KR20050083791A - 비-유전자도입 포유동물의 유선에서 재조합 단백질의생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비-유전자도입 동물의 유선으로부터 생물약학적으로 흥미 있는 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 단백질을 코드하는 유전자는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 유방의 상피세포로 전이된다. 이러한 벡터는 전부 또는 대부분의 아데노바이러스 코딩 시퀀스가 제거된 보조제-의존 아데노바이러스 또는 ΔE1ΔE3와 같이 불충분한 복제를 갖는 아데노바이러스에 기초할 수 있다. 상기 방법으로 높은 수준의 재조합 단백질이 밀크에 생산되어 질 수 있고, 이에 의해 이들의 생물학적으로 활성인 형태로 생물약학적 대상 단백질의 대규모 생산이 가능하다.

Description

비-유전자도입 포유동물의 유선에서 재조합 단백질의 생산방법{METHOD FOR THE PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS IN THE MAMMARY GLAND OF NON TRANSGENIC MAMMALS}
본 발명은 유전자 전이용 벡터로서 재조합된 아데노바이러스(adenoviruses)와 생물반응기로서 유선을 사용하여 약학적 가치를 갖는 생물학적으로 활성인 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
많은 질병의 치료에는 대 생물활성 단백질의 투여를 요한다. 이들 약제는 장기간을 요하고 값비싸다는 것에 부가하여 에이즈(AIDS) 및 간염의 원인이 되는 것들과 같은 전염성 제제의 전이의 위험을 수반하는 과정으로 조직 및 혈액으로부터 정제될 수 있다.
DNA-재조합 기술의 발달은 약학적으로 가치 있는 단백질의 생산을 위한 숙주 시스템으로서 박테리아와 효모의 상대적으로 저렴한 사용을 가능하게 했다. 그럼에도 불구하고 많은 경우에 있어서, 이들 단백질의 생물학적 활성이 이들 시스템의 불충분한 번역 후(post-translational) 과정에 기인하여 영향을 받는다. 이런 이유 때문에, 대부분의 생물학적으로 활성인 단백질의 생산은 보다 고등인 진핵세포의 생합성적인 절차를 요구한다. 이러한 관점에서, 바큘로바이러스(baculovirus)와 포유동물의 세포에 기한 시스템이 실용적인 전략으로 실행되어져 왔다. 그럼에도 불구하고 동물세포의 발효는 여전히 많은 비용이 들고 기술적으로 어려운 공정이다.
생물반응기로서 유전자도입 동물의 유선의 사용은 상기 언급된 문제의 잠정적인 해결안으로서 인식되어 왔다. 유전자 도입의 주요한 이점은 자연적인 재생에 의한 주조(founder) 동물로부터 새로운 유전자도입 집단의 창조 가능성에 의존한다. 이 기술의 전도유망한 가능성에도 불구하고 보다 일반화된 형태로서의 사용을 방지하는 제한이 현재로서 존재한다. 특히, 유전자도입이 큰 농장 동물들에서 이루어질 때, 많은 시간과 노력이 유전자도입 세대인 G0의 매우 제한된 수의 생산을 위해 필요로 된다. 유전자도입 된 G0세대 중의 오직 작은 비율만이 밀크에서, 상업적인 상태로 도입하기 위해 필요한 상당한 수준으로 흥미 있는 단백질을 발현할 것이다. 시장에의 진입을 허용하는 적당한 생산량에 도달할 때 까지, G0 세대를 고준위의 발현을 가지고 교배함으로써 증식시키는데 부가적인 장시간이 요구된다. 이러한 스케일-업 기간 동안에, 유전자도입 자손이 최초 주조 동물의 수준으로 외래성 단백질을 발현하지 않을 것이라는 위험성 또한 존재한다.
대안적인 경로로서 체세포(somatic) 클로닝은 상기 언급된 몇 가지의 제한을 극복하게 하지만, 높은 비용 뿐 아니라 이들 기술의 불충분성이 이것의 보다 일상적이고 폭 넓은 이용을 방해한다.
바이오공장으로 유전자도입 포유동물의 사용은 복합 발현 카셋트의 구성을 의미하여, 외래성 유전자는 포유기 동안에 단지 유선 상피 조직에서만 발현을 허용하는 조절 시퀀스에 연결된다. 많은 경우에 있어 이들 조절 시퀀스는 소량의 재조합 단백질이 동물의 건강에 유해한 영향을 주면서 다른 조직에서 합성되게 하여 효과적으로 작동하지 않는다.
성숙 동물에서 유선의 상피조직(MGE)으로 유전자의 직접적인 전이는 아주 전망이 밝은 전략이다. 이 기술은 생물-약학적 약의 생산 비용을 낮출 뿐 아니라 이들의 생산에 필요한 시간을 상당히 감소할 수 있다. MGE의 생체 내 도입은 그 유전적 백그라운드와 별개로 최소한의 기술적 요구를 가지고 어느 동물에서도 수행될 수 있다.
초기 연구에서 Archer 등 (Proc Natl Acad Sci U S A. 1994, 91(15):6840-4)은 염소의 유방 상피세포로 인간의 성장 호르몬(hGH)의 유전자를 전이하기 위해 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors)의 사용 가능성을 평가하였다. hGH는 밀크에서 비록 극히 낮은 농도이더라도 감지될 수 있으며, 이 발현은 첫날 이후 기본 수준으로 떨어진다.
특허 US 5,215,904 및 WO99/43795에도 또한 MGE의 형질도입을 위해 레트로바이러스 벡터를 사용한 방법이 기술되어 있다. EP 725141,A4에서의 리셉터-매개 식균작용(endocytosis)과 US 5.780.009에서의 지질 및/또는 복제에 기초한 복합체의 사용이 또한 MGE에 유전자의 도입을 위한 대안적인 것으로 기술되어 있다. 비록 이들 연구는 처리된 동물의 밀크에서 목적 단백질을 수득할 수 있었지만, 이때까지는 보고된 효능이 극히 낮고 수득된 단백질 수준이 밀리리터 당 나노그램이고, 이 방법이 생산 공정에서 유용하게 쓰여지기 위해서는 까다로운 제한이 있다.
아데노바이러스의 벡터는 세포들이 활성적으로 분열하거나 그렇지 않거나 관계 없이 독립적으로 광범위한 영역의 세포 타입을 감염시킬 수 있다. 일반적 관점에서, 아데노바이러스의 벡터에 포함된 도입유전자의 발현은 매우 활발하다. 감염에 의하여, 바이러스는 에피좀(episome)으로 남고, 따라서 발현은 바이러스 위치 에 의해 영향을 받지 않는다. 그러나, 아데노바이러스의 벡터로부터 도입유전자의 발현은 대략 10일에 유실 된다. 이는 주로 발현된 바이러스의 단백질에 대해 조직에 의해 유발된 높은 면역 반응에 기인된다.
유전자의 보다 장기간의 발현을 얻기 위하여, 새로운 아데노바이러스의 벡터가 대부분 또는 전체 바이러스 코딩 시퀀스가 제거되어진 것으로부터 개발되어 왔다(Robin J. Parks et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1996, 93(24):13565-70). 이들 벡터의 증식은 제 2의 바이러스를 갖는 생산 세포의 공동감염에 의해 이루어지고, 제 2바이러스는 모든 요구된 아데노바이러스의 단백질을 트랜스형(in trans)으로 제공한다. 이 새로운 세대의 벡터는 헬퍼-의존(Helper-dependent) 또는 거트리스(Gutless)로 명명되고 이것은 단지 각각 역 말단 반복(inverted terminal repeats; ITR))과 패키징 및 복제에 요구되는 요소만을 보유한다. 이들 벡터의 클로닝 능력은 36 Kb에 달하고 생체내의 유전자 치료 분석에서 아주 안전한 것으로 나타난다.
마우스의 유방 상피세포로 생체 내에서 유전자 전이를 위한 아데노바이러스 벡터의 능력이 Yang 및 그 공동연구자(Cancer Lett. 1995, 98(1):9-17)에 의해 발표되었다. 그 이래로 몇몇 연구가 MGE로 유전자를 전이하기 위한 아데노바이러스의 사용에 대해 공개되었지만 어느 연구에서도 목적 유전자를 밀크에서 발현하지 않았다.
생물활성 화합물의 생산을 위한 도구로서 아데노바이러스의 사용 가능성은 특허출원 WO97/17090호에 기술되어 있다. 비록 이 문헌에 MGE의 형질도입 가능성이 언급되었지만 그럼에도 불구하고, 결과뿐만 아니라 개시된 모든 실험 데이타는 생체 외의, 조직 배양 샘플에의 형질도입에 초점이 맞추어져 있고, 유방의 상피세포를 사용한 것은 아니다.
아데노바이러스를 사용한 MGE 감염을 설명한 WO97/17090 호에서 나타난 발명의 단순한 형태는 젓을 분비하는 젓소(cows)의 유선에 재조합 아데노바이러스의 주입을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 이 방법에 따르면, 감염의 수준 및 그에 따른 재조합 단백질의 생산이 상당히 낮고 따라서 아데노바이러스 벡터를 갖는 MGE의 형질도입이 밀크에서 생물학적으로 활성인 의약품의 생산을 위한 실행 가능한 대안이 될 수 있다는 것을 입증하지 못한다.
도 1은 hGH 와 hEPO의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 ΔE1ΔE3의 제조를 위해 사용된 방법을 도시한다.
도 2는 hEPO의 유전자를 포함하는 헬퍼-의존 아데노바이러스 지놈의 제조를 위해 사용된 방법을 도시한다.
도 3은 인간 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터의 조절하에 hGH의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 ΔE1ΔE3의 유선 당 2.5x106 GTU로 주입된 마우스의 밀크에서 hGH의 발현에 대한 분석이다. A) 웨스턴 블럿 어세이 : 네가티브 컨트롤(C-)는 hGH에 대한 발현 카셋트가 결핍된 아데노바이러스가 주입된 마우스의 밀크에 대한 것이고, 레인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9는 상응하는 젓 분비 일에 수집된 밀크의 샘플을 포함한다. B) 분만 후의 날과 관련하여 밀크에서의 hGH 농도.
도 4는 인간 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 hEPO의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 ΔE1ΔE3의 유선 당 1x108 GTU로 주입된 마우스의 밀크에서 hEPO의 발현에 대한 분석이다. A) 웨스턴 블럿 어세이 : 네가티브 컨트롤(C-)는 hEPO에 대한 발현 카셋트가 결핍된 아데노바이러스가 주입된 마우스의 밀크에 대한 것이고, 레인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9는 상응하는 젓 분비 일에 수집된 밀크의 샘플을 포함한다. B) 분만 후의 날과 관련하여 밀크에서의 hEPO 농도.
도 5은 인간 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절하에 hGH의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 ΔE1ΔE3의 유선 당 2x1011 GTU로 주입된 염소의 밀크에서 hGH의 존재를 나타낸다. A) 주입 후 최초 10일 동안 수집된 밀크 샘플의 전기영동, 네가티브 컨트롤은 hGH에 대한 발현 카셋트가 결핍된 아데노바이러스가 주입된 유선으로부터의 밀크에 상응한다. B) 염소의 밀크에서 hGH의 발현을 나타내는 웨스턴 블럿 어세이; 네가티브 컨트롤은 hGH에 대한 발현 카셋트가 결핍된 아데노바이러스가 주입된 유선으로부터 밀크에 상응한다. 포지티브 컨트롤은 박테리아의 세포로부터 정제된 재조합 hGH에 상응한다. C) 주입 후의 날과 관련하여 밀크에서의 hGH 농도.
도 6은 인간 시토메갈로바이러스 프로모터의 조절 하에 hEPO의 유전자를 포함하는 헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터가 주입된 염소의 밀크에서 hEPO의 준위를 나타내는 ELISA의 결과이다.
본 발명은 비-유전자도입 포유류의 밀크에서 높은 수준으로 이종기원의 단백질을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 MGE의 세포에 외래 유전자를 전이하기 위해 ΔE1ΔE3 헬퍼-의존형의 아데노바이러스 벡터의 사용을 언급한다. 이 방법으로 전이된 세포는 밀크에 생물학적으로 활성인 단백질을 합성하고 분비한다.
따라서 비-유전자도입 포유류의 밀크에서 다량의 생물학적으로 활성인 복잡한 단백질의 생산을 위한 간단하고 효과적인 수단을 제공하는 것은 본 발명의 범주에 포함된다.
여기에서 제시된 방법은 유선의 상피세포의 생체 내에서 효과적인 형질도입을 가능하게 한다. 상기 세포는 모든 요구된 유전 물질에 접근하여 이들은 처리된 동물의 밀크에 생물약학적인 단백질을 분비할 수 있다. 특히 본 발명에 있어서, 아데노바이러스의 벡터는 MGE의 세포 내부로 외래 DNA를 도입하기 위해 사용된다. 감염에 의하여 바이러스의 DNA는 감염된 세포의 핵에 에피좀으로 남아 바이러스 벡터에 함유된 도입유전자의 발현을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 젓꼭지의 유로를 통해 직접적으로 아데노바이러스의 벡터를 포함하는 용액의 주입을 의미한다. 동물은 바람직하기로는 반추동물이다(즉, 소, 양, 또는 염소). 동물은 포유동물기원 및 유기원(lactogenesis)의 호르몬의 유도가 대상이 될 수 있고, 대안적으로는 자연적으로 젓을 분비하는 동물이 사용될 수 있다. 감염 후 도입유전자는 유 분비 세포로 이전되어, 전사되고 번역되어 밀크로 분비되기 전에 요구된 후-번역 과정을 받는다. 밀크를 만드는 수단에 의하여, 상기 유전자 도입된 동물은 생물 약학적으로 흥미 있는 외래 단백질 생산을 위한 살아있는 공장이 된다.
바이러스 벡터는 흥미 있는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현 카셋트와 효과적인 분비를 위한 시그날 펩티드 시퀀스를 포함하고, 이 시그날 펩티드는 코딩 유전자 또는 이종기원에서 유래될 수 있으며, 또한 바이러스 벡터는 MGE에 필수적으로 특이하지 않은 프로모터 시퀀스와, 절단(cleavage) 시퀀스와 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.
바이러스 벡터는 바람직하기로는 타입 2 및 5의 인간 아데노바이러스에 기초된다. 대안적으로, 아데노바이러스의 벡터는 유전자 E1 및 E3가 결핍된 것이 사용될 수 있고, 또는 모든 아데노바이러스의 코딩 시퀀스가 결핍된 것(헬퍼-의존 또는 거트리스)이 사용될 수 있다.
본 발명에서 기술된 바와 같이 불완전한 복제능력을 가지는 아데노바이러스의 벡터(즉, ΔE1ΔE3)의 사용은 면역력이 있는 동물에 있어서 대략 10일 후에 밀크에 재조합 단백질의 높은 수준의 발현을 가능하게 한다. 상기 벡터는 물리적 및 화학적 특성 또는 치료적 처리를 위해 소량으로 요구되는 단백질의 발현에 특히 적당하다. 에리스로포이에틴(erythropoietin) 및 조직 플라스미노겐(plasminogen) 활성자에 대한 경우도 이에 해당한다.
제시된 방법에 기술된 바와 같이, 대안적으로 다량의 단백질이 요구되어 질 때 헬퍼-의존 아데노바이러스는 최상의 선택이다. 이들 벡터는 MGE에서 매우 안정적인 것으로 나타나, 면역력이 있는 동물에 있어서 길게는 5개월 동안 재조합 단백질의 밀크를 발현할 수 있게 한다. 거트리스 벡터의 안정성은 면역이 억제된 동물을 이용함으로써 또는 재조합 단백질의 면역기원성에 의존하여 개선될 수 있다. 부가하여 거트리스 벡터는 다중 발현 카셋트의 삽입을 허용하는 보다 큰 클로닝 능력(36 Kb 까지)을 가진다.
발현 카셋트
본 발명의 아데노바이러스의 벡터는 MGE에 필수적으로 특이적이지 않은 프로모터, 대상 유전자에 대한 코딩 시퀀스, 절단 및 폴리아데닐화 시퀀스로 구성된 발현 카셋트를 포함한다.
상기 발현 카셋트를 제조하기 위해, 구조 프로모터(constitutive promoter)가 사용될 수 있고, 상기 프로모터는 전이된 세포에 이종기원일 수 있다. 상기 프로모터의 예는 초기 직접(early immediate)단계의 인간 시토메갈로바이러스(citomegalovirus), 액틴, 초기 SV40, 미오신, 및 룩스 사코마 바이러스(Roux Sarcoma Virus)를 포함한다. 유선에 단백질의 발현을 자연적으로 구동하는 프로모터는 아주 흥미 있는 것일 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 αS1 카제인, αS2 카제인, β 락토글로불린, κ-카제인, 유장 산성 단백질(whey acidic protein) 및 α-락트알부민을 포함한다.
코딩 시퀀스는 발현 준위의 고양을 위해 인트론을 포함하거나 포함하지 않은 보상 DNA (cDNA)일 수 있다. 대안적으로 그리고 벡터의 클로닝 능력에 따라서, 유전자로부터 인트론을 포함하는 지놈 DNA(genomic DNA)가 사용될 수 있다. 이 벡터 구성은 cDNA 구동 발현과 비교할 때 보다 양호한 발현 수준이 얻어지기 때문에 바람직하다.
실질적으로 이종기원의 단백질이 여기서 제시된 시스템을 사용하여 밀크에서 발현될 수 있다. 특히 인간 또는 동물에서 치료적 또는 예방적인 가치를 갖는 단백질이 유용하게 발현될 수 있다. 본 발명을 사용하여 수득될 수 있는 단백질의 예는, 여기에 한정되는 것은 아니지만 항원(즉, 헤파티디스 B 표면 항원) 성장 인자(즉, 인간 성장 호르몬, 상피 성장 호르몬, 인슐린 형 성장 호르몬, 콜로니 자극 인자, 그래뉼로사이트 매크로파아지 자극 인자, 신경 성장 인자, 에리스로포이에틴) 항체, 싸이토카인(cytokine)(즉, 인터류킨(interleukin) 6 또는 인터류킨 2), α-1 안티트립신, 인간 혈청 알부민, β 글로빈, 조직 플라스미노겐 활성자, 종양 억제 단백질(즉, p53), 단백질 C 및 인터페론을 포함한다.
본 발명에 따라 생산된 이 이종유래의 단백질 각각은 직접 밀크내로 분비를 하는 시그날 펩티드에 연결됨이 틀림없다. 상기 시그날 펩티드는 만일 단백질이 자연적으로 분비된다면, 이종유래의 단백질로부터 유래될 수 있다. 단백질이 분비될 수 없을 때에 이 유전자 구조는 상기 단백질의 분비를 가능하게 하는 이종유래의 시그날 펩티드를 포함하여야 한다.
메신저 RNA(mRNA)의 안정성은 유전자의 3' 말단에 위치된 영역에 의해 아주 큰 정도까지 조정된다. 이 영역은 절단 및 폴리아데닐화 시퀀스를 포함하여야 한다. 이들 시퀀스는 이종기원일 수도 있지만, 글로빈 유전자, 소의 성장 호르몬, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제(Herpes Simplex tymidine kinase) 또는 SV40 바이러스의 초기 영역으로부터 유래된 시퀀스가 보다 공통적으로 사용될 수 있다.
아데노바이러스의 벡터
인간 유래의 아데노바이러스 벡터가 반추동물 종의 유방 상피세포에 효과적으로 전염될 수 있고 분비성의 상피에서 이들의 안정성은 바이러스 지놈으로부터 발현된 단백질의 면역기원성의 정도에 아주 큰 정도로 의존하며, 이 때 발현된 단백질은 바이러스 유래의 단백질과 생물약학적 단백질 모두(양자)를 포함한다는 것이 보고 되어 있다. 복제능력이 결핍된 아데노바이러스의 벡터(즉, ΔE1ΔE3)는 재조합 단백질의 발현을 높은 수준으로 증가시킬 수 있지만, 감염된 세포에 대해 바이러스의 단백질에 의해 유도된 강력한 면역 반응에 기인하여 벡터의 안정성은 감소한다.
헬퍼-의존 또는 거트리스 벡터는 그들의 지놈에 바이러스성 유전자를 포함하지 않고, 따라서 감염된 세포에 대한 면역 반응이 아주 낮으며, 면역반응은 단지 재조합 단백질 그 자체의 면역기원성에 의해서만 결정된다. 본 발명자들은 이들 벡터가 매우 안정하고 처리된 동물의 밀크에 생물약학적 단백질의 발현을 허용한다는 것을 밝혔다.
복제능력이 결핍된 아데노바이러스의 벡터는 문헌(Tong-Chuan He et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 1998, 95(5):2509-14)에 보고된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 바이러스성 입자의 패키징 및 증식 모두 HEK-293 세포 또는 아데노바이러스의 결핍을 보상할 수 있는 다른 세포 라인에서 수행된다. 헬퍼-의존 아데노바이러스의 벡터는 Robin J. Parks 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93(24):13565-70)에 따라 제조될 수 있다. 이를 위해, 복제능력이 결핍된 아데노바이러스의 벡터는 헬퍼 아데노바이러스와 공동으로 감염될 것이 요구되고, 이러한 헬퍼 바이러스는 벡터의 올바른 패키징을 위해 요구되는 모든 단백질을 트랜스형으로 제공하여야 한다. 양 경우에 있어서, 벡터는 3 회의 동결 및 해동에 의해 세포로부터 추출된다. 아데노바이러스의 벡터에 포함된 발현 카셋트의 기능성은 배양된 상피의 유방 세포의 감염에 의해 생체 외에서 분석되어질 수 있다. 감염에 의존하여 대상 단백질은 배양 배지에서 검출될 수 있다. 마우스 유래의 유방 상피 세포 HC11 또는 KIM2 및 소 유래의 MAC-T가 특히 이런 검출 면에서 유용할 수 있다.
유방 상피 세포의 효과적인 감염에 잠정적으로 방해를 할 수 있는 결함 있는 입자와 세포성 잔여물을 제거하기 위해 CsCl 농도구배로 이중의 원심분리에 의해 바이러스성 입자를 정제하는 것이 권고될 수 있다. 헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터의 정제를 위해, CsCl 농도구배로 원심분리 하는 것은 헬퍼 아데노바이러스에 의해 발생할 수 있는 오염을 제거하기 위해서 강제된다. 이 방법에 의해 정제된 아데노바이러스는 CsCl의 고농도가 세포 및 조직의 바이러스성의 감염에 방해될 수 있기 때문에 투석된다. 일단 투석되면, 아데노바이러스는 섭씨 -80도에서 이들의 적정량(titer)에 있어 감지할 만한 변화 없이 보관될 수 있다.
동물
본 발명은 모든 포유동물에 적용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들의 보다 높은 밀크 생산 능력에 기인하여 반추 동물이 바람직하다. 성적 성숙기의 초기 단계에 있는 동물이 사용될 수 있다. 이들 동물은 포유발생 및 젓의 분비를 유도하기 위해 호르몬 요법을 받는다. 일반적인 규칙으로서, 호르몬으로 유도하여 젓을 분비 하는 동물보다 자연적으로 젓을 분비하는 동물은 보다 높은 수준의 밀크 생산성을 가지고, 따라서 도입유전자 역시 높은 수준으로 생산될 것이다.
주입(Infusion)
아데노바이러스의 벡터를 포함하는 용액을 주입하기 전에, 강(腔,cistern)의 유 저장기(milk container)를 제거하기 위해 동물은 반드시 포유되어야 한다. 그런 다음 유선은 유선의 젓꼭지의 유로를 통해 등장의 용액으로, 유선이 채워질 때까지 맛사지를 하면서 주입되어, 용액이 소포(alveoli)의 전체에 도달하게 되고 용액은 유화(milking)에 의해 제거된다. 이 단계는 유선의 완전한 세정과 소포의 팽창 및 수송관 조직의 팽창을 확실하게 하기 위해 2 내지 3회 반복된다. 등장액 용액은 PBS, NaCl 0.9%, 글루코스 5%, HBS 조직 배양 배지일 수 있다.
바이러스성 입자를 포함하는 용액의 주입은 젓꼭지의 유로를 통해 직접적으로 수행된다. 수반하는 액체로는 글루코스 5%, PBS, NaCl 0.9%, HBS, 또는 조직 배양 배지(즉, DMEM)와 같은 등장 용액이 사용될 수 있다. 주입 용액에서의 바이러스의 농도는, 비록 1 x 109 PFU/ml 또는 그 이상의 농도가 바람직하지만 가변적일 수 있다. 주입의 최적의 부피는 유선의 사이즈에 의존하여 다양하게 되고, 염소를 예를 들어 그 부피는 유선 당 50 내지 300ml 사이에서 변할 수 있다.
젓꼭지의 유로를 통한 주입을 위하여 캐뉼라에 연결된 실린지가 사용될 수 있다. 주입은 서서히 수행되어야 하고, 모든 유방 상피세포에 용액의 균질한 분산을 확실하게 하기 위해 주입 중 및 그 후에 맛사지가 요구된다.
이종기원 단백질의 수집
처리된 동물로부터의 밀크는 손을 사용한 통상적인 방법 또는 자동적인 착유에 의해 얻어질 수 있다. 유장으로부터 카제인 및 지방이 분리되고, 대부분은 -20℃에서 저장되고, 적은 분획이 통상적으로 공지된 분석 기술(즉, ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 생물학적 활성)에 의해 대상 단백질을 검지하고 정량하기 위해 사용된다. 상당한 양의 대상 단백질을 함유하는 유장은 혼합되고, 이종기원 단백질의 정제를 위한 활성적 원료 물질로서 사용된다. 정제 공정은 얻어진 단백질에 의존하여 매우 다양하게 변할 수 있다.
이 방법에 있어서, 본 발명에 따른 밀크에 높은 수준의 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법은 다음의 단계를 필요로 한다.
1. 원하는 유전자를 갖는 발현 카셋트를 포함하는 재조합 아데노바이러스의 제조. 이 단계는:
a) - 재조합 아데노바이러스 지놈의 제조
b) - 세포 라인 293에서 바이러스의 입자의 생산
c) - 아데노바이러스의 벡터의 증식 및 정제
를 포함한다.
2. 유반 상피세포의 감염. 이 단계는:
a) - 비 자연적 젓 분비를 갖는 동물이 사용되는 경우에 포유발생 및 젓 분비의 유도
b) - 바이러스 입자를 포함하는 용액을 유선으로 주입
을 포함한다.
3. 재조합 단백질의 회수. 이 단계는:
a) - 처리된 동물의 착유
b) - 수집된 밀크에서 이종기원 단백질의 검출 및 정량
c) - 이종기원 단백질의 정제
를 포함한다.
다음의 실시예로 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
실시예 1. hGH 및 hEPO에 대한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 (ΔE1ΔE3)의 구성.
불완전한 복제를 하는 아데노바이러스의 벡터는 애드이지 시스템(AdEasy system) (Tong-Chuan He et al.; Proc Natl Acad Sci U S A. 1998, 95(5):2509-14)에 기초하여 구성되고, 전이벡터로서 플라스미드 pAdTrack-CMV (도 1참고)가 사용된다. 애드이지에 기한 시스템은 재조합 아데노바이러스를 제조하기 위한 빠르고 용이한 선택이다. 두 단계의 과정이 요구되는데 여기서 첫 단계는 발현 카셋트가 전이 벡터 내에 클론되고 이어서 박테리아 균주 BJ5183에 동종의 재조합(homologous recombination)에 의해 바이러스 지놈으로 전이된다. 그런 다음 아데노바이러스 지놈은 Pac I 엔도뉴클레아제로 절단(cleavage)되고 293 또는 911 세포 라인으로 형질도입된다. 우리의 경우에는, 감염성 비리온의 형성 뿐 아니라 최상의 증식의 양자가 전이 벡터 pAdTrack-CMV에 포함된 그린 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP))의 공동 발현에 의해 모니터된다.
실시예 2: 헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터의 구성.
헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터는 플라스미드 pSH-1의 복합 클로닝 사이트에 에리스로포이에틴의 유전자를 포함하는 발현 카셋트를 클로닝함에 의해 제조된다. 패키징을 가능하게 하는 적절한 사이즈를 제조된 플라스미드에 부여하기 위해, 이플라스미드를 박테리아 균주 BJ5183에서 동종의 재조합함으로써 pStuffer-26 벡터에 전이시킨다(도 2참고). 동종 재조합의 결과로 28 Kb 이상의 플라스미드가 생성된다. Pac I 엔도뉴클레아제로 절단한 후에 이 플라스미드는 293-Cre 세포 라인으로 전이되고, 그 후 헬퍼 아데노바이러스 AdInvLΨL-GFP로 감염된다. 293-Cre 세포 라인에서 Cre 리콤비나제(Cre recombinase)의 발현은 헬퍼 아데노바이러스에서 패키징 시퀀스의 양쪽에 위치한 Lox P 사이트 사이에서 재조합을 증진하여, 이는 비록 패키지 되는 능력은 상실되지만, 복제하는 능력은 유지되고 따라서 헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터의 지놈을 포함하는 바이러스 입자의 형성에 필요한 바이러스 단백질을 트랜스형으로 제공한다.
실시예 3: 아데노바이러스로 감염된 일차적인 유방상피 배양 세포에서 인간 성장 호르몬(hGH) 및 인간 에리스로포이에틴(hEPO)의 발현.
아데노바이러스 벡터에 구성된 hGH 및 hEPO에 대한 발현 카셋트의 바른 기능화를 시험하기 위해, 유방 상피의 HC11 세포를 감염시킨다. 세포는 EGF(10ng/ml) 및 인슐린(10 ㎍/ml)이 보충된 DMEM 배지에서 배양된다. 80%의 합류점(confluence)에서, 세포당 20 입자의 비율로 아데노바이러스 벡터가 세포 배양에 부가된다. 24 시간 후 배지는 FCS 없이 EGF 및 인슐린으로 보충된 동일한 배지로 교체된다. 48 시간 후, 배지가 수집되고, 1ml 안에 포함된 단백질은 트리클로로아세트산으로 침전되고 40 ㎕의 물에 재현탁되고, 20 ㎕는 전기영동과 연속하는 웨스턴 블럿팅 어세이를 위해 사용된다.
실시예 4: 마우스의 밀크에서 인간 성장 호르몬(hGH) 및 인간 에리스로포이에틴(hEPO)의 발현.
MGE를 감염하고 더 나아가 대상 단백질의 밀크에 분비를 증진하는 아데노바이러스의 능력은 마우스에서 분석된다. 세 실험군이 각각 5마리의 마우스로 구성되었다. B6D2F1 암컷 마우스에 임신 17일에 실험군마다 바이러스를 포함하는 100 ㎕의 제제를 주입한다: 즉 I군 - hGH의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 (ΔE1ΔE3)의 2.5x107 GTU/ml; II군 - hEPO의 유전자를 포함하는 아데노바이러스 (ΔE1ΔE3)의 1x109 GTU/ml; III군 - 식염수 용액을 각각 주입한다.
처리된 마우스의 착유는 분만 후의 제2의 날 이후에 시작된다. 수집된 밀크는 분리 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM CaCl2)에서 1:5로 희석되고 카제인은 유장으로부터 15,000g에서 30분 동안 4℃에서 냉 원심분리에 의해 분리된다.
밀크 샘플 내에 hGH의 함량은 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되고, ELISA (hGH ELISA, Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 585 878)에 의해 정량된다(도 3참고). hEPO의 함량 또한 웨스턴 블럿팅에 의해 검출되고, ELISA (CIGB에서 제조된 ELISA)에 의해 정량된다(도 4참고).
실시예 5: 염소에서 젓 분비의 유도.
유선으로 유전자의 전이를 위한 재조합 아데노바이러스 벡터는 어떤 종의 포유동물에서도 실질적으로 사용될 수 있지만, 그 높은 밀크 생산 능력에 기인하여 반추동물이 바람직하다. 포유발생 및 젓의 분비가 호르몬적으로 유도될 수 있는 성적 성숙기의 초기 단계에 있는 동물이 사용될 수 있다. 자연적 상태로 젓을 분비하는 동물이 또한 사용될 수 있다. 만일 사용된 동물이 예를 들어 염소라면, 호르몬의 유도는 1, 3, 5, 7, 9, 11 및 13일에 에스트라디올(0.25 mg/kg, i.m) 및 프로게스테론(0.75 mg/kg, i.m.)을 투여함에 의해 이루어질 수 있고 반면에 5일 부터 젓통을 매일 맛사지하면서 14 내지 16일에 프레드니솔론(0.4 mg/kg, i.m)이 투여되어야 한다.
실시예 6: 염소의 유선에 인간 성장 호르몬 hGH의 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 (ΔE1ΔE3)의 주입.
젓의 분비기에 있는 염소에 처리기간 동안 스트레스를 줄이기 위해 근육내로 10mg의 디아제팜(diazepam)이 투여된다. 동물은 강(腔)으로부터 가능한 한 많은 밀크를 제거하기 위해 광범위하게 착유된다. 유선은 37℃에서 200ml 식염수의 주입에 의해 2회 세정되고 이어서 착유된다. 모든 주입은 카테테르에 연결된 50-ml 주사기로 젓꼭지의 유로를 통해 직접적으로 이루어진다. 주입은 서서히 수행되고 동시에 주입된 젓통은 맛사지 된다.
염소에 있어서, 젓통은 두 개의 독립된 반구체로 분리되어 있는데, 이들 중 하나는 아데노바이러스의 벡터를 포함하는 용액이 주입되고 반면 다른 하나는 단지 식염수만이 주입되어 네거티브 내부 대조로서 사용된다. 각 유선에 109 GTU/ml의 바이러스가 포함된 200ml의 식염수의 용액, 다시 말하여 각 유선에 전체 2 x 1011의 바이러스 입자가 주입된다. 주입 후, 용액의 균일한 분산을 용이하게 하고 용액이 모든 관로 및 소낭에 도달하도록 하기 위해 젓통이 맛사지된다. 주입된 용액은 착유에 의해 다음 날에 제거된다.
실시예 7: 염소의 유선에 에리스로포이에틴을 함유하는 재조합 헬퍼-의존 아데노바이러스의 주입.
젓의 분비기에 있는 염소는 처리기간 동안 스트레스를 줄이기 위해 근육내로 10mg의 디아제팜이 투여된다. 동물은 강(腔)로부터 가능한 한 많은 밀크를 제거하기 위해 광범위하게 착유된다. 유선은 37℃에서 200ml 식염수의 주입에 의해 2회 수세되고 이어서 착유된다. 모든 주입은 카테테르에 연결된 50-ml 주사기로 젓꼭지의 유로를 통해 직접적으로 이루어진다. 주입은 서서히 수행되고 동시에 주입된 젓통은 맛사지된다.
염소에 있어서, 젓통은 두 개의 독립된 반구체로 분리되어 있는데, 이들 중 하나는 아데노바이러스의 벡터를 포함하는 용액이 주입되고 반면 다른 하나는 단지 식염수만이 주입되어 네거티브 내부 대조로서 사용된다. 각 유선에 109 GTU/ml의 바이러스가 포함된 200ml의 식염수의 용액, 다시 말하여 각 유선에 전체 2 x 1011의 바이러스 입자가 주입된다. 주입 후, 용액의 균일한 분산을 용이하게 하고 용액이 모든 관로 및 소낭에 도달하도록 하기 위해 젓통이 맛사지된다. 주입된 용액은 착유에 의해 다음 날에 제거된다.
실시예 8: 아데노바이러스 벡터가 주입된 염소의 밀크에서 hGH 및 hEPO의 검출.
주입 후 48시간부터 주입된 동물로부터 밀크가 손으로 착유되어 수집된다. 매일 두 번의 착유가 수행되고, 한번은 아침에 다른 한번은 늦은 오후에 수행된다. 수집된 밀크의 대부분은 이후의 단백질의 정제를 위해 -70℃에서 저장되고, 소량의 샘플은 각 롯트에서 hGH 및 hEPO의 함량을 검출하고 정량하기 위해 사용된다.
hGH 또는 hEPO의 검출은 다음과 같이 수행된다. 150 ㎕의 밀크 샘플에 네 개의 부피로 분리된 완충액(10 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2)이 부가되고 15000g에서 30분 간 4℃에서 원심분리되어 지방 및 카제인으로부터 유장을 분리한다. 유장 분획이 회수되고 10 ㎕에 포함된 단백질은 12.5% 아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 단백질은 니트로셀루로스 필터에 이동되고 hGH (1/500)에 대해 다클론성 항체로 표지된다. 면역반응성 밴드는 어머샴 파마시아 바이오텍(Amersham Pharmacia Biotech)사로부터의 케미루미니슨트 시스템(chemiluminiscent system; ECL)에 의해 인지된다(도 5B 참고).
hGH의 정량은 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim) (Cat. No. 1 585 878)사로부터의 hGH ELISA에 의하여 수행된다. 모든 절차는 제조사의 지시에 따라 수행된다.
hEPO의 정량은 큐바 하바나에 있는 센터 포 제네틱 엔지니어링 엔드 바이오텍크놀로지(Center for Genetic Engineering and Biotechnology)에서 제조된 샌드윗치 ELISA에 의하여 수행된다.
ΔE1ΔE3의 아데노바이러스 벡터가 주입된 동물에서, hGH는 처음 3일 동안 0.3 mg/ml로 주입 후 11일 까지 검출된다(도 5C 참고).
헬퍼-의존 아데노바이러스 벡터로 접종된 동물의 경우에 있어서, hEPO의 준위 또한 상당히 높다(도 6참고). 이들 벡터의 사용은 처음 5주 동안 0.2 mg/ml보다 우수한 발현수준으로 생산하여, 주입 후 145일에 5ng/ml에 도달할 때까지 서서히 감소한다.
본 발명에서 제안된 방법은 단백질 구성의 생물약학 제품의 생산에 대해 증가하는 요구에 대한 해결책을 구성한다. 특히 본 발명은 그 생물학적 활성이 복잡한 번역 후 과정에 긴밀하게 연결되고 따라서 고등 생물체의 생합성 기구에 의존하는 단백질의 대규모 생산을 가능하게 한다. 여기서 제시된 방법은 이러한 단백질의 생산을 빠르고, 간단하고 경제적으로 달성할 수 있게 한다. 이러한 관점에서, 본 발명은 시장 사정의 변화에 따라 단기간에 빨리 대응할 수 있게 하고, 그적용은 큰 기술적 요구를 포함하지 않으며 반응 용량이 수요에 의존하여 용이하게 조절될 수 있다.
부가적으로, 본 발명은 다른 종의 유선의 번역 후의 변이(modification)의 연구에 대한 대안으로서 시간 및 자원의 절약을 가능하게 한다. 연구 하에 있는 단백질의 코딩 시퀀스가 아데노바이러스에 포함된다는 것을 고려하면, 이것은 광범위한 종의 유선으로 전이가 될 수 있어, 이 방법은 단백질이 생산되어지는 그 종에 따라서 동일한 단백질에서 일어나는 차별적인 변형을 연구할 수 있게 한다.

Claims (4)

  1. a) 성적 성숙의 초기 단계 동안에 포유동물의 젓의 분비 유도;
    b) 바이러스 주입 전에 유선의 내부의 완전한 수세 및 밀크의 제거;
    c) 대상단백질인 이종기원 단백질을 코드하는 유전자를 가지는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 용액을 유선의 용량이 채워질 때까지 젓꼭지 유로를 통한 주입;
    d) 주입 후 4 내지 24시간 사이에 유선을 추출 ;
    e) 주입 48시간 후부터 유선에 함유된 밀크의 수집; 및
    f) 밀크로부터 대상단백질인 이종기원 단백질의 정제;
    의 단계를 포함하는, 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 유성 상피 세포(MGE)에 의해 매개된 비인간 포유동물의 밀크로부터 이종기원 단백질의 생산 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 대부분의 아데노바이러스 유전자를 포함하는 이종기원 단백질의 생산 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 대부분 또는 모든 아데노바이러스 유전자를 결핍한 아데노바이러스이고 바이러스 입자의 형성을 위해 요구된 모든 필요 단백질을 트랜스형으로 제공하는 헬퍼 아데노바이러스를 필요로 하는 이종기원 단백질의 생산 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 대상인 이종기원 단백질은 인간 성장 호르몬, 상피 성장 호르몬, 인슐린 형 성장 호르몬, 그래뉼로사이트 매크로파아지 콜로니 자극 인자, 신경 성장 인자, 에리스로포이에틴, FVIII 및 FIX와 같은 응집인자, 항체, 인터류킨 6 또는 인터류킨 2와 같은 싸이토카인, α-1 안티트립신, 인간 혈청 알부민, β 글로빈, 조직 플라스미노겐 활성자, p53과 같은 종양 억제 단백질, 단백질 C 또는 인터페론으로 구성된 군으로부터 선택된 이종기원 단백질의 생산 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU23544A1 (es) * 2006-02-28 2010-06-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la peste porcina clásica
CU23576A1 (es) * 2006-02-28 2010-09-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Antígenos vacunales quiméricos contra el virus de la influenza aviar
CN1869217B (zh) * 2006-05-22 2013-08-07 李青旺 以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法
AU2009266603B2 (en) 2008-06-30 2013-01-24 Cho-A Pharm Co., Ltd. Gene of porcine alpha-s1 casein, a promoter of the same and use thereof
CA2858825A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Lfb Usa, Inc. Recombinant human alpha-1-antitrypsin for the treatment of inflammatory disorders
CL2014002410A1 (es) * 2014-09-12 2014-11-14 Univ Concepcion Método para la producción de proteínas recombinantes en glándula mamaria de mamíferos mediante la transformación del epítelio glandular mamario con vectores adenoasociados.
WO2018085967A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Guangzhou Institutes Of Biomedicine And Health, Chinese Academy Of Sciences Genetically humanized mammals expressing human serum albumin and uses thereof
WO2021013997A1 (en) 2019-07-25 2021-01-28 Medichem, S.A. Process for the synthesis of n-alkyl-4-pyridinamines

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5780009A (en) * 1995-01-20 1998-07-14 Nexia Biotechnologies, Inc. Direct gene transfer into the ruminant mammary gland
AU7719596A (en) * 1995-11-07 1997-05-29 Baylor College Of Medicine Adenovirus-mediated production of bioactive proteins by mammalian cells and animals
CA2258755A1 (en) * 1996-06-20 1997-12-24 Merck & Co., Inc. Gene therapy for obesity
EP1056840A1 (en) * 1998-02-24 2000-12-06 Her Majesty in Right of Canada, as represented by The Minister of Agriculture and Agri-Food Trans-somatics with gene transfer into mammary epithelial cells
AU2002228730A1 (en) * 2000-10-27 2002-05-06 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Mammary secreted protein 36 (msp36) for cancer treatment and diagnosis

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