KR20060009866A - Treatment of hi-virus infections with oxidized blood proteins - Google Patents

Abstract

The invention relates to medicaments for the treatment of an infection of a host cell by HI-viruses and/or for the inhibition of the binding of an Env protein to a CD4 protein. Medicaments are disclosed for the above, containing oxidised proteins, oxidised peptides and/or oxidised peptides, obtainable from full blood, production methods for such medicaments and therapeutic and non-therapeutic applications of said medicaments.

Description

산화된 혈액 단백질을 이용한 ＨＩ-바이러스 감염의 치료{Treatment of HI-Virus Infections with Oxidized Blood Proteins}Treatment of HI-Virus Infections with Oxidized Blood Proteins

본 발명은 HI 바이러스에 의한 숙주 세포의 감염에 대한 대처 및/또는 Env 단백질이 CD4 단백질에 결합되는 것을 억제하는 의약 조성물에 관한 것이다. 이를 위해 산화된 단백질, 산화된 펩타이드 및/또는 상기 산화된 단백질 및/또는 산화된 펩타이드의 펩타이드 모방체(peptidomimetic) 물질을 함유하는 본 발명의 의약 조성물을 제공하고, 상기 의약 조성물의 제조방법 및 상기 의약 조성물의 치료 및 비치료적 용도를 제공한다. 이하에서는 산화된 단백질, 산화된 펩타이드 및 도입부에 언급한 펩티도미메틱 물질을 용어 "oxP"로 통칭한다.The present invention relates to a pharmaceutical composition which copes with infection of a host cell by HI virus and / or inhibits the binding of an Env protein to a CD4 protein. To this end, there is provided a pharmaceutical composition of the present invention containing an oxidized protein, an oxidized peptide and / or a peptide peptidomimetic material of the oxidized protein and / or oxidized peptide, and a method of preparing the pharmaceutical composition and the It provides a therapeutic and non-therapeutic use of the pharmaceutical composition. In the following oxidized proteins, oxidized peptides and peptidomimetic materials mentioned in the introduction are referred to collectively as the term "oxP".

WO 02/22150A2 및 WO 02/32445 A2에 개시된 바와 같이 이에 제한되는 것은 아니지만, "면역 방어 활성화된(immune defense activated)" 안티트롬빈(IDA-ATIII), 산화된 혈청 알부민, 산화된 피브리노겐과 같은 oxP는 HI 바이러스의 엔벨로프(envelope)에 있는 Env 단백질의 GP120에 결합한다. OxP는 WO 02/22150 A2에서 본 발명자들이 예시적으로 IDA-ATIII에 대해 보인 바와 같이 숙주세포에서 HI 바이러스의 증식을 방해한다.OxP such as, but not limited to, WO 02 / 22150A2 and WO 02/32445 A2, "immune defense activated" antithrombin (IDA-ATIII), oxidized serum albumin, oxidized fibrinogen Binds to GP120 of the Env protein in the envelope of the HI virus. OxP interferes with the proliferation of HI virus in host cells as we exemplarily show for IDA-ATIII in WO 02/22150 A2.

본 발명에서는 oxP 가 HI 바이러스와 숙주세포간의 접촉을 방해하고, 감염된 및 감염되지 않은 방어세포로부터 합포체(syncytia)의 생성을 차단함으로써 "엔트리(entry)" 레벨에서 감염을 억제한다. 놀랍게도 숙주세포의 HI 바이러스에 의한 감염을 방지하기 위해 사람의 혈청 알부민과 같이 정제되고 산화된 단백질 및 산화된 펩타이드가 필요하지 않고, 산화된 혈장이 이미 그 자체로써 "엔트리" 레벨에서 감염을 방해한다는 것을 발견하였다.In the present invention, oxP inhibits infection at the "entry" level by interfering with the contact between HI virus and host cells and blocking the production of syncytia from infected and uninfected defense cells. Surprisingly, there is no need for purified and oxidized proteins and oxidized peptides, such as human serum albumin, to prevent infection by the HI virus in the host cell, and that oxidized plasma already inhibits infection at its "entry" level. I found that.

비록 몇 개의 강력한 항바이러스 의약품이 존재하지만 HIV는 전세계적인 질병으로 발전하였고 이에 따라 가장 심각한 감염성 질병이 되었다. 400백만 명 이상이 매년 상기 질병에 인해 사망한다. 프로테아제 억제제 및 역전사효소 억제제와 같이 오늘날 허용된 HIV 의약품이 감염된 사람으로부터 HIV를 완전히 제거할 수 없으므로 신규한 항 바이러스 의약품을 발명하여야 하는 긴요한 필요성이 존재한다.Although several powerful antiviral drugs exist, HIV has developed into a worldwide disease and therefore the most serious infectious disease. More than 400 million people die from the disease each year. There is a critical need to invent novel antiviral medicines because today's accepted HIV medications, such as protease inhibitors and reverse transcriptase inhibitors, cannot completely eliminate HIV from an infected person.

HIV 감염 / AIDS는 인류 발전상 가장 중요한 위기를 대표한다. 따라서 모든 과학적 노력 외에도 용이하게 제조되고 저렴한 반면 사하라 지역 이남의 사람들에게도 쉽게 보급될 수 있는 HIV 의약품이 개발되어야 한다.HIV infection / AIDS represents the most important crisis in human development. Therefore, in addition to all scientific efforts, HIV drugs must be developed that are easily manufactured and inexpensive, but also readily available to people outside the sub-Saharan region.

본 발명에 개시된 oxP 가 HIV 감염의 가장 초기단계에서 차단하고, oxP는 용이하고 저렴하게 제조될 수 있고(사람의 혈장 유래의 단백질을 직접 이용할 수 있다) 특수 실험실에서만 수행되는 것이 아니기 때문에 이러한 목적은 본 발명에 의해 해결되었다.This is because the oxPs disclosed herein block at the earliest stages of HIV infection, and oxPs can be produced easily and inexpensively (directly using proteins derived from human plasma) and are not performed only in specialized laboratories. It was solved by the present invention.

원칙적으로는 바이러스의 멤브레인(membrane)이 목표세포(target cell)의 멤브레인과 접촉하고 그 후 두개의 멤브레인이 융합될 때까지 접근하여 엔벨로프에 감싸인 바이러스는 목표 세포에 침투한다. HIV-1 바이러스가 숙주세포와 접촉하기 위해서는 외부에 위치한 HIV 엔벨로프 단백질 Env가 수용체 CD4에 결합하는 것이 필요하다. 이는 Env 구성성분인 GP120에 의해 이루어진다. GP120은 그 다음 주요 보조 수용체(co-receptor)인 CXCR4 또는 CCR5에 결합한다. GP120이 그의 수용체에 결합함으로써 외부 GP120/GP41 복합체(complex)의 구조 변형에 이른다. 바이러스의 GP41-N-말단의 제공을 가능하게 하기 위해 이러한 상호작용은 전제 조건이며 궁극적으로 멤브레인 융합에 이른다.In principle, the virus's membrane contacts the membrane of the target cell and then approaches until the two membranes fuse, so that the virus wrapped in the envelope penetrates the target cell. In order for the HIV-1 virus to contact the host cell, the externally located HIV envelope protein Env needs to bind to the receptor CD4. This is done by the Env component GP120. GP120 then binds to the major co-receptor, CXCR4 or CCR5. The binding of GP120 to its receptor leads to structural modification of the outer GP120 / GP41 complex. In order to enable the provision of the GP41-N-terminus of the virus, this interaction is a prerequisite and ultimately leads to membrane fusion.

바이러스 침투를 부분적으로 차단할 수 있는 하나의 인자는 직접 GP120을 표적으로 하는 중화 항체이다. 그러나 자연 발생적인 감염에 대한 중화 항체의 효율성에는 제약이 따르는데, 이는 한편으로 HIV가 상당한 양의 다양한 항원 변이체(variant)를 생산하고, 다른 한편으로는 감염 후 HIV 중화 항체의 제한되는 "클로날 우위"가 일어나기 때문이다. 따라서 새로운 HIV-1 변이체가 이러한 특이적이지만 제한된 반응을 피할 수 있다.One factor that can partially block viral infiltration is neutralizing antibodies that directly target GP120. However, the effectiveness of neutralizing antibodies against naturally occurring infections is limited, on the one hand that HIV produces a significant amount of various antigenic variants, and on the other hand the limited "clonal" of HIV neutralizing antibodies after infection. Advantage ". Thus new HIV-1 variants may avoid this specific but limited response.

최근 비특이적이고 선천성 면역 반응이 HIV에 대한 방어와 관련이 있다는 것이 알려졌다. 다형핵 호중성 백혈구(PMNL) 및 단핵구(monocyte)는 자극 후 HIV-1에 대해 바이러스 살생적이다. 백혈구의 산화성 폭발(burst)을 일으키는 리포폴리사카라이드(LPS) 자극은 HIV 침투의 차단을 발생시키고 바이러스의 보조 수용체의 표현형은 고려하지 않는다.Recently, it has been known that nonspecific and innate immune responses are associated with defense against HIV. Polymorphonuclear neutrophils (PMNL) and monocytes are viral killing for HIV-1 after stimulation. Lipopolysaccharide (LPS) stimulation, which causes oxidative bursts of leukocytes, results in blockade of HIV invasion and does not take into account the phenotype of the viral's co-receptors.

백혈구는 H₂O₂를 생성하고 헴(Haem) 단백질인 마이엘로퍼옥시다제(MPO)를 분 비한다. Klebanoff 등은 효소 MPO의 유전된 결핍을 지닌 환자에게 자극된 PMNL은 감소된 바이러스 살생 활성을 갖는다는 것을 보여주었다. MPO를 첨가함으로써 감소된 방어력이 재구성될 수 있었다. 현재의 지식수준을 기초로 MPO 생성물인 HOCL 자체가 항바이러스 작용하는 에이전트인 것으로 추정된다. HOCL을 생산하는 MPO의 발현 및 분비는 생체 내(in vivo)에서 엄격하게 제어된다. 유리된 HOCL은 산화 스트레스의 일부분을 나타낸다.Leukocytes produce H ₂ O ₂ and secrete myeloperoxidase (MPO), a heme protein. Klebanoff et al. Showed that stimulated PMNL in patients with an inherited deficiency of the enzyme MPO had reduced viral killing activity. By adding MPO the reduced defenses could be reconstructed. Based on current knowledge, HOCL itself, the MPO product, is assumed to be an antiviral agent. Expression and secretion of MPO producing HOCL are tightly controlled in vivo. Free HOCL represents part of the oxidative stress.

본 발명자들은 HOCL와 접촉한 단백질/펩타이드가 항바이러스 형태로 전환(transform)될 수 있고 이리하여 HOCL은 공지된 직접적 작용 외에 HIV-1에 대해 간접적 작용을 한다는 것을 발견하였다. The inventors have found that proteins / peptides in contact with HOCL can be transformed into antiviral forms, such that HOCL acts indirectly against HIV-1 in addition to known direct actions.

장래의 치료적 응용을 위한 억제 유형의 비교를 위해 MPO로 인해 염증이 생긴 조직에서 생성된 HOCL은 LDL 및 많은 다른 인간 단백질을 생체 내에서 변형(modify)시킨다. HOCL 변형된 단백질은 특이적 모노클로날 항체(WO 02/32445 A2)에 의해 감지될 수 있다. 따라서 HOCL 처리에 의해 생성된 구조적 변화로 하나의 에피토프가 제공되고, 이는 이미 생체 내에서 존재하였고 그리하여 면역체계에 잘 알려진 것이다. 따라서 oxP는 생체 내에서 용인(tolerate)될 것이다.HOCL generated in inflamed tissues due to MPO for comparison of the type of inhibition for future therapeutic applications modifies LDL and many other human proteins in vivo. HOCL modified protein can be detected by specific monoclonal antibodies (WO 02/32445 A2). Thus, the structural change produced by HOCL treatment provides one epitope, which is already present in vivo and is therefore well known to the immune system. Thus oxP will be tolerated in vivo.

추가로 oxP는 비교적 용이하고 저렴한 화학적 변형에 기초를 둔다.In addition, oxP is based on relatively easy and inexpensive chemical modifications.

왜 인체는 HIV 감염에 대해 보호하기 위해 생체 내에서 충분한 oxP를 생성하지 않는가? 이에 대한 해답은 HIV 감염된 사람에게서 호중성 백혈구 및 단핵구의 기능이 감염 초기에 악화되고 HIV 유도된 질병의 정도/경과와 기능손실이 양성적으로 관련이 있다는 관측이 될 수 있다.Why doesn't the human body produce enough oxP in vivo to protect against HIV infection? The answer may be that the function of neutrophil leukocytes and monocytes deteriorates early in infection in HIV-infected individuals, and that the loss / function of HIV-induced disease is positively related.

따라서 본 발명의 목적은 HIV 감염을 이미 "엔트리" 레벨에서 억제하고 동시에 용이하고 저렴하게 제조함으로써 이른바 "제 3세계"에 있는 환자에게도 적용할 수 있는 의약 조성물을 제공하는데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition that can be applied to patients in the so-called "third world" by inhibiting HIV infection already at the "entry" level and at the same time making it easy and inexpensive.

본 발명의 목적은 HI 바이러스에 의한 숙주세포의 감염에 대한 대처 및/또는 Env 단백질이 CD4 단백질에 결합하는 것을 억제하는 의약 조성물의 제조방법으로 달성되며, 이는 다음의 단계를 특징으로 하고 있다:An object of the present invention is achieved by a method of preparing a pharmaceutical composition for coping with infection of a host cell by HI virus and / or inhibiting the binding of an Env protein to a CD4 protein, which is characterized by the following steps:

a) 사람 및/또는 동물의 혈액으로부터 얻을 수 있는 단백질 및/또는 펩타이드를 함유한 혼합물의 제조a) preparation of a mixture containing proteins and / or peptides obtainable from the blood of humans and / or animals

b) 상기 혼합물에 함유된 단백질 및/또는 펩타이드의 산화b) oxidation of proteins and / or peptides contained in the mixture

종래의 연구에서 CD4 단백질과 Env 단백질의 결합에 대한 개개의 정제된 단백질의 작용을 보여주었으나, 이제는 놀랍게도 HI 바이러스에 의한 숙주세포의 감염 및/또는 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합도 단백질 혼합물에 의해 억제되고, 감소되고 또는 완전히 억제될 수 있다. 특히 이러한 작용은 하나 이상의 단백질 또는 펩타이드류를 가진 복합 단백질 및/또는 펩타이드를 함유한 혼합물에 의해 달성될 수 있다. HI 바이러스에 의한 숙주세포의 감염에 대한 대처 및/또는 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하기 위해 필요한 산화된 단백질 및/또는 펩타이드의 제조과정이 산화시 이러한 복합 혼합물에서 오류적 구조 및 부반응에 의해 영향을 받아 이러한 혼합물에서 산화된 단백질의 활성을 감소시키거나 완전히 배제되는 것이 예상되기 때문에 이러한 사실은 놀라왔다.Previous studies have shown the effect of individual purified proteins on binding of CD4 and Env proteins, but now surprisingly, infection of host cells with HI virus and / or binding of Env proteins to CD4 proteins is also incorporated into the protein mixture. Can be inhibited, reduced or completely suppressed. In particular this action can be achieved by mixtures containing complex proteins and / or peptides with one or more proteins or peptides. The production of oxidized proteins and / or peptides necessary to cope with infection of host cells by the HI virus and / or to inhibit the binding of Env proteins to CD4 proteins is subject to erroneous structure and side reactions in these complex mixtures upon oxidation. This fact was surprising because it is expected to be affected by and to reduce or completely exclude the activity of oxidized proteins in such mixtures.

본 발명에서의 혈액은 사람 또는 동물, 특히 원숭이, 소, 양, 돼지, 개, 염소, 토끼 또는 마우스로부터 채취한 혈액 및 필요에 따라 적절한 항응고제와 혼합한 혈액이다.Blood in the present invention is blood obtained from humans or animals, especially monkeys, cows, sheep, pigs, dogs, goats, rabbits or mice, and blood mixed with appropriate anticoagulants as necessary.

본 발명에서는 상술한 바와 같이 oxP가 CD4에 대한 HIV-GP120의 결합을 차단하고 이에 따라 목표세포로 HIV의 침투를 방해한다. 그러나 바이러스는 증식을 위해 숙주세포로 침투하여야 하기 때문에 더 이상 증식할 수 없다. HIV 감염된 방어세포와 감염되지 않은 방어세포 간의 합포체 생성은 억제되어 본래의 역할을 계속 수행하여 감염된 세포를 파괴한다.In the present invention, as described above, oxP blocks the binding of HIV-GP120 to CD4 and thus hinders penetration of HIV into target cells. However, the virus can no longer propagate because it must penetrate the host cell for proliferation. The formation of the cochlear body between HIV-infected and non-infected cells is suppressed and continues to play its original role, destroying the infected cells.

특히 바람직하게는 단계 b)에서 산화된 혼합물이 단계 b)에서 산화되는 혈장 단백질 및/또는 혈장 펩타이드를 함유할 때이다. 이 때 혈장 단백질과 혈장 펩타이드는 혈액의 원심분리 또는 침전시에 위쪽에 위치하는 액체에 함유되고, 이로부터 제조할 수 있는 단백질, 펩타이드 및 단백질 또는 펩타이드 복합물이다. 혈장 단백질 또는 혈장 펩타이드에는 특히 혈청 알부민, 특히 사람의 혈청 알부민과 소의 혈청 알부민이 해당되며, 안티트롬빈, "면역 방어 활성화된" 안티트롬빈(IDA-ATIII), 피브리노겐, 응고인자 및 면역글로불린이 해당된다. 따라서 혈장 단백질, 혈장 펩타이드, 혈청 알부민, 특히 사람의 혈청 알부민과 소의 혈청 알부민, 안티트롬빈, "면역 방어 활성화된" 안티트롬빈(IDA-ATIII), 피브리노겐, 응고인자 또는 면역글로불린 또는 이들의 혼합물을 HI 바이러스에 의한 숙주세포의 감염에 대한 대처 및/또는 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하기 위한 의약 조성물을 제조하는데 사용하는 것이 바람직하다.Especially preferably, the mixture oxidized in step b) contains plasma proteins and / or plasma peptides which are oxidized in step b). In this case, the plasma protein and the plasma peptide are proteins, peptides and protein or peptide complexes that can be contained in the liquid located at the time of centrifugation or precipitation of blood and prepared therefrom. Plasma proteins or plasma peptides include, in particular, serum albumin, in particular human serum albumin and bovine serum albumin, and antithrombin, "immune defense activated" antithrombin (IDA-ATIII), fibrinogen, coagulation factor and immunoglobulin. . Therefore, plasma proteins, plasma peptides, serum albumin, in particular human serum albumin and bovine serum albumin, antithrombin, "immune defense activated" antithrombin (IDA-ATIII), fibrinogen, coagulation factor or immunoglobulin or mixtures thereof It is preferably used to prepare a pharmaceutical composition for coping with infection of a host cell by a virus and / or for inhibiting binding of an Env protein to a CD4 protein.

산화된 단백질 및/또는 산화된 펩타이드 대신 또는 이를 보충하여 의약 조성물을 약제학적으로 허용 가능한 담체를 상술한 본 발명의 단계 b)의 제조방법에 따른 산화된 혼합물의 산화된 단백질 및/또는 펩타이드를 대체할 수 있는 펩타이드 모방체를 혼합함으로써 제조할 수도 있다. 펩타이드 모방체를 제조하기 위해 특히 제약-화학 연구 전략이 수립되었다(Roempp online, 문서번호 RD-16-00950 참조). 이러한 전략을 적용함으로써 당업자는 본 발명에 따른 제조방법을 수행하기 위해 필요한 펩타이드 모방체를 제조할 수 있다.Substituting or supplementing the oxidized protein and / or the oxidized peptide, the pharmaceutical composition replaces the oxidized protein and / or peptide of the oxidized mixture according to the process of the process of step b) of the present invention, which describes a pharmaceutically acceptable carrier. It can also be prepared by mixing possible peptide mimetics. In particular, pharmaceutical-chemical research strategies have been established to prepare peptide mimetics (see Roempp online, document no. RD-16-00950). By applying this strategy one skilled in the art can prepare the peptide mimetics necessary to carry out the preparation method according to the invention.

본 발명에 따라 제조한 의약 조성물은 이에 따라 산화된 단백질(들), 산화된 펩타이드(들), 산화된 아미노산, 펩타이드 모방체 및/또는 펩타이드 유사체(oxP로 약칭)를 함유한다.Pharmaceutical compositions prepared according to the invention thus contain oxidized protein (s), oxidized peptide (s), oxidized amino acids, peptide mimetics and / or peptide analogs (abbreviated as oxP).

본 발명에서 의약 조성물은 예를 들면 실시예에 기재된 방법에 따라 제조된 완전한 oxP를 함유할 수 있다. 반면 방어 반응 후 생성된 oxP를 신체로부터 분리할 수도 있다. 더 나아가 환자 자신 또는 공여자의 혈장 분획(혈장 단백질 혼합물)을 단백질의 분리과정을 거치지 않고 oxP를 함유한 의약품으로 직접 전환시킬 수 있다. 더 나아가 HIV-GP120에 결합하는 ox-펩타이드를 사용하는 것을 고려할 수 있다. 본 발명의 범위 내에서 목표세포로 HIV의 침투를 역시 방해한다면 oxP 유사체도 적합하다.The pharmaceutical composition in the present invention may contain a complete oxP prepared according to the method described in the Examples, for example. On the other hand, the oxP produced after the defense reaction can be separated from the body. Furthermore, the plasma fraction (plasma protein mixture) of the patient himself or the donor can be directly converted into oxP-containing medicinal products without the isolation of the protein. Furthermore, one may consider using an ox-peptide that binds to HIV-GP120. OxP analogs are also suitable if they also interfere with the penetration of HIV into target cells within the scope of the present invention.

본 발명의 의약 조성물은 당연히 기타 약제학적으로 허용 가능한 보조 및/또는 담체 성분을 함유할 수 있고, 이때 상기 의약 조성물은 국부적, 진피내, 피상의, 복강내, 정맥내, 근육내 또는 구강 투여를 위해 제형화될 수 있고 또는 소포(vesicle)에 의한 투여가 가능하다. 본 발명의 의약 조성물은 이에 따라 바람직하게는 이러한 보조 또는 담체 성분을 함유하고, 이는 개별적으로 바람직한 응용 유형을 가능하게 한다.The pharmaceutical composition of the present invention may naturally contain other pharmaceutically acceptable adjuvant and / or carrier ingredients, wherein the pharmaceutical composition is intended for local, intradermal, superficial, intraperitoneal, intravenous, intramuscular or oral administration. To be formulated or administered by vesicles. The pharmaceutical compositions of the invention thus preferably contain such auxiliary or carrier components, which individually enable the desired type of application.

본 발명의 의약 조성물은 oxP, 이들의 일부분 또는 유사체 또는 모방체 외에 예를 들면 항생제, 기타 HIV 감염 억제제와 같은 기타 성분을 추가로 함유할 수 있다. 처치하는 수반 질병에 따라 공지된 의약 조성물의 지원을 받아 처치하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 의약 조성물과 oxP의 적절한 조합은 이에 따라 필요한 경우 본 발명의 바람직한 실시양태이다.The pharmaceutical composition of the present invention may further contain other ingredients such as, for example, antibiotics, other HIV infection inhibitors, in addition to oxP, a portion or an analog or mimetic thereof. Depending on the accompanying disease to be treated, it may be desirable to treat it with the support of known pharmaceutical compositions. Appropriate combinations of such pharmaceutical compositions with oxPs are thus preferred embodiments of the present invention where necessary.

본 발명에 따른 의약 조성물의 바람직한 용도는 특허청구범위에 기재되어 있다. 특히 바람직한 비치료적 용도는 각각 특히 동물 또는 사람 기원의 세포 및/또는 세포 배양물의 처리, HI 바이러스에 의한 숙주세포의 감염에 대한 대처, 특히 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합 억제, 이때 특히 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 GP120 단위 간의 결합 억제에 관한 연구일 수 있다. 더 나아가 본 발명에 따른 의약 조성물은 Env 단백질, 특히 Env 단백질의 GP120 단위의 결합 또는 확인을 위해 사용될 수 있다. 이하 본 발명은 후술하는 실시예 및 도면에 의해 상세히 설명한다.Preferred uses of the pharmaceutical compositions according to the invention are described in the claims. Particularly preferred non-therapeutic uses are, respectively, treatment of cells and / or cell cultures, particularly of animal or human origin, to combat infection of host cells by the HI virus, in particular to inhibit binding of the Env protein to the CD4 protein, in particular the CD4 protein. May be a study on inhibition of binding between GP120 units of Env protein for. Furthermore, the pharmaceutical composition according to the present invention can be used for binding or identification of Env protein, especially GP120 unit of Env protein. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples and drawings.

도 1은 IDA-HSA가 세포독성을 유발하지 않는다는 것을 보여준다.1 shows that IDA-HSA does not cause cytotoxicity.

도 2a 및 도 2b는 IDA-HSA가 GP120에 결합함을 보여준다.2A and 2B show that IDA-HSA binds to GP120.

도 3은 산화된 혈장 단백질 혼합물이 HIV-GP120에 결합함을 보여준다.3 shows that the oxidized plasma protein mixture binds to HIV-GP120.

도 4는 HIV 복제가 억제됨을 보여준다.4 shows that HIV replication is inhibited.

도 5a 내지 5l은 HIV에 의해 유도되는 합포체 형성이 억제됨을 보여준다.5A-5L show that HIV-induced complex formation is inhibited.

도 6a 내지 6g는 GP-160에 의해 유도되는 합포체 형성이 억제됨을 보여준다.6A-6G show that the formation of the conjugates induced by GP-160 is inhibited.

<실시예 1><Example 1>

oxP 제조를 위한 예시(본 발명자들의 출원 WO 02/32445 A2 참조)Example for preparing oxP (see our application WO 02/32445 A2)

정상적인 사람 혈청 알부민을 항바이러스 형태로 전환하기 위해 HSA는 HOCL에 의해 활성화 되었다. 방금 제조된 HOCL이 몰비율 1:100으로 HSA에 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 정치시킨 후 잔류 하이포클로리트는 겔여과(Sephadex G25)에 의해 제거하였다.HSA was activated by HOCL to convert normal human serum albumin into antiviral form. The just prepared HOCL was added to HSA in a molar ratio of 1: 100. After standing for 30 minutes at room temperature, residual hypochlorite was removed by gel filtration (Sephadex G25).

또 다른 응용으로 표준 방법(예를 들면 암모늄 설페이트 침전/탈염 또는 냉동침전)에 의해 단백질 혼합물을 사람 혈장으로부터 분리하였고 이를 직접 방금 제조된 HOCL과 사람 알부민에 대해 설명한 바와 같이 변형시켰다.In another application, the protein mixture was separated from human plasma by standard methods (eg ammonium sulfate precipitation / desalting or cryoprecipitation) and modified directly as described for the just-prepared HOCL and human albumin.

<실시예 2><Example 2>

oxP는 세포독성을 유발하지 않는다oxP does not cause cytotoxicity

HOCL에 의해 변형된 HSA는 먼저 ³H-티미딘-통합 에세이에서 시험하였다. 50㎍/㎖의 소모 농도까지 정상적인 HSA와 비교하였을 때 Hela 또는 GHOST 세포의 세포증식 측면에서 항 세포성 활성이 관측되지 않았다(도 1).HSA modified by HOCL was first tested in a ³ H-thymidine-integrated assay. No cellular activity was observed in terms of cell proliferation of Hela or GHOST cells when compared to normal HSA up to a consumption concentration of 50 μg / ml (FIG. 1).

<실시예 3><Example 3>

IIIB GP120에 대한 oxP의 결합(출처는 AIDS Reagent Project EVA)은 표준 ELISA 에세이에서 보여주었다(도 2a). 추가로 IIIP GP120 뿐만 아니라 SF2 GP120에 대한 oxP의 결합을 표면 플라스몬 공명 분광분석기(SPR)에서 보여주었다(도 2b). 두 시험 모두에서 GP120에 대한 oxP의 직접적인 상호작용을 보였다. oxP 형태로 단백질의 변환(transformation) 다음인 경우에만 특이적 결합이 관측되었다. 정상적인 단백질을 사용할 때, 이 경우에는 HSA, 정상적인 소 혈청 알부민, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 또는 FP120 V3 루프(loop)를 함유한 GST-V3 융합단백질일 때는 결합이 관측되지 않았다. 모든 대조군 시험에서 "반응 단위(response unit, RU)"는 5 미만이었다. SPR 결합조사에 더하여 oxP(여기서는 ox ATIII) GP120-IIIB 상호작용의 반응속도를 조사하였다. 분석 결과 ka 및 kd 값은 1.47 x 10^-9 및 7.01 x 10^-10 M이었으며, 결과적으로 KD는 7.0 x 10^-10 M(Rmax=120; Chi2=40)이었다.The binding of oxP to IIIB GP120 (source AIDS Reagent Project EVA) was shown in a standard ELISA assay (FIG. 2A). Further binding of oxP to SF2 GP120 as well as IIIP GP120 was shown in Surface Plasmon Resonance Spectroscopy (SPR) (FIG. 2B). Both tests showed a direct interaction of oxP with GP120. Specific binding was observed only after the transformation of the protein into oxP form. When using a normal protein, no binding was observed in this case with HSA, normal bovine serum albumin, glutathione-S-transferase (GST) or GST-V3 fusion protein containing FP120 V3 loops. The "response unit (RU)" was less than 5 in all control trials. In addition to the SPR binding assay, the reaction rate of the oxP (here ox ATIII) GP120-IIIB interaction was investigated. As a result, ka and kd values were 1.47 × 10 ⁻⁹ and 7.01 × 10 ⁻¹⁰ M, and as a result, KD was 7.0 × 10 ⁻¹⁰ M (Rmax = 120; Chi2 = 40).

<실시예 4><Example 4>

사람 혈장 유래의 분획화시키지 않은 단백질 혼합물은 HOCL에 의해 처리한 후 위에서 설명한바와 같이 HIV-GP120에 결합한다(도 3).Unfractionated protein mixtures derived from human plasma bind to HIV-GP120 as described above after treatment with HOCL (FIG. 3).

<실시예 5><Example 5>

OxP는 HIV를 중화한다.OxP neutralizes HIV.

HIV 중화 실험을 위해 HIV-1 균주 NL4-3과 NL4-3의 변이체인 NL-991이 사용되었으며, 이때 V3 루프는 일차 분리 물질 PI-991의 V3 루프에 의해 대체되었다. NL4-3은 단지향성(monotropic) 바이러스로서 CXCR4 보조 수용체만을 이용한다. NL-991 바이러스는 단지향성 바이러스로서 보조 수용체로 CCR5만을 소모한다. 도 4에 나타낸 바와 같이 두 바이러스의 복제는 모두 oxP에 의해 억제되었다. 이는 제조된 HIV p24-항원의 양에 반영되어 있다.A variant of HIV-1 strains NL4-3 and NL4-3, NL-991, was used for HIV neutralization experiments, where the V3 loop was replaced by the V3 loop of the primary separation substance PI-991. NL4-3 only uses CXCR4 co-receptor as a monotropic virus. NL-991 virus is only a directed virus that consumes only CCR5 as a co-receptor. As shown in FIG. 4, replication of both viruses was inhibited by oxP. This is reflected in the amount of HIV p24-antigen prepared.

<실시예 6><Example 6>

HIV 세포 배양물에서 HIV 감염된 세포는 감염되지 않은 CD4⁺ 표적세포와 융합한다. 이러한 세포간 융합은 합포체 생성이라고 알려져 있다. 이러한 합포체 생성은 감염된 세포의 멤브레인 상에 발현된 GP120에 대한 결합, 표적세포의 CD4 수용체에 대한 결합 및 후속되는 표적 멤브레인에서 GP41 N 말단의 삽입에 기인한다. 중화 에세이에서 사용된 양 바이러스(NL4-3 및 NL-991)는 GHOST-CXCR4 및 GHOST-CCR5 세포와 합포체를 생성할 수 있었다(도 5). NL4-3 바이러스(도 5a)에 의해 유도된 합포체 생성 뿐만 아니라 NL-991 바이러스에 의한 것(도 5g)도 20㎍/㎖의 농도까지 oxP(여기서는 ox-HSA)를 첨가함으로써 억제할 수 있었다(도 5e-4k). oxP는 용량 의존적 억제를 나타냈다(5b-e; 5h-k). 이미 도 1에 나타낸 바와 같이 oxP는 세포증식 또는 세포 형태학(도 5f; 5l)에 영향을 주지 않았으며 세포핵의 염색은 GHOST 세포의 생존을 입증하였다.HIV infected cells in HIV cell culture fuse with uninfected CD4 ⁺ target cells. This intercellular fusion is known as synapse production. This complex production is due to binding to GP120 expressed on the membrane of infected cells, binding to the CD4 receptor of target cells and subsequent insertion of the GP41 N terminus on the target membrane. Both viruses (NL4-3 and NL-991) used in the neutralizing assay were able to produce a complex with GHOST-CXCR4 and GHOST-CCR5 cells (FIG. 5). In addition to the formation of the conjugates induced by the NL4-3 virus (FIG. 5A), the NL-991 virus (FIG. 5G) was also inhibited by adding oxP (here ox-HSA) to a concentration of 20 μg / ml (FIGS. 5E-4K). oxP showed dose dependent inhibition (5b-e; 5h-k). As already shown in FIG. 1, oxP did not affect cell proliferation or cell morphology (FIG. 5F; 5L) and staining of cell nuclei demonstrated survival of GHOST cells.

<실시예 7><Example 7>

OxP는 HIV 감염을 "엔트리 레벨"에서 차단한다.OxP blocks HIV infection at the "entry level".

합포체 생성은 숙주세포의 멤브레인 표면상에 바이러스의 엔벨로프 및 바이러스의 도킹(docking) 단백질의 존재에 기초를 한다. 그리하여 추가로 바이러스의 수용체인 GP120/GP41을 발현하는 Hela-P4 세포(CD4+, CXCR4+, CCR5+)를 사용하였다. Hela-P4 세포는 또한 HIV-NL4-3 및 HIV-NL-911의 Env 단백질을 발현하도록 GP160 벡터에 의해 형질감염되었다. GP160에 의해 형질감염된 Hela-P4 세포는 융합하여 28시간 후 형질감염되지 않은 세포(6b; 6h)와는 달리 합포체를 생성하였다(도 6a; 6g).Combination production is based on the presence of the viral envelope and the virus's docking protein on the membrane surface of the host cell. Therefore, Hela-P4 cells (CD4 +, CXCR4 +, CCR5 +) expressing viral receptor GP120 / GP41 were used. Hela-P4 cells were also transfected with GP160 vectors to express Env proteins of HIV-NL4-3 and HIV-NL-911. Hela-P4 cells transfected with GP160 produced fusions unlike the non-transfected cells (6b; 6h) after 28 hours (FIGS. 6A; 6G).

oxP에 의한 정치는 변형되지 않은 단백질(여기서의 예는 HSA)에 의한 정치(6c, e, i, k)와는 달리 합포체 생성의 용량 의존적 억제(6d, f, 6j, l)에 이르렀다. 이러한 형질감염 에세이는 X4 및 R5 지향성(tropic) HI-바이러스(NL4-3, NL-911)의 침투를 모사한 것이다. 양 합포체 시험방법에서 oxP는 20 및 50㎍/㎖에서 "항 HIV 엔트리" 활성을 나타내었다. 이를 통해 oxP가 GP120-CD4 상호작용 레벨에 대해 50 ㎍/㎖에서 ID>95로 작용하는 것을 보여준다.Standing by oxP led to dose-dependent inhibition (6d, f, 6j, l) of the formation of the conjugates, unlike standing (6c, e, i, k) by unmodified proteins (HSA in this example). This transfection assay simulates the infiltration of X4 and R5 tropic HI-viruses (NL4-3, NL-911). In both conjugate test methods, oxP showed "anti-HIV entry" activity at 20 and 50 μg / ml. This shows that oxP acts as ID> 95 at 50 μg / ml for GP120-CD4 interaction level.

<실시예 8><Example 8>

혈장 단백질의 침전 및 이의 산화Precipitation of Plasma Proteins and Their Oxidation

10㎖의 시트레이트 혈액을 3200rpm/2000g에서 10분 동안 원심분리하였고 상등액의 혈장을 채취하였다. 부피비율이 1:1이 되도록 5M (NH₄)2SO₄를 첨가하였고, 상기 혈장은 20분 동안 교반함으로써 혈장 단백질을 침전시켰다. 상기 서스펜션 용액은 재차 10분 동안 3200rpm/2000g에서 원심분리하였고, 상등액은 버리고 침전된 단백질은 PBS 완충용액(pH 7.4)에 재서스펜션시켰다. 상기 용액은 투석튜브(배제한계 10,000Da)에 채워져 3일 동안 PBS 완충액으로 투석하였다. 이때 완충용액은 3회 교체하였다. 대안적으로 상기 단백질 혼합물은 겔여과 방법에 의해 탈염되었다.10 ml of citrate blood was centrifuged at 3200 rpm / 2000 g for 10 minutes and plasma of the supernatant was collected. 5M (NH ₄ ) 2 SO ₄ was added so that the volume ratio was 1: 1, and the plasma precipitated the plasma protein by stirring for 20 minutes. The suspension solution was again centrifuged at 3200 rpm / 2000 g for 10 minutes, the supernatant was discarded and the precipitated protein was resuspended in PBS buffer (pH 7.4). The solution was filled in a dialysis tube (exclusion limit 10,000 Da) and dialyzed with PBS buffer for 3 days. At this time, the buffer solution was replaced three times. Alternatively the protein mixture was desalted by gel filtration.

투석/겔여과 후 전체 단백질 함량은 표준방법에 따라 포토메트릭하게 결정되었다.The total protein content after dialysis / gel filtration was determined photometrically according to standard methods.

본 발명에 따른 의약 조성물의 산화:Oxidation of Pharmaceutical Compositions According to the Invention:

단백질 용액 500㎍에 신선한 HOCL(12㎕)이 첨가되었고 PBS/0.1mM EDTA 완충용액에 의해 부피가 1㎖가 되도록 채웠다. 얼음(0℃)에서 반응시간 15분 후 상기 용액은 PBS 완충용액으로 평형화된 겔여과 컬럼에 첨가되고 이리하여 전환되지 않은 HOCL이 제거되었다.Fresh HOCL (12 μL) was added to 500 μg of protein solution and filled to volume 1 ml with PBS / 0.1 mM EDTA buffer. After 15 minutes of reaction time on ice (0 ° C.) the solution was added to a gel filtration column equilibrated with PBS buffer to remove the unconverted HOCL.

도 1: IDA-HSA는 세포독성을 유발하지 않는다.1: IDA-HSA does not cause cytotoxicity.

사람의 CD4, CXCR4 및 CCR5를 발현하는 Hela 세포는 [³H]-티미딘의 존재 및 IDA-HSA(□) 또는 HSA(▲)의 상이한 농도에서 배양하였다. 상기 세포들은 3회에 걸쳐 "구" 당 10⁴개 세포로 96 "구" 플레이트에 접종되었다. 2일째 각 "구"에 [³H]-티미딘 (10μCi/㎖)을 첨가하였다. 8시간 후 DNA를 회수하였고, 유리섬유 멤브레인에 결합시켰고 내재된 [³H]-티미딘을 β-카운터에 의해 정량화하였다.Hela cells expressing human CD4, CXCR4 and CCR5 were cultured at different concentrations of [ ³ H] -thymidine and at IDA-HSA (□) or HSA (▲). The cells were seeded in 96 "sphere" plates three times at 10 ⁴ cells per "sphere". On day 2 [ ³ H] -thymidine (10 μCi / ml) was added. After 8 hours DNA was recovered, bound to the fiberglass membrane and the inherent [ ³ H] -thymidine was quantified by β-counter.

도 2: IDA-HSA가 HIV-1 GP120에 결합한다.Figure 2: IDA-HSA binds to HIV-1 GP120.

GP120에 대한 IDA-HSA의 특이적 결합은 표준 ELISA 방법(도 2a)과 표면 플라스몬 공명 측정기(SPR)(도 2b)에 의해 보여주었다. ELISA의 경우 96 구 플레이트는 100㎕/구의 재조합 GP120(1㎍/㎖)에 의해 코팅되었고 그 다음 (PBS 내) 0.25% 젤라틴에 의해 차단되었다(1시간동안 실온에서). IDA-HSA(○)과 HSA(●)는 상이한 농도에서 도입되었다(PBS 내 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20㎍/㎖). 결합된 단백질은 HRP-콘쥬게이티드, 폴리클로날, 특이적 항 HSA 항체(Sigma)에 의해 감지되었다. SPR의 경우 GP120(10㎍/㎖)은 EDC/NHC에 의해 덱스트란 코팅된 CH 활성화된 센서칩(CM5, Biacore, 스웨덴)에 결합되었다. 유속은 10분 동안 5㎕/분이었다. 에탄올아민에 의한 차단 후 IDA-HSA 및 HSA의 결합(각 1㎍/㎖)이 5㎕/분의 유속에서 6분 동안 조사하였다.Specific binding of IDA-HSA to GP120 was shown by standard ELISA methods (FIG. 2A) and surface plasmon resonance analyzer (SPR) (FIG. 2B). For ELISA 96 sphere plates were coated with 100 μl / sphere of recombinant GP120 (1 μg / ml) and then blocked by 0.25% gelatin (in PBS) (at room temperature for 1 hour). IDA-HSA (o) and HSA (o) were introduced at different concentrations (0, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 μg / ml in PBS). Bound proteins were detected by HRP-conjugated, polyclonal, specific anti-HSA antibodies (Sigma). For SPR, GP120 (10 μg / ml) was bound to a dextran coated CH activated sensor chip (CM5, Biacore, Sweden) by EDC / NHC. The flow rate was 5 μl / min for 10 minutes. After blocking by ethanolamine, binding of IDA-HSA and HSA (1 μg / ml each) was investigated for 6 minutes at a flow rate of 5 μl / min.

도 3: 산화된 혈장 단백질 혼합물은 HIV-GP120에 결합한다.Figure 3: The oxidized plasma protein mixture binds to HIV-GP120.

산화된 플라즈마 단백질 혼합물의 GP120에 대한 특이적인 결합이 표면 플라즈몬 공명 측정기(SPR)에 의해 입증되었다. GP120(10㎍/㎖)이 센서칩(C1, Biacore, 스웨덴) 상에 공유결합되었다.Specific binding of the oxidized plasma protein mixture to GP120 was demonstrated by surface plasmon resonance analyzer (SPR). GP120 (10 μg / ml) was covalently bound onto the sensor chip (C1, Biacore, Sweden).

20㎕ 100mM 글리신, 0.3% 트리톤 X-100 pH12의 주입(두 차례)Injection of 20 μl 100 mM glycine, 0.3% Triton X-100 pH12 (twice) 센서 표면의 정제Purification of the sensor surface 5㎕/분5 μl / min 유속Flow rate 20㎕ 400mM EDTA의 주입Injection of 20 μl 400 mM EDTA 센서 표면으로부터 칼슘 이온의 제거Removal of calcium ions from sensor surface 50㎕ NHS/EDC의 주입Injection of 50 μl NHS / EDC 센서 표면의 활성화Activation of the sensor surface 10mM NaAc 중 20㎕ 100nM P120의 주입(희석 1:10)Injection of 20 μl 100 nM P120 in 10 mM NaAc (dilution 1:10) P120의 공유결합 커플링Covalent Coupling of P120 55㎕ 에탄올아민의 주입Injection of 55 μl ethanolamine 잔류 활성 에스테르의 차단Blocking of residual active esters

93.5nM의 PluO 용액이 고정화된 P120을 통해서 주입되었다. (상기된 바와 같이) 명백한 결합 곡선이 얻어졌다. 추후 실험에서 시그날 높이는 고정화된 P120의 양과 상관관계가 있는 것으로 보여졌다.93.5 nM PluO solution was injected through immobilized P120. Obvious binding curves were obtained (as described above). Subsequent experiments showed that signal height correlated with the amount of immobilized P120.

도 4: HIV 복제의 억제4: Inhibition of HIV replication

GHOST-CXCR4 또는 GHOST-CCR5 세포를 X4-지향성 NL4-3(삼각형) 또는 R5-지향성 NL-991 바이러스(사각형)로 감염시켰다(500TCID₅₀). 5일째에 세포 배양물의 상층액을 p24항원에 대하여 p24 표준 ELISA를 이용해서 테스트하였다. 3회 측정의 평균을 나타내었다. 상기 평균에 대한 표준 오차는 <10% 이다, NL4-3 + IDA-HSA (▲); NL4-3 + HSA (△); NL-991 + IDA-HSA (■); NL-991 + HSA (□).GHOST-CXCR4 or GHOST-CCR5 cells were infected with X4-directed NL4-3 (triangle) or R5-directed NL-991 virus (square) (500TCID ₅₀ ). On day 5 supernatants of cell cultures were tested for p24 antigen using p24 standard ELISA. The average of three measurements is shown. The standard error for the mean is <10%, NL4-3 + IDA-HSA (▲); NL4-3 + HSA (Δ); NL-991 + IDA-HSA (■); NL-991 + HSA (□).

도 5: HIV에 의해 유도되는 합포체 형성의 억제Figure 5: Inhibition of the formation of conjugates induced by HIV

GHOST-CXCR4 또는 GHOST-CCR5 세포를 HIV 실험실 분리물질(A-E) NL4-3(X4-단지향성) 또는 (F-L) NL-991(R5-단지향성)의 500TCID₅₀으로 감염시켰다. 감염은 배양 배지에 IDA-HSA 단백질을 최종 농도 0, 5, 10 또는 20㎍/㎖로 첨가함으로써 억제되었다. 감염 개시 후 5일 째에 유도된 합포체 및 세포 로운(lawn)의 파괴가 관찰됨에 따라 감염은 식별가능하게 되었다. 이를 위하여 세포/핵은 표준 에오신/메틸렌 블루/애주어(azure) 염색 과정에 의해 염색되었다(Hemacolor, Merck). (a) NL4-3 감염세포; (b) NL4-3 + 2㎍/㎖ IDA-HSA; (c) NL4-3 + 5㎍/㎖ IDA-HSA; (d) NL4-3 + 10㎍/㎖ IDA-HSA; (e) NL4-3 + 20㎍/㎖ IDA-HSA; (g) NL-991 감염세포; (h) NL-991 + 2㎍/㎖ IDA-HSA; (i) NL-911 + 5㎍/㎖ IDA-HSA; (j) NL-911 + 10㎍/㎖ IDA-HSA; (k) NL-911 + 20㎍/㎖ IDA-HSA; (l) 20㎍/㎖ IDA-HSA.GHOST-CXCR4 or GHOST-CCR5 cells were infected with 500TCID ₅₀ of HIV laboratory isolate (AE) NL4-3 (X4-unidirectional) or (FL) NL-991 (R5-unidirectional). Infection was inhibited by adding IDA-HSA protein to the culture medium at final concentrations of 0, 5, 10 or 20 μg / ml. The infection became identifiable as the destruction of induced complexes and cell Law was observed 5 days after the start of infection. To this end, cells / nuclei were stained by a standard eosin / methylene blue / azure staining procedure (Hemacolor, Merck). (a) NL4-3 infected cells; (b) NL4-3 + 2 μg / ml IDA-HSA; (c) NL4-3 + 5 μg / ml IDA-HSA; (d) NL4-3 + 10 μg / ml IDA-HSA; (e) NL4-3 + 20 μg / ml IDA-HSA; (g) NL-991 infected cells; (h) NL-991 + 2 μg / ml IDA-HSA; (i) NL-911 + 5 μg / ml IDA-HSA; (j) NL-911 + 10 μg / ml IDA-HSA; (k) NL-911 + 20 μg / ml IDA-HSA; (l) 20 μg / ml IDA-HSA.

도 6: GP-160에 의해 유도된 합포체 형성의 억제Figure 6: Inhibition of copolymer formation induced by GP-160

사람의 CD4, CXCR4 및 CCR을 발현하는 Hela 세포를 pSVATGrev 플라스미드로 형질전환시켜서 NL4-3 또는 NL-911 env를 발현하게 하였다. 이를 위하여 IDA-HSA 또는 HSA 단백질이 (최종 농도 20 및 50㎍/㎖로) 첨가되었다. 합포체 형성은 살아있는 세포에 대하여 표준 위상차 현미경에 의해 28시간 후에 관찰되었다. IDA-HSA는 용량 의존적인 방식으로 합포체 형성을 억제하였다.Hela cells expressing human CD4, CXCR4 and CCR were transformed with pSVATGrev plasmid to express NL4-3 or NL-911 env. For this purpose IDA-HSA or HSA protein was added (at a final concentration of 20 and 50 μg / ml). Coform formation was observed after 28 hours by standard phase contrast microscopy on live cells. IDA-HSA inhibited coform formation in a dose dependent manner.

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16. WO-A-02/3244516. WO-A-02 / 32445

Claims (9)

a) 사람 및/또는 동물의 혈액으로부터 얻을 수 있는 단백질 및/또는 펩타이드를 포함하는 혼합물의 제조 단계 및a) preparing a mixture comprising proteins and / or peptides obtainable from the blood of humans and / or animals and b) 상기 혼합물에 포함된 단백질 및/또는 펩타이드의 산화 단계를 특징으로 하는 HIV 바이러스에 의한 숙주 세포 감염에 대처하고/거나 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하는 의약 조성물의 제조방법.b) a method for the preparation of a pharmaceutical composition for combating host cell infection by an HIV virus and / or inhibiting binding of an Env protein to a CD4 protein, characterized by an oxidation step of the proteins and / or peptides contained in the mixture. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 혼합물은 혈장 단백질 및/또는 혈장 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.Wherein said mixture comprises plasma proteins and / or plasma peptides. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 혼합물에 포함되고 단계 b)에서 산화되는 단백질 중 하나는 혈청 알부민, 특히 사람의 혈청 알부민 또는 소의 혈청 알부민, 안티트롬빈, "면역 방어 활성화된" 안티트롬빈(IDA-ATIII), 피브리노겐, 응고 인자 또는 면역글로불린인 것을 특징으로 하는 제조방법.One of the proteins included in the mixture and oxidized in step b) is serum albumin, in particular human serum albumin or bovine serum albumin, antithrombin, "immune defense activated" antithrombin (IDA-ATIII), fibrinogen, coagulation factor or immunity. Method of producing a globulin. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 단계 b)에서 산화되는 혼합물의 산화된 단백질 및/또는 산화된 펩타이드를 대체할 수 있는 펩타이드 모방체와 약제 학적으로 허용되는 담체를 혼합하는 것을 특징으로 하여 HIV 바이러스에 의한 숙주 세포 감염에 대처하고/거나 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하는 의약 조성물의 제조방법.A peptide mimetic capable of replacing an oxidized protein and / or an oxidized peptide of a mixture which is oxidized in step b) according to any one of claims 1 to 3, characterized in that a pharmaceutically acceptable carrier is mixed. To cope with host cell infection by the HIV virus and / or to inhibit the binding of the Env protein to the CD4 protein. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하고 이에 의해 수득된 혼합물을 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 단계 b)에서 산화되는 혼합물의 산화된 단백질 및/또는 산화된 펩타이드를 대체할 수 있는 펩타이드 모방체와 혼합하는 것을 특징으로 하여 HIV 바이러스 의한 숙주 세포 감염에 대처하고/거나 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하는 의약 조성물의 제조방법.The oxidized protein and / or of the mixture which is subjected to the process according to any one of claims 1 to 3 and the mixture obtained thereby is oxidized in step b) according to any one of claims 1 to 3. A method of preparing a pharmaceutical composition for coping with host cell infection by HIV virus and / or inhibiting binding of Env protein to CD4 protein, characterized in that it is mixed with a peptide mimetic that can replace the oxidized peptide. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따라 제조될 수 있는 HIV 바이러스 의한 숙주 세포 감염에 대처하고/거나 CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합을 억제하는 의약 조성물.A pharmaceutical composition that copes with host cell infection by an HIV virus and / or inhibits the binding of an Env protein to a CD4 protein, which may be prepared according to any one of claims 1 to 5. HI 바이러스에 의한 숙주 세포의 감염의 비치료적 대처를 위한 제 6항에 따른 의약 조성물의 용도.Use of the pharmaceutical composition according to claim 6 for non-therapeutic treatment of infection of a host cell by HI virus. CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 결합의 비치료적 억제를 위한 제 6항에 따른 의약 조성물의 용도.Use of the pharmaceutical composition according to claim 6 for non-therapeutic inhibition of binding of Env protein to CD4 protein. CD4 단백질에 대한 Env 단백질의 GP120 유니트 간의 결합의 비치료적인 억제를 위한 제 6항에 따른 의약 조성물의 용도. Use of the pharmaceutical composition according to claim 6 for non-therapeutic inhibition of binding between GP120 units of Env protein to CD4 protein.

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