KR20060002087A - Combination of ginseng total saponin and coicis semen for treatment and prevention of obesity - Google Patents
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Abstract
발명은 정제된 홍삼 총 사포닌(ginseng total saponin, GTS), 의이인(Coicis Semen, CS) 혹은 이들 약물의 복합처치 및 의이인의 주된 성분인 코이솔(coixol)의 비만억제 및 치료를 위한 약제학적 성분에 대한 것이다. 본 발명은 비만 억제효과를 규명하기 위하여 고지방 식이로 유도된 비만 쥐에서 약제를 투여하여 에너지 균형 및 섭식행동에 대한 효과를 비교해 보고자 체중변화, 식이 섭취량변화, 식이 효율, 체지방분해, 보행성 활동량(locomotor activity)등을 측정하여 본 발명의 영향을 평가하고, 나아가 약물 처치에 대한 뇌의 변화를 면역조직화학기법(immunohistochemistry)을 이용하여 시상하부에서의 대표적인 섭식을 자극물질인 NPY(neuropeptide Y)와 섭식을 감소시키는 물질인 CCK(cholecystokinin)의 활성을 살펴보았다.
연구 결과, 고지방 식이에서 유도된 비만 쥐에서 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합처치는 체중증가 억제, 체지방감소 및 에너지 소비에 대한 효과가 있으며, 대조군에 비하여 시상하부에서의 NPY 발현의 감소 및 CCK 발현의 증가를 보이는 섭식행동에 대한 억제효과의 신경화학적 변동을 나타냈기에 본 발명의 홍삼의 주요성분 인 총 사포닌과 의이인의 복합처치가 비만억제 및 치료제로 사용될 수 있다.
홍삼 총 사포닌, 의이인, 코이솔, NPY, CCK, 시상하부, 보행성 활동량, 섭식행동
The invention relates to a pharmaceutical ingredient for inhibiting and treating obesity of purified ginseng total saponin (GTS), Coicis Semen (CS), or a combination of these drugs and coixol, a major component of the drug. It is about. The present invention is to compare the effects on the energy balance and eating behavior by administering drugs in high fat diet-induced obesity rats in order to determine the effect of obesity, weight change, dietary intake changes, dietary efficiency, body fat decomposition, walking activity amount ( locomotor activity, etc. to evaluate the effects of the present invention, and furthermore, changes in the brain on drug treatment were performed by immunohistochemistry and the representative feeding of the hypothalamus to NPY (neuropeptide Y) We investigated the activity of CCK (cholecystokinin), a substance that reduces feeding.
The results showed that the combined treatment of red ginseng total saponin and Euiin in high-fat diet-induced obese rats had an effect on weight gain inhibition, body fat reduction, and energy consumption, and decreased NPY expression and CCK expression in the hypothalamus compared to the control group. Since the neurochemical variation of the inhibitory effect on the feeding behavior is increased, the combination treatment of total saponin, which is the main component of the red ginseng, and Euiin are used as an anti-obesity and therapeutic agent.
Red ginseng total saponin, Euiin, Kosol, NPY, CCK, Hypothalamus, Ambulatory activity, Feeding behavior
Description
도1은 고지방 식이로 유도된 비만군의 약물 처치에 따른 체중의 변화를 나타내는 그래프.1 is a graph showing the change in body weight according to drug treatment of obese group induced by high fat diet.
도2는 고지방 식이로 유도된 비만군의 약물 처치에 따른 식이섭취의 변화를 나타내는 그래프.Figure 2 is a graph showing the change in dietary intake according to drug treatment of obese group induced by high fat diet.
도3는 고지방 식이로 유도된 비만군의 약물 처치에 따른 보행성 활동량의 비교를 나타내는 그래프.3 is a graph showing a comparison of gait activity according to the drug treatment of obese group induced by high fat diet.
도4는 고지방 식이로 유도된 비만군의 약물 처치에 따른 부위별 지방량의 변화를 나타내는 그래프.Figure 4 is a graph showing the change in fat mass according to the drug treatment of obesity group induced by high fat diet.
도5은 고지방 식이로 유도된 비만군의 약물 처치에 따른 각 처치군의 시상하부에서의 NPY의 발현정도를 나타내는 그래프.Figure 5 is a graph showing the expression level of NPY in the hypothalamus of each treatment group according to the drug treatment of obese group induced by high fat diet.
도6는 고지방 식이로 유도된 비만군 약물 처치에 따른 각 처치군의 시상하부에서의 CCK의 발현정도를 나타내는 그래프.Figure 6 is a graph showing the expression level of CCK in the hypothalamus of each treatment group following the obesity group drug treatment induced by a high fat diet.
인삼 약리효능은 주로 인삼 사포닌에 관한 것으로 중추신경계에 대한 작용, 뇌기능에 대한 작용, 항발암과 항암작용, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 강화 작용, 심혈관 장애 개선 작용, 혈압 조절작용, 갱년기 장애 개선작용, 항스트레스와 항피로작용, 항산화작용 등이 보고되었다. 또한 흰쥐의 혈청 콜레스테롤 및 중성지방 수준을 감소와 인삼의 분획물들의 간장내 지방축적 감소효과가 보고되었다. 그러나 인삼은 부위별, 년근별 및 원료삼류에 따라 사포닌의 함량이나 조성이상이한 것으로 밝혀졌고, 또한 홍삼 추출용매의 에탄올 농도에 따라서도 엑스 수율과 사포닌 함량도 상이한 것으로 일부 보고된 바 있다. 홍삼은 인삼을 증숙 또는 팽숙하거나 기타의 방법으로 인삼의 녹말을 호화한 것을 말하며, 홍삼의 중요 성분으로는 백삼과 같이 배당체(glycosides) · 인삼향성분(panacen) · 폴리아세틸렌계 화합물 · 함질소성분 · 플라보노이드 · 비타민(B군) · 미량원소 · 효소 · 항산화물질과 유기산 및 아미노산 등이 함유되어 있다. 홍삼은 중추신경에 대해서 진정작용과 흥분작용이 있으며, 순환계에 작용하여 고혈압이나 동맥경화의 예방효과가 있다. 그러면서도 조혈작용(造血作用)과 혈당치(血糖値)를 저하시켜 주고, 간을 보호하며, 내분비계에 작용하여 성행동(性行動)이나 생식효과에 간접적으로 유효하게 작용하며, 항염(抗炎) 및 항종양작용(抗腫瘍作用)이 있고, 방사선에 대한 방어효과, 피부를 보호하며 부드럽게 하는 작용도 있다. 홍삼의 효과 중 중요한 것은 어댑토겐(adaptogen:適應素) 효과로서 주위 환경으로부터 오는 각종 유해작용인 누병(淚病), 각종 스트레스 등에 대해 방어능력을 증가시켜 생체가 보다 쉽게 적응하도록 하는 능력이 있음이 과학적으로 입증되고 있다. Ginseng pharmacological effect is mainly related to ginseng saponin, action on the central nervous system, action on brain function, anti-cancer and anticancer action, immune function control, antidiabetic action, liver function enhancement, cardiovascular disorder improvement, blood pressure control action , Menopausal disorders improvement, antistress and anti-fatigue, antioxidant activity. In addition, serum cholesterol and triglyceride levels in rats and ginseng fractions were reported to reduce liver fat accumulation. However, ginseng was found to be different in saponin content or composition according to parts, annual roots, and raw ginseng. Also, it was reported that X yield and saponin content were different depending on ethanol concentration of red ginseng extract solvent. Red ginseng refers to steaming or swelling ginseng or gelatinizing starch of ginseng by other means.The main components of red ginseng are glycosides, panacen, polyacetylene-based compounds and nitrogen-containing compounds like white ginseng. Contains flavonoids, vitamins (group B), trace elements, enzymes, antioxidants, organic acids and amino acids. Red ginseng has a sedative and arousing effect on the central nervous system, and it acts on the circulatory system to prevent hypertension or atherosclerosis. At the same time, hematopoietic effect (당 作用) and blood sugar levels (血糖 値) lowers, protects the liver, acts on the endocrine system indirectly effective on sexual behavior and reproductive effects, anti-inflammatory And anti-tumor effect (抗 腫 瘍 作用), the protective effect against radiation, protects and softens the skin. The most important of the effects of red ginseng is the adaptogen effect, which increases the ability of the organism to adapt more easily by increasing the defense ability against leakage, stress, and other harmful effects from the environment. Scientifically proven.
한편 벼과에 속하는 의이인은 항종양작용, 이상각질증식에 의한 사마귀 제거작용, 혈당강하작용, 배난유발작용, 항보체활성, 이뇨, 진통, 진정 및 해열작용, 항스트레스작용, 혈관확장작용, 호흡마비 항길작용, 지사작용, 해독작용 등 생리활성 및 효능이 있으며, 생리활성 성분으로는 코이솔(coixol), 코이제노라이드(coizenolide), 스테롤류, 파이틴(phytin), 비타민 B1, 아미노산류 등이 있으며 알려진 독성이나 부작용은 없다.On the other hand, yiyiin belonging to the rice family, anti-tumor action, wart removal action by dyskerosis, hypoglycemic action, ovulation-induced action, anti-complementary activity, diuresis, analgesic, sedation and antipyretic action, antistress action, vasodilation, respiratory paralysis It has physiological activity and efficacy such as anti-gill action, anti-diabetic action, detoxification action, and the physiologically active ingredients include coixol, coizenolide, sterols, phytin, vitamin B1 and amino acids. It has no known toxicity or side effects.
홍삼 사포닌을 포함한 복합한약제를 이용하여 지방축적 억제효과 및 체중감소효과가 보고된 바는 있으나(공개특허 공보 제2001-0066713 및 제10-2002-0011477호) 기존 보고는 홍삼과 다른 한약제제를 복합으로 사용하였으며 기존 인삼액기스와 추출물만으로는 비만치료효과를 증명하거나 선별적인 효과를 증명하는데 한계가 있었다. 본 발명은 비만의 효과적인 약물치료의 일환으로 홍삼의 총사포닌과 의이인의 혼합물이 선별적인 비만 억제 및 비만 치료효능을 섭식 행동의 변동과 중추신경계에 영향을 바탕으로 강력한 섭식억제 작용을 밝히고자 하였다.Although there have been reports of fat accumulation inhibitory effect and weight loss effect using a combination herbal medicine containing red ginseng saponin (Public Patent Publication Nos. 2001-0066713 and 10-2002-0011477) Existing ginseng extracts and extracts alone had limitations in proving the effects of obesity treatment or proving selective effects. The present invention aims to reveal the potent inhibitory effect of red ginseng as a mixture of total saponin and uiyiin on the basis of selective obesity inhibition and treatment of obesity based on changes in eating behavior and effects on the central nervous system.
지난 수십년동안 비만증을 이해하기 위한 신경기전을 밝히는 연구가 진행되어 섭식과 열대사에 대한 구체적인 모델이 제시되어 왔으나 개별적인 신경인자와 신경전달물질에 대한 부분적인 이해와 뇌의 구조적인 설명은 명백하지 않다. 그러나 섭식기능을 담당하는 신경전달물질의 작용에 대한 이해는 비만 치료의 가능성을 제시해 주고 있다. 비만치료 후보 물질로서 카테콜라민과 세로토닌계의 식욕억제제, Ephedrine, β3효능제 같은 열대사 촉진제, lipase inhibitor(Orlistat), 지방대용물 등을 이용한 지방소화 억제제, NPY, 렙틴(leptin)과 같은 호르몬 조절을 하는 약물등이 있다. 이들 약물들은 단순한 섭식억제 효과뿐만 아니라 인슐린에 대한 저항을 억제하고, 야간 산소 산소공급에 관여하고, 지방세포의 산화를 촉진시키는 역할을 하게 된다.Over the last few decades, research has been carried out to understand neural mechanisms for understanding obesity, but specific models of feeding and tropical history have been proposed, but partial understanding of individual neurofactors and neurotransmitters and structural explanations of the brain are unclear. not. However, the understanding of the action of neurotransmitters responsible for eating functions suggests the possibility of treating obesity. Candidates for the treatment of obesity include catecholamines and serotonin-based appetite suppressants, tropical death promoters such as Ephedrine and β 3 agonists, lipase inhibitors (Orlistat), and hormone control such as NPY and leptin There are drugs that do. These drugs not only provide a simple eating inhibitory effect, but also inhibit insulin resistance, participate in nocturnal oxygen supply, and promote fat cell oxidation.
최근 비만의 발생기전에 대하여 많은 연구가 진행되어 NPY, CCK과 같은 조절 펩타이드의 통합적인 기능이 음식섭취를 조절하고, 음식섭취 강화가 뇌에서는 세로토닌과 도파민계를 통하여 소화기관 그리고 혈액으로부터 혹은 감각신경으로부터 섭식이 조절되며, 섭식 선택과 체중유지에 대한 신경계조절은 태아때부터 경험과 학습으로부터 많은 영향을 받는다. 즉 비만과 관련된 신경학적 인자들은 모태에서부터 시작되고 각종 신경펩타이드의 상호작용에 의하여 조절된다. 비만에 대한 신경과학의 기술적인 진보로 인하여 최근 NPY, CCK 등 시상하부에 작용하는 여러 가지 호르몬 또는 신경전달물질이 식욕의 조절에 관여하는 것이 밝혀지면서 비만에서 뇌의 역할은 더욱 중요한 것으로 밝혀지고 있다. 즉 NPY와 CCK는 비만의 신경화학적 지표로 널리 이용되고 있다.Recently, a lot of research has been conducted on the mechanism of obesity, and the integrated function of regulatory peptides such as NPY and CCK regulates food intake. Eating is regulated, and nervous system control of eating choice and weight maintenance is greatly influenced by experience and learning from the fetus. In other words, neurological factors related to obesity start from the mother's and are regulated by the interaction of various neuropeptides. Due to technological advances in neuroscience for obesity, the role of the brain in obesity has been found to be more important as recent hormones and neurotransmitters that act on the hypothalamus, such as NPY and CCK, are involved in the regulation of appetite. . NPY and CCK are widely used as neurochemical markers of obesity.
본 발명은 정제된 홍삼 총 사포닌(ginseng total saponin, GTS)과 의이인(Coicis Semen, CS) 혹은 이들 약물의 복합처치 및 의이인의 주된 성분인 코이솔(coixol)에 대한 비만 억제효과를 규명하기 위한 연구로서, 정상 식이군과 고지방 식이로 유도된 비만 쥐에 약물을 투여하여 에너지 균형 및 섭식행동에 대한 효과를 비교해 보고자 체중변화, 식이 섭취량, 식이 효율, 보행성 활동량(locomotor activity) 측정하였으며, 나아가 각 그룹에 약물 처치에 대한 뇌의 변화를 면역조직화학기법(immunohistochemistry)을 이용하여 시상하부에서의 대표적인 섭식을 자극물질인 NPY와 섭식을 억제하는 물질인 CCK의 활성을 살펴보고자 하였다.
The present invention is to investigate the effect of inhibiting the obesity of purified ginseng total saponin (GTS) and Coicis Semen (CS) or co-treatment of these drugs and the main component of colic (Coixol) To compare the effects on energy balance and eating behavior by administering drugs to normal diet and obese rats induced by high fat diet, we measured weight change, dietary intake, dietary efficiency, and locomotor activity. The purpose of this study was to examine the activity of NPY, a substance that inhibits feeding, and CCK, a substance that inhibits the feeding of the hypothalamus using immunohistochemistry.
본 발명은 고지방으로 유도된 비만동물모델에서 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합투여가 현저한 체중감량, 체지방감소, 보행성 활동량의 증가와 NPY의 발현 감소 및 CCK 발현 증가를 나타내어, 비만억제 및 비만치료약제를 제공함을 목적으로 한다.
The present invention shows that the combined administration of red ginseng total saponin and the right person in the high fat-induced obesity animal model shows remarkable weight loss, body fat reduction, increased gait activity, decreased NPY expression, and increased CCK expression. It is intended to provide.
실험에 사용한 식이와 구성성분을 나타낸 표.Table showing the diet and ingredients used in the experiment.
1) Normal diet : AIN-76A diet #100000 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA) 1) Normal diet: AIN-76A diet # 100000 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)
2) High fat diet : AIN-76 diet #100496 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)
2) High fat diet: AIN-76 diet # 100496 (Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA)
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 고지방 식이로 유도된 비만동물모델에서 홍삼에서 추출한 물질인 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만 치료를 위한 약제학적 성분을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical ingredient for treating obesity using total saponin, which is a substance extracted from red ginseng, and a lysine in a obese animal model induced by a high fat diet.
또한, 본 발명은 에너지 균형과 NPY의 발현을 감소 및 CCK의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 홍삼 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만 치료를 위한 약제학적 성분을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutical ingredient for treating obesity using red ginseng total saponin and uiyiin, characterized by reducing energy balance and reducing the expression of NPY and increasing the expression of CCK.
또한, 본 발명에 사용된 홍삼 시료는 한국담배인삼공사에서 6년근 원료수삼을 증감가온시켜 제조한 홍삼을 42-80mesh로 균일하게 분쇄한 의료용 분말(수분함량 7.22%)을 구입하여 시료로 사용하였다.In addition, the red ginseng sample used in the present invention was used as a sample to purchase medical powder (water content 7.22%) of uniformly pulverized red ginseng prepared by increasing and decreasing the raw ginseng six years old at Korea Tobacco Ginseng Corporation to 42-80mesh. .
본 발명은 홍삼을 상온에서 70% 에탄올로 추출하고 농축하여 이 농축액에 동량의 물을 가한 후 pH를 중성으로 조절한 다음 벤젠으로 3회 추출하였다. 그 수층을 Ando 등의 수포화 n-부탄올 추출방법으로 조사포닌을 얻었으며, 이 조사포닌 클로로포름을 가하여 가용성부분을 제거한 후, 활성탄으로 탈색시켜 조제된 정제 총 사포닌을 이용한 비만 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다. In the present invention, red ginseng was extracted with 70% ethanol at room temperature, concentrated, and the same amount of water was added to the concentrate, and then the pH was adjusted to neutral and extracted three times with benzene. The aqueous layer was irradiated with the saturated n-butanol extraction method of Ando et al., Which was obtained by removing the soluble portion by adding the irradiated n-butanol, and then dissolving it with activated charcoal to prepare a pharmaceutical composition for treating obesity using the purified total saponin. To provide.
또한 의이인은 85% 메탄올 추출물을 감압증류기로 농축한 것을 동결건조 후 분말화 조성물을 제공한다. 이하, 본 발명의 일실시예에 따른 홍삼 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만 치료를 위한 약제학적 조성물을 상세하게 설명한다. 본 실시예는 고지방 식이를 지속적으로 먹여 유발된 비만모델에 대한 실험을 중심으로 하였다. In addition, Euiin provides a powdered composition after lyophilization of the concentrated 85% methanol extract in a vacuum distillation. Hereinafter, a pharmaceutical composition for treating obesity using red ginseng total saponin and uiyiin according to an embodiment of the present invention will be described in detail. This example was based on experiments on the obesity model caused by the continuous feeding of high fat diet.
본 발명의 일실시예에 따른 홍삼 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만 치료를 위한 약제물은 고지방 식이군의 비만모델에서 시상하부의 표적부위인 궁상핵(arcuate nucleus), 외측핵(lateral hypothalamic nucleus), 복내측핵(ventromedial hypothalamic nucleus) 및 방실핵(paraventricular nucleus)에서 섭식을 자극하는 물질인 NPY와 섭식을 감소시키는 물질인 CCK의 변화로 인한 섭식행동 감소 및 에너지 균형을 위한 보행성 활동량 증가시키는 물질이 유효성분이다.Drugs for the treatment of obesity using red ginseng total saponin and right ear in accordance with one embodiment of the present invention are the target site of the hypothalamus in the high fat diet group, the nucleus (arcuate nucleus), lateral hypothalamic nucleus, In the ventromedial hypothalamic nucleus and the paraventricular nucleus, NPY, a substance that stimulates feeding, and CCK, a substance that reduces feeding, increase the gait activity for the reduction of eating behavior and energy balance. It is an active ingredient.
본 발명에 따른 홍삼 총 사포닌과 의이인의 효과를 알아보기 위해 흰쥐를 이용하여 다음과 같은 동물실험을 하였다.
In order to determine the effect of red ginseng total saponin and Uiin according to the present invention, the following animal experiments were conducted using rats.
1. 실험동물의 구입과 사육1. Purchase and breeding of experimental animals
본 실험에 사용한 흰쥐는 스프라그-돌리계로 생후 3주령(체중 80± 10g)의 수컷(샘타코, 한국)을 구입하여 동물실험실 내 고형사료(삼양사료, 한국)과 물은 무제한 공급하면서 사육실에서 7일간의 적응기간을 갖도록 하였다. 적응기간 후 고지방 식이를 제공하여 비만을 유도하고 각각 생리식염수(contorl), 홍삼 총 사포닌(GTS), 의이인(CS), 홍삼 총 사포닌-의이인(GTS-CS) 및 코이솔(coixol) 투여군으로 총 5군으로 나누어 각각 준비된 사료 및 물을 자유로이 섭취하도록 하여 5주간 사육하면서 체중변화 및 식이 섭취량을 측정한 후 3주 동안 약물을 처치하면서 비만 억제효과 실험에 사용하였다. 동물사육실의 조건은 항온항습(23± 3℃, 50± 10% RH)환경에서 08：00부터 20：00까지 12시간 간격으로 명암이 자동 조절된다. 실험군은 각각 생리식염수(1ml/kg, i.p.), 홍삼 총 사포닌(200mg/kg, i.p.), 의이인(100mg/kg, i.p.), 코이솔(1mg/kg, i.p.) 투여군으로 나누었다.
The rats used in this experiment were Sprague-Dawley males aged 3 weeks (weight 80 ± 10g), males (Sam taco, Korea), and were fed in the laboratory while supplying unlimited solid foods (Samyang feed, Korea) and water in the animal laboratory. Seven days of adaptation were allowed. After the acclimation period, high-fat diet was provided to induce obesity, and total saline (contorl), total red ginseng saponin (GTS), right ginseng (CS), total ginseng saponin-Gs (CS), and coixol administration groups After dividing into five groups, each prepared feed and water were freely ingested, and the weight change and dietary intake were measured while breeding for 5 weeks, and then used for experiments on the inhibition of obesity while treating drugs for 3 weeks. The conditions of the animal breeding room are automatically controlled in 12 hours intervals from 08:00 to 20:00 in constant temperature and humidity (23 ± 3 ℃, 50 ± 10% RH). The experimental group was divided into physiological saline (1ml / kg, ip), red ginseng total saponin (200mg / kg, ip), uiyiin (100mg / kg, ip), cosol (1mg / kg, ip) administration group.
2. 실험재료2. Experimental materials
본 실험에 사용된 홍삼 시료는 한국담배인삼공사에서 6년근 원료수삼을 증감가온시켜 제조한 홍삼을 42~80mesh로 균일하게 분쇄한 의료용 분말(수분함량 7.22%)을 구입하여 시료로 사용하였다. 액체크로마도그래피 분석에 사용한 acetonitrile, n-butanol, methanol, 증류수 등의 용매류는 E. Merck 회사의 HPLC용 용매류를 사용하였고, 그 외의 추출용매류는 일급시약을 사용하였다. 의이인은 85% 메탄올 추출물을 감압증류기로 농축한 것을 동결건조 후 분말화하여 사용하였으며, 코이솔은 Sigma 회사로부터 구입하였다.
The red ginseng sample used in this experiment was purchased from Korea Tobacco Ginseng Corporation, and the medical powder (water content 7.22%), which was uniformly ground to 42-80 mesh of red ginseng prepared by increasing and decreasing the raw ginseng six years old, was used as a sample. Solvents such as acetonitrile, n-butanol, methanol, and distilled water were used for the liquid chromatography analysis, and solvents for HPLC of E. Merck Co., Ltd. were used. For other extraction solvents, first-class reagents were used. Euiin was concentrated by vacuum distillation of 85% methanol extract, lyophilized and powdered. Cosol was purchased from Sigma.
3. 정제 총 사포닌의 조제3. Preparation of Purified Total Saponins
홍삼을 상온에서 70% 에탄올로 추출하고 농축하여 이 농축액에 동량의 물을 가한 후 pH를 중성으로 조절한 다음 벤젠으로 3회 추출하였다. 그 수층을 Ando 등의 수포화 n-부탄올 추출방법으로 조사포닌을 얻었으며, 이 조사포닌 클로로포름을 가하여 가용성부분을 제거한 후, 활성탄으로 탈색시켜 정제 총 사포닌을 조제하였다. 이 정제된 총사포닌을 Ko 등이 제시한 조건으로 HPLC를 시행한 결과 ginsenoside-Rb1, -Rb2, -Rd 등 디올계 사포닌이 트리올계 사포닌보다 더 많이 함유되어 있음을 나타내고 있다.Red ginseng was extracted with 70% ethanol at room temperature, concentrated, and the same amount of water was added to the concentrate, the pH was adjusted to neutral, and extracted three times with benzene. The aqueous layer was irradiated with a saturated n-butanol extraction method of Ando et al., And the soluble portion was removed by adding the irradiated n-butanol, followed by decolorization with activated carbon to prepare purified total saponin. HPLC analysis of the purified total saponin under the conditions suggested by Ko et al indicates that diol-based saponins such as ginsenoside-Rb1, -Rb2, and -Rd contain more than triol-based saponins.
4. 조제사료의 조성4. Preparation of prepared food
실험에 사용한 식이와 구성성분은 표 1과 같다.
The diet and components used in the experiment are shown in Table 1.
5. 체중, 식이 및 부위별 체지방 무게의 측정5. Determination of body fat weight by weight, diet and site
사흘마다 오후 2시경에 체중을 측정하였으며 평량된 식이를 주고, 다음날 사료의 잔량을 평량하여 매일의 식이 섭취량을 계산하였다. 모든 실험이 끝난 후 부위별 체지방 무게를 비교하기 위하여 마취 후 관류하기 전 갈색지방조직(brown adipose tissue;BAT), 부고환 지방(epididymal fat)의 무게를 재고, 관류 후에 복막지방(peritoneal fat)과 내장지방(visceral fat)의 무게를 측정하였다.
The body weight was measured at 2 pm every three days, and a weighted diet was given. The next day's feed was weighed to calculate the daily dietary intake. In order to compare the body fat weight after each experiment, brown adipose tissue (BAT) and epididymal fat were weighed before perfusion after anesthesia and peritoneal fat and viscera after perfusion. The weight of the fat (visceral fat) was measured.
6. 보행성 활동량 측정6. Measurement of ambulatory activity
피험동물의 활동량을 정량화하기 위하여, 본 연구에서는 S-MART 프로그램(Pan Lab, Spain)을 이용하여 보행성 활동량을 측정하였다. 크기가 가로, 세로, 높이가 각각 26× 30× 45 ㎝인 검은 색 무광택 아크릴 상자에서 피험동물의 움직임을 추적하였다. 8개의 상자 약 2.5 m 위에 설치된 디지털 카메라에서 얻어진 화상을 컴퓨터에 전달하여, 검은 배경에 흰색 피사체의 대조의 원리를 이용하여 흰색 피험동물 상(image)의 중심전을 초당 수 번을 인식하는 방식으로 피험동물의 움직임을 따라 추적하였다 피험동물의 움직임의 궤적을 테이터화하여 움직인 거리를 정량화 하였다.In order to quantify the activity of test animals, the activity of gait was measured using S-MART program (Pan Lab, Spain). The animal's movement was tracked in a black matt acrylic box measuring 26 x 30 x 45 cm in size, horizontally, vertically, and in height. The image obtained from the digital camera mounted on the eight boxes about 2.5 m is transferred to the computer, and the center of the white subject image is recognized several times per second using the principle of contrasting the white subject against the black background. Followed by the movement of the test animal The distance of the movement was quantified by quantifying the trajectory of the test animal movement.
1시간 동안 안정시의 활동량 측정을 거친 실험동물은 5개의 군으로 나누어 각 실험물질을 처치하였다. 실험동물은 각 그룹당 5마리씩 배정하였다.The experimental animals that measured the activity levels at rest for 1 hour were divided into 5 groups and treated with each test substance. Experimental animals were assigned to five animals in each group.
약물 처치 후의 보행성 활동량을 매일 동일한 시간에 1시간 동안 측정하였다. 이러한 과정을 3주간 반복 처치하여 비만에 대한 보행성 활동량 정도를 살펴보았다.
The amount of gait activity after drug treatment was measured at the same time every day for 1 hour. This procedure was repeated for three weeks to evaluate the amount of gait activity in obesity.
7. 면역조직화학법(Immunohistochemistry)7. Immunohistochemistry
모든 행동 실험이 끝난 직후 실험동물을 염산 펜토바비탈(100mg/kg, i.p.)로 마취시키고 생리식염수 100㎖에 이어 인산완충액(PBS)으로 준비한 4% formalin 고정액(fixative) 900㎖로 심장을 통해 관류하였다. 처음 고정액 200㎖은 5분간 빠른 유속으로, 그리고 나머지 700㎖은 25분간 천천히 관류하였다. 그 다음 뇌를 꺼내 같은 고정액으로 2 ~ 3시간동안 고정시키고 백당 20%가 함유된 인산완충액에 넣어 4℃에서 하루동안 보관하였다. 다음날 뇌를 급속 냉동한 후 미세절편기(Leica, CM1850, Germany)를 이용하여 뇌 조직을 배측(dorsal)과 복측(ventral)의 시상하부 부위에서 30㎛의 두께로 자른 다음 취하였다. Neuropeptide Y(NPY) 면역조직화학법(immunohistochemistry)은 조직절편을 인산완충액(PBS)에 3회 세척하여 0.3% Triton X, 0.1% sodium azide, 1:2000 희석된 1차토끼 NPY 항체(ImmunoStar, WI, USA)를 이용하였으며, Cholecystokinin (CCK) 면역조직화학법은 1:500 희석된 1차토끼 CCK 항체(ImmunoStar, WI, USA)를 이용하였으며, 뇌 조직은 1차 항혈청에 4℃에서 72시간동안 지속적으로 흔들어 주면서 배양하였다. 그 후 3번 이상 조직을 PBST로 씻은 다음 2시간동안 실온에서 2% 정상염소혈청을 함유하는 PBST에서 200배 희석한 바이오틴-항 토끼혈청(Vector Laboratories, CA, USA)에 반응시켰다. PBST로 3번 씻은 다음, 뇌 조직은 실온에서 2시간 동안 백타스테인 엘리트ABC reagent 키트(Vector)에 담구었다. PBS로 몇 번 헹군 다음 조직을 착색제로서 디아미노벤지딘(DAB)을 사용하여 발현시켰다. Immediately after all behavioral experiments, the animals were anesthetized with pentobarbital hydrochloride (100 mg / kg, ip) and perfused through the heart with 900 ml of 4% formalin fixative prepared with 100 ml of physiological saline followed by phosphate buffer (PBS). It was. The first 200 ml of fixative was flowed at a high flow rate for 5 minutes, and the remaining 700 ml was slowly perfused for 25 minutes. Then the brain was taken out and fixed with the same fixative for 2 to 3 hours and placed in a phosphate buffer solution containing 20% per bag and stored at 4 ℃ for one day. The next day, after freezing the brain, the brain tissues were cut to a thickness of 30 μm in the dorsal and ventral hypothalamus using a microtomy (Leica, CM1850, Germany). Neuropeptide Y (NPY) immunohistochemistry was performed by washing tissue sections three times in phosphate buffer (PBS) to remove primary rabbit NPY antibodies (ImmunoStar, WI) diluted with 0.3% Triton X, 0.1% sodium azide, 1: 2000. , USA), and Cholecystokinin (CCK) immunohistochemistry was performed using primary rabbit CCK antibody (ImmunoStar, WI, USA) diluted 1: 500, and brain tissues were used in primary antisera for 72 hours at 4 ° C. The culture was continuously shaken. Tissues were then washed three times or more with PBST and then reacted with biotin-anti rabbit serum (Vector Laboratories, CA, USA) diluted 200-fold in PBST containing 2% normal chlorine serum at room temperature for 2 hours. After washing three times with PBST, brain tissues were soaked in a vectorase elite ABC reagent kit (Vector) for 2 hours at room temperature. After several rinses with PBS the tissue was expressed using diaminobenzidine (DAB) as a colorant.
모든 처리를 거친 뇌 조직을 젤라틴으로 코팅된 슬라이드에 고정하고 공기를 제거하면서 커버글라스를 덮은 후 현미경으로 관찰하였다. 200× 200 ㎛ 크기의 현미경 4각 격자(rectangle grid)를 사용하여 200배로 확대하여 내측 중격과 해마에서 CCK 및 NPY-immunoreactive 신경세포의 수를 측정하였다.
All treated brain tissues were fixed on gelatin-coated slides and covered with a cover glass while removing air and observed under a microscope. The number of CCK and NPY-immunoreactive neurons in the medial septum and hippocampus was measured by a magnification of 200 times using a 200 × 200 μm microscopic rectangular grid.
8. 통계처리8. Statistical Processing
본 연구의 모든 측정값은 평균값±표준오차(mean± SEM)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 Window용 SPSS를 이용하였다. 각 집단간 행동 측정치의 비교는 반복측정 분산분석을 시행하였고, 면역조직화학분석법의 측정값은 일원분산분석을 시행하였으며, 사후검증은 Tukey 검증법을 적용하였다.
All measurements in this study were expressed as mean ± standard error (mean ± SEM), and statistical analysis between each experimental group was performed using SPSS for windows. The comparison of behavioral measures among the groups was performed by repeated measures ANOVA. The immunohistochemical analysis was performed by one-way ANOVA.
상기의 실험과정에 의한 실험결과는 다음과 같다.
Experimental results by the above experimental procedure are as follows.
1. 체중의 변화 1. Change in weight
도1은 SD계 흰쥐에 고지방 식이로 사육하면서 3주동안 약물투여에 따른 체중변화를 비교하여 본 결과이다.1 is a result of comparing the weight change according to drug administration for 3 weeks while breeding a high fat diet in SD rats.
도1을 참조하면, 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합 투여군에서 체중증가의 억제효과는 유의하게 억제되었다 {F(1,21)=3670.7, P<0.001}. Referring to FIG. 1, the inhibitory effect of weight gain was significantly suppressed in the combined administration group of red ginseng total saponin and Uiin {F (1,21) = 3670.7, P <0.001}.
처치가 끝난 후 최종 몸무게를 비교하여 보았을 때 대조군에 비하여 홍삼 총사포닌과 의이인의 복합처치 투여군이 홍삼 총사포닌 혹은 의이인의 단독투여보다 체중증가의 억제효과가 현저하게 나타났다 (P<0.05). *P<0.05, **P<0.01 compared with control group.
In comparison with the final weight after treatment, the combined treatment group of red ginseng total saponin and Euiin showed significantly more inhibitory effect on weight gain than the total administration of red ginseng total saponin or Euiin (P <0.05). * P <0.05, ** P <0.01 compared with control group.
2. 식이섭취 및 효율의 비교2. Comparison of Dietary Intake and Efficiency
도2 약물투여에 의한 식이 섭취량의 변화를 비교한 것이다. 도2를 참고하여서 홍삼 총 사포닌, 의이인, 이들 혼합물, 혹은 코이솔에 의한 각 군의 식이 섭취 및 효율을 살펴보면 다음과 같다.Figure 2 compares the change in dietary intake by drug administration. Referring to Figure 2 with reference to the red ginseng total saponin, uiyiin, these mixtures, or the diet of each group by cosol as follows.
식이 총섭취량은 대조군 대비 홍삼 총 사포닌 투여군은 18.9%, 의이인 투여군은 7.2%, 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합투여군은 24.5%의 체중증가량의 억제효과가 인정되었다. The total dietary intake was 18.9% in the total saponin-treated group, 7.2% in the Ui-in group, and 24.5% in the combined administration group of total saponin and Ui-in red ginseng.
고지방식이로 유도된 비만군의 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합투여에서 체중 증가량과 식이 섭취량의 감소를 나타냈다. 또한 체중증가량의 억제효과는 식이효율에 비례한다.
The high-fat diet-induced obesity group with red ginseng and saponin showed a decrease in weight gain and dietary intake. In addition, the inhibitory effect of weight gain is proportional to dietary efficiency.
3. 부위별 체지방 무게의 비교3. Comparison of Body Fat Weight by Site
도3은 약물 투여에 의한 부위별 체지방 무게의 변화를 비교한 것이다. 도3 참고 하여서 홍삼 총 사포닌과 의이인의 투여에 의한 지방조직을 비교하여 보면 다음과 같다.Figure 3 compares the change in body fat weight by site by drug administration. Referring to Figure 3 when comparing the adipose tissue by administration of red ginseng total saponin and uiyiin as follows.
대조군 대비 갈색지방(brown adipose fat)은 46.4%, 부고환 지방(epididymal fat)은 38.2%, 내장 지방(visceral fat)과 복막 지방(peritoneal fat)은 대조군 대비 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합 투여군은 각각 71.1%, 68.9% 감소되었다.
46.4% of brown adipose fat, 38.2% of epididymal fat, and 7% of visceral fat and peritoneal fat were 71.1% of total saponin and Uiin compared to control group. %, 68.9%.
4. 보행성 활동량4. Ambulatory activity
약물투여에 따른 지단간 활동량에 대한 효과를 분석한 결과는 도4와 같다. 고지방 식이조건에서 각각 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합처치 그룹에서 유의미한 보행성 활동량이 증가되었다 {F(1,20)=842.4, P<0.001}.
The result of analyzing the effect on the amount of Zidane activity according to drug administration is shown in FIG. 4. Significant gait activity was increased in the combined treatment group of red ginseng total saponin and Euiin under high fat diet conditions {F (1,20) = 842.4, P <0.001}, respectively.
5. 면역조직화학분석결과5. Immunohistochemical Analysis
5-1. Neuropeptide Y(NPY) immunohistochemistry5-1. Neuropeptide Y (NPY) immunohistochemistry
도5은 뇌의 시상하부 각 핵에서 NPY 발현정도를 비교한 그래프이다. Figure 5 is a graph comparing the degree of NPY expression in each nucleus of the hypothalamus of the brain.
NPY 발현을 살펴보면 대조군은 궁상핵(arcuate nucleus;ARC)에서 50.4 ± 5.7, 시상하부 외측핵(lateral hypothalamus; LH)에서 24.8± 4.1, 복내측핵(ventromedial hypothalamus;VMH)에서 34.9± 3.5, 실방핵(paraventricular nucleus;PVN)에서 40.5± 1.6, 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합 투여군 궁상핵에서 28.3± 4.8, 시상하부 외측핵에서 22.7± 1.7, 복내측핵에서 26.0± 3.8, 실방핵에서 28.5± 5.2 로 각각 나타났다. In terms of NPY expression, the control group was 50.4 ± 5.7 in the arcuate nucleus (ARC), 24.8 ± 4.1 in the lateral hypothalamus (LH), 34.9 ± 3.5 in the ventromedial hypothalamus (VMH), and chamber nucleus. 40.5 ± 1.6 in paraventricular nucleus (PVN), 28.3 ± 4.8 in the total nucleus of red ginseng and Euiin, 22.7 ± 1.7 in the hypothalamus lateral nucleus, 26.0 ± 3.8 in the ventral medial nucleus and 28.5 ± 5.2 in the parenchymal nucleus. Each appeared.
5-2. Cholecystokinin (CCK) immunohistochemistry5-2. Cholecystokinin (CCK) immunohistochemistry
도6는 뇌의 시상하부 각 핵에서 CCK 발현정도를 비교한 그래프이다. Figure 6 is a graph comparing the degree of CCK expression in each nucleus of the hypothalamus of the brain.
CCK 발현을 살펴보면 궁상핵(arcuate nucleus;ARC)에서 36.1± 6.2, 시상하부 외측핵(lateral hypothalamus; LH)에서 15.8± 4.1, 복내측핵(ventromedial hypothalamus;VMH)에서 28.2± 4.3, 실방핵(paraventricular nucleus;PVN)에서 22.2± 5.2, 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합투여군 궁상핵에서 48.7± 5.1, 시상하부 외측핵에서 25.0± 2.0, 복내측핵에서 32.8± 4.1, 실방핵에서 35.6± 6.9 로 각각 나타났다.
CCK expression was 36.1 ± 6.2 in the arcuate nucleus (ARC), 15.8 ± 4.1 in the lateral hypothalamus (LH), 28.2 ± 4.3 in the ventromedial hypothalamus (VMH), and paraventricular. nucleus (PVN), 22.2 ± 5.2 in total saponin and red ginseng, 48.7 ± 5.1 in arch-nucleus, 25.0 ± 2.0 in hypothalamic lateral nucleus, 32.8 ± 4.1 in ventral medial nucleus and 35.6 ± 6.9 in parenchymal nucleus, respectively. .
이상 도면을 참조하여 본 발명에 대해 실시예 및 실험예들을 들어 설명하였으나 본 발명은 이에 제한되지 않는다.Although the embodiments and experimental examples have been described with reference to the drawings, the present invention is not limited thereto.
위 실시예 및 실험예들에서는 실험용 동물을 쥐로 하였으나, 마우스, 개나 고양이, 모래쥐, 원숭이 등일 수 있다. 따라서, 고지방 식이로 유도된 비만 동물모델도 쥐 뿐만 아니라 다른 포유류 동물일 수 있다.In the above examples and experimental examples, but the experimental animal as a rat, it may be a mouse, dog or cat, sand mouse, monkey and the like. Thus, an obese animal model derived from a high fat diet can be not only mice but also other mammalian animals.
약제 제제화 방법으로 추출물 제조만을 언급하였으나, 통상적으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 허용되는 약학적 제제, 예를 들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화하여 비만 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 제제로 사용될 수 있다.Although only extract preparation is mentioned as a pharmaceutical formulation method, it is conventionally formulated with a pharmaceutically acceptable excipient together with a pharmaceutically acceptable pharmaceutical agent, for example, injection, liquid, syrup, tablet, capsule, etc. to prevent obesity disease. And pharmaceutical preparations for treatment.
이상의 결과에서, 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합투여군에서는 보행성 활동량을 증가시켜 에너지 균형 효과를 보여 주었으며, 시상하부에서의 섭식 자극 물질인 NPY 활성은 감소시키고 섭식 감소 물질인 CCK의 활성을 증가시키므로, 비만을 억제하는 효과를 보여 주었다. 따라서 홍삼 총 사포닌과 의이인의 복합물은 효과적인 비만 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.In the above results, the combined administration of red ginseng total saponin and Euiin showed an energy balance effect by increasing the amount of gait activity, and decreased the NPY activity, which is a feeding stimulant in the hypothalamus, and increased the activity of CCK, a dietary reducing substance, It has been shown to suppress obesity. Therefore, the combination of red ginseng total saponin and Euiin could be used as an effective obesity treatment.
본 발명에 따른 홍삼 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만억제 및 치료를 위한 약제학적 조성물은 임상적으로 투여시 경구, 복강, 피하 투여 등의 방법으로 투여할 수 있다. According to the present invention, the red ginseng saponin and the pharmaceutical composition for the treatment of obesity using yiinin can be administered by a method such as oral, intraperitoneal, subcutaneous administration during clinical administration.
또한, 본 발명에 따른 홍삼 총 사포닌과 의이인을 이용한 비만 치료를 위한 약제학적 조성물의 투여용량은 환자의 연령, 증상, 투여제형 또는 약물의 종류에 따라 다양하게 조절할 수 있다. 특정한 상태에서 바람직한 투여량을 결정하는 것은 공지된 기술에 해당한다.
In addition, the dosage of the pharmaceutical composition for the treatment of obesity using red ginseng total saponin and yiinin according to the present invention can be variously adjusted according to the age, symptoms, dosage form or type of drug of the patient. Determining the desired dosage in a particular condition corresponds to known techniques.
본 발명은 홍삼에서 추출한 물질인 총 사포닌과 의이인의 성분을 유효성분으로, 고지방 식이로 유도된 비만동물군에서 반복적인 약물 투여로 인해 비만을 억제함으로써 에너지 균형의 행동적 지표인 보행성 활동량의 증가와 섭식행동의 지표인 NPY와 CCK의 발현을 조절할 수 있는 비만 치료를 약제학적 성분을 제공한다.
The present invention is an active ingredient of total saponin and uiyiin extracted from red ginseng as an active ingredient, the increase in the amount of gait activity as a behavioral indicator of energy balance by inhibiting obesity due to repeated drug administration in obese animals group induced by high fat diet It provides pharmaceutical components for the treatment of obesity that can regulate the expression of NPY and CCK, which are indicators of feeding behavior.
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| E601 | Decision to refuse application |