KR20050105313A - A fermentated drink from bifido and yeast, and its process - Google Patents
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Abstract
본 발명은 찹쌀가루의 증류수 상층액, 쌀엿, 유청 및 유당의 혼합가공물에 식용 비피더스균 및 식용 효모균을 접종하여 순차적 또는 동시 혼합 배양한 발효음료로써 생균의 안정성이 높으면서 면역 기능을 증가시켜주는 여러가지 생리활성 물질을 함유한 비피더스-효모 발효음료 및 그의 제조방법이다.The present invention is inoculated with edible bifidus bacteria and edible yeasts in a mixed process of distilled water supernatant, glutinous rice flour, whey and lactose of glutinous rice flour and fermented beverages in sequential or simultaneous mixing culture to increase the stability of live bacteria and increase immunity. Bifidus-Yeast Fermented Beverage Containing Active Material and Method for Making the Same.
Description
본 발명은 인체에 유익하다고 입증된 식용 비피더스 및 효모균을 순차적 또는 동시혼합 배양하여 이들 균 특히, 비피더스균의 안정성을 확보함으로써 면역기능 증가에 충분한 비피더스와 효모 균수 및 생리활성물질을 함유하는 발효음료 및 그 제조방법에 관한 것이다. The present invention is a fermentation beverage containing bifidus and yeast bacteria and physiologically active substances sufficient to increase the immune function by sequential or co-mix culture of edible bifidus and yeast bacteria proved to be beneficial to the human body to ensure the stability of these bacteria, in particular, bifidus bacteria and It relates to a manufacturing method.
비피더스균은 모유 영양아의 분변에서 최초로 발견된 이후 여러 연구결과를 통해 유해세균의 장내 증식을 억제하며, 세균성 질환에 대한 예방능력을 보유하는 것으로 널리 알려져 있다. 또한 항암, 항종양 효과, 혈중 콜레스테롤함량의 저하 및 정장 효과와 같은 비피더스균의 다양한 생리활성이 보고되고 있다. Bifidobacteria has been widely known to inhibit intestinal proliferation of harmful bacteria and to prevent bacterial diseases since it was first discovered in fecal breast milk. In addition, various physiological activities of Bifidobacteria have been reported, such as anticancer, antitumor effect, lowering blood cholesterol content and intestinal effect.
효모는 식품을 포함한 다양한 산업분야에서 이용되고 있으며, 최근에는 효모 세포벽의 주성분인 글루칸이 세균, 바이러스 및 각종 감염질환에 대해 저항력을 길러주고 면역세포를 활성화시킨다는 연구결과가 발표되었다. 이 외에도 비타민 B군, C, E를 비롯한 미네랄류, 식이섬유질등이 들어있어 다양한 영양성분을 균형있게 공급할 수 있다는 것이 알려지면서 식품첨가제로서의 활용도가 높아지고 있다. Yeast is used in a variety of industries including food, and recently, studies have shown that glucan, the main component of the yeast cell wall, increases resistance to bacteria, viruses, and various infectious diseases and activates immune cells. In addition, vitamin B group, C, E and other minerals, dietary fiber, etc. are known to be able to supply a variety of nutrients in a balanced manner as the utilization of food additives is increasing.
위와같은 다양한 생리활성 기능을 가진 비피더스균과 효모를 식품산업에 이용하는 사례가 증가하고 있지만 실제로는 위장과 소장에서 분비되는 소화효소 및 담즙산에 의해 살아있는 상태로 대장에 도달하는 경우가 드물고, 다행히 장을 통과하더라도 균의 활성이 낮아져 장내 정착율이 저하된다는 점이 지적되어왔다. 또한제품으로 출시되었을 경우 유통기한이 짧고 초기의 생균수를 유지하지 못하고 생균이 거의 사멸된 상태에서 섭취하게 되어 그 효과를 기대하기 어려웠다.Increasingly, Bifidobacteria and yeasts with various physiologically active functions are being used in the food industry, but in reality, the intestines are rarely reached by the digestive enzymes and bile acids secreted by the stomach and small intestine. It has been pointed out that even if passed, the activity of the fungus is lowered, thereby lowering the intestinal fixation rate. In addition, when it is released as a product, the shelf life is short, it is difficult to maintain the initial viable count, and it is difficult to expect the effect because it is consumed in a state where the viable bacteria are almost killed.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고, 음료에 함유된 생리활성물질뿐 아니라 생균이 살아있는 상태로 장내에 도달하는 확률을 높이는 것은 물론 장내에서도 계속 발효를 촉진하여 면역기능을 촉진하기 위한 적당한 탄소원 (유당,맥아당)과 질소원 (유청에 함유된 단백질 및 발효과정에서 생성된 부산물) 및 충분한 물을 제공하여 면역기능을 증가시킬 수 있는 발효음료와 그 제조방법을 제공함에 목적이 있다. The present invention solves the above problems, and increases the probability of reaching the intestine in the living state as well as the bioactive substances contained in the beverage, as well as to promote the fermentation in the intestine, a suitable carbon source for promoting immune function ( It is an object of the present invention to provide a fermented beverage and a method for producing the same, which provide an increase in immune function by providing lactose and maltose) and a nitrogen source (proteins contained in whey and by-products generated during fermentation) and sufficient water.
본 발명은 비피더스-효모 혼합 발효음료 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 찹쌀가루의 증류수 상층액에 쌀엿, 유청 및 유당을 첨가하고 가열멸균, 냉각 후 비피더스균 (Bifidobacterium longum) 및 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)을 순차적 또는 동시에 혼합접종하고, 혐기성 배양 및 호기성 배양 후 안정제로 유당을 첨가한, 알코올 및 방부제를 함유하지 않은, 면역기능 증가작용을 갖는 비피더스-효모 발효음료와,The present invention relates to a bifidus-yeast mixed fermented beverage and a method for preparing the same, and more specifically, to a distilled water supernatant of glutinous rice flour, rice starch, whey and lactose are added and heat sterilized, followed by Bifidobacterium longum and yeast ( Bifidus-yeast fermented beverage having an immune function-increasing effect, containing no alcohol and preservatives, mixed with saccharomyces cerevisiae ) sequentially or simultaneously with lactose as a stabilizer after anaerobic and aerobic culture,
찹쌀가루의 증류수 상층액에 쌀엿, 유청 및 유당을 첨가하고 가열멸균, 냉각후 비피더스균 (Bifidobacterium longum) 및 효모균 (Saccharomyces cerevisiae)을 순차적 또는 동시에 혼합접종하고, 혐기성 배양 및 호기성 배양 후 안정제로 유당을 첨가하는, 알코올 및 방부제를 함유하지 않은, 면역기능 증가작용을 갖는 비피더스-효모 발효음료의 제조방법이다.Add rice starch, whey and lactose to the distilled water supernatant of glutinous rice flour, and heat-sterilize, mix and inoculate Bifidobacterium longum and yeast ( Saccharomyces cerevisiae ) sequentially or simultaneously with lactose as a stabilizer after anaerobic and aerobic culture. It is a manufacturing method of the bifidus-yeast fermented beverage which has an immune function increasing action which does not contain alcohol and a preservative which are added.
본 발명에 의한 비피더스-효모 혼합 발효음료의 제조방법에 대해 더욱 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 증류수에 찹쌀가루를 첨가하여 충분히 교반하고 방치한 후 침전물을 제거한 상층액에 쌀엿, 유청 및 유당을 첨가하여 가열멸균하여 냉각시킨다. 여기에 비피더스균 및 효모균을 원심분리하여 세척한 것을 순차적 또는 동시 혼합접종하고 혐기성 배양 및 호기성 배양 단계를 거쳐 안정제로 유당을 첨가하면 알코올 및 방부제를 함유하지 않은 발효음료를 제조할 수 있다.Referring to the method of manufacturing the bifidus-yeast mixed fermented beverage according to the present invention in more detail as follows. Glutinous rice flour is added to distilled water, and the mixture is sufficiently stirred and left to stand. Then, rice starch, whey and lactose are added to the supernatant from which the precipitate is removed, followed by heat sterilization and cooling. Here, centrifuged and washed with bifidus and yeast, sequential or simultaneous inoculation and the addition of lactose as a stabilizer through the anaerobic and aerobic culture step can be prepared a fermented beverage containing no alcohol and preservatives.
상기 비피더스균은 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) KCTC 3128, 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) KCTC 3421 또는 비피도박테리움 롱검 (Bifidobacterium longum) KCTC 3466 균중에서 선택사용하고, 효모균은 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7928, 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7238, 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7906 또는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7919 균중에서 선택사용하며, 이들은 모두 공지의 균주로 KCTC를 통해 구입가능하며, 쌀엿, 유청(whey) 및 유당등은 기존 유제품등에 널리 사용되는 상품으로 구입이 가능하다.The Bifidobacterium strain is selected from among Bifidobacterium longum KCTC 3128, Bifidobacterium longum KCTC 3421 or Bifidobacterium longum KCTC 3466, and the yeast bacterium Saccharomyces cerevisiae KCTC 7928, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7238, Saccharomyces cerevisiae KCTC 7906 or Saccharomyces cerevisiae Selected and used among the KCTC 7919 bacteria, these are all known strains can be purchased through KCTC, rice syrup, whey and lactose can be purchased as a widely used product in the existing dairy products.
유청은 유당, 수분 5.0 % 이하, 조단백 11.0 % 이상 조지방 3.0 ~ 8.0 %, 회분 8.0 % 이하로 조성된 상품을 사용한다. Whey uses products formulated with lactose, water 5.0% or less, crude protein 11.0% or more, crude fat 3.0-8.0%, and ash 8.0% or less.
본 발명의 음료에 사용하는 효모추출물 (yeast extract)은 발효 과정에서 생산되는 부산물을 사용함으로써 건조, 멸균 등의 과정이 불필요하므로 기존의 시판 추출물을 사용하는것에 비해 비피더스에 대한 보호 작용이 훨씬 우수하다.Yeast extract (yeast extract) used in the beverage of the present invention by using the by-products produced during the fermentation process is not necessary to dry, sterilization, etc. It is much better protection against bifidus than the conventional commercial extract. .
비피더스균, 효모균 및 이들의 추출물을 함유한 생리활성물질에 의한 면역기능 증가등 인체에 유익한 여러가지 효과를 얻기 위해서는 이미 알려져 있는 것과 같이 제품의 안정성을 확보하는 것이 중요하다. It is important to secure the stability of the product as already known in order to obtain various effects beneficial to the human body such as increased immune function by the bifidus bacteria, yeasts and bioactive substances containing their extracts.
본 발명에 따라 제조된 본 발명의 발효음료는 각각 107 cfu/㎖ 이상의 생균수를 3 개월간 유지할 수 있는 것으로 나타나 기존의 유산균 발효음료의 유통기한이 7 일 이내이면서 생균수 106 cfu/㎖를 유지하는 것과 비교할 때 안정성이 뛰어나다고 할 수 있다. 또한 본 발명의 비피더스-효모 혼합 발효음료는 마우스 면역기능 시험에서 대조군, 본 음료의 침전물, 본 음료의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 또는 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 비장세포의 Con A 와 LPS에 대한 증식반응,비장세포와 복강 대식세포의 임파종양세포에 대한 세포활성이 현저한 증가를 나타내어 T, B 임파세포의 기능이 현저히 증가되었을 뿐만 아니라 흉선 및 비장의 중량 증가도 현저한 차이를 보여주어 임파양기관의 세포량도 증가되는 것으로 나타났다.The fermented beverages of the present invention prepared according to the present invention were able to maintain a viable cell number of 10 7 cfu / ㎖ each for three months, so that the expiration date of the existing lactic acid bacteria fermented beverages within 10 days of 10 6 cfu / ㎖ Compared to maintaining, the stability is excellent. In addition, the bifidus-yeast mixed fermented beverage of the present invention is administered after the fermentation of the control, the precipitate of the beverage, the supernatant of the beverage, the bifidus-only fermented beverage, the yeast-only fermented beverage, or the bifidus and yeast alone in the mouse immune function test. The proliferative response of the splenic cells to Con A and LPS and the cell activity of the splenocytes and the peritoneal macrophages to the lymphoma cells were markedly increased than the one group, which not only increased the function of T and B lymph cells but also the thymus and spleen In addition, the increase in weight showed a significant difference, indicating that the amount of lymphoid organs increased.
본 발명의 음료는 안정성실험 결과와 면역기능 증가실험 결과를 종합하여 분석할 때, 기존의 효모 발효식품 또는 비피더스 식품보다 보존기간 중 안정성이 높아졌을 뿐만 아니라 함유된 생리활성물질과 생균이 살아있는 상태로 장내에 도달하는 확률을 높여 면역기능을 촉진시킨 것으로 해석된다.When the beverage of the present invention is analyzed by combining the stability test results and the immune function increase test results, the stability is higher than the conventional yeast fermented food or bifidus food during the storage period, as well as containing the bioactive substances and live bacteria It is interpreted that it promotes immune function by increasing the probability of reaching the intestine.
본 발명의 음료는 제제학적으로 허용가능한 부형제, 안정제, 교미제, 보존제, 완충제 또는 다른 적당한 첨가제를 포함할 수 있다. Beverages of the present invention may include pharmaceutically acceptable excipients, stabilizers, copulation agents, preservatives, buffers or other suitable additives.
본 발명의 음료는 성인기준 일일 100~150 ㎖씩 수회 음용이 가능하며, 이는 음료수나 물대신 마시는 제품으로 개발된 것이어서 일반음료수의 복용법과 유사하다. The beverage of the present invention can be drunk several times daily by adult 100 ~ 150 ㎖, which is similar to the method of taking general beverages because it was developed as a product to drink instead of drinking water or water.
본 발명을 구체적으로 이해하고 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실시예로 나타내었다. 하기 설명한 실시예는 식용 비피더스 (Bifidobacterium)와 효모 (Saccharomyces)의 순차적 또는 혼합 발효생산에 의한 기능성 음료에 관한 것으로, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것에 지나지 않으며, 따라서 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.In order to understand the present invention in detail and to examine the effects are shown in the following Examples. To be mentioned embodiment relates to a functional drink by sequentially or mixed fermentation production of edible bifidobacteria (Bifidobacterium) and yeast (Saccharomyces), not merely exemplifying in order to help the understanding of the present invention, therefore, carried out in the range of the invention these It is not limited to the example.
실시예 1 : 음료의 제조방법 Example 1 preparation of beverages
1) 증류수 500 L에 500 g의 찹쌀가루를 첨가하여 충분히 교반하고 30 분간 방치한 다음 침전물을 제거하고 상층액을 배양 탱크에 옮긴다. 쌀엿 5 L, 유당 2 kg 및 유청 2 kg을 첨가하여 121 ℃에서 15 분간 가열멸균하고 냉각시켜 조제한 혼합물에 식용 비피더스균 (Bifidobacterium longum KCTC 3128) 및 효모균 (Saccharomyces cerevisiae KCTC 7928)을 순차적 (한가지 균을 먼저 접종하여 배양을 시킨 다음 다른 균을 접종하여 배양하는 방법) 또는 동시 혼합 접종하여 혐기조건에서 3 일간 배양한 후 다시 호기조건에서 3 일간 더 배양한다. 안정제로 농축 유당을 최종 농도 0.5 %가 되도록 첨가하여 제조된 배양물을 본 발명의 발효음료로 하며, 발효음료 A로 표시한다.1) Add 500 g of glutinous rice flour to 500 L of distilled water, stir it sufficiently, let stand for 30 minutes, remove the precipitate and transfer the supernatant to the culture tank. 5 L of rice starch, 2 kg of lactose and 2 kg of whey were added to the mixture prepared by heat sterilization and cooling at 121 ° C. for 15 minutes, followed by edible Bifidobacterium longum KCTC 3128 and yeast ( Saccharomyces cerevisiae KCTC 7928). First, inoculate, incubate, and then inoculate other bacteria, and incubate at the same time. A culture prepared by adding concentrated lactose to a final concentration of 0.5% as a stabilizer is used as a fermented beverage of the present invention, and is represented by fermented beverage A.
2) 이어서, 발효음료 A를 3,400 rpm 에서 30 분간 원심분리하여 얻어진 상층액과 침전물을 분리하여, 발효음료 A 상층액 및 발효음료 A 침전물이라 하였으며, 발효음료 A 상층액은 주로 균의 대사물질을 함유하며, 침전물은 주로 생균을 함유한다. 2) Subsequently, the supernatant and precipitate obtained by centrifuging the fermented beverage A for 30 minutes at 3,400 rpm were separated. The fermented beverage A supernatant and the fermented beverage A precipitate were referred to as the fermented beverage A supernatant. The precipitate contains mainly live bacteria.
3) 증류수 5 L에 5 g의 찹쌀가루를 첨가하여 충분히 교반하고 30 분간 방치한 다음 침전물을 제거하고 상층액을 배양 탱크에 옮긴다. 유당 20 g 및 유청 20 g을 첨가하여 121 ℃에서 15 분간 가열멸균하여 조제한 혼합물에 식용 비피더스 (Bifidobacterium longum KCTC 3128)만 단독 접종하여 (단 접종 비례는 발효음료 A 보다 1 배 더 접종함) 3 일간 혐기배양하고 안정제로 농축 유당을 최종 농도 0.5 %가 되도록 첨가하고, 효모추출물 (yeast extract) 농축액을 최종 농도 0.3 % 가 되도록 첨가하여 제조된 배양물을 발효음료 B로 하며, 실험 대조에 사용한다.3) Add 5 g of glutinous rice flour to 5 L of distilled water, stir it sufficiently, leave for 30 minutes, remove the precipitate and transfer the supernatant to the culture tank. 20 g of lactose and 20 g of whey were added to the mixture prepared by heat sterilization at 121 ° C. for 15 minutes to inoculate only edible bifidus ( Bifidobacterium longum KCTC 3128) alone (inoculation proportional to 1 times higher than fermented beverage A). Analyze the culture prepared by adding lactose to a final concentration of 0.5% as a stabilizer, and adding a yeast extract concentrate to a final concentration of 0.3% as a fermentation beverage B, and used as an experimental control.
4) 증류수 5 L에 5 g의 찹쌀가루를 첨가하여 충분히 교반하고 30 분간 방치한 다음 침전물을 제거하고 상층액을 배양 탱크에 옮긴다. 쌀엿 50 ㎖를 첨가하여 121 ℃에서 15 분간 가열멸균하여 조제한 혼합물에 식용 효모균 (Saccharomyces cerevisiae KCTC 7928)만 단독 접종하여 (단 접종 비례는 발효음료 A 보다 1배 더 접종함) 3 일간 호기 배양하여 제조된 배양물을 발효음료 C로 하며, 실험 대조에 사용한다.4) Add 5 g of glutinous rice flour to 5 L of distilled water, stir it sufficiently and leave for 30 minutes, remove the precipitate and transfer the supernatant to the culture tank. 50 ml of rice syrup was added and heat sterilized at 121 ° C. for 15 minutes to inoculate only edible yeast ( Saccharomyces cerevisiae KCTC 7928) alone (inoculation proportional inoculated 1 times more than fermented beverage A). The culture was used as fermented beverage C and used for experimental control.
실험예 1 : 발효음료의 안정성 실험 Experimental Example 1 Stability Experiment of Fermented Beverage
발효음료 A, 발효음료 B 및 발효음료 C를 동시에 1 주일 간격으로 안정성 실험을 시행하였다. 비피더스와 효모의 생균수 측정은 식품공전 제7, 일반시험법 8. 미생물시험법 8) 유산균수, (2)비피더스균 (Bifidobacterium), 또는 진균수 (효모 및 사상균수)에 따라 시행하였다. 그 결과를 표 1. 2. 3.과 도 1. 2. 3. 에 나타내었다. 본 발명의 발효음료 A 는 13 주 (3 개월)까지 비피더스와 효모균의 생균수를 유지할 수 있었으나 발효음료 B 는 단독배양 효모추출물을 더 첨가하였음에도 불구하고 비피더스 생균수는 1 주일 이후 급격히 감소하였다. 반면, 발효음료 C 는 효모 생균수가 15 주 까지도 변화가 없었다.The fermented beverage A, fermented beverage B and fermented beverage C were simultaneously subjected to stability tests at one week intervals. The viable cell counts of bifidus and yeast were measured according to Food Code No. 7, General Test Method 8. Microbial Test Method 8) Lactobacillus, (2) Bifidobacterium , or Fungal Count (Yeast and Filamentous). The results are shown in Table 1. 2. 3. and Fig. 1. 2. 3. The fermented beverage A of the present invention was able to maintain the viable cell number of bifidus and yeast for up to 13 weeks (3 months), but the fermented beverage B rapidly decreased after one week despite the addition of a single culture yeast extract. On the other hand, fermented beverage C did not change until 15 weeks.
표 1. 발효음료 A 생균의 안정성 실험결과 (생균수 : cfu/㎖)Table 1. Stability test results of fermented beverage A live bacteria (Number of live bacteria: cfu / mL)
표 2. 발효음료 B 생균의 안정성 실험결과 (생균수 : cfu/㎖)Table 2. Stability test results of fermented beverage B live bacteria (Number of live bacteria: cfu / mL)
표 3. 발효음료 C 생균의 안정성 실험결과 (생균수 : cfu/㎖)Table 3. Stability test results of fermented beverage C live bacteria (Number of live bacteria: cfu / mL)
실험예 2 : 면역기능 증가 실험 Experimental Example 2 Immune Function Increase Experiment
1. 자료와 시험 방법1. Data and test method
1.1. 실험 동물과 처리: 1.1. Experimental Animals and Treatments:
18~22 g 정도의 건강한 마우스 (암컷) 70 마리를 선택하여 체중에 따라 무작위 7군으로 나누어 대조군, 발효음료 A 투여군, 발효음료 A 침전물 투여군, 발효음료 A 상층액 투여군, 발효음료 B 투여군, 발효음료 C 투여군 및 발효음료 B와 발효음료 C 혼합 투여군으로 하여 연속 30 일간 물 대신 하루에 50~65 ㎖/케이지 (마우스 10마리/케이지)정도로 공급하였다. 단, 대조군은 물을 공급하였고, 발효음료 A 침전물 투여군은 발효음료 A 와 같은 양으로 계산한 것으로 발효액 65 ㎖ 을 원심분리한 침전물을 사료에 혼합시켜 투여하였다. 발효음료 B 는 생균수를 유지하기 위하여 1 주일 간격으로 새로 제조한 것을 투여하였다.70 healthy mice (females) of 18-22 g were selected and divided into 7 groups randomly according to the weight of the control group, fermented beverage A group, fermented beverage A precipitate group, fermented beverage A supernatant group, fermented beverage B group, and fermentation. The beverage C administration group and the fermented beverage B and fermented beverage C mixed administration groups were supplied at about 50-65 ml / cage (10 mice / cage) per day instead of water for 30 consecutive days. However, the control group was supplied with water, and the fermented beverage A precipitate-administered group was calculated in the same amount as the fermented beverage A. 65 ml of the fermentation broth was centrifuged and mixed and administered to the feed. Fermented beverage B was administered freshly prepared at weekly intervals to maintain the viable count.
1.2. 임파기관 중량 측정1.2. Lymphatic Weighing
31 일째 체중을 측정하고 마우스를 경추탈골 시킨 후, 대식세포를 조제하고, 무균적으로 흉선과 비장을 채취하여 무게를 측정하였다. 비장은 비장세포 현탁액 제조에 사용하였으며, 흉선과 비장의 무게는 g/100 g 체중으로 표시하였다.At 31 days, the body weight was measured and the mouse was cervical distal bone, macrophages were prepared, and the thymus and spleen were aseptically collected and weighed. The spleen was used to prepare the splenocyte suspension, and the weight of the thymus and spleen was expressed in g / 100 g body weight.
1.3. 비장세포와 대식세포의 조제1.3. Preparation of Splenocytes and Macrophages
마우스를 경추탈골 시킨 다음 10 ml 냉각 Hank's 액으로 복강 내에 주사하여 세척한다. 냉각 Hank's 액으로 3 회 세척하여 얻은 복강세포를 RPMI-1640 배지에 균질화 시킨 후 배양평판에 접종하고, 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양한다. 2 시간 배양 후 배양상층액을 버리고 벽면에 부착된 세포를 수거하여 RPMI-1640 배지에 현탁시킨 후, 트립판-블루 (trypan-blue) 염색법으로 생존율이 95 % 이상인 것을 확인하고, ANAE법 염색에서 대식세포가 98 % 이상인 것을 확인한다. 무균조건에서 비장을 갈아 0.125 % 트립신 (trypsin)으로 30 분간 37 ℃ 수욕에 방치하고 단일 세포 부유액으로 조제하여 Hank's액으로 3 차 세척한 후 10 % 소 태아 혈청, 2mM 엘-글루타민 (L-glutamine), 100 unit 페니실린 (penicillin), 100 ㎍ 스트렙토마이신 (streptomycin)을 함유한 RPMI-1640 배지에 접종한다.Mice are dissected and then washed by intraperitoneal injection with 10 ml cold Hank's fluid. Peritoneal cells obtained by washing three times with cold Hank's solution were homogenized in RPMI-1640 medium, inoculated on a culture plate, and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After 2 hours of incubation, the culture supernatant was discarded and the cells attached to the wall were collected and suspended in RPMI-1640 medium, and the survival rate was confirmed to be 95% or more by trypan-blue staining. Confirm that the macrophages are at least 98%. Under sterile conditions, the spleen is ground, left in 0.125% trypsin for 30 minutes in a 37 ° C water bath, prepared as a single cell suspension, washed three times with Hank's solution, and then washed with 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine. , RPMI-1640 medium containing 100 unit penicillin, 100 μg streptomycin.
1.4. 세포 증식 반응 시험1.4. Cell proliferation response test
비장세포를 2x106 cells/㎖ 농도로 조절하여 96 well plate 에 well당 0.1 ml씩 접종하고, T세포 유사분열원 Con A (Concanavalin-A from Conavalia ensiformis, SIGMA) 1.5 μg/well, B세포 유사분열원 LPS (Lipopolysaccharides, SIGMA) 4 μg/well를 각각 접종하고 동물마다 3 well씩 접종한 후, 37 ℃ 5 % CO2 배양기에서 65 시간 배양한다. 세포증식반응은 MTT (Methylthiazole tetrazolium, SIGMA)를 사용하여 비색법으로 측정한다. MTT (5 mg/ml)용액을 각 well에 20 μl 첨가하고 4 시간 더 배양한 후, MDF-SDS (Macrophage disappearance factor, Sodium dodecyl sulfate solution, SIGMA) 용해액을 첨가하여 590 nm 에서 흡광도를 측정한다. 세포증식반응은 Con A 또는 LPS 자극지수 (SI)로 표시한다. 즉 실험 well 과 대조 well의 흡광도의 비율로 표시한다.Spleen cells were inoculated at a concentration of 2x10 6 cells / ml at a concentration of 0.1 ml per well in a 96 well plate, T cell mitotic Con A (Concanavalin-A from Conavalia ensiformis, SIGMA) 1.5 μg / well, B cell mitosis Inoculate 4 μg / well of original LPS (Lipopolysaccharides, SIGMA) and inoculate 3 wells per animal, and incubate for 65 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 incubator. Cell proliferation is measured by colorimetry using MTT (Methylthiazole tetrazolium, SIGMA). 20 μl of MTT (5 mg / ml) solution is added to each well and incubated for another 4 hours, and then absorbance is measured at 590 nm by adding MDF-SDS (Macrophage disappearance factor, Sodium dodecyl sulfate solution, SIGMA) solution. . Cell proliferation responses are expressed as Con A or LPS stimulus index (SI). In other words, it is expressed as the ratio of absorbance of the experimental well and the control well.
1.5. NK세포 (Natural killer cell : 자연살세포) 활성시험1.5. NK cell (Natural killer cell) activity test
비장세포를 5x106 cells/㎖ 농도로 조절하고 표적세포로는 임파종양세포 (YAC-1)를 1x105 cells/㎖ 농도로 조절하여 즉, 효능세포와 표적세포의 비율 (E:T)은 50:1 로 0.1 ㎖ 씩 96 well plate에 접종하였다. 매개 동물의 비장세포 현탁액은 3 well씩 접종하였다. 대조군은 위 농도로 비장세포와 표적세포를 plate마다 각각 3 well씩 접종한다. 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후, 위에서 서술한 MTT 비색법으로 NK세포 활성을 측정한다. NK세포 활성은 아래의 계산식으로 계산한다.The splenocytes were adjusted to 5x10 6 cells / ml and the target cells were lymphoma cells (YAC-1) to 1x10 5 cells / ml. That is, the ratio of effector cells to target cells (E: T) was 50. 1: 0.1 ml each was inoculated in a 96 well plate. Splenocyte suspensions of each animal were inoculated 3 wells each. The control group was inoculated with 3 wells of splenocytes and target cells per plate at the above concentration. After incubation for 24 hours at 37 ℃, 5% CO 2 incubator, NK cell activity is measured by the MTT colorimetric method described above. NK cell activity is calculated by the following formula.
(효능세포+표적세포)흡광도-효능세포흡광도(Efficacy Cell + Target Cell) Absorbance-Effective Cell Absorbance
( 1 - ) x 100( One - ) x 100
표적세포흡광도Target cell absorbance
1.6. 대식세포 활성 시험1.6. Macrophage activity test
대식세포를 2x106 cells/㎖ 농도로 조절하고 표적세포 임파종양세포 (YAC-1)를 1x105 cells/㎖ 농도로 조절하여 즉, 효능세포와 표적세포의 비율 (E:T)은 20:1 로 0.1 ml씩 96 well plate에 접종하였다. 매개 동물의 비장세포 현탁액은 3 well씩 접종하였다. 대조군은 위 농도로 대식세포와 표적세포를 plate마다 각각 3 well씩 접종한다. 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 24 시간 배양한 후, 위에 서술한 NK세포 활성 시험과 같은 측정방법 및 계산법으로 한다.The macrophages were adjusted to 2x10 6 cells / ml and the target cell lymphoma (YAC-1) was adjusted to 1x10 5 cells / ml, ie the ratio of agonist to target cells (E: T) was 20: 1. 0.1 ml each was inoculated into a 96 well plate. Splenocyte suspensions of each animal were inoculated 3 wells each. The control group was inoculated with 3 wells of macrophages and target cells per plate at the above concentration. After 24 hours of incubation at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator, the same measurement and calculation methods as in the NK cell activity test described above are used.
2. 결과 2. Results
2.1. 임파양 기관의 중량의 변화2.1. Changes in the weight of lymphoid organs
임파양 기관의 중량 변화는 표 4.와 같은 결과를 얻었다. The weight change of the lymphoid organs was obtained as shown in Table 4.
1) 흉선 중량의 변화:발효음료 A 투여군은 대조군, 본 음료 (발효음료 A)의 침전물,본 음료 (발효음료 A)의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 현저히 증가하였으며, 본 음료의 침전물,본 음료의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았고 본 음료의 침전물, 비피더스 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 대조군과 비교할 때 현저한 차이를 보여주었으며, 본 음료의 상층액 및 효모 단독 음료는 대조군과 비교할 때 현저한 차이를 나타내지 않았다;1) Changes in the thymus weight: Fermented beverage A-administered group is the control, sediment of the beverage (fermented beverage A), supernatant of the beverage (fermented beverage A), bifidus-only fermented beverage, yeast-only fermented beverage, and bifidus and yeast alone. After fermentation, it was significantly increased compared with the administration group. The precipitates of this beverage, the supernatant of the beverage, the bifidus fermented beverage, the yeast-only fermented beverage, and the fermented and mixed administrations of bifidus and yeast were significantly different from each other. There was no difference, and the sediment, bifidus fermented beverage, and the fermented group after the fermentation of bifidus and yeast alone showed a significant difference compared to the control group. There was no significant difference when compared;
2) 비장 중량의 변화: 발효음료 A 투여군은 대조군, 본 음료 (발효음료 A)의 침전물, 본 음료 (발효음료 A)의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 현저히 증가하였으며, 대조군, 본 음료의 침전물,본 음료의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았다.2) Changes in spleen weight: The fermented beverage A-administered group contained only the control group, the precipitate of the beverage (fermented beverage A), the supernatant of the beverage (fermented beverage A), the bifidus-only fermented beverage, the yeast-only fermented beverage, and the bifidus and yeast alone. After fermentation, it was significantly increased compared with the administration group, and the control group, the precipitate of the beverage, the supernatant of the beverage, the bifidus fermented beverage, the yeast alone fermented beverage, and the bifidus and yeast administered group were mixed and administered. There was no significant difference between them.
표 4. 임파양 기관의 중량의 변화Table 4. Changes in weight of lymphoid organs
2.2. 세포증식 반응에 미치는 영향2.2. Effect on cell proliferation response
마우스 비장세포의 Con A와 LPS 에 대한 증식반응은 표 5에 나타낸 바와 같다. 마우스 비장세포의 Con A와 LPS 에 대한 증식반응에서, 발효음료 A 투여군은 대조군, 본 음료 (발효음료 A)의 침전물, 본 음료 (발효음료 A)의 상층액，비피더스 단독 발효음료，효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 현저히 증가하였으며, 본 음료의 침전물，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았다. 본 음료의 침전물，비피더스 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았고 대조군과 비교할 때는 현저한 차이를 보여주었으며, 단독 효모음료와 본 음료의 상층액 투여군간은 현저한 차이가 없었으며, 본 음료의 상층액과 대조군간도 현저한 차이를 보여주지는 않았다.Proliferative responses to Con A and LPS of mouse splenocytes are shown in Table 5. In the proliferative response to Con A and LPS of mouse splenocytes, the fermented beverage A-administered group was treated with the control group, the precipitate of the beverage (fermented beverage A), the supernatant of the beverage (fermented beverage A), the bifidus-only fermented beverage, and the yeast fermentation alone. After fermentation of beverage and bifidus and yeast alone, it was significantly increased compared with the administration group. There was no significant difference. The sediment, bifidus single fermented beverage, and the mixed group of bifidus and yeast were not significantly different from each other and showed significant difference compared to the control group. There was no significant difference in the liver, and there was no significant difference between the supernatants of the drink and the control.
표 5. 세포증식 반응에 미치는 영향Table 5. Effect on Cell Proliferation Response
2.3. NK세포와 복강 대식세포의 세포활성2.3. Cellular Activity of NK Cells and Peritoneal Macrophages
마우스 비장세포와 복강 대식세포의 세포활성을 표 6에 표시하였다. The cell activity of mouse splenocytes and peritoneal macrophages is shown in Table 6.
1) NK세포활성: 발효음료 A 투여군은 대조군, 본 음료 (발효음료 A)의 침전물, 본 음료(발효음료 A)의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 현저히 증가하였으며, 대조군, 본 음료의 침전물,본 음료의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았다. 1) NK cell activity: The fermented beverage A-administered group is a fermentation of the control group, the precipitate of the beverage (fermented beverage A), the supernatant of the beverage (fermented beverage A), the bifidus-only fermented beverage, the yeast-only fermented beverage, and the bifidus and yeast. The control group, the precipitate of the beverage, the supernatant of the beverage, the bifidus fermented beverage, the yeast alone fermented beverage, and the bifidus and yeast administered groups after fermentation alone were mixed with each other. There was no significant difference.
2) 대식세포활성: 발효음료 A 투여군은 대조군, 본 음료 (발효음료 A)의 침전물, 본 음료 (발효음료 A)의 상층액，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효 음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군보다 현저히 증가하였으며, 본 음료의 침전물，비피더스 단독 발효음료， 효모 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 상호간 현저한 차이를 나타내지 않았다. 본 음료의 침전물，비피더스 단독 발효음료 및 비피더스와 효모를 단독발효한 후 혼합하여 투여한 투여군은 본 음료의 상층액 및 대조군과 비교할 때 현저한 차이를 보여주었으며, 효모 단독 발효음료, 본 음료의 상층액 및 대조군은 상호간 현저한 차이를 보여주지 않았다.2) Macrophage activity: The fermented beverage A-administered group fermented the control group, the precipitate of the beverage (fermented beverage A), the supernatant of the beverage (fermented beverage A), the bifidus-only fermented beverage, the yeast-only fermented beverage, and the bifidus and yeast alone. After the fermentation, the precipitates, bifidus fermented beverages, yeast-only fermented beverages, and fermented bifidus and yeast were not significantly different from each other. The sediment, bifidus fermented beverage, and the fermented group after the fermentation of bifidus and yeast alone showed a significant difference compared to the supernatant and the control of the beverage. And the control did not show significant differences between each other.
표 6. NK세포와 복강 대식세포의 세포활성Table 6. Cellular Activities of NK Cells and Peritoneal Macrophages
본 발명의 발효음료는 비피더스나 효모의 단독 발효음료 혹은 두가지 단독 발효음료를 혼합하거나 단독 생균, 단독 발효균 추출물보다 우월한 안정성과 면역기능 증가작용을 기대할 수 있다.Fermented beverages of the present invention can be expected to have superior stability and immune function-increasing activity than the single fermented beverage of bifidus or yeast, or a mixture of two fermented beverages alone or extracts from live bacteria or sole fermented bacteria.
도 1은 발효음료 A 생균의 안정성 실험결과를 나타낸 도이고, 1 is a view showing the stability test results of fermented beverage A live bacteria,
도 2는 발효음료 B 생균의 안정성 실험결과를 나타낸 도이며, 2 is a view showing the stability test results of fermented beverage B live bacteria,
도 3은 발효음료 C 생균의 안정성 실험결과를 나타낸 도이다. Figure 3 is a view showing the stability test results of fermented beverage C live bacteria.
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| KR100801143B1 (en) * | 2006-08-17 | 2008-02-05 | 주식회사 바이넥스 | Method for culturing of mixture of bacillus polyfermenticus and saccharomyces cerevisiae |
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