로 한정된 배양 배지 및 성장 인자들의 최소 농도와 함께, 낮은 칼슘 환경은 분화된 세포들이 더욱 천천히 분열하게 하여 세포 자멸사를 겪게 하며, 결과적으로 배양물 내에서 전구 세포들의 군락을 야기한다.

많은 세포 자멸사 또는 괴사-관련 경로들이 당업계에 공지되어 있다. 1차 배양 배지는 그러한 경로들을 개시하거나 강화하도록 고안될 수 있다. 그와 같은 스트레스들을 억제 조절하는 경로들은 비활성화될 수 있으며-예를 들어, 세포 자멸사를 억제하는 단백질 키나아제는 차단될 수 있다. 이러한 경로들 중 많은 것들은, 상호공조하며, 조합되어 사용될 수 있다. 그러한 신호전달 경로의 예들은, 카스파아제 경로 (caspase pathways), Bcl-2 경로, 및 인터루킨-10 경로를 포함한다.

카스파아제 경로는 핵 인자 카파 B (NF-κB)를 포함하는데, 이는 전사 인자로서, 일단 핵으로 운반되면, 세포 사멸의 개시에 영향을 주는 다양한 유전자들의 전사를 활성화한다. 리간드, 항원, 항체, 성장 인자, 시토카인, 림포카인, 케모카인, 조인자, 호르몬, 및 종양 괴사 인자 (TNF)와 같이 NF-κB를 조절하는 다른 인자들이, 분화 중인 세포들 및/또는 분화된 세포들을, 카스파아제, Bcl-2 및 다른 경로들을 통하여 죽이기 위해서, 배양 배지에 첨가될 수 있다. 그와 같은 인자들은 TNF-α, TNF-성 약 세포 자멸사 유도체 (TNF-like weak inducers of apoptosis, TWEAK), TNF-관련 세포 자멸사-유도 리간드 (TNF-related apoptosis-inducing ligands, TRAIL), 인터루킨 (IL) (예를 들어, IL 10), Fas 리간드, 세포 자멸사 유도 단백질 리간드 (예를 들어, APO-3L 및 2L), 변환 성장 인자 베타 (transforming growth factor beta, TGF-β), 엔도톡신 (예를 들어, 리포다당류), 발현되고 분비된 활성시 조절되는 정상 T-세포 (regulated-upon-activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES), 인터페론 (예를 들어, IFN-γ), 옥사다익산 (oxadaic acid) (세린/쓰레오닌 단백질-포스파타아제 저해제) 등을 포함한다.

더욱 분화된 세포들의 생존을 억제하도록 방해될 수 있는 세포 자멸사-저해 신호전달 경로의 예들은, AKT-매개 신호전달 경로 및 IKK, erk, Raf-1과 같은 소위 "생존 키나아제"로 불리우는 것들에 의해서 활성화되는 것들을 포함한다. AKT 신호전달 경로를 방해하는 가능한 방법들은 siRNA, 자가분비/측분비에 의해서 생산되는 것들과 같은 성장 인자들, 및/또는 수용체 타이로신 키나아제 AKT를 차단하는 항체들의 사용을 포함한다. 다른 한편으로, 엄격하게 한정된 배지를 사용하여 이러한 경로를 유도할 수 있는 성장 인자들을 제거하는 것도 비슷한 결과들을 야기할 수 있다. 세포 자멸사-저해 신호들을 방해하는 다른 예는 열 쇼크 단백질 70의 비활성화를 포함한다.

열, 조사, 습기, 및 pH와 같은 다른 환경적 인자들도 세포 배양물 내에서 원하는 스트레스 반응을 야기할 수 있다. 예를 들어, 자외선 조사는 더욱 분화된 세포들에서 세포 사멸을 유도할 수 있다.

2차 세포 배양물

2차 세포 배양물은 통상적으로, 스트레스 조건 하에서 번식할 수 있는 능력을 갖기 때문에 1차 세포 배양물로부터 선택된 전구 세포들을 포함한다. 2차 세포 배양물은 전구 세포들을 유지하여, 그들이 분화하거나, 또는 실제 분화 없이 신생하는 능력을 보존하도록 한다. 일련의 단계들을 거치며 전구 세포 군락이 장시간 번식할 수 있는 능력으로 인해서, 본 발명의 또 다른 장점이 야기되는데, 이는 신생 또는 다른 응용을 위해서 전구 세포들을 충분한 양으로 수집할 수 있다는 점이다.

2차 세포 배양물은 계속해서 전구 세포들의 분화를 억제하기 위해서 1차 배양물에서와 동일한 종류의 배지를 사용할 수 있다. 다른 한편으로, 2차 배양 배지는 덜 엄격할 수도 있다. 일부 제한된 양의 성장 인자들이 기저 배지로 첨가될 수도 있는데, 이는 배양물이 초기에는 실질적으로 더욱 분화된 세포들을 포함하고 있지 않기 때문이다. 일부 비필수적인 성장 인자들이 드물게 또는 간헐적으로 2차 배양 배지에 사용될 수도 있다. 그러한 성장 인자들의 예는 상피 성장 인자 (EGF), 변환 성장 인자 알파 (TGF-α), 케라티노사이트 성장 인자 (KGF) 및 기초적인 피브로블라스트 성장 인자들을 포함한다.

이후의 조절

1차 또는 2차 배양물로부터 수집된 세포들은 더욱 조절될 수도 있다. 특정 구현예들에서, 전구 세포들은 도 1을 참조하여 상기에서 설명된 바와 같이, 점진적으로 다양한 단계들로 분화되도록 유도된다. 3차 배지는 높은 농도의 칼슘, 혈청 및/또는 TGF-β와 같은 분화 인자들로 제조될 수도 있다. 배지는 또한 덱사메타손 및 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP) 상승제, 및 분화 세포들의 성장을 촉진하고 유지하는 것으로 공지된 다른 인자들을 포함할 수도 있다. 세포 분화는 세포 복합체의 형성을 보조할 수 있는 세포외 매트릭스, 히드로겔 또는 히드로콜로이드 물질 또는 폴리머의 첨가에 의해서 촉진될 수도 있다. 그와 같은 세포들은 다양한 요법들에 적용된다.

본 발명 자체뿐만 아니라, 본 발명의 상기 및 다른 특징들은 상기 서술 및 도면으로부터 더욱 완전하게 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 췌장 생성과 관련된 세포들 및 전구 세포 풀을 이용한 신생 (neogenesis) 방법을 도시한 것이다.

하기 도면은 실제 크기를 도시한 것은 아니며, 일반적으로 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이라는 점을 염두에 두어야 할 것이다. 본 발명의 이점들은 첨부된 도면 및 상기 서술을 참조함으로써 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다.

하기 실시예들은 본 발명의 원리를 설명하기 위한 것이며, 어떠한 방식으로든지 청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니될 것이다. 당업자라면 본 발 명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형이 수행될 수 있다는 점을 인식할 것이다.

실시예 1: 배양조건

사람조직에서 유래된 전구세포는 관심조직을 효소적으로 분리하거나 얇게 잘라서 1 ~ 2mm² 조직 외식 편을 형성함으로써 얻었다. 효소적 소화가 사용된다면, 콜라겐나아제 (collagenase), 히알루로니다아제 (hyaluronidase), 디스파아제 (dispase), 프로나아제 (pronase), 트립신 (trypsin), 엘라스타아제 (elastase), 키모트립신 (chymotrypsin)과 같은 효소가 바람직하다. 1차 세포배양물을 준비하는 많은 방법은 당업계에 공지되어 있다.

배양은 유형 I 콜라겐 (Type I collagen)으로 코팅된 접시와 같은 조직 배양 기판 위에 이종의 세포 집단을 얇게 도포함으로써 개시되었다. 통상적으로, 세포의 대부분은 크고, 펼쳐진 상피조직 모양에서 섬유아세포의 모습을 보여준다. 세포들은 칼슘이 거의 없거나 완전히 없고, 성장 인자가 거의 없거나 완전히 없는 화학적으로 한정된 배양 배지에서 배양되었다. 화학적으로 한정된 조건이란 배양 배지가 혈청이나 개체 추출물을 본질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 만약 칼슘이 배양 배지에 존재한다면, 칼슘의 농도는 바람직하게는 약 1mM이하, 예를 들면, 약 0.001 ~ 0.9 mM이다. 또 다른 예에서는, 칼슘의 농도가 약 0.08mM 이다. 만약 성장 인자가 존재한다면, 농도는 약 10ng/ml 이하, 바람직하게는 약 5ng/ml 이하, 예를 들면, 약 1ng/ml이다.

단일 유조직 전구세포와 유조직 전구세포의 콜로니들은 처음 10일 내에 동정하였다. 보통, 콜로니들은 다른 세포와 시각적으로 구별된다. 대부분의 세포들과 다르게, 유조직 전구세포들은 작고, 둥글거나 육각형의 모양을 지녔다. 전구세포들은 통상적으로 약 15 미크론(microns) 이하이며, 밀집된 모양을 가졌다. 이들 세포들은 굴절성이고, 위상차 현미경을 사용하여 쉽게 판독되었다. 더욱이, 유조직 전구세포들은 이들 세포들의 활발한 유사분열로 인하여 구별될 수 있었다. 통상적으로 유조직 전구세포들의 콜로니들은 약 14일 이내에 1차 배양물에서 우세한 군락이 될 정도의 수로 증가한다. 세포들은 느슨하게 형성된 콜로니들과 작은 분열 세포들이 세포 배양 표면의 약 50 ~ 70%를 차지할 때 트립신을 처리하여 수득하였다. 일 구현예에서, 전구세포들은 세포배양 표면의 약 80%를 차지하였다.

2차 배양물에서 결과물인 전구세포의 군락은 작은 크기를 가지고, 약 40%의 평판 배양 효율 혹은 계대에 따라 그보다 큰 효율을 가지며, 약 36시간 혹은 그 이하의 빠른 세포분열을 하는 특징을 갖는다. 전구세포는 적어도 약 5회의 계대 배양이 되고, 계대 배양 동안 사용되는 분열 비율에 따라 약 13회 혹은 그 이상의 계대로 연장되었다. 세포들은 통상적으로 약 10 군락 분열 혹은 그 이상을 획득한다. 세포들은 계통 특이적 유전자 및 전구세포들과 발달상으로 연관된 유전자의 발현과 같은, 조직 특이적 전구세포의 특성들을 유지하였다.

전구세포들은 배양조건을 환경, 즉 분화되는 세포의 발달과 성장을 촉진시키거나 유지시키는 인자를 포함하는 3차 배양 배지로 변화시킴에 따라서 기관유형적 분화를 보이는 능력을 가졌다. 그러한 인자들의 예로 히드로코르티손 (hydrocortisone), TGF-β 간세포 성장인자 (hepatocyte growth factor), 배아 기관발생 조절에 효과적인 것으로 확인된 다른 인자들이 있다. 3차 배양에 도입될 수 있는 다른 환경적 조건의 예들로는 콜로니 형성 혹은 3차원 배양을 촉진시키는 세포외 기질의 첨가, 약 1.0 mM 이상 농도의 칼슘 첨가, 또는 세포와 세포간의 착생이 일어나고, 조직 구조가 발달될 수 있도록 하는 임의의 방법들을 포함한다. 이들 인자와 조건들의 어느 것이든 함께, 또는 순서대로 조직 유형에 따라서 기관발생을 진척시키는데 사용될 수 있다.

췌장 섬 전구세포 (pancreatic islet progenitor cells) 군락의 선택은 아래에 기술되어있다. 그러나, 그 예는 비제한적인 것이며, 전구세포는 간, 장, 심장, 각막, 피부, 망막, 내이, 골격 근육, 뇌, 선과 같은 재생 능력을 가진 유조직 세포들을 포함하는 임의의 기관이나 조직에서 유래될 수 있다.

실시예 2: 췌장 섬 세포

내분비 전구세포 (endocrine progenitor cells)들은 신생아의 전체 췌장이나 분리된 어른 췌장 섬에서 유도되었다. 그 뒤, 세포들은 내분비 전구세포 군락의 성장을 선택하기 위해 세포배양물에 스트레스 조건을 부여하는 엄격 조건 아래에서 배양되었다. 일단 확립되면, 이 군락은 복수의 계대를 통해 미분화 증식됨으로써, 인슐린 의존성 당뇨병의 임상적 치료법을 위해 증식되었다.

본 발명의 스트레스 유도 배양 배지는 1차 배양물을 얻는 것을 가능케 하고, 연속적으로 계대될 수 있는 이들 1차 배양물로부터 세포들의 부분 군락을 동정하는 것을 용이하게 함으로써, 치료 가치를 가질 수 있는 증식된 수의 세포를 제공하게 하였다. 바람직하게는, 스트레스 유도 배양 배지는 혈청이나 성장인자가 없는 화학적으로 한정된 배지로 구성되었다. 이 배지와 배양 방법론을 사용하여 췌장 혹은 섬 조직에서 성장된 세포들은 두드러지게 상피조직 모양의 형태를 보이고, 상피세포의 사이토케라틴 (cytokeratin) 표지 특징을 나타내었다.

세포가 배양물에서 증식되면서, 세포들은 PDX 1과 같은 췌장 전구세포와 연관된 표지자 발현으로 특성화되었다. 호메오도메인 (homeodomain) 단백질 PDX 1은 췌장 발달의 초기 단계에서 요구된다 (Nature Genetics 15: 106-110 (1997); Development 122:1409-1416(1996)). 분화된 내분비 세포가 나타나면서, 이들 세포들은 상피조직에서 분리되어 세포들이 인접한 중간엽으로 이동하여 밀집된다. PDX 1은 후에 인슐린과 섬 아밀로이드 폴리펩티드의 발현을 긍정적으로 조절하고, 글루카곤 발현을 억제함으로써, β 세포의 호르몬 생산 표현형을 유지하는데 요구된다 (Genes Dev 12: 1763-1768(1998)). PDX 1은 또한 β 세포에서 GLUT2 발현을 조절하며, 이는 정상 β 세포의 항상성을 유지함에 중요 역할을 한다.

포유동물의 뉴로제닌 (neurogenin) 유전자 패밀리의 일원인 뉴로제닌3 (Neurogenin-3)은 프로내분비 유전자로서 확립되었고 (Proc Natl Acad Sci USA 97: 1607-1611(2000); Curr Opin Genet Dev 9: 295-300 (1999)), 발생 동안에는 섬 전구세포의 표지자로 간주된다 (Development 129: 2447-2457(2002)). 섬유래 세포 군락의 전구세포 특징은 뉴로제닌3를 발현한다는 점이다.

내분비 전구세포는, 예를 들어 배양 배지에 인슐린 생산 베타 세포로의 분화를 촉진시키는 약품을 공급하거나 세포외 기질의 존재 하에 세포 클러스터 형성과 같은 형태적 변화를 유도함으로써, 화학적 혹은 물리적 수단을 사용하여 분화되게 유도된다. 세포들은 또한 가능한 환경 내로 이식됨으로써 분화하도록 유도될 수 있다. 예를 들면, 피하적으로 신장주머니 아래에 이식하거나, 혹은 소장의 점막 공간에 이식하여 인 비보 분화될 수 있다.

실시예 3: 배양 배지

1차 배양에 사용된 엄격한 스트레스 유도 배양 배지는 혈청이나 기관 추출물을 전혀 포함하지 않거나 본질적으로 포함하지 않았다.

본 발명의 1차 배양 배지는 다른 성분들을 더 첨가하거나, 혹은 첨가하지 않는 영양소 베이스로 제공되었다. 영양소 베이스는 무기염, 포도당, 아미노산, 비타민 및 다른 기본 배지 성분을 포함하였다. 예로 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), M199, RPMI 1640, Iscove's Modified Culbecco's Medium (EDMEM), Ham s F12, Ham's F-10, NCTC 109, NCTC 135를 포함하였다. 본 발명의 바람직한 기본 배지는 포도당, 마그네슘 혹은 피루브산 나트륨 (sodium pyruvate)이 포함되지 않고, 4.0 mM L-글루타민을 포함하며, 무칼슘 또는 저칼슘 DMEM의 영양소 베이스와, 5 mM 포도당을 가진 Ham's F-12를 3:1의 비율로 포함하였다. 베이스의 최종 포도당 농도는 바람직하게는 약 5 mM로 조절하였다. 기본 배지는 동물세포 배양의 당업자들에게 알려진 하나 혹은 그 이상의 하기 성분들로 보충하였다: 인슐린(insulin) 혹은 인슈린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor), 트란스페린 (transferring) 혹은 제1철 이온 (ferrous ion), 트리요오드 타이로닌 (triiodothyronine) 혹은 티록신(thyroxin), 에탄올 아민 (ethanolamine) 혹은 o-인산화 에탄올 아민 (o-phosphoryl-ethanolamine), 염화 스트론튬 (strontium chloride), 피루브산 나트륨 (sodium pyruvate), 셀레늄 (selenium), 비필수 아미노산 (non-essential amino acids), 프로테아제 저해제(protease inhibitor) (예: 아프로티닌 (aprotinin), 대두 트립신 저해제 (soybean trypsin inhibitor (SBTI)), 포도당 (glucose).

일 예로, 성장 인자를 배지에 첨가하지 않았다. 다른 한 예로, 기본 배지는 비필수 아미노산, 성장인자 및 호르몬과 같은 성분으로 더욱 보충되었다. 예를 들면, TGF-β가 분화된 간세포의 세포 자멸사 (apoptosis)를 촉진시키는 세포 자멸원 (apoptogen)으로서 첨가되었으며, TNF-α가 분화된 섬, 간, 표피 세포의 세포 자멸원으로서 첨가되었다. 본 발명에서 유용할 수 있는 한정된 배양 배지는 Parenteau에 의한 미국 특허 번호 제5,712,163호에 기술되었으며, 이는 여기에 참고문헌으로 통합되었다. 적정 실험은 당업자에 의해 알려진 바와 같이, 보충물들의 적정 농도를 결정하기 위해 사용되었다. 바람직한 농도들의 예들은 다음과 같이 규정된다:

2차 배지의 바람직한 인슐린의 농도는 5.0 ㎍/ml이었다. 전구 인슐린 (proinsulin), IGF-1 혹은 IGF-II와 같은 인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factors)는 인슐린 대신 대체될 수 있다. 여기서 사용된 인슐린 유사 성장 인자는 인슐린과 구조적으로 유사하고, 인슐린 유사 성장 인자 수용체를 자극하는 성분을 의미한다.

바람직하게는, 제1철 이온은 2차 배지에서 약 0.05 ~ 50ug/ml의 농도의 트란스페린에 의해 공급되었으며, 바람직한 농도는 약 5 ㎍/ml이었다.

트리요오드타이로닌은 세포 대사의 속도를 유지하기 위하여 첨가되었다. 바람직하게는, 약 2 ~ 200 pM 의 농도로, 더욱 바람직하게는, 약 20 pM의 농도로 존재하였다.

에탄올 아민과 o-인산화 에탄올 아민 모두 혹은 둘 중 한 가지는 본 발명의 실시에서 사용되었다. 두 가지 모두 이노시톨 (inositol) 경로와 지방산 (fatty acid) 대사의 전구체로서 작용하는 인지질이다. 보통 혈청에서 발견되는 지질의 공급은 무혈청 배지에 필수적이다. 에탄올 아민과 o-인산화 에탄올 아민 모두 혹은 둘 중 한 가지는 가급적으로 약 10^-6 M ~ 10^-2 M사이의 농도 범위로 배지에 공급되었으며, 더욱 바람직하게는, 약 10^-4 M 농도로 공급되었다.

셀레늄은 약 10^-9 M ~ 10^-7 M 사이의 농도로 사용되었으며, 바람직하게는 약 5x10^-8 M 농도에서 사용되었다. 아미노산 글루타민 L-glutamine 혹은 그 대체 물질은 약 1 mM ~ 약 10 mM의 농도로 사용되었으며, 바람직하게는 약 6 mM로 사용되었다.

전구 세포의 연속적 계대를 위한 2차 배지를 준비할 때, 예를 들면 배양되는 특정 세포에 따라, 이에 제한되는 것은 아니지만, 표피 성장 인자 (epidermal growth factor, EGF), 변환 성장 인자 알파 (transforming growth factor alpha, TGF-α), 케라티노사이트 성장 인자 (keratinocyte growth factor, KGF), 기본 피브로블라스트 성장 인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF) 등을 포함하는 다른 성분들을 배지에 첨가하였다. 2차 배지의 선택적 구성요소인 EGF 는 1 ng/ml까지의 낮은 농도로 사용되었다.

2차 배지의 바람직한 구현예는 하기 성분들을 포함하였다: DMEM (무포도당, 무칼슘, 4 mM 글루타민)과 Ham's F-12 배지를 3:1로 섞은 기본 배지로서, 각 성분에 표시된 최종 농도를 획득하기 위하여 하기 성분들을 보충하였다: 6 mM L-글루타민 (혹은 균등물), 1 ng/ml EGF, 1x 10^-4 M 에탄올 아민, 1x 10^-4 M o-인산화 에탄올 아민, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트란스페린, 20 pM 트리요오드타이로닌, 6.78 ng/ml 셀레늄, 24.4 ㎍/ml 아데닌(adenine), 1 mM 염화 스트론튬, 100 mM 피루브산 나트륨, 10 mM 비필수아미노산, 및 5mM 포도당.

본 발명에 따라서 증식된 세포 군락이 한 단계에서의 전구 세포의 풀(pool)을 포함하지만, 더 진행된 분화와 기관 발달이 유도될 수 있다. 3차 배지는 전구 세포가 다수의 일시적 증폭 세포 (transit amplifying cells)를 발생시키고, 원하는 경우에는 기관 발생을 진척시키도록 한다. 일시적 증폭 세포들의 발생을 위한 배지의 바람직한 구현예는 DMEM (무포도당, 무칼슘, 4 mM L-글루타민)과 Ham's F-12 배지를 1:1의 비율로 섞은 기본 배지로서, 하기 성분들을 각각의 성분들에 대해서 지시된 최종 농도를 획득하기 위하여 보충한 것이다: 6 mM L-글루타민 (혹은 균등물), 10 ng/ml EGF 혹은 HGF 혹은 두 가지 모두 (세포 종류에 의존함), 1x 10^-4 M 에탄올아민, 1x 10^-4 M o-인산화 에탄올 아민, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트란스페린, 20 pM 트리요오드타이로닌, 6.78 ng/ml 셀레늄, 24.4 ㎍/ml 아데닌, 100 mM 피 루브산 나트륨, 2x10^-9 M 프로게스테론 (progesterone), 1.1 μM 하이드로코르티손, 0.08 mM 염화칼슘 (calcium chloride), 9 ng/ml 포스콜린 (forskolin).

전구 세포는 콜라겐으로 코팅된 플라스틱 표면 상에서 이 배지에서 제곱 센티미터 당 1,000 ~ 5,000개의 세포의 밀도로 플레이팅되었으며, 적어도 한 계대동안 배양되었다. 세포 군락은 그 상태로 혹은 더 분화가 시작될 때 사용되었다. 더 분화되길 바라면, 세포는 포스콜린이 3차 배지에서 제거되고 칼슘 농도가 증가된 상태, 예를 들면 약 1.88 mM의 농도로 증가된 상태의 조건으로 옮겼다. 배양 환경의 다른 변화, 예를 들면 세포외 기질 성분의 첨가 또한 이 시기에 포함되었다. 환경 조건의 몇 가지 변화는 조직 유형에 의존하였다. 예를 들면, 표피 세포는 공기-액체 경계면에서 배양되었고, 섬 세포는 클러스터 형성을 촉진시키는 기질 조건에서 배양되었으며, 간 세포는 다발 형성을 촉진시키는 3차원 기질에서 배양되었다.

본 발명에 유용한 배지를 준비하는 통상적인 방법은 아래에 기술되었다. 그러나, 본 발명의 성분들은 유사체 또는 기능적 균등물로 특정 성분이 보충되거나 보충되지 않은 다른 통상적인 방법을 사용하여 준비하였다. 또한, 보충물들의 농도는 나이, 크기 및 건강과 같은 인자로 인하여 다른 종으로부터 유래된 세포들과 다른 개체에서 온 세포주들에 따라 최적화될 수 있다. 적정 실험은 해당 성분에 대한 최적의 농도에 도달하기 위해서 다양한 농도로 실행될 수 있다.

여과와 같은 통상적 방법을 통하여 멸균된 기본 배지 및 성분들로부터 출발 하여, 1차, 2차, 3차 배지가 멸균 상태에서 준비되었다. 적당한 무균적 절차가 실시예 전반에 걸쳐 사용되었다. DMEM과 F-12를 조합하고 난 후에, 각각 성분들을 배지를 완성하기 위해 첨가하였다. 모든 성분들의 원액들은 -20℃에서 보관되고, 영양 물질들은 예외적으로 4℃에서 보관되었다.

동물세포 혹은 조직 배양에 적합한 용기, 예를 들면, 배양 접시, 플라스크, 롤러 보틀이 내분비 전구 세포들의 배양에 사용된다. 유리, 스텐리스 스틸, 중합체, 융합 실리카 (silica) 또는 폴리실리콘을 포함하는 실리콘 (silicon) 기판, 및 다른 생물학적으로 양립가능한 물질들이 세포 성장 표면으로서 사용될 수 있다. 본 발명의 세포들은 배양된 세포들에 배지가 양면 접촉할 수 있는, 다공성 멤브레인과 같은, 고형체의 표면이나, 다공성 표면 상에서 성장될 수 있다. 부가적으로, 세포 성장 표면 물질은 화학적으로 처리되거나, 변형되거나, 정전기적으로 대전되거나, 펩티드 또는 매트릭스 성분과 같은 생물학적 시약으로 덮여질 수 있다. 본 실험을 수행하는데 바람직한 성장표면은 유형 I 콜라겐으로 덮인 통상적인 조직 배양 표면이다.

배양은 가급적 약 34℃ ~ 38℃사이에서 유지되었으며, 더욱 바람직하게는 37℃에서 유지되었고, 5 ~ 10% CO₂ 및 약 80 ~ 90 %의 상대 습도 분위기에서 배양되었다. 배양기는 세포 배양을 위한 조절된 온도, 습도, 기체 혼합의 환경 조건을 유지하기 위해서 사용되었다.

고유 전구 세포로부터의 전구 세포 활성화 첫 단계에서 사용된 배지는 수득 되어, 확장된 배양물에 여전히 잔류하는 전구 세포들의 활성화를 촉진시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 이후 계대 세포들이 증식하는 것을 조절하는 배지가, 낮은 밀도로 펼쳐진 전구 세포들의 증식을 유지하기 위해 사용되었다. 조절된 배지는 10 ~ 15%의 영양 배지를 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 더욱 특성화된 조절된 보충물이 통상적인 헤파린 결합 성장 인자 (heparin-binding growth factors)의 제거, 농축 및 수득된 배지의 염 제거에 의해서 제조된다. 농축된 보충물은 원래 출발 물질에 상응하는 농도로 사용될 수 있다. 더욱 자세한 예는 하기 실시예 7에 제공된다.

실시예 4: 이식

본 발명은 포유동물로 이식하는 방법을 제공한다. 상술한 전구 세포는 포유동물이나 환자에게 이식되거나, 도입될 수 있었다. 일 예로, 이식은, 포유동물이나 환자에게 세포 부유액을 주사하거나, 포유동물이나 환자의 조직이나 기관에 세포 덩어리를 외과적으로 이식하거나, 세포 부유액으로 조직이나 기관을 관류시키는 등의 방법에 의해서, 포유동물이나 환자에게 전구 세포를 옮기는 것을 포함한다. 전구 세포를 옮기거나 이식하는 경로는 특정 조직이나 기관에 존재하는 세포의 필요에 의해 결정되고, 원하는 표적 조직 또는 기관에 의해서 발견되고 보유되는 세포의 능력에 의해 결정될 것이다. 이식된 세포가 특정 위치에 놓여지는 경우, 외과적으로 조직이나 기관 (예를 들면, 십이지장) 내로 놓여질 수 있거나, 또는 간 세포가 문맥 순환이나 지라로 주입되었을 때 간에 위치할 수 있는 것과 같이, 세포가 원하는 목표 기관으로 이동할 수 있는 능력을 갖는다면, 혈관이나 관련된 기관 에 주사될 수도 있다.

본 발명은 특히 동종인자형의 (isogenic), 동종이인자형의 (allogenic), 이종발생성의 (xenogenic) 전구세포들, 혹은 이들의 조합을 환자에게 이식하는 것을 고려하였다.

실시예 5: 췌장 전구세포를 이용한 인슐린 의존성 당뇨병의 치료

전구 세포들은 유형 1 당뇨병 환자들에게서 상실된 베타 세포들을 치환하거나, 유형 2 인슐린 의존형 당뇨병 환자의 베타 세포의 전체적인 수를 증가시키는데 유용하였다. 시체 조직은 바람직하게는 전구 세포들을 생산하는데 사용되는 공여조직으로서 작용하였다. 섬은 조직으로부터 분리되었고, 전구세포는 여기서 기술한 바와 같이 선택되었다. 전구 세포들은 다음의 배양 확대로, 혹은 성장 인자, 호르몬, 칼슘에 의해 유도되는 분화기간 이후에, 환자에게 직접 이식될 수 있었다. 일 구현예에서, 전구 세포는 면역학적으로 내성이 있고, 동종이형의 이식에 있어서는, 체액성의 혹은 면역세포반응을 유도하지 않았다. 본 발명의 구현예의 일 태양에서, 이들 세포들은 보통 MHC class Ⅱ 항원을 표현하지 않고, 티 세포 (T cell)활성을 개시하는 공촉진성 반응을 야기하지 않는다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 이식 수여자는 예를 들어 GAD65와 같은 자가 항원에 대한 차단 항체의 투여에 의해서, 또는 여기서 기술된 하나 혹은 그 이상의 면역 억제 약물의 투여에 의해서, 또는 동종면역 또는 자가면역 거부를 방해하거나 개량하는 당업계에 공지된 방법에 의해서, 싸워질 수 있는 이식된 세포들에 대한 면역 반응을 나타낼 수 있다.

실시예 6: 약물 발견

성체 기관 전구 세포의 군락, 특히 농축되거나 실질적으로 순수한 군락의 독특한 성질은, 이들 세포들로 하여금, 예를 들면, 기관 조절과 자가 분비 조절의 기작을 특성화하는 데에 매우 적합하고 바람직한 도구가 되게 한다. 이는 특히 발암과 인 비보 재생을 촉진하는 방법에 대한 연구와 관련이 있다. 인간 세포가 사용될 수 있다는 사실은 특히 유익하다. 화학적으로 한정된 조건 하에서 계를 사용하는 능력은 연구와 분석에도 또한 유익하다.

일부 구현예들에서, 본 발명에 의해 배양된 세포 군락은 상기에서 기술한 방법에 있는 다양한 단계들에서, 유전자 칩 분석, PCR, 및/또는 프로테오믹스 분석법을 사용하여 특성화된다: 성체 기관으로부터의 일차 활성화, 2차 성장 및 일련의 계대, 및 분화를 촉진하는 3차 조건들 하에서. 활성화된 유전자와 생성되는 단백질들과, 동일한 세포주를 사용한 각각의 단계에서의 이들의 발현 수준을 비교함으로써, 세포 군락의 조절의 변화와 직접적인 관련이 있는 차이점들을 관찰할 수 있다. 이어서, 성체 기관에서 인간 세포 군락들을 지배하는 통상적인 세포 경로들에 도달하기 위한 조건들을 변화시키면서, 유사하거나 또는 다른 기관들로부터 유도된 하나 이상의 인간 세포주들에서 비교될 수 있다. 이러한 경로들은 생약제학적 혹은 약제학적 조작을 위한 후보 목표가 된다. 일단 목표들이 확인되면, 화합물들은 인간 세포 혹은 기관유형적 조직의 조절에의 그들의 역할을 확인하기 위해 세포계에서 실험될 수 있다.

실시예 7: 분리된 인간 랑게르한스섬으로부터 전구세포 군락의 수득과 사용

인간 섬의 분리는 Ricordi에 의해 제안된 반자동방법을 사용하여 수행되었다 (Diabates 37:413-420, 1998). 수득한 기관은 리버레이즈 HI (Liberase HI) (Roche molecular Biosciences, Indianapolis IN) 또는 Serva 콜라게나아제 (Crescent Chemical, Brooklyn, NY)의 관내 주입에 의해 확장되었다. 대략 12 ~30분 동안의 계속된 소화 과정 후에, 조직을 8 리터의 행크 용액에 모아서 세척하였다. 분리된 섬들은 Cobe 2991 세포분리기 안의 EuroFicoll의 연속적 증감도를 사용하여 다른 조직들로부터 분리되었다 (Cell Tiss Res 310: 51-58, 2002).

약 200개의 섬 균등물을 1차 배지 4ml을 포함하는 콜라겐으로 코팅된 60-mm 배양 접시에 도포하였으며, 1차 배지는 DMEM (무포도당, 무칼슘, 4 mM 글루타민)과 Ham F12가 3:1의 비율로 구성된 베이스와 다음의 성분들을 각각의 성분들의 최종 농도를 획득하기 위하여 보충한 것으로 이루어져 있다: 6 mM 글루타민 (혹은 균등물), 1x 10^-4 M 에탄올 아민, 1x 10^-4 M 인산화 에탄올 아민, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트란스페린, 20 pM 트리요오드타이로닌, 6.78 ng/ml 셀레늄, 24.4 ㎍/ml 아데닌, 1 mM 염화 스트론튬, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 μM 비필수 아미노산, 25 ㎍/ml 아프로티닌, 9 ng/ml 포스콜린 (forskolin), 5 mM 포도당.

배양물은 세포들이 분리된 섬들에서 증식되는 시간 동안에 14일간 배양되었다. 나타난 전구 소세포 군락은 70%의 군집을 보이면 트립신 처리하여 수득하였다.

섬 유도 전구 세포의 연속 계대

증식하는 전구세포들은 유형 I 콜라겐으로 코팅된 접시에서 2차 배지로 제곱센티미터 당 4000개 세포로 연속적으로 계대되었으며, 2차 배지는 DMEM (무포도당, 무칼슘, 4 mM 글루타민)과 F-12 배지를 3:1로 섞은 베이스에 하기 성분들을 각각의 성분들의 최종 농도를 획득하기 위하여 보충하였다: 6 mM L-글루타민 (혹은 균등물), 1 ng/ml EGF, 1x 10^-4 M 에탄올 아민, 1x 10^-4 M o-인산화 에탄올 아민, 5 ㎍/ml 인슐린, 5 ㎍/ml 트란스페린, 20 pM 트리요오드타이로닌, 6.78 ng/ml 셀레늄, 24.4 ㎍/ml 아데닌(adenine), 1 mM 염화 스트론튬, 1 mM 피루브산 나트륨, 100 μM 비필수 아미노산, 5 mM 포도당. EGF는 세포가 확립되어 적어도 30% 군집에 다다르면 영양분 공급되었다. 세포는 약 80% 이하일 때 계대되었다.

전구 세포의 선택적 자극을 위한 헤파린 분획 조절 배지

조절된 배지는 활성화된 증식 전구 세포 배양물에서 수득되었으며, 헤파린 결합 성장 인자를 제거하기 위하여 준비된 헤파린-세파로즈 (heparin-sepharose)를 통과시켰다. 빈 분획은 여과로 농축시키고 G-100 세파로즈 컬럼을 사용하여 제염시켰다. 농축된 분획은 필터 멸균되었으며, 일정 분획하여 -70℃에서 사용할 때까지 보관하였다. 농축된 분획은 신선한 보충 베이스 배지에 의해서 원래 부피로 재구성되었으며, 후기 계대 혹은 낮은 밀도의 전구세포의 증식을 유지하기 위해 사용되었다.

전구세포의 활성화를 위한 조절 배지

배양물은 위에서 기술한 바와 같이 섬으로부터 확보하였다. 조절 배지는 분 화된 세포의 세포 자멸사와 전구 콜로니 형성의 개시 동안의 중간단계에서의 배양물로부터 수득되었다. 조절 배지는 여과로 농축되어 G-100 세파로즈 컬럼을 사용하여 제염시켰다. 농축된 분획은 신선한 보충 베이스 배지에 의해서 원래 부피로 재구성되었으며, 세포 분류 혹은 서서히 사이클링하는 췌장 소세포들의 배양물을 생산하는 배양 방법과 같은 다른 방법들을 사용하여 유도된 새 전구 세포의 활성화를 유지하기 위해 사용되었다.

인 비보 섬 전구 세포의 분화

섬 전구 세포들은 연속적으로 6 계대로 배양하였다. 트립신 처리된 세포들은 베이스 배지에서 현탁되고 십이지장의 점막 공간 내로 큰 바늘을 통하여 복강경수술 방법에 의해서 전달되었다. 전구 세포는 인슐린 생산 섬 조직으로 군집되어 분화되었다.

인 비보 부분적 분화된 섬 전구 세포의 전달

섬 전구 세포는 연속적으로 6 계대로 배양되어 트립신 처리되었다. 세포는 1.8 mM 염화 칼슘, 10 ng/ml 포스콜린, 4㎍/ml 히드로코르티손, 유형 I 콜라겐의 겹층을 첨가한 위에서 언급된 보충 베이스를 포함하는 조직 배양 접시 위에 도포되었다. 포낭 구조를 형성하였다. 포낭은 포스콜린의 제거와 콜라겐 겹층 제거를 위한 콜라게나아제를 처리에 의해 더 분화되도록 처리되어서, 획득되고 전달될 수 있다. 대안으로, 세포 현탁액은 1.8 mM 염화 칼슘과 4 ㎍/ml 히드로코르티손이 첨가된 위에서 언급된 보충 베이스의 존재 하에서 부유된 세포 클러스터의 형성을 촉진시키는 무중력 배양계로 접종되었다. 포낭 혹은 부분적으로 분화된 클러스터들 은 십이지장의 점막공간으로, 혹은 대신 간의 간문맥으로 투관침 (trochar)을 이용하여 복강경 수술 방법에 의해서 주입되었다.

본 발명은 본 발명의 정신 또는 필수적인 특성들로부터 벗어남이 없이 다른 특정 형태들로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 구현예들은 모든 관점에서 서술적인 것이며, 여기에 서술된 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 첨부된 청구범위에 의해서 정해지며, 청구범위의 균등물 범위 내에 속하는 모든 변화들은 이에 포함되는 것으로 간주된다.

상기 개시된 특허 문서들 및 특정 문헌들은 여기에 참고문헌으로서 통합된다.

Claims

전구 세포 및 분화 중인 세포 및 분화된 세포 중 적어도 하나를 포함하는 1차 세포 배양물을 무혈청 배지 중에 제공하는 단계;

상기 1차 세포 배양물 중에서, 상기 전구 세포의 복제를 가능하게 하면서 상기 분화 중인 세포 및 분화된 세포 중 적어도 하나의 증식을 억제하는 스트레스 반응을 유도하는 단계; 및

상기 복제로부터 야기되고 상기 1차 세포 배양물 중 세포들의 대부분을 구성하는 전구 세포들의 군락을 동정하는 단계

를 포함하는 인 비트로에서 전구 세포를 증식하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 스트레스 반응이 세포 자멸사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 스트레스 반응이 세포 괴사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 전구 세포들을 상기 1차 세포 배양물로부터 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 전구 세포들을 배양하여 2차 세포 배양물을 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양 단계가 상기 전구 세포 군락의 5 계대 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 1차 세포 배양물이 상피 세포, 췌장 세포 및 간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 분화 중인 세포 및 상기 분화된 세포 중 적어도 하나가 관상 상피 세포, 너스 세포, 협막 세포, 또는 피브로블라스트 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 실질적으로 기관 추출물을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 약 0 mM 내지 약 0.9 mM의 칼슘 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 배지가 약 0.08 mM 농도의 칼슘 이온을 포함하는 것 을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 실질적으로 어떠한 성장 인자도 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 세포 착생을 억제하도록 고안된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 리간드, 항원, 항체, 성장 인자, 시토카인, 림포카인, 케모카인, 조인자, 및 호르몬 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 스트레스 반응을 유도하는 단계가 카스파아제 경로 (caspase pathways), Bcl-2 경로, 인터루킨-10 경로, 및 AKT-매개 경로 중 적어도 하나를 조절하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 종양 괴사 인자 (TNF), TNF-성 약 세포 자멸사 유도체 (TNF-like weak inducers of apoptosis, TWEAK), TNF-관련 세포 자멸사-유도 리간드 (TNF-related apoptosis-inducing ligands, TRAIL), 인터루킨 (IL), Fas 리간드, 세포 자멸사 유도 단백질 리간드, 변환 성장 인자, 엔도톡신, 발현되고 분 비된 활성시 조절되는 정상 T-세포 (regulated-upon-activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES) 분자, 인터페론 (IFN), 및 옥사다익산 (oxadaic acid) 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 질산, TNF-α, IL-10, IL 1-β, APO-3L, APO-2L, TGF-β, IFN-γ 및 리포다당류 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지가 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)에 대한 상승제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전구 세포들의 군락이 적어도 약 80%의 개수의 전구 세포들로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 전구 세포들의 군락에 대한 분화를 촉진하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 따른 방법에 따라서 분리된 전구 세포들을 포유류에 이식하는 단계를 포함하는, 포유류 중의 질병 또는 상태를 예방하거나 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 질병이 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
한정된 배양 배지 중에서 보존되는 전구 세포들을 포함하는 인 비트로 전구 세포 군락으로서, 상기 한정된 배양 배지는 상기 세포 배양물 중에서 스트레스 반응을 유도하며, 상기 전구 세포 군락은 개수에 있어서 배지 중 모든 세포들의 대부분을 구성하는 것을 특징으로 하는 인 비트로 전구 세포 군락.
제23항에 있어서, 상기 한정된 배양 배지가 혈청 및 성장 인자들을 포함하지 않으며, 약 0.09 mM 미만의 농도로 칼슘을 포함하고, 상기 전구 세포 군락이 상기 배지 중의 모든 세포들 중 80% 이상을 차지하고, 상기 전구 세포들이 분화 및 신생 가능한 것을 특징으로 하는 인 비트로 전구 세포 군락.
비-태아 조직으로부터 인 비트로에서 증식된, 실질적으로 순수한 포유류 전구 세포 군락.