KR20050118668A - 유체의 미세유체식 조작, 증폭 및 분석, 예를 들어 세균검정 및 항글로불린 시험을 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

유체의 미세유체식 조작, 증폭 및 분석, 예를 들어 세균검정 및 항글로불린 시험을 위한 방법 및 시스템 Download PDF

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KR20050118668A
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베른하르트 에이취 바이글
밍차오 선
제프리 엠 하우칼
크리스티 에이 랜캐스터
웨인 브레이드포드
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마이크로닉스 인코포레이티드.
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Abstract

본원에는, 혈소판 내의 세균의 분석 및 소변 내의 성-매개된 질환(STD)의 분석에 사용하기 위한 1회용 미세유체식 카드를 포함하는, 측류 검출 스트립 상의 DNA의 검출 및 수용액으로 부터 DNA의 분리 및 증폭을 위한 미세유체식 시스템이 기재되어 있다. 상기 카드는 세포와 세포 부산물을 여과하는 매몰된 막을 포함할 것이다. 막 위의 모든 생물학적 부산물은 용해될 것이고, DNA는 적당한 시약 및 열-순환 조건을 포함한 PCR 증폭 프로토콜을 통해 증폭될 것이다. 증폭된 DNA는 육안에 의한 진단 판독을 위하여 측류 검출 스트립으로 전달된다. 또 다른 태양은 항글로불린 검정물의 유형을 결정하는데 사용하기 위한 미세유체식 카드를 포함한다.

Description

유체의 미세유체식 조작, 증폭 및 분석, 예를 들어 세균 검정 및 항글로불린 시험을 위한 방법 및 시스템{Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing}
본 발명은 일반적으로 미세유체식(microfluidic) 장치와 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 특히 예를 들어 혈소판 세균 검정 및 항글로불린 시험을 포함한, 유체 샘플의 조작, 증폭 및 분석을 위한 미세유체 장치 및 방법에 관한 것이다.
미세유체식 장치는 최근에 분석 시험을 수행하는 데 널리 사용되고 있다. 전자부품을 소형화하기 위한 반도체 산업에 의하여 개발된 공구를 사용함으로써, 저렴하게 대량 생산될 수 있는 복잡한 유체 시스템을 제조하는 것이 가능하게 되었다. 정보를 수집 및 처리하기 위한 다양한 분석 기술을 수행하기 위한 시스템이 개발되어 왔다.
미세유체식으로 분석을 수행하기 위한 능력은 처리량, 시약 소모 및 자동화가능성의 실질적인 장점을 제공한다. 미세유체식 시스템의 또 다른 장점은 분석 및/또는 합성을 위한 반응물의 처리를 수행하기 위한 단일의 "랩-온-어-칩(lap-on-a-chip)"에서 다수의 서로 다른 작업을 통합시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다.
미세유체식 장치는 다중층으로 적층된 구조로 구성되는데, 이때 각각의 층은 유체가 흐르는 미소규모의 간극(void) 또는 채널을 형성하기 위하여 적층 재료로 부터 제조된 채널 및 구조체를 가진다. 미소규모 또는 미세유체식의 채널은 500㎛이하, 통상적으로는 약 0.1 ㎛ 내지 약 500㎛인 내부 단면적을 적어도 하나 가지는 유체 통로로서 일반적으로 정의된다.
본원에서 참조로서 전문이 인용된 미국 특허 제5,716,852호에는 미세유체식 장치의 일례가 기재되어 있다. 상기 '852 특허는 층류(laminar flow) 채널을 사용하여 샘플 스트림 중의 분석물 입자의 존재를 검출하기 위한 미세유체식 시스템을 교시하는데, 상기 층류 채널은 인디케이터 스트림(indicator stream) 및 샘플 스트림(sample stream)을 제공하는 적어도 2개의 도입 채널을 가지며, 이때 층류 채널은 스트림의 층류를 허용하기에 충분히 작은 깊이와, 분석물의 입자를 인디케이터 스트림으로 확산시켜 검출 영역을 형성하도록 하기에 충분한 길이를 가지며, 또한 상기 층류 채널은 단일의 혼합 스트림을 형성하기 위하여 채널의 바깥으로 향하는 배출구를 가진다. T-센서로 알려진 상기 장치는 확산이외의 혼합 없이 채널 내에서 서로에 인접된 상이한 유체층의 이동을 가능케 한다. 전혈과 같은 샘플 스트림, 인디케이터 용액(indicator solution)과 같은 리셉터(receptor) 스트림, 및 공지된 표준 분석물일 수 있는 기준 스트림은 상기 T-센서 내의 공통의 미세유체식 채널 내로 도입되고, 상기 스트림은 이들이 채널을 빠져 나갈 때까지 서로에 인접되게 흐른다. 이온 또는 작은 단백질과 같은 보다 작은 입자는 유체 경계를 지나 신속히 확산되는 반면에, 보다 큰 분자는 보다 서서히 확산된다. 혈구와 같은 큰 입자는 2개의 유동 스트림이 접촉하는 시간 내에 현저한 확산을 나타내지 않는다.
통상적으로, 미세유체식 시스템은, 압전 펌프, 마이크로-시린지(micro-syringe) 펌프, 전기삼투압 펌프(electroosmotic pump) 등과 같은 기능을 하는 몇몇 형태의 외부 유체식 구동기(fludic driver)를 요구한다. 그러나, 본원 발명의 양수인에게 양도된, 본원에 참조로서 전문이 인용된 출원인 미국 특허출원 제09/684,094호에는, 미세유체식 시스템이, 내부적으로 이용가능한 내부 힘, 예를 들어 중력, 정수압, 모세관력, 다공성 물질에 의한 흡수, 또는 화학적으로 유도된 압력 또는 진공에 의하여 완전하게 구동되는 것으로 기재되어 있다.
또한, 미소규모의 장치에서 유체를 제어하는데 사용하기 위한 다수의 상이한 형태의 밸브가 개발되어 왔다. 예를 들면, 미국 특허 제6,432,212호에는 적층된 미세유체식 구조에서 사용하기 위한 일-방향 밸브가 기재되어 있으며, 미국 특허 제6,581,899호에는 적층된 미세유체식 구조체에서 사용하기 위한 볼베어링 밸브가 기재되어 있으며, 본 출원의 양수인에게 양도된 미국 특허출원 제10/114,890호에는 공압 밸브 인터페이스(interface)가 기재되어 있는데, 이는 적층 미세유체식 구조에서 사용하기 위한 제로 데드 볼륨(zero dead volume) 밸브로서 또한 공지되어 있다. 상술된 특허 및 특허출원은 본원에 참조로서 전문이 인용된다.
당해 분야에서 많은 향상이 있어 왔지만, 유체 샘플을 조작하고, 증폭하고, 분석하기 위한 새롭고 향상된 미세유체식 장치가 여전히 요구되고 있다.
새롭고 향상된 미세유체식 장치를 필요로 하는 분야의 예로는 세균 및 항글로불린 분석과 관련된 분야가 있다. 세균에 의해 오염된 혈소판에 의해 야기되는 세균성 패혈증은, HIV, C형 간염 바이러스 또는 웨스트 나일(West Nile) 바이러스 보다도 최대 250배 까지 빈빈하게, 혈액 수혈에 의해 전염되는 감염증의 원인이다. 미국에서 매년 수혈된 4백만 혈소판 단위 중에서, 1,000 내지 4,000개가 세균에 의해 오염되며, 167 내지 1,000건의 임상 패혈증이 생긴다. 임상 증상을 나타내는 환자의 20 내지 40%가 사망한다.
현재의 혈소판 세균 검정
혈소판 스크리닝은 미국에서는 수혈 전에 통상적으로 수행되지 않는다; 그러나, AABB는 세균 오염에 대해 혈소판을 시험하기 위한 예비-수혈을 요구하는 새로운 표준을 제안하였다.
여러 방법이 미국 외에서 현재 사용되고 있다.
● 표준 세포 배양: 혈소판을 페트리-디쉬(Petri-dish)에서 배양하고, 염색 후 세균을 검출한다. 이 방법은 매우 시간-소모적이고, 자동화되지 않았으며, 상당한 양의 혈소판을 요구한다.
● 폴 세균 검출 시스템 (Pall BDS): 세균 성장의 결과인 산소 농도의 변화를 이용한다. 세균이 산소를 소비하기 때문에, 혈소판 샘플 내의 비정상적으로 낮은 수준의 산소는 세균의 존재를 나타내는 것이다.
● BioMerieux BacT/Alert 시스템은 세균에 의한 이산화탄소의 생성을 추적하여 세균의 존재를 검출한다.
● 헤모시스템(Hemosystem)은 형광성 마커로 세균을 표지화한 후, 형광성 검출을 토대로 하여 혈소판 농축물에서 세균을 검출하는 시스템을 개발한 것이다.
발명의 간단한 요약
본 발명의 양태는 소변 및 전혈 분석을 위한 혈소판-특이적 세균 검정을 포함한다. BAC 카드(Card) 시스템으로서 공지된 이 시스템은, 세균 용해 및 후속적인 등온 DNA 증폭 및 검출 통한 세균 DNA 검출의 동정을 기반으로 한다. 본 발명의 또 다른 태양은 성-매개 질환을 판정하기 위한 소변의 분석 및 검출을 제공하는 것이다.
아래의 예시적인 단계는 본 발명의 양태에 따른 미세유체식 카드 상에서 수행한다: 혈소판 주머니로 부터 샘플을 수집하여, 랩 카드의 도입부 상에 놓고; 용해 채널 내에서 (잔존하는 백혈구 뿐만 아니라) 세균을 용해시키고; 세균 DNA를 증폭 챔버 내의 고체 기판 상에 포획시키고; 증폭 챔버가 등온 증폭 온도 프로필에 노출되는 동안에, 리보좀의 RNA 분자의 소단위를 암호화하는 유전자(16S rRNA 또는 SSU rRNA 유전자)로 부터 설계된 DNA 프라이머를 상기 고체 기판 상으로 펌핑(pumping)한 후 완충액으로 세척하며; 증폭된 16S rRNA DNA을 측류(lateral flow) 스트립으로 펌핑하고; 세균 DNA의 존재를 가시화한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 유동 채널을 보유하는 기판, 혈액 샘플을 수용하기 위한 도입구, 적혈구와 혈장을 분리하기 위한 필터, 혈장의 일부를 적당한 시약과 혼합하기 위한 시스템, 열원, 항글로불린 혈장을 첨가하기 위한 입구, 및 시험 결과를 육안으로 관찰하기 위한 창을 포함하는, 항글로불린 검정물의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템을 포함한다.
도 1a는 본 발명의 원리에 따른 미세유체식 분석 카드의 구성도를 예시한다. 도 1b는 B-1 B 라인에 따른 도 1a의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 원리에 따른 미세유체식 분석 카드에서 유체 유동을 구동시키는 장비의 구성도를 예시한다.
도 3은 본 발명의 원리에 따른 미세유체식 항글로불린 분석을 수행하기 위한 진단 장치에 대한 공정 흐름도를 예시한다.
도 4a는 본 발명의 원리에 따른 혈소판에서 세균을 검출하기 위한 세균 진단 장치에 대한 공정 흐름도를 예시한다.
도 4b는 본 발명의 원리에 따른 혈소판에서 세균을 보호하기 위한 세균 진단 장치를 수행하는 흐름도를 예시하는 본 발명의 또 다른 태양이다.
도 4c는 도 4b에 포함된 흐름도의 단계를 예시하는 도표이다.
도 5는 도 4의 흐름도에 따른 미세유체식 장치의 구성도이다.
도 6은 본 발명의 원리에 따른 예시적인 세균 검정 카드의 흐름도이다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 원리에 따른 시린지에 대한 연결 포트를 보여주는 세균 검정 카드의 일 태양을 예시한다.
도 8은 본 발명의 원리에 따른 가열기 블록 내에 설치된 열 전달 로드(rod) 및 플레이트(plate)의 단면도이다.
도 9는 본 발명의 원리에 따른 절연체 및 압반(platen) 어셈블리의 단면도이다.
도 10은 본 발명의 원리에 따라 시스템을 가열하는 시간 대 온도의 도표이다.
도 11은 본 발명의 원리에 따른 온도 대 시간의 그래프이다.
도 12는 본 발명의 원리에 따른 온도 대 시간의 그래프이다.
도 13은 본 발명의 원리에 따른 온도 대 시간의 그래프이다.
도 14는 본 발명의 원리에 따른 온도 대 시간의 그래프이다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 분석을 위한 유체 샘플을 제조하고 유체 샘플을 분석하기 위하여, 다수의 미세유체식 채널, 도입구, 밸브, 막, 펌프, 액체 배리어(liquid barrier), 및 유체 샘플의 유동을 조작하기 위하여 다양한 형태로 배열된 기타 요소를 사용하는 미세유체식 장치 및 방법에 관한 것이다. 후술되는 상세한 설명에서, 본 발명의 장치 및 방법의 특정 태양이 기재되어 있으나, 당업자는 후술되는 다양한 태양 및 요소가 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 조합되거나 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
도 1a 및 1b에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일 태양은, 소변 및 전혈 분석을 위한 세균 검정 시스템인 1회용 랩 카드(100) 장치를 포함한다. 당해 시스템은 유체 소형화 수단을 포함하여, 용해 및 DNA 포획을 수행할 수 있다. 이어서, 샘플 내의 세균을 검출하고 동정하기 위하여, 카드 내에서 등온 증폭을 수행한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 예를 들어 수 중에서의 이. 콜라이의 분석 뿐만 아니라 성-매개된 질환(STD)의 분석에서 사용가기 위한 1회용 카드를 포함하는, 수용액으로 부터의 DNA의 분리 및 증폭 및 스트립 판독기 상에서의 DNA의 검출을 위한 미세유체식 시스템을 포함한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 당해 카드는 매몰된 막을 포함하여, 일정량의 유체, 예를 들어 약 100ml의 물 또는 10ml의 소변이 당해 막을 통과하도록 한다. 유체가 막을 통과할 때, 당해 막이 세포와 세포 부산물을 여과하여 제거한다. 막 위의 모든 생물학적 부산물은 용해될 수 있고, DNA는 PCR 증폭 프로토콜(적당한 시약 및 열 순환 조건)에 따라 증폭된다. 이어서, 증폭된 DNA는 진단 판독을 위해 측류 검출 스트립(lateral flow detection strip)으로 전달될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 항글로불린 검정물의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템을 포함한다. 항글로불린 카드(AHG 카드)는, 많은 적혈구 항체가 IgG이며 감작화된 적혈구 세포를 직접 응집시키지 않는다는 문제를 해결하고자 한다. 일단 이들 항체 또는 이들 항체에 의해 활성화된 보체가 감작화된 적혈구에 부착되면, 이들은 항-사람 글로불린 또는 항-보체 시약의 첨가에 의해 검출된다. 이러한 태양은 3개의 영역을 포함한다: 미세유체식 분리기; 실온 미세유체식 회로, 및 섭씨 37℃의 미세유체식 회로.
세균 검정 미세유체식 카드
본 발명의 양태는 소변 및 전혈 분석을 위한 혈소판-특이적 세균 검정 시스템을 포함한다. BAC 카드 시스템으로서 알려진 이러한 시스템은, 세균 용해 및 후속적인 등온 DNA 증폭 및 검출을 통한 세균 DNA 검출의 동정을 기반으로 한다.
모든 단계는 미세유체식 카드 상에서 수행한다. 종래의 방법에 비해, 본 발명의 전 과정은, 소요 시간이 예를 들어 90분 미만으로 감소될 것이며, 선택도가 예를 들어 약 100 세균/mL의 선택도로 증가될 것이다. 아래의 내용은 상기 과정의 예시적인 단계를 포함한다:
● 샘플을 혈소판 주머니로 부터 수집하여 램 카드의 도입구 상에 놓는다.
● 세균 (뿐 만 아리나 잔존 백혈구)을 용해 채널에서 용해시킨다.
● 세균 DNA를 증폭 챔버 내의 고체 기판 상에 포획한다.
● 상기 증폭 챔버가 등온 증폭 온도 프로필에 노출되는 동안에, 리보좀의 RNA 분자의 작은 소단위를 암호화하는 유전자(16S rRNA 또는 SSU rRNA 유전자)로 부터 설계된 DNA 프라이머를 고체 기판으로 펌핑(pumping)한 다음, 완충액으로 세척한다.
● 이어서, 증폭된 16S rRNA DNA를 측류 스트립으로 펌핑하면, 그 곳에서 세균 DNA의 존재가 육안으로 보인다.
도 2는, 세균 검정 카드(BAC)(100)를 작동시키는 사용되는 장비 시스템(200)과 접속하는 BAC 카드를 예시한다.
항글로불린 ( AHG ) 카드
본 발명의 또 다른 태양은 항글로불린 시험을 위한 검정 카드 (AHG 카드)이다.
AGH 카드는, 많은 적혈구 항체가 IgG이며 감작화된 적혈구를 직접적으로 응집시키는 않는다는 문제를 해결하고자 한다. 일단 이들 항체 또는 이들 항체에 의해 활성화되는 보체가 감작화된 적혈구에 부착되면, 이들은 항-사람 글루불린 또는 항-보체 시약의 첨가에 의해 검출된다.
도 3에 예시된 바와 같이, 본 발명에 일 태양에 따르면 미세유체식을 이용한 카드는 당해 카드 위에서의 ABO/Rh 및 AHG 검정에 요구되는 모든 기능을 수행할 것이다. 이러한 태양은 3개의 영역을 포함한다:
I. 미세유체식 혈장 분리기
II. 실온 미세유체식 회로, 및
Ill. 37℃ 미세유체식 회로.
영역 II 및 III은 통상의 열 패드 항온배양기(incubator)를 사용하여 상이한 온도에서 항온배양한다. 상기 AHG 카드는 어떠한 외부 펌핑 또는 검출 수단도 요구하지 않는다. 유체는 통합된 카드-내 풀무 펌프[참조: 2004년 1월 14일에 출원된 공동-계류중인 출원인의 출원; 발명의 명칭: MICROFLUIDIC DEVICES FOR FLUID MANIPULATION AND ANALYSIS; 이의 출원 번호는 아직 부여되지 않았으며, 이의 전문이 본원에 참조로서 인용된다]를 사용하여 카드를 통해 이동된다. 결과는 육안으로 해석된다.
본 발명의 일 양태와 도 3에 도시된 흐름도에 따르면, 아래의 단계들이 카드 위에서 수행될 수 있다.
1. 영역 I에서, 전혈 샘플이 원심분리에 의하지 않고, 미세유체식으로 적혈구(샘플 1)과 혈장(샘플 2)로 분리된다.
2. 샘플 2는 2개의 분액- 샘플 2a 및 샘플 2b로 분리된다. 샘플 2a는 영역 II로 이동되고, 샘플 2b는 영역 III으로 이동된다.
3. 영역 II에서, 잔존 혈장 단백질을 확산에 의한 분리로 적혈구가 풍부한 분액으로 부터 제거하고, 당해 분액을 염수 중에 희석시켜, 3 내지 5%의 적혈구 농도를 수득한다. 이어서, 3개의 마이크로채널에서, 샘플 1을 항-A, 항-B, 및 항-D 시약과 반응시키고, 당해 반응을 반응 창을 통해 육안으로 해석한다. 동시에, 샘플 2a를 두 개의 독립적 채널에서 A1 및 B 적혈구와 반응시키고, 반응을 육안으로 해석한다.
4. 영역 III에서, 카드를 37℃로 가열하고; 시약, 적혈구, SI 및 SII (희석된 적혈구)를 혈장과 함께 15 내지 60 분 동안 항온배양한다. 만일 혈청이 적혈구 상의 항원에 특이적인 항체를 함유한다면, 당해 항체는 세포를 감작시킬 것이다(그러나, 항체가 IgG인 경우에 이들을 응집시키지는 않는다). 당해 혼합물을 분리 매질을 통해 유동시키면, 이때 단백질이 샘플로 부터 제거된다. 세척 단계 후, AHG 혈청을 마이크로채널 내에 가하고, 시험 결과를 육안으로 해석한다.
위에서 언급된 단계 중에서, 단계 1은, 혈액 샘플을 원심분리에 의하지 않고 미세유체식으로 적혈구와 혈장으로 분리하는 것에 관한 것이다. 이는 다수의 상이한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일 태양에서, 확산을 이용한 분리가 사용되며, 이는 본원에 참조로서 이의 전문이 인용된 미국 특허 제5,932,100호에서 논의된 바 있다. 차동적 수송은 위에서 언급된 흐름도에서는 생략된 추출 유체를 요구한다.
또 다른 태양에서, 입자 리프트(lift) 효과가 사용될 수 있다. 마이크로채널 속에서 유동하는 입자가 벽 밖으로 흘러 나가서, 입자가 존재하지 않는 상기 채널에 바로 인접한 층을 남길 수 있다. 이러한 얇은 입자-부존재 층을, 채널의 벽에 구멍을 내거나, 배출구를 제공하거나, 또는 유사한 수단을 포함한 여러 수단에 의해 유체 유동으로 부터 제거할 수 있다. 다양한 입자-부존재 유체의 제거에도 불구하고, 입자는 계속하여 중심으로 이동하므로, 상기 과정은 루프 내에 유동 채널을 제공함으로써 반복될 수 있다.
또 다른 태양에서, 입자-부존재 유체를 여과하는 데 필터가 사용될 수 있다. 통상적으로, 필터가 사용되는 경우에, 이는 실제로 적혈구로 인해 막히지만, 본 발명에 따르면, 소량의 혈장만이 작업을 수행하는데 필요하므로, 필터가 적절하다.
또 다른 태양에서, 적혈구와 혈장을 분리하는 수단은 접선 유동 필터(tangential flow filter)의 사용을 포함한다. 분리 수단의 또 다른 태양에서, 침강을 사용하여 혈액 샘플을 침전시킬 수 있으며, 따라서 적혈구를 서서히 침전시키면서, 박층을 상단으로 부터 제거할 수 있다. 또한, 소량의 혈장이 요구되기 때문에, 침강은 실행 가능한 대안이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 확산에 의한 분리를 사용하여 적혈구 분액으로 부터 혈장 및 혈장 단백질을 완전히 제거하기 위하여, 단계 3과 단계 2를 조합할 수 있다.
단계 3은 혈액 샘플과 항체 A, B 및 D 시약과의 반응을 필요로 한다. 이들 합해진 유동은 확산, 침강 및 응집을 통해 혼합될 수 있으며, 이는 본원에 참조로서 이의 전문이 인용된 미국 특허 제6,136,272호에 기재된 바와 같다.
혈액의 유형을 결정하는 미세유체식 시스템에 관하여 위에서 기재된 내용과 더불어 도 4의 흐름도에 추가로 예시된 바와 같이, 항-글로불린 검정에 관하여 개략화된 단계는 단일 카드 상에서 수행될 수 있거나, 달리 2 개 이상의 카드 상에서 수행될 수 있다. 영역 2에서의 기능을 위해 실온을 유지하면서, 항온배양을 제공하기 위하여, 예를 들어, 영역 3에서 수행된 기능을 제거하는 것이 유리할 수 있다. 그러나, 또 다른 태양에서, 영역 1, 2 및 3에 개략화된 기능을 모두 수행하고, 카드-내 가열 요소, 예를 들어 혈장 혼합물을 특이적으로 가열하고 항온배양하는 저항자(resistor)를 제공할 수 있다.
미세유체식 진단 시스템의 이러한 태양에서, 적혈구 및 SI 및 SII로서 알려진 희석된 적혈구의 취약성으로 인해, 이들 시약은, 예컨대 항체-A, B 및 D 시약와 같이 카드 상에 예비적재될 수 없다.
혈장 혼합물을 함유하는 카드 부분을 37℃로 가열하는데 사용되는 가열 수단은 모든 공지된 가열 수단일 수 있으며, 이에는 평면 금속 저항자, 적외선 가열, 방사선 가열, 펠티에(Peltier) 가열기, 액체 가열, 또는 기타 적당한 수단이 포함된다.
세균 검정에 관한 일반적 기술
본 발명의 일 태양에 따르면, 단일 분석물 진단 장치/시스템(SADD/S)은 수용액 샘플로 부터 DNA를 분리하여 증폭시킬 수 있다. 증폭된 DNA는 필터 막으로 부터 측류 검출 스트립으로 옮겨져서, 진단 판독에 사용될 것이다.
하나의 예시적 용도로, 상기 장치/시스템은, 세균 예를 들어 에쉬체리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 엔터로박터 클로아새(Enterobacter cloacae), β-스트렙토코쿠스(β-Streptococcus), 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens), 및/또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 검출을 위하여 물(水) 샘플 중에서 발견된 DNA의 분리 및 증폭에 사용될 수 있다.
열 증폭을 위한 분리 및 유체식 제조는 상기 장비 상의 적소에 있는 동안에 1회용 카드 상에서 수행될 것이다. 당해 카드는 DNA 증폭을 완료하는데 요구되는 항온배양을 위한 장비로 부터 제거될 것이다. 항온배양 후, 당해 카드를 상기 장비에 다시 갖다 놓고, 그곳에서 증폭된 DNA는 진단 판독을 위한 검출 스트립으로 옮겨질 것이다.
본 발명의 또 다른 용도는 성-매개된 질환의 검출을 위하여 소변으로 부터 DNA를 분리하고 증폭하는 것이다.
도 4a 및 4b는 BAC 카드의 태양을 예시하는 도식적인 흐름도를 보여준다. 도 4c는 도 4a 및 4b의 흐름도에 도시된 각 단계의 설명서를 제공한다. 도 4a는, 분석용 샘플의 포획 후 카드 속으로 스냅핑(snapping)될 수 있는 필터 막 모듈(FMM: Filter Membrane Module)을 가진 태양을 예시한다. 도 4b는 미세유체식 카드 내에 설치된 FMM을 가진 태양을 예시한다.
상기 SADD 시스템은 3개의 주요 구성요소를 포함한다:
● 물 샘플로 부터 여과되어진 표적 세포를 갖는 필터 막, 및 시험된 물 샘플 내의 이. 콜라이 또는 다른 세균의 존재를 검출하는데 사용되는 측류 검출 스트립을 함유하는 1회용 진단 미세유체식 카드;
● 상기 1회용 카드 상의 유체를 지지하고 제어하는 장비; 및
● 증폭 및 검출을 위하여 유체를 구동시키는 장비 제어를 가능케 하는 소프트웨어.
미세유체식 카드, 장비 및 소프트웨가 아래에서 추가로 상세히 기재될 것이다.
1회용 미세유체식 카드의 설명
SADD/S 1회용 미세유체식 카드는 다중층의 미세유체식 카드이다. 도 1a, 1b 및 5는 미세유체식 카드의 태양을 예시한다. 도 1a는 미세유체식 카드(100)를 예시하며, 당해 카드 위에 막 또는 필터(120)가 수용된다. 또한, 폐수 챔버 또는 저장소(130), 측류 검출 스트립(110), 및 미세유체식 밸브(170) 및 미세유체식 유동 채널(170)이 당해 카드 위에 수용된다. 당해 미세유체식 카드(100)는 피펫으로 첨가하기 위한 또는 그 밖에 샘플을 카드에 적용하기 위한 입구(140)를 추가로 함유할 수 있다. 미세유체식 카드(100)는 본 발명의 일 태양에 따른 미세유체식 펌프 인터페이스 포트(interface port)(150)를 추가로 함유할 수 있다. 이들 인터페이스 포트(150)는 본원에서 추가로 기술되는 장비 시스템과 접속한다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 미세유체식 카드는 증폭 챔버(180)을 추가로 함유할 수 있다.
도 1b는 도 1a의 미세유체식 카드의 1B-1B 라인에 따른 단면도이다. 도 1b는 당해 카드의 두께 내에 당해 카드의 각종 구성요소의 위치를 예시한다. 미세유체식 유동 채널(170)은 당해 카드 내에서 다양한 높이로 위치하여, 밸브, 저장소 및 입구와 접속한다. 임의적인 도입구(140)가 연장되어 카드 표면의 외부로 개통된다. 저장소, 측류 스트립, 유동 채널, 밸브 등은 미세유체식 카드 내에 수용된다.
도 5는 미세유체식 카드(100)를 도시하는 또 다른 태양으로서, 이는 당해 카드 위에 막 또는 필터(120)를 함유한다. 또한, 당해 카드 위에는 폐수 챔버 또는 저장소(130), 측류 검출 스트립(110), 미세유체식 저장소(520, 522, 524, 526), 미세유체식 유동 채널(170), 및 증폭 챔버 또는 저장소가 함유된다. 미세유체식 저장소(520, 522, 524, 526)는, 예를 들어 시리즈 II 용해 용액, 효소 부존재 NASBA, 효소 함유 NASBA, 유도 용액, 검출 용액, 세척 용액 또는 기타 적당한 물질을 함유할 수 있다.
도 6은 본 발명의 원리에 따른 유체 샘플의 수집, 용해, 세척, 증폭 및 검출을 위한 여러 개의 독립적인 시스템을 함유하는 미세유체식 카드의 도식적인 구성예를 보여준다.
도 7a 및 7b는 미세유체식 카드(700) 내에 도입구(710)를 추가로 포함하는, 본 발명에 따른 미세유체식 카드(700)의 또 다른 예를 도시한다. 액체 샘플을 미세유체식 카드로 도입하기 위한 시린지(720)는 도 7b에 도시되어 있다. 달리, 피펫 또는 기타 적당한 장치가 사용될 수 있다. 일 태양에서, 시린지(720)에 대한 배출구(730)는 미세유체식 카드(700)의 도입구(740)와 일치하도록 배치된다.
BAC 카드는 본 발명의 일 태양에 따른 아래의 구성요소로 이루어 질 수 있다:
적층(Laminate Layer): 이들 층은 정해진 바 대로 당해 카드를 통한 조정된 유동을 용이하게 하기 위하여 미세하게 제조된 적층이다. 포개진 적층은, 크기가 약 3.25 인치 x 2.5 인치인 카드를 형성할 것이다. 카드 두께는 층의 수에 따라 달라질 것이다.
측류 스트립(lateral flow strip): 측류 스트립은 당해 카드의 적층 구조에 매몰되어, 표적 세포의 분리되어 증폭된 DNA의 검출을 용이하게 할 것이다. 하나의 예시적 검출 스트립은 두께가 1.25 mm(0.050 인치)이고, 폭이 약 2.5 내지 3.0 mm이고, 길이가 25 mm이다.
용액 저장소: 5개의 용액 저장소가 카드 위에 있어서, 사용자가 표적 DNA의 분리, 검출 및 증폭을 위한 용액을 카드 위에 피펫으로 가할 수 있다. 예시적 태양에서, 3개의 저장소가 최소 40㎕의 용액의 적재를 허용할 것이다. 2개의 저장소는 약 10㎕의 용액의 적재를 허용할 것이다.
폐수 저장소: 폐수 저장소는 상기 공정의 분리 및 증폭 단계 동안에 사용된 유체의 수집 및 수용을 가능하게 할 것이다. 예시적 태양에서, 폐수 저장소는 약 750㎕의 폐 용액을 수집할 것이다.
필터 막 모듈(Filter Membrane Module): 당해 필터 막 모듈은 샘플의 표적 세포를 수집(결합)하는데 사용된 필터 막을 함유하는 구성요소이다. 예시적 태양에서, 당해 모듈은, 당해 카드 상에서 수행되는 증폭 및 항온배양 전에, 100mL의 물 샘플의 여과를 가능케 할 것이다. 이러한 태양에서, 필터 물질은 두께가 0.17 mm (0.007 인치)이고 직경이 13mm인 나일론 막이다. 물 샘플을 여과한 후, 필터 막 모듈(FMM)은 여과 장치로 부터 제거되어, 추가 공정을 위해 1회용 카드 속에 삽입될 것이다.
미세유체식 카드의 수행성/ 혼화성 요건
예시적 태양에서, 미세유체식 카드의 한 가지 설계 목표는, 본 명세서에서 약술된 바와 같이 일련의 샘플 검정에 대한 당해 카드의 미세유체식 기능이 80% 신뢰도 보다 높은 95% 확신을 가지는 것이다.
초기설정 과정 및 검출 과정 동안에 모든 유체가 카드 위에 함유되어 남아 있도록 카드 작업이 이루어져야 할 것이다. 카드의 누출은 허용되지 않는다.
1회용 카드의 설계 및 제조에 사용된 물질은 다음과 조건을 가져야 한다:
○ 수성 유체가, 랩 카드의 성공적 기능에 실질적으로 영향을 미치는 기포 및 간극을 형성하지 않으면서 채널을 채울 수 있도록 해야 한다.
○ 표적 샘플의 여과, 증폭 및 판정에 사용된 용액 및 물질과 혼화성을 가져야 한다. 적층은 상기 용액에 의해 용해되거나 침식되어서는 아니되며, 노출 후 상기 유체를 시각적으로 탁하게 만들어서는 아니될 것이다.
○ 본 명세서의 열-순환 과정에서 약술된 항온배양 온도 및 노출 시간에 견딜 수 있어야 한다.
○ 표적 물질의 여과, 증폭 및 진단적 검출을 방해하는 성분을 삼출해서는 안된다.
상기 1회용 카드는, 표적 물질의 육안 검출을 판독하는 데 사용된 영역 내에서 시각적으로 투명해야 할 것이다.
당해 1회용 카드는, 열-순환 과정을 제외하고는 통상적인 실험실 조건 (10 내지 30℃ 및 5% 내지 90% 상대 습도) 하에서 사용될 수 있어야 하며, 해발 10,000 피트 이하에서 작동될 수 있어야 할 것이다.
당해 미세유체식 카드는 청결해야 하나, 멸균할 필요는 없을 것이다. 카드에는 입자, 및 여과, 증폭 및 검출을 방해하는 기타 오염물질이 부존재해야 할 것이다.
본 발명의 일 태양에 따른 제품 사양
장비 시스템의 설명
도 2에 도시된 바와 같은, 미세유체식 카드 상에서 유체를 지지하고 제어하는 장비는 충분히 작아서 휴대할 수 있다. 당해 장비는 미세유체식 카드와 접속되는 다기관(manifold)을 포함한다. SADD/S 장비는 컴퓨터에 의해 제어되는 플랫폼이다. 본 발명의 일 태양에 따르면, 당해 장비는 아래의 구성요소를 포함할 것이다:
다기관 어셈블리(Manifold Assembly): 당해 다기관은 진단 시험 동안에 사용되는 1회용 카드를 고정한다. 당해 다기관은 최적 수의 솔레노이드-작동 공기 밸브를 가지며, 이는 미세유체식 밸브로 전달되는 압력 및 진공을 제어하여 작업 도중 개방 및 폐쇄를 수행한다.
펌프 어셈블리(Pump Assembly): 4개의 250㎕의 펌프를 포함하는 펌프 어셈블리. 당해 펌프는 비-진동성 유동, 자가-개시성, 정밀 마이크로시린지-형의 펌프이다. 1회 최대 펌프 용량은 250㎕이고, 이때 최대 유속은 8㎕/초이고 최소 유속은 5 nl/초이다.
펌프 어셈블리 전자부품: 당해 펌프 어셈블리 전자부품은, 다기관의 최적 수의 공기 밸브 및 펌프를 작동시키는데 사용된 개개의 스테퍼 모터(stepper motor)를 제어하기 위한 모터 제어장치 하드웨어, 및 당해 시스템 전원장치를 함유한다.
시약 저장소: 상기 태양의 장비에는 2개의 저장소가 있다. 한 저장소는 필요한 세척 완충액을 함유한다. 다른 저장소는 플로우리너트(flourinert) 완충액을 함유한다.
시약 공급 라인: 당해 시약 공급 라인은 상기 장비의 작동 중에 사용되는 시약 보관 저장소에 연결된다.
진공/압력 밸브 제어장치: 상기된 태양에서 카드 위의 밸브는 공기식으로 작동한다. 진공/압력 밸브 제어장치는 컴퓨터-제어 전자 밸브의 어레이(array)로 구성되며, 이는 칩내(on-chip) 밸브가 진공 펌프 및 공기압 펌프를 수용하는 장치에 의해 공급되는 진공 또는 압력에 노출될 수 있도록 한다.
시리얼 포트(serial port): 시리얼 포트가 장비의 초기 실행에 사용될 것이다. 당해 포트는 장비 플랫폼과 마이크로프로세서 사이의 접속수단으로 사용된다.
수행성 요건
카드 삽입 시기 부터 시약 적재 후, 분리 및 결합 단계는 수 분 이하를 요구해야 한다. 열 순환(항온배양) 과정 후, 진단 시험은 수 분 이하를 요구해야 한다.
모든 구성요소가 통상의 실험실 조건(10 내지 30℃ 및 5% 내지 90% 상대습도) 하에서 사용될 수 있고 해발 10,000피트 이하에서 작동될 수 있도록, 상기 장비가 제작되어야 할 것이다. 상기 장비는 통상의 세제 및 검정 동안에 사용되는 용액에 대한 노출에 견딜 수 있어야 한다.
상기 장비의 신뢰도는, 당해 시스템이 서비스가 요구되기 전에 평균 100개의 카트리지를 수행할 수 있을 정도이어야 할 것이다. 매일 1회, 세정 과정을 수행하여, 펌프 어셈블리로 부터 공기를 제거해야 할 것이다. 세정 카트리지는 이러한 예방적 보수 단계를 위해 공급될 것이다.
PC를 포함하지 않는 상기 장비는 무게가 25 lbs 미만이고, 손에 휴대할 수 있도록 제작될 것이다.
호환성 요건
상기 장비는 아래의 사양을 갖는 PC와 호환가능해야 할 것이다: 최소 128 MB RAM을 가진 최소 펜티엄 또는 셀러론 333 MHz 최소 마이크로프로세서; 최소 1 G-바이트 하드 드라이브; 소프트웨어 설치용 CD ROM; 최소 1개의 시리얼 포트; 윈도우NT (서브스 팩 3.0 또는 그 이후), 윈도우 98, 윈도우 2000 또는 윈도우 ME의 운영 체계.
상기 장비는 pH 1 내지 13의 수성 유체에 적합해야 할 것이다. 펌프는 플루오리너트 추진기(fluorinert pusher) 유체 및 TRIS 세척 완충액과 적합해야 할 것이다. 상기 장비는 100-240 VAC 50/60 Hz의 전력 요건을 가지며, 2 15A 콘센트를 가진다. 상기 장비는 통상의 실험실 세제에 적합해야 한다.
소프트웨어의 설명
SADD/S 작동 소프트웨어는 사용자가 당해 장비를 제어하여, 당해 장비의 기능을 제어할 수 있도록 한다. SADD/S 작동 소프트웨어는, 동작 제어장치, 개인용 컴퓨터(PC), 카트리지 다기관 및 카트리지를 포함하는 완전한 장비 시스템의 구성요소이다.
상기 소프트웨어는, 유체의 펌핑을 제어하고, 카트리지 밸브 작동을 위해 진공 및 가압 공기를 제공하는 진공/압력 박스를 제어하기 위하여, PC 내의 오프-더-셀프(off-the-shelf) 동작 제어장치와 함께, 기존 동작 제어 시스템, 예를 들어 오이손(Oisson) 동작 제어 시스템과 접속할 것이다.
수행성 요건
SADD/S 작동 소프트웨어는, 그래픽 사용자 인터페이스(Graphical User Interface), RS232 케이블을 통한 동작 제어장치 또는 PC 컴퓨터 뒷면을 통한 오프-더-셀프 제어장치인 인터페이스, 및 사용자 안전성으로 이루어질 것이다.
SADD/S 작동 소프트웨어는 사용자가 모터 증폭기 보드로 관통하는, 동작 제어 시스템으로 부터의 시그날을 제어할 수 있도록 한다. 모터 증폭기 보드로 부터 펌프 상태 및 제어 시그날이 동작 제어 시스템으로 통과되면, 이때 사용자는 시스템 상태를 알게된다.
SADD/S 작동 소프트웨어는, 카드 밸브를 제어하는데 사용된 진공 및 가압 공기의 온/오프 제어를 추가로 제공한다. SADD/S 작동 소프트웨어는 전체 사용자에게 모든 요소의 제어를 제공한다. SADD/S 작동 소프트웨어는, 보수를 가능케 하는 키스트로크(keystroke)에 의해 이용가능한 숨겨진 장치내(in-house) 모드를 가질 수 있다.
호환성 요건
SADD/S 작동 소프트웨어는 아래의 사양을 갖는 PC와 호환가능해야 한다: 최소 128 MB RAM을 가진 최소 펜티엄 또는 셀러론 333 MHz 최소 마이크로프로세서; 최소 1 G-바이트 하드 드라이브; 소프트웨어 설치용 CD ROM; 최소 1개의 시리얼 포트; 윈도우NT (서브스 팩 3.0 또는 그 이후), 윈도우 98, 윈도우 2000 또는 윈도우 ME의 운영 체계.
SADD/S 작동 소프트웨어는 표준 I/0 및 모터 제어장치, 예를 들면 오이슨(Oisson) I/0 및 모터 제어장치와 호환가능해야 할 것이다. SADD/S 작동 소프트웨어는 오프-더-셀프(off-the-shelf) PC에 내재하는 모터 제어장치와 호환가능해야 할 것이다.
권고된 각종 호환성 요건
O/S는 긴급 정지 버튼을 명확하게 규정해야 할 것이다. O/S 메뉴 배치는 마이크로소프트 제품에 사용된 배치와 일치해야 할 것이다(좌측에 파일, 우측에 헬프, 등). 모든 콘트롤은 쉽게 조작될 수 있도록 충분히 커야 하여, 의도되지 않은 작동을 피하기 위하여 간격을 두어야 한다.
콘트롤 및 디스플레이의 상태는 흑백 스크린에서 식별될 수 있어야 할 것이다. 팝업 팁(pop-up tip)이 제공될 수 있을 것이다. 헬프 파일이 제공될 수 있을 것이다. 종종 사용되는 매뉴 아이템은 키스트로크로서 정해질 수 있을 것이다. 어떠한 메뉴 네스팅(menu nesting)도 두 개의 딥(deep)을 초과하지 않는다. O/S 사용자 스크린은 눈의 피로를 줄이기 위하여 칼라일 수 있다. 가능하다면, 사용자가 부정확한 값을 집어 넣거나 부정확한 제어를 작동시키지 못하도록 해야 할 것이다. 가능하다면, 최소 폰트 크기는 12 포인트일 것이다.
사용 및 작동
단일 분석물 진단 장치/시스템(SADD/S)의 한가지 의도된 용도는 수 중에서 이. 콜라이와 같은 세균의 존재를 결정하는 것이다. 여과된 물 샘플이 진단 카드 위에 도입되어지면, 그 곳에서 장치 시스템이 물 샘플로 부터 DNA를 분리하여 증폭시킬 것이다. 이어서, 증폭된 DNA를, 진단 판독에 사용되는 독점적인 측류 검출 스트립에 노출시킨다.
도 4a 및 4b의 흐름도 및 도 4c의 표 형태로 도시된 바와 같이, 당해 시스템의 작동은 다음과 같다:
사용자는 먼저 필터 모듈 및 여과 공정을 통하여 샘플을 포획한다. 필터 모듈은, 당해 모듈을 카드에 부착시키거나 또는 카드 내에 모듈을 제작하는 방법으로 1회용 진단 미세유체식 카드에 사용될 수 있다(참조 도 7a 및 7b).
샘플을 획득한 후, 사용자는 여과 장치로 부터 필터 모듈을 제거하여, 당해 모듈을 1회용 미세유체식 카드 속에 삽입한다. 달리, 필터 모듈 또는 막이 미세유체식 카드 내에 설치될 수 있다.
이어서, 사용자는 샘플을 함유하는 카드를, 막 위에 함유된 표적 물질의 진단 평가를 수행할 목적으로, 컴퓨터 제어 장비의 다기관 속에 삽입한다. .
장비 공정을 수행하기 전에, 사용자는 당해 장비가 최소량의 세척 완충액을 보유하는 지를 점검해야 한다. 이러한 세척 완충액은 각각의 시험 샘플이 수행되는 동안에 소비될 것이다.
진단 시험을 수행하기 전에, 사용자는 당해 장비가 펌프 2, 3, 및 4를 위한 최소량의 푸싱 완충액(pushing buffer) (통상적으로 플루오리너트(fluorinert))을 보유하는지를 점검해야 한다.
상기 공정을 개시하기 전에, 사용자는 당해 시험을 수행하기에 앞서 당해 카드 위에 아래의 용액을 피펫으로 가한다(로딩):
● 유도 용액: 20 내지 40㎕ (추정량)
● 시리즈 II 용해 용액: 20 내지 40㎕ (추정량)
● 효소를 함유하지 않는 NASBA 용액: 4 내지 40㎕ (추정량)
● NASBA 효소 용액: 4 내지 8㎕ (추정량)
● 검출 프로브 용액: 2.5 내지 5㎕ (추정량)
사용자는 당해 장비에 초기 설정을 하고, 런(RUN) 공정을 개시한다. 런(RUN) 공정은 세척 완충액, 유도 용액 및 검출 용액의 유동을 제어하는 유체식 단계를 개시시켜, 표적 DNA를 분리하고, 이를 필터 막 물질에 결합시킬 것이다. 예시적인 런(RUN) 공정이 도 3B에 도식화되었다. 유속 및 펌핑된 양은 표에 기재되어 있다. 런(RUN) 공정으로 부터의 모든 폐기물은 카드 위에 함유될 것이다.
런(RUN) 공정( 분리 및 결합 단계)을 완료한 후, 기술자는 DNA 시그날을 증폭하는데 사용되는 열 순환/항온배양 공정을 시작한다. 1회용 카드를 당해 장비 다기관으로 부터 제거하고 열 순환 공정을 시판용 열 순환기에서 마친다.
또 다른 태양에서, 열 순환기는 당해 장비의 일부가 아니며, 또 다른 태양에서, 당해 장비 다기관은, 기존의 시판용 열 순환기와 일치하고, 필요할 때마다 열 순환되어지는 동안에 당해 카드가 다기관에 보유될 수 있는 능력을 제공하도록 설계될 것이다.
도 8은 본 발명에서 사용되는 열 순환기의 일 태양을 도시한다. 도 8은 본 발명의 원리에 따른 가열기 블럭 내에 설치된 열 전달 로드(rod) 및 플레이트의 단면도이다. 도 8의 열 전달 시스템은 로드(810), 상기 로드 내의 온도 제어 센서 홀(820), Thermal-Lok 무수 욕조(dry bath) 가열기 블럭(850)을 포함한다. 로드(810)는 가열기 블럭(850) 속까지 연장된다. 플레이트(830)는 로드(810)를 둘러싸며, 실리콘 열 화합물(840)이 로드(810)와 가열기 블럭(850) 사이의 모근 간극을 메운다. 온도 제어 프로브(도시되지 않음)는 온도 제어 센서 홀(820) 속에 삽입되며, 열전쌍이 플레이트(830)에 연결되고, 당해 압반의 상단의 표면 온도를 모니터한다. 로드(810)과 플레이트(830)는 황동 또는 기타 임의의 열 전도성 물질로 제조될 수 있다. 도 9는 본 발명의 원리에 따른 절연체 어셈블리 및 압반 어셈블리의 단면도이다.
도 10 내지 14는 상기된 열 순환기에 관한 본 발명의 원리를 설명해주는 그래프이다. 도 10은 본 발명의 원리에 따른 시스템을 가열하는 시간 대 온도의 그래프이다. 도 11은 본 발명의 원리에 따른 시간 대 온도의 그래프이다. 도 12는 본 발명의 원리에 따른 시간 대 온도의 그래프이다. 도 13은 본 발명의 원리에 따른 시간 대 온도의 그래프이다. 도 14는 본 발명의 원리에 따른 시간 대 온도의 그래프이다.
열 순환 공정은 아래와 같은 것으로 확인된다:
열 순환 공정 후, 사용자는 검출 공정 단계를 위해 상기 장비에 카드를 다시 설치한다. 이는 채널을 측류 검출 스트립으로 개통시키고, 세척 완충액을 막을 통해 펌핑할 것이다. 이는 검출 스트립을 검출용 화학 제품에 노출시킬 것이다.
적절한 노출 시간 후, 사용자는 측류 검출 스트립을 판독하여, 표적물의 존재 또는 부존재를 결정한다.
검출 스트립을 판독한 후, 카드를 당해 장비로 부터 제거하여 폐기한다. 샘플로 부터의 모든 폐기물이 카드 위에 함유될 것이다.
단일 분석물 진단 장치/시스템(SADD/S)의 또 다른 용도는 소변으로 부터 성-매개된 질환의 존재를 결정하는 것이다. 소변 샘플을 진단 카드에 도입하여, 그곳에서 당해 장치 시스템이 소변으로 부터 DNA를 분리하고 증폭시켜, 성-매개된 질환을 검출한다.
아래의 실시예는 설명을 위하여 제공된 것이지, 본 발명을 어떤식으로도 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
Thermal- Loc 무수 욕으로 부터 마이크로닉스 적층으로의 열 전달을 시험하는 카드/다기관
목표:
Thermal-Lok 무수 욕(Dry-Bath) 열판으로 부터 미세유체식 적층에 대한 국소 계면으로 열을 전달하는 효율 및 방법을 결정한다.
Ｏ 적층물을 마이크로 하이드로 매니폴드(MHM: Micro Hydro Manifold)에 의해 유지시킨다.
Ｏ 적층물의 작은-국소 영역으로 열을 전달한다. 온도는 60℃ 내지 95℃이다. 카드의 나머지를 가능한 한 열로 부터 격리시킨다.
Ｏ 온도를 가능한 한 적층물과 유사하게 제어한다.
Ｏ 마이크로 하이드로 매니폴드(MHM) 및 이의 설치 플랫폼을 열원으로 부터 격리시키여 한다.
요약:
4 mil의 적층을 통해 제어된 방식으로 열을 전달할 수 있는 능력이 명백히 수득될 수 있다. 가장 우수한 결과는, "습윤" 실리콘 열전달 그리스(thermal grease)을 사용하여 폴리에스테르 표면을 황동에 커플링시킴으로써 달성된다. 추가 시험을 수행하여, 사용되는 크기의 습윤 유체-충전된 챔버의 온도를 확립해야 한다. 본 발명자들의 과거의 경험에 의하면, 상기 액체가 마이라(Mylar) 보다도 훨씬 우수하게 열을 전도하고 상기와 같이 소량에 대한 열 확산이 거의 균일한 온도를 허용하기 때문에, 상기 온도는 바닥의 폴리에스테르 온도를 매우 근사하게 따른다. 시험은 이를 확인할 수 있다.
권고:
Thermal-Lok 무수 욕이 DNA 증폭 및 DNA의 탈쇄(de-stranding)를 위한 온도 공급원으로서 사용될 수 있다.
장치:
● 외부 온도 제어 프로브가 구비된 Thermal-Lok 무수 욕.
● USA Scientific Inc.
● Fluke 52 온도계
● 마이크로닉스 미세유체식 카드 위에 설치된 .005 직경의 K형 열전쌍. .004 Mylar에 의해 피복됨.
● Thermolink 1000 실리콘 열 접합(Thermal Joint) 화합물(P/N 000006 AAVID Thermal Technology Inc. Laconia NH).
● 황동 열 로드 및 절연체 플레이트. 계면 직경 .250".
●마이크로 하이드로 매니폴드
●절연된 압반
수행된 시험
● 당해 시스템을 가열시키는 총 시간.
○ 가열기의 온도.
○ 적층물 말단에서의 열 전달 로드의 온도.
○ 적층물의 온도.
○ 압반의 온도.
○ 압반의 최대 온도.
○ 작동 온도로 예열된 시스템으로 적층물을 가열하는 시간. 적층물을 가열기 위에 놓아 시험을 개시한다.
○ 무수 접촉 계면.
○ "습윤" 실리콘 화합물 계면.
○ 로드 상의 실리콘 엘라스토머.
○적층물 상의 실리콘 엘라스토머
설정:
황동 열 전달 로드를 Thermal-Lok 무수 욕 열판(Dry-Bath heat plate) 내의 구멍 중의 하나에 맞도록 제조하였다. 열 전달이 보다 효율적일 필요가 있다는 것이 결정된 후, 전체 가열기를 피복하는 편평한 황동 플레이트를 열 전달 로드에 납땜하였다.
상기 로드의 최고 직경은 .250"이고, 이의 측면에 온도 제어 프로브를 위한 작은 구멍이 있다. 또한, 상기 로드는, 다기관 및 카드의 나머지를 보호하는 절연체 플레이트를 위한 공간을 제공하기에 충분히 길다.
당해 압반 절연체 물질은 폴리스티렌이다. MHM(마이크로 하이드로 매니폴드)를 유지하는 당해 압반 상단 플레이트를 절연성 물질을 사용하여 제조한다.
열 전달 로드 및 절연체의 자세한 사항은 도면을 참조한다.
계속적인 데이터:
센서 프로브의 열 전달 로드와 적층물 사이의 온도 차이인 델타 온도는, 본 발명자들이 상당량의 열을 계면에서 손실한다는 것을 보여준다. 샘플을 개방 룸(room)에서 30초 마다 기록하였다. 카드를 피복하고, 주위 실온 변동을 막기 위하여 황동-가열 로드로의 기류 경로를 차단하고, 기류가 결과에 영향을 주는 것을 차단함으로써 약간의 개선이 얻어질 수 있다.
"습윤" Thermolink 1000 화합물은 가장 작은 델타 온도로 나타난 바와 같이 가장 효율적이다. 이는 카트리지에 넣기 전에 적용해야 한다는 관점에서 다소 귀찮을 수 있으나, 예비적 실현가능성 시험에 대하여는 괜찮다.
엘라스토머가 무수 접촉에 비해 우수하다. 전자부품용 열 싱크 패드(sink pad)로서 사용되는, 쉽게 이용가능한 여러 유형이 있다. 이러한 패드는 적층물 위 또는 내에, 또는 로드 말단 위에 설치될 수 있다. 이러한 적용의 최상을 결정하기 위하여, 상이한 물질을 사용하여 추가 시험을 수행할 수 있다.
델타 온도는, 온도 변동을 허용하는 가열기와 적층물 변화사이의 변동을 커플링할 가능성을 제거하므로, 중요한 측정치이다. 그러나, 다른 중요한 파라미터는 온도 안정성이다. 샘플의 표준 편차, 및 가열기와 카드를 커플링한 후 4분째에 시작되는 델타 온도를 계산하고 상기 표에 나타냈다. 4 경우 중 3 경우에서, 폴리에스테르 온도가 실제로 로드 온도 보다 안정적이였다. 델타 표준 편차에 주목하여 제어된 로드 내의 변동을 팩토링(factoring)함으로써, 모든 경우에서, mylar 온도의 변동이 로드 온도와의 상이한 정도 보다 덜하다는 것이 명백해졌다. 만일 로드 온도가 잘 제어된다면, 폴리에스테르 온도도 역시 안정적일 것이다.
모든 커플링 방법이 충분히 안정한 것으로 보이지만, 명백히 "습윤" 실리콘 화합물 커플링이 가장 우수하게 제어되며, 황동 정점 내의 설정 온도에 가장 근사하다.
주의:
열 전달 로드 말단의 크기는 적층물 유체 챔버의 크기에 대한 대략적인 추측을 토대로 하였다. 따라서, 보다 작거나 큰 계면 면적이 열 전달 속도에 영향을 줄 것이다.
로드 상의 실리콘 패드로 부터의 데이터는, 폴리에스테르 온도에서는 나타나지 않는 온도의 감소를 나타낸다. 이 경우에, 가열기 로드 내의 열전쌍의 접촉이 이동되어, 덜 효과적인 열 접속을 만들 수 있다고 추측된다.
또한, 적층물 내에 박혀 있는 열전쌍은 그 뒤에 고체 Mylar가 있다는 점에 주의해야 한다. 이는 "챔버" 내에서 온도를 측정하는 것이 아니라, 가열기 표면의 .004" 위의 적층물의 온도를 측정하는 것이다.
공정:
모든 펌프의 경우:
1) 샘플을 피펫을 사용하여 저장소에 충전시킨다. (V3, V4 밸브는 폐쇄되는 반면, V5 밸브는 개방된다)
2) "A" 증폭 챔버를 충전시킨다. (V4, V5 밸브는 폐쇄되는 반면에, V3 밸브는 개방된다)
3) "B" 증폭 챔버를 충전시킨다. (V3, V5 밸브는 폐쇄되는 반면에, V4 밸브는 개방된다)
4) 카드를 특별히 설계된 가열기 블럭에 놓는다.
5) A와 B 증폭 챔버를 교대시키면서, 펌프를 앞 뒤로 느린 속도(약 10μL 이동)로 진동시킨다.
6) 90 분 후, 가열에 의해 증폭 혼합물을 피펫 제거를 위한 출구로 이동시킨다.
본 명세서에서 언급되고/되거나 본 출원 데이터 시트 상에 기록된 모든 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 및 비-특허 문헌은 참조로서 본원에 이들의 전문이 인용된다.
비록 본 발명의 구체적 태양이 설명을 위하여 기재되었지만, 전술한 내용으로 부터, 각종 변형이 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서 가해질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의한 경우를 제외하고는 제한되지 않는다.
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 2003년 1월 2일에 출원된 미국 임시 특허 출원 제60/441,906호 및 2003년 1월 2일에 출원된 제60/441,873호(상기 두 출원은 모두 본원에 참조로서 이의 전문이 인용된다)의 이익을 주장한다.

Claims (24)

  1. 미세유체식 카드에 유체 샘플을 로딩하고;
    당해 유체 샘플을 용해시켜, 유체 샘플의 성분을 분리하고;
    분리된 성분을 고체 기판 상에 포획시키고;
    분리된 성분을 세척 완충액으로 세척하고;
    세척된 성분을 증폭 챔버 내에서 증폭 온도 프로필로 증폭시키고;
    증폭된 성분을 검출용 측류 스트립(lateral flow strip)으로 펌핑(pumping)함을 포함하는, 유체 샘플의 미세유체식 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분리된 성분이 세균인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 세척 단계가 핵산을 제거하여, 세척된 성분의 증폭의 방해를 방지함을 포함하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 세균이 에쉬체리키아 콜라이, 스타필로코쿠스 아우레우스, 슈도모나스 아에루기노사, 살모넬라 종, 스타필로코쿠스 에피더미디스, 클레브시엘라 뉴모니애, 엔터로박터 클로아새, β-스트렙토코쿠스, 세라티아 마르세스센스, 및/또는 바실러스 세레우스인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 분리된 성분을 DNA 프라이머로 프리이밍(priming)시킴을 추가로 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 펌핑 단계가 측류 스트립 상에서 세균 DNA의 존재를 육안으로 검출함을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 미세유체식 카드를, 당해 카드를 통해 유체 샘플을 펌핑하기 위한 장비의 다기관(manipold)과 접속시킴을 추가로 포함하는 방법.
  8. 유체 샘플을 수집하고;
    표적 세포 물질이 막 위에 보유되어 있는 막 모듈을 통해 유체 샘플을 여과하고;
    표적 세포 물질이 막 위에 잔류하도록 세척 완충액을 막에 통과시키고;
    유도 용액을 막에 통과시키고;
    용해 용액을 막에 통과시키고;
    세척 완충액을 막에 통과시켜 막으로 부터 용해 용액을 세척하고;
    제1 NASBA 용액을 막에 통과시키고;
    세척 완충액을 막에 통과시켜 막으로 부터 제1 NASBA 용액을 세척하고;
    제2 NASBA 용액을 막에 통과시키고;
    세척 완충액을 막에 통과시켜 막으로 부터 제2 NASBA 용액을 세척하고;
    검출 용액을 막에 통과시키고;
    세포 물질의 열-순환에 의해 RNA 시그날을 증폭시키고;
    막으로 부터 검출 프로브 용액을 세척하고;
    RNA의 육안 검출을 위해, 세척된 검출 프로브 용액을 측류 스트립에 노출시킴을 포함하여, 미세유체식 카드 상에서의 유체 샘플의 미세유체식 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서, 막 모듈을 여과 장치로 부터 제거하고 미세유체식 카드 속에 삽입하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 유도 용액을 카드 상에 피펫으로 가하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 제2 NASBA 용액이 효소를 포함하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 미세유체식 카드를, 당해 카드를 통하여 유체를 펌핑하기 위한 유체식 장비의 다기관과 유체를 통해 접속시키는 방법.
  13. 제9항에 있어서, 미세유체식 카드를 다기관의 유체 접속으로 부터 제거하여, RNA 시그날의 증폭을 위해 열전쌍장치(thermo-coupler)에 분리가능하게 연결시키는 방법.
  14. 서로 연결된 유동 채널, 밸브, 저장소, 도입구, 필터 막 및 열전쌍장치, 및 당해 카드 내에 함유되어 있으며, 세균의 DNA 또는 RNA의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 측류 검출 스트립을 가진 1회용 진단 미세유체식 카드; 및
    미세유체식 카드와 유체로 커플링하기 위한 다기관을 가진 장비로서, 당해 1회용 카드 상에서 유체 유동을 제어하는 장비
    를 포함하는, 검정물의 미세유체식 분석용 시스템.
  15. 제1 면 및 제2 면을 갖는 기판(이때, 제1 면과 제2 면 사이에는 유동 채널이 함유되어 있으며, 당해 유동 채널은 상류 말단 및 하류 말단을 갖는다);
    제1 면을 통해 연장되어 도입구 유동 채널에 유체로 연결된, 제1 유체 샘플을 수용하기 위한 도입구;
    도입구 유동 채널의 하류에 위치한 필터 (당해 필터의 하류에서 제1 및 제2 유동 채널이 필터와 유체에 의해 연결되고, 당해 필터가 제1 유체를 입자가 부존재하는 유체와 입자를 함유하는 유체로 분리하여, 입자가 부존재하는 유체는 제1 유동 채널로 들어가고, 입자를 함유하는 유체는 제2 유동 채널로 들어간다);
    제1 유동 채널과 유체에 의해 서로 연결되어 있고, 제2 유체를 수용하기 위한 입구가 있는 혼합 챔버;
    혼합 챔버에 열에 의해 커플링된, 혼합 챔버를 가열하는 가열기;
    혼합 챔버에 유체에 의해 연결된 분리 장치; 및
    상기 분리 장치에 유체에 의해 연결되어 있으며, 제3 유체 샘플을 수용하기 위한 도입구를 포함하고, 추가로 검정 결과를 육안으로 해석하기 위한 도입구 하류의 투명한 창을 포함하는 인디케이터 유동 채널
    을 포함하는 항글로불린 검정물의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 제1 유체가 혈액인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  17. 제15항에 있어서, 입자가 부존재하는 유체가 혈장인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  18. 제15항에 있어서, 제2 유체가 시약, 적혈구, 및 SI 및 SII로 명명된 희석된 적혈구를 포함하는 혼합물인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  19. 제15항에 있어서, 제3 혼합물이 항글로불린 혈청인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  20. 제15항에 있어서, 가열기가 전기 저항자인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  21. 제15항에 있어서, 필터가 확산-이용 필터인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  22. 제15항에 있어서, 필터가 접선(tangential) 유동 필터인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  23. 제15항에 있어서, 필터가 침강 필터인, 항글로불린의 유형을 결정하기 위한 미세유체식 시스템.
  24. 적혈구와 혈장을 확산에 의한 분리로 미세유체식으로 분리하고;
    적혈구로 부터 혈액 단백질을 제거하고;
    적혈구를 염수로 희석하고;
    희석된 적혈구를 3개의 분획으로 나누어서, 제1 분획을 항-A와 반응시키고, 제2 분획을 항-B와 반응시키고, 제3분획을 항-D와 반응시키고;
    상기 혈장을 2개의 분획으로 나누어서, 혈장의 제1 분획을 A1과 반응시키고, 혈장의 제2 분획을 B 적혈구와 반응시키고;
    반응을 육안으로 해석함을 포함하여, 혈액의 유형을 미세유체식으로 결정하는 방법.
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