KR20060015721A - 신경보호제로서의 글루타메이트 수용체 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 글루타메이트 수용체, 바람직하게는 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 t-PA 매개 활성화 억제제의 신경보호제로서의 용도에 관한 것이다.

Description

신경보호제로서의 글루타메이트 수용체 길항제{GLUTAMATE RECEPTOR ANTAGONISTS AS NEUROPROTECTIVES}

본 발명은 신경학적 손상, 특히 메틸-D-아스파레이트 유형의 글루타메이트 수용체(이하, NMDA-글루타메이트 수용체)의 과다활성화에 직간접적으로 기인하는 손상의 치료 및 예방을 위한 신경보호제에 관한 것이다.

용어 "신경보호제"는 본 발명의 맥락에서 신경 세포를 세포 손상으로부터 보호하고/하거나 신경변성 진행 및 신경세포 효율의 장애를 중화시키는데 기여하는 치료제 또는 활성 성분을 의미한다.

신경보호제의 개발에서, 특히 흥분성 신경전달물질 수용체(흥분독성)의 증가된 활성에 대해 신경 세포를 보호하거나 과다활성화를 완화시키는 글루타메이트 수용체 길항제의 확인 및/또는 추가 개발에 실질적인 노력을 기울이고 있다. 수용체 길항제의 가장 중요한 군은 글루타메이트 수용체의 NMDA 유형을 억제하는 NMDA 길항제이다. 이와 관련하여, 글루타메이트 결합 부위에 작용하는 2-아미노-5-포스포노펜타노에이트((D)-AP5) 및 (+/-)-4-(4-페닐벤조일)피페라진-2,3-디카르복실산(PBPD)과 같은 경쟁적 NMDA 길항제; 수용체의 이온 채널을 차단하는 MK-801, 메만틴(memantine) 및 케타민과 같은 NMDA 수용체 채널 차단제; 공동효능제(coagonist) 글리신의 결합을 억제하는 GV96771A와 같은 글리신 결합 부위에 작용하는 NMDA 길항제; 및 결합성 수용체-자극 폴리아민을 억제하는 이펜프로딜(ifenprodil)과 같은 폴리아민 부위 길항제로 구별된다.

각각 글루타메이트-의존성 이온 채널로서 작용하는 3가지 부류의 글루타메이트 수용체(AMPA, 카이네이트 및 NMDA 수용체)는 가장 중요한 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 시냅스후 신호(post-synaptic signal)를 전도한다. NMDA-글루타메이트 수용체는 다양한 수용체 서브타입의 형태로 뇌 전반에 걸쳐 분포되어 있고, 중추신경계(CNS)의 작용을 위한 중요한 흥분성 신경전달물질 수용체로서 필수적이다.

최근 몇년간 NMDA-글루타메이트 수용체의 분자생물학의 상세한 연구가 이루어져 왔다. 이러한 연구로부터 이들 수용체가 NR1 서브유닛이 하나 이상의 NR2 서브유닛 및 덜 일반적으로 NR3 서브유닛이 결합된 형태로 구성되어 있는 것으로 밝혀졌다(Das, S. et al.: Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature 393 (1998), 377-381; Chatterton, J.E. et al.: Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature 415 (2002), 793-798).

특히, 4개의 형태 A 내지 D로 존재하는 NR2 서브유닛 뿐만 아니라, NR1 서브유닛의 택일적 스플라이스(splice) 변이체가 NMDA-글루타메이트 수용체의 약리학을 결정한다. NR1 및 NR2A는 CNS에 편재하게 발현되는 반면에, NR2B, NR2C 및 NR2D는 덜 일반적으로 존재하거나 뇌의 특정 영역에만 존재한다. 수용체 서브타입의 조성 에서의 이러한 차이는 선택적으로 작용하는 길항제를 사용하는 치료법을 가능하게 한다.

NMDA-글루타메이트 수용체의 복잡한 활성화를 담당하는 것은 흥분성 신경전달물질로서 시냅스전에 방출되는 글루타메이트, 및 조절 신경전달물질 및 공동효능제로서의 글리신이다. 수용체의 활성화는 칼슘 이온의 유입을 일으키고, 특히 자극이 지속되는 경우 복잡한 세포 신호의 활성화와 관련된다. 이들은 특히 기억 및 학습 과정에 대해 필수적인 근간을 이루는 CRE 결합 단백질(CREB)의 인산화, 및 다유전자 활성화 및 시냅스 가소성(신경가소성)을 일으킨다.

NMDA 수용체 및 NMDA 길항제의 일반 약리학의 고찰은 참조로서 본원에 통합된 간행물(Kemp, J.A. and McKernan, R.M.: NMDA Receptor Pathways as Drug Targets, Nature Neuroscience, Nov. 2002, Vol. 5 Suppl., 1039-1042)에 제공되어 있다.

대조적으로, 수용체의 과다활성화 및 이와 관련하여 증가된 Ca²⁺ 유입은 에너지 대사를 포함하는 Ca²⁺-의존성 세포 대사를 광범위하게 간섭한다. Ca²⁺-의존성 이화작용 효소의 활성화는 특히 이후에 발생하는 세포 사멸의 원인이 되는 것으로 생각된다(Lee, Jin-Moo et al., "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms"; Dennis W. Choi "Glutamate neurotoxicity and deseases of the nervous system"). 이러한 과정은 흥분독성으로 공지되어 있다.

흥분독성은 글루타메이트 수용체의 과다활성화에 기초하므로, 일반적으로 글 루타메이트 수용체의 길항제는 뉴런이 이러한 과정에 의해 위협받거나 손상되는 모든 CNS 장애 또는 신경 질환에 대한 치료적 및/또는 예방적 잠재력을 지닌다. 또한, 이들 "질환"은 뇌졸중 동안 발생하는 대뇌허혈 뿐만 아니라 파킨슨병 및 헌팅턴 무도병과 같은 신경변성 장애를 포함하는데, 여기서 질환의 주 원인은 과량의 글루타메이트가 아니라 흥분독성 손상에 대해 증가된 민감성이다. 최종적으로, 흥분성 신호 경로의 과다 활성에 기초한 간질 및 신경병성 동통과 같은 장애는 또한 글루타메이트 수용체 길항제의 사용이 가능한 분야이다.

기타 용도로는, 예컨대 동통 질환, 특히 만성 동통의 치료, 중독성 장애의 치료, 정신질환의 치료 및 학습 및 기억의 자극을 포함한다.

길항제는 수용체를 경쟁적 또는 비경쟁적으로 억제할 수 있다. 경쟁적 길항제가, 예컨대 천연 효능제인 글루타메이트 및 글리신에 의한 수용체 활성화를 중화시키는 반면에, 비경쟁적 길항제는, 예컨대 이온 채널을 차단함으로써 효능제의 존재 또는 농도에 관계없이 수용체를 억제한다. NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 경쟁적 억제(길항작용)는, 예컨대 2-아미노-5-포스포노발러레이트(APV) 또는 2-아미노-5-포스포노헵타노에이트(APH)를 사용하여 가능해진다. 대조적으로, 비경쟁적 억제는 펜시클리딘, MK-801, 덱스트로판(dextrophan) 또는 케타민과 같은 채널의 펜시클리딘 측에 결합하는 물질에 의해 달성될 수 있다.

그러나, NMDA 길항제를 신경보호제로 사용하는 지금까지의 임상적 연구는 특히 뇌졸중 및 외상성 뇌 손상의 경우에 아직 바람직한 결과를 나타내지 못했다(Kemp, J.A.; Kew, J.N.C.; Gill, R.: Handbook of Experimental Pharmakology Vol. 141 (eds. Jonas, P. & Monyer, H.) 495-527 (Springer, Berlin, 1999); Lees, K.R. et al.: Glycine antagonist (gavestinel) in neuroprotection (GAIN International) in patients with acute STROKE: a randomised controlled trial. GAIN International Investigators. Lancet 355 (2000), 1949-1954; Sacco, R.L. et al. Glycine antagonist in neuroprotection for patients with acute stroke: GAIN Americas: a randomized controlled trial. JAMA 285 (2001), 1719-1728).

뇌졸중의 경우의 신경보호 시도가 지금까지 성공을 거두지 못한 것은, 특히 공지된 신경보호제가 조직 손상의 부위로 침투하고 여기서의 이들의 효과를 나타내기 위해서 반드시 혈전 용해제와 병용되어야 한다는 사실에 기인될 수 있다. 더욱이, 상당한 부작용으로 인해 요망되는 효과를 달성하기에 충분히 높은 용량의 공지된 NMDA-글루타메이트 수용체 길항제를 투여하는 것이 일반적으로 가능하지 않다. 이는 상기 길항제가 높은 투여량에서 특히 환각 및 혈압의 현저한 증가를 야기시키기 때문이다. 물론, 혈압의 현저한 증가는 뇌졸중 환자에게 있어서 특히 위험하다.

게다가, 공지된 글루타메이트 수용체 길항제는 종종 신경보호제를 위해 필요한 투여량에서 용납하기 어려운 강한 마취 또는 마약 효과를 지닌다. 따라서, 펜시클리딘 및 케타민과 같은 다수의 NMDA 길항제는 본래 마취를 목적으로 개발되어졌다.

따라서, 수용체 선택적 NMDA 길항제를 사용하여 상기 부작용을 피하기 위한 시도가 이루어졌다. 이러한 시도로부터 뇌졸중의 동물 모델에서 현저하게 감소된 부작용과 함께 이로운 효과를 지니는 NR2B-선택적 길항제인 이펜프로딜이 밝혀졌다(Gotti, B. et al. Ifenprodil and SL 82.0715 as cerebral anti-ischemic agents. Evidence for efficacy in models of focal cerebral ischemia. J. Pharmacoil. Exp. Ther. 247 (1988), 1211-1221). 다수의 NR2B 서브유닛의 추가의 길항제, 예컨대 CP-101606, Ro 25-6981 및 Ro 63-1908이 이후에 기재되었다(Kemp, J.A.; Kew, J.N.C.; Gill, R.: Handbook of Experimental Pharmakology Vol 141 (eds. Jonas, P. & Monyer, H.) 495-527 (Springer, Berlin, 1999); Gill R. et al.: Pharmacological characterization of RO63-1908 (1-[2-(4-hydroxy-phenoxy)-ethyl]-4-(4-methyl-benzyl)-piperidin-4-01), a novel sinotype-selective N-methyl-D-asparatate antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302 (2002), 940-948). 이들은 또한 동물 모델에서 거의 부작용 없이 신경보호 효과를 확실하게 나타냈다. 그러나, 이러한 긍정적인 결과는 외상성 뇌 손상에 대한 임상적 연구에서 확증할 수 없었다. 오히려, CP-101606은 반복적으로 실패했다(Press release from Pfizer, October 2001). 게다가, 뇌졸중시 세포 손상을 감소시키기 위한 적절한 신경보호제를 찾는 것과 관련된 특정한 문제는 신경보호제가 혈전의 장벽을 극복하고 손상된 조직의 영역으로 침투하기 위해 섬유소용해제/혈전용해제와 병용되어야 한다는 점이다(상기 참조). 통상적으로 투여되는 혈전용해제는 현재 뇌졸중의 치료에 대해 인가된 유일한 혈전용해제인 t-PA이다.

그러나, t-PA가 흥분독성에서 중요한 역할을 한다는 것이 니콜 등(Nicole et al.)의 연구로부터 공지되어 있다(Nicole O; Docagne F Ali C; Margaill I; Carmeliet P; MacKenzie ET; Vivien D and Buisson A. 2001; The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling; in: Nat Med 7, 59-64). 이에 따르면, 탈분극된 피질 뉴런은 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 NR1 서브유닛과 상호 작용하여 이를 분해시키는 t-PA를 분비한다. 이는 수용체 활성의 활성화와 관련이 있다. 따라서, t-PA의 투여는 세포 손상 흥분독성에 기여한다. 결과는 t-PA의 신경독성 효과이다. 따라서, 뇌졸중과 관련된 세포 손상의 예방 및 치료를 위한 신경보호제의 개발은 뇌졸중에 의해 야기된 세포 손상을 약화시키는 것 뿐만 아니라 가능하다면 혈관을 다시 열기 위한 치료제의 투여에 의해 야기되거나 증가된 손상도 고려해야 하는 특정한 난제에 직면한다.

따라서, 본 발명의 목적은 신경학적 손상의 치료 및 예방을 위한 대안적 가능성을 제공하는데에 있다.

이러한 목적은 t-PA 활성을 억제하는 물질을 신경보호제로 사용함으로써 달성된다. 이와 관련하여, 용어 "억제"는 t-PA 활성의 축소 또는 감소를 일으키는 모든 효과를 포함한다. 이는, 예컨대 t-PA의 경쟁적 또는 비경쟁적 억제, 가속된 분해 또는 t-PA 발현의 감소(서프레션(suppression))를 수반할 수 있다. 이에 따라, 용어 억제제는 세포에서 t-PA 활성의 감소를 야기시키는 모든 물질을 의미한다.

t-PA 활성은 특히 글루타메이트 수용체, 바람직하게는 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 활성화로 정의된다. 바람직하게는, 신경보호제에 의한 글루타메이트 수용체의 활성화의 감소는 신경보호제의 투여시 영향을 받은 조직의 세포 내로의 Ca⁺⁺ 유입을 결정함으로써 측정된다. Ca⁺⁺를 시각화 하기 위한 검정은 당업자에게 공지되어 있고, 본원의 섹션 Ⅱ의 실시예 3에 기재되어 있다.

t-PA 억제제는 광범위하게 공지되어 있다. 이에따라, 예컨대 t-PA의 활성은 플라스미노겐 활성제 억제제(PAI)에 의해 조절되는 것으로 공지되어 있다. 마찬가지로, t-PA는 프로테아제 뉴로세르핀 또는 프로테아제 넥신 Ⅰ(PN-1)에 의해 억제될 수 있다. 이들 억제제는 각각의 경우에서 생리적 환경에서 t-PA를 억제하는 세린 프로테아제 억제제이다. 그러나, 이들은 본 발명에 따라 신경보호제로 사용된다.

또한, 본 발명에 따라 생리적 억제제의 전사 속도의 증가를 통해 간접적으로 t-PA 활성을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 예컨대 PAI-1의 전사를 자극하는 것으로 공지된 TGF-β(전환성장인자 β)를 투여하는 것이 가능하다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 플라스미노겐 활성 인자인 DSPA(데스모테플라제(desmoteplase))가, 특히 흥분독성으로부터 유래된 (병리학적) 질환의 치료를 위한 신경보호제로 사용된다. DSPA와 이의 이소폼(isoform)은 특히 미국 특허 제 5,830,849호 및 미국 특허 제 6,008,019호에 상세하게 기재되어 있다. DSPA의 재조합 제법이 미국 특허 제 5,731,186호에 기재되어 있다. 이들 간행물은 DSPA의 구조, 기능 및 제조를 기재하기 위한 목적으로 본원에 참조로서 통합되어 있다.

특히 바람직하게 사용되는 데스모테플라제 이소폼의 일차 구조는 도 1에 묘사되어 있다(DSPA 알파1). 그러나, 동일한 기능을 지니는 기타 DSPA 이소폼을 사용하는 것이 본 발명에 따라 또한 가능하다. 마찬가지로, 이들은 상기 언급된 미국 특허에 기재되어 있다. 이들 플라스미노겐 활성 인자는 이후 이들과 관련되는 DSPA 알파1에 제한됨이 없이 DSPA 또는 데스모테플라제로 일률적으로 언급된다.

천연의 정제된 DSPA 및 재조합 DSPA 둘 모두를 사용하는 것이 본 발명에 따라 가능하다. 마찬가지로, DSPA의 신경보호 효과를 나타내는 한 DSPA의 유도체 또는 단편을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, 용어 "DSPA"는 본원에서 실질적으로 동일한 기능을 지니는 천연 또는 재조합 DSPA 및 이의 유도체, 유사체 또는 단편에 대한 일반 용어로 이해된다.

용어 DSPA의 "유도체, 유사체 또는 단편"은 천연 DSPA의 특성, 특히 천연 t-PA와 관련하여 증가된 피브린 특이성을 기능적으로 나타내는 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한다. t-PA와 관련한 DSPA의 증가된 피브린 특이성은 WO 03/037363에 기재되어 있다. 바람직하게는, DSPA 유도체 및 유사체는 도 1에 나타낸 DSPA의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80 내지 90% 이상의 상동성을 지닌다.

DSPA의 본 발명에 따른 놀라운 신경보호 효과는 DSPA가 신경독성이 없을 뿐만 아니라 t-PA의 신경독성 효과를 중화시켜 신경보호 효과를 지닌다는 것을 나타낼 수 있는 동물 실험 및 시험관내 실험에서 확인되었다. 이 실험으로부터 DSPA가 t-PA의 길항제로 작용한다는 것을 확인하였다. DSPA의 높은 농도가 DSPA가 단독으로 투여되는 경우, 즉 t-PA의 외부 투여가 없는 경우에서도 NMDA에 의해 유도된 신경 손상을 감소시킨다는 것이 추가로 밝혀질 수 있었다.

DSPA의 신경보호 효과를 실험적으로 연구하기 위해, 마우스 태아로부터 단리된 피질 뉴런의 배양물을 신경 세포 사멸을 유도시키기 위해 NMDA로 처리했다. NMDA 이외에, 배양 배지는 다양한 양의 t-PA 및/또는 DSPA를 함유했다. 이들 시험관내 실험은 t-PA가 NMDA에 의해 유도된 세포 사멸의 강화작용을 발생시키는 반면, DSPA는 이러한 효과를 야기시키지 않음을 나타냈다(도 2). 다른 한편으로, DSPA가 t-PA와 함께 투여되는 경우, t-PA 단독으로 투여한 경우와 비교하여 NMDA에 의해 유도된 세포 사멸이 현저하게 감소되었다(도 3). 또한, 이러한 실험으로부터 DSPA가 t-PA에 의해서 증가되는 신경 세포 손상에서 현저한 농도-의존성 감소를 일으킬 수 있음이 명백했다.

글루타메이트 수용체의 활성화에 의해 야기된 Ca⁺⁺ 유입의 감소가 각각의 테스트 물질에 의한 신경보호의 인디케이터(indicator)로 공지되어 있으므로, DSPA 또는 t-PA의 사전 투여시의 Ca⁺⁺ 유입을 결정하기 위한 연구를 추가로 수행했다. DSPA가 세포 내로의 Ca⁺⁺ 유입을 증가시키지 않았고 t-PA의 손상 효과를 중화시켰으므로 DSPA에 의한 신경보호가 상기 실험으로부터 또한 확증되었다(도 4).

DSPA의 신경보호 효과의 메커니즘은 아직 명확하게 알려지지 않았다. 그러나, 이는 t-PA와 같이 DSPA가 글루타메이트 수용체에 결합하지만 이를 분해시키지 않아서, 이후에 활성화시키지 않는다는 사실로부터 도출될 수 있다. 따라서, DSPA는 그 자체로 흥분독성에 기여하지 않고, t-PA에 의한 수용체의 활성화를 차단할 것이다.

신경보호제로서의 DSPA의 적합성은 1995년 이래로 공지된 t-PA의 신경독성의 견지에서 특히 놀랍다. DSPA 및 t-PA는 상당한 기능적 및 구조적 일치를 지니므로, DSPA가 또한 신경독성일 것으로 예상되었었다.

DSPA 또는 이의 유도체 또는 단편의 본 발명에 따른 용도의 특별한 장점은 DSPA의 신경보호 효과의 놀라운 발견으로 인해 피브린용해 특성 및 신경보호 특성 둘 모두를 지니는 치료제를 사용하는 것이 가능하다는 사실을 기초로 한다.

이러한 장점은 뇌졸중의 치료에 특히 효과적인데, 이는 뇌졸중과 관련된 조직 손상이 특히 내생성 t-PA 및 치료 목적에 적합한 경우에 투여되는 t-PA의 신경독성 부작용에 기인하기 때문이다. DSPA의 신경보호 효과를 통해 적어도 t-PA의 이러한 손상 효과를 중화시키는 것이 가능하다.

본 발명의 특히 이로운 구체예에서, 뇌졸중의 치료에 있어서 혈전 용해제, 예컨대 t-PA와 함께 DSPA가 신경보호제로서 투여될 수 있다. 따라서, 환자에 대한 t-PA의 치료 이점을 활용하고, 동시에 신경보호제로서의 DSPA에 의해 t-PA의 신경독성 부작용을 중화시키거나 적어도 약화시키는 것이 가능하다.

본 발명에 따라 신경보호제로 사용될 수 있는 물질은 다수의 병리학적 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다(상기 참조). 가능한 용도는 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴 무도병 및 당뇨병과 같은 신경변성 장애의 치료; 동통성 질환의 치료; 중독성 장애의 치료; 간질, 운동장애, 우울증, 불안상태 및 기억 장애과 같은 신경 및 정신질환의 치료; 인지기능의 전반적인 개선; 및 근위축성 측삭 경화증의 치료를 포함한다. NMDA-글루타메이트 수용체의 과다활성화는 상기 장애 또는 질환의 각각의 발병기전에서 중요한 역할을 한다.

이미 최초의 임상적 연구에서 환자의 정동 상태에 대해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 신경보호제의 치료 효능을 밝혀낼 수 있었다. 이 연구에서, DSPA로 처리된 환자의 정동 상태(우울증 및 불안상태)가 검사되었다.

용어 "우울증"은 장애의 발달에 대한 생리적 또는 심리적 백그라운드(background)와 관계없이 외부 상황에 대한 적절한 반응으로 간주될 수 없는 모든 정동 또는 정신 장애를 포함하는 것으로, 본원에서 광범위하게 정의된다. 또한, 용어 "우울증"은 특히 불안상태를 포함한다. 따라서, 용어 "항우울제"는 상기 장애의 치료를 위한 치료제를 포괄적으로 의미한다.

급성 허혈성 뇌졸중에서 DSPA 알파1의 임상적 효과 및 안전성을 평가하기 위해 임상적 연구를 수행했다(이하, DIAS(급성 허혈성 뇌졸중에서의 데스모테플라제) 연구로 표기). 이 연구는 뇌졸중의 증상이 발생한 후 3 내지 9시간 이내에 환자에게 DSPA를 정맥내로 투여한, 위약 대조된 무작위 Ⅱ상 이중 맹검 연구이다.

뇌졸중에 의해 영향을 받은 뇌의 영역이 비가역적으로 손상되었거나, 부분적으로 손상되었거나, 뇌의 위험한 영역이 여전히 보호될 수 있는지의 여부에 따라 선별된 46명의 환자가 연구의 제 1 파트에 참여했다. 뇌의 이전에 손상된 영역이 혈전 용해제를 사용하는 재관류에 의해 잠재적으로 보호될 수 있는 환자만을 본 연구에 포함시켰다. 환자들은 MRI(자기 공명 영상)에 의해 선택하였다.

46명의 연구 환자중 16명의 환자는 위약으로 처리했다. 나머지 30명은 데스모테플라제 생성물을 투여하였는데, 17명은 25 ㎎의 활성 성분으로 처리했고 13명은 37.5 또는 50 ㎎으로 처리했다.

위약 처리된 환자의 56% 이상이 우울증을 호소했다. 이들 우울증이 각각의 치료 의사에 의해 우울증으로 명백하게 진단되었으나, 추가의 정보의 부재로 인해 우울증의 특정한 소견으로 명백히 지정하는 것은 가능하지 않았다. 따라서, 이러한 우울 증후군은 각각의 경우에서 "우울증 NOS", 즉 "달리 특정되지 않음"으로 치료 의사에 의해 분류되었다.

따라서, 위약 치료된 환자의 절반 이상이 이러한 불특정된 우울증을 나타낸 반면에, 필적하는 데스모테플라제 처리된 군에서의 우울증에 걸린 환자의 비율은 전체적으로 16.7% 뿐이었다.

특히, 62 ㎍/㎏, 90 ㎍/㎏, 125 ㎍/㎏의 DSPA 또는 위약으로 처리된 56명의 환자가 본 연구의 두번째 파트에 참여했다. 본 연구의 두번째 파트의 결과는 재관류 및 우울증의 빈도의 감소 둘 모두에 대해서 첫번째 파트의 결과를 확증했다.

이러한 결과를 기초로 하면, 정동 장애의 치료를 위해 DSPA 알파1에 대한 바람직한 투여량은 60 ㎍/㎏ 보다 크고 160 ㎍/㎏ 보다 작은 용량, 특히 90 내지 125 ㎍/㎏이다. 그러나, 보다 높은 투여량으로 정동 장애를 감소시키는 것이 또한 가능하다.

투여량은 기타 DSPA 이소폼 또는 DSPA 유도체, 유사체 또는 단편의 사용시에 다양할 수 있다. 이 경우에서, 투여량은 사용되는 물질의 각각의 생물학적 등가성을 기초로 유리하게 적합된다.

이러한 낮은 투여량은 정맥내로 볼루스(bolus) 투여에 의해 단일 치료가 수행되는 경우에 뇌졸중에 이은 우울증(뇌졸중후 우울증)에 대해 특히 유리하다. 이후, 90 ㎍/㎏의 DSPA도 충분할 수 있다. 훨씬 낮은 투여량은 (아)만성 용도시에 충분할 수 있다. 이는 본 발명에 따라 사용되고 내인성 t-PA 생성의 억제를 일으키는 t-PA 억제제에 특히 적용된다. 다른 한편으로, 상기 언급된 투여량은 NMDA 수용체에서 경쟁적 억제를 야기시키는 억제제에 대해 바람직하다. 보다 덜 급성인 병적 상태는 피하, 경구 또는 흡입 제형이 유리하다.

인간의 정동 상태 및 학습 행동에 대한 t-PA의 중요성은 공지되어 있다. 따라서, t-PA는 건강한 사람의 학습 행동에서 긍정적인 역할을 한다(Pawlak 2002 and 2003). 마찬가지로, t-PA 결핍 마우스 돌연변이에 대한 연구로부터 편도의 t-PA가 스트레스에 의해 유발된 불안상태에 대한 중요한 요인이고(Pawlak et al. 2003) 불안의 유발에 있어 필수적임(Pawlak 2003)이 공지되어 있다. 다른 한편으로, 우울증의 발생은 신체가, 예를들어 상해와 같은 스트레스에 대해 반응할 수 있게 하는 소위 신경 가소성과 관련이 있는 것으로 생각된다. 지금까지 발견된 바에 따르면, 이러한 과정은 특히 t-PA 매개 글루타메이트 수용체 활성화에 의해 조절된다.

종합해 보면, 공지된 연구는 스트레스 또는 상해를 통해 방출된 내인성 t-PA가 시냅스후 세포에 대한 신호를 나타내고 성형적인 신경 변화에 대한 트리거(trigger)로 작용한다는 것을 나타낸다.

신경가소성을 기초로 하는 메커니즘은 소위 장기 강화(long term potentiation, LTP) 및 장기 우울증(LTD)을 포함할 것이다. LTP는 뉴런의 고주파수 흥분 및 이에 의해 유발되는 증가된 탈분극에 의해 유발된다. 이러한 장기 강화는 Ca⁺⁺ 방출을 증가시키는 NMDA-글루타메이트 수용체의 글루타메이트 의존 활성화를 기초로 한다. 증가된 칼슘 농도는 시냅스의 증가된 효능을 유발하고 이에 따라 특정한 환경에 적응할 수 있게 한다.

LTD는 이전의 LTP의 "보상"으로 유발되거나 저주파수 전기자극에 의해 새로이 유발될 수 있다. 따라서, LTP와 같이 상기 메커니즘은 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체의 활성화를 기초로 한다. 그러나, 이는 적당한 Ca⁺⁺ 유입을 일으키고, 이에 따라 시냅스 효능을 단지 감소시킨다. 이는 우울증을 야기시킨다.

현재, t-PA가 NMDA 유형의 글루타메이트 수용체에 결합하여 수용체를 분해시키고 이에 따라 이를 활성화시키는 것으로 공지되어 있다. 이는 참고문헌(Pawlak et al.)에서 관찰되는 바와 같이 t-PA에 의한 신경 가소성에 대한 영향의 기초를 형성할 수 있다. 장기 강화 및 장기 우울증의 발달 둘 모두는 방출되는 t-PA의 양에 따라 설명될 수 있을 것이다.

따라서, DSPA가 길항제로서 NMDA-글루타메이트 수용체의 활성화를 차단하고 이에 따라 결과적으로 장기 우울증을 중화시킬 수 있다는 것이 본 발명에 따른 DSPA의 신경보호 효과에 대해 설명된 연구로부터 추론될 수 있다.

시냅스 활성에 대한 DSPA 및 t-PA의 효과의 차이점 및 이에따른 LTP 및/또는 LTD에 대한 효과의 차이점은 또한 신경 세포에 대한 칼슘 이동 실험으로부터 명백해진다(상기 참조). 이들 시험관내 실험은 t-PA를 사용한 신경 세포의 처리가 NMDA 의존 칼슘 방출을 일으키는 반면에, DSPA를 사용한 동일한 처리가 세포내 칼슘 농도에 영향을 주지 않음을 나타낸다(도 4 참조). t-PA에 의해 야기된 농도의 증가는 대조군과 비교하여 30%였다.

Ⅰ. 임상적 연구(DIAS)

정동 장애(우울증 및 불안상태)에 대한 DSPA의 효과의 DIAS 연구의 결과는 도 5에 요약되어 있다.

Ⅱ. 뮤린 피질 뉴런에 대한 시험관내 연구

일차 피질 포유동물 뉴런의 배양:

수태한 스위스 화이트 마우스(모나쉬 대학교의 센트럴 애니멀 하우스로부터 입수)를 수태 14 내지 16일 째에 희생시키고 자궁을 제거했다. 태아를 멸균 상태 하에서 분리하고, 머리를 떼어내어 뇌를 노출시키고, 해부 현미경(Industrial and Scientific Supply Co.) 하에서 현미 해부에 의해 대뇌 네코르티스(necortice)를 해부하였다. 상기 해부는 3 ㎎/㎖ 우 혈청 알부민(BSA) 및 1.2 mM MgSO₄(pH 7.4)를 포함하는 행크 균형 염용액(Hank's balanced salt solution, HBSS; 137 mM NaCl, 5.37 mM KCl, 4.10 mM NaHCO₃, 44 mM KH₂PO₄, 0.13 mM NaHPO₄, 10mM HEPES, 1 mM 피루베이트, 13 mM D(+)글루코오스 및 0.001 g/ℓ 페놀 레드)중의 얼음상에서 수행했다. 수막 및 혈관을 조심스럽게 제거했다. 플라스틱 피펫의 끝을 사용하여 조직 을 작은 조각으로 부수고 단편을 수거하기 위해 1000 g의 속도에서 간단하게 원심분리시켰다. 단편의 펠레트를 트립신(0.2 ㎎/㎖) 및 데옥시리보뉴클레아제 Ⅰ(DNase Ⅰ, 880 U/㎖)을 포함하는 따뜻한(37℃) HBSS(3 ㎎/㎖ BSA 및 1.2 mM MgSO₄가 함유되어 있음)중에 재현탁시키고, 5분 동안 37℃에서 진탕되는 수조에서 인큐베이션시켰다. 트립신 억제제(83.2 ㎍/㎖), DNase Ⅰ(880 U/㎖) 및 MgSO₄(1.22 mM)를 포함하는 동등한 부피의 HBSS(3 ㎎/㎖의 BSA가 함유되어 있음)를 첨가함으로써 단편의 분해를 정지시키고, 5분 동안 1000 g에서 원심분리시켰다. 상층액을 흡입기로 제거하고, 트립신 억제제(0.52 ㎎/㎖), DNase Ⅰ(880 U/㎖) 및 MgSO₄(2.7 mM)를 포함하는 HBSS를 펠레트에 첨가하였다. 조직을 분쇄(구경 24 주사 바늘에 15회 통과시킴)시켜 분해시키고, 5분 동안 1000 g에서 원심분리시켰다. 상층액을 흡입기로 제거하고, 세포를 2% B27 보충제(Invitrogen, USA), 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 0.5 mM의 L-글루타민 및 10%의 투석된 우 태아 혈청(dFCS)을 포함하는, 이하 완전 NBM으로 언급되는 뉴로베이설(Neurobasal^TM) 배지(InVitrogen, USA; NBM)에 재현탁시켰다. 현탁액의 세포 밀도 및 배양 수율은 헤모사이토미터 챔버에서 세포수 계산을 반복하여 밝혀냈다. 세포를 0.3 × 10⁶ 또는 0.12 × 10⁶ 세포수/샘플 챔버의 밀도로 눈크(Nunc^TM)(Denmark) 24- 또는 96-샘플 플레이트에 접종시켰고, 이를 0 일의 시험관내 기간으로 규정지었다(0 분열). 세포 부착을 촉진시키기 위해 플레이트를 미리 폴리-D-리신(50 ㎍/㎖)으로 코팅시켰 다. 이러한 코팅은 37℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후 제거했다. 24시간 후(1회의 세포 분열), 완전 NBM을 dFCS가 제거된 완전 NBM(2.5% B27 보충제 함유)으로 대체시켰다. 혈청이 제거된 완전 NBM의 절반을 3 내지 4회의 분열마다 대체시켰다. 세포를 CO₂ 습도 배양기 내에서 37℃에서 유지시켰고, 역위상차현미경(Olympus, IMT-2)으로 검사하였다. 세포 손상이 진행됨에 따라 세포 배양물의 형태를 기록하기 위해, 사진을 찍었다(Kodacolor Gold 100 Iso film). 모든 작업 단계는 달리 기록되지 않는 경우 실온에서 수행했다.

1. NMDA 유발 신경 세포 사멸에 대한 t-PA 및 DSPA의 효과

상기 프로토콜에 따라 배양된 피질 뉴런에 NMDA(30 μM 또는 70 μM)를 첨가함으로써 t-PA 및 DSPA에 의한 NMDA 유발 세포 사멸의 증가를 검사하였고, 배양물을 추가로 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 비교로서 TX-100을 사용한 완전한 용해를 이용하여, 유리된 락테이트 탈수소효소(LDH)를 결정함으로써 유발된 세포 사멸의 범위를 측정하였다. 이어서, NMDA를 증가하는 농도의 t-PA(5, 50, 250, 500 nM) 또는 DSPA(5, 50, 500 nM)의 존재 하에서 배양물에 첨가하고, 세포 사멸을 유사한 방식으로 결정하였다.

30 μM 또는 70 μM의 NMDA의 첨가는 둘 모두의 NMDA 농도에서 현저한 세포 사멸을 일으켰다(도 2 참조). 증가되는 농도의 t-PA의 존재 하에서, 500 nM의 가장 높은 t-PA 농도에서만 세포 사멸 유발의 속도가 증가함을 관찰했다(도 2 참조). 대조적으로, DSPA를 사용한 경우에는 NMDA 유발 세포 사멸의 향상이 관찰되지 않았 고, 특히 높은 DSPA 농도에서는 NMDA 유발 세포 사멸의 감소가 있었다. NMDA의 부재하에서, t-PA 또는 DSPA에 의한 신경 세포 사멸이 유발되지 않았다(도 2 참조).

2. DSPA에 의한 t-PA 유발 세포 사멸의 감소

DSPA의 첨가가 NMDA 유발 세포 사멸의 t-PA 유발 향상을 중화시킬 수 있는지의 여부를 확인하기 위해 추가의 시험관내 실험을 수행했다. 이러한 목적을 위하여, 각각의 경우에, 500 nM의 일정한 t-PA 농도 및 5, 50 및 500 nM의 증가하는 DSPA 농도의 존재 하에서 피질 뉴런의 일차 배양물에 70 μM NMDA를 첨가하였다(도 3). 24시간 동안 인큐베이션시킨 후에 유리된 락테이트 탈수소효소(LDH)의 양을 기초로 하여 배양물에서 발생하는 세포 손상의 범위를 다시 결정하였다.

각각의 경우에 500 nM의 일정한 t-PA 농도 및 증가하는 DSPA 농도(5, 50, 500 nM)에서 피질 뉴런의 일차 배양물에 NMDA(70 μM)를 첨가하고 24 시간 후에 유리된 LDH 양을 기초로 하여 신경 세포 사멸을 결정하였다. 이는 증가하는 DSPA 농도를 사용한 경우에 신경 세포 사멸 유발의 t-PA 의존성 자극이 억제됨을 나타냈다.

3. Ca ⁺⁺ 이동 실험

Fluo-3/AM을 사용하는 검정에 의해 세포내 칼슘 농도를 연구하였다. 이러한 목적을 위해, 피질 뉴런을 9일 동안 배양하였고(상기 참조), HEPES-완충식염수 중에 10 μM Fluo-3/AM과 함께 로딩하였다. 이 식염수는 135 mM의 NaCl, 5 mM의 KCl, 0.62 mM의 MgSO₄, 1.8 mM의 CaCl₂, 10 mM의 HEPES 및 6 mM의 글루코오스를 포 함하고(pH 7.4), 1시간 동안 37℃에서 유지시킨 식염수이다. 색상의 분산을 촉진시키기 위해 DMSO(1%) 및 0.2%의 플루로닉(Pluronic) F-127을 첨가하였다.

색상이 완충액으로부터 빠져나오는 것을 방지하기 위해 세포를 1 mM의 퓨로세마이드를 함유하는 상기 언급된 HEPES 완충액으로 세척했다(이하, 모든 완충액에 사용됨). 기준선을 수득하기 위해 세척 후 및 처리 시간(5분) 동안 485/530 ㎚(여기/발광)에서 세포의 상대 형광 단위(RFU)를 측정하였다. 이를 위해 플루오로스캔 상승 형광계(Labsystems)를 사용했다.

도 4에 나타낸 바와 같이, NMDA 단독 처리는 1분 후에 칼슘 농도를 현저하게 증가시켰다(P < 0.05). 이러한 칼슘 농도는 NMDA가 첨가되기 전 5분 동안 세포가 t-PA(30 ㎍/㎖; 500 nM; P < 0.05)로 전처리되는 경우에 30%까지 추가로 증가했다.

이러한 결과는 t-PA의 사전 첨가가 NMDA에 의한 칼슘 방출을 추가로 증가시킨다는 문헌(Nicole et al. 2001)의 보고와 일치한다. t-PA 단독 처리는 유리 칼슘 이온의 농도를 변화시키지 않았다. 다른 한편으로, NMDA의 첨가 전에 5분 동안 DSPA를 사용한 신경 세포의 전처리는 NMDA 단독으로 첨가하여 달성한 범위 이상으로 칼슘 농도를 변화시키지 않았다. 따라서, DSPA 단독은 세포내 칼슘 농도에 영향을 주지 않는다.

참조문헌

- Chatterton, J.E. et al.: Excitatory glycine receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature 415 (2002), 793-798

- Das, S. et al.: Increased NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature 393 (1998), 377-381;

- Dennis W. Choi "Glutamate neurotoxicity and deseases of the nervous system"

- Gill R. et al.: Pharmacological characterization of RO 63-1908 (1-[2-(4-hydroxy-phenoxy)-ethyl]-4-(4-methyl-benzyl)-piperidin-4-01), a novel sinotype-selective N-methyl-D-asparatate antagonist. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302 (2002), 940-948

- Gotti, B. et al. Ifenprodil and SL 82.0715 as cerebral anti-ischemic agents. Evidence for efficacy in models of focal cerebral ischemia. J. Pharmacoil. Exp. Ther. 247 (1988), 1211-1221

- Kemp, J.A. and McKernan R.M.: NMDA Receptor Pathways as Drug Targets, Nature Neuroscience. Nov. 2002, Vol. 5 Suppl., 1039-1042

- Kemp, J.A.; Kew, J.N.C.; Gill, R.: Handbook of Experimental Pharmakology Vol. 141 (eds. Jonas, P. & Monyer, H.) 495-527 (Springer, Berlin, 1999);

- Lee, Jin-Moo et al.: "The changing landscape of ischemic brain injury mechanisms";

- Lees, K.R. et al.: Glycine antagonist (gavestinel) in neuroprotection (GAIN International) in patients with acute STROKE: a randomised controlled trial. GAIN International Investigators. Lancet 355 (2000), 1949-1954;

- Nicole O., Docagne F., Ali C., Margaill I., Carmeliet P., MacKenzie E.T., Vivien D., Buisson A., 2001: The proteolytic activity of tissue-plasminogen activator enhances NMDA receptor-mediated signaling, Nat. Med. 7, 59-64

- Pawlak R., Magarinos A.M., Melchor J., McEwen B., Strickland S., 2003: Tissue plasminogen activator in the amygdala is critical for stress-induced anxiety-like behavior, nature neuroscience, 6 (2), 168-174

- Pawlak R., Nagal, N., Urano T., Napiorkowska-Pawlak D., Ihara H., Takada Y., Collen D. Takada A., Rapid, specific and active site-catalyzed effect of tissue-Plasminogen activator on hippocampus-dependent learning in mice, 2002, Neuroscience, 113(4), 995-1001

- Press release from Pfizer, October 2001).

- Sacco, R.L. et al. Glycine antagonist in neuroprotection for patients with acute stroke: GAIN Americas: a randomized controlled trial. JAMA 285 (2001), 1719-1728

Claims (12)

1. 글루타메이트 수용체, 바람직하게는 NMDA 유형의 t-PA-매개되어 활성화된 억제제의 신경보호제로서의 용도.
2. 뉴런 손상 또는 글루타메이트 수용체의 흥분독성(excitotoxicity)을 바탕으로 한 질환의 치료 및 예방을 위한 청구항 1에 청구된 억제제의 용도.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 우울증 또는 불안상태를 치료하기 위한 억제제의 용도.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뇌졸중의 치료에 사용됨을 특징으로 하는 억제제의 용도.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 파킨슨증, 알츠하이머병, 헌팅톤 무도병, 당뇨병, 동통 질환, 간질 또는 기억 장애와 같은 질환의 치료 또는 예방을 특징으로 하는 억제제의 용도.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, t-PA 활성을 억제하는 프로테아제의 사용을 특징으로 하는 억제제의 용도.
7. 제 6 항에 있어서, 세린 프로테아제 억제제, 바람직하게는 뉴로세르핀(neuroserpin), 플라스미노겐 활성제 억제제(PAI) 또는 프로테아제 넥신Ⅰ(PN-Ⅰ)임을 특징으로 하는 억제제의 용도.
8. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, DSPA 또는 기능적 및/또는 구조적으로 DSPA에서 유래될 수 있는 이의 유도체, 유사체 또는 단편의 사용을 특징으로 하는 억제제의 용도.
9. 제 8 항에 있어서, 도 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 지니는 DSPA 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80 내지 90%의 상동성을 지니는 DSPA 유도체, 유사체 또는 단편이 사용됨을 특지으로 하는 억제제의 용도.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 도 1에 나타낸 바와 같이 62.5 이상, 160 ㎍/㎏ DSPA 미만, 바람직하게는 90 내지 125 ㎍/㎏ DSPA, 특히 바람직하게는 90 ㎍/㎏ DSPA의 투여량, 또는 이의 유도체, 유사체 또는 단편의 생물학적 동등성을 기초로 하여 조정된 용량이 사용됨을 특징으로 하는 억제제의 용도.
11. 제 8 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, DSPA 또는 이의 유도체, 유사체 또는 단편이 혈전 용해제와 병용하는 뇌졸중의 치료에 있어서 신경보호제로 사용됨을 특징으로 하는 억제제의 용도.
12. 제 11 항에 있어서, 혈전용해제가 t-PA임을 특징으로 하는 억제제의 용도.

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