KR20060029527A

KR20060029527A - 곰팡이 유래의 에노일 환원효소 저해 활성 물질 및 그물질을 생산하는 신규 균주

Info

Publication number: KR20060029527A
Application number: KR1020040078516A
Authority: KR
Inventors: 김원곤; 정창길; 이태규; 김진환
Original assignee: 한국생명공학연구원; 크리스탈지노믹스(주)
Priority date: 2004-10-02
Filing date: 2004-10-02
Publication date: 2006-04-06

Abstract

본 발명은 지방산 생합성 활성을 저해하는 하기의 화학식(I) 또는 화학식(Ⅱ)로 표시되는 115B1 또는 115B2 물질과 그의 유도체를 제공하는 것이며, 이 115B1 또는 115B2를 생산하는 신규한 균주에 관한 것이다.

화학식(I)

화학식(Ⅱ)

후사리움, 항균활성

Description

곰팡이 유래의 에노일 환원효소 저해 활성 물질 및 그 물질을 생산하는 신규 균주{A novel compound for inhibiting enoyl-reductase and novel microorganism thereof}

도 1a는 115B1 물질의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 도 1b는 탄소핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼을 나타내는 그림.

도 2a는 115B2 물질의 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 도 2b는 HMBC 스펙트럼을 나타내는 그림.

도 3a는 115B1 물질 및 도 3b는 115B2 물질의 에노일 환원효소(enoyl-reductase) 저해 활성을 나타내는 그림.

본 발명은 세균의 지방산 생합성효소 enoyl-reductase (Fab I)에 저해하여, 포도상 구균(staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes)에 강한 항균 활성을 나타내는 115B1과 115B2 화합물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 토양 곰팡이로부터 새로운 세균의 지방산 생합성 효소(Enoyl reductase,Fab I) 저해 물질을 탐색하기 위하여 전국 토양으로부터 곰 팡이를 분리한 후 이 곰팡이 균주의 배양액으로부터 세균의 지방산 생합성효소 (Fab I) 저해 활성물질을 스크리닝하던 중 후사리움 B020115(Fusarium sp.B020115) 균주로부터 불포화 지방산 계열 2개의 화합물 115B1과 115B2를 발견하였다. 115B1 과 115B2 화합물은 각각 9-hydroxy-10, 12-octadecadienoic acid 화합물의 (10E, 12E) form과 (10E, 12Z) form이고, 9-hydroxy-10, 12-octadecadienoic acid은 식물에서 발견된 바 있다(Biosci. Biotech. biochem. 57(2), 283-287, 1993); J. Biol. Chem. 279(13), 12495-12502, 2004). 그러나 115B1과 115B2 화합물의 세균의 지방산 생합성효소 enoyl-reductase(Fab I)에 대한 저해활성 및 포도상 구균(staphylococcus aureus) 및 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes)에 대한 항균활성은 본 특허에서 최초로 보고한다.

인체 감염의 가장 흔한 원인균인 포도상구균의 마지막 치료제라고 하던 "반코마이신"에도 고도의 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin-resistant staphylococcus aureus, VRSA)이 2002년 미국 질병통제국(Centers for Disease Control)에서 세계 최초로 보고됨으로써 소위 "슈퍼 박테리아"의 확산 가능성이 매우 높아지고 있다. 이는 "반코마이신"에 의해서만 치료가 되는 메치실린 내성 포도상구균(methicillin-resistant s. aureus, MRSA)이 1970년대부터 문제시된 이후 1988년 "반코마이신"에 내성을 보이는 장구균(vancomycin resistant enterococcus, VRE)이 유럽에서 처음으로 발견되었고 1990년 후반에는 일본, 미국, 프랑스, 한국에서 보고된 "반코마이신"에 내성을 보이는 포도상구균(vancomycin intermediate-resistant s. aureus, VISA)이 발생하면서 범세계적인 위기로 떠오른 항생제 내성 의 새로운 예로서 내성문제가 얼마나 심각한지를 보여 주고 있어 새로운 개념의 항생제 개발이 시급히 요구되고 있다. 한편, 1990년 중반부터 시작한 병원 미생물 유전체 연구 결과, 새로운 항생제 타겟이 발굴되어 새로운 개념의 항생제 개발 가능성을 열어 주고 있다. 미생물 유전체 정보를 활용하여 발굴 검증된 새로운 항생제 타겟중 enoyl-ACP reductase (Fab I)은 지방산 합성 경로 중 연장(elongation)의 마지막 단계를 담당하는 미생물 생장에 필수 효소로 Gram (+), Gram (-)에 모두 존재하며 인간과 호모로지가 매우 낮으며 기존에 그 기전에 밝혀지지 않았던 트리크로산(triclosan)의 작용 타겟(target)으로 밝혀져 항생제 개발 작용점으로 다시 확인된 타겟이다.

또한, enoyl-reductase를 저해하여 지방산 생합성을 저해하는 물질은 항암제 개발로도 가능하다. 이는 인간 타입 I 지방산 합성효소(fatty acid synthase)는 유방암(breast cancer)의 치료 작용점으로 유망하기 때문이다. 실제로 트리크로산은 인간 타입 I 지방산 합성효소(Human type I fatty acid synthase)의 enoyl-reductase를 저해하여 유방암의 생육을 저해하는 항암효과를 보이고 있다(Cancer Chemother Pharmacol 49: 187-193, 2002). 따라서 본 연구에서 개발된 enoyl-reductase를 저해하여 지방산 생합성을 저해하는 물질은 항암물질로도 유용하다. 뿐만 아니라, enoyl-reductase를 저해하여 지방산 생합성을 저해하는 물질은 항결핵 및 항말라리아 의약으로의 개발이 가능하다. 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 말라리아 원충(Plasmodium falciparum)에서도 enoyl-reductase 단계는 지방산 생합성에 필수적인 과정이기 때문이다. 이미 triclosan의 항결핵 및 항말라리아 활성은 잘 알려져 있다(J. Bio. Chem.278;20851-20859, 2003).

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 지방산 생합성을 저해하는 물질을 저해하는 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 지방산 생합성을 저해하는 물질을 생산하는 균주를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 에노일 리덕타아제(enoyl reductase, Fab I)를 저해하여 항균 활성을 나타내는 하기 화학식 (I) 또는 화학식(Ⅱ)로 표시되는 115B1과 115B2 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 제공한다.

화학식(I)

화학식(Ⅱ)

본 발명에 있어서, 상기의 화합물은 신규의 후사리움 속(Fusarium sp.) 미생물에 의하여 생산되는 것이 바람직하며 기탁번호가 KCTC 10693BP인 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115)인 것이 더욱 바람직하다. 상기 후사리움 균주는 대한민국 대전시 유성구 어은동 소재 한국생명공학연구원(KRIBB) 유전자 은행에 2004년 9월 6일 기탁번호가 KCTC 10693BP로 기탁하였다.

또 본 발명은 상기의 후사리움 균주를 배양하여, 그 배양액 또는 균체를 추출하고 정제하는 단계를 포함하는 화학식(I) 또는 화학식(Ⅱ)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 화학식(I) 또는 화학식(Ⅱ)의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 그람 양성 세균에 대한 항균활성을 나타내는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 화합물에 효과적인 상기의 그람 양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus), 또는 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes)인 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 간단하게 설명한다.

본 발명자들은 미생물, 식물 등 천연물로부터 enoyl-ACP reductase (Fab I)을 이용하여 새로운 활성물질을 탐색하는 연구를 수행하던 중, enoyl-ACP reductase (Fab I)를 강하게 억제하는 물질을 생산하는 곰팡이를 발견하고 생산균주의 미생물학적 특성을 규명함과 동시에 그 균주의 배양액으로부터 본 115B1 및 115B2 물질을 순수하게 분리 정제한 후 화학구조를 결정하고 활성을 검토 확인함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다. 본 발명에 사용한 115B1 및 115B2 물질 생산균주는 토양으로부터 새롭게 분리한 균주로 미생물학적 특성은 다음과 같다.

1) 균주의 배양학적 특성

본 115B1 및 115B2 물질 생산균주는 MEA 및 CzA 배지에서의 10일 동안 배양후의 배양학적 특징은 다음과 같다.

본 발명에 있어서 115B1 및 115B2 물질을 생산하기 위한 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115) 균주 배양은 통상의 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 함유하는 배지에서 배양한다. 영양원으로는 종래 곰팡이의 배양에 이용되고 있는 공지의 영양원을 사용한다. 예를 들면 탄소원으로서는 글루코스, 물엿, 덱스트린, 전분, 당밀, 동물유, 식물유 등을 사용할 수 있으며, 질소원으로서는 밀기울, 대두박, 소맥, 맥아, 면실박, 어박, 콘스팁리커, 육즙, 효모추출물, 황산암모니움, 질산소다, 요소 등을 사용할 수 있다. 필요에 따라서는, 식염, 칼륨, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온생성을 촉진하는 무기염류를 첨가하면 매우 효 과적이다. 또한, 밀기울을 주성분으로 하는 고체배지는 균의 생육을 촉진하며 115B 물질의 생산을 촉진하는 효과가 있다. 배양방법으로는 호기적 조건에서는 진탕배양 혹은 정치배양이 가능하다.

배양온도는 상기의 각 조건들에서 배양할 경우 조건에 따라 약간씩 상이하기는 하나, 보통 20-37℃에서 배양하는 것이 적당하며, 대부분의 경우에는 26-30℃에서 배양한다. 또한, 배양기간은 진탕배양, 정치배양의 경우 모두 통상 4일 내지 7일간 배양할 때 115B 물질의 생산이 최고에 달하였다.

B020115 균주의 생육은 매우 양호하였으며 mycelium은 흰색으로 왕성하게 형성되었다.

2) 균주의 형태적 특성

분생자와 후막포자를 형성한다. 분생자중 소형분생자는 난원형 또는 원통형이고 단포이며 무색인데 크기는 8∼16㎛ 정도이며 도관속에 존재한다. 대형분생자는 초생달 모양이고 무색이며 27∼42㎛ 정도인데 2∼3개의 격막이 있다.

이상의 형태학적, 배양학적들을 조사한 결과, 본 균주를 후사리움 균주로 동정하여, 본 균주를 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115) 균주로 명명하였다.

곰팡이의 제반성질은 일정한 것이 아니라 자연적으로 혹은 인공적으로 용이하게 변화되는 것이 일반적인 성질이며, 본 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115) 균주도 그 성상이 변화하기 쉽다. 따라서, 본 발명 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115) 균주는 물론, 이 균주에 유래하는 돌연변이주(자연돌연변이 또는 인공돌연변이주), 형질접합체 또는 유전공학적인 방법에 의해 새롭게 만들어 진 균주라 하여도 115B 물질을 생산하는 것은 모두 본 발명에 포함한다.

상기에서 기술한 바와 같은 조건으로 배양하면 115B계 물질을 얻을 수 있는데, 본 물질은 배양액 뿐만 아니라 균체부분에도 존재하므로 다음의 방법에 따라 효율적으로 추출, 정제를 실시할 수 있다. 즉, 배양액 및 균사체에 아세톤 등의 유기용매를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트와 클로로포름으로 용매추출한다. 이와 같이하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 클로로포름용매층을 감압농축하여 클로로포름을 제거한 후 클로로포름:메탄올을 50:1-5:1인 용매를 사용한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 실시한다. 이와 같이 얻어진 활성분획을 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에서 정제한 후 재차 HPLC를 하여서 순수한 본 발명의 물질을 얻을 수 있다.

이상과 같이 정제된 본 발명의 115B1 및 115B2 물질의 이화학적 특성 및 화학구조는 다음과 같다.

1. 115B1 화합물

1) 물질의 성상 : 흰색 분말

2) 분자량 : 296

3) 분자식 : C18H32O3

4) 자외선흡수스펙트럼 [ UVλmax MeOHnm(logε)]: 230, 275

5) 적외선 흡수스펙트럼[ IR(KBr)υ cm-1 ] :3424, 2924, 1713, 1570, 1464

6) 핵자기 공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : 클로로포름과 메탄올을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 탄소 핵자기 공명(13C-NMR) 스펙트럼은 도 1에 도시하였다.

7) 화학구조식

2. 115B2 화합물

1) 물질의 성상 : 흰색 분말

2) 분자량 : 296

3) 분자식 : C18H32O3

4) 자외선흡수스펙트럼 [ UVλmax MeOHnm(logε)]: 233, 273

5) 적외선 흡수스펙트럼[ IR(KBr)υ cm-1 ] :3403, 2930, 1711, 1561, 1461

6) 핵자기 공명 (NMR) 흡수스펙트럼 : 클로로포름과 메탄올을 용매로 하고 테트라메칠실란(TMS)을 표준물질로 하여 측정한 수소 핵자기 공명(1H-NMR) 및 HMBC 스펙트럼은 도 2에 도시하였다.

7) 화학구조식

본 발명은 상기의 이화학적 특성을 갖는 115B1 및 115B2 물질은 물론 이들의 무기 또는 유기염, 에스테르, 수화물 및 용매화물과 이성질체를 포함한 모든 유도체까지도 포함한다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 그러나, 이 실시예에 본 발명이 국한되는 것은 아니며, 배지의 종류, 배양조건, 추출정제 방법 등을 대폭적으로 바꾸어도 본 물질을 얻을 수 있다.

[실시예 1]

후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115) 균주의 배양

한국생명공학연구원 유전자원센터 균주기탁기관에서 분양받은 후사리움 B020115(Fusarium sp.B020115) 균주를 배양하기 위하여 종 배지로는 yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, tryptone 0.5%, glucose 1%를 함유한 배지를 멸균전에 pH를 5.5로 조절한 후 사용하였다.

상기의 종배지 20ml가 담긴 100ml 용량의 삼각 플라스크를 121℃에서 20분간 멸균한 후 후사리움 B020115(Fusarium sp.B020115) 균주의 사면배양 시험관으로부터 1 백금이를 접종하여 28℃에서 3일간 진탕배양하여 이것을 1차 종배양액으로 사용하였다. 그런 다음에 멸균된 밀기울이 들어 있는 500ml 용량의 삼각플라스크(48개)에 종배양액를 접종하여 28℃에서 7일간 고체배양하였다.

[실시예 2]

115B1 및 115B2 물질의 분리및 정제

상기의 실시예 1에서 배양한 밀기울 배양체에 아세톤를 가하여 교반하여 균체로부터도 유효성분을 추출한 후 아세톤을 증발시키고 에틸아세테이트로 3번 용매추출하였다. 이와 같이하여 얻어진 유효성분을 함유하고 있는 에틸아세테이트 용매츨을 감압농축하여 에틸아세테이트를 제거한 후 클로로포름:메탄올을 100:1-5:1인 용매로 한 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 이와 같이하여 얻어진 활성분획을 감압농축하여 오일성 조유효성분을 얻은 뒤 메탄올을 용매로 한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 활성분획을 메탄올 : 물 = 85:15인 용매조건에서 HPLC를 실시하여 활성분획 115B1 및 115B2 화합물를 얻었다.

[실시예 3]

115B1 및 115B2 물질의 enoyl-ACP reductase (Fab I) 저해활성

효소 역가 측정을 위해서 Ward 등의 방법(Biochemistry 38, 12514(1999))을 변형하여 구축하였다. 유전자 재조합 기술에 의해 제조된 Staphylococcus aureus Enoyl-(acyl-carrier protein) Reductase를 사용하였다. 역가 측정은 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.5) 중에서 수행하며 기질로는 crotonyl-CoA 400uM, NADH 100uM 을 사용하고 Enoyl-(acyl-carrier protein) Reductase를 500nM 사용한다. 효소를 첨가하고 상온에서 60분 반응시킨 후 UV-spectrometer를 이용하여 340nm에서 NADH의 흡광도 감소를 측정하였다. 저해능을 평가한 화합물은 디메칠설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켜 전체 반응액의 5% 이내로 첨가하여 효소 저해능을 평가하였다. 효소 저해능은 시험 화합물이 없는 상태에서의 NADH 소실 정도에 대한, 시험화합물의 NADH 소실 정도를 백분율로 표시하며 50%의 효소 활성을 저해하는 각 시험 화합물의 농도를 IC50로 결정하였다.

그 결과는 하기 도 3에 도시하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이 115B1 및 115B2 물질 화합물은 병원균으로서 매우 중요한 S. aureus의 ENR(Fab I)에 대한 저해활성을 측정하였다. 도 3에서 보는 바와 같이 본 발명의 화합물들은 농도 의존적으로 S. aureus의 ENR를 저해하였다. 115B1 화합물은 20㎍/ml에서 40%, 40㎍/ml에서 50%, 80㎍/ml에서 80%의 ENR 저해활성을 보였으며 IC50는 30㎍/ml이였다. 115B2 화합물은 25㎍/ml에서 20%, 50㎍/ml에서 45%, 100㎍/ml에서 50%의 ENR 저해활성을 보였으며 IC50는 77.2㎍/ml이였다.

[실시예 4]

115B1 및 115B2 물질의 항균 활성

20 여균주의 G(+) 세균과 G(-) 세균을 대상으로 agar dilution 방법으로 표준약물로는 meropenem을 사용하여 MIC(μg/ml)를 측정하였다. 그 결과, 115B1 물질은 주요한 병원성 Gram 양성 세균인 Streptococcus pyrogenes 2균주, Staphylococcus aureus 3균주에 대하여 각각 25, 50의 MIC(μg/ml)의 항균 활성을 보였으며, 115B2 물질은 Streptococcus pyrogenes 2균주, Staphylococcus aureus 3균주에 대하여 각각 25, 100의 MIC(㎍/ml)의 항균 활성을 보였다.

상기의 구성에서 살펴 본 바와 같이 본 발명의 신규한 균주에서 얻은 화합물들은 그람 양성 세균에 뛰어한 항균활성을 나타내는 효과를 갖는다.

Claims

에노일 리덕타아제(enoyl reductase, Fab I)를 저해하여 항균 활성을 나타내는 하기 화학식(I) 또는 화학식(Ⅱ)로 표시되는 115A 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염.

화학식(I)

화학식(Ⅱ)
제 1항의 화합물을 생산하는 신규의 후사리움 속(Fusarium sp.) 미생물.
제 2항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호가 KCTC 10693BP인 후사리움 B020115 (Fusarium sp.B020115).
제 2항 또는 제 3항의 후사리움 균주를 배양하여, 그 배양액 또는 균체를 추출하고 정제하는 단계를 포함하는 제 1항의 화합물을 제조하는 방법.
제 1항의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 그람 양성 세균에 대한 항균활성을 나타내는 항균용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 세균은 메치실린 내성 포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus), 또는 스트렙토코커스 피로게네스(Streptococcus pyrogenes)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.