KR20060025662A

KR20060025662A - Primers for detection of pythium porphyrae, and detection method and kit using the same

Info

Publication number: KR20060025662A
Application number: KR1020040074408A
Authority: KR
Inventors: 박찬선; 황은경; 백재민
Original assignee: 박찬선
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2006-03-22

Abstract

본 발명은 한국산 김 붉은갯병 병원균(Pythium porphyrae)의 검출 또는 동정용 올리고뉴클레오타이드 프라이머(oligonucleotide primers), 이를 이용한 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정방법 및 유주자(zoospores) 수 정량방법, 및 이를 포함하는 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정용 키트 및 유주자 수 정량용 키트에 관한 것이다.The present invention provides oligonucleotide primers for the detection or identification of Pythium porphyrae in Korea, a method for the detection or identification of Korean S. aureus pathogens using the same, and a method for quantifying zoospores, and the same. The present invention relates to a kit for the detection or identification of Korean red seaweed pathogens and a kit for quantifying the number of strainers.

Description

한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출을 위한 프라이머 및 이를 이용한 검출방법 및 키트{Primers for detection of Pythium porphyrae, and detection method and kit using the same}Primers for detection of Pythium porphyrae, and detection method and kit using the same}

도 1은 한국산 김 붉은갯병 병원균의 5.8S rDNA를 포함한 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역의 염기서열을 나타낸 도면이고;1 is a diagram showing the nucleotide sequence of the ITS (Internal Transcribed Spacer) region containing 5.8S rDNA of Korean red seaweed disease pathogens;

도 2는 다양한 균주로부터 추출된 DNA에 대해 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이며;2 is a photograph showing the results of PCR using primers PP-1 and PP-2 on DNA extracted from various strains;

도 3은 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 경합 PCR 반응을 위한 내부 표준 DNA의 제작과정을 보여주는 도면이다.Figure 3 is a view showing the preparation of the internal standard DNA for competition PCR reaction using primers PP-1 and PP-2.

본 발명은 한국산 김 붉은갯병 병원균(Pythium porphyrae)의 검출을 위한 프라이머(primers), 및 이를 이용한 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출방법 및 유주자(zoospores) 수 정량방법 및 키트에 관한 것이다.The present invention relates to primers for the detection of Pythium porphyrae from Korea, and a method and kit for detecting the number of zoospores from Korea using the same.

김 붉은갯병(red rot disease)은 피티움(Pythium) 속 난균류에 속하는 병원균 에 의해 유발되는 김 갯병의 일종으로, 매년 김 양식장에 널리 발생하여 양식 김의 생산량과 품질을 떨어뜨림으로써 심각한 피해를 일으키고 있다. 이 병은 김 엽체에 적색의 둥근 병반이 나타나는 것으로부터 육안으로 병해 발생을 인식하는 것이 보통이다. 김 엽체에 붉은갯병의 병증이 관찰되면 김발의 노출 시간을 연장하거나, 김발에 직접 산처리를 실시하여 병의 확산이나 진행을 억제하거나, 김발을 갯병균이 없는 새로운 냉동망으로 교체하거나, 김의 수확시기를 앞당기거나, 병증이 만연한 김발을 육상으로 철거하는 등의 대책을 강구하고 있다. 그러나, 현재까지 김 붉은갯병에 대한 유효한 방제법은 전무한 상태이다.Seaweed red rot disease is a type of seaweed disease caused by pathogens belonging to Pythium spp., Which occurs widely in seaweed farms every year and causes serious damage by reducing the yield and quality of farmed seaweed. It's happening. It is common to recognize the development of the disease with the naked eye from the appearance of red round lesions on the lamellar leaves. If red plague symptoms are observed on the laver, the exposure time of the gimbal may be extended, or acid treatment may be applied directly to the gimbal to suppress the spread or progression of the disease, or replace the gimbal with a new freezing network without pathogens, or Measures are being taken to advance the harvest season, or to remove gimbal, which is prevalent in disease, from land. However, there is no effective control method for the red seaweed disease so far.

김 양식은 바다라는 환경에서 이루어지기 때문에 육상의 농작물과는 달리 일단 병이 발생하면 병원균이 물이라는 연속 매질을 통해 단시간 내에 인근 어장으로 확산되게 된다. 김 붉은갯병도 마찬가지로 운동성이 활발한 붉은갯병균의 유주자(zoospore)가 빠른 속도로 확산되므로 병의 감염속도가 매우 빠르고, 유효한 방제법이 전무하기 때문에, 병의 발생이 육안으로 확인되었을 때에는 붉은갯병에 의한 피해를 줄이기 위한 대책을 강구할 시간적 여유가 거의 없게 된다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 김 붉은갯병의 진단은 병원균이 현미경적인 크기이기 때문에 김 엽체에 병원균이 감염되어 병반부가 확대되어 육안으로 확인될 때까지 곤란하였다.Seaweed farming takes place in the sea environment. Unlike land crops, pathogens can spread to nearby fisheries in a short period of time through a continuous medium called water. Similarly, in the case of laver red blood disease, the infection rate of the disease is very fast because of the rapid spread of the zoospore of active red blood fungus, and there is no effective control method. There is little time for taking measures to reduce the damage. Nevertheless, until now, the diagnosis of laver red plague has been difficult until the pathogen is infected with the lamellar leaf and the lesion is enlarged and visually confirmed because the pathogen is microscopic in size.

따라서, 현재 김 붉은갯병의 피해를 최소화할 수 있는 방제대책으로 가장 현실적인 방법은 붉은갯병의 발생을 보다 조기에 판별하는 것이 무엇보다 중요하다.Therefore, it is most important to determine the occurrence of red bottle disease earlier as the most realistic method as a preventive measure that can minimize the damage of seaweed red bottle disease.

본 발명자들은 김 양식장에 발생하는 김 붉은갯병 병원균의 조기 검출법을 확 립하기 위하여, 김 붉은갯병 병원균에 특이적인 DNA 염기서열을 찾아내고 여러 종의 병원균과 비교 시험한 결과, 이들이 김 붉은갯병 병원균의 검출 및 동정에 극히 적합한 종 특이성이 매우 높은 서열임을 확인하고, 이들을 이용한 김 붉은갯병 병원균의 검출 및 동정방법을 확립하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.In order to establish an early detection method for the Kimchi red pathogen, which occurs in aquaculture, we found DNA sequences specific to the Kimchi red pathogen and compared them with various pathogens. It was confirmed that the species specificity is very suitable for the detection and identification of very high sequence, and by using them to establish a method for the detection and identification of laver red pathogenic pathogens, the present invention was completed.

따라서, 본 발명의 목적은 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정용 프라이머를 제공하기 위한 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a primer for the detection or identification of Korean red seaweed pathogens.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 한국산 김 붉은갯병 병원균을 검출 또는 동정하는 방법 및 키트를 제공하기 위한 것이다.Another object of the present invention is to provide a method and kit for detecting or identifying Korean laver red pathogens using the primers.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수의 정량방법 및 키트를 제공하기 위한 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method and kit for quantifying the number of resident of Korean red ginseng disease pathogen using the primer.

첫째, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기서열을 갖는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정용 프라이머에 관한 것이다.First, the present invention relates to a primer for the detection or identification of Korean laver red pathogenic pathogens having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 and 2.

둘째, 본 발명은 프라이머로 상기 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계를 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정방법에 관한 것이다.Second, the present invention relates to a method for the detection or identification of Korean laver red pathogenic pathogens, comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR) using the primer as a primer.

셋째, 본 발명은 프라이머로 상기 프라이머를 사용하는 경합 PCR(competitive PCR)을 수행하는 단계를 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수 정량방법에 관한 것이다.Third, the present invention relates to a method for quantifying the number of resident of Korean red seaweed disease pathogen, comprising the step of performing a competitive PCR (competitive PCR) using the primer as a primer.

넷째, 본 발명은 상기 프라이머; 및Fourth, the present invention is the primer; And

중합효소 연쇄반응 용액:Polymerase Chain Reaction Solution:

을 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정용 키트에 관한 것이다.Containing, it relates to a kit for the detection or identification of Korean red seaweed pathogens.

다섯째, 본 발명은 상기 프라이머;Fifth, the present invention is the primer;

내부 표준 DNA; 및Internal standard DNA; And

중합효소 연쇄반응 용액:Polymerase Chain Reaction Solution:

을 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수 정량용 키트에 관한 것이다.Containing, it relates to a kit for quantifying the number of users of the Korean red seaweed pathogen pathogens.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명에서는, 한국산 김 붉은갯병 병원균으로부터 총 DNA를 추출하여 그 DNA의 염기서열 중에서 종 특이성이 높은 리보솜 구조유전자(rDNA), 5.8S rDNA를 포함하는 ITS(Internal Transcribed Spacer) 영역의 DNA 염기서열을 결정하고, 이를 기초로 하여 김 붉은갯병 병원균에 특이적인 중합효소 연쇄반응을 위한 올리고뉴클레오타이드 프라이머, PP-1(5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3') 및 PP-2(5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-3')를 작성하였다.In the present invention, the DNA sequence of the internal transcript spacer (ITS) region containing ribosome structural gene (rDNA) and 5.8S rDNA having high species-specificity among the DNA sequences extracted from Korean laver red ginseng pathogens Based on the oligonucleotide primer, PP-1 (5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3 ') and PP-2 (5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-3') Created.

즉, 김 붉은갯병 병원균에 특이적인 DNA 염기서열을 분석하기 위하여, 우리나라의 대표적인 김 양식장인 전남 완도, 해남 및 신안군 김 양식장에서 균주를 분리하였다. 이 균주로부터 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide)법에 의해 총 DNA를 추출하였다. 추출된 총 DNA를 주형으로 ITS 를 포함한 rDNA 영역을 증폭하는 것으로 알려진 프라이머 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 및 ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')를 이용한 PCR법에 의해 김 붉은갯병 병원균의 rDNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA 단편을 회수하여 rDNA 영역의 염기서열을 결정하였다. 이 rDNA 염기서열 중 종 특이성이 높은 영역인 ITS 영역의 염기서열에 기초하여 김 붉은갯병 병원균에 특이적인 PCR 프라이머 PP-1(5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3') 및 PP-2(5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-3')를 작성하였다.In other words, in order to analyze the DNA sequence specific to the pathogenic red pathogen, the strains were isolated from the Kim farms in Wando, Haenam, and Sinan-gun seaweed farms in Korea. Total DNA was extracted from this strain by cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) method. Using the extracted total DNA as a template, it was known that amplification of rDNA region including ITS was performed by PCR using primers ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ') and ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'). rDNA was amplified. The amplified DNA fragment was recovered to determine the base sequence of the rDNA region. PCR primers PP-1 (5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3 ') and PP-2 (5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-) specific for the S. aureus pathogens based on the ITS region, which is a high species specific region of the rDNA sequence 3 ').

상기 프라이머를 이용한 PCR법에 의하면 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자를 신속하고 정확하게 검출 및 동정하는 것이 가능하다. 또한, 김 양식장의 해수 중에 존재하는 김 붉은갯병 병원균의 유주자 및 시중에 판매되는 마른김이나 맛김 등의 가공품에 대해서도 붉은갯병 병원균의 존재 유무를 정확하게 판별하고 병원균의 함유량을 정량하는 것이 가능하다.According to the PCR method using the primers it is possible to quickly and accurately detect and identify the resident of the Korean seaweed red pathogen pathogens. In addition, it is possible to accurately determine the presence or absence of red bottle disease pathogens and to quantify the content of pathogens for the owners of seaweed red pathogens present in seaweed farms and processed products such as dried seaweed or flavored seaweed sold on the market.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예에 의해 구체적으로 설명하나, 이들에 의해 본 발명의 범위가 어떤 식으로든지 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of preferred embodiments, but the scope of the present invention is not limited by them in any way.

실시예 1: 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정을 위한 프라이머 PP-1 및 PP-2의 제작 및 종 특이성 확인Example 1: Preparation and identification of species specificity of primers PP-1 and PP-2 for the detection or identification of Korean red seaweed pathogens

전남 완도, 해남, 및 신안군 김 양식장으로부터 김 붉은갯병에 감염된 김 엽체에서 분리한 김 붉은갯병 병원균 균주로부터 각각 총 DNA를 추출하였다. 병원균 의 순수분리는 옥수수 분말 한천(corn meal agar) 배지를 이용하여 이루어졌다. 균주들의 균사로부터 DNA를 추출하기 위하여, 한천 배지에서 생육시킨 병원균의 균사를 1 ℓ의 아라사키(Arasaki) B 배지에 접종하여 20 ℃에서 15 일간 배양하였다. 증식된 균사를 회수하여 액체 질소로 냉동시킨 후 잘게 부순 균사 분말 100 ㎎을 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% CTAB를 포함한 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충액으로 65 ℃에서 30 분간 처리하였다. 그 후, 균사 현탁액에 현탁액의 절반량의 클로로포름:이소아밀알콜(24:1 v/v)을 첨가하여 65 ℃에서 다시 30 분간 처리하였다. 22,000×g에서 5 분간 원심분리하여 얻은 수층에 1/10량의 1.4 M NaCl을 포함하는 10% CTAB 용액을 첨가한 후 절반량의 클로로포름:이소아밀알콜(24:1 v/v)을 첨가하여 65 ℃에서 30 분간 처리하였다. 원심분리 후, 수층에 동량의 이소프로판올을 첨가하여 다시 한 번 원심분리를 실시하여 얻어진 핵산의 침전물을 1 mM EDTA를 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충액으로 용해하였다.Total DNA was extracted from S. aureus strains isolated from S. aureus infected with S. aureus from Wanda, Haenam, and Sinan-gun S. a. The pure separation of pathogens was done using corn meal agar medium. In order to extract DNA from the mycelia of the strains, the mycelia of pathogens grown in agar medium were inoculated in 1 L of Arasaki B medium and incubated at 20 ° C. for 15 days. The grown mycelia were recovered, frozen in liquid nitrogen, and then 100 mg of finely pulverized mycelium powder was treated with 100 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer containing 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 2% CTAB for 30 minutes at 65 ° C. . Thereafter, half the amount of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1 v / v) of the suspension was added to the hyphae suspension and treated again at 65 ° C. for 30 minutes. To a water layer obtained by centrifugation at 22,000 × g for 5 minutes, a 10% CTAB solution containing 1/10 of 1.4 M NaCl was added, followed by half of chloroform: isoamyl alcohol (24: 1 v / v). Treatment was carried out at 65 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, the same amount of isopropanol was added to the aqueous layer, followed by centrifugation once again to dissolve the precipitate of the nucleic acid with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) buffer containing 1 mM EDTA.

rDNA 중 5.8 rDNA를 포함한 ITS 영역을 이미 알려진 프라이머 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 및 ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다. PCR은 1.5 mM MgCl₂, 200 μM dNTPs, 0.6 μM ITS4 및 ITS5 프라이머, 1.25 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(일본 다카라 슈조사 제품), 100 ng의 추출 총 DNA로 구성된 50 ㎕의 반응액으로 수행하였다. PCR 조건은 최초 95 ℃, 3 분간 열변성, 그 후 95 ℃, 1 분간 열변성, 55 ℃, 30 초간 어닐링, 72 ℃, 5 분간 신장 반응으로 설정되었다. 증폭된 DNA 단편을 회수하여 rDNA 영역의 염기서열을 결정하였다.The ITS region with 5.8 rDNA in rDNA was amplified by PCR using known primers ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ') and ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'). PCR was performed with 50 μl reaction solution consisting of 1.5 mM MgCl ₂ , 200 μM dNTPs, 0.6 μM ITS4 and ITS5 primers, 1.25 units of Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo, Japan), and 100 ng of extracted total DNA. PCR conditions were initially set at 95 ° C. for 3 minutes, followed by 95 ° C. for 1 minute, at 55 ° C. for 30 seconds, annealing for 30 seconds, and 72 ° C. for 5 minutes for elongation. The amplified DNA fragment was recovered to determine the base sequence of the rDNA region.

도 1에 한국산 김 붉은갯병 병원균의 5.8S rDNA를 포함한 ITS 영역의 염기서열을 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 ITS1, 5.8S rDNA, ITS2 영역은 각각 174, 158 및 452 bp였다. 시험에 사용된 세 균주의 5.8S rDNA를 포함한 ITS 영역의 DNA 염기서열은 완전히 일치하였다. 결정된 ITS 영역의 염기서열을 GeneBank에 등록된 다른 피티움 속 균종 및 해양세균의 ITS 영역의 염기서열과 비교한 결과, ITS1 및 ITS2 영역의 염기서열에 큰 차이가 인정되었다. 따라서, 이들 영역의 염기서열을 기초로 하여 한국산 김 붉은갯병 병원균에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프라이머, PP-1(5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3') 및 PP-2(5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-3')를 작성하였다(도 1 참조).Figure 1 shows the nucleotide sequence of the ITS region containing 5.8S rDNA of Korean red seaweed pathogens. As shown in Fig. 1, the ITS1, 5.8S rDNA, and ITS2 regions of Korean laver red pathogen were 174, 158, and 452 bp, respectively. DNA sequences of the ITS region, including the 5.8S rDNA of the three strains used in the test, were completely identical. As a result of comparing the nucleotide sequence of the determined ITS region with that of the ITS region of other Ptium species and marine bacteria registered in GeneBank, a large difference was found in the ITS1 and ITS2 region sequences. Therefore, based on the nucleotide sequences of these regions, oligonucleotide primers, PP-1 (5'-TGTGTTCTGTGCTCCTCTCG-3 ') and PP-2 (5'-CCCAAATTGGTGTTGCCTCC-3'), which are specific to Korean red ginseng pathogen, are prepared. (See FIG. 1).

상기 프라이머의 종 특이성을 검정하기 위하여, 일반 김류에서 병원성을 갖는 피티움 포르피라(Pythium porphyrae)(IFO 30800), 다른 식물류에서 병원성을 갖는 피티움 속의 병원균 P. 아파니데르마텀(P. aphanidermatum)(IFO 7030), P. 이레귤라레(P. irregulare)(IFO 30346), P. 스피노섬(P. spinosum)(IFO 7031), P. 얼티멈(P. ultimum)(IFO 32210)의 총 5 종의 병원성 균주, 김 양식장의 해수 중에 존재하는 해양세균으로부터 각각 추출된 총 DNA 100 ng을 주형으로 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다[M: 마커; 1-2: P. porphyrae(IFO 30800); 3: P. aphanidermatum(IFO 7030); 4: P. irregulare)(IFO 30346); 5: P. spinosum(IFO 7031); 6: P. ultimum(IFO 32210); 7: 해양세균]. 도 2에 나타낸 바와 같이, P. 포르피라(IFO 30800)의 균주에서 약 700 bp의 DNA 단편의 증폭이 확인되었고, 나머 지 균주에서는 DNA 단편의 증폭이 확인되지 않았다.To test the species specificity of the primer, Pythium porphyrae (IFO 30800), which is pathogenic in common seaweed, and P. aphanidermatum , a pathogen of Pydium which is pathogenic in other plants (IFO 7030), P. irregulare (IFO 30346), P. spinosum (IFO 7031), P. ultimum (IFO 32210) PCR was performed with 100 ng of total DNA extracted from marine bacteria present in seawater of pathogenic strains and seaweed farms. The result is shown in FIG. 2 [M: marker; 1-2: P. porphyrae (IFO 30800); 3: P. aphanidermatum (IFO 7030); 4: P. irregulare ) (IFO 30346); 5: P. spinosum (IFO 7031); 6: P. ultimum (IFO 32210); 7: marine bacteria]. As shown in FIG. 2, the amplification of the DNA fragment of about 700 bp was confirmed in the strain of P. porphyra (IFO 30800), and the amplification of the DNA fragment was not confirmed in the remaining strains.

실시예 2: 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 PCR에 의한 한국산 김 붉은갯병 병원균 유주자의 검출시험Example 2 Detection Test of Korean Laver Sick Pathogens by PCR Using Primers PP-1 and PP-2

실시예 1에서 제작한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용하는 PCR법에 의해 한국산 김 붉은갯병 병원균 유주자의 검출시험을 수행하였다.The detection test of the Korean red ginseng disease pathogen strain was performed by PCR using the oligonucleotide primers PP-1 and PP-2 prepared in Example 1.

아라사키 B 배지에서 생육시킨 김 붉은갯병 병원균 균사를 50 ㎖의 반해수 배지에 접종하여 20 ℃에서 15 시간 교반배양하여 붉은갯병 병원균의 유주자를 얻었다. 방출된 유주자를 20 ㎛ 나일론 메쉬로 여과 채집하여 1 mM EDTA를 포함한 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)의 완충액에 현탁하여, 1 내지 10,000 개의 유주자를 포함하는 5 ㎕의 시료액을 조제하였다. 시료액을 95 ℃에서 20 분간 처리한 후, 전량을 40 ㎕의 PCR 반응액에 첨가하여 PCR을 수행하였다.S. red pathogen pathogen hyphae grown in Arasaki B medium were inoculated in 50 ml of half-sea water medium and stirred and cultured at 20 ° C. for 15 hours to obtain a resident of red pathogen pathogens. The released strainer was collected by filtration with a 20 μm nylon mesh and suspended in a buffer of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA to prepare 5 μl of sample solution containing 1 to 10,000 strainers. After the sample solution was treated at 95 ° C. for 20 minutes, the entire amount was added to 40 μl of PCR reaction solution to perform PCR.

그 결과, 단 1 개의 유주자의 DNA를 주형으로 한 경우에도 약 700 bp의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 이로부터, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 사용한 PCR법에 의해 김 붉은갯병 병원균인 P. 포르피라의 균사, 감염 초기의 발아형 유주자 및 김 양식장 해수 중에 존재하는 감염 전의 비발아형 유주자도 동시에 검출하는 것이 가능함을 알 수 있다.As a result, amplification of a DNA fragment of about 700 bp was confirmed even when the DNA of only one strainer was used as a template. From this, by the PCR method using the oligonucleotide primers PP-1 and PP-2 according to the present invention, the mycelia of P. porphyra, which are the pathogens of the Kimchi red pathogen, the germination type of the early stage of infection and the pre-infection in the seaweed farm It can be seen that non-germination type strainers can be detected simultaneously.

실시예 3: 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 PCR에 의한 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출시험Example 3 Detection Test of Korean Red Seaweed Pathogens by PCR Using Primers PP-1 and PP-2

실시예 1에서 제작한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용하는 PCR법에 의해 마른김 및 맛김에 포함되어 있는 김 붉은갯병 병원균의 검출시험을 수행하였다.The detection test of the seaweed red pathogen pathogen contained in dried laver and taste laver by the PCR method using the oligonucleotide primer PP-1 and PP-2 produced in Example 1 was performed.

김 붉은갯병 병원균의 감염이 확인된 김 양식장에서 갯병의 만연 정도를 감염 초기, 중기 및 말기로 나누어 김을 수확하였다. 그 엽체를 이용하여 제조된 마른김과 맛김 1 장(약 3 g, 21×19 ㎝)을 마쇄기로 잘게 부수었다. 마쇄된 김 분말 1 g으로부터 CTAB법에 의해 총 DNA를 추출하고, 추출한 총 DNA를 10 ㎖의 1 mM EDTA를 포함하는 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)의 완충액에 용해한 후, 원심분리(22,000×g, 10 분)하여 수층을 분리하였다. 분리된 수층에 알콜을 첨가하여 핵산의 침전을 유도하여 얻은 핵산 침전물을 10 ㎖의 1 mM EDTA를 포함한 10 mM Tris-HCl(pH 8.0)의 완충액에 용해하였다. 이 핵산 용액 2 ㎕를 주형으로 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 사용한 PCR을 수행하였다. 그 결과 김 붉은갯병 병원균에 감염된 김 엽체로 제조된 마른김 및 맛김으로부터 추출된 DNA를 주형으로 한 경우에만 약 700 bp의 DNA 단편의 증폭이 확인되었다. 이 결과는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 PCR에 의해 마른김 및 맛김 중에 포함되어 있는 김 붉은갯병 병원균에 감염된 김을 검출하는 것이 가능하여, 김 가공제품의 품질관리를 신속하고 간편하게 행할 수 있음을 의미하는 것이다.Seaweed was harvested by dividing the prevalence of seaweed disease into the early, middle and late stages. The dried laver and flavor laver (about 3 g, 21 × 19 cm) prepared using the leaves were crushed finely with a crusher. Total DNA was extracted from 1 g of ground laver powder by CTAB method, and the extracted total DNA was dissolved in a buffer of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 ml of 1 mM EDTA, followed by centrifugation (22,000 × g, 10 minutes) to separate the aqueous layer. The nucleic acid precipitate obtained by adding alcohol to the separated aqueous layer to induce precipitation of the nucleic acid was dissolved in a buffer of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 ml of 1 mM EDTA. PCR was performed using oligonucleotide primers PP-1 and PP-2 as templates for 2 µl of this nucleic acid solution. As a result, the amplification of the DNA fragment of about 700 bp was confirmed only when the DNA extracted from dried laver and taste laver made from laver leaves infected with laver red pathogens was used as a template. This result can detect the seaweed infected with seaweed red pathogens contained in dried seaweed and taste seaweed by PCR using oligonucleotide primers PP-1 and PP-2. It means you can do it.

실시예 4: 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용한 경합 PCR에 의한 한국산 김 붉은갯병 병원균 유주자 수의 정량시험Example 4: Quantitative Test of the Number of Korean Red Seaweed Pathogen Pathogens by Contention PCR Using Primers PP-1 and PP-2

실시예 1에서 제작한 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 이용하는 경합 PCR법에 의해 한국산 김 붉은갯병 병원균 유주자 수의 정량시험을 수행하였다.The quantitative test of the number of Korean red ginseng pathogen pathogens was performed by a competitive PCR method using the oligonucleotide primers PP-1 and PP-2 prepared in Example 1.

경합 PCR 반응에 필요한 정량의 내부 표준이 되는 경합 DNA를 아래와 같이 제작하였다. 김 붉은갯병 병원균의 균사로부터 추출한 총 DNA를 주형으로 올리고뉴클레오타이드 프라이머 PP-1 및 PP-2를 사용하는 PCR을 수행하여 양쪽 말단에 PP-1 및 PP-2의 염기서열을 포함하는 증폭 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을 플라스미드 벡터 pT7Blue(R)(미국 노바젠사 제품)로 서브클로닝하였다. 그 후 도 3에 나타낸 바와 같이, 각종 제한효소로 절단하여 얻어진 DNA 단편을 다카라 DNA 결찰 키트(일본 다카라 슈조사 제품)를 이용하여 환상화하여 경합 PCR을 위한 내부 표준 DNA로 하였다.A competitive DNA serving as an internal standard for quantification required for a competitive PCR reaction was produced as follows. PCR was performed using oligonucleotide primers PP-1 and PP-2 as a template of the total DNA extracted from the mycelia of the pathogen of Kim's red pathogen, and amplified DNA fragments containing the nucleotide sequences of PP-1 and PP-2 at both ends were obtained. Got it. This DNA fragment was subcloned into the plasmid vector pT7Blue (R) (Novazen, USA). After that, as shown in Fig. 3, DNA fragments obtained by cleaving with various restriction enzymes were cyclized using a Takara DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo, Japan) to obtain internal standard DNA for competitive PCR.

김 붉은갯병 병원균의 유주자 2,000개로부터 추출한 총 DNA 및 10 pg의 내부 표준 DNA를 주형으로 프라이머 PP-1 및 PP-2를 사용하여 증폭 사이클의 변수를 16-38 사이클 범위로 설정하여 경합 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드(EtBr)로 염색하여 자외선 조사 하에서 나타나는 형광강도를 FAS-Ⅲ CCD 화상 시스템(미국 토요보사 제품)을 이용하여 김 붉은갯병 병원균 rDNA 및 내부 표준 DNA의 증폭율을 해석하였다. 그 결과, 유주자의 DNA에서 기인하는 약 700 bp의 DNA 단편 및 내부 표준 DNA에서 기인하는 약 400 bp의 DNA 단편은 경합 PCR의 20-32 사이클의 범위에서 동일한 증폭율로 증폭되는 것이 확인되었다.Competitive PCR was performed using primers PP-1 and PP-2 as the template from total DNA and 10 pg of internal standard DNA extracted from 2,000 red blood disease pathogens, using a range of 16-38 cycles. It was. After agarose gel electrophoresis of the PCR product, stained with ethidium bromide (EtBr), the fluorescence intensity under UV irradiation was measured using a FAS-III CCD image system (Toyobo Co., Ltd.). The amplification rate of DNA was analyzed. As a result, it was confirmed that the DNA fragment of about 700 bp resulting from the DNA of the resident and the DNA fragment of about 400 bp resulting from the internal standard DNA were amplified at the same amplification rate in the range of 20-32 cycles of competition PCR.

김 붉은갯병 병원균의 유주자 수의 정량적 분석을 위하여, 김 붉은갯병 병원균의 유주자 2,000개로부터 추출한 총 DNA 및 0.1 pg 내지 10 ng의 내부 표준 DNA를 주형으로 프라이머 PP-1 및 PP-2를 사용하여 30 사이클의 경합 PCR을 수행하였다. 증폭 DNA 단편의 FAS-Ⅲ CCD 화상 시스템에 의한 정량분석의 결과, 프라이머 PP-1 및 PP-2, 내부 표준 DNA는 함께 경합적으로 증폭되는 것으로 확인되었다. 즉, 프라이머 PP-1 및 PP-2, 내부 표준 DNA를 이용한 경합 PCR법에 의해 증폭된 유주자 DNA에서 기인한 약 700 bp의 DNA 단편 및 내부 표준 DNA에서 기인한 약 400 bp의 DNA 단편의 EtBr 염색에 의한 형광강도를 측정함으로써 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수를 정량화하는 것이 가능하다.For the quantitative analysis of the number of resident populations of the Kimchi disease pathogens, the total DNA extracted from 2,000 residents of the Kimchi disease pathogen and 0.1 pg to 10ng of internal standard DNA were used as primers using primers PP-1 and PP-2. Cycle contention PCR was performed. As a result of the quantitative analysis of the amplified DNA fragments by the FAS-III CCD image system, it was confirmed that the primers PP-1 and PP-2 and the internal standard DNA were amplified competitively together. That is, EtBr staining of DNA fragments of about 700 bp resulting from primer DNA PP-1 and PP-2, resident DNA amplified by contention PCR using internal standard DNA, and approximately 400 bp DNA fragments resulting from internal standard DNA. It is possible to quantify the number of resident population of laver red pathogen by measuring fluorescence intensity by.

본 발명에 따르면, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자를 신속하고 정확하게 검출 및 동정하는 것이 가능하다. 또한, 김 양식장의 해수 중에 존재하는 김 붉은갯병 병원균의 유주자 및 시중에 판매되는 마른김이나 맛김 등의 가공품에 대해서도 붉은갯병 병원균의 존재 유무를 정확하게 판별하고 병원균의 함유량을 정량하는 것이 가능하다.According to the present invention, it is possible to quickly and accurately detect and identify the resident of Korean red seaweed pathogen. In addition, it is possible to accurately determine the presence or absence of red bottle disease pathogens and to quantify the content of pathogens for the owners of seaweed red pathogens present in seaweed farms and processed products such as dried seaweed or flavored seaweed sold on the market.

<110> PARK, Chan Sun <120> Primers for detection of Pythium porphyrae, and detection method and kit using the same <130> PC04-0297-MKPO <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer PP-1 for detection of Pythium porphyrae <400> 1 tgtgttctgt gctcctctcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer PP-2 for detection of Pythium porphyrae <400> 2 cccaaattgg tgttgcctcc 20 <110> PARK, Chan Sun <120> Primers for detection of Pythium porphyrae, and detection method and kit using the same <130> PC04-0297-MKPO <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer PP-1 for detection of Pythium porphyrae <400> 1 tgtgttctgt gctcctctcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer PP-2 for detection of Pythium porphyrae <400> 2 cccaaattgg tgttgcctcc 20

Claims

서열번호 1 및 2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기서열을 갖는, 한국산 김 붉은갯병 병원균(Pythium porphyrae)의 검출 또는 동정용 프라이머.Primer for the detection or identification of Korean laver strains ( Pythium porphyrae ), having a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 and 2.

프라이머로서 제1항의 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)을 수행하는 단계를 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정방법.Using a primer of claim 1 as a primer comprising the step of performing a polymerase chain reaction (PCR: Polymerase Chain Reaction), the detection or identification method of Korean red ginseng disease.

프라이머로서 제1항의 프라이머를 사용하여 경합(competititve) 중합효소 연소반응을 수행하는 단계를 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수 정량방법.Using a primer of claim 1 as a primer comprising the step of performing a competition (competititve) polymerase combustion reaction, quantitative method for the number of resident of the Korean red seaweed disease pathogens.

제1항에 기재된 프라이머; 및The primer according to claim 1; And

중합효소 연쇄반응 용액:Polymerase Chain Reaction Solution:

을 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 검출 또는 동정용 키트.Comprising, kit for the detection or identification of Korean red seaweed pathogens.

제1항에 기재된 프라이머;The primer according to claim 1;

내부 표준 DNA; 및Internal standard DNA; And

중합효소 연쇄반응 용액:Polymerase Chain Reaction Solution:

을 포함하는, 한국산 김 붉은갯병 병원균의 유주자 수 정량용 키트.Including, the kit for quantifying the number of users of Korean laver red pathogen pathogens.