KR20050046714A - 2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료및 예방 방법 - Google Patents

2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료및 예방 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050046714A
KR20050046714A KR1020057001685A KR20057001685A KR20050046714A KR 20050046714 A KR20050046714 A KR 20050046714A KR 1020057001685 A KR1020057001685 A KR 1020057001685A KR 20057001685 A KR20057001685 A KR 20057001685A KR 20050046714 A KR20050046714 A KR 20050046714A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
group
optionally substituted
same
alkyl
groups
Prior art date
Application number
KR1020057001685A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101297924B1 (ko
Inventor
라진더 싱
앙쿠쉬 아게이드
도날드 쥐. 페이얀
제프리 클러프
홀거 케임
캐서린 실베인
휘 리
소마세카 브하미디파티
Original Assignee
리겔 파마슈티칼스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리겔 파마슈티칼스, 인크. filed Critical 리겔 파마슈티칼스, 인크.
Priority claimed from PCT/US2003/024087 external-priority patent/WO2004014382A1/en
Publication of KR20050046714A publication Critical patent/KR20050046714A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101297924B1 publication Critical patent/KR101297924B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings
    • C07D407/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D498/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D498/04—Ortho-condensed systems

Abstract

본 발명은 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 이용한 자가면역질환의 치료 또는 예방 방법뿐만 아니라 이러한 질환과 관련된 증상의 치료, 예방 또는 개선 방법을 제공한다. 이러한 화합물들로 치료하거나 예방할 수 있는 자가면역질환의 구체적인 예로, 류마티스성 관절염 및/또는 이와 관련된 증상, 전신성 루푸스 및/또는 이와 관련된 증상, 그리고 다발성 경화증 및/또는 이와 관련된 증상 등이 있다.

Description

2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료 및 예방 방법{METHODS OF TREATING OR PREVENTING AUTOIMMUNE DISEASES WITH 2,4-PYRIMIDINEDIAMINE COMPOUNDS}
4. 발명의 요약
한 측면에서는, 본 발명은 다음에서 상세히 설명되는 무수한 생물학적 활성을 가진 새로운 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 제공한다. 이러한 화합물은 일반적으로 다음의 구조와 번호 규약을 가진 2,4-피리미딘디아민 "핵심"으로 구성된다:
본 발명의 화합물은 C2 질소(N2)에서 치환이 되어 이차 아민을 형성하며, 선택적으로 다음 중 하나 이상의 위치에서 추가적으로 치환된다: C4 질소(N4), C5 위치 및(또는) C6 위치. N4에서 치환되면, 치환기는 이차 아민을 형성한다. N2에서의 치환기는 물론 다른 위치에서의 선택적 치환기도 그 특성과 물리화학적 물성이 다양할 수 있다. 예를 들어, 치환기(들)은 가지 사슬, 곧은 사슬 또는 고리형 알킬, 가지 사슬, 곧은 사슬 또는 고리형 헤테로알킬, 모노- 또는 폴리사이클릭 아릴, 모노- 또는 폴리사이클릭 헤테로아릴 또는 이러한 기들의 조합일 수 있다. 이러한 치환기들은 다음에서 보다 상세히 설명되는 바와 같이 더 치환될 수 있다.
N2 및/또는 N4 치환기는 해당 질소 원소에 직접 부착되거나, 또는 해당 질소 원자로부터 링커를 통하여 간격을 둘 수 있으며, 이러한 링커는 동일하거나 다를 수 있다. 링커의 성격은 광범위하며, 실질적으로 한 분자 부분에서 다른 부분으로 공간을 두는 데 유용한 원자나 기들의 모든 조합이 포함될 수 있다. 예를 들어, 링커는 비고리 탄화수소 다리(예: 메타노, 에타노, 에테노, 프로파노, 프로[1]케노, 부타노, 부[1]테노, 부[2]테노, 부타[1,3] 디에노 등과 같은 포화 또는 비포화 알킬레노, 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄화수소 다리(예: [1,2]벤제노, [2,3]나프탈레노 등), 단순 비고리 이종원자 또는 헤테로알킬디일다리(예: -O-, -S-, -S-O-, -NH-, -PH-, -C(O)-, -C(O)NH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -S(O)2NH-, -O-CH2-, -CH2-O-CH2-, -O-CH=CH-CH2- 등), 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 헤테로아릴 다리(예: [3,4]퓨라노, 피리디노, 티오페노, 피페리디노, 피페라지노, 파리지디노, 피롤리디노 등) 또는 이러한 다리들의 조합일 수 있다.
N2, N4, C5 및/또는C6 위치에서의 치환기는 물론 선택적 링커는 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 치환기로 더 치환될 수 있다. 이러한 치환기들의 성격은 광범위하다. 적절한 치환기에 대한 비제한적인 실시예에는, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 알킬, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 헤테로알킬, 모노- 또는 폴리사이클릭 아릴, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 헤테로알킬, 모노- 또는 폴리사이클릭 헤테로아릴, 할로, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 할로알킬, 히드록실, 옥소, 티옥소, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 알콕시, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 할로알콕시, 트리트리플루오로메톡시, 모노- 또는 폴리사이클릭 아릴옥시, 모노- 또는 폴리사이클릭 헤테로아릴옥시, 에테르, 알코올, 황화물, 티오에테르, 술폰일(티올), 이민, 아조, 아자이드, 아민(일차, 이차 및 삼차), 니트릴(모든 이성질체), 시안염(모든 이성질체), 티오시안염(모든 이성질체), 니트로소, 니트로, 디아조, 술폭사이드, 술폰일, 술폰산, 술파마이드, 술폰아미드, 술폰산 에스테르, 알데히드, 아세틸렌, 케톤, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 아미딘, 포르마딘, 아미노산, 아세틸렌, 카밤산염, 락톤, 락탐, 글루코시드, 글루콘유리드, 술폰, 케탈, 아세탈, 티오케탈, 옥심, 옴삼산, 옥삼산 에스테르 등 그리고 이러한 기들의 조합이 포함된다. 반응성 기능을 소유한 치환기는 당업계에서 잘 알려진 바와 같이 보호되거나 보호되지 않을 수 있다.
한 예시적 실시예에서는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 다음 구조식(I)에 의한 화합물로서:
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며:
상기식에서 L1과 L2은 각각 직접 결합과 연결자(linker)로 구성된 군에서 선택되었다.
R2 는 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
R4 는 수소, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
R5는R6 , R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알카닐, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알케닐 및 R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알키닐로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
각 R6 는 수소, 전기음전성 그룹, -ORd, -SRd, (C1-C3) 할로알킬옥시, (C1-C3) 퍼할로알킬옥시, -NRcRc, 할로겐, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 퍼할로알킬, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcR c, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRc Rc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcR c, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRc Rc 및 -[NHC(NH)]nNRcRc, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C10) 아릴, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C6-C16) 아릴알킬, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 5-10인 헤테로아릴, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 6-16인 헤테로아릴알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되었다.
R8 은 Ra, Rb, Ra 또는 Rb과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 Ra, Ra 또는 Rb과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 -ORa, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH 2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O-(CH2 )m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m -Rb, -O- (CH2)m-CH[(CH2)mRb]R b, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2) m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa )m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m-Rb , -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -NH[(CH 2)mRb], -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH-(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb 및 -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH 2)m-Rb 로 구성된 그룹에서 선택되었다.
각 Ra는 수소, (C1-C6) 알킬, (C3-C8) 시클로알킬, 시클로헥실, (C4-C11) 시클로알킬알킬, (C5-C10) 아릴, 페닐, (C6-C16) 아릴알킬, 벤질, 탄소수 2-6 인 헤테로알킬, 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, 모폴리닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 피페리디닐, 탄소수 4-11인 시크로헤테로알킬알킬, 탄소수 5-10인 헤티로아릴 및 탄소수 6-16인 헤테로아릴알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되었다.
각 Rb는 O, -ORd, (C1-C3) 할로알킬옥시, =S, -SRd, =NRd, =NOR d, -NRcRc, 할로겐, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)R d, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRc Rc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc , -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcR c, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcR c, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NRaC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)] nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)] nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc 및 -[NRaC(NRa)]nNR cRc로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된 적절한 기이다.
각 Rc은 독립적으로 보호기이거나 Ra, 또는 다른 방식으로, 각 Rc는 동일하거나 다른 추가 헤테로원자들 중에서 한 개 이상을 선택적으로 포함시킬 수 있고 동일하거나 다른 Ra 또는 적당한 Rb 그룹 중에서 한 개 이상을 선택적으로 치환할 수 있는 탄소수 5-8인 시클로헤테로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하기 위해 결합한 질소 원자와 결합하였다.
각 Rd는 독립적으로 보호기이거나 Ra이며,
각 m은 독립적으로 1부터3까지의 정수이며,
각 n은 독립적으로 0에서 3까지의 정수이다.
다른 측면에서는, 본 발명은 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 전구 약물을 제공한다. 이러한 전구 약물은 해당 전구 약물 형태로서 활성일 수 있으며 혹은 생리적 또는 사용되는 다른 조건 하에서 활성 약물로 변환될 때까지 비활성일 수 있다. 본 발명의 전구 약물에서는, 2,4-피리미딘디아민 화합물의 하나 이상의 작용기들이 사용하는 조건 하에서 분자로부터 벽개되는 프로모이티들에 포함되며, 이러한 벽개는 가수분해, 효소적 벽개 또는 그 밖의 벽개 기전에 의해 대개 이루어져 작용기들을 생성한다. 예를 들어, 일차나 이차 아미노기는 사용하는 조건 하에서 벽개되는 아미드 프로모이티에 포함되어 일차나 이차 아미노기를 생성할 수 있다. 그리므로 본 발명의 전구 약물에는 "프로그룹"이라고 부르는 특수한 유형의 보호기들이 포함되며, 사용되는 조건 하에서 벽개되어 활성 2,4-피리미딘디아민 약물의 화합물을 생성하는 하나 이상의 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 덮는다. 프로모이티에 포함되는 프로 그룹으로 덮을 수 있는 2,4-피리미딘디아민 화합물들 내의 작용기에는, 아민 (일차 및 이차), 히드록실, 술파닐 (티올), 카르복실, 카르보닐, 페놀, 카테콜, 디올, 알킨, 인산염 등이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 이러한 작용기들을 덮으며, 사용하는 바람직한 조건 하에서 벽개가 가능한 프로모이티를 생성할 수 있는 수많은 프로그룹들이 당업계에 알려져 있다. 이러한 프로그룹들은 개별적으로 또는 조합으로 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있다. 일차 또는 이차 아민기를 생성하며 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있는 프로모이티의 구체적인 실시예에는 아미드, 카밤산염, 이민, 요소, 포스페닐, 포스포릴 및 술페닐이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 술파닐기를 생성하며 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있는 프로모이티의 구체적인 실시예에는 티오에테르 등이 포함되며, 그 예로는 S-메틸 유도체들(모노티오, 디티오, 옥시티오, 아미노티오 아세탈), 시릴 티오에테르, 티오에스테르, 티오탄산염, 티오카밤산염, 비대칭 이황화물 등이 있다. 벽개하여 히드록실이기를 생성하며 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있는 프로모이티의 구체적인 실시예에는 술폰산염, 에스테르 및 탄산염이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 카르복실기를 생성하며 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있는 프로모이티의 구체적인 실시예에는 에스테르(시릴 에스테르, 옥삼산 에스테르, 티오에스테르 등), 아미드 및 하이드라지드가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
한 예시적 실시예에서는, 본 발명의 전구 약물들이 구조식(I)에 의한 화합물로서 Rc 및 Rd의 보호기가 프로그룹이다.
구조식(I)의 2,4-피리미딘디아민에서 N2 및 N4에 부착된 수소를 치환기로 치환하는 경우 그 화합물의 활동도에 부정적인 영향을 주게 된다. 그러나, 당업자라면 알 수 있듯이, 이러한 질소는 사용 조건 하에서 절단을 통해 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 생성하는 프로모이티에 포함될 수 있다. 그러므로, 또 다른 예시적 실시예에서는, 본 발명의 전구 약물은 구조식(II)에 의한 화합물로서:
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며:
R2, R4, R5, R6, L1 및 L2는 구조식(I)으로 이미 정의된 바와 같으며;
R2b 및 R4b는 각각 서로 독립된 프로그룹이다.
다른 측면에서는, 본 발명은 하나 이상의 화합물 및/또는 본 발명의 전구 약물 그리고 적절한 운반체, 부형제 또는 희석제로 구성된 성분을 제공한다. 운반체, 부형제 또는 희석제의 정확한 성격은 해당 성분에 대해 바라는 용도에 따라 다르며, 수의학 용도에 적절하거나 허용될 수 있는 것부터 인체를 위한 용도에 적절하거나 허용될 수 있는 것까지 다양하다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 2,4-피리미딘디아민과 전구 약물의 합성에 유용한 중간체들을 제공한다. 한 실시예에서는, 중간체들은 구조식(III)에 의한 4-피리미딘아민으로서:
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며, 여기서 R4, R5, R6 및 L2는 구조식(I)로 이미 정의된 바와 같으며; LG는 예를 들어 -S(O)2Me, -SMe 또는 할로(예: F, Cl, Br, I)와 같은 이탈기이며; R4c는 수소 또는 프로그룹이다.
한 실시예에서는, 중간체들은 구조식(III)에 의한 2-피리미딘아민으로서:
; LG는 예를 들어 -S(O)2Me, -SMe 또는 할로(예: F, Cl, Br, I)와 같은 이탈기이며, 여기서 R2, R5, R6 및 L1은 구조식(I)으로 이미 정의된 바와 같으며; LG는 예를 들어 -S(O)2Me, -SMe 또는 할로(예: F, Cl, Br, I)와 같은 이탈기이며, R2c는 수소 또는 프로그룹이다.
또 하나의 다른 실시예에서는, 중간체들은 구조식(V)에 의한 4-아미노 또는 4-히드록시-2-피리미딘아민으로서:
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며, 여기서 R2, R5, R6 및 L1는 구조식(I)로 이미 정의된 바와 같으며, R7은 아미노 또는 히드록실기이며, R2c는 수소 또는 프로그룹이다.
또 하나의 실시예에서는, 중간체들이 구조식(IV)에 의한 N4-치환 사이토신으로서;
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며 여기서 R4, R5, R6 및 L2는 구조식(I)로 이미 정의된 바와 같으며, R4c는 수소 또는 프로그룹이다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들과 전구 약물들을 합성하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 그 방법은 구조식(III)
또 다른 측면에서는, 본 발명은 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들과 전구 약물들을 합성하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 그 방법은 구조식(III)에 의한 4-피리미딘아민을 화학식 HR2cN-L1-R2의 아민과 반응시키며, 여기서 L1, R2 및 R2c는 구조식 (IV)에 이미 정의된 바와 같으며 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민 또는 구조식 (II)에 의한 전구 약물을 생성한다.
다른 실시예에서는, 그 방법은 구조식(IV)에 의한 2-피리미딘디아민 화학식 R4-L2-NHR4c의 아민과 반응시키며, 여기서 L4, R4 및 R4c는 구조식(III)에 이미 정의된 바와 같으며 구조식(I)에 의한 2,4-피리미딘아민 또는 구조식(II)에 의한 전구 약물을 생성한다.
또 다른 실시예에서는, 그 방법은 구조식 (V) (여기서 R7은 아미노기)에 의한 4-아미노-2-피리미딘아민과 화학식 R4-L2-NHR4c의 아민을 반응시키며, 여기서 L2, R4 및 R4c는 구조식 (III)에 이미 정의된 바와 같으며 구조식(I)에 의한 2,4-피리미딘디아민 또는 구조식 (II)에 의한 전구 약물을 생성한다. 다른 방식으로,는, 4-아미노-2-피리미딘아민과 화학식 R4-L2-LG의 화합물과 반응시킬 수 있으며, 여기서 R4 및L2는 구조식 (I)에 이미 정의된 바와 같으며 LG는 이탈기이다.
또 다른 실시예에서는, 그 방법은 구조식 (V) (R7은 히드록실이기)에 의한 4-히드록시-2-피리미딘아민을 할로겐화하여 구조식 (IV)에 의한 2-피리미딘아민을 생성하며, 위에서 설명한 바와 같이 이 피리미딘아민을 적절한 아민과 반응시킨다.
또 다른 실시예에서는, 그 방법은 구조식 (IV)에 의한 N4-치환 사이토신을 할로겐화하여 구조식 (III)에 의한 4-피리미딘아민을 생성하며, 위에서 설명한 바와 같이 이 피리미딘아민을 적절한 아민과 반응시킨다.
본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 비만 세포, 호염기구, 호중구 및/또는 호산구 세포와 같은 면역 세포들의 탈과립에 대한 강력한 억제제이다. 그러므로, 또 다른 하나의 측면에서는, 본 발명은 그러한 세포들의 탈과립에 대한 조절 그리고 특히 억제의 방법을 제공하는 것이다. 그 방법은 일반적으로 세포의 탈과립 조절이나 억제에 대해 효과적인 분량의 2,4-피리미딘디아민이나 본 발명의 전구 약물, 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 질소산화물 및/또는 이것들에 의한 성분을 사용하여 탈과립을 수행하는 세포를 접촉하는 것이다. 그 방법은 세포의 탈과립에 의해 특징지워지거나 그로 인해 유발되거나 또는 그와 연관 있는 질병의 치료 혹은 예방을 위한 치료용 접근 방식으로,서 시험관이나 생체내에서 실행할 수 있다.
어떠한 동작 이론에 의해 구속하려는 의도는 없지만, 생화학적 자료에 의하면 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 적어도 부분적으로, IgE ("FcεRI") 및/또는 IgG ("FcγRI")에 대한 고친화성 수용체의 교차 결합에 의해 개시되는 신호 도입카스케이드(들)을 차폐 또는 억제함으로써 자체의 탈과립 억제 효과를 적어도 부분적으로 인가한다. 실제로, 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 FcεRI 매개 및FcγRI 매개 탈과립에 대한 강력한 억제제이다. 결과적으로 2,4-피리미딘 화합물들은 대식세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구 및/또는 호산구 등의 FcεRI 및/또는 FcγRI 수용체를 발현하는 모든 세포 유형에 있어서 이러한 Fc 수용체 신호전달 순차반응을 억제하는 데에 사용할 수 있다.
또한, 이러한 방법들은 그러한 Fc 수용체 신호전달 순차반응을 활성화 시키는 결과로 일어나는 하류 과정들에 대한 조절 특히 억제를 허용한다. 이러한 하류 과정에는 FcεRI 매개 및/또는 FcγRI 매개 탈과립, 사이토카인 생성 및/또는 류코트리엔, 프로스타글란딘과 같은 지질 매개물질의 생성 및/또는 방출이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 그 방법은 일반적으로 Fc 수용체 신호전달 순차반응 및/또는 그러한 신호전달 순차반응의 활성화에 의해 발현되는 하류 과정을 조절 또는 억제하는 데 충분한 양을 가진, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민이나 전구 약물 또는 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 질소산화물 및/또는 이것들에 의한 성분으로써, 위에서 설명한 세포 유형과 같은 Fc 수용체를 발현하는 세포를 접촉하는 것이다. 그 방법은 탈과립 시 과립별 화학 매개물질의 방출, 사이토카인의 방출 및/또는 합성 그리고/또는 류코트리엔과 프로스타글란딘과 같은 지질 매개물질의 방출 및/또는 합성에 의한 질병과 같은, Fc 수용체 신호전달 순차반응에 의해 특징지워지거나, 그로 인해 유발되거나 또는 그와 연관 있는 질병들의 치료 혹은 예방을 위한 치료용 접근 방식으로,서 시험관이나 생체내에서 실행할 수 있다.
또 다른 측면에서는, 본 발명은 FcεRI 및/또는FcγRI- 신호전달 순차반응과 같은 Fc 수용체 신호전달 순차반응의 활성화에 의한 결과로써 화학 매개물질의 방출로 특징지워지거나, 그로 인해 유발되거나 또는 그와 연관 있는 질병들의 치료 및/또는 예방의 방법들을 제공한다. 그 방법들은 동물이나 인체에서 실행할 수 있다. 그 방법들은 일반적으로 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물이나 전구 약물 또는 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 질소산화물 및/또는 이것들에 의한 성분을 해당 질병의 치료나 예방에 유효한 양만큼 동물 대상이나 인간에게 투여하는 것이다. 이미 설명한 바와 같이, 특징 면역 세포에서의 FcεRI 또는 FcγRI 수용체 신호전달 순차반응의 활성화는 다양한 질병에 대한 약리학적 매개물질인 다양한 화학 물질들의 방출 및/또는 합성을 유도한다. 이러한 모든 질병들은 본 발명의 방법들에 의해서 치료나 예방이 가능하다.
예를 들어, 비만 세포와 호염기구 세포에 있어서, FcεRI 또는 FcγRI 신호전달 순차반응의 활성화는 탈과립 과정을 통하여 아토피 반응 및/또는 제1형 과민 반응의 사전 성형된 매개물질(예: 히스타민, 트립타제와 같은 프로테아제 등)의 즉각적인 (예: 수용체 활성화 후 1-3분 이내) 방출을 유도한다. 이러한 아토피 반응이나 제1형 과민 반응에는 환경이나 다른 알레르겐(예: 꽃가루, 곤충 및/또는 동물의 독액, 식품, 약물, 염료 등)에 대한 아나필락시 반응, 건초열, 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 알레르기성 천식, 아토피성 피부염, 습진, 두드러기, 점막 질환, 조직 질환 및 특정 위장 질환 등이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
사전 성형된 매개물질의 탈과립을 거친 즉각적인 방출이 있게 되면, 혈소판 활성화 인자(PAF), 프로스타글란딘, 류코트리엔(예: LTC4) 등과 같은 다른 다양한 화학 매개물질의 방출 및 합성 그리고 TNFα, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 등과 같은 사이토카인의 신생(de novo) 합성 및 방출이 그 뒤를 따르게 된다. 이 두 가지 과정의 첫 번째는 수용체 활성화 이후 약 3 - 30분 이내에 발생하며, 두 번째는 수용체 활성화 이후 약 30분 - 7 시간 이내에 발생한다. 이러한 "후기"의 매개물질들은 위에 열거한 아토피 반응과 제1형 과민 반응의 만성 증상들을 부분적으로 유발하는 것으로 사료되며, 또한 염증 및 염증성 질환(예: 골관절염, 염증성 장 질환, 자극성 대장 증후군, 경성 결장 등), 낮은 정도의 흉터(예: 공피증, 증가된 섬유증, 해족증, 수술후 흉터, 폐 섬유증, 맥관 경련, 편두통, 재칸류 상해, 후 심근경색) 및 건조(Sicca) 증후군의 화학 매개물질이다. 이러한 질병들은 모두 본 발명의 방법들에 따라 치료하거나 예방할 수 있다.
본 발명의 방법들에 의해 치료하거나 예방 가능한 다른 질병에는 호염기구 세포 및/또는 비만 세포의 병리학과 연관 있는 질병들이 포함된다. 이러한 질병의 예로는 공피증과 같은 피부의 질환, 후심근 경색과 같은 심장 질환, 폐 근육의 변화나 재조직 또는 만성폐색성 폐 질환(COPD)과 같은 폐 질환, 염증성 대장 증후군(경성 결장)과 같은 내장의 질환이 포함된다.
또는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 티로신 키나제인 Syk 키나제의 강력한 억제제이다. 그러므로, 또 다른 측면에서, 본 발명은 Syk 키나제 활성의 조절 그리고 특히 억제하는 방법을 제공한다. 그 방법은 일반적으로 Syk 키나제 활성의 조절이나 억제에 효과적인 양을 가진, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물이나 전구 약물 또는 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 질소산화물 및/또는 이들의 성분으로써 Syk 키나제나 Syk 키나제를 구성하는 세포를 접촉하는 것이다. 한 실시예에서, Syk 키나제는 분리된 혹은 재조합체 Syk 키나제이다. 또 다른 실시예에서, Syk 키나제는 비만 세포나 호염기구 등의 세포에 의해 발현되는 내인성 또는 재조합체 Syk 키나제다. 그 방법은 Syk 키나제 활성에 의해 특징지어지거나 초래되거나 또는 그와 연관 있는 질병들의 치료나 예방을 위한 치료 접근 방식으로,써 시험관이나생체내에서 시험할 수 있다.
어떠한 특정 동작 이론에 의해 구속하려는 의도는 없지만, 본 발명의 2,4- 피리미딘디아민 화합물들은 FcεRI의 감마 사슬 호모다이머(예: 그림 2 참조)를 통하여 활성화가 이루어지는 Syk 키나제를 주로 억제함으로써, 세포 탈과립 및/또는 그 밖의 화학 매개물질의 방출을 억제한다. 이러한 감마 사슬 동종이중체는 FcγRI, FcγRIII, FcαRI 등의 다른 Fc 수용체들과 공유된다. 이러한 모든 수용체의 경우, 세포내 신호전달체계는 공통의 감마 사슬 동종이중체에 의해 매개된다. 이러한 수용체들의 결합과 응집은Syk 키나제와 같은 티로신의 동원과 활성화를 초래한다. 이러한 통상적인 시그널링 활동의 결과로써, 여기에서 설명한 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 FcεRI, FcγRI, FcγRIII 및 FcαRI와 같은 그러한 감마 사슬 동종이중체를 가진 Fc 수용체들의 신호전달 순차반응, 그리고 그러한 수용체를 통해 유발된 세포의 반응을 조절하거나 특히 억제하는데 사용할 수 있다.
Syk 키나제는 다른 신호전달 순차반응에서도 중대한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, Syk 키나제는 B-세포 수용체(BCR) 신호전달의 작동인자이며(Turner 등, 2000, Immunology Today 21:148-154) 또한 호중구에서 인테그린 베타(1), 베타(2) 및 베타(3) 신호전달의 필수 성분이다(Mocsai 등, 2002, Immunity 16:547-558). 여기서 설명한 2,4-피리미딘디아민 화합물들은Syk 키나제의 강력한 억제제이므로, 이것들은 Fc 수용체, BCR 및 인테그린 신호전달 순차반응 등 Syk가 역할을 수행하는 모든 신호전달 순차반응은 물론 이러한 신호전달 순차반응을 통해 유발된 세포의 응답을 조절하거나 특히 억제하는 데 사용할 수 있다. 조절이나 억제되는 특정 세포의 반응은, 해당 분야에서 잘 알려진 바와 같이 특정한 세포 유형과 수용체 신호전달 순차반응에 일부 의존하게 된다. 2,4-피리미딘디아민 화합물로써 조절하거나 억제할 수 있는 세포 응답의 예로는 호흡성 방출, 세포성 부착, 세포성 탈과립, 세포 확산, 세포 이동, 식작용(예: 마크로파지), 칼슘 이온 유출(예: 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구 및 B-세포), 혈소판 응집 및 세포 성숙(예:, B 세포의 경우) 등이 있다.
그러므로, 또 다른 측면에서는, 본 발명은 Syk가 역할을 수행하는 신호전달체계를 조절 그리고 특히 억제하는 방법을 제공한다. 그 방법은 일반적으로 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물이나 전구 약물 또는 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 질소산화물 및/또는 이것들의 성분을, 신호전달체계의 조절이나 억제에 유효한 양만큼Syk-의존성 수용체나 Syk-의존성 수용체를 발현하는 세포에 접촉하는 것이다. 이 방법은 하류 과정 또는 특정 Syk-의존성 신호전달체계의 활성화로 유발된 세포 반응을 조절하거나 특히 억제하는데 사용할 수 있다. 또한 이 방법은 특정한 Syk가 역할을 수행하는 것으로 알려지지 않거나 추후 역할을 하는 것으로 밝혀지는 모든 신호전달체계의 조절을 위해서도 실행할 수 있다. 그 방법들은 Syk-의존성 신호전달체계의 활성화에 의해 특징 지워지거나 유발되거나 또는 연관 있는 질병의 치료와 예방을 위한 치료의 접근 방식으로,써 실험관 또는생체내에서 실행할 수 있다. 이러한 질병의 예로는 위에서 설명한 것들이 포함되지만 그로써 제한되지는 않는다.
또한 세포 및 동물 데이터에 의하면 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물은 자가면역질환 및(또는) 증상을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있다. 이 방법은 일반적으로 자가면역질환을 앓고 있거나 자가면역질환 증세가 나타날 위험이 있는 피실험자에게 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 방법 또는 전구 약물, 허용되는 염, 질소산화물, 수화물 또는 이것들에 의한 성분을 자가면역질환 및(또는) 관련 증상을 치료하고 예방하는데 효과적인 양만큼 투여하는 방법이다. 2,4-피리미딘디아민 화합물로 치료하거나 예방할 수 있는 자가면역질환에는 아나필락시형이 아닌 과민반응(제2형, 제3형 및(또는) 제4형)과 연관있는 질환 및(또는) 단핵세포의 FcγR 신호전달체계 활성화로 인해 최소한 부분적인 매개 질환이 포함된다. 이러한 자가면역질환에는 대개 단일 장기 또는 단일 세포형 자가면역장애를 유발하는 자가면역질환 및 전신성 자가면역장애를 유발하는 자가면역질환이 포함되지만 이로써 제한되지 않는다. 단일 장기 또는 단일 세포형 자가면역장애를 유발하는 질환에는 다음과 같은 질환이 포함되며 이에 제한되지 않는다. 하시모토 갑상선염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 악성 빈혈과 관련된 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 뇌척수염, 자가면역성 고환염, 굳패스처(Goodpasture) 질환, 자가면역성 혈소판 감소증, 교감성 안염, 중증근무력증, 그레이브스(Graves) 병, 일차성 담즙성 간경변, 만성공격성 간염, 궤양성 대장염 및 막성 사구체병증. 간혹 전신성 자가면역장애를 유발하는 질환은 다음과 같으며 이에 제한되지 않는다. 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 라이터(Reiter) 증후군, 다발성 근염/피부근염, 전신성 경화증, 결절성 다발동맥염, 다발성 경화증 및 유전포창.
5. 도면의 간단한 설명
그림 1은 알레르겐에 의해 유도되는IgE의 생성 및 그에 따라 비만 세포로부터의 사전 형성되거나 그 밖의 화학 매개물질의 방출을 도시하는 그림이다;
그림 2는 비만 및/또는 호염기구 세포의 탈과립을 초래하는 FcεR1 신호전달체계를 도시하는 그림이다;
그림 3은 상류 FcεRI-매개 탈과립을 선택적으로 억제하는 화합물 그리고 FcεRI-매개 및 이오노마이신 유도 과립화를 모두 억제하는 화합물의 작용에 대해 추정되는 내용을 도시하는 그림이다;
그림 4는 특정한 2,4-피리미딘디아민 화합물, DMSO (콘트롤) 및 이오노마이신이 CHMC 세포에서의 Ca2+ 유출에 미치는 영향을 도시하는 그래프이다;
그림 5는 화합물 R921218 및 R926495의 억제적 활성의 즉시성을 도시하는 그래프이다;
그림 6는 화합물R921218 및 R921302의 억제적 활성의 즉시성을 도시하는 그래프이다;
그림 7은 활성화된 BMMC 세포의 IgE 수용체 신호전달체계에서 다양한 농도의 화합물 R921218 (A) 및 R921219 (B)가 Syk 키나제의 다양한 단백질 하류의 인산화를 억제하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다;
그림 8은 화합물 R921218(X), R921219(Y) 및 R921304(Z)의 농도가 증가하는 환경에서, 내인성 기질(LAT)과 펩티드 기질에 대한 Syk 키나제 인산화의 용량 반응 억제를 보여주는 데이터를 제공한다;
그림 9는 화합물 R921219에 의한 Syk 키나제 억제가 ATP 경쟁적임을 보여주는 데이터이다;
그림 10은 활성화된 CHMC 세포의 FcεRI 신호전달체계에서 다양한 농도의 R921219(A) 및 R218218(B)가 LYN 키나제가 아닌 Syk 키나제의 하류의 단백질 인산화를 억제하는 것을 보여주는 데이터이다; 또한, 알려진 LYN 키나제 억제제(PP2)의 존재 하에서 Syk 키나제가 아닌 LYN 키나제의 하류의 단백질 인산화 억제도 보여준다;
그림 11A-D는 BMMC 세포의 FcεRI 신호전달체계에서 Syk 키나제의 하류의 단백질 인산화 억제를 보여주는 데이터를 제공한다;
그림 12는 콜라겐 항체에 의해 유도된 관절염("CAIA") 쥐 모델에서 화합물 R921302의 효능을 도시하는 그래프이다;
그림 13은 CAIA 모델을 대상으로 화합물 R921302의 효능을 기타 약물 및 조절제와 비교한 그래프이다;
그림 14는 콜라겐에 의해 유도된 관절염("CIA") 증상을 보이는 쥐 모델을 대상으로 화합물 R921302의 효능을 도시한 그래프이다;
그림 15는 다발성 경화증의 임상적 모델인 쥐를 대상으로 화합물 R921302의 실험적 자가면역뇌척수염("EAE") 억제 효능을 도시한 그래프이다;
그림 16은 첫 날 150μg PLP 139-151/200μg MTB(CFA)를 접종한 SJL 쥐를 대상으로 화합물 R921302의 효능을 도시한 그래프이다.
6. 우선 실시예의 상세한 설명
6.1 정의
여기서 사용되는 용어들은 다음의 의미를 갖는다:
"알킬"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 알칸, 알켄 또는 알킨의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 얻어지며 서술된 숫자의 탄소 원자(즉, C1-C6은 하나에서 여섯까지의 탄소를 의미)를 가진, 포화나 불포화 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 단일 원자가 탄화수소를 말한다. 전형적인 알킬기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 안는다: 메틸; 에칸일, 에테닐, 에티닐 등의 에틸; 프로판-1-일, 프로판-2-일, 사이클로 프로판-1-일, 프로프-1-엔-1-일, 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일, 사이클로프로프-1-엔-1-일; 사이클로프로프-2-엔-1-일, 프로프-1-인-1-일 , 프로프-2-인-1-일 등; 부탄-1-일, 부탄-2-일, 2-메틸-프로판-1-일, 2-메틸-프로판-2-일, 사이클로부탄-1-일, 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일 , 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 사이클로부트-1-엔-1-일, 사이클로부트-1-엔-3-일, 사이클로부타-1,3-디엔-1-일, 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일, 등의 부틸; 등등. 특정 수준의 포화를 의도하는 곳에서는, 다음과 같이 정의되는 "알칸일," "알켄일" 및/또는 "알킨일" 명명법이 사용된다. 우선 실시예에서의 알킬기는 (C1-C6) 알킬이다.
"알칸일"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 알칸의 하나의 탄소 분자에서 수소 원자 하나를 제거하여 얻어지는 포화 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 알킬을 말한다. 전형적인 알킬기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 메타닐; 에타닐; 프로판-1-일, 프로판-2-일 (이소프로필), 사이클로프로판-1-일, 등; 부탄-1-일, 부탄-2-일 (sec-부틸), 2-메틸-프로판-1-일 (이소부틸), 2-메틸-프로판-2-일 (t-부틸), 사이클로부탄-1-일, 등의 부탄일; 등등. 우선 실시예에서의 알칸일기는 (C1-C6) 알칸일이다.
"알켄일”은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 부모 알켄의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 얻어지며, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가지는, 불포화 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 알킬을 말한다. 이 기는 이중 결합(등)에 대해 시스 또는 트란스 형태일 수 있다. 전형적인 알켄일기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 에테닐; 프로프-1-엔-1-일 , 프로프-1-엔-2-일, 프로프-2-엔-1-일, 프로프-2-엔-2-일, 사이클로프로프-1-엔-1-일; 사이클로프로프-2-엔-1-일 등의 프로테닐; 부트-1-엔-1-일, 부트-1-엔-2-일, 2-메틸-프로프-1-엔-1-일, 부트-2-엔-1-일, 부트-2-엔-2-일, 부타-1,3-디엔-1-일, 부타-1,3-디엔-2-일, 사이클로부트-1-엔-1-일, 사이클로부트-1-엔-3-일, 사이클로부타-1,3-디엔-1-일 등의 부테닐; 등등. 우선 실시예에서의 알켄일기는 (C2-C6) 알켄일이다.
"알킨일"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 알킨의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 얻어지며, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖는 불포화 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 알킬을 말한다. 전형적인 알킨일기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 에티닐; 프로프-1-인-1-일 , 프로프-2-인-1-일 등의 프로피닐; 부트-1-인-1-일, 부트-1-인-3-일, 부트-3-인-1-일 등의 부티닐; 등등. 우선 실시예에서의 알킨일기는 (C2-C6) 알킨일이다.
"알킬디일”은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 알칸, 알켄 또는 알킨의 두 탄소 원자에서 산소 원자 하나씩을 제거하거나, 어미 알칸, 알켄 또는 알킨의 하나의 탄소 원자에서 두 개의 수소 원자를 제거하여 얻어지며, 서술된 숫자의 탄소 원자(즉, C1-C6은 하나에서 여섯까지의 탄소 원자를 의미)를 갖는, 포화 또는 불포화, 가지, 곧은 사슬 또는 고리형 2가 탄화수소기를 말한다. 두 개의 1가 라디칼 센터 또는 2가 라디칼 센터의 각 원자가는 같거나 다른 원자들과 결합을 형성할 수 있다. 전형적인 알킬디일기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다; 에탄-1,1디일-, 에탄-1,2디일-, 에텐-1,1디일-, 에텐-1,2디일- 등의 프로필디일; 프로판-1,1디일-, 프로판-1,2디일-, 프로판-2,2디일-, 프로판-1,3디일-, 사이클로프로판-1,1디일-, 사이클로프로판-1,2디일-, 프로프-1-엔-1,1디일-, 프로프-1-엔-1,2디일-, 프로프-2-엔-1,2디일-, 프로프-1-엔-1,3디일-, 사이클로프로프-1-엔-1,2디일-, 사이클로프로프-2-엔-1,2디일-, 사이클로프로프-2-엔-1,1디일-, 프로프-1-인-1,3디일 등의 부틸디일; 부탄-1,1디일-, 부탄-1,2디일-, 부탄-1,3디일-, 부탄-1,4디일-, 부탄-2,2디일-, 2-메틸-프로판-1,1디일-, 2-메틸-프로판-1,2디일-, 사이클로부탄-1,1디일-; 사이클로부탄-1,2디일-, 사이클로부탄-1,3디일-, 부트-1-엔-1,1디일-, 부트-1-엔-1,2디일-, 부트-1-엔-1,3디일-, 부트-1-엔-1,4디일-, 2-메틸-프로프-1-엔-1,1디일-, 2-메탄일이덴-프로판-1,1디일-, 부타-1,3-디엔-1,1디일-, 부타-1,3-디엔-1,2디일-, 부타-1,3-디엔-1,3디일-, 부타-1,3-디엔-1,4디일-, 사이클로부트-1-엔-1,2디일-, 사이클로부트-1-엔-1,3디일-, 사이클로부트-2-엔-1,2디일-, 사이클로부타-1,3-디엔-1,2디일-, 사이클로부타-1,3-디엔-1,3디일-, 부트-1-인-1,3디일-, 부트-1-인-1,4디일-, 부타-1,3-다이인-1,4디일-등의 부틸디일; 등등. 특정 수준의 포화를 의도하는 곳에서는, 다음과 같이 정의되는 알칸일디일, 알켄일디일 및/또는 알킨일디일 명명법이 사용된다. 두 원자가가 동일한 탄소 원자에 있음을 구체적으로 의도하는 곳에서는, "알킬이덴" 명명법이 사용된다. 우선 실시예의 알킬디일이기는 (C1-C6) 알킬디일이다. 라디칼 센터가 말단 탄소에 있는 포화 비고리 알칸일디일이기도 선호된다. 예: 메탄디일(메타노); 에탄-1,2디일- (에타노); 프로판-1,3디일- (프로파노); 부탄-1,4디일- (부타노); 등등(알킬레노로도 불리며, 이하에서 정의됨).
"알킬레노”는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 곧은 사슬의 부모 알칼, 알켄 또는 알킨의 두 개의 말단 산소로부터 각각 산소 원자 하나씩을 제거하여 얻어지며, 두 개의 말단 1가 라디칼 센터를 갖는 곧은 사슬 포화 또는 불포화 알킬디일이기를 말한다. 만약 특정 알킬레노에서 이중 결합이나 삼중 결합이 있는 경우, 그 자리는 대괄호로 표시된다. 전형적인 알킬레노기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 에타노, 에테노, 에티노 등의 에틸레노; 프로파노, 프로프 [1]에노, 프로파[1,2]디에노, 프로프[1]이노 등의 프로필레노; 부타노, 부트[1]에노, 부트[2]에노, 부타[1,3]디에노, 부트[1]이노, 부트[2]이노, 부타[1,3]다이이노 등의 부틸레노 ; 등등. 특정 수준의 포화를 의도하는 곳에서는, 알카노, 알케노 및/또는 알키노 명명법이 사용된다. 우선 실시예에서의 알킬레노기는 (C1-C6) 또는 (C1-C3) 알킬레노이다. 또한, 곧은 사슬 포화 알카노기(예: 메타노, 에타노, 프로파노, 부타노 등)도 선호된다.
"헤테로알킬,” "헤테로알칸일,” "헤테로알켄일,” "헤테로알킨일 ,” "헤테로알킬디일” 및 "헤테로알킬레노”는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 하나 이상의 탄소 원자들이 같거나 다른 이종 원자 또는 이종 원자기로서 각각 독립적으로 치환된, 알킬, 알칸일, 알켄일, 알킨일, 알킬디일 및 알킬레노기를 각각 말한다. 탄소 원자들을 치환할 수 있는 전형적인 이종 원자 및 이종 원자기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O) NR'-, -S(O)2NR'등과 이들의 조합이 포함되며, R'은 각각 수소이거나 (C1-C6) 알킬이다.
"사이클로알킬” 및 "헤테로사이클로알킬”은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 각각 고리형 "알킬"과 "헤테로알킬" 기를 말한다. 헤테로알킬기에서는 이종 원자가 나머지 분자에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 전형적인 사이클로알킬기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다; 사이클로프로필; 사이클로부타닐, 사이클로부테닐 등의 사이클로부틸; 사이클로펜타닐, 사이클로펜테닐 등의 사이클로펜틸; 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐 등의 사이클로헥실; 등등. 전형적인 헤테로사이클로알킬기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 테트라하이드로푸라닐(예: 테트라하이드로푸란-2-일, 테트라하이드로푸란-3-일 등), 피페리디닐(예: 피데리딘-1-일, 피데리딘-2-일 등), 모포리닐(예: 모폴린-3-일, 모폴린-4-일 등), 피페라지닐(예: 피페라진-1-일, 피페라진-2-일 등) 등등.
"비고리 이종 원자 브리지”는 백본 원자들이 전적으로 이종 원자 및/또는 이종 원자기인 2가 브리지를 말한다. 전형적인 비고리 이종 원자 브리지에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: -O-, -S-, -S-O-, -NR'-, -PH-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O) NR'-, -S(O)2NR'- 등과 이들의 조합이 포함되며, 각 R'은 각각 수소이거나 (C1-C6) 알킬이다.
"어미 방향족 고리계"란 짝π전자계(conjugated π electron system)를 가진 불포화 고리 또는 여러 고리 고리계를 말한다. "어미 방향족 고리계"의 정의에 구체적으로 포함되는 것으로는 하나 이상의 고리가 방향족이거나 하나 이상의 고리가 포화 또는 불포화인 접합 고리계가 있으며, 그 예로는 플루오렌, 인단, 인덴, 페날렌, 테트라하이드로 나프탈렌 등이 있다. 전형적인 어미 방향족 고리계에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페안트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란센, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥살렌, 인다센, S-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥탈렌, 오발렌, 펜타-2,4-디엔, 펜타센, 펜탈렌, 펜타펜, 페닐렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란센, 루비센, 테트라하이드로나프탈렌, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등이며 이들의 다양한 하이드로 이성질체들.
"아릴"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 방향족 고리계의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 얻어지며, 서술된 숫자의 탄소 원자들(즉, C5-C15은 5개에서 15개의 탄소 원자를 의미)을 가진 1가 방향족 탄화수소기를 말한다. 전형적인 아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페안트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 코로넨, 플루오란센, 플루오렌, 헥사센, 헥사펜, 헥살렌, 인다센, S-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 옥타센, 옥타펜, 옥탈렌, 오발렌, 펜타-2,4-디엔, 펜타센, 펜탈렌, 펜타펜, 페닐렌, 페날렌, 페난트렌, 피센, 플레이아덴, 피렌, 피란센, 루비센, 테트라하이드로나프탈렌, 트리페닐렌, 트리나프탈렌 등이며 이들의 다양한 하이드로 이성질체들로부터 유도된 기들. 우선 실시예에서의 아릴기는 (C5-C15) 아릴이며 (C5-C10)가 더욱 선호된다. 특별히 선호되는 아릴은 사이클로펜타디엔일, 페닐 및 나프틸이다.
"아릴아릴"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 하나 이상의 동일하거나 동일하지 않은 어미 방향족 고리계들이 단일 결합에 의해 직접 합쳐지며, 그러한 직접 고리 접합의 숫자가 관여된 어미 방향족 고리계의 숫자보다 하나가 적은, 고리계의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 유도되는 1가 탄화수소기를 말한다. 전형적인 아릴아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 바이페닐, 트리트리페닐, 페닐-나프틸, 바이나프틸, 바이페닐-나프틸 등. 아릴아릴기의 탄소 원자가 명시된 경우, 그 숫자는 각 어미 방향족 고리를 구성하는 탄소 원자들을 말한다. 예를 들어, (C5-C15) 아릴아릴은 각 방향족 고리계가 5개에서 15개의 탄소들 즉, 바이페닐, 트리트리페닐, 바이나프틸, 페닐나프틸 등으로 구성된 아릴아릴기이다. 바람직하게는, 아릴아릴기의 각 어미 방향족 고리계는 독립적으로 (C5-C15) 방향족이며, 더 바람직하게는 (C5-C10) 방향족이다. 어미 방향족 고리계들 모두가 동일한 아릴아릴계들 즉, 바이페닐, 트리트리페닐, 바이나프틸, 트리트리나프틸 등도 바람직하다.
"바이아릴"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 단일 결합에 의해 직접 합쳐지는 두 개의 동일한 어미 방향족 계를 가지는 아릴아릴기를 말한다. 전형적인 바이아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 바이페닐, 바이나프틸, 바이안트라실 등. 바람직하게는, 방향족 고리계는, (C5-C15) 방향족 고리이며, 더 바람직하게는 (C5-C10) 방향족 고리이다. 특히 바람직한 바이아릴기는 바이페닐이다.
"아릴알킬"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 탄소 원자, 전형적으로 말단이나 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자들의 하나가 아릴기로 치환된 비고리 알킬기를 말한다. 전형적인 아릴알킬기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 벤질, 2-페닐에탄-1-일, 2-페닐에텐-1-일, 나프틸메틸, 2-나프틸에탄-1-일, 2-나프틸에텐-1-일, 나프토벤질, 2-나프토페닐에탄-1-일 등. 특정한 알킬 부분들을 의도하는 경우, 아릴알칸일, 아릴알켄일 및/또는 아릴아키닐 명명법이 사용된다. 우선 실시예에서는 아릴알킬기는 (C6-C21) 아릴알킬이며, 다시 말해서, 아릴알킬기의 알칸일, 알켄일 또는 알킨일 부분은 (C1-C6)이며 아릴 부분은 (C5-C15)이다. 특별한 우선 실시예에서의 아릴알킬기는 (C6-C13)이며, 다시 말해서, 아릴알킬기의 알칸일, 알켄일 또는 알킨일 부분은 (C1-C3)이며, 아릴 부분은 (C5-C10)이다.
"어미 이종 원자 고리계"는 하나 이상의 탄소 원자들이 각각 독립적으로 동일하거나 다른 이종 원자 또는 이종 원자기로 치환되는 어미 방향족 고리계이다. 탄소 원자를 치환하는 전형적인 이종 원자나 이종 원자기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: N, NH, P, O, S, S(O), S(O)2, Si, 등. "어미 이종 원자 고리계"의 정의에 구체적으로 포함되는 것에는 하나 이상의 고리가 방향족이며 또한 하나 이상의 고리가 포화 또는 불포화인 접합 고리계가 있으며, 그 예로는 벤조다이옥산, 벤조퓨란, 크로만, 코로멘, 인돌, 인돌린, 크산텐 등이 있다. "어미 이종 원자 고리계"의 정의에 포함되는 또 다른 것에는, 예를 들어 벤조피론과 1-메틸-1,2,3,4-테트라졸과 같은 통상적인 치환기를 포함하는 고리들이 있다. "어미 이종 원자 고리계"의 정의에서 명시적으로 제외되는 것에는 고리 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고리 폴리칼킬렌 글리콜에 접합된 벤젠 고리들이 있다. 전형적인 어미 이종 원자 고리계에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 아크리딘, 벤즈이미다졸, 벤즈이속사졸, 벤조다이옥산, 벤조다이옥솔, 벤조퓨란, 벤조피론, 벤조티아다이아졸, 벤조티아졸, 벤조트리아졸, 벤즈옥사신, 벤즈옥사졸, 벤즈옥사졸린, 카바롤, (-카볼린, 크로만, 크로멘, 시놀린, 퓨란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조퓨란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사다이아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피나졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피졸, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아다이아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐 등.
"헤테로아릴"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 어미 이종 원자 고리계의 하나의 원자로부터 수소 하나를 제거하여 유도되며, 서술된 숫자의 고리 원자들(예, "5-14 구성원"이란 5에서 14의 고리 원자들을 의미)을 가진 1가 이종 방향족 기를 말한다. 전형적인 헤테로아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 아크리딘, 벤즈이미다졸, 벤즈이속사졸, 벤조다이옥산, 벤조다이옥솔, 벤조퓨란, 벤조피론, 벤조티아다이아졸, 벤조티아졸, 벤조트리아졸, 벤즈옥사신, 벤즈옥사졸, 벤즈옥사졸린, 카바롤, (-카볼린, 크로만, 크로멘, 시놀린, 퓨란, 이미다졸, 인다졸, 인돌, 인돌린, 인돌리진, 이소벤조퓨란, 이소크로멘, 이소인돌, 이소인돌린, 이소퀴놀린, 이소티아졸, 이속사졸, 나프티리딘, 옥사다이아졸, 옥사졸, 페리미딘, 페난트리딘, 페난트롤린, 페나진, 프탈라진, 프테리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피나졸, 피리다진, 피리딘, 피리미딘, 피졸, 피롤리진, 퀴나졸린, 퀴놀린, 퀴놀리진, 퀴녹살린, 테트라졸, 티아다이아졸, 티아졸, 티오펜, 트리아졸, 크산텐 등 그리고 이들의 다양한 하이드로 이성질체로부터 유도된 기들. 우선 실시예에서의 헤테로아릴기는 5-14개 구성원의 헤테로아릴이며, 5-10개 구성원의 헤테로아릴이 특히 바람직하다.
"헤테로아릴-헤테로아릴"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 하나 이상의 동일하거나 동일하지 않은 어미 이종 원자 방향족 고리계들이 단일 결합에 의해 직접 합쳐지며, 그러한 직접 고리 접합의 숫자가 관여된 어미 이종 원자 방향족 고리계의 숫자보다 하나가 적은, 고리계의 하나의 탄소 원자에서 수소 원자 하나를 제거하여 유도되는 1가 이종 원자 방향족기를 말한다. 전형적인 헤테로아릴-헤테로아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 바이피리딜, 트리트리피리딜, 피리딜퓨리닐, 바이퓨리닐 등. 원자의 숫자가 명시된 경우, 그 숫자는 각 어미 이종 원자 방향족 고리를 구성하는 원자들의 숫자를 말한다. 예를 들어, 5-15 구성원의 헤테로아릴-헤테로아릴은 어미 이종 원자 방향족 고리계가 각각 5개에서 15개의 원자들로 구성된 헤테로아릴-헤테로아릴기, 즉, 바이피리딜, 트리트리피리딜 등이다 바람직하게는 아릴아릴기의 각 어미 이종 원자 방향족 고리계는 독립적으로 5-15 구성원의 이종 원자 방향족이며, 더 바람직하게는 5-10 구성원의 이종 원자 방향족이다. 어미 이종 원자 방향족 고리계들 모두가 동일한 헤테로아릴-헤테로아릴기들도 바람직하다.
"바이헤테로아릴”은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 단일 결합에 의해 직접 합쳐지는 두 개의 동일한 어미 이종 원자 방향족 고리계를 가지는 헤테로아릴-헤테로아릴기를 말한다. 전형적인 바이아릴기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 바이피리딜, 바이퓨리닐, 바이퀴놀리닐 등. 바람직하게는, 이종 원자 방향족 고리계는 5-15 구성원의 이종 원자 방향족 고리이며, 더 바람직하게는 5-10 구성원의 이종 원자 방향족 고리이다.
"헤테로알킬"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 탄소 원자, 전형적으로 말단이나 sp3 탄소 원자에 결합된 수소 원자들의 하나가 헤테로아릴로 치환된 비고리 알킬기를 말한다. 특정한 알킬 부분들을 의도하는 경우, 헤테로 아릴알칸일, 헤테로아릴알켄일 및/또는 헤테로아릴알킨일 명명법이 사용된다. 우선 실시예에서는 헤테로아릴알킬기는 6-21 구성원의 헤테로아릴알킬이며, 다시 말해서, 헤테로아릴알킬기의 알칸일, 알켄일 또는 알킨일 부분은 (C1-C6) 알킬이며 헤테로 아릴 부분은 5-15-구성원의 헤테로아릴이다. 특별한 우선 실시예에서의 헤테로아릴알킬기는 6-13 구성원의 헤테로아릴알킬이며, 다시 말해서, 알킨일, 알켄일 또는 알킨일 부분은 (C1-C3) 알킬이며, 헤테로아릴 부분은 5-10 구성원의 헤테로아릴이다.
"할로겐"또는 "할로”는 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 달리 서술되어 있지 않는 한, 불화, 염화, 브롬화 및 요드화를 말한다.
"할로알킬"은 그 자체로서 또는 다른 치환기의 일부로서, 하나 이상의 수소 원자가 할로겐으로 치환된 알킬기를 말한다. 그러므로, "할로알킬"이란 용어는 모노할로알킬, 다이할로알킬, 트리할로알킬에서 과할로알킬까지를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, "(C1-C2) 할로알킬"이란 표현에는 플루오로메틸, 다이플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 1-플루오로에틸, 1,1-플루오로에틸, 1,2-다이플루오로에틸, 1,1,1-트리플루오로에틸 등이 포함된다.
위에서 정의된 기들에는 그 밖에도 널리 인식되는 치환기들을 만들기 위해 해당 분야에서 흔히 사용되는 접두사 및/또는 접미사가 포함될 수 있다. 그 예로서, "알킬옥시" 또는 "알콕시"는 화학식-OR"의 기를 말하며, "알킬아민"은 화학식-NHR"의 기를 말하고, "다이알킬아민"은 화학식-NR"R"의 기를 말하는 데, 각 R"은 독립적으로 알킬이다. 다른 예로서, "할로알콕시" 또는 "할로알킬옥시"는 화학식 -OR'''의 기를 말하는 데, 여기서 R'''은 할로알킬이다.
"보호기"란 어떤 분자에서 반응성이 있는 작용기에 부착될 때, 작용기의 반응성을 가리거나, 감소시키거나 또는 방해하는 그룹의 분자들을 말한다. 일반적으로 보호기는 합성 과정에서 원하는 경우 선택적으로 제거할 수 있다. 보호기의 예는 다음에서 찾아볼 수 있다: Greene 및 Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, 3rd Ed., 1999, John Wiley & Sons, NY 그리고Harrison 등, Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8, 1971-1996, John Wiley & Sons, NY. 대표적인 아미노 보호기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 포밀, 아세틸, 트리플로오로아세틸, 벤질, 벤질옥시카르보닐("CBZ"), 삼차-부톡시카르보닐("Boc"), 트리메틸실릴("TMS"), 2-트리메틸실릴-에탄술포닐 ("TES"), 트리틸 및 치환 트리틸 기, 알릴옥시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시 옥시카르보닐("FMOC"), 니트로-베라트릴옥시카르보닐("NVOC") 등. 대표적인 히드록실 보호기에는 히드록실이기가 아실화 또는 알킬화된 것으로 벤질 및 트리틸에테르는 물론 알킬에테르, 테트라하이드로퓨란 에테르, 트리알킬실릴 에테르(예: TMS, TIPPS 기) 및 알릴 에테르가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
"전구 약물"이란 활성 2,4-피리미딘디아민 약물의 방출을 위해 체내와 같이 사용되는 조건 하에서 변환이 요구되는 활성 2,4-피리미딘디아민 화합물(약물)의 유도체를 말한다. 전구 약물은 항상 그렇지는 않지만 흔히 활성 약물로 전환될 때 까지는 약리학적으로 비활성적이다. 전구 약물은 일반적으로 활성을 위해 부분적으로 필요한 것으로 사용되는 프로모이티의 형성을 위해 프로 그룹(다음에 정의)으로 2,4-피리미딘디아민 약물의 반응기를 가리움으로써 얻어지는 데, 그 프로모이티는 특정한 사용 조건 하에서 절단과 같은 변환을 거침으로써 반응기를 방출하고, 따라서 전구 약물이란 활성 2,4-피리미딘디아민 약물이다. 프로모이티의 절단은 가수분해에서와 같이 자발적으로 진행되거나 효소, 빛, 산이나 염기와 같은 다른 작용 인자에 의해서 혹은 온도의 변화와 같은 물리적이나 환경적 매개변수의 변경이나 그에 대한 노출에 의해서 촉매화가 이루어지거나 유도될 수 있다. 이러한 작용 인자는 전구 약물이 투여되는 세포에 존재하는 효소나 위 내의 산성 조건과 같은 사용하는 조건에 대해 내인성이거나, 또는 외인성으로 공급될 수 있다.
활성 2,4-피리미딘디아민 화합물에서 반응기를 가리움으로써 전구 약물을 생성하는 데 적합한 다양한 프로그룹은 물론 그에 따른 프로모이티들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 히드록실 반응기는 술폰산염, 에스테르 또는 탄산염 프로모이티로서 가리워질 수 있으며, 이는 생체 내에서 가수분해되어 히드록실이기를 제공할 수 있다. 아미노 반응기는 아미드, 카발산염, 이민, 요소, 포스페닐, 포스포릴 또는 설페닐 부분의 가리워질 수 있으며, 이는 생체 내에서 가수분해되어 아미노기를 제공할 수 있다. 카르복실기는 에스테르(실릴 에스테르와 티오에스테르 포함). 아미드 또는 하이드라지드 프로모이티로 가리워질 수 있으며, 이는 생체 내에서 가수분해되어 카르복실기를 제공할 수 있다. 그 밖에 적절한 프로그룹과 그에 해당하는 프로모이티의 구체적인 예들은 당업자에게 분명할 것이다.
"프로 그룹"은 활성 2,4-피리미딘디아민 약물 내에서 프로모이티 형성을 위해 반응기의 가리움을 위해 사용될 때, 약물을 전구 약물로 전환시키는 유형의 보호기를 말한다. 프로그룹은 일반적으로 특정한 사용 조건 하에서 절단될 수 있는 결합들을 통해 약물의 반응기에 부착된다. 그러므로 프로 그룹이란 특정한 사용 조건 하에서 절단되어 반응기를 방출하는 부분의 프로모이티다. 한 구체적인 예로서, 화학식 -NH-C(O)CH3의 아미드 프로모이티는 프로그룹 -C(O)CH3로써 구성된다.
"Fc 수용체"는 면역글로불린의 Fc 부분(특정한 일정 부위를 포함)에 결합하는 세포 표면 분자들로 이루어진 계통의 구성원을 말한다. 각 Fc 수용체는 특정한 유형의 면역글로불린에 결합한다. 예를 들어, Fcα 수용체("FcaR")는 IgA와, FcεR은 IgE와, 그리고 FcεR은 IgG와 각각 결합한다.
FcαR 계통에는 IgA/IgM의 상피성 고반에 관여하는 중합 Ig 수용체, 척수성 수용체 RcαRI(CD89으로도 불림), Fcα/μR 그리고 적어도 두 개의 대체 IgA 수용체들이 포함된다(이에 관한 최근의 리뷰 논문은 다음을 참조: Monteiro & van de Winkel, 2003, Annu. Rev. Immunol, advanced e-publication). FcαRI는 호염기구, 호산구, 단구/대식세포, 수지상 세포 및 쿠퍼 세포 상에서 발현된다. FcαRI에는 하나의 알파 사슬 그리고 세포질 도메인에서 활성화 모티프(ITAM)를 소유하고 Syk 키나제를 인산화하는 FcR 감마 동종이중체가 포함된다.
FcεR 계통에는 지정 FcεRI 및 FcεRII(CD23으로도 불린다)의 두 가지 유형이 포함된다. FcεRI는 비만 , 호염기구 및 호산구 세포에서 발견되며 단량체 IgE를 세포 표면에 고정시키는 고친화성 수용체(약 1010M-1의 친화성으로 IgE를 결합)이다. FcεRI는 하나의 알파 사슬과 하나의 베타 사슬 및 위에서 설명한 감마 사슬 동종이중체를 가진다. FcεRII는 단핵 식세포, B 림프구, 호산구 및 혈소판에 발현되는 저친화성 수용체이다. FcεRII는 하나의 폴리펩티드 사슬로 구성되며 감마 사슬 동종이중체가 포함되지 않는다.
FcγR 계통에는 지정 FcγRI(CD64으로도 불림), FcγRII(CD32으로도 불림) 및 FcγRIII(CD16으로도 불림)의 세 가지 유형이 포함된다. FcγRI는 비만, 호염기구, 단핵세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포 및 식세포에서 발견되며 단량체 IgG를 세포 표면에 고정시키는 고친화성 수용체(108M-1의 친화성으로 IgG1을 결합)이다. FcγRI에는 하나의 알파 사슬과 FcαRI 및 FcεRI와 공유하는 감마 사슬 이합체가 포함된다.
FcγRII는 호중구, 단구, 호산구, 혈소판 및 B 림프구 상에서 발현되는 저친화성 수용체이다. FcγRII에는 하나의 알파 사슬이 포함되며 위에서 설명한 감마 사슬 호모다이머는 포함되지 않는다.
FcγRIII은 NK, 호산구, 대식세포, 호중구 및 비만 세포 상에서 발현되는 저친화성 수용체(5x105M-1의 친화성으로 IgG1를 결합)이다. 이것은 하나의 알파 사슬과 FcαRI, FcεRI 및 FcγRI와 공유하는 감마 동종이중체로 구성된다.
당업자는 이러한 다양한 Fc 수용체들과 이들을 발현하는 세포 유형들의 하부 단위와 결합 성질에 대한 특성화가 완전히 이루어지지 않았음을 인식할 것이다. 이상의 설명은 다만 이러한 수용체들에 관해 현재 알려진 내용을 반영하는 것으로써(참조, 예: Immunobiology: The Immune System in Health & Disease, 5th Edition, Janeway 등, Eds, 2001, ISBN 0-8153-3642-x, 그림 9.30 pp. 371), 여기에서 설명한 화합물들로 조절할 수 있는 수많은 수용체 신호전달 순차반응에 대해 이를 제한하려는 의도는 아니다.
"Fc 수용체 매개 탈과립" 또는 "Fc 수용체 유도 탈과립"은 Fc 수용체의 가교에 의해 개시되는 Fc 수용체 신호전달체계를 통해 진행되는 탈과립을 말한다.
"IgE-유도 탈과립" 또는 "FcεRI-매개 탈과립"은 FcεR1에 결합된 IgE의 가교에 의해 개시되는 IgE 수용체 신호전달체계를 통해 진행되는 탈과립을 말한다. 이 가교는 IgE에 대한 알레르겐이나 그 밖의 항 IgE 항체와 같은 다가 결합제(multivalent binding agent)에 의해 유도될 수 있다. 그림 2를 참조하면, 비만 세포 및/또는 호염기구에서는 탈과립을 초래하는 FcεRI 신호전달체계는 상류 및 하류의 두 단계로써 분리될 수 있다. 상류 단계에는 칼슘 이온 기동(그림 2에서 "Ca2+"로 표시; 그림 3 참조) 이전에 발생하는 모든 과정들이 포함된다. 하류 단계에는 칼슘 이온 기동과 그로부터 하류의 모든 과정들이 포함된다. FcεRI 매개 탈과립을 억제하는 화합물은 FcεRI 매개 신호전달체계를 따라 어떠한 위치에서든지 작용할 수 있다. FcεRI 매개 탈과립의 상류를 선택적으로 억제하는 화합물은 칼슘 이온 기동이 유도되는 지점의 상류에서 FcεRI 신호전달 순차반응의 해당 부분을 억제하기 위해 작용한다. 세포 기반의 검정에서, 상류 FcεRI 매개 탈과립을 선택적으로 억제하는 화합물은 IgE에 대한 알레르겐이나 결합 인자(항 IgE 항체 등)에 의해 활성화되거나 자극되는 비만 세포나 호염기구와 같은 세포들을 억제하지만, 예를 들어 칼슘 이오노포아 이오노마이신과 A23187 같은, FcεRI 신호전달경로를 우회하는 탈과립 인자로써 활성화되거나 자극되는 세포들의 탈과립을 상당히 억제하지는 않는다.
"IgG 유도 탈과립" 또는 "FcγRI 매개 탈과립"이란 FcγRI 결합 IgG의 가교에 의해 개시되는 FcγRI 신호전달체계 도입과정을 통해 진행되는 탈과립을 말한다. 이 교차 결합은 IgG에 대한 알레르겐이나 항 IgG 항체, 단편 항체와 같은 또 다른 다가 결합제에 의해 유도될 수 있다. FcεRI 신호전달 순차반응과 마찬가지로, FcγRI 신호전달 순차반응은 비만 세포와 호염기구에서 동일한 두 단계인 상류 및 하류로 분리될 수 있는 탈과립을 초래한다. FcεRI 매개 탈과립과 유사하게, 상류 FcγRI 매개 탈과립을 선택적으로 억제하는 화합물들은 칼슘 이온 기동이 유도되는 지점의 상류에서 작용한다. 세포 기반의 검정에서, 상류 FcγRI매개 탈과립을 선택적으로 억제하는 화합물은 IgG에 대한 알레르겐이나 결합 인자(항 IgG 항체 단편 등)에 의해 활성화되거나 자극되는 비만 세포나 호염기구와 같은 세포들을 억제하지만, 예를 들어 칼슘 이오노포아 이오노마이신과 A23187 같은, FcγRI 신호전달경로를 우회하는 탈과립 인자로써 활성화되거나 자극되는 세포들의 탈과립을 상당히 억제하지는 않는다.
"이오노포아 유도 탈과립" 또는 "이오노포아 매개 탈과립"이란 예를 들어 이오노마이신이나 A23187과 같은 칼슘 이오노포아에 대한 노출 시 발생하는, 비만 세포나 호염기구 등의 세포의 탈과립을 말한다.
"Syk 키나제"란 B-세포와 다른 조혈 세포에서 발현되는, 잘 알려진 72kDa 비수용체(세포질의) 비장 단백질 티로신 키나제를 말한다. Syk 키나제에는 인산화된 면역수용체 티로신 기반의 활성화 모티프("ITAMs"), "링커" 도메인 및 촉매 도메인에 결합하는 종열에 의한 두 개의 공통 Src-호몰로지 2(SH2) 도메인들이 포함된다(Syk 키나제의 구조와 기능에 대한 리뷰 논문은 다음을 참조: Sada 등, 2001, J. Biochem. (Tokyo) 130:177-186; Turner 등, 2000, Immunology Today 21:148-154). Syk 키나제는 B-세포 수용체(BCR) 시그널링의 작용인자로서 상당히 연구되고 있다(Turner 등, 2000, 상기). 또한, Syk 키나제는 Ca2+ 기동이나 마이토젠 활성 단백질 키나제(MAPK) 카스케이드(참조, 예: 그림 2) 및 탈과립과 같은, 면역수용체로부터 유도되는 중요한 경로들을 조절하는 복수의 단백질에 대한 티로신 인산화에 매우 중요하다. 또한, Syk 키나제는 호중구에서 인테그린 신호전달에 대해 중대한 역할도 수행한다(참조, 예: Mocsai 등 2002, Immunity 16:547-558).
여기서 사용된 바와 같이, Syk 키나제에는 Syk 계통에 속하는 것으로 인식되는 모든 종의 동물들 즉, 인간, 원숭이, 소, 돼지, 설치류 등의 키나제가 포함된다. 구체적으로, 자연 발생하거나 인위적인 이소형, 스플라이스 변이, 대립형질 변이, 돌연변이가 포함된다. 이러한 Syk 키나제의 아미노산 배열은 잘 알려져 있으며 유전자 은행(GENBANK)을 통해 얻을 수 있다. 인간 Syk 키나제의 여러 이소형을 코드화하는 mRNA의 구체적인 예들은 GENBANK 수납 번호 gi|21361552|ref|NM__003177.2|,gi|496899|emb|Z29630.1|HSSYKPTK[496899] 및 gi|15030258|gb|BC011399.1|BC011399[15030258]에서 찾을 수 있으며, 이들은 여기에 참고로써 포함되어 있다.
당업자는 다른 계통에 속하는 티로신 키나제가 3차원 구조에 있어서 Syk의 활성자리나 결합 포켓과 유사한 그것들을 가질 수 있다는 점을 인정할 것이다. 이러한 구조적 유사성의 결과로써, 여기서 "Syk 모방체"라고 부르는 이러한 키나제들은 Syk에 의해 인산화되는 기질의 인산화를 촉매할 것으로 기대한다. 그러므로 이러한 Syk에 의해, 이러한 Syk 모방체가 역할을 수행하는 신호전달체계와 이러한 Syk 모방체에 의해 영향을 받은 생물적 반응 그리고 Syk 모방체에 의존하는 신호전달 순차반응은, 여기서 설명하는 2,4-피리미딘디아민 화합물로써 조절할 수 있으며 특히 억제할 수 있다.
"Syk 의존 신호전달 순차반응"은 Syk 키나제가 역할을 수행하는 신호전달체계를 말한다. 이러한 Syk 의존 신호전달 순차반응의 예로는 FcαRI, FcεRI, FcγRI, FcγRIII, BCR, 인테그린 신호전달 순차반응을 포함하되 이에 제한되지는 않는다.
"자가면역질환"은 일반적으로 내인성 및(또는) 외인성 병인에 대한 하나 이상의 면역원성 물질에 대해 피험자의 체액성 및(또는) 세포 매개성 면역반응의 결과로 발생하는 아나필락시형 외 과민반응(제2형, 제3형 및(또는) 제4형 과민반응) 관련 질환이다. 이러한 자가면역질환은 아나필락시형(제1형 또는 IgE-매개) 과민반응 관련 질환과 구별된다.
6.2 2,4-피리미딘디아민 화합물
본 발명의 화합물들은 일반적으로 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민 화합물로서:
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며:
상기식에서 L1과 L2은 각각 직접 결합과 연결자(linker)로 구성된 군에서 선택되었다.
R2 는 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
R4 는 수소, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
R5는R6 , R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알카닐, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알케닐 및 R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알키닐로 이루어진 그룹에서 선택되었다.
각 R6는 수소, 전기음성적 기, -ORd, -SRd, (C1-C3) 할로알킬옥시, (C1-C3) 과할로알킬옥시, -NRcRc, 할로겐, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 과할로알킬, -CF3 , -CH2CF3, -CF2CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcR c, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRcRc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRc Rc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcR c, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRc Rc 및 -[NHC(NH)]nNRcRc, 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 R8 기들로써 선택적으로 치환되는 (C5-C10) 아릴, 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 R8 기들로써 선택적으로 치환되는 페닐, 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 R8 기들로써 선택적으로 치환되는 (C6-C16) 아릴알킬, 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 R8 기들로써 선택적으로 치환되는 5-10 구성원의 헤테로아릴 그리고 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 R8 기들로써 선택적으로 치환되는 6-16 구성원의 헤테로아릴알킬로 구성되는 그룹에서 독립적으로 선택되며;
R8 은 Ra, Rb, Ra 또는 Rb과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 Ra, Ra 또는 Rb과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 -ORa, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH 2)m-Rb, -(CHRa)m-Rb, -O-(CH2 )m-Rb, -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHRa)m -Rb, -O- (CH2)m-CH[(CH2)mRb]R b, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2) m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa )m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m -Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -NH[(CH 2)mRb], -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH-(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb 및 -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH 2)m-Rb 로 구성된 그룹에서 선택되었다.
각 Ra는 수소, (C1-C6) 알킬, (C3-C8) 시클로알킬, 시클로헥실, (C4-C11) 시클로알킬알킬, (C5-C10) 아릴, 페닐, (C6-C16) 아릴알킬, 벤질, 탄소수 2-6 인 헤테로알킬, 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, 모폴리닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 피페리디닐, 탄소수 4-11인 시크로헤테로알킬알킬, 탄소수 5-10인 헤티로아릴 및 탄소수 6-16인 헤테로아릴알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되었다.
각 Rb는 O, -ORd, (C1-C3) 할로알킬옥시, =S, -SRd, =NRd, =NOR d, -NRcRc, 할로겐, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)R d, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcR c, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc , -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcR c, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcR c, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NRaC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)] nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)] nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc 및 -[NRaC(NRa)]nNR cRc로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된 적절한 기이다.
각 Rc는 독립적으로 보호기이거나 Ra이며 또는 다른 방식으로, 각 Rc는 질소원자에 결합함으로써, 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 추가의 이종 원자들을 선택적으로 포함할 수 있으며 또한 하나 이상의 동일하거나 서로 다른 Ra나 적절한 Rb 기로써 선택적으로 치환될 수 있는 5 내지 8의 구성원의 사이클로헤테로알킬이나 헤테로아릴을 형성하며;
각 Rd는 독립적으로 Ra이다.
각 m은 독립적으로 1부터3까지의 정수이며,
각 n은 독립적으로 0에서 3까지의 정수이다.
구조식 (I)의 화합물에서, L1 및 L2는 서로 독립적으로 직접 결합이나 링커를 나타낸다. 그러므로, 당업자가 인정할 것으로 기대하는 바와 같이, 치환기 R2 및/또는 R4는 각각의 질소 원자에 직접 결합되거나 또는 대체적으로 링커에 의해서 각각의 질소 원자로부터 떨어질 수 있다. 링커의 정체는 중요하지 않으며, 일반적으로 적절한 링커에는 (C1-C6) 알킬디일, (C1-C6) 알카노, (C1-C6) 헤테로알킬디일 등이 있으며 이들 모두 하나 이상의 동일하거나 다른 R8 기로 선택적으로 치환될 수 있는 데, 여기서 R8은 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같다. 특정 실시예에서 L1 및 L2는 각각, 이중 결합, 하나 이상의 동일하거나 다른Ra, 적절한 Rb 또는 R9 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C3) 알킬디일 및 하나 이상의 동일하거나 다른 Ra, 적절한 Rb 또는 R9 기로써 선택적으로 치환된 1 - 3 구성원의 헤테로알킬디일로 구성된 그룹으로부터 서로 독립적으로 선택되며, 여기서 R9은 (C1-C3) 알킬, -ORa, -C(O)ORa, 하나 이상의 동일하거나 다른 할로겐으로써 선택적으로 치환된 (C5-C10), 하나 이상의 동일하거나 다른 할로겐으로써 선택적으로 치환된 페닐, 하나 이상의 동일하거나 다른 할로겐으로써 선택적으로 치환된 5-10 구성원의 헤테로아릴 및 하나 이상의 동일하거나 다른 할로겐으로써 선택적으로 치환된 구성원의 헤테로아릴로 구성되는 그룹으로부터 선택된다; 그리고 Ra 및 Rb는 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같다. L1 및 L2의 치환에 사용될 수 있는 구체적인 R9 기에는 -ORa, -C(O)ORa, 페닐, 할로페닐, 4-할로페닐 등이 있으며, 여기서 Ra는 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같다. L1 및 L2의 치환에 사용될 수 있는 구체적인 R9 기에는 -ORa, -C(O)ORa, 페닐, 할로페닐, 4-할로페닐 등이 있으며, 여기서 Ra는 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같다.
또 다른 특정 실시예에서는, L1 및 L2는 각각 메타노, 에타노 및 프로파노로 구성되는 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 데, 모두 R9 기로써 선택적으로 단일 치환할 수 있으며, 여기서 R9는 위에서 이미 정의된 바와 같다.
이상의 모든 실시예에서, R9 기에 포함될 수 있는 구체적인 Ra 기는 수소, (C1-C6) 알킬, 페닐 및 벤질로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.
또 다른 하나의 특정 실시예에서는, L1 및 L2는 각각 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들이 구조식 (Ia)에 의한 화합물이 되도록 하는 직접 결합이며;
이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며 여기서 R4, R5, R6 및 R6는 구조식(I)로 이미 정의된 바와 같으며, R4c는 수소 또는 프로그룹이다. 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 또 다른 구체적 실시예들은 다음에 설명한다.
구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들에 대한 첫 째 실시예에서는, R2, R4, R5, R6, L1 및 L2는 해당 구조식 (I) 및 (Ia)에 대해 이미 정의한 바와 같으며, 단 R2 는 3,4,5-트리메톡시페닐, 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시 페닐 또는 다음이 아니어야 하며,
여기서 R21, R22 및 R23는 미국 특허 번호 6,235,746에서 각각 R1 , R2 및 R3로서 정의된 바와 같으며, 이 특허는 여기에 참조로 포함된다. 이 첫 째 실시예의 구체적 실시예에서는, R21은 수소, 할로, 하나 이상의 동일하거나 다른 R25 기로써 선택적으로 치환된 곧은 사슬이나 가지 (C1-C6) 알킬, 히드록실, 하나 이상의 동일하거나 다른 페닐이나 R25 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알콕시, 티올(-SH), 하나 이상의 동일하거나 다른 페닐이나 R25 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬티오, 아미노 (-NH2), -NHR26 또는 -NR26R26이며; R22 및 R23는 각각 서로 독립적으로 하나 이상의 동일하거나 다른 R25 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 곧은 사슬이나 가지 알킬이며; R25는 할로, 히드록실, (C1-C6) 알콕시, 티올, (C1-C6) 알킬티오, (C1-C6) 알킬아미노 및 (C1-C6) 다이알킬아미노로 구성되는 그룹으로부터 선택되며; R26은 각각 독립적으로 하나 이상의 동일하거나 다른 페닐이나 R25 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬 혹은 -C(O)R27이며, 여기서R27은 하나 이상의 동일하거나 다른 페닐이나 R25 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬이다.
이 첫 째 실시예의 또 다른 구체적인 실시예에서는, R21가 하나 이상의 동일하거나 다른 할로기로써 선택적으로 치환된 R21이며/이거나, R22 및 R23는 각각 서로 독립적으로 하나 이상의 동일하거나 다른 할로기로써 선택적으로 치환된 메틸이나 에틸이다.
구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물에 대한 둘 째 실시예에서는 R2, R4, R5 및 L2는 해당 구조 (I) 및 (Ia)에 대해 이미 정의된 바와 같으며, L1은 직접 결합이고 R6는 수소이다. 단, R2는 3,4,5-트리메톡시 페닐, 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시페닐 또는 다음이 아니어야 하며,
여기서 R21, R22 및R23는 첫째 실시예와 관련하여 위에서 정의된 바와 같다.
셋 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 2,4-피리미딘디아민 화합물로서 하나 이상의 다음 화합물들이 제외된다:
N2,N4-비스(4-에톡시페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R070790);
N2,N4-비스(2-메톡시페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R081166);
N2,N4-비스(4-메톡시페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R088814);
N2,N4-비스(2-클로로페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R088815);
N2,N4-비스페닐-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R091880);
N2,N4-비스(3-메틸페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R092788);
N2,N4-비스(3-클로로페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R067962);
N2,N4-비스(2,5-다이메틸페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R067963);
N2,N4-비스(3,4-다이메틸페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R067964);
N2,N4-비스(4-클로로페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R0707153);
N2,N4-비스(2,4-다이메틸페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R070791);
N2,N4-비스(3-브로모페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 (R008958);
N2,N4-비스(페닐)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민;
N2,N4-비스(모폴리노)-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민; 및
N2,N4-비스[(3-클로로-4-메톡시페닐)]-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민.
넷 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 다음 구조식 (Ib)에 대한 화합물들이 제외된다:
여기서 R24는 (C1-C6) 알킬이며 R21, R22, R23는 첫 째 실시예와 관련하여 이미 정의된 바와 같다.
다섯 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia) 화합물로서 미국 특허 6,235,746호의 실시예 1-141에서 설명된 화합물들을 제외시키며, 그 공개 내용은 여기에 인용 문헌으로 포함된다.
여섯 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 이 미국 특허 6,235,746 호의 화학식 (1)이나 화학식 1(a)에 의해 정의된 화합물들이 제외된다(참조, 예: 여기에 인용 문헌으로 포함된 공개 내용의 1단 줄 48 ~ 7단 줄 49 그리고 8단 줄 9-36).
일곱 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 R5가 시아노 또는 -C(O)NHR, R이 수소나 (C1-C6) 알킬, 그리고 R2가 치환 페닐; R4가 치환 또는 비치환 (C1-C6) 알킬, (C3-C8) 사이클로알킬, 3-8 구성원의 사이클로헤테로알킬 또는5-15 구성원의 헤테로아릴; 및 R6가 수소인 화합물들이 제외된다.
여덟 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 WO 02/04429의 화학식 (I)과 (X)에 의해 정의된 화합물이나 WO 02/04429에서 공개된 모든 화합물들이 제외되며, 그 공개 내용은 여기에 인용 문헌으로 포함된다.
구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들에 대한 아홉 째 실시예에서는, R5가 시아노이거나 -C(O)NHR, R이 수소이거나 (C1-C6) 알킬; 그리고 R6가 수소이면, R2는 치환 페닐기 이외의 것이다.
열 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 R2와 R4가 각각 독립적으로 치환 또는 비치환 피롤인 화합물이나 그 고리의 질소 원자를 통하여 분자의 나머지에 부착된 인돌 고리가 제외된다.
열한 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물로서 미국 특허 번호 4,983,608의 화학식 (I)과 (IV)에 의해 정의된 화합물이나, 여기에 그 공개 내용이 인용 문헌으로 포함된 미국 특허 4,983,608호의 모든 화합물들이 제외된다.
당업자라면 화학식 (I)과 (Ia)의 화합물들에서 R2와 R4가 동일하거나 다를 수 있으며 광범위하게 변할 수 있는 점을 인정할 것이다. R2 및/또는 R4로써 치환된 사이클로알킬, 사이클로헤테로알킬, 아릴 및 헤테로아릴과 같은 선택적으로 치환된 고리일 때, 그 고리는 가능한 탄소나 이종 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 그 선택적 치환기는 모든 가능한 원자 및/또는 이종 원자에 부착될 수 있다.
구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물에 대한 열두 째 실시예에서는, R2 및/또는 R4는 선택적으로 치환된 페닐이거나 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴이지만 다음을 조건으로 한다: (1) R6가 수소이면, R2는 3,4,5-트리메톡시페닐이나, 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시페닐이 아니다; (2) R2가 3,4,5-트리 치환 페닐이면, 3- 및 4- 위치의 치환기는 동시에 메톡시 또는 (C1-C6) 알콕시가 아니다; 또는 (3) R6가 수소이며 R4가 (C1-C6) 알킬, (C3-C8) 사이클로알킬, 3-8 구성원 사이클로헤테로알킬 또는 5-15 구성원 헤테로아릴이면, R5는 시아노가 아니다. 또는, R2는 첫째나 둘째 실시예와 관련하여 설명한 조건에 해당된다. 선택적으로 치환된 아릴이나 페닐기는 가능한 모든 탄소 원자를 통해 분자의 나머지에 부착될 수 있다. 선택적으로 치환된 페닐의 구체적인 예로는, 동일하거나 다른 R8 기에 의해 선택적으로 일-, 이- 또는 삼- 치환된 페닐이 포함되며, 여기서 R8은 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같고 위의 조건에 해당된다. 페닐이 일-치환이면, R8 치환기는 오소, 메타 또는 파라의 위치에 있을 수 있다. 오소, 메타 또는 파라의 위치에 있는 경우, R8은 (C1-C10) 알킬, (C1-C10) 가지 알킬, 하나 이상의 동일하거나 다른 Rb 기, -O-C(O)ORa, -O-(CH2)m-C(O)ORa, -C(O)ORa, -O-(CH2)m-NR cRc, -O-C(O)NRcRc, -O-(CH2)m-C(O)NRcRc, -O-C(NH)NRcRc, -O-(CH2)m-C(NH)NR cRc 및 -NH-(CH2)m-NRcRc로써 선택적으로 치환된 -ORa로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 여기서 m, Ra 및 Rc는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 이러한 화합물들의 한 실시예에서는, -NRcRc는 하나 이상의 동일하거나 다른 추가의 이종 원자들을 선택적으로 혼합하는 5-6 구성원 헤테로아릴이다. 이러한 5-6 구성원 헤테로아릴의 구체적인 예로는 옥사다이아졸릴, 트리아졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 테트라졸릴 및 이속사졸릴이 있지만 이로써 제한되지는 않는다.
이러한 화합물들의 또 다른 실시예에서는, -NRcRc는 하나 이상의 동일하거나 다른 이종 원자들을 선택적으로 포함하는 5-6 구성원 포화 사이클로헤테로알킬 고리이다. 이러한 사이클로헤테로알킬의 구체적인 예로는 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐이 있지만 이로써 제한되지는 않는다.
이러한 화합물들의 또 다른 실시예에서는, 각 Ra는 독립적으로 (C1-C6) 알킬이며/이거나 각 -NRcRc는 -NHRa인데, 여기서 Ra는 (C1-C6) 알킬이다. 한 구체적인 실시예에서는, R8는 -O-CH2-C(O)NHCH3이다. 또 다른 구체적인 실시예에서는 R8는 -OH이다.
페닐이 이-치환 또는 삼-이-치환이면, R8 치환기들은 모든 위치의 조합에 위치할 수 있다. 예를 들어, R8 치환기는 다음에 위치할 수 있다: 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4-, 3,5-, 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4,5-, 2,4,6-, 2,5,6-, 3,4,5-위치. 이-치환 페닐을 포함하는 화합물의 한 실시예에서는, 그 치환기들이3,4 이외에 위치한다. 다른 실시예에서는, 그 화합물들이 3,4에 위치한다. 삼중치환 페닐을 포함하는 화합물들의 한 실시예에서는 그 치환기들이 3,4,5 이외에 위치하거나, 또는 두 치환기가 3,4에 위치하지 않는다. 또 다른 실시예에서는 치환기들이 3,4,5에 위치한다.
이러한 이중 및 삼중치환 페닐에서 R8 치환기의 구체적인 실시예에서는, 오소, 메타 및 파라 치환 페닐과 관련하여 위에서 설명한 다양한 R8 치환기들이 포함된다.
또 다른 구체적인 실시예에서는, 그러한 이중 및 삼중 치환 페닐을 치환하는 데 유용한 R8 치환기에는 (C1-C6) 알킬, (C1-C6) 알콕시, 메톡시, 할로, 클로로, (C1-C6) 과할로알킬, -CF3, (C1-C6) 과할로알콕시, -OCF3 등이 포함된다. 바람직한 실시예에서는, 그러한 R8 치환기들은 3,4 또는 3,5에 위치한다. 바람직한 이- 치환 페닐 고리의 구체적인 예로는, 3-클로로-4-메톡시-페닐, 3-메톡시-4-클로로페닐, 3-클로로-4-트리플루오로메톡시-페닐, 3-트리플루오로메톡시-4-클로로-페닐, 3,4-다이클로로-페닐, 3,4-다이메톡시페닐 및 3,5-다이메톡시 페닐이 포함되며 다음 조건이 적용된다: (1) R4가 위에서 지적한 페닐이며 R5 및 R6가 각각 수소이면, R2는 3,4,5-트리(C1-C6)알콕시페닐 또는 3,4,5-트리메톡시페닐이 아니다; (2) R2가 3,4-디메톡시페닐이며, R5 및 R6가 각각 수소이면, R4는 3-(C1-C6)알콕시페닐, 3-메톡시페닐, 3,4-디-(C1-C6) 알콕시페닐 또는 3,4-디메톡시페닐이 아니다; (3) R4가 3-클로로-4-메톡시페닐이고 R5가 할로나 플루오로이며 선택적으로 R6가 수소이면, R2는 3-클로로-4-(C1-C6)알콕시페닐 또는 3-클로로-4-메톡시페닐이 아니다; (4) R4가 3,4-디클로로페닐이며, R5가 수소, (C1-C6) 알킬, 메틸, 할로 또는 클로로이며, 선택적으로 R6가 수소이면, R2는 하나 이상의 동일하거나 다른Rb, -OH 또는 -NRcRc 기로써 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알콕시기에 의해 파라 위치에서 (모노) 치환된 페닐이 아니며, 여기서 Rb 및 Rc는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다; 그리고/또는 (5) R2 및/또는 R4는 3,4,5-트리(C1-C6)알콕시페닐 또는3,4,5-트리메톡시페닐이 아니며, R5 및 R6는 각각 수소이다.
삼중 치환 페닐이 포함되는 화합물들의 또 다른 실시예에서는, 삼중 치환 페닐은 다음 화학식을 갖는다:
여기서 R31은 메틸 또는 (C1-C6) 알킬, R32는 수소, 메틸 또는 (C1-C6) 알킬, R33은 할로 그룹이다.
구조식 (I) 및 (Ia) 화합물에 대한 13번째 실시예에서는, R2 및/또는 R4가 선택적으로 치환되는 헤테로아릴이다. 이 13번째 실시예에 따른 전형적인 헤테로아릴기는 5개에서 15개, 보다 전형적으로 5개에서 11개의 고리 원자로 구성되며,
N, NH, O, S, S(O) 및 S(O)2로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 동일하거나 다른 이종 원자나 이종 원자기를 포함한다. 이 선택적으로 치환되는 헤테로아릴은 모든 가능한 탄소 원자나 이종 원자를 통하여 해당 C2나 C4 질소 원자 또는 링커 L1이나 L2에 부착될 수 있지만, 전형적으로는 탄소 원자를 통하여 부착된다. 이 선택적 치환기들은 동일하거나 다를 수 있으며, 가능한 모든 탄소 원자나 이종 원자에 부착될 수 있다. 이러한 화합물의 한 실시예에서는, R5가 브로모, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노 또는 -C(O)NHR 이외의 것이며, R은 수소나 (C1-C6) 알킬이다. 이러한 화합물들의 다른 실시예에서 R2와 R4가 각각 치환 또는 비치환 피롤이나 인돌이면, 그 고리는 고리 탄소 원자를 통하여 그 분자의 다른 부분에 부착된다. 선택적으로 치환된 헤테로아릴기가 포함되는 화합물들의 또 다른 실시예에서는, 헤테로아릴은 치환되지 않거나 하나에서 넷의 동일하거나 다른 R8 기로써 치환되며, 여기서 R8은 구조식(I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 이러한 선택적으로 치환되는 헤테로아릴의 구체적인 예로는 다음 헤테로아릴기가 포함되지만 이에 제한되지 않는다:
여기서
p는 1에서 3까지의 정수이다.
- - -는 각각 독립적으로 단일 결합이나 이중 결합을 나타낸다.
R35는 수소나 R8이고 R8은 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같으며;
X는 CH, N 및 N-O로서 구성된 그룹에서 선택된다.
각 Y는 O, S 및 NH로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
각 Y1는 O, S, SO, SO2, SONR36, NH 및 NR37로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
각 Y2는 CH, CH2, O, S, N, NH 및 NR37으로써 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다.
R36은 수소 또는 알킬이다.
R37은 수소와 프로그룹으로 구성된 그룹에서 선택되며, 바람직하게는 수소 또는 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, Ra, Rb-CRaRb-O-C(O)R8 , -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8)2, -CH2-PO(OR8)2, -C(O)-CRaR b-N(CH3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb -N(CH3)2, -C(O)R8, -C(O)CF3 및 -C(O)-NR8-C(O)R8으로써 구성된 그룹에서 선택된 프로그룹이며;
A는 O, NH 및 NR38로 구성된 그룹에서 선택된다.
R38은 알킬과 아릴로 구성된 그룹에서 선택된다.
R9, R10, R11 및 R12는 알킬, 알콕시, 할로겐, 할로알콕시, 아미노알콕시 및 하이드로알콕시로 구성된 그룹에서 각각 서로 독립적으로 선택되거나 또는 R9및 R10 그리고/또는 R11 및 R12는 케탈에서 선택된다.
Z는 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 에스테르, 카밤산염 및 술포닐로 구성된 그룹에서 각각 선택된다.
Q는 -OH, OR8, -NRcRc, -NHR39-C(O)R8, -NHR39 -C(O)OR8, -NR39-CHR40-Rb, -NR39-(CH2)m-Rb 및 -NR39-C(O)-CHR40-NRcR c로 구성된 그룹에서 선택되며;
R39과 R40는 수소, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬 및 NHR8로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택되며;
Ra, Rb 및 Rc는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. Q에 대한 바람직한 Rb 치환기는 -C(O)OR8, -O-C(O)R8, -O-P(O)(OR8) 2 및 -P(O)(OR8)2에서 선택된다.
위에 도시한 헤테로아릴은 물론 본 발명의 이 실시예에 의한 또 다른 5-15 구성원 헤테로아릴에 대한 한 실시예에서는, R8 은 Rd, -NRcRc, -(CH2)m-NRcRc, -C(O)NRcRc, -(CH2)m-C(O)NRcRc, -C(O)OR d, -(CH2)m-C(O)ORd 및 -(CH2)m-OR d로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택되며, m, Rc 및 Rd는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다.
한 구체적인 실시예에서는, Rd 및/또는 Rc가 하나 이상의 동일하거나 다른 히드록실, 아미노 또는 카로복실기에 의해 선택적으로 치환된 Ra와 (C3-C8) 사이클로알킬로 구성된 그룹에서 선택된다.
위에 도시한 헤테로아릴의 또 다른 실시예에서는 각 R35는 수소 원자, 메틸, 에틸, 이소프로필을 포함하는 (C1-C6) 탄소 사슬, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸을 포함하는 시클로알킬기, 이며, 여기서 x = 1-8, -CH2CONHMe, -CH2CH2NHMe, -CH2CH2 CONHMe, -CH2CH2CH2NHMe 혹은 -CH2CH2CH2OCH 3이다.
위에 실시된 헤테로아릴의 또 다른 실시예에서는, 방향족 고리의 연결이 5 또는 6의 위치에서 이루어진다. R2 또는 R4는 본 명세서 전반에 걸쳐 설명한 헤테로아릴기를 활용할 수 있음에 유의해야 한다.
구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물에 대한 14째 실시예에서는, R2와 R4가 각각 서로 독립적으로, 선택적으로 치환된 페닐, 아릴 또는 헤테로아릴이며, 다음 조건에 적용된다: (1) L1이 직접 결합이며 R6와 R5가 수소이며, R2는 3,4,5-트리메톡시페닐 또는 3,4,5-트리(C1-C6) 알콕시테닐 이외의 것이며; (2) L1 및 L2가 각각 직접 결합이며 R6가 수소이고 R5가 할로이면, R2 및 R4는 3,4,5-트리메톡시페닐 또는 3,4,5-트리(C1-C6) 알콕시페닐이 동시에 될 수 없으며; (3) R4가 3-메톡시페닐 또는 3-(C1-C6) 알콕시페닐이며, R2가 3,4,5-트리치환 페닐이면, 3과 4의 위치에 있는 치환기들은 메톡시 또는 (C1-C6) 알코올기가 동시에 될 수 없으며; (4) R2가 치환된 페닐이고 R6가 수소이면, R5는 시아노 또는 -C(O)NHR 이외의 것이며, 여기서 R은 수소이거나 (C1-C6) 알킬이며; 그리고/또는 (5) R2 및 R4가 각각 독립적으로 치환되거나 치환되지 않은 피롤이나 인돌이면, 피롤이나 인돌은 고리 탄소 원자를 통하여 그 분자의 나머지에 부착된다. 또는, R2는 첫 째나 둘 째 실시예와 관련하여 설명한 조건의 적용을 받는다.
본 발명의 열네 째 실시예에서는, R2와 R4 치환기가 동일하거나 다를 수 있다. 선택적으로 치환되는 구체적인 페닐, 아릴 및 헤테로아릴에는 열두 째와 열세 째 실시예와 관련하여 위에 도시한 것들이 포함된다.
상기의 첫 째부터 열네 째 실시예까지를 포함하여 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물에 대한 열다섯 째 실시예에서는, R6는 수소이며 R5는 전기음성적 기이다. 당업자라면 알 수 있듯이, 전기 음성적 그룹은 비교적 전자를 끌어 당기는 힘이 큰 원자 또는 원자 그룹이다. 당업자가 아는 바와 같이, 본 열네 째 실시예에 의한 전기음성적 기에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: -CN, -NC, -NO2, 할로, 브로모, 클로로, 플루오로, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 과할로알킬, (C1-C3) 플루오로alkyl, (C1-C3) 과플루오로알킬, -CF3, (C1-C3) 할로알콕시, (C1-C3) 과할로알콕시, (C1-C3) 플루오로알콕시, (C1-C3) 과플루오로알콕시, -OCF3, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)CF3 및 -C(O)OCF3. 한 구체적인 실시예에서는, 이 전기 음성적 기는 -OCF3, -CF3, 브로모, 클로로 또는 플루오로와 같은 할로겐을 포함하는 전기음성적 기이다. 또 다른 구체적인 실시예에서는, R5는 플루오로이며, 단 그 화합물이 세 째 실시예에 의한 모든 화합물이 아닌 조건이 적용된다.
열여섯 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들은 다음 구조식 (Ib)에 의한 화합물이며:
이 화합물들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소화합물이 포함되며, 여기서 R11, R12, R13 및 R14은 수소, 히드록시, (C1-C6) 알콕시 및 -NRcRc로 구성된 그룹에서 각각 서로 독립적으로 선택되며; R5, R6 및 Rc는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같으며, R13, R5 및 R6가 각각 수소이면 R11 및 R12 는 동시에 메톡시, (C1-C6) 알콕시 또는 (C1-C6) 할로알콕시가 될 수 없는 조건이 적용된다.
열일곱 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들은 다음 구조식 (Ic)에 의한 화합물이며:
그리고 이들의 염, 수화물, 용매화합물, 질소산화물 및 전구 약물:
R4는 5-10 구성원 헤테로아릴과 3-히드록시페닐로 구성되는 그룹에서 선택되며;
R5는 F 또는 -CF3이며;
R8은 -O(CH2)m-Rb이며 m 및 Rb는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 한 구체적인 실시예에서는, R8은 -O-CH2-C(O)NH-CH3 이며/이거나 R4 는 열세 째 실시예에 의한 헤테로아릴이다.
열여덟 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들에는 Fc 수용체 신호전달체계, Syk 키나제 활동도, Syk-키나제 의존 수용체 신호전달체계 또는 생체내 검정에서 측정되는 세포 탈과립을 억제하는 것으로 표 1에서 선택된 모든 화합물이 포함되며, 그 화합물은 상기의 열세 째 실시예 및/또는 다른 실시예에서 제외되는 화합물이 아님의 조건이 선택적으로 적용된다. 구체적인 실시예에서는, 이러한 화합물들은 생체의 탈과립 검정에서 측정할 때 IC50가 약 20 ㄹμM이며 이러한 검정에는 실시예 부분에서 설명하는 탈과립 검정이 포함된다.
열아홉 째 실시예에서는, 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들에는 시험관 검정에서 측정되는 IC50가 약 20μM인 FcγR1 또는 FcεR1 수용체 순차반응을 억제하는 것으로 표 1에서 선택되는 모든 화합물이 포함되며, 이러한 검정에는 실시예 절에서 제공되는 시험관 검정이 포함되고, 또한 그 화합물은 상기의 열세 째 실시예 및/또는 다른 실시예들에서 제외되는 화합물이 아님의 조건이 선택적으로 적용된다.
이십번 째 실시예에서, 구조식 (Ia)의 화합물은 R2가 로 구성된 그룹에서 선택되었다.
여기서 R4, R8, Ra, Rb, Rc, Rd는 상기 설명한 바와 같으며, R5는 불소 원자, R6은 수소 원자, 그리고 각 R21은 독립적으로 하나 이상의 동일하거나 다른 할로 그룹에서 선택적으로 치환된 할로겐 원자 또는 알킬이고, R22 및 R23은 각각 독립적으로 하나 이상의 동일하거나 다른 할로 그룹에서 선택적으로 치환된 수소 원자, 메틸, 또는 에틸이며, 각 m은 독립적으로 1부터3까지의 정수, 각 n은 독립적으로 0에서 3까지의 정수이다.
이십일번 째 실시예에서 구조식 (Ia)의 R4는 , R9 및 R10은 상기 설명하 바와 같으며 각각 독립적으로 수소 원자이고, R2는 하나 이상의 동일하거나 다른 R8 그룹과 선택적으로 치환된 페닐기이거나 이며, 여기서 R35는 상기 설명한 바와 같다. 한 구체적인 측면에서, R2가 페닐기인 경우, 하나 이상의 R8이 할로겐 및 알콕시 그룹에서 선택된다. 한 측면에서는 페닐기가 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 이중 또는 삼중 치환되었다.
이십이번 째 실시예에서, 구조식 (Ia) 화합물은 R4는 , R2는 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 치환된 페닐기이다. 한 구체적인 측면에서, 하나 이상의 R8은 할로겐 및 알콕시기에서 선택되었다. 한 측면에서는 페닐기가 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 이중 또는 삼중 치환되었다.
이십삼번 째 실시예에서, 구조식 (Ia) 화합물은 R4가 하나 이상의 동일한 R8 기와 치환된 페닐기이다. 여기서 R2는 이고 R35는 상기 정의한 바와 같다. 특정 실시예에서, R4 페닐기는 동일하거나 다른 할로겐 원자와 이중 또는 삼중 치환되었다. 다른 실시예에서, R4는 할로겐 원자와 단일 치환된 페닐기이다. 한 측면에서, R35는 히드록시알킬기이다. 어떤 측면에서, 히드록시알킬기는 에스테르기 또는 카발산염으로 더 관능화될 수 있다.
이십사번 째 실시예에서, 구조식 (Ia) 화합물은 R4가 이며 여기서 R35는 상기 정의된 바와 같고, R2는 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 치환된 페닐 그룹이다. 한 구체적인 측면에서, R35는 수소 원자 또는 알킬기이다. 다른 실시예에서, R2 페닐기는 동일하거나 다른 R8 그룹과 이중 또는 삼중 치환되었고, 특히 할로겐 원자와 치환되었다.
이십오번째 실시예에서, 구조식 (Ia)의 화합물은 R4가 이며 여기서 R35는 상기 정의한 바와 같고, R2는 이며 여기서 R9 및 R10은 상기 정의한 바와 같고 각각 독립적으로 수소 원자이다. 한 측면에서 R35은 수소 원자 또는 메틸과 같은 알킬기이고 R9 및 R10은 메틸기와 같은 알킬기이다.
이십육번 째 실시예에서, 구조식 (Ia)의 화합물은 R4가 이중 치환된 페닐기이며 동일하거나 다른 R8 그룹과 치환되었다. 그리고 R2는 이고 여기서 R35는 상기 정의한 바와 같다. 어떤 측면에서는 페닐기는 할로겐 원자 및 메톡시기와 같은 알콕시기와 치환되었다. 특정 실시예에서는, R35가 수소 원자, 메틸기와 같은 알킬기, 또는 히드록시알킬기이다. 어떤 측면에서, 히드록시알킬기는 에스테르기 또는 카발산염으로 더 관능화될 수 있다.
이십칠번 째 실시예에서, 구조식 (Ia) 화합물은 R4가 이며, 여기서 R8 및 Rc는 상기 정의된 바와 같고, R2는 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 치환된 페닐기이다. 한 구체적인 측면에서, Rc는 수소 원자 또는 알킬기이다. 다른 실시예에서, R2 페닐기는 동일하거나 다른 R8 그룹과 이중 또는 삼중 치환되었고, 특히 할로겐 원자 또는 와 치환되었다.
이십팔번째 실시예에서는, 구조식 (Ia)의 화합물은 R4가 이고, 여기서 Y1, Y2 및 각 R35는 독립적으로 상기 언급한 바와 같으며, R2는 이고, 여기서 R35는 상기 언급한 바와 같다. R4에 관한 이십팔번째 실시예를 보면, Y1은 산소, Y2는 NH 및 하나 이상의 R35이거나 R4 부분이 특히 메틸기인 알킬기이다. 이십팔번째 실시예의 어떤 측면에서는 R4 부분의 두 R35가 같은 자리 이알킬(gem dialkyl) 부분을 형성하고, 특히 같은 자리 이메틸 부분이 NH와 이웃하여 로 나타낼 수 있다. R2에 관한 이십팔번째 실시예의 어떤 측면에서는 R35은 수소 원자이거나 특히 메틸기인 알킬기이다.
이십구번 째 실시예에서는, 구조식 (Ia)의 화합물은 R4 가 이고, 여기서 R9 및R10이 상기 정의한 바와 같거나 페닐기로 치환되었다. 한 측면에서는 페닐기가 하나 이상의 동일한 R8 그룹과 이중 또는 삼중 치환되었다. 특히 페닐기는 하나 이상의 동일하거나 다른 할로겐 원자와 이중 또는 삼중 치환될 수 있다. 이십구번 째 실시예에서 R2는 이고, 여기서 R35는 상의 정의한 바와 같다. 29번 째 실시예의 한 측면에서, R2의 R35는 메틸기가 아니다. 이십구번 째 실시예의 또 다른 측면에서, R2는 이다.
첫번 째 ~ 이십구번 째 실시예에 적용되는 십삼번 째 실시예에서, R5는 플루오르와 같은 할로겐 원자이고, R6은 수소 원자이다.
또한, 상기의 첫번 째부터 십삼번 째까지의 실시예들에 대한 조합을 설명한다.
당업자라면 여기에서 설명하는 2,4-피리미딘디아민 화합물들에는 전구 약물을 만들기 위해 프로그룹으로 가리울 수 있는 반응기들이 포함되는 점을 알 수 있다. 이러한 전구 약물은 반드시 그러할 필요는 없지만 대개 해당되는 활성 약물 형태로 변환되기 전까지는 약리학적으로 비활성이다. 실제로 이하의 표 1에 나와 있는 다수의 활성 2,4-피리미딘디아민 화합물에는 사용하는 조건 하에서 가수분해 또는 절단이 가능한 프로모이티들이 포함된다. 예를 들어, 에스테르기는 흔히 위의 산성 조건에 노출되는 경우 산촉매 가수분해를 거쳐 어미 카르복실 산을 생성하며, 장이나 혈액의 염기 조건에 노출되는 경우에는 염기 촉매 가수분해를 거치게 된다. 그러므로 피험자에게 구강 투여되는 에스테르 부분을 포함하는 2,4-피리미딘디아민 화합물은 그에 대응하는 카르복실산의 전구 약물로 간주할 수 있으며, 이는 그 에스테르 형태의 약리학적 활성과는 무관하다. 표 1을 참조하면, 본 발명의 무수한 에스테르 포함 2,4-피리미딘디아민들은 각각의 에스테르 "전구 약물" 형태에서 활성이 있다.
본 발명의 전구 약물에서는 가능한 모든 기능적 부분을 프로그룹으로 가리움으로써 전구 약물을 만들 수 있다. 프로모이티에 포함시키기 위하여 프로그룹으로써 가리울 수 있는 2,4-피리미딘디아민 화합물 내의 반응기에는 아민(일차 및 이차), 히드록실, 설판일(티올), 카르복실 등이 포함된다. 이러한 반응기의 가리움으로써 바람직한 사용 조건 하에서, 절단 가능한 프로모이티 생성에 적절한 무수한 프로그룹들은 그 분야에서 알려져 있다. 이러한 프로그룹은 개별적으로 또는 조합으로써 본 발명의 전구 약물에 포함될 수 있다.
한 예시적 실시예에서는, 본 발명의 전구 약물은 Rc 및 Rd가 이미 정의된 대체안 외에도 프로그룹일 수 있는, 구조식 (I)에 의한 화합물들이다.
구조식 (I)의 2,4-피리미딘디아민에서 N2 및 N4에 부착된 수소들을 치환기로 치환하는 경우 그 화합물의 활동도에 부정적인 영향을 초래한다. 그러나, 당업자라면 알 수 있듯이, 이러한 질소는 사용 조건 하에서 절단을 통해 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 생성하는 프로모이티에 포함될 수 있다. 그러므로 다른 실시예에서는, 본 발명의 전구 약물은 구조식(II)에 의한 화합물이며,
또한 이들의 염, 수화물, 용매화물 및 질소산화물을 포함하며,
여기서 R2, R4, R5, R6, L1 및 L2는 구조식(I)으로 이미 정의된 바와 같으며;
R2b 및 R4b는 각각 서로 독립된 프로그룹이다. 본 발명의 이 실시예에 의한 프로 그룹들의 구체적 예로는 (C1-C6) 알킬, -C(O)CH3, -C(O)NHR36 및 -S(O)2 R36 등이 있으며, 여기서 R36는 (C1-C6) 알킬, (C5-C15) 아릴 및 (C3-C8) 사이클로알킬이다.
구조식 (II)의 전구 약물에서, 다양한 치환기들은 구조식 (I) 및 (Ia)의 화합물들에 대해 이미 설명한 첫 째부터 열두 째까지의 실시예 그리고 이 실시예들의 조합에 나와 있는 것과 같다.
당업자라면 본 발명의 많은 화합물들과 전구 약물들은 물론 여기서 구체적으로 설명한/하거나 도시된 다양한 화합물 종들이, 토토머화와 형태 이성질, 기하 이성질 및 광학 이성질의 현상을 발현할 수 있음을 인정할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물과 전구 약물은 하나 이상의 키랄 중심 및/또는 이중 결합을 포함할 수 있으며, 결과적으로 이중 결합 이성질체(예: 기하 이성질체), 거울상 이성질체 및 부분입체 이성질체 그리고 라세미 혼합물과 같은 이들의 혼합물 등과 같은 입체 이성질체로서 존재할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 화합물과 전구 약물은 엔올형, 케토형 또는 이들의 혼합물을 포함하는 몇 가지의 토토머 형태로도 존재할 수 있다. 본 명세서와 특허 청구의 범위에 나와 있는 다양한 화합물 명칭, 화학식 및 화합물 도면들은 가능한 토토머, 형태 이성질체, 광학 이성질체 또는 기하 이성질체들의 한 가지만을 나타낼 수 있으므로, 본 발명은 여기서 설명하는 하나 이상의 기능을 가진 화합물이나 전구 약물들에 대한 모든 토토머, 형태 이성질체, 광학 이성질체 및/또는 기하 이성질체들은 물론 이러한 다양하고 서로 다른 이성질체들의 혼합물까지도 포함하는 것을 숙지해야 한다. 2,4-피리미딘디아민 핵심 구조의 주위에 대한 제한된 회전의 경우, 회전장애 이성질체도 가능하며 따라서 본 발명의 화합물에 구체적으로 포함된다.
더욱이, 당업자라면 대체 치환기들의 목록에 원자가 요구조건이나 다른 이유로 인하여 특정한 기를 치환하는 데 사용할 수 있는 구성원이 포함되는 경우, 그러한 목록의 의도가 특정한 기의 치환에 적합한 목록의 구성원들을 포함시킨다는 것에 있음을 인정할 것이다. 예를 들어, 당업자라면 Rb에 대해 나열된 모든 대체안들이 알킬기의 치환에 사용될 수 있는 반면, =O와 같은 일부의 대체안들은 페닐기의 치환에 사용할 수 없음을 인정할 것이다. 가능한 치환기-기의 쌍만을 의도한다는 것을 이해해야 한다.
본 발명의 화합물 및/또는 전구 약물은 화학적 구조나 화학명으로 그 정체를 파악할 수 있다. 화학적 구조와 화학명이 상충하는 경우에는, 그 화학적 구조가 특정 화합물의 정체를 결정한다.
다양한 치환기들의 성격에 따라, 본 발명은 2,4-피리미딘디아민 화합물과 전구 약물은 염의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 염에는 제약 용도에 적합한 염("제약상 수용되는 염"), 수의학 용도에 적합한 염 등이 포함된다. 이러한 염은 당업계에서 잘 알려진 바와 같이 산이나 염기로부터 유도될 수 있다.
한 실시예에서는 이 염은 제약상 수용되는 염이다. 일반적으로 제약상 수용되는 염이란 어미 화합물의 바람직한 제약상 활성을 하나 이상 상당히 유지하며 인체 투여에 적합한 염을 말한다. 제약상 수용되는 염에는 무기산이나 유기산으로써 형성되는 산 추가 염이 포함된다. 제약상 수용되는 산 추가 염의 형성에 적합한 무기 산에는 불화수소산(예: 염화수소산, 브롬화수소산, 요도화수소산 등), 황산, 질산, 인산 등이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 제약상 수요되는 산 추가 염의 형성에 적합한 유기산에는 아세트산, 삼불화아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 옥살산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 팔미트산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 알킬술폰산(예: 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄-다이술폰산, 2-히드록시에탄술폰산 등), 아릴술폰산(예: 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 2-나프탈렌술폰산, 4-톨루엔술폰산, 시클로알킬술폰산(캄포르술폰산), 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글로쿠헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 삼차 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 실리살산, 스테아르산, 뮤콘산 등이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
또한, 제약상 적합한 염에는, 어미 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온(예: 염기성 금속 이온, 알칼리 금속 이온, 알루미늄 이온)에 의해 치환된 염, 암모늄 이온 또는 유기 염기(예: 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민, 모폴린, 피페리딘, 다이메틸아민, 다이에틸아민 등)와 배위를 이루어서 형성되는 염들도 포함된다.
본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 물론 이들의 염들은 수화물, 용매화물 및 질소산화물의 형태로도 존재할 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다.
6.3 합성의 방법
본 발명의 화합물들과 전구 약물들은 공업용 개시 물질 및/또는 전통적인 합성 방법들에 의해 만들어진 개시 물질을 사용하여 다양한 합성 경로를 통하여 합성할 수 있다. 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들과 전구 약물들의 합성을 위해 일상적으로 적응시킬 수 있는 적합한 방법의 예들은 미국 특허 5,958,935호에 나와 있으며, 그 공개 내용은 인용 문헌으로 여기에 포함된다. 본 발명의 다수의 화합물과 전구 약물 그리고 이들의 중간체들의 합성을 설명하는 구체적인 예들은 실시예 부분에서 제공된다. 구조식 (I), (Ia) 및 (II)에 해당하는 모든 화합물은 이러한 방법들의 일상적 적응에 의해 만들 수 있다.
본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 합성에 사용할 수 있는 합성 경로에 대한 다양한 예는 다음의 방식 (I)-(XI)에서 설명된다. 방식 (I)-(XI)에서 번호가 같은 화합물은 유사한 구조를 가진다. 이 방법들은 구조식 (II)에 의한 전구 약물들의 합성을 위해 일상적으로 적응시킬 수 있다.
한 예시적 실시예에서는, 이 화합물들은 다음 방식 (I)에 도시된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 우라실 또는 티오우라실로부터 합성할 수 있다:
방식 (I)에서, R2, R4, R5, R6, L1 및 L2 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같으며, X는 할로겐(예: F, Cl, Br 또는 I)이며, Y 및 Y'는 O 및 S로 구성된 그룹으로부터 각각 서로 독립적으로 선택된다. 방식 (I)을 참조하면, 우라실 또는 티오우라실 2는 표준 조건 하에서 기본적 할로겐화 물질 POX3 (또는 다른 기본적 할로겐화 물질)을 사용하여 2- 및 4- 위치에서 다이할로겐화가 이루어져 2,4-비스할로피리미딘 4가 생성된다. 피리미딘 4에서 R5 치환기에 따라, C4 위치의 할로겐화물은 C2 위치의 할로겐화물 보다 친핵체에 대해 반응성이 더 크다. 이러한 반응성 차이를 활용함으로써 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 합성할 수 있는데, 먼저 2,4-비스할로피리미딘 4를 1 당량의 아민 10과 반응시켜 4N-치환-2-할로-4-피리미딘아민 8를 얻은 다음 아민 6와 반응시켜 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 얻는다. 2N,4N-비스(치환)-2,4-피리미딘디아민 12 및 14는 2,4-비스할로피리미딘 4를 과다 6 또는 10과 각각 반응시켜 얻을 수 있다.
대부분의 상황에서는, 이 방식에 도시된 바와 같이 C4 할로겐화물의 친핵체에 대한 반응성이 더 크다. 그러나, 당업자라면 알 수 있듯이, R5 치환기의 정체는 이러한 반응성을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, R5가 트리플루오로메틸이면, 4N-치환-4-피리미딘아민 8 및 상응하는 2N-치환-2-피리미딘아민의 50:50 혼합물이 얻어진다. R5의 정체에 관계 없이, 이 반응의 위치 선택성은 당업계에서 잘 알려진 바와 같이, 용매와 다른 합성 조건들(온도 등)을 조정함으로써 조절할 수 있다.
방식 (I)에 도시된 반응들은 반응 혼합물을 마이크로파를 통하여 가열할 때 보다 신속히 진행될 수 있다. 이러한 방식으로 가열할 때, 다음 조건을 사용할 수 있다 밀봉관 내에서 Smith 반응기(Personal Chemistry)를 사용하여 에탄올에서 5-20분 동안 175°C까지 가열한다(20바의 압력).
우라실 또는 티오우라실 2의 개시 물질은 상업적 공급원으로부터 구입하거나 유기화학의 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 방식 (I)에서 개시 물질로써 사용 가능하며 공업용으로 얻을 수 있는 우라실과 티오우라실에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: (Aldrich #13,078-8; CAS Registry 66-22-8); 2-티오-우라실 (Aldrich #11,558-4; CAS Registry 141-90-2); 2,4-디티오우라실 (Aldrich #15,846-1; CAS Registry 2001-93-6); 5-아세토우라실 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 6214-65-9); 5-아지도우라실; 5-아미노우라실 (Aldrich #85,528-6; CAS Registry 932-52-5); 5-브로모우라실 (Aldrich #85,247-3; CAS Registry 51-20-7); 5-(트란스-2-브로모비닐)-우라실 (Aldrich #45,744-2; CAS Registry 69304-49-0); 5-(트란스-2-클로로비닐)-우라실 (CAS Registry 81751-48-2); 5-(트란스-2-카르복시비닐)-우라실; 우라실-5-카르복실산(2,4-디히드로피리미딘-5-카르복실산 수화물; Aldrich #27,770-3; CAS Registry 23945-44-0); 5-클로로우라실 (Aldrich #22,458-8; CAS Registry 1820-81-1); 5-시아노우라실 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 4425-56-3); 5-에틸우라실 (Aldrich #23,044-8; CAS Registry 4212-49-1); 5-에테닐우라실 (CAS Registry 37107-81-6); 5-플로오로우라실 (Aldrich #85,847-1; CAS Registry 51-21-8); 5-이오도우라실 (Aldrich #85,785-8; CAS Registry 696-07-1); 5-메틸우라실(티민; Aldrich #13,199-7; CAS Registry 65-71-4); 5-니트로우라실 (Aldrich #85,276-7; CAS Registry 611-08-5); 우라실-5-설팜산 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 5435-16-5); 5-(트리플루오로메틸)-우라실 (Aldrich #22,327-1; CAS Registry 54-20-6); 5-(2,2,2-트리플루오로에틸)-우라실 (CAS Registry 155143-31-6); 5-(펜타플루오로에틸)-우라실 (CAS Registry 60007-38-3); 6-아미노우라실 (Aldrich #A5060-6; CAS Registry 873-83-6) 우라실-6-카르복실산 (오로트산; Aldrich #0-840-2; CAS Registry 50887-69-9); 6-메틸우라실 (Aldrich #D11,520-7; CAS Registry 626-48-2); 우라실-5-아미노-6-카르복실산 (5-아미노오로트산; Aldrich #19,121-3; CAS Registry #7164-43-4); 6-아미노-5-니트로소우라실 (6-아미노-2,4-다이히드록시-5-니트로이소피리미딘; Aldrich #27,689-8; CAS Registry 5442-24-0); 우라실-5-플루오로-6-카르복실산 (5-플루오로오로트산; Aldrich #42,513-3; CAS Registry 00000-00-0); 및 우라실-5-니트로-6-카르복실산 (5-니트로오로트산; Aldrich #18,528-0; CAS Registry 600779-49-9). 추가의 5-, 6- 그리고 5,6-치환 우라실 및/또는 티오우라실은 General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) 및/또는 Interchim, France (www.interchim.com)를 통해 얻을 수 있으며 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
아민 6 및 10은 상업적 공급처를 통해 구입하거나 또는 표준 기법을 활용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 적절한 아민들은 일반 화학을 사용하여 니트로 전구체로부터 합성할 수 있다. 실시예 절에는 구체적인 반응 예들이 나와 있다. 또한, 다음을 참조할 수도 있다: Vogel, 1989, Practical Organic Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. 및 John Wiley & Sons, Inc.
당업자라면 경우에 따라서 아민 6 및 10 그리고/또는 우라실이나 티오우라실 2의 치환기 R5 및/또는 R6에는 합성 도중 보호를 요하는 작용기가 포함될 수 있음을 알 것이다. 사용되는 보호기의 정체는 보호 대상의 반응기의 정체에 의존하며, 이는 당업자에게 분명할 것이다. 적절한 보호기의 선택을 위한 지침 그리고 이들의 부착에 관한 전략은 한 예로써 다음에서 찾아볼 수 있다: Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 제 3판, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999) 그리고 여기서 인용된 참조 문헌들(이하 "Greene & Wuts").
5-플루오로우라실 (Aldrich #32,937-1)을 개시 물질로 활용하는 방식(I)의 한 구체적인 실시예는 다음 방식 (Ia)에 도시되어 있다:
방식 (Ia)
방식 (Ia)에서 R2, R4, L1 및 L2는 방식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 방식 (Ia)에 의하면, 5-플루오로우라실 3는 POCl3로써 할로겐화되어 2,4-다이클로로-5-플루오로피리미딘 5가 생성되고, 이는 다시 과다 아민 6 또는 10과 반응하여N2,N4-비스치환 5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 11 또는 13을 각각 생성한다. 또는, 비대칭 2N,4N-이치환-5-플루오로-2,4-피리미딘디아민 9는, 2,4-다이클로로-5-플루오로피리미딘 5와 1 당량의 아민 10 (2-클로로-N4-치환-5-플루오로-4-피리미딘아민 7을 생성)을 반응시킨 다음 1당량 이상의 아민 6와 반응시켜서 얻을 수 있다.
또 다른 실시예에서는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 다음의 방식 (IIa) 및 (IIb)에 도시된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 사이토신으로부터 합성할 수 있다:
방식 (IIa)
방식 (IIb)
방식 (IIa) 및 (IIb), R2, R4, R5, R6, L1, L2 및 X는 방식 (I)에서 이미 정의된 바와 같으며, PG는 보호기를 나타낸다. 방식 (IIa)를 참조하면 사이토 20의 C4 외향 고리 아민은 적절한 보호기 PG로써 먼저 보호함으로써 N4-보호 사이토신22가 생성된다. 여기서 유용한 보호기에 대한 구체적인 지침은 다음을 참조할 수 있다: Vorbruggen 및 Ruh-Pohlenz, 2001, Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, NY, pp. 1-631 (이하 "Vorbruggen"). 보호된 사이토신 22는 표준 조건 하에서 표준 할로겐화 시약을 사용하여 C2 위치에서 할로겐화되어 2-클로로-4N-보호-4-피리미딘아민 24를 생성한다. 아민 6와의 반응 후 C4 외향 고리 아민의 탈보호기를 거쳐 아민 10과의 반응을 거치면 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민이 생성된다.
또는, 방식 (IIb)를 참조하면, 사이토신 20는 아민 10 또는 보호된 아민 21과 반응하여 N4-치환 사이토신 23 또는 27을 각각 생성할 수 있다. 이러한 치환된 사이토신들을 위에서 설명한 대로 할로겐화, 탈보호기(N4-치환 사이토신 27의 경우) 및 아민 6와의 반응을 차례로 거쳐서 구조식(I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 생성할 수 있다.
방식 (IIa) 및 (IIb)에서 개시 물질로써 사용할 수 있는 공업용 사이토신에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 사이토신 (Aldrich #14,201-8; CAS Registry 71-30-7); N4-아세틸사이토신 (Aldrich #37,791-0; CAS Registry 14631-20-0); 5-플루오로사이토신 (Aldrich #27,159-4; CAS Registry 2022-85-7); 그리고 5-(트리플루오로메틸)-사이토신. 방식 (IIa)에서 개시 물질로서 유용한 다른 적절한 사이토신은 General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) 및/또는 Interchim, France (www.interchim.com)으로부터 얻거나 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
또 다른 실시예에서는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 다음의 방식(III)에 도시된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 2-아미노-4-피리미딘올로부터 합성할 수 있다:
방식 (III)
방식 (III), R2, R4, R5, R6, L1, L2 및 X는 방식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같으며, Z는 다음에 나오는 방식 IV와 관련하여 보다 상세히 설명되는 이탈기이다. 방식 (III)을 참조하면, 2-아미노-4-피리미딘올 30을 아민 6 (또는 선택적으로 보호된 아민 21)과 반응시켜 N2-치환-4-피리미딘올 32를 생성하고, 다음 이것을 이미 설명한 바와 같이 할로겐화하여 N2-치환-4-할로-2-피리미딘아민 34를 생성한다. 선택적으로 탈보호기(예를 들어, 보호된 아민 21을 첫째 단계에서 사용한 경우) 및 아민 10과의 반응을 차례로 거치면 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민을 얻을 수 있다. 또는, 피리미딘올 30을 아실화시약 31과 반응시킬 수 있다.
방식 (III)에서 개시 물질로써 사용할 수 있으며 공업용으로 얻을 수 있는 적절한 2-아미노-4-피리미딘올 30에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 2-아미노-6-클로로-4-피리미딘올 수화물 (Aldrich #A4702-8; CAS Registry 00000-00-0) 및 2-아미노-6-히드록시-4-피리미딘올 (Aldrich #A5040-1; CAS Registry 56-09-7). 방식 (III)에서 개시 물질로써 유용한 다른 2-아미노-4-피리미딘올 30은 General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) 및/또는 Interchim, France (www.interchim.com)으로부터 얻거나, 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
또는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 다음의 방식 (IV)에 표시된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 4-아미노-2-피리미딘올로부터 만들 수 있다:
방식 (IV)
방식 (IV)에서, R2, R4, R5, R6, L1 및 L2 는 방식 (I)에서 이미 정의된 바와 같으며, Z는 이탈기를 나타낸다. 방식 (IV)를 참조하면, 4-아미노-2-피리미딘올 40의 C2-히드록실은 C4-아미노 보다 친핵체에 대해 반응성이 더 크므로, 아민 6과의 반응에 의해 N2-치환-2,4-피리미딘디아민 42가 생성된다. 다음, 양호한 이탈기 Z가 포함된 화합물 44 또는 아민 10과의 반응에 의해 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민이 생성된다. 화합물 44에는 N2-치환-2,4-피리미딘디아민 42의 C4-아미노에 의해 대치될 수 있는 거의 모든 이탈기들이 포함된다. 적절한 이탈기 Z에는 다음이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다: 할로겐, 메탄술폰일옥시(메실옥시; "OMs"), 트리플루오로메탄술폰일옥시("OTf")와 p-톨루엔술폰일옥시(토실옥시; "OTs"), 벤젠 술폰일옥시("베실레이트") 및 메타니트로 벤젠 술폰일옥시("노시레이트"). 그 밖의 적절한 이탈기들은 당업자에게는 분명할 것이다.
치환된 4-아미노-2-피리미딘올 개시 물질은 구입하거나 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
또 다른 예시적 실시예에서는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 2-클로로-4-아미노피리미딘 또는 2-아미노-4-클로로피리미딘으로부터 만들 수 있으며, 이는 다음 방식(V)에 표시되어 있다:
방식 (V)
방식 (V)에서, R2, R4, R5, R6, L1, L2 및 X는 방식 (I)에서 정의된 바와 같으며 Z는 방식 (IV)에서 정의된 바와 같다. 방식 (V)를 참조하면, 2-아미노-4-클로로피리미딘 50을 아민 10과 반응시켜 4N-치환-2-피리미딘아민 52를 생성하고, 이는 화합물 31 또는 아민 6과의 반응을 거쳐 구조식 (I)에 의한 2,4-피리미딘디아민이 생성된다. 또는, 2-클로로-4-아미노-피리미딘 54을 화합물 44 및 아민 6와 차례로 반응시켜 구조식 (I)에 의한 화합물을 생성한다.
방식 (V)에서 개시 물질로써 사용하는 데 적합한 피리미딘 50 및 54 등은 구입할 수 있으며 그 예는 다음과 같지만 이로써 제한되지는 않는다: 2-아미노-4,6-디클로로피리미딘 (Aldrich #A4860-1; CAS Registry 56-05-3); 2-아미노-4-클로로-6-메톡시-피리미딘 (Aldrich #51,864-6; CAS Registry 5734-64-5); 2-아미노-4-클로로-6-메틸피리미딘 (Aldrich #12,288-2; CAS Registry 5600-21-5); 및 2-아미노-4-클로로-6-메틸티오피리미딘 (Aldrich #A4600-5; CAS Registry 1005-38-5). 그 밖의 피리미딘 개시 물질은 General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) 및/또는 Interchim, France (www.interchim.com)으로부터 구입하거나 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
또는, 4-클로로-2-피리미딘아민 50은 방식 (Va)에서 도시된 바와 같이 제조할 수 있다:
방식 (Va)
방식 (Va)에서, R5 및 R6은 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 방식 (Va)에서는 디카르보닐 53을 구아니딘과 반응시켜 2-피리미딘아민 51을 생성한다. m-과염화벤조산, 삼염화과아세트산 또는 요소 과산화수소 착물과 같은 과산(peracid)과의 반응은 질소산화물 55를 생성하며, 이는 다시 할로겐화를 거쳐 4-클로로-2-피리미딘아민 50를 제공한다. 이에 상응하는 4-할로-2-피리미딘아민은 적절한 할로겐화 시약을 사용하여 얻을 수 있다.
또 다른 예시적 실시예에서는, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 다음의 방식 (VI)에 도시된 바와 같이 치환되거나 치환되지 않은 우리딘으로부터 제조할 수 있다:
방식 (VI)
방식 (VI)에서, R2, R4, R5, R6, L1, L2 및 X는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같으며, 위첨자 PG는 방식 (IIb)와 관련하여 설명한 바와 같이 보호기를 나타낸다. 방식 (VI)에 의하면, 우리딘 60에는 C4 반응 중심이 있어서 아민 10 또는 보호된 아민 21과 반응하여 N4-치환 시티딘 62와 64를 생성한다. N4-치환 62 또는 64 ("PG"가 산 치환성 보호기를 나타내는 경우)의 산 촉매에 의한 탈보호기는 N4-치환 사이토신 28을 생성하며, 이는 다시 C2-위치에서 할로겐화가 이루어지고 아민 6와 반응함으로써 구조식 (I)의 2,4-피리미딘디아민이 생성된다.
또한, 시티딘은 다음의 방식 (VII)에 도시된 바와 같이, 유사한 방식으로 개시 물질로도 사용될 수 있다:
방식 (VII)
방식 (VII)에서, R2, R4, R5, R6, L1, L2 및 X는 방식 (I)에서 이미 정의된 바와 같으며 위첨자 PG는 상기 설명된 바와 같이 보호기를 나타낸다. 방식 (VII)를 참조하면, 시티딘 70은 우리딘 60과 마찬가지로 C4 반응 중심이 있어서 아민 10 또는 보호된 아민 21과 반응하여 N4-치환 시티딘 62 또는 64를 각각 생성한다. 다음, 이러한 시티딘 62 및 64를 방식 (VI)에 이미 설명된 바와 같이 처리하여 구조식 (I)의 2,4-피리미딘디아민을 생성한다.
방식 (VI) 및 (VII)은 리보실뉴클레오티드로서 예시했지만, 당업자라면 상응하는 2'-디옥시리보 및 2',3'-디디옥시리보 뉴클레오시드는 물론 리보스가 아닌 당이나 당 유사체를 포함하는 뉴클레오시드도 가능하다는 것을 인정할 것이다.
당업계에는 방식 (VI) 및 (VII)에서 개시 물질로써 유용한 수많은 우리딘과 시티딘이 알려져 있으며, 그 예는 다음과 같지만 이로써 제한되지는 않는다: 5-트리플루오로메틸-2'-디옥시시티딘 (Chem. Sources #ABCR F07669; CAS Registry 66,384-66-5); 5-브로모우리딘 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 957-75-5); 5-이오도-2'-디옥시우리딘 (Aldrich #1-775-6; CAS Registry 54-42-2); 5-플로오로우리딘 (Aldrich #32,937-1; CAS Registry 316-46-1); 5-이오도우리딘 (Aldrich #85,259-7; CAS Registry 1024-99-3); 5-(트리트리플루오로메틸)우리딘 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 70-00-8); 5-트리트리플루오로메틸-2'-디옥시우리딘 (Chem. Sources Int'l 2000; CAS Registry 70-00-8). 방식 (VI) 및 (VII)에서 개시 물질로써 사용될 수 있는 추가의 우리딘 및 시티딘은 General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, Alberta, CA (www.generalintermediates.com) 및/또는 Interchim, France (www.interchim.com)으로부터 구입하거나 표준 기법을 사용하여 만들 수 있다. 적절한 합성 방법들을 알려주는 수많은 교과서의 참조 문헌이 이하에 나와 있다.
또한, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 클로로-치환 피리미딘과 같은 치환된 피리미딘으로부터 합성할 수 있으며, 다음의 방식 (VIII) 및 (IX)에 예시된 바와 같다:
방식 (VIII)
방식 (IX)
방식 (VIII) 및 (IX)에서, R2, R4, L1, L2 및 Ra는 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같으며 "Ar"은 아릴기를 나타낸다. 방식 (VIII)을 참조하면, 2,4,6-트리클로로피리미딘 80 (Aldrich #T5,620-0; CAS#3764-01-0)과 아민 6과의 반응으로부터 다음 세 화합물의 혼합물이 생성된다: 치환된 피리미딘 모노-, 디 및 트리아민 81, 82 및 83이며, 이것은 HPLC 또는 다른 기존 기법을 사용하여 분리할 수 있다. 모노- 및 디아민 81 및 82는 아민 6 및/또는 10과 더 반응시켜 N2,N4,N6-삼치환-2,4,6-피리미딘트리아민 84 및 85를 각각 생성할 수 있다.
N2,N4-비스-치환-2,4-피리미딘디아민은 방식 (VIII)과 유사한 방식으로, 만들 수 있으며, 2,4-디클로로-5-메틸피리미딘 또는 2,4-디클로로-피리미딘을 개시 물질로 사용한다. 이 경우 화합물 81에 상응하는 일치환 피리미딘아민을 얻을 수 없다. 대신, 이 반응이 진행되면 N2,N4-비스-치환-2,4-피리미딘디아민을 직접 생성하게 된다.
방식 (IX)을 참고하면, 2,4,5,6-테트라클로로피리미딘 90 (Aldrich #24,671-9; CAS#1780-40-1)을 과다 아민 6과 반응시켜, 91, 92 및 93 세 화합물들의 혼합물을 생성하며, 이는 HPLC 또는 다른 기존 기법을 사용하여 분리할 수 있다. 도시된 바와 같이, N2,N4-비스-치환-5,6,-디클로로-2,4-피리미딘디아민 92는 예를 들어 친핵제 94와 C6 할로겐화물에서 더 반응시켜 화합물 95를 생성할 수 있다. 또는 화합물 92는 수즈끼 반응을 통해 N2,N4-비스-치환-5-클로로-6-아릴-2,4-피리미딘디아민 97로 변환시킬 수 있다. 2,4-피리미딘디아민 95는 Bn3SnH와의 반응에 의해 2,4-피리미딘디아민 99로 변환시킬 수 있다.
당업자라면 알 수 있듯이, 위에서 설명한 예시적 방법 또는 다른 잘 알려진 수단에 의한 합성되는 본 발명의 2,4-피리미딘디아민은 본 발명의 또 다른 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 합성하는 개시 물질 및/또는 중간체로도 사용될 수 있다 한 구체적인 예는 다음의 방식 (X)에 도시되어 있다:
방식 (X)
방식 (X)에서 R4, R5, R6, L2 및 Ra는 구조식 (I)에서 이미 정의된 바와 같다. Ra'는 각각 독립적으로 Ra이며 예시된 Ra와 동일하거나 다를 수 있다. 방식 (X)을 참조하면, 카르복실산 또는 에스테르 100은 아민 102와 반응시켜 아미도 104로 변환시킬 수 있다. 아민 102에서 Ra'에는 산 또는 에스테르 100의 Ra와 동일하거나 다를 수 있다. 마찬가지로 탄산염 에스테르 106은 카밤산염 108로 변환시킬 수 있다.
두 번째의 구체적인 예는 다음의 방식 (XI)에 도시되어 있다:
방식 (XI)
방식 (XI)에서 R4, R5, R6, L2 및 Rc는 구조식 (I)에 대해 이미 정의된 바와 같다. 방식 (XI)을 참조하면, 아미드 110 또는 116은 보란 메틸술피드 착물 112로써 보란 환원을 함으로써 각각 아민 114 또는 118로 변환시킬 수 있다. 2,4-피리미딘디아민 개시 물질로부터 2,4-피리미딘디아민 화합물들을 합성시킬 수 있는 다른 적합한 반응들은 당업자에게는 분명할 것이다.
위에서 설명한 다수의 합성 방식들이 보호기의 사용을 예시하지 못하지만, 당업자라면 경우에 따라서 R2, R4, R5, R6, L1 및/또는 L2의 치환기들이 보호를 요하는 반응기를 포함하는 것을 이해할 것이다. 사용되는 보호기의 정확한 정체는 특정 합성 방식에 있어서 보호되는 반응기의 정체 그리고 사용되는 반응 조건 등에 따라 다르며, 이는 당업자에게는 분명할 것이다. 보호기의 선택을 위한 지침 그리고 특정 용도를 위한 부착과 제거에 대한 화학적 설명은 상기한 Greene & Wuts에서 찾을 수 있다.
구조식 (II)의 전구 약물은 상기한 방법들의 일상적 변형으로써 만들 수 있다. 또는, 이러한 전구 약물은 구조식 (I)의 적절히 보호된 2,4-피리미딘디아민을 적절한 프로그룹과 반응시킴으로써 만들 수 있다. 이러한 반응의 실행과 그리고 화학식 (II)의 전구 약물의 생성을 위한 생성물의 탈보호기에 대한 조건들은 잘 알려져 있다.
일반적으로 피리미딘 및 방식 (I)-(IX)에서 설명한 개시 물질의 합성에 유용한 방법을 알려주는 수많은 참조 문헌들은 당업계에 알려져 있다. 구체적인 지침이 필요한 독자는 다음을 참조하면 된다: Brown, D. J., "The Pyrimidines", The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16 (Weissberger, A., Ed.), 1962, Interscience Publishers, (A Division of John Wiley & Sons), New York (“Brown I”); Brown, D. J., "The Pyrimidines", The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16, Supplement I (Weissberger, A. 및 Taylor, E. C., Ed.), 1970, Wiley-Interscience, (A Division of John Wiley & Sons), New York (Brown II”); Brown, D. J., "The Pyrimidines", The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 16, Supplement II (Weissberger, A. 및 Taylor, E. C., Ed.), 1985, An Interscience Publication (John Wiley & Sons), New York (“Brown III”); Brown, D. J., "The Pyrimidines" in The Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 52 (Weissberger, A. 및 Taylor, E. C., Ed.), 1994, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 1-1509 (Brown IV”); Kenner, G. W. 및 Todd, A., in Heterocyclic Compounds, Volume 6, (Elderfield, R. C., Ed.), 1957, John Wiley, New York, Chapter 7 (피리미딘); Paquette, L. A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry, 1968, W. A. Benjamin, Inc., New York, pp. 1 - 401 (우라실 합성 pp. 313, 315; 피리미딘 합성 pp. 313-316; 아미노 피리미딘 합성 pp. 315); Joule, J. A., Mills, K. and Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 3rd Edition, 1995, Chapman and Hall, London, UK, pp. 1 - 516; Vorbruggen, H. and Ruh-Pohlenz, C., Handbook of Nucleoside Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 2001, pp. 1-631 (아실화에 의한 피리미딘의 보호 pp. 90-91; 피리미딘의 실릴화 pp. 91-93); Joule, J. A., Mills, K. and Smith, G. F., Heterocyclic Chemistry, 4th Edition, 2000, Blackwell Science, Ltd, Oxford, UK, pp. 1 - 589; 및 Comprehensive Organic Synthesis, Volumes 1-9 (Trost, B. M. and Fleming, I., Ed.), 1991, Pergamon Press, Oxford, UK.
6.4 Fc 수용체 신호전달 순차반응의 억제
본 발명의 활성 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 세포의 탈과립 등을 유도하는 Fc 수용체 신호전달 순차반응을 억제한다. 한 구체적인 예로서, 이 화합물들은 호중구, 호산구, 비만 세포 및/또는 호염기구와 같은 면역 세포들의 탈과립을 유도하는 FcεRI 및/또는 FcγRI 신호전달 순차반응을 억제한다. 비만 세포와 호염기구는 예를 들어 알레르기성 비염과 천식 등을 포함하는 알레르겐 유도 질병의 중심적인 역할을 수행한다. 그림 1을 참조하면, 꽃가루나 기생충과 같은 알레르겐에 노출될 때, IL-4 (또는 IL-13) 및 기타 메신저에 의해 활성화되는 B-세포에 의해서 알레르겐에 상응하는 IgE 항체가 합성되어 IgE 등급에 해당되는 항체 합성으로 변경된다. 이러한 알레르겐에 상응하는 IgE들은 고친화성 FcεRI와 결합한다. 일단 항원과 결합하면 Fc(RI와 결합된 IgE는 가교가 이루어지고 IgE 수용체 신호 도입 경로가 활성화되며, 이는 세포의 탈과립과 그에 따른 각종 화학 매개물질들 즉, 히스타민, 프로테아제(예: 트립타아제, 키나제), 류코트리엔(예: LTC4), 혈소판 응집 인자(PAF), 프로스타글란딘(예: PGD2)와 같은 지질 매개물질들, TNF-α, IL-4, IL-13, IL-5, IL-6, IL-8, GMCSF, VEGF, TGF-β 등의 사이토카인들의 방출 및/또는 합성을 유도한다. 비만 세포 및/또는 호염기구로부터의 이러한 전달물질의 방출 및/또는 합성은, 알레르겐에 의해 유도되는 초기 및 후기 단계의 반응을 설명하며 또한 지속되는 염증 상태를 유도하는 하류 이벤트와 직접 연계된다.
탈과립을 거치는 사전 형성된 전달 물질의 방출 및/또는 다른 화학 매개 물질들의 합성을 유도하는, FcεRI 신호전달경로에서의 분자적 이벤트는 잘 알려져 있으며 그림 2에 도시되어 있다. 그림 2를 참조하면, Fc(RI는 IgE와 결합하는 하나의 알파 서브유닛, 하나의 베타 서브유닛 및 두 개의 감마 서브유닛(감마 동종이중체)로 구성되는 이종 원자의 수용체이다. 다가 결합제(예를 들어, IgE 상응 알레르겐 또는 항 IgE 항체 또는 단편을 포함)에 의한 FcεRI 결합 IgE의 가교는 Src 관련 키나제 Lyn의 급속한 회합과 활성화를 유도한다. Lyn은 면역수용체인 티로신 기반의 활성화 모티프(ITAMS)를 세포내 베타 및 감마 서브유닛 상에서 인산화하며, 이는 추가의 Lyn을 베타 서브유닛에 그리고 Syk 키나제를 감마 동종이중체에 보충시키는 것을 초래한다. 이러한 수용체와 연관된 키나제는 세포내 및 세포간 인산화에 의해 활성화가 이루어지며, Btk 키나제, LAT 및 포스포리파아제 C-감마 PLC-감마)와 같은 그 경로의 다른 구성요소들을 인산화시킨다. 활성 PLC-감마는 단백질 키나제 C 활성화 및 Ca2+ 동원을 유도하는 경로들을 개시하며, 이 둘은 모두 탈과립에 요구된다. 또한, FcεRI 가교는 마이토젠 활성 단백질(MAP) 키나제의 삼대 등급 즉, ERK1/2, JNK1/2 및 p38도 활성화시킨다. 이러한 경로들의 활성화는 TNF-α및 IL-6와 같은 염증성 매개물질의 전구체는 물론 지질 매개물질인 류코트리엔 CA (LTC4)의 전사 조절에 있어서 중요하다.
도시되어 있지는 않지만, FcγRI 신호전달 순차반응은 FceRI 신호전달 순차반응과 일부의 공통 요소들을 공유하는 것으로 생각된다. 중요한 것은 FcεRI와 마찬가지로, FcγRI가 인산화되는 감마 동종이중체를 포함하며 Syk를 보충한다는 점이며, 또한 FcεRI와 마찬가지로 FcγRI의 신호전달 순차반응의 활성화는 탈과립 등을 유도한다. 감마 동종이중체를 공유하며, 활성 2,4-피리미딘디아민 화합물들에 의해 조절될 수 있는 다른 Fc 수용체로는 FcαRI와 FcγRIII가 있지만 이로써 제한되지는 않는다.
본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 Fc 수용체 신호전달 순차반응에 대한 억제 능력은 생체 내 검정을 통하여 간단히 결정하거나 확인할 수 있다. FcεRI 매개 탈과립의 억제를 확인하는 적절한 검정 방법은 실시예 부분에서 제공된다. 한 전형적인 검정에서는, FcεRI 매개 탈과립을 거칠 수 있는 비만 세포나 호염기구와 같은 세포들을 IL-4, 줄기 세포 요인(SCF), IL-6 및 IgE의 존재 하에서 먼저 성장시켜 FcεRI의 발현을 증가시킨 다음, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 시험 화합물에 노출시킨 후, 항 IgE 항체(혹은 IgE-상응 알레르겐)으로써 촉진시킨다. 배양 후, FcεRI 신호전달 순차반응의 활성화 결과로서 방출 및/또는 합성되는 화학 매개물질이나 다른 작동물질의 양은 표준 기법을 사용하여 정량화한 다음, 컨트롤 세포(즉, 촉진되지만 시험 화합물에 노출되지 않은 세포)로부터 방출되는 매개물질이나 작동물질의 양과 비교할 수 있다. 컨트롤 세포에 비교하여 측정되는 매개물질이나 작동물질의 양의 50% 감소를 가져오는 시험 화합물의 농도가 시험화합물의 IC50이다. 검정에서 사용되는 비만 세포나 호염기구의 원천은 부분적으로 화합물들에 대해 원하는 용도에 따라 달라지며, 이는 당업자에게는 분명할 것이다. 예를 들어, 이 화합물을 사용하여 인간의 특정 질병을 치료 또는 예방한다면, 비만 세포나 호염기구의 편리한 원천은 그 특정 질병에 대해 수용되거나 알려진 임상적 모델을 구성하는 인간이나 동물이다. 그러므로, 특정 용도에 따라서, 비만 세포나 호염기구는 광범위한 동물 출처로부터 유도될 수 있으며, 예를 들어 생쥐와 쥐 등의 하급 포유 동물에서부터 개, 양, 임상 실험에 흔히 사용되는 다른 동물들 그리고 원숭이, 침판지, 고릴라와 같은 고급 동물을 비롯하여 인간까지 광범위하다. 이러한 생체 내 검정을 실행하는 데 적절한 세포들의 구체적인 실례로는 설치류나 인간의 호염기구 세포, 쥐의 호염기구 백혈병 세포 계통, 일차 쥐 비만 세포(골수 유도 쥐 비만 세포 "BMMC" 등), 탯줄 혈액에서 분리된 일차 인간 비만 세포("CHMC"), 폐와 같은 다른 조직이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 이러한 유형의 세포를 분리하고 배양하는 방법들은 잘 알려져 있으며, 실시예 부분에 나와 있다(참조, 예: Demo 등, 1999, Cytometry 36(4):340-348 20001년 11월 8일 출원 접수된 일련 번호 10/053,355가 있으며 그 공개 내용은 여기에 참조문헌으로 포함되어 있다). 물론 FcεRI 신호전달 순차반응의 활성화에 의해 탈과립하는 다른 유형의 세포들도 사용될 수 있으며 그 예로는 호산구 세포가 있다.
당업자라면 알 수 있듯이, 정량화되는 전달물질이나 작동물질이 반드시 중요한 것은 아니다. 유일한 요구조건은 Fc 수용체 신호전달 순차반응의 개시나 활성의 결과로서 방출 및/또는 합성되는 전달물질이나 작동물질이 있어야 하는 것이다. 예를 들어, 그림 1을 참조하면, 비만 세포 및/또는 호염기구에서 FcεRI 신호전달 순차반응의 활성화는 무수한 하류 이벤트를 유도한다. 예를 들어, FcεRI 신호전달 순차반응의 활성화는 탈과립에 의해 사전 생성된 다양한 화학 전달물질 및 작동물질들의 즉각적인 방출(예: 수용체 활성화 이후 1 - 3일 이내)을 유도한다. 그러므로 한 실시예에서는, 정량화되는 전달물질이나 작동물질이 과립에 대해 고유할 수 있다(즉, 과립에 존재하지만 세포의 세포질에는 일반적으로 존재하지않음). 과립에 고유한 매개물질이나 작동물질로서 정량화하여 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물의 활동도를 결정 및/또는 확인할 수 있는 예에는, 헥소스아미나제와 트립타제와 같은 과립 고유 효소들 그리고 히스타민과 세로토닌과 같은 과립 고유 성분들이 있지만 이로써 제한되지는 않는다. 이러한 요인들의 정량화 검정들은 잘 알려져 있으며, 대부분 구입할 수 있다. 예를 들어, 트립타제 및/또는 헥소스아미니다제의 방출은, 분리 시 형광을 발하는 분리 가능한 기질과 세포를 함께 배양한 다음 기존 기법을 사용하여 생성되는 형광의 양을 측정하여 정량화할 수 있다. 이러한 분리 가능한 형광 발생 기질은 구입할 수 있다. 예를 들어, 형광 발생 기질은 Z-Gly-Pro-Arg-AMC (Z=벤질옥시카르보닐; AMC=7-아미노-4-메틸쿠마린; BIOMOL Research Laboratories, Inc., Plymouth Meeting, PA 19462, Catalog No. P-142) 및 Z-Ala-Lys-Arg-AMC (Enzyme Systems Products, ICN Biomedicals, Inc. 자회사, Livermore, CA 94550, Catalog No. AMC-246)을 사용하여 방출되는 헥소스아미니다제의 양을 정량화할 수 있다. 형광 발생 기질인 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-(-D-글루코스아미니드(Sigma, St. Louis, MO, Catalog #69585)를 사용하여 방출되는 헥소스아미니다제의 양을 정량화할 수 있다. 히스타민 방출의 정량화는 Immunotech 히스타민 ELISA 검정 #IM2015 (Beckman-Coulter, Inc.)과 같은 구입할 수 있는 효소 결합 항체 면역 흡착 검정(ELISA)을 사용하여 가능하다. 트립타제, 헥소스나미니다제 및 히스타민의 방출을 정량화하는 구체적인 방법은 실시예 부분에 나와 있다. 이러한 검정들은 모두 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 활동도 결정이나 확인에 사용할 수 있다.
그림 1을 다시 참조하면, 탈과립은 FcεRI 신호전달 순차반응에 의해 개시되는 몇 가지 반응 중의 하나일 뿐이다. 또한, 이 신호전달경로의 활성화는 IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α, IL-13 및 MIP1-α와 같은 사이토카닌과 케모카인의 de novo 합성 및 방출 그리고 류코트리엔(예: LTC4), 혈소판 활성화 인자(PAF) 및 프로스타글란딘과 같은 지질 매개물질의 방출을 유도한다. 따라서, 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물들은 활성화된 세포에 의해 방출 및/또는 합성되는 이러한 매개 물질의 양을 정량화함으로써 그 활동도를 측정할 수도 있다.
상기한 과립 고유의 성분과는 달리, 이러한 "후기" 매개물질들은 FcεRI 신호전달 순차반응의 활성화 이후 즉시 방출되지 않는다. 따라서, 이러한 만기 매개물질을 활성화할 때, 활성화된 세포 배양액이 정량화 대상의 매개물질의 합성(필요하면) 및 방출이 이루어지도록 충분한 시간 동안 배양되도록 주의해야 한다. 일반적으로 PAF와 류코트리엔 C4 등의 지질 매개물질은 FcεRI 활성화 이후 3 - 30분 이내에 방출된다. 사이토카인과 그 밖의 후기 매개물질들은 FcεRI 활성화 이후 약 4 - 8시간 이내에 방출된다. 특정 매개물질에 적합한 배양 시간은 당업자에게는 분명할 것이다. 구체적인 지침과 검정에 관한 설명은 실시예 부분에 나와있다.
특정한 후기 매개물질의 방출되는 양은 여러 일반 기법을 사용하여 정량화할 수 있다. 한 실시예에서는, ELISA 검정을 사용하여 그 양(들)을 정량화할 수 있다. TNFα, IL-4, IL-5, IL-6 및/또는IL-13의 방출되는 양의 정량화에 적절한 ELISA 검정 키트는 예를 들어, Biosource International, Inc., Camarillo, CA 93012로부터 구입할 수 있다 (참조, 예: 카탈로그 번호 KHC3011, KHC0042, KHC0052, KHC0061 및 KHC0132). 세포에서 방출되는 류코트리엔 C4 (LTC4)의 양의 정량화에 적절한 ELISA 검정 키트는 다음에서 구입할 수 있다: Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI 48108 (참조, 예: 카탈로그 번호 520211).
일반적으로 본 발명의 활성 2,4-피리미딘디아민 화합물들은, 상기한 시험관 검정과 같은 시험관 검정 또는 실시예 부분에서 측정한 바와 같이 FcεRI 매개 탈과립 및/또는 매개물질의 방출 또는 합성에 대하여 약 20 μM 이하의 IC50s을 나타낼 것이다. 물론 당업자는 예를 들어, 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 정도 또는 그 이하의 더 낮은 IC50s를 발현하는 화합물들이 특히 유용함을 인정할 것이다.
당업자는 상기 다양한 매개물질이 서로 다른 부작용을 유발하거나 같은 부작용에 대해서도 서로 다른 효능을 발현할 수 있음도 인정할 것이다. 예를 들어, 지질 매개물질 LTC4는 강력한 혈관수축약이며, 혈관수축을 유발하는 데 있어서 그 효능이 히스타민에 비해 약 1000배 이상 강하다. 또 다른 예로서, 사이토카인은 아토피성이나 제1형 과민성 반응의 매개 이외에도, 조직의 개조와 세포 증식도 초래할 수 있다. 그러므로, 위에서 설명한 화학 매개물질 가운데 하나라도 그 방출 및/또는 합성을 억제하는 화합물들은 유용하지만, 당업자는 위에서 설명한 매개물질들 가운데 여러 개 또는 모두에 대한 합성 및/또는 방출을 억제하는 화합물이 특히 유용함을 인정할 것이며, 제1형 과민성 반응은 물론 이와 연관된 만성 증상의 치료나 예방에 유용하다. 예를 들어, 세가지 유형의 모든 매개물질(과립 특이, 지질 및 사이토카인)의 방출을 억제하는 화합물은 즉시형인 제1형 과민반응 및 이와 관련된 만성 증상을 치료하고 예방하는데 유용하다.
본 발명의 화합물 가운데 두 가지 유형 이상의 매개물질(예: 과립 특이 또는 후기)의 방출을 억제할 수 있는 것은, 위에서 설명한 다양한 시험관 검정(또는 다른 동등한 시험관 검정)을 사용하여 각 등급의 대표적 매개물질에 대한 IC50을 결정함으로써 파악할 수 있다. 두 가지 유형 이상의 매개물질의 방출을 억제할 수 있는 본 발명의 화합물은 대개 시험 대상의 각 매개물질에 대해 약 20 μM 미만의 IC50를 나타낼 것이다. 예를 들어, 히스타민 방출에 대해 1 μM의 IC50(IC50히스타민)을 나타내며, 류코트리엔 LTC4 합성 및/또는 방출에 대해 1 nM의 IC50(IC50LTC4)를 나타내는 화합물은 즉시형(과립 특이) 및 후기형 매개물질의 방출을 모두 억제한다. 또 다른 구체적인 예로서, 10 μM의 IC50 트립타제, 1 μM의 IC50LTC4 및 1 μM의 IC50 IL-4를 나타내는 화합물은 즉시형(과립 특이), 지질 및 사이토카인 매개물질의 방출을 억제한다. 이 예에서는 각 등급에서 하나의 대표적 매개물질의 IC50를 활용하지만, 당업자라면 하나 이상의 등급을 구성하는 복수 또는 모든 매개물질의 IC50를 얻을 수 있음을 인정할 것이다. 특정 화합물과 용도에 대해 IC50 데이터를 규명해야 할 대상의 매개물질의 양 및 정체는 당업자에게는 분명할 것이다.
FcαRI, FcγRI 및/또는FcγRIII 신호전달과 같은 다른 Fc 수용체에 의해 개시되는 신호전달체계의 억제에 대한 확인은 유사한 검정과 일상적인 변형을 활용하여 가능하다. 예를 들어, FcγRI 신호전달체계를 억제하는 화합물의 능력은 위에서 설명한 검정과 유사한 것으로 확인할 수 있으며, 단 FcγRI 신호전달 순차반응의 활성화는 예를 들어 IgE 및 IgE 특이 알레르겐이나 항체 대신 IgG 및 IgG 특이 알레르겐이나 항체로써 세포를 배양함으로써 이루어지는 것은 제외된다. 감마 동종이중체를 구성하는 Fc 수용체와 같은 다른 Fc 수용체의 억제를 수량화하는 데 적합한 세포 유형과 활성화 물질 및 작동물질은 당업자에게는 분명할 것이다.
특히 유용한 등급의 화합물에는 거의 동등한 IC50를 가진 즉시형 과립 특이 매개물질과 후기형 매개물질을 억제하는 2,4-피리미딘디아민 화합물이 포함된다. 여기서 거의 동등하다는 것은 각 매개물질 유형에 대한 IC50가 서로 약 10배 이내에 있음을 의미한다. 또 다른 특히 유용한 등급의 화합물에는 거의 동등한 IC50를 가진 즉시형 과립 특이 매개물질, 지질 매개물질 및 사이토카인 매개물질의 방출을 억제하는 화합물들이다. 한 구체적인 실시예에서, 이러한 화합물들은 거의 동등한 IC50를 가진 다음 매개물질들의 방출을 억제한다: 히스타민, 트립타제, 헥소스 아미니다제, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNFα 및 LTC4. 이러한 화합물들은 여러 가지가 있겠지만 아토피성이나 즉시형인 제1형 과민성 반응과 연관 있는 초기 및 후기 반응을 개선하거나 회피하는데 특히 유용하다.
이상적으로는, 원하는 모든 유형의 매개물질을 억제하는 능력이 하나의 화합물 내에 존재하는 것이다. 그러나, 같은 결과를 성취하는 화합물들의 혼합물도 알아낼 수 있다. 예를 들어, 과립 특이의 매개물질의 방출을 억제하는 첫째 화합물은 사이토카딘 매개물질들의 방출 및/또는 합성을 억제하는 둘째 화합물과 병용할 수 있다.
위에서 설명한 FcεRI 또는 FcγRI 탈과립 경로 외에도, 비만 및/또는 호염기구 세포의 탈과립은 다른 작동물질에 의해서도 유발할 수 있다. 예를 들어, 세포에 있어서 초기의 FcεRI 또는 FcγRI 신호전달기구를 우회하는 칼슘 이오노포아인 이오노마이신은 탈과립을 시동시키는 칼슘 유출을 유발한다. 그림 2를 참조하면, 활성화된 PLCγ(는 칼슘 이온 동원과 그에 따른 탈과립 등을 유도하는 경로를 개시한다. 도시된 바와 같이, 이러한 Ca2+ 동원은 FcεRI 신호전달경로에 있어서 나중에 시동된다. 위에서 언급한 바와 같이, 그리고 그림 3에 도시된 바와 같이, 이오노마이신은 탈과립을 유도하는 Ca2+ 동원과 Ca2+ 유출을 직접 유발시킨다. 이러한 방식으로 탈과립을 유발하는 다른 이오노포아로는A23187 등이 있다. 이오노마이신과 같이, FcεRI 및/또는 FcγRI 신호전달 순차반응를 우회하며 과립화를 유발하는 이오노포아의 능력은, 위에서 설명한 바와 같이 초기의 FcεRI 또는 FcγRI 신호전달 순차반응의 차폐 또는 억제에 의해 탈과립 억제 활동을 구체적으로 수행하는 본 발명의 활성 화합물을 파악하는데 있어서 계산용 선별 기능으로 사용할 수 있다. 이러한 조기의 FcεRI 또는 FcγRI 매개 탈과립을 구체적으로 억제하는 화합물은 히스타민, 트립타제 및 다른 과립 내용물의 탈과립과 그에 따른 신속한 방출을 억제할 뿐만 아니라, TNFα, IL-4, IL-13 및 LTC4과 같은 지질 매개물질의 방출을 초래하는 사전 염증 활성화 경로로 억제한다. 그러므로 이러한 조기의 FcεRI 및/또는 FcγRI 매개 탈과립을 구체적으로 억제하는 화합물들은 급성의 아토피성 혹은 제1형 과민성 반응뿐만 아니라 복수의 염증성 매개물질이 관련된 후기 반응들도 차단 또는 억제시킨다.
조기의 FcεRI 및/또는FcγRI 매개 탈과립을 구체적으로 억제하는 본 발명의 화합물들은 FcεRI 및/또는 FcγRI 매개 탈과립을 억제하지만(예를 들어, IgE나 IgG 결합제로서 자극시킨 세포를 사용한 시험관 검정에서의 측정 시, 과립 특이의 매개물질이나 성분의 방출에 대해 약 20μM 미만의 IC50를 갖는 화합물), 이오노포아가 유발하는 탈과립을 상당히 억제하지 않는 화합물이다. 한 실시예에서는, 시험관 검정에서의 측정 시 이오노포아 유발의 탈과립에 대한 IC50가20μM을 초과하는 경우 해당 화합물은 이오노포아 유발 탈과립을 상당히 억제하는 것으로 고려하지 않는다. 물론 이보다 더 높은 이오노포아 유발 탈과립의 IC50를 나타내거나, 이오노포아 유발 탈과립을 전혀 억제하지 않는 활성 화합물은 특히 유용하다. 다른 실시예에서는, 시험관 검정에서의 측정 시 FcεRI 및/또는 FcγRI 매개 탈과립과 이오노포아 유발 탈과립의 IC50에 대한 차이가 10배를 초과하는 경우, 해당하는 화합물은 이오노포아 유발 탈과립을 상당히 억제하지 않는 것으로 간주한다. 이오노포아 유발 탈과립의 IC50를 결정하는 데 적절한 검정에는, 위에서 설명한 탈과립 검정들이 모두 포함되지만, 세포의 촉진이나 활성화에 있어서 항 IgE 항체나 IgE 특이 알레르겐 대신 이오노마이신이나 A23187 (A.G. Scientific, San Diego, CA)과 같은 탈과립 유발의 칼슘 이오노포아를 사용하는 변형이 필요하다. 본 발명의 특정 2,4-피리미딘디아민 화합물의 이오노포아 유발 탈과립을 억제하는 능력에 대한 구체적인 검정은 실시예 부분에 나와 있다.
당업자라면 알 수 있는 바와 같이, FcεRI 매개 탈과립에 대해 높은 수준의 선택성을 나타내는 화합물들이 특히 유용한 데, 이러한 화합물은 FcεRI 순차반응을 선택적으로 목표로 정하며 다른 탈과립 기전을 방해하지 않기 때문이다. 마찬가지로, FcγRI 매개 탈과립에 대해 높은 수준의 선택성을 나타내는 화합물이 특히 유용한 데, 이러한 화합물은 FcγRI 순차반응을 선택적으로 목표로 정하며 다른 탈과립 기전을 방해하지 않기 때문이다. 높은 수준의 선택성을 나타내는 화합물을 일반적으로, 이오노마이신 유발 탈과립과 같은 이오노포아 유발 탈과립에 비해 FcεRI- 또는 FcγRI 유발 탈과립에 대한 선택성이 10배 이상 크다.
생화학과 기타 데이터는 여기에서 설명하는 2,4-피리미딘디아민 화합물이 Syk 키나제 활동도의 강력한 억제제임을 확인해준다. 예를 들어, 분리된 Syk 키나제를 사용한 실험에서는 시험한 24가지의 2,4-피리미딘디아민 화합물 중에서 두 개를 제외한 모든 화합물들이 Syk 키나제 촉매에 의한 펩티드 기질의 인산화를 억제했으며 이때 IC50의 범위는 미크로몰 미만이었다. 나머지 화합물들은 미크로몰 범위에서 인산화를 억제했다. 또한, 비만 세포를 사용한 생체의 검정에서 16개의 화합물을 시험한 결과, 모두 Syk 키나제 기질(예: PLC-감마, LAT) 및 Syk 키나제의 하류 단백질들(예: 시험했을 때 JNK, p38, Erk1/2 및 PKB)의 인산화를 억제했지만, 순차반응에 존재하는 Syk 키나제의 상류 단백질들(예: Lyn)은 억제하지 않았다. Lyn 기질의 인산화는 시험 대상의 2,4-피리미딘디아민에 의해 억제되지 않았다. 더욱이, 다음 화합물의 경우 생화학 검정에서 Syk 키나제 활동도의 억제(3에서 1850 nM 범위의 IC50)와 비만 세포에서 FcεR1 매개 탈과립의 억제(30에서 1650 nM 범위의 IC50) 사이에 높은 상관 관계가 관찰되었다: R950373, R950368, R921302, R945371, R945370, R945369, R945365, R921304, R945144, R945140, R945071, R940358, R940353, R940352, R940351, R940350, R940347, R921303, R940338, R940323, R940290, R940277, R940276, R940275, R940269, R940255, R935393, R935372, R935366, R935310, R935309, R935307, R935304, R935302, R935293, R935237, R935198, R935196, R935194, R935193, R935191, R935190, R935138, R927050, R926968, R926956, R926931, R926891, R926839, R926834, R926816, R926813, R926791, R926782, R926780, R926757, R926753, R926745, R926715, R926508, R926505, R926502, R926501, R926500, R921218, R921147, R920410, R909268, R921219, R908712, R908702.
따라서, 본 발명의2,4-피리미딘디아민 화합물들의 활동도는 Syk 키나제 활동도에 대한 생화학 또는 세포 검정에서도 확인할 수 있다. 다시 그림 2를 참조하면, 비만 및/또는 호염기구 세포에서 FcεRI 신호전달 순차반응의 경우, Syk 키나제는 LAT 및 PLC-감마 1을 인산화시키며 이는 다시 탈과립 등을 유도한다. 이러한 활동들은 모두 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물의 활동을 확인하는 데 사용할 수 있다. 한 실시예에서는, Syk 키나제 기질(예: 신호전달 순차반응에서 Syk에 의해 인산화되는 것으로 알려진 합성 펩티드나 단백질)의 존재 하에서 분리된 Syk 키나제나 그 활성 단편을 2,4-피리미딘디아민 화합물로써 접촉시킨 다음, Syk 키나제가 기질을 인산화시키는지 평가함으로써 활동도를 확인했다. 또는, 이러한 검정은 Syk 키나제를 발현하는 세포를 사용하여 실행할 수 있다. 이 세포는 Syk 키나제를 내생으로 발현할 수 있거나, 재조합 Syk 키나제를 발현하도록 조작할 수 있다. 선택적으로 이 세포는 Syk 키나제 기질을 발현할 수도 있다. 이러한 확인 검정의 수행에 적절한 세포와 적절한 세포의 조작 방법은 당업자에게는 분명할 것이다. 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 활동도의 확인에 적합한 생화학 및 세포 검정들의 구체적인 예는 실시예 부분에 나와 있다.
일반적으로, Syk 키나제 억제제인 화합물은 시험관이나 세포 검정에서, 합성 또는 내인성 기질을 인산화하는 Syk 키나제의 능력과 같은 Syk 키나제의 활동도에 대해 20 μM 이하 범위의 IC50를 나타낼 것이다. 당업자라면 10 μM, 1μM, 100 nM, 10 nM, 1 nM 또는 더 낮은 IC50를 나타내는 화합물들이 특히 유용함을 인정할 것이다.
6.5 용도 및 조성
이미 설명한 바와 같이, 본 발명의 활성 화합물들은 Fc 수용체 신호전달 순차반응, 특히 탈과립이나 다른 프로세스를 통하여 세포로부터 화학 전달물질의 방출 및/또는 합성 등을 유도하는 FcεRI 및/또는 FcγRI 신호전달 순차반응과 같은 감마 동종이중체를 포함하는Fc 수용체를 억제한다. 또한 이미 설명한 바와 같이, 이 활성 화합물들은Syk 키나제의 강력한 억제제이기도 하다. 이러한 활동의 결과로써, 본 발명의 활성 화합물들은 시험관내, 생체내 및 시험관의 다양한 환경에서 Syk 키나제, Syk 키나제가 역할을 하는 신호전달 순차반응, Fc 수용체 신호전달 순차반응 및 이러한 신호전달 순차반응의 영향을 받는 생물적 반응을 조절하거나 억제하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시예에서는, 이 화합물들을 시험관 또는 생체내에서 Syk 키나제를 발현하는 거의 모든 세포 유형에 있어서 Syk 키나제의 억제에 사용할 수 있다. 이들은 Syk 키나제가 역할을 하는 신호전달체계의 조절에도 사용될 수 있다. 이러한 Syk-의존 신호전달체계에는 FcεRI, FcγRI, FcγRIII, BCR 및 인테그린 신호전달체계가 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 이 화합물은 그러한 Syk-의존 신호전달체계에 의해 영향을 받는 세포나 생물적 반응을 시험관 또는 생체내에서 조절 특히 억제하는 데에도 사용할 수 있다. 이러한 세포나 생물적 반응에는 호흡성 방출, 세포 유착, 세포 탈과립, 세포 확산, 세포 이동, 세포 응집, 세포 식작용, 사이토카민 합성과 방출, 세포 성숙 및Ca2+ 유출이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다. 중요한 것은 전체적으로 혹은 부분적으로 Syk 키나제 활동에 의해 매개되는 질병의 치료나 예방을 목적으로 하는 치료의 접근 방식으로써, 이러한 화합물들을 생체 내에서 Syk 키나제의 억제에 사용할 수 있다는 것이다. 이러한 화합물로 치료 또는 예방할 수 있는 Syk 키나제가 매개하는 질병의 예 몇 가지를 다음에서 보다 상세하게 설명한다.
또 다른 실시예에서는, 그러한 Fc 수용체 신호전달 순차반응의 화학 전달물질의 방출이나 합성 또는 탈과립에 의한 특징의, 원인의, 및/또는 연관된 질병들의 치료나 예방을 목적으로 하는 치료 접근 방식으로써, Fc 수용체 신호전달 순차반응 및/또는 FcεRI- 및/또는 FcγRI-매개 탈과립을 조절하거나 억제하는 데 이 화합물들을 사용할 수 있다. 이러한 치료는 수의학적 의미에서의 동물 또는 인간에 대해 시행할 수 있다. 이러한 매개물질의 방출, 합성 또는 탈과립에 의해 특징 지워지거나 기인하거나 혹은 연관이 있고 그러므로 이러한 활성 화합물들로써 치료하거나 예방이 가능한 질병에는 아토피성 혹은 아니필락시성 과민 반응이나 알레르기 반응, 알레르기(예: 알레르기성 결막염, 알레르기성 비염, 아토피성 천식, 아토피성 피부염, 음식물 알레르기), 낮은 정도의 흉터(예: 공피증, 증가된 섬유증, 해족증, 수술후 흉터, 폐 섬유증, 맥관 경련, 편두통, 재칸류 상해, 후 심근경색), 조직 파괴와 연관이 있는 질병(예: COPD, 심장기관지염, 후심근경색), 조직 염증과 연관이 있는 질병(예: 자극성 장 증후군, 경성 결장, 염증성 장 질환), 염증 및 상흔이 포함되지만 이로써 제한되지는 않는다.
세포 및 동물 실험적 데이터에 의하면 여기서 설명하는, 2.4-피리미딘디아민 화합물은 상기 언급한 수많은 질환 이외에도 자가면역질환과 이와 관련된 여러 가지 증상의 치료와 예방에 유용하다. 2,4-피리미딘디아민 화합물로 치료와 예방이 가능한 자가면역질환 유형에는 내인성 및(또는) 외인성 병인의 면역원이나 항원의 체액성 및(또는) 세포 매개성 면역반응의 결과로 발생하는 조직 손상을 수반하는 질병이 일반적으로 포함된다. 이러한 질병은 비아나필락시형 과민반응(예: 제2형, 제3형 및(또는) 제4형)을 수반하는 질환으로도 알려져 있다.
앞에 설명한 바와 같이, 제1형 과민반응 은 비만 세포 및(또는) 호염기구 세포가 특이 외인성 항원과 반응하여 방출되는 히스타민과 같은 약리학적 활성 물질에 의해 유발된다. 상기 언급한 데로, 이와 같은 제1형 반응은 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 등을 포함한 수많은 질병에 영향을 미친다.
제2형 과민반응(세포독성, 보체의존성 세포용해 또는 세포자극 과민반응이라고도 함)은 면역글로불린이 세포 또는 조직의 항원 성분과 반응하거나, 세포 또는 조직에 밀접하게 짝지어진 항원 또는 합텐(hapten)과의 반응 결과 발생한다. 일반적으로 제2형 과민반응과 관련된 질환에는 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 태아적아구증(erythroblastosis fetalis) 및 굳패스처(Goodpasture) 질환이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
제3형 과민반응(독성 착체, 수용성 착체 또는 면역 착체 과민반응이라고도 함)은 수용성 순환 항원-면역글로불린 착체가 혈관이나 조직에 침착하여 면역 착체가 침착한 위치에 급성 염증성 반응이 나타나는 질환이다. 원형적 제3형 반응 질환에는 아르튀스(Arthus) 반응, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 사구체신염의 특이 유형, 다발성 경화증 및 유전포창이 포함되며 이에 제한되지 않는다.
제4형 과민반응(세포형, 세포 매개형, 지연형 또는 투베르쿨린형 과민반응이라고도 함)은 특이 항원과 반응한 감작된 T 림프구에 의해 유발된다. 제4형 반응 질환에는 접촉 피부염 및 동종이식 거부반응이 포함되며 이에 제한되지 않는다.
상기 비아나필락시형 과민반응과 관련된 자가면역질환은 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물로 치료 또는 예방할 수 있다. 특히, 이 방법은 단일 장기 또는 단일 세포형 자가면역 질환의 특성을 나타내는 자가면역 질병을 치료하거나 예방하는데 사용할 수 있으며 다음과 같은 질환에 제한되지 않는다. 하시모토 갑상선염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 악성 빈혈과 관련된 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 뇌척수염, 자가면역성 고환염, 굳패스처(Goodpasture) 질환, 자가면역성 혈소판 감소증, 교감성 안결막염, 중증근무력증, 그레이브스(Graves)병, 일차성 담즙성 간경변, 만성공격성간염, 궤양성대장염 및 막성 사구체병증 외에도 전신성 질환이 특징인 자가면역질환을 포함하되 다음에 제한되지 않는다: 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 쇼그렌(Sjogren) 증후군, 라이터(Reiter) 증후군, 다발성 근염/피부근염, 전신성 경화증, 결절성 다발동맥염, 다발성 경화증 및 유전포창.
당업자는 상기 수많은 자가면역질환은 심각한 증상을 동반하고, 근본적인 자가면역질환이 호전되지 않는 경우에도 심각한 증상을 개선함으로써 치료에 크게 효과를 나타내는 것을 알 수 있을 것이다. 근본적인 질환 상태 외의 많은 증상들은 단핵세포의 FcγR 신호전달 순차반응의 활성화에 의해 유발된다. 여기서 설명하는 2,4-피리미딘디아민 화합물은 단핵세포 및 기타 세포의 FcγR 신호전달체계에 대한 강력한 억제제로, 상기 자가면역질환과 관련된 수많은 부작용의 치료 및(또는) 예방에 사용된다.
한 구체적인 예로, 류마티스성 관절염(RA)은 몸 전체 표적 관절의 종창(swelling), 통증, 운동제한 및 압통(tenderness) 증상이 나타난다. RA는 활막에 림프구가 밀집하여 만성적인 염증을 일으키는 질환이다. 일반적으로 한 세포층 두께로 이루어진 활막은 굉장히 세포화되며, 수지상세포(dendritic cells), T-, B- 및 NK 세포, 마이크로파지 및 플라즈마세포의 클러스터를 포함하는 림프 조직과 유사한 역할을 한다. 이 과정이 진행되면 항원-면역 글로불린 착체의 형성을 포함한 면역병리학적 기전의 다혈증과 마찬가지로 결국 관절의 완전성이 파괴되어 관절이 변형되고, 기능이 영구히 상실되고, 관절 또는 관절과 인접한 위치에 골침식이 나타난다. 이 방법들은 심각한 RA 또는 모든 RA 증상이 나타나는 모든 사람을 치료하거나 증상을 호전시키는데 사용할 수 있다. RA 관계에 있어서 이 방법은 근본적인 RA 동시치료(concomitant treatment)의 치료 결과 및(또는) 순환하는 류마티즘 인자의 감소량과 상관없이 RA와 관련된 일반적인 증상이 완화 또는 호전될 때 치료 효과(이하 총체적으로 설명)가 있다고 간주된다.
또 다른 구체적인 예로, 전신성 홍반성루푸스("SLE")는 일반적으로 발열, 관절통증(관절통), 관절염 및 장막염(늑막염 또는 심낭염) 증상과 관련있다. SLE 관계에 있어서 이 방법은 근본적인 SLE 동시치료의 치료 결과와 상관 없이 SLE와 관련된 일반적인 증상이 완화 또는 개선될 때 치료 효과가 있다고 간주된다.
또 다른 구체적인 예로, 다발성 경화증("MS") 증세로는 시력저하로 인한 불안정 보행; 복시(double vision); 운동기능 저하로 인한 보행 및 손 장애; 대변실금 및 요실금, 근육 강직, 지각장애(감각, 통증 및 온도 지각)가 나타난다. MS 관계에 있어서 이 방법은 근본적인 MS 동시치료의 치료 결과와 상관 없이 MS와 관련된 하나 이상의 불구 증상 진행이 완화 또는 개선될 때 치료 효과가 있다고 간주된다.
예방 활성 화합물들을 이러한 질병의 치료나 예방에 사용할 때, 한 가지를 단독으로, 하나 이상의 활성 화합물들의 혼합물을, 또는 이러한 질병 및/또는 이러한 질병과 연관 있는 증상의 치료에 유용한 다른 작동물질과의 혼합물로서 혹은 병용하여 투여할 수 있다. 또한, 활성 화합물들은, 스테로이드, 막 안정제, 5LO 억제제, 류코트리엔 합성 및 수용체 억제제, IgE 동위체 스위칭이나 IgE 합성, IgG 동위체 스위칭 또는 IgG 합성의 억제제, β-작동물질, 트립타제 억제제, 아스피린, COX 억제제, 메토트렉세이트, 항 TNF 약물, 레툭신, PD4 억제제, p38 억제제, PDE4 억제제, 항히스타민 등과 같은 다른 질병이나 질환의 치료에 유용한 작동물질과의 혼합물로써 또는 병용하여 투여할 수도 있다. 이 활성 화합물들은 전구 약물의 형태 그대로 또는 활성 화합물이나 전구 약물로 구성된 제약 성분으로서 투여할 수 있다.
본 발명의 활성 화합물들(혹은 그 전구 약물들)로 구성된 제약 성분은, 기존의 혼합, 용해, 과립화, 현택 분리, 유화, 캡슐화, 포획화 또는 동결 건조 공정의 수단에 의해 생산할 수 있다. 이러한 성분들은 활성 화합물을 약학적으로 사용 가능한 제제로 가공하는 것을 돕는, 하나 이상의 생리적으로 수용되는 운반체나 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용한 기존의 방식으로 배합할 수 있다.
이 활성 화합물이나 전구 약물은 제약 성분 그 자체로써 또는 이미 설명한 바와 같이 수화물, 용매화물, 질소산화물 또는 약학적으로 수용되는 염으로써 배합할 수 있다. 대개 이러한 염은 상응하는 유리 산과 염기 보다는 수용액에서 더 잘 용해되지만, 상응하는 유리 산과 염기 보다 용해도가 낮은 염도 형성될 수 있다.
본 발명의 제약 성분은 거의 모든 형태의 투여에 적합한 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어 국소, 눈, 구강, 볼, 전신, 코, 주입, 경피, 항문, 질 등이 포함되며, 또한 흡입이나 취입에 의한 투여에 적합한 형태를 취할 수 있다.
국소 투여에서는 활성 화합물(들)이나 전구 약물(들) 당업계에 잘 알려진 용역, 젤, 연고, 크림, 현탁액 등으로 배합할 수 있다.
전신 투여 배합에는 피하, 정맥, 근육 내, 초내, 복강 등의 주사에 의한 투여를 위한 것과 경피, 점막, 구강 또는 폐 투여를 위한 것이 포함된다.
유용한 주사용 제제에는 수용성이나 지용성 부형제에 포함된 활성 화합물(들)의 멸균 현탁액, 용액, 또는 유화액이 포함된다. 이러한 조성에는 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 배합 작동물질도 포함될 수 있다. 주사를 위한 배합은 단위 투여량 형태 즉, 앰플이나 다수 투여 용기로서 제공될 수 있으며, 첨가된 보존제를 포함할 수 있다.
또는, 주사용 배합은 분말 형태로서 제공될 수 있으며, 사용하기 전에 적절한 부형제 즉, 멸균된 발열물질이 없는 물, 완충액, 포도당 용액 등에 용해한다. 이 목적을 위해, 활성 화합물(들)은 동결건조와 같은 업계에 알려진 기법으로 건조시킬 수 있으며, 사용 전에 용해시킨다.
점막 투여에서는 침투 대상의 장벽에 적합한 침투제를 배합에 사용한다. 이러한 침투제는 당업계에 알려져 있다
구강 투여에서는 제약 성분이 예를 들어 함당정제, 정제, 캡슐 등의 형태를 취할 수 있으며, 이는 결합제(예: 사전젤라틴화 된 녹말, 폴리비닐피롤리돈, 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제(예: 락토스, 미세결정성 셀룰로스, 인산수소칼슘); 활택제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 실리카); 붕괴제(예: 감자 녹말, 녹말 글로콜산 나트륨); 적심제(예: 황산 라우릴 나트륨)과 같은 제약적으로 수용되는 부형제로써 기존의 수단들에 의해 제조된다. 정제는 예를 들어, 당, 필름, 장용 제피와 같은 업계에 잘 알려진 방식으로, 도포할 수 있다. 구강 투여에 특히 적절한 화합물에는 화합물 R940350, R935372, R935193, R927050 및 R935391이 포함된다.
구강 투여를 위한 액체 제제는 예를 들어, 일릭서, 용액, 시럽, 현탁액 등의 형태를 취할 수 있거나, 또는 건조 제품으로 제조하여 사용 전에 물이나 다른 적절한 부형제에 용해할 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제(예: 소비톨 시럽, 셀룰로스 유도체, 수소화된 식이 섬유); 유화제(예: 레시친, 아카시아): 비수용성 부형제(예: 아몬드유, 오일성 에스테르, 에탄올, 크레모포아(cremophoreTM) 또는 분획된 야채유); 보존제(예: p-히드록시 벤조산 메틸이나 프로필, 소르브산)과 같은 제약적으로 수용되는 첨가제를 사용하여 기존 수단에 의해 제조할 수 있다. 이러한 제제는 필요에 따라 완충염, 보존제, 향미, 색소 및 감미료도 포함할 수 있다.
구강 투여를 위한 제제는 잘 알려진 바와 같이, 활성 화합물의 조절 방출이 되도록 적절히 배합할 수 있다.
경구점막 투여에서는 그 성분이 기존의 방식으로 배합한 정제나 함당정제의 형태를 취할 수 있다.
항문과 질을 통한 투여에서는 활성 화합물을 코코아버터나 다른 글리세리드와 같은 기존의 좌약을 함유하는 연고, 용액(정체 관장용), 또는 좌약으로 배합할 수 있다.
코를 통한 투여나 흡입 또는 취입의 투여에서는, 적절한 추진제 즉, 이염화이불화메탄, 삼염화불화메탄, 이염화사불화에칸, 불화탄소, 이산화탄소, 또는 다른 적절한 가스를 사용하여 압축된 팩이나 분무기로부터 나오는 에어로솔 분무의 형태로서, 활성 화합물이나 전구 약물이 편리하게 전달될 수 있다. 압축 에어로솔의 경우, 투여량 단위는 측정된 양을 배달하는 밸브를 사용함으로써 결정할 수 있다. 흡입기나 취입기에서 사용하는 캡슐과 카트리지(예: 젤라틴으로 구성된 캡슐이나 카트리지)는, 화합물과 락토스나 녹말 등의 적절한 분말 기부로 이루어진 분말 믹스를 포함시켜 배합할 수 있다.
구입할 수 있는 코 스프레이 장치를 사용하는, 코 투여에 적절한 수용성 현탁 배합의 구체적인 예는 다음의 성분을 포함한다: 활성 화합물이나 전구 약물(0.5-20 mg/ml); 염화 벤잘코늄(0.1-0.2 mg/mL); 폴리소르브산염 80 (TWEEN?? 80; 0.5-5 mg/ml); 카르복시메틸셀룰로스 나트륨 또는 미세 결정성 셀룰로스(1-15 mg/ml); 페닐에탄올(1-4 mg/ml); 및 포도당(20-50 mg/ml). 최종 현탁액의 pH는 pH5부터 pH7까지의 범위에서 조정할 수 있으며, 일반적인 pH는 약 pH 5.5이다.
흡입에 의한 화합물의 투여 그리고 특히 화합물 R921218의 투여에 적절한 수용성 현탁액의 또 다른 구체적인 예는, 1-20 mg/mL 화합물이나 전구 약물, 0.1-1% (v/v) 폴리소르브산염 80 (TWEEN(r)80), 50 mM 구연산염 및/또는 0.9% 염화나트륨을 포함한다.
눈의 투여에서는 활성화합물(들)이나 전구 약물(들)을 눈에 투여하는 데 적합한 용액, 유화액, 현탁액 등으로 배합할 수 있다. 눈에 화합물을 투여하는 데 적합한 다양한 부형제는 당업계에 알려져 있다. 구체적이며 제한되지 않는 예는 다음에 설명되어 있다: 미국특허번호 6,261,547; 미국특허번호 6,197,934; 미국특허번호 6,056,950; 미국특허번호 5,800,807; 미국특허번호 5,776,445; 미국특허번호 5,698,219; 미국특허번호 5,521,222; 미국특허번호 5,403,841; 미국특허번호 5,077,033; 미국특허번호 4,882,150; 및 미국특허번호 4,738,851.
장기 전달을 위하여, 활성 화합물(들)이나 전구 약물(들)는 이식이나 근육내 주사에 의한 투여용 저장부 제제로서 배합할 수 있다. 활성 성분을 적절한 고분자나 소수성 물질(예: 수용되는 오일에 함유된 에멀전으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 배합하거나 또는 잘 용해되지 않는 염과 같이 잘 용해되지 않는 유도체로서 배합할 수 있다. 또는, 경피 흡수를 위해 활성 화합물을 서서히 방출하는 접착 디스크나 패치로써 제조되는 경피 전달 체계를 사용할 수 있다. 이를 위하여 침투 강화제를 사용함으로써 활성 화합물의 경피 침투를 원활하게 할 수 있다. 적절한 경피 패치는 다음 특허의 실시예에서 설명되어 있다: 미국특허번호5,407,713.; 미국특허번호 5,352,456; 미국특허번호 5,332,213; 미국특허번호 5,336,168; 미국특허번호 5,290,561; 미국특허번호 5,254,346; 미국특허번호 5,164,189; 미국특허번호 5,163,899; 미국특허번호 5,088,977; 미국특허번호 5,087,240; 미국특허번호 5,008,110; 및 미국특허번호 4,921,475.
또는, 다른 제약 전달 체계를 사용할 수 있다. 리포솜과 에멀젼은 활성 화합물이나 전구 약물의 전달을 위해 사용할 수 있는 잘 알려진 전달 기구의 예이다. 디메틸술폭사이드(DMSO)와 같은 특정 유기 용매들도 사용할 수 있지만, 대개는 그에 따른 독성이 따른다.
원하는 경우, 제약 성분은 활성 화합물을 함유하는 단위 투여량 형태를 하나 이상 포함하는 팩이나 분배 장치를 통해 제공할 수 있다. 예를 들어, 팩은 블리스터 포장과 같이 금속이나 플라스틱 포일로써 구성할 수 있다. 팩이나 분배 장치에서는 투여에 대한 지시사항을 함께 제공할 수 있다.
6.6 유효 투여량
본 발명의 활성 화합물 또는 전구 약물이나 이들의 조성은 일반적으로 의도하는 결과의 달성에 효과적인 양으로써 사용되는 데, 예를 들어 치료 중인 질병의 치료나 예방에 효과적인 양이 사용된다. 그러한 화합물은 치료를 위해 투여함으로써 치료의 혜택을 달성하거나 또는 예방을 위해 투여하여 예방 혜택을 달성할 수 있다. 치료 혜택이란 치료 대상의 근원적인 질병의 퇴치나 개선 및/또는 존재하는 질병과 연관있는 하나 이상의 증상의 퇴치나 개선에 의해, 그 환자가 여전히 근원적인 질병에 걸려 있더라도 환자가 기분이나 상태의 호전을 보고하는 것을 의미한다. 예를 들어, 알레르기로 고생하는 어떤 환자에 대한 화합물의 투여는, 존재하는 알레르기성 반응이 퇴치되거나 개선되는 경우는 물론 그 환자가 알레르겐 노출 이후 알레르기와 연관있는 증상들의 정도나 기간의 감소를 보고할 경우에도 치료의 혜택을 제공하는 것이다. 또 다른 예로서, 천식에서의 치료 혜택에는 천식 발작의 시작 후 호흡의 개선 또는 천식 에피소드의 빈도나 정도의 감소가 포함된다. 또한, 치료 효과에는 호전이 실현되는 것과는 관계없이 질병의 진행의 정지나 완화도 포함된다.
예방적 투여에서는 위에서 설명한 질병들의 하나가 발병되는 위험을 감수하고 화합물을 환자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 어떤 환자가 특정 약물에 대한 알레르기가 있는지 모르는 경우, 그 약물에 대한 알레르기성 반응을 피하거나 개선할 목적으로 약물을 투여하기 전에 그 화합물을 투여할 수 있다. 또는, 근원적인 질병이 있는 것으로 진단된 환자에 있어서 그 증상의 개시를 피하기 위해 예방적 투여를 적용할 수 있다. 예를 들어, 알레르기로 고생하는 환자가 알레르겐에 노출되기 전에 화합물을 투여할 수 있다. 또한, 위에서 설명한 질환들의 하나에 대한 작용인자로 알려진 것에 반복적으로 노출된 건강한 자에게 화합물들을 예방적으로 투여함으로써 그 질병의 개시를 예방할 수도 있다. 예들 들어, 어떤 개인이 라텍스와 같은 알레르기를 유발하는 것으로 알려진 알레르겐에 반복적으로 노출된 경우, 그 개인이 알레르기를 발병하지 않도록 하기 위해 화합물을 투여할 수 있다. 또는, 천식으로 고생하는 환자가 천식 발작을 유발하는 활동을 하기 전에, 천식 에피소드의 정도를 경감시키거나 또는 완전히 피할 목적으로 화합물을 그 환자에게 투여할 수 있다.
투여하는 화합물의 양은 다양한 요인에 의해 달라지며, 그러한 요인의 예로는 치료 대상의 특정 적응증, 원하는 혜택이 예방이거나 치료이거나 관계없이 투여의 방식, 치료 대상의 적응증의 정도와 환자의 연령과 체중, 특정 활성 화합물의 생체이용률 등이다. 유효 투여량의 결정은 당업자가 용이하게 할 수 있다.
유효 투여량은 초기에는 시험관 검정으로부터 추정할 수 있다. 예를 들어, 동물에서 사용하는 초기 투여량은 활성 화합물의 순환 혈액이나 혈청 농도가 해당 화합물이 IC50 이상이 되도록 배합할 수 있으며, 그 농도는 실시예 부분에서 설명하는 시험관내 CHMC 또는 BMMC 및 다른 시험관 내 검정과 같은 시험관내 검정에서 측정된다. 특정 화합물의 생체이용률을 고려하여 그러한 순환 혈액이나 혈청 농도를 달성하는 데 필요한 투여량을 계산하는 것은, 당업자가 용이하게 할 수 있다. 참고로 다음을 독자에게 권한다: . Fingl & Woodbury, "General Principles(일반 원리)," In: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 제1장, pp. 1-46, 최신판, Pagamonon Press, 그리고 인용된 참조 문헌들.
초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체내 데이터로부터도 추정할 수 있다. 위에서 설명한 다양한 질병들을 치료나 예방하는 화합물의 효능을 시험하는 데 유용한 동물 모델은 당업계에 잘 알려져 있다. 과민성 반응이나 알레르기성 반응의 특정한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Foster, 1995, Allergy 50(21Suppl):6-9, 고찰 34-38 그리고 Tumas 등, 2001, J. Allergy Clin. Immunol. 107(6):1025-1033. 알레르기성 비염에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Szelenyi 등, 2000, Arzneimittelforschung 50(11):1037-42; Kawaguchi 등, 1994, Clin. Exp. Allergy 24(3):238-244 그리고 Sugimoto 등, 2000, Immunopharmacology 48(1):1-7. 알레르기성 결막염에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Carreras 등, 1993, Br. J. Ophthalmol. 77(8):509-514; Saiga 등, 1992, Ophthalmic Res. 24(1):45-50; 그리고 Kunert 등, 2001, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 42(11):2483-2489. 전신 비반세포증에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: O'Keefe 등, 1987, J. Vet. Intern. Med. 1(2):75-80 그리고 Bean-Knudsen 등, 1989, Vet. Pathol. 26(1):90-92. 과잉 IgE 증후군에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Claman 등, 1990, Clin. Immunol. Immunopathol. 56(1):46-53. B-세포 림프 종양에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Hough 등, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13853-13858 그리고 Hakim 등, 1996, J. Immunol. 157(12):5503-5511. 아토피성 피부염, 아토피성 습진 및 아토피성 천식과 같은 아토피성 질병에 대한 적절한 동물 모델은 다음에 설명되어 있다: Chan 등, 2001, J. Invest. Dermatol. 117(4):977-983 그리고 Suto 등, 1999, Int. Arch. Allergy Immunol. 120(Suppl 1):70-75. 당업자라면 이러한 정보를 일상적으로 적응시켜 인체 투여에 적합한 투여량을 결정할 수 있다. 그 밖의 적절한 동물 모델은 실시예 부분에 설명되어 있다.
투여량은 대개 0.0001 또는 0.001 또는 0.01 mg/kg/day로부터 약 100 mg/kg/day까지의 범위에 있지만, 그 화합물의 활동도, 생체이용률, 투여 방식 및 위에서 설명한 요인들에 따라 더 높을 수도, 혹은 낮을 수도 있다. 치료나 예방 효과의 유지에 충분한 화합물의 혈청 농도를 제공하기 위해, 투여량과 기간을 개별적으로 조정할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 1주일에 한 번, 1주일에 서너 번(예: 하루 건너), 하루에 한 번 또는 하루에 여러 번 투여할 수 있으며, 이는 투여의 방식, 치료 중인 특정 적응증, 처방의의 판단 등 다양한 요인에 의존한다. 국부 국소적 투여와 같이 국부 투여나 선택적 섭취의 경우에는, 활성 화합물(들)의 유효 국부 농도는 혈청 농도와 관련이 없을 수 있다. 당업자라면 많이 시험하지 않더라도 유효 국부 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
화합물이 심한 독성을 일으키지 않고 치료나 예방 효과를 제공하는 것이 바람직하다. 화합물의 독성은 일반 약학 절차를 사용하여 확인할 수 있다. 독성과 치료(또는 예방) 효과 사이의 투여량 비율이 치료 지수이다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
이제 본 발명에 대한 설명을 마쳤으므로, 다음 실시예들을 제한의 목적이 아니라 예시로서 제공한다.
7. 실시예
7.1 방식 (I)-(V)에 따른 2,4-피리미딘디아민 화합물의 합성에 유용한 개시 물질과 중간체의 합성
방식 (I)-(V)에 의한 본 발명의 2,4-피리미딘디아민 화합물의 합성에 유용한, 다양한 개시 물질과 N4-일치환-2-피리미딘아민 및N2-단일치환-4-피리미딘디아민 [일치환 친핵성 방향족 반응(SNAR) 생성물]은 다음 설명과 같이 만들어졌다. 모노 SNAR 생성물들의 합성에 적합한 조건은 2-클로로-N4-(3,4-에틸렌디옥시페닐)-5-플루오로-4-피리미딘아민 (R926087)으로 예시한다.
7.5 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 FcεRI 수용체-매개 탈과립 억제 작용
본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 IgE-유도성 탈과립 억제 효능을, 배양된 인간 비만 세포(CHMC) 및/또는 쥐의 골수 유도 세포(BMMC)를 이용한 다양한 세포 분석을 통해 증명하였다. 탈과립 억제 작용을 과립 특이 요소 트립타제, 히스타민 및 헥소사미니다제의 방출을 정량화하여 저밀도 및 고농도 세포를 대상으로 측정하였다. 지질 매개물질 방출 및/또는 합성의 억제 작용은 류코트리엔 LTC4 방출을 측정하여 분석하였으며, 사이토카인의 방출 및/또는 합성의 억제 작용은 TNF-α, IL-6 및 IL-13를 정량화하여 관찰하였다. 트립타제 및 헥소사미니다제는 해당 예에서 설명한 바와 같이 형광 기질을 사용하여 정량화하였다. 히스타민, TNF(, IL-6, IL-13 및 LTC4는 다음과 같은 상용 ELISA 키트를 사용하여 정량화하였다. 히스타민(Immunotech #2015, Beckman Coulter), TNF((Biosource #KHC3011), IL-6(Biosource #KMC0061), IL-13(Biosource #KHC0132) 및 LTC4(Cayman Chemical #520211). 다음은 여러 검정에 대한 프로토콜이다.
7.5.1 인간 비만 세포 및 호염구 세포의 배양
인간 비만 세포 및 호염구 세포를 아래 명시한 CD34-음성 전구세포에서 배양하였다(U.S. 동시 계속 출원번호 10/053,355에 명시된 방법을 참조. 청구일: 2001년 11월 08일, 참조 자료로 편입된 내용임)
7.5.1.1 STEMPRO-34 완전 배지 제조
STEMPRO-34 완전 배지(이하 "CM")를 제조하기 위해 250mL의 STEMPRO-34TM 무혈청 배지("SFM"; GibcoBRL, 카탈로그 번호 10640)를 필터 플라스크에 첨가하였다. 여기에 13mL의 STEMPRO-34 Nutrient Supplement ("NS"; GibcoBRL, 카탈로그 번호 10641)를 추가하였다(아래 상세한 지시사항에 따라 제조하시오). NS 용기를 약10mL의 SFM으로 세정하고 이것을 필터 플라스크에 넣었다. 5 mL L-글루타민(200mM; Mediatech, 카탈로그 번호 MT 25-005-CI) 및 5mL 100X 페니실린/스트렙토마이신("pen-strep"; HyClone, 카탈로그 번호 SV30010) 첨가한 후, SFM으로 부피를 500mL로 만든 다음 이 용액을 여과하였다.
CM 제조의 가장 큰 변수는 SFM을 첨가하기 전에 NS를 녹여 혼합하는 과정에 있다. NS가 완전히 용액 상태가 될 때까지 37° C 수욕에서 녹이면서 천천히 교반하고 소용돌이를 발생시키거나 흔들지 않도록 한다. 천천히 저을 때 지질이 아직 용액 상태가 아니라는 점에 유의해야 한다. 지질이 존재하고 NS의 형태가 균일하지 않은 경우, 다시 수욕 하에서 천천히 저어주는 과정을 NS 형태가 균일해 질 때 까지 반복한다. 이 성분은 즉시 용액 상태로 될 때도 있지만 몇 번 저어 주어야 될 때도 있고 전혀 효과가 없는 경우도 있다. 2시간이 경과한 후에도 NS가 용액 상태가 아닌 경우, 버린 다음 새로 준비하여 녹여야 한다. 녹인 후의 NS 형태가 균일하지 않으면 사용하지 않는다
7.5.1.2 CD34+ 세포의 팽창
비교적 적은 수(1-5 x l06 세포)의 CD34-양성 (CD34+) 세포의 초기 수는 배양 매개물질과 아래 명시한 방법을 이용하여 비교적 큰 수의 CD34-음성 전구 세포(약2-4 x l09 세포)로 팽창하였다. CD34+ 세포(단일 공여자)는 Allcells (Berkeley, CA)에서 얻었다. Allcells에서 일반적으로 제공하는 CD34+ 세포의 품질과 수 차이가 다소 차이가 있기 때문에 새로 받은 세포를 사용하기 전에 15mL의 원뿔 시험관에 넣고 CM으로 10mL로 만든다.
0번째 날(시작한 날)에, 생존 가능한(phase-bright) 세포의 수를 측정하고 세포를 1200rpm으로 회전시켜 작은 입자로 만든다. 세포를 200 ng/mL의 인간 재조합 줄기세포 인자("SCF"; Peprotech, 카탈로그 번호 300-07) 및 20ng/mL의 human flt-3 ligand (Peprotech, 카탈로그 번호 300-19) ("CM/SCF/flt-3 배지")를 포함하는 CM을 이용하여 275,000 cells/mL의 밀도로 현탁하였다. 4번째 또는 5번째 날에는 세포수를 측정하여 배양물질의 밀도를 확인하였고 새 CM/SCF/flt-3 배지를 이용하여 배양물질의 밀도가 275,000 cells/mL 되도록 희석하였다. 7번째 날에는 배양물질을 멸균 시험관에 넣어 세포수를 측정하였다. 세포를 1200 rpm으로 회전시키고 새 CM/SCF/flt-3 배지를 이용하여 밀도가 275,000 cells/mL되도록 현탁시켰다
이 주기를 팽창 시기에 0번째 날부터 시작하여, 총 3-5회 반복하였다.
배양물질이 커서 여러 플라스크에 보관되어 있고 현탁시켜야 하는 경우, 세포수를 측정하기 전에 모든 플래스크의 내용물을 한 용기에 넣어야 한다. 이 방법은 세포수를 정확하게 측정할 수 있도록 하고 총 세포 군집에 대한 처리 균일성를 제공한다. 전체 세포 군집의 오염을 막기 위해 플라스크의 내용물을 합하기 전에 현미경을 이용하여 각 플라스크의 오염 여부를 확인한다.
17-24번째 날에는 배양이 감소(즉, 대략 전체 세포수의 10%가 죽는다)할 수 있으며 이전 처럼 급격하게 팽창하지 않는다. 이 시기에는 세포를 하루에 한번 관찰하고 최소 24시간 내에 배양이 완전히 중단될 수 있다. 일단 배양 감소가 시작되면 세포수를 측정하고 850 rpm에서 15분간 회전한 후 CM/SCF/flt-3 배지에서 현탁시켜 350,000 세포/mL의 밀도로 만들어 하나 또는 2개의 층을 유도할 수 있다. 배양이 중단되지 않도록 세포를 매일 한번씩 관찰하였다.
전구 세포 배양의 세포가 15% 이상 죽은 것이 확실하고 배양기에 세포 조각이 일부 남아 있는 경우, CD34-음성 전구 세포를 분화시켜야 한다.
7.5.1.3 CD34-음성 전구 세포를 점박 비만 세포로 분화
CD34-음성 전구 세포를 분화된 점막 비만 세포로 전환하는 두 번째 단계를 실행하였다. 점막 배양 인간 비만 세포("CHMC")를 탯줄 혈액에서 적출한 CD34+ 세포에서 얻었으며 위에 명시한 것과 같이 CD34-음성 전구 세포의 증식한 군집을 형성하기 위해 처리하였다. CD43-음성 전구 세포를 생성하기 위해 배양 현탁 주기를 상기 설명한 바와 동일하게 하였고, 단 425,000 세포/mL의 밀도로 배양하고 15%의 추가 배지를 4번째 또는 5번째 날 세포수를 측정하지 않은 상태에서 첨가하였다. 배지의 사이토카인 조성물을 조정하여 SCF (200 ng/mL) 및 인간 재조합 IL-6 (200ng/mL; Peprotech, 카탈로그 번호 200-06 멸균10 mM아세트산에 100 ug/mL으로 재구성)이 포함되었다.
I 및 II 단계가 걸리는 기간은 대략 5주이다. 세포 배양 중 죽은 세포 및 입자는 1-3주에 나타나며, 2-5주에는 아주 적은 비율의 배양 세포가 현탁되지 않고, 대신 배양기 표면에 부착되어 있다.
배양 세포를 각 주기의 7번째 날에 현탁시켜야 하는 I 단계에서는, 모든 플라스크의 내용물을 전체 세포 군집의 균일성을 위하여, 세포수를 측정하기 전에 용기 하나에 합쳐 놓았다. 전체 세포 군집의 오염을 막기 위해 플라스크의 내용물을 합하기 전에 현미경을 이용하여 각 플라스크의 오염 여부를 확인한다.
플라스크 내용물을 합하면 총 용량의 75% 정도가 공동 용기에 옮겨지고 10mL 정도가 플라스크에 남는다. 부착되어 있는 세포를 떼어내기 위해 용량이 남아 있는 플라스크 부위를 날카롭게 측면으로 두드렸다. 세포를 완전히 떼어내기 위해 처음 두들긴 지점에서 반복하여 90도로 두드렸다.
남은 용량을 계수기(counting vessel)에 넣기 전에 플라스크를 2분간 45도로 기울였다. 플라스크 당 35-50mL에 접종(425,000세포/mL)하기 전에 세포를 950rpm에서 15분간 회전시켰다.
7.5.1.4 CD34-음성 전구 세포를 결합 조직 유형 비만 세포로 분화
CD34-음성 전구 세포의 증식한 군집을 상기 방법에 따라 준비하고 트립타제/치마제 양성(결합 조직) 표현형을 형성하기 위해 처리하였다. 점막 비만 세포에 대해 상기 명시된 방법대로 실시하되 배양 배지에서 IL-6 를 IL-4로 치환하였다. 얻어진 세포는 일반적인 결합 조직 비만 세포이다.
7.5.1.5 CD34-음성 전구 세포를 호염구 세포로 분화
CD34-음성 전구 세포의 증식한 군집을 상기 섹션 7.5.1.3에 명시되어 있는 방법에 따라 준비하였고 이는 호염구 세포의 증식된 군집을 형성하는데 사용되었다. CD34-음성 세포를 점막 비만 세포와 동일하게 처리하되 배양 배지에서 IL-6을IL-3(20-50 ng/mL)으로 치환하였다.
7.5.2 CHMC 저밀도 세포 IgE 활성: 트립타제 및 LTC4 검정
96-well U-bottom plates(Costar 3799)를 복제하려면 희석된 화합물을 65 ul 첨가하거나, 2% MeOH 및 1% DMSO를 포함하는 MT [137mM NaCl, 2.7mM KCl, 1.8mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, 5.6mM 포도당, 20mM 헤퍼스(pH 7.4), 0.1% 소혈청 알부민, (Sigma A4503)]에서 제조한 시료를 조절한다. CHMC 세포를 작은 입자로 만들고(980rpm, 10분) 예열한 MT에서 현탁시킨다. 각 96-well 플레이트에 65ul의 세포를 첨가한다. 각 특정 CHMC 공여자에 대한 탈과립 작용에 따라 1000-1500 세포/well을 채운다. 4번 혼합한 후 37oC에서 1시간 배양한다. 배양 1시간 동안 6X항 IgE 용액[토끼 안티-인간 IgE (1mg/ml, Bethyl Laboratories A80-109A) MT 완충용액에서 1:167로 희석]을 제조한다. 6X 항 IgE 용액 25ul 해당 플레이트에 추가하여 세포를 자극시킨다. MT 25ul을 비자극 컨트롤 웰(well)에 추가한다. 항 IgE를 추가한 후 2번 혼합한다. 37oC에서 30분간 배양한다. 배양 30분 동안 트립타제 분석 완충용액[0.1 M Hepes (pH 7.5), 10 % w/v Glycerol, 10uM 헤파린(Sigma H-4898) 0.01% NaN3]에서 20 mM 트립타제 기질 저장 용액[(Z-Ala-Lys-Arg-AMC.2TFA; Enzyme Systems Products, #AMC-246)]을 1:2000로 희석한다. 플레이트를 1000rpm에서 10분간 회전시켜 작은 세포 입자로 만든다. 상층액의 25ul을 96-well 검정 바닥 플레이트에 옮긴 후 새로 희석한 트립타제 기질 용액 100ul을 각 well에 넣는다. 플레이트를 실온에서 30분간 배양한다. 분광광도 플레이트 판독기로 355nm/460nm에서 플레이트의 광학 밀도를 측정한다.
제공업체의 지시에 따라 적합하게 희석된 상층액 시료(각 공여자 세포 군집에 대해 실험을 통해 결정하여 시료 측정이 표준 곡선 범위 안에 포함됨)의 류코트리엔리엔 C4 (LTC4) 또한 ELISA 키트를 이용하여 정량하였다.
7.5.3 CHMC 고농도 세포 IgE 활성화: 탈과립(트립타제, 히스타민), 류코트리엔리엔(LTC4) 및 사이토카인(TNFalpah, IL-13) 검정
배양된 인간 비만 세포(CHMC)를 CM 배지에서 IL-4 (20 ng/ml), SCF (200ng/ml), IL-6(200ng/ml) 및 인간 IgE(CP 1035K from Cortx Biochem, 100-500ng/ml 생성에 따라)로써 5일간 감작(sensitized)시켰다. 감작시킨 후, 세포수를 측정, 펠렛화(1000rpm, 5-10분)하고 MT 완충용액에서 1-2 x106 세포/ml로 현탁시켰다. 세포 현탁액 100ul과 화합물 희석액 100ul를 각 well에 첨가하였다. 최종 부형제 농도는 0.5% DMSO이다. 37(C(5% CO2)에서 1시간 동안 배양한다. 화합물 처리 1시간 후, 6X 항 IgE로 세포를 자극한다. 세포를 잘 혼합하고 플레이트를 37℃(5% CO2)에서 1시간 동안 배양한다. 1시간 배양 후, 세포를 펠렛화(10분, 1000RPM)하고 상층액에서 well 당 200ul을 수집하되 펠렛을 손상시키지 않도록 주의한다. 상층액 플레이트를 얼음에 올려 놓는다. 7시간의 절차(다음 참조) 동안 1:500으로 희석된 상층액에서 트립타제 검정을 실행한다. 세포 펠렛을 0.5% DMSO를 포함하는 CM 배지 240ul 및 화합물의 해당 농도에서 현탁시킨다. CHMC 세포를 37℃ (5% CO2)에서 7시간 동안 배양한다. 배양 후, 세포를 펠렛화(1000RPM, 10분)하고 well 당 225ul을 수집하여 ELISAS를 수행하기 전까지 -80℃에서 보관한다. ELISAS를 제공업체의 지시에 따라 적합하게 희석된 시료(각 공여자 세포 군집에 대한 실험을 통해 확인하였으므로 시료 측정이 표준 곡선 범위 안에 포함됨)에서 수행한다.
7.5.4 BMMC 고세포밀도 IgE 활성화: 탈과립(헥소시미니다아제, 히스타민), 류코트리엔(LTC4) 및 사이토카인(TNFalpah, IL-6) 검정
7.5.4.1 WEHI-처리 배지 제조
WEHI-처리 배지는 마우스 골수단핵(murine myelomonocytic) WEHI-3B 세포(American Type Culture Collection, Rockville, MD)를Iscove의 Modified Eagles Media(Mediatech, Hernandon, VA)에서 성장시켜 얻었으며, 10%의 열비동화 우태혈청(FBS; JRH Biosciences, Kansas City, MO), 50 (M 2-메르캅토에탄올 (Sigma, St. Louis, MO) 및100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech)을 가습된37°C, 5% CO2/95% 공기 배양기에 보충하였다. 초기 세포 현탁은200,000 세포/mL로 하였으며 2주 기간 동안 매 3-4일 마다 1:4로 나누었다. 무세포 상층액을 생성, 분취, 그리고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다.
7.5.4.2 BMMC 배지 제조
BMMC 배지는RPMI 1640 배지(Mediatech) 안에 WEHI-처리 배지 20%, 열비동화 FBS (JHR Biosciences) 20%, 25mM HEPES, pH7.4 (Sigma), 2mM L-글루타민(Mediatech), 0.1 mM비필수 아미노산(Mediatech), 1mM 피루빈산 나트륨 (Mediatech), 50 μM 2-메르캅토에탄올(Sigma) 및 100 IU/mL 페니실린-스트렙토마이신(Mediatech)이 포함되어 있다. BMMC 배지를 제조하려면 모든 구성 요소를 사용하기 전에 멸균 IL 필터 장치에 추가하고 0.2 μM 필터를 통과해야만 한다.
7.5.4.3 프로토콜
비만 세포에서 유도한 골수(BMMC)는,666 x103 세포/ml의 세포 밀도를 가진 BMMC 배지의 마우스 SCF(20ng/ml) 및 단일클론 안티-DNP(10 ng/ml, clone SPE-7, Sigma # D-8406)을 사용하여 하룻밤동안 감작시킨다. 감작시킨 후, 세포수를 측정, 펠렛화(1000rpm, 5-10분)하고 MT 완충용액에서 1-3 x106 세포/ml로 현탁시켰다. 세포 현탁액 100ul과 화합물 희석액 100ul를 각 well에 첨가하였다. 최종 부형제 농도는 0.5% DMSO이다. 37℃(5% CO2)에서 1시간 동안 배양한다. 1 시간 동안 화합물을 처리한 후, 6배 자극(60ng/ml DNP-BSA)으로 세포를 자극시킨다． 세포를 잘 혼합하고 플레이트를 37(C(5% CO2)에서 1시간 동안 배양한다. 1시간 배양 후 세포를 펠렛화(10분, 1000RPM)하고， 200ul/well의 상층액을 수집하고, 도중에 펠렛이 흔들리지 않도록 조심하여 깨끗한 시험관이나 96-웰 플레이트로 옮긴다. 상층액 플레이트를 얼음에 올려 놓는다. 4-5 시간 단계(다음 참조)에서는 헥소시미니다아제 검정을 수행한다. 세포 펠렛을0.5% DMSO 및 대응하는 농도의 화합물이 포함된 240 ul WEI-처리 배제에 현탁한다. BMMC세포를 4-5시간 동안37℃ (5% CO2)에서 배양한다. 배양 후, 세포를 펠렛화(1000RPM, 10분)하고 well 당 225ul을 수집하여 ELISAS를 수행하기 전까지 -80℃에서 보관한다. ELISAS를 제공업체의 지시에 따라 적합하게 희석된 시료(각 공여자 세포 군집에 대해 실험을 통해 결정하여 시료 측정이 표준 곡선 범위 안에 포함됨)에서 수행한다.
헥소시미니다아제 검정: 단색 흑색의 96-웰 시험 플레이트에, 50 uL 헥소시미니다아제 기질(4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-β-D-글루사미니드; 2mM)을 각 웰에 추가한다. 50 uL의 BMMC 세포 상층액(위 참조)을 헥소시미니다아제 기질에 추가하고, 30분 동안37℃에 보관한 다음 분광광도계로 5, 10, 15 및 30분에 플레이트를 판독한다.
7.5.5 호염구IgE 또는 진드기 활성화: 히스타민 방출 검정
호염구 활성화 검정은 진드기에 알레르기 증상이 있는 기증인의 말초 혈액을 사용하여 시행되었다. 대부분의 적혈구는 덱스트란 혈침을 사용하여 제거하였다. 인간 말초 혈액을 3% 덱스트란 T500 및 RBC를 1:1로 혼합하여 20-25분 동안 침강시켰다. 윗 분획은 3배 부피의 D-PBS로 희석하였고 세포는 10분 동안 상온에서 1500rpm으로 회전시켰다. 상층액은 흡입하고 세포는 당량의 MT-완충용액을 사용하여 세척하였다. 최종적으로 세포는 원래 혈액량에 들어있던0.5% DMSO가 포함된 MT-완충용액에 현탁하였다. 0.5% DMSO의 존재 하에서 80 uL세포를, 3개의 V-형 96-웰 조직 배양 플레이트에서 20 uL 화합물과 혼합하였다. 8가지 화합물 농도의 투약 범위를 시험한 결과 최대치(자극) 및 최소치(비자극) 반응을 나타내는 10-포인트 투약 반응 곡선을 만들었다.. 20 uL 의 6배 자극물질[1 ug/mL 항 IgE (Bethyl Laboratories) 667 au/mL 집 진드기 (Antigen Laboratories)]를 첨가하기 전에, 세포를 1시간 동안37°C, 5% CO2 환경에서 화합물로 배양하였다. 얻어진 세포를 37°C, 5% CO2 환경에서 30분 동안 자극하였다. 플레이트는 10분 동안 상온에서 1500rpm으로 회전시켰으며, Immunotech가 공급한 히스타민 ELISA 키트를 사용하여, 히스타민 내용물 분석을 위한 상층액 80 uL을 생성하였다. ELISA는 제공 업체의 지침에 따라 시행하였다.
7.5.6 결과
저밀도 CHMC 시험 결과(섹션 7.5.2), 고농도 BMMC 시험 결과(섹션 7.5.4) 및 호염구 시험 결과(섹션 7.5.5)는 표 1에 표시되어 있다. 고밀도 CHMC 시험 결과(섹션 7.5.3)는 표 2에 표시되어 있다. 표 1 및 표 2에서 모든 값은IC50s((M)로 보고된다. ＂9999＂ 값은 IC50> 10μM 즉,10μM 농도에서 측정할 수 없는 활성을 의미한다. 시험한 대부분 화합물의IC50은10μM 미만이었으며 상당 수의IC50은 미크로몰 하위 수준의 결과를 보였다.
7.6 2,4-피리미딘디아민 화합물의 FcγRI 수용체-매개 탈과립 억제 작용
본 발명의 FcγRI-매개 탈과립을 억제하는 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 능력은, 섹션 7.5에 설명한것과 비슷한 검정에서 R921218, R921302, R921303, R940347, R920410, R927050, R940350, R935372, R920323, R926971 및 R940352 화합물들을 통해 보여주었으며, 단 예외 사항은 세포를 IgE로 프라임 하지 않았으며, 토끼의 항사람 IgG Fab 단편(Bethyl Laboratories, 카탈로그 번호 A80-105)을 사용하여 활성화하였다.
시험한 모든 화합물들의IC50은 미크로몰 하위 수준의 결과를 보였다.
표2
고밀도 독성 Jurkat광산란 독성 Jurkat세포적정 glo 독성 BJAB 광산란 독성 BJAB 세포적정 glo
CHMC 고밀도 핵소스 CHMC 고밀도 트립타제 CHMC 고밀도 히스타민 CHMC 고밀도 LTC4 CHMC 고밀도 TNF-알파 CHMC 고밀도 IL-13
R008951
R008952
R008953
R008955
R008956
R008958
R067934
R067963
R070153
R070791
R081166
R088814
R088815
R091880
R092788 9999 9999
R909241 3.736
R921219 0.124 0.121 0.162 0.034 0.190 0.175 >10 >10
표2
고밀도 독성 Jurkat광산란 독성 Jurkat세포적정 glo 독성 BJAB 광산란 독성 BJAB 세포적정 glo
CHMC 고밀도 핵소스 CHMC 고밀도 트립타제 CHMC 고밀도 히스타민 CHMC 고밀도 LTC4 CHMC 고밀도 TNF-알파 CHMC 고밀도 IL-13
R925775 9999 9999
R925778 9999 9999
R925779 >10 9999
R925797 >10 9999
R926108 >10 >10
R926109 0.783 0.906 1.827 0.808 1.504 1.664 >10 9999
R926110 >10 >10
R921218 0.464 0.647 0.463 0.695 1.752 2.0776 >10 >10
R926113 1.448 1.649 1.848 0.468 5.678 3.569 >10 >10
R926146 9999 9999
R926210 >10 9999
R926240 10 9999
R926248 >10 9999
R926249 >10 9999
R926253 9999 9999
R926256 >10 9999
R926258 9999 9999
표2
고밀도 독성 Jurkat광산란 독성 Jurkat세포적정 glo 독성 BJAB 광산란 독성 BJAB 세포적정 glo
CHMC 고밀도 핵소스 CHMC 고밀도 트립타제 CHMC 고밀도 히스타민 CHMC 고밀도 LTC4 CHMC 고밀도 TNF-알파 CHMC 고밀도 IL-13
R926387 >10 9999
R926395 >10 9999
R926396 >10 9999
R926411 8.5 >10
R926486 1.088 1.313 1.928 0.834 0.455
R926488 0.521 0.623 0.792 0.201 2.443 1.012
R926493 0.889 1.093 1.324 0.474 >2 >4.33
R926494 0.640 >2 9999 0.326 9999
R926495 0.100 0.235 0.066 0.241 0.362 0.449 >10 >10
R926496 0.429 0.533 0.809 0.414 0.622
R926497 1.106 1.234 1.333 1.876 9999
R926501 >2 >2 9999 9999 9999 >4.33 >4.33
R926502 >2 >2 >2 1.807 >2 1.513
R926505 4.199
R926508 0.170 0.434 0.105 0.505 0.763 >10 >10
R926510 0.921 1.115 1.667 0.417 0.686 2.77
R926511 1.183 1.474 1.73 1.307 >2 >4.33 >4.33
표2
고밀도 독성 Jurkat광산란 독성 Jurkat세포적정 glo 독성 BJAB 광산란 독성 BJAB 세포적정 glo
CHMC 고밀도 핵소스 CHMC 고밀도 트립타제 CHMC 고밀도 히스타민 CHMC 고밀도 LTC4 CHMC 고밀도 TNF-알파 CHMC 고밀도 IL-13
R926614 >10 >10 >10 6.442
R926696 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 1.773 >5.0
R926699 <1.1 <1.1 1.44 <1.1 <1.1 1.294
R926700 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 2.053
R926703 1.512 1.947 >2 0.724 >2
R926704 >2 9999 9999 9999 9999
R926705 1.007 1.256 0.641 0.494 9999
R926706 >2 9999 9999 1.491 9999
R926742 0.104 0.217 0.080 0.385 0.667 9 >10
R926745 >10 >10
R926780 >5.0
R926782 >4.33 >4.33
R935075 0.647 1.212 0.443 <0.22 >2 >4.33 >4.33
R935154 >4.33
R935156 4.054
R940216 <1.1 <1.1 1.176 <1.1 3.188 3.006
R940233 0.577 0.642 0.586 0.118 2.247 1.781 >4.33 >4.33
표2
고밀도 독성 Jurkat광산란 독성 Jurkat세포적정 glo 독성 BJAB 광산란 독성 BJAB 세포적정 glo
CHMC 고밀도 핵소스 CHMC 고밀도 트립타제 CHMC 고밀도 히스타민 CHMC 고밀도 LTC4 CHMC 고밀도 TNF-알파 CHMC 고밀도 IL-13
R945032 0.357 0.458 0.439 0.0929 1.082 0.291
R945033 8.151 8.868 >10 5.983
R945071 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1 <1.1
R945128 1.279 1.749 0.547 0.729 >2 ND
R945140 0.994 1.112 1.551 1.714 9999
R945142 >2 >2 9999 >2 9999
R945150 >4.33 >4.33
R921302 0.682 0.795 1.588 0.514 1.173 1.672
R950141 0.567 0.618 0.627 0.201 1.059 0.798
R950207 >4.33
7.7 상향 IgE 수용체 카스케이드를 선택적으로 억제하는 본 발명의 2,4-피리미딘 화합물들
본원 발명의 여러 2,4-피리미딘 화합물이 억제 작용을 하여 초기 IgE 수용체 신호전달체계를 차단하거나 억제하는 사실을 확인하기 위해 몇가지 화합물을 대상으로, 아래 명시한 바와 같이 이오노마이신 유도성 탈과립에 대한 세포 검정을 통해 시험하였다.
7.7.1 CHMC 저세포 밀도 이오노마이신 작용: 트립타제 검정
이오노마이신 유도성 비만 세포 탈과립 현상에 대한 분석을 CHMC 저밀도 IgE 작용 검정(섹션 7.5.2, 참조) 설명에 따라 실행하되, 배양 1시간 동안 6X 이오노마이신 용액[MT 버퍼(최종 농도 2 (M )로 희석한 MeOH (모액) 1:416.75에 5mM 이오노마이신(Signma I-0634) 용해]을 준비하고 6X 이오노마이신 25(l를 첨가하여 세포를 자극하였다.
7.7.2 호염기성 이오노마이신 활성화: 히스타민 방출 검정
이오노마이신 유도성 호염기성 세포 탈과립에 대한 검정은 호염기성 IgE 또는 진애진드기 활성화 검정(섹션 7.5.5, 참조), 설명에 따라 실행하되 화합물 배양시 2(M 이오노마이신 20(l로 세포를 자극하였다.
7.7.3 결과
이오노마이신 유도성 탈과립 분석의 결과는 상기 표1에서 IC50 값((M)으로 표시하였다. 시험한 활성 화합물(예: IgE 유도성 탈과립을 억제하는 화합물)중 대부분의 경우 이오노마이신 유도성 탈과립 현상을 억제하지 못했고, 이들 활성 화합물들이 초기(상향) IgE 수용체 신호전달체계를 선택적으로 억제하는 것을 확인하였다.
CHMC 세포에서 항 IgE 유도성 및 이오노마이신 유도성 칼슘 이온 흐름을 측정하여 특정 화합물에 대한 결과를 확인하였다. Ca2+ 흐름 시험에서는 10 (M R921218 및 10 (M R902420이 항 IgE 유도성 Ca2+ 흐름을 억제하였지만, 이오노마이신 유도성 Ca2+ 흐름에는 효과가 없었다(그림 4 참조)
7.8 본원 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 억제 효과의 즉시성
억제 효과의 즉시성을 시험하기 위해 본원 발명의 특정 2,4-피리미딘디아민과 항 IgE 항체 활성제를 위에 명시한 세포 검정과 동시에 첨가하였다. 시험한 모든 화합물은 수용체 가교결합 이전에 화합물과 CHMC 세포를 10분이나 30분간 사전 배양했을 때 관찰된 바와 마찬가지로, CHMC 세포의 IgE 유도성 탈과립 현상을 차단하였다.
7.9 시험관 내(In vitro) 약리 작용의 역학
R921218, R921302, R921219, R926240, R940277, R926742, R926495, R909243 및 R926782 화합물을 워시아웃 실험으로 시험하였다. 이 실험에서 CHMC 세포는 1.25 (M 화합물의 존재 하에서 항 IgE 항체로 즉시 활성화되었거나(시간 0) 항 IgE 항체로 활성화된 30, 60 또는 120분후 화합물이 워시아웃되었다. 이들 화합물의 억제 작용은 화합물을 제거한 30분 후에 크게 감소하였으므로 탈과립 현상을 최대한으로 억제하려면 비만 세포를 이들 화합물에 일정하게 노출해야 한다는 것을 알 수 있다. 시험한 다른 화합물도 비슷한 결과가 나타났다.
7.10 독성: Ｔ－ 및Ｂ－세포
본원 발명 화합물의 면역계 세포에 대한 유해성 없는 억제 작용 능력을 B- 및 T-세포를 이용한 세포 검정을 통해 증명하였다. 다음은 분석에 대한 프로토콜이다.
7.10.1 Jurkat(T-세포) 독성
완전 RPMI(10% 열비작용 처리한 소혈청) 배지에서Jurkat 세포를 2x105 세포/ml로 희석하고 37℃, 5% CO2에서 18시간 배양한다. 7.7 x 105 세포/ml의 65 ul 세포를 65 ul 2X 화합물(최종 용액 농도 0.5% DMSO, 1.5% MeOH)을 포함하는 V-형 96-웰 플레이트(TC-처리, Costar)에 넣는다. 배양 플레이트를 37℃, 5% CO2 환경에서 18-24시간 동안 교반한다. 독성은 세포 광산란의 유세포 분석법으로 분석하였다.
7.10.2 BJAB(T-세포) 독성
B-세포 라인 BJAB는 증식기까지 37°C, 5% CO의 RPMI1640 + 10% 열비작용 처리한 소혈청, 1x L-글루타민, 1x 페니실린, 1x 스트렙타비딘 및1x 베타-머캅토에탄올에서 배양되었다. 첫째, BJAB를 수확, 회전시킨 후 배양배지에서 7.7x105 세포/mL의 농도로 현탁시킨다. 65uL의 세포를 V-형 96-웰 조직 배양 플레이트에서 0.1% DMSO 존재 하에 65 uL 화합물과 혼합 하였다. 세포는 다양한 농도의 화합물과 37°C, 5% CO2 조건에서 배양되었다. 독성은 세포 광산란의 유세포 분석법으로 분석하였다.
7.10.3 유독성: 세포 적정 Glo 검정
50㎕의 세포(1x106/ml)를 50(l의 화합물을 포함하는 각 웰(well)에 종균한다. 최종 용액 농도는 0.5% DMSO, 1.5% MeOH이다. 플레이트를 1분간 흔들어 세포와 화합물을 혼합시킨다. 플레이트를 37℃ (5% CO2)에서 18시간 동안 배양한다. 다음날, 각 well에서 50㎕의 세포를 수확하여 50㎕의 세포 적정 Glo 시약(인바이트로겐)에 넣는다. 플레이트를 1분간 흔든다. 발광 측정기를 판독한다.
7.10.4 결과
T- 및 B-세포 독성 검정 결과는 상기 표2에서 IC50 값(μM)으로 표시하였다. 시험한 모든 화합물은 효과적으로 억제 작용을 하는 농도에서 거의 예외 없이(표 1 참조) B- 및 T-세포에 비독성이었다. 1차 세포에 행한 검정도 비슷한 결과가 나왔다.
7.11 동물의 2,4-피리미딘 화합물에 대한 내성
동물에게 독성이 나타나는 투여량 이하의 용량으로 본원 발명 화합물이 보여주는 억제 작용을 R921218, R921219 및 R921302 화합물로 증명하였다.
7.11.1 R921218
R921218는 비임상 안정성 연구의 집중프로그램을 통해 연구되었으며 이 제제는 설치류 및 비설치류에 대한 내성이 양호하다는 결과를 얻었다． R921218에 대한 독성/비임상 안정성 시험의 결과를 요약하자면 본 제제는 비설치류(토끼, 영장류 등)에게 코를 통해 투여하거나 설치류(쥐 등)에 대해 경구 투여했을 때, 용량을 제어하는 유독물을 생성하지 않았으며, 연구 기간 14일 동안 지속적으로 독성 연구를 위한 투여를 반복했으며, 투여량은 사람에게 유효한 용량으로 기대되는 투여량보다 몇 배가 넘는 양을 투여했다. 약학적으로 중요한 안전성에 있어서, 심장 혈관, 호흡기 및(또는) 중추 신경계 기능에 주는 부작용을 찾지 못했다. 유전적 독성 시험에서 돌연변이성 또는 연삭체 이상 유발에 대한 가능성을 찾지 못했으며 피부나 눈의 노출에 대한 부작용도 없었다. 주요 독극물 연구에 대한 내용을 제공하였다.
키노몰구 원숭이에 대한 비공 독성 연구를 위해, 14일간 반복적으로 투여했으며, 2.1, 4.5 또는 6.3mg/kg/일 용량을 사용했다. 연구 대상의 생매개변수는 다음과 같다: 임상 관찰, 체중, 식사량, 안과학, 혈압, 심전도, 혈액학, 임상화학, 검뇨, 독물 면역 평가, 검시, 장기 무게, 독물역학 평가 및 조직병리학(비공 포함). R921218로 인한 부작용은 어떠한 연구 대상의 매개변수에서도 찾아볼 수 없었으며 NOAEL(관찰 부작용이 없는 수준)은 6.3 mg/kg/일로 사료되었다.
비공 투약 독성 연구로서 뉴질랜드의 백색 토끼를 상대로 1.7, 3,4 또는 5.0 mg/kg/일 용량을 14일간 반복적으로 투약했다. 포함된 생매개변수는 다음과 같다: 임상 관찰, 체중, 식사량, 안과학, 혈액학, 임상화학, 검시, 장기 무게, 독물역학 평가 및 조직병리학(비공 포함). R921218로 인한 부작용은 어떠한 연구 대상의 매개변수에서도 찾아볼 수 없었으며 NOAEL(관찰 부작용이 없는 수준)은 5.0 mg/kg/일로 사료되었다.
7.11.2 R921219
초기 투여량 측정 연구에서 일회 경구 투여량은 600mg/kg이 NOEL(효과 없는 수준)으로 간주되었지만 7일간 투약할 경우 200mg/kg/일 이상은 허용되지 않았다
살모넬라-대장균/포유동물-미크로솜 복귀변위 검정(에이스 시험)에서, R921219는 '시헝용 균주' TA1537 시험에서 양성 결과가 나왔으며, 이 결과는 대사 활성화와 무관하였으므로 과거 연구의 결과를 입증하게 되었다. 다른 '시헝용 균주'에서도 R921219는 부작용을 끼치지 않는 것으로 드러났다. R921219는 시험관 염색체 이상 검정에서 염색체 이상 유발이 아닌 것으로 나타났다.
7.11.3 R921302
설치류에 있어서 초기 비GLP 독성에 대한 연구가 진행되어 왔다 . 쥐에게 있어서1000 mg/kg의 경구 투여량이 7일간 허용되었다. 14일간의 경구 독성 연구에 있어서, 쥐는 100, 300 및 1000mg/kg의 용량으로 진행하였으며 1000mg/kg는 지탱하지 못하였지만 300mg/kg 용량의 경우 음문에 대한 조직병리학적인 변화를 촉진하는 흔적이 있었다. 100 mg/kg의 용량은 본 연구의 NOAEL(관찰 부작용이 없는 수준)으로 간주하였다. 28일 간의 경구 독성 연구에서는, 쥐에게 100 mg/kg q.d., 100 mg/kg b.i.d, 300 mg/kg q.d. 및 300 mg/kg b.i.d를 투여하였다. R921302은 300 mg/kg q.d. 또는 b.i.d. 수준의 내성이 없었다. 낮은 투여량(100 mg/kg q.d. 또는 b.i.d.)은 잘 허용되는 것으로 보였다(임상결과 또는 조직임상결과는 아직 모름) 쥐 투여량인 50, 150 및 300 mg/kg는 32일간 투약하였으며, 허용되는 것으로 나타났다(임상결과 또는 조직임상결과는 아직 모름).
살모넬라-대장균/포유동물-미크로솜 복귀변위 검정(에이스 시험)에서 R921302는, TA98과 S9 및 TA1537 '시험용 균주' 시험에서 양성 결과가 나왔으며, 이 결과는 대사 활성화와 무관하였다. 다른 '시험용 균주'에서도 R921302은 부작용이 없는 것으로 드러났다. R921302은 시험관 염색체 이상 검정에서 염색체 이상 유발이 아닌 것으로 나타났다.
7.12 2,4-피리미딘디아민 화합물들의 구강 생체 이용성
본 발명의 50개가 넘는 2,4-피리미딘디아민 화합물에 대한 구강 생체이용성을 시험했다. 본 연구에서는 쥐에게 주사 또는 경구로 투여하도록 화합물을 여러 종류의 투여 용액(예: PEG 400 용액 및 CMC 현탁액)에 용해시켰다. 약물 투여 후, 혈장 시료를 획득 및 추출하였다. 화합물의 혈장 농도는 고성능 액체 크로마토그래피/직렬 질량 분석(LC/MS/MS) 방법을 사용하여 측정하였다. 약동학 분석은 혈장 농도 자료를 기반으로 수행하였다. 약동학 매개변수는 제거율(CL), 정류 상태에서의 분포 용적(Vss), 말단 반감기(t 1/2) 및 구강 생체이용률(%F)을 포함한다.
약동학 연구에 의하면2,4-피리미딘디아민 화합물 중 많은 화합물은 구강 생체이용성이 있으며 %F는 대략 50% 수준이다(0-50% 범위). 반감기 범위는 0.5-3.0 시간이다. 이 중R940350, R935372, R935193, R927050 및 R935391 화합물의 경우에는 쥐에 대해 특히 양호한 경구 생체이용성 및 반감기를 보여줬다. 그러므로 연구 결과2,4-피리미딘디아민 화합물들은 경구 투여에 적합한 것으로 입증되었다.
7.13 화합물은 알레르기 치료에 효과적이다
알레르기에 대한R926109, R921218, R921219, R921302, R926495, R926508, R926742, R926745 및 R945150 화합물의생체 효능은 쥐의 수동 피부 아나필락시(PCA)를 통해 평가하였다. 본 모델은 IgE-유도된 비만 세포 조직의 탈과립을 직접적으로 측정할 수 있다. 본 모델은 IgE 프라임된 동물들을 알레르기 자극물에 노출하여 지방 세포의 히스타민 방출로 인한 피부 맥관 구조의 투과성 변경을, 주위 조직에 누출되는 색소 변화를 통해 측정한다. 지방 세포 탈과립을 변화시키는 화합물의 매개물질 방출 억제는 조직에서 색소를 추출하여 쉽게 측정할 수 있다.
7.13.1 연구 프로토콜 및 결과
PCA 검정에서는 쥐에게 피내 주사 및 항-디니트로페놀(DNP) IgE 항체를 통해 수동으로 감작시킨다(1번째 날). 미리 정한 시간에 동물들에게 시험 시약을 투여한다(0번째 날) 시약이 피부의 비만 세포의 탈과립에 변화 효과를 주는 정도는, 사람 혈청 알부민을 접합한 DNP(HAS-DNP)를 피내 주사 및 Evans 청색 색소를 투여한 다음 측정한다. 결과적인 IgE 수용체의 가교결합 및 차후 비만 세포 탈과립으로 초래되는 혈관의 투과성 변화는 조직에서 추출한 색소의 양을 보고 측정하여 결정한다. 색소는 조직에서 포름아미드를 사용하여 추출하며 흡수된 추출물은 620 nm에서 읽는다. 약물 치료의 억제 효과는 부형제 치료와 비교했을 때 억제된 퍼센트로서 보고하며, 이는 A620의 백분율 감소에 해당된다.
다음의 두 화합물을 양성 대조군으로 시험하였다:. 히스타민 길항제 디펜히드라민 및 세로토닌 길항제 시프로헤프타딘. 두 매개물질(히스타민 및 세로토닌)은 쥐의 지방 세포에서 IgE-매개된 탈과립이 생기는 즉시 방출된다. 위의 두 참조 화합물은 PCA 반응을 억제한다; 추후 실험에서는시프로헤프타딘를 일반적으로 사용하였다. 시프로헤프타딘은 PCA 반응을 61% +/- 4%(8 mg/kg, 30분 전치료 시간, n=실험 횟수 23) 만큼 재현성 있게 억제하였다.
7.13.1.1 결과
R921218, R926109, R921219 및 RR921302의 투여량을 증가하면서 투여량에 의존하는 FcεR-매개된 혈관 출혈 억제를 관찰하였다. 이 화합물들은 수용액(67%PEG/33% 구연산 완충용액) 또는 현탁액(1.5% Avicel)을 통해 투여했다. 이 결과들은생체내 효능, 시험관내 효력 및 화합물 혈장 수준간의 강한 관계를 나타낸다. 가장 효력이 강한 화합물인 R921219는 약 10 μg/ml의 순환하는 방출 수준(100 mg/kg 용량으로 65% 감소)으로 활성화되었으며, R921302에 비해 상대적으로 약한 화합물로 100mg/kg의 용량으로 혈장의 관외유출을 42% 감소하였다. 또한 순환하는 화합물에 노출된 시간도 억제 활동 시간에 반영되었다. R921302는 약동학 연구에서 가장 대사적으로 안정된 화합물이었으며, 이 화합물은 항원-유도 수용체 신호 전에 1-2시간 동안 혈관의 투과성을 억제했으며, 이 시점에서 효능이 감소되기 시작했다. 이 자료는 표 3 및 표 4에 요약되어 있다.
R926495, R926508, R926742, R926745 및 R926150 화합물에서도 비슷한 시험관내 활동이 관찰되었으며, 이들은 PEG-기반 배합(표에 나와 있지 않음)에 따른 구강 투여 후 PCA 반응을 억제할 수 있었다.
7.1.4 천식 치료에 효과있는 화합물
천식 치료에 효과 있는 R921218, R921302, R926495, R926508, R926742 및R921219 화합물을 알레르기성 천식에 대한 양 모델로 증명하였다. 양은 항원(돈 회충)를 흡입한 수 분 이내에 기관지 수축을 하기 시작하며, 초기 알레르기 반응(EAR)으로 극심한 기도 폐쇄증상이 유발된다. 기성 비만 세포 매개물질의 방출은 기도 폐쇄 초기 단계의 원인이다. EAR 이외에도 양 모델에 알레르겐을 기도에 국부 투여하여 후기 천식 반응(LAR) 및 비특이성 기도 과민성반응(AHR)에 대한 화합물의 효능을 평가할 수 있다. 양의 경우, AHR은 항원 공격 후 몇시간 내에 발생하고 최대 2주간 지속된다. 아래 결과는 시험한 화합물이 비만 세포로부터 사이토카인이 방출되어 전달계를 억제하는 것을 나타낸다.
7.14.1 연구 프로토콜
알레르기성 천식의 양 모델에서 양의 기관내 관을 통해 시험 입자를 에어로졸로 투여한 후 양이 선천적으로 알레르기 반응을 보이는 회충인 돈회충으로부터 추출한 항체로 에어로졸 시험을 하였다. 알레르겐 검사는 직접 기관지 수축(EAR 및 LAR) 및 만성 비특이성 AHR을 유도한다. 세가지 형질은 인간 알레르기성 천식과 유사하다. 시험 인자의 작용은 폐 저항성(RL)의 변화에 의해 결정되고, 이는 폐내 압력차, 혈류 및 호흡 용적의 측정값으로부터 계산된다. 염수로 처리한 양에서 얻은 이전 자료를 알레르겐 검사와 비교했을 때, EAR 기간 동안 RL이 급격히 상승하고 알레르겐 검사를 한 후 2-3시간 동안 지속된다. 알레르겐 공격으로부터 5-6 시간후 시작되는 LAR에서는 RL 증가 속도가 더디고, 공격 후 8시간이 지나면 해결되었다. 공격 24시간 후, AHR을 확인하기 위해 카르바콜에 반응하는 투여량을 측정하였고, 이는 RL을 기준선 보다 400% 증가시키는데 필요한 카르바콜의 투여량이다. (이 측정값은 RL을 기준(PC400) 보다 400% 증가시키는 것을 유도하는 카르바콜의 분비 자극 농도를 말한다.) 이 자료를 염수 대조 에어로졸을 투여하고 돈 회충으로 공격할 때의 같은 개체에 대한 이전의 대조 자료와 비교하였다.
7.14.2 결과
시험된 모든 화합물은 LAR 및 AHR에 대한 억제 효과가 있었으며 일부는 EAR도 억제하였다. 몇 가지 전처리 시간의 작용을 평가하기 위한 지속적으로 연구한 각 화합물에 대한 최적 반응 및 몇 가지 용액 및 현탁액의 조성이 표 5에 명시되어 있다. EAR에 대한 R921218의 효능은 조성에 따라 결정되며 10% 에탄올 용액의 에어로졸로 30mg/sheep를 투여했을 때 가장 효능이 컸다. R926495, R926742, R926508 및R921219를 알레르겐 공격 60분 전에 수용성 현탁액으로 양 네마리에 45 mg/sheep 를 투여하여 LAR 및 AHR의 차단을 증명하였다. 이러한 말기 변수 외에도 EAR은 R921219, R926508 또는 R926495로 인해 현저하게 감소되었다. RR921302의 효능은 45%PEG400/55% 구연산 완충 부형제를 이용하여 조사하였다. 이러한 조건하에서 공격 60분 전에 R921302를 30 mg/sheep 투여하여, LAR 및 AHR은 차단되었고 EAR은 영향을 받지 않았다.
이 자료는 이들 화합물이 알레르기성 양의 천식 반응에 대한 차단 능력을 확실하게 증명한다. 모든 화합물이 과거의 대조에 비해 AHR 및 LAR을 현저하게 억제한다. EAR은 R921219, R926508 및 R92649 (각각 54%, 21% 및 33%)에 의해 현저하게 억제되었다. 반면, R921218, R921302 및 R926742을 수용성 현탁액으로 투여했을 때 EAR을 억제하지 못했다.
7.15 기관지 천식 치료에 효과있는 화합물
천식 치료에 대한 R921304 및R921219 화합물의 효능도 천식에 대한 쥐 모델을 이용하여 증명하였다.
7.15.1 연구 프로토콜
0번째 날 및 7번째 날에 복강내 경로로 면역 반응 항진제(백반) 존재하에서 알부민(닭 단백질)으로 쥐를 감작시켰다. 일주일 후, 14, 15 및 16번째 날(엄격한 모델) 또는 14번째 날(덜 엄격한 모델) 알부민을 쥐의 비강내 투여하여 공격하였다. 이러한 감작 및 공격 투여는 인간 기관지 천식의 두 가지 우성 형질인 기도 과민성 반응 및 폐의 조직 파괴를 유도한다. 쥐 모델에서 생체 내 기도 과민 반응을 PENH (enhanced Pause, Buxco Electronics)를 결정하는전신체 변동 기록기(whole body plethysmograph)로 측정한다. PENH는 단위가 없는 값으로서 최고 흡기유량(PIF), 최대 호기유량(PEF), 흡기 시간, 호기 및 이완 시간으로 구성되며 기도 과민성 반응의 유효한 변수로 간주된다. 알레르겐 공격 반응(OVA)은 염수만을 투여한 동물 시험과 비교된다. 공격 24시간 후, 증가시킨 메타콜린(무스카린성 수용체 효능제) 투여량을 쥐에게 노출 시킨 결과, 평할 근육이 수축되었다. 알부민으로 시험한 쥐는 염수 시험한 쥐에 비해 메타콜린에 대한 심한 기도과민성반응을 보인다. 이 외에도 염수 시험한 쥐에 비해 알부민 시험한 쥐에게서 기도의 세포 침윤 현상을 볼 수 있었다. 세포 침윤은 호산구가 특징이지만 호중구 및 단핵세포의 유입 또한 존재한다.
비만 세포 탈과립현상의 소분자 억제제를 평가하기 위한 이 모델의 사용은 여러 방식으로, 유효화되었다. 첫 째, 비만 세포가 부족한 쥐(W/Wv)의 사용으로 알부민 유도성 반응은 비만 세포의 존재에 의존함을 알 수 있었다. 비만 세포가 부족한 쥐에서는 기도과민성반응 및 호산구 유입에서 알부민 감작 및 공격에 대한 반응을 볼 수 없었다. 둘 째, 비만 세포 안정제인 크로몰린은 알부민 유도성 기도과민성반응 및 염증을 차단하였다(자료 없음). 천식 반응 치료를 위한 화합물의 평가를 위한 이 모델의 사용은 비만 세포 안정제 이외의 기전에 의해 매개될 수 있고, 메타콜린-유도에 의한 기관지수축에 대한 스테로이드, 덱사메타손 및 부데소나이드의 억제 효과로써 더욱 뒷받침된다.
7.15.2 결과
R921304의 효능을 평가하기 위해 7번째 날부터 16번째 날까지 10일간 연속해서 20mg/kg을 비강내 투여하되, 마지막 3일간은 염수 또는 알부민 공격 30 분전에 투여하였다. 부형제를 투여한 쥐와 비교했을 때, R921304은 메타콜린에 의한 알부민 유도 기도 과민반응을 억제하였다.
쥐를 14번 째 날 하루만 알부민으로 공격한, 덜 엄격한 프로토콜에서, R921219을 염수 또는 알부민 공격 30분 전에70 mg/kg in 67%PEG400/33% 구연산 완충용액을 피하주사 했을 때, R921219가 알부민 유도에 의한 기도 과민성 반응 및 세포 유입을 차단하는 것으로 나타났다.
이 결과들을 보면 R921219 및 R921304가 천식에 의한 쥐의 기도 반응을 효과적으로 억제함을 알수 있다.
7.16 활성화된 비만 세포에서 Syk 키나제의 단백질 하류 인산화를 억제하는 2,4-피리미딘 화합물
Syk 키나제의 단백질 하류의 인산화에 대한 2,4-피리미딘디아민 화합물의 억제 효과를, IgE 수용체에 의해 활성화된 BMMC 세포에서 R921218, R218219 및 R921304 화합물을 이용하여 시험하였다.
검정에 사용할 BMMC 세포를 여러 농도의 시험 화합물(0.08 μM, 0.4 μM, 2 μM 및 10 μM)의 존재하에 1시간 동안 37°C에서 배양하였다. 세포를 상기 설명한 항 IgE 항체로 자극하였다. 10분 후, 세포가 용해되고 세포 단백질이 전기영동(SDS 페이지)으로 분리되었다.
전기영동 후, 그림 7,10 및 11A-D에 표시된 단백질의 인산화 반응을 면역 이적법(immunblot)으로 분석하였다. 항체는 Cell Signaling Technology, Beverley, MA로부터 구입하였다.
그림 7,10 및 11A-D에서 표시된 화합물들은, IgE 수용체 신호 전달계에서 Syk 하류의 단백질 인산화 반응을 억제하였으나 Syk 상류는 억제하지 않았으므로, 상류 IgE를 억제하는 화합물들은 탈과립을 유도하였고, 또한 Syk 키나제를 억제함으로서 화합물들의 억제 작용을 나타내는 것이 확인되었다.
7.17 생화학 검정에서 2,4-피리미딘디아민 화합물이 Syk 키나제를 억제하다
일부 2,4-피리미딘디아민 화합물에 대한 생화학적 편광 분석에서, 분리한 Syk 키나제를 이용한 펩티드 기질의 Syk 키나제 촉매에 따른 인산화 반응 능력을 시험하였다. 이 실험에서는 화합물을 키나제 완충용액(20mM HEPES, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM MnCl2, 1mM DTT, 0.1mg/mL 아세틸화 Bovine Gamma Globulin)에 1% DMSO로 희석하였다. 1% DMSO(최종 농도 0.2% DMSO)의 화합물을 상온에서 ATP/기질 용액에 혼합하였다. Syk 키나제(Upstate, Lake Placid NY)를 최종 반응량 20 uL에 추가한 후, 반응을 위해 상온에서 30분간 배양하였다. 최종 효소 반응 조건은 20mM HEPES, pH 7.4, 5mM MgCl2, 2mM MnCl2, 1mM DTT, 0.1mg/mL 아세틸화 Bovine Gamma Globulin, 0.125ng Syk, 4uM ATP, 2.5uM 펩티드 기질(비오틴-EQEDEPEGDYEEVLE-CONH2, SynPep Corporation)이다. 총 용량 40 uL에 대한 반응을 중지시키기 위해, 제조업체(Pan Vera Corporation) 지시에 따라 EDTA(최종 농도10 mM)/항 포스포티로신 항체(최종 농도 1X)/형광 포스포펩티드 추적물질(최종 농도 0.5X)을 FP 희석 완충용액에 첨가하였다. 플레이트를 30분간 상온의 암실에서 배양하였다. 플레이트를 Polarion 편광 플레이트 측정기(Tecan)로 판독하였다. Tyrosine Kinase Assay Kit, Green (PanVera Corporation)과 함께 제공된, 포스포펩티드 제조 경쟁 회사가 작성한 검량선을 기준으로 얻어진 자료를 포스포펩티드 양으로 변환하였다.
검정 결과는 아래 표6에 표시되어 있다
이 자료는 R945142 및R909236을 제외한 시험 대상의 모든 화합물이 마이크로몰 농도 미만의 범위에서, IC50로써 Syk 키나제 인산화를 억제하는 것을 보여준다. 시험한 모든 화합물은 마이크로몰 농도 범위에서 IC50로써 Syk 키나제 인산화를 억제한다.
7.18 자가면역 치료에 효과적인 화합물
자가면역질환에 대한 특정 2,4-피리미딘디아민 화합물의 생체 내(in vivo) 효과는 역수신 아르튀스 반응, 항원-항체 매개에 의한 조직 손상의 급성 모델 및 자가면역 및 염증의 질환 모델로 평가하였다. 이 모델들은 특히 항원의 항체가 면역착체에 의한 염증성 질환 및 이에 따른 조직 파괴를 매개하는 점에서 유사하다. 특이 해부학적 위치(실험자가면역뇌척수염("EAE")은 중추 신경계(CNS), 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA)은 염증)에서 일어나는 IC침착은, 표면 FcγR 및 FcεR를 가진 세포, 특히 비만 세포, 대식세포 및 호중구의 활성화를 유도하여 사이토카인을 방출하고 호중구의 주화성(chemotaxis) 인자를 생산한다. 염증 반응의 활성화는 부종, 폐출혈, 호중구 침윤 및 염증전 매개물질의 방출을 포함하는 하위 효과기(downstream effector) 반응을 일으킨다. 이러한 IC에 의한 결과는 자가면역질환에서 확인하기 어렵지만 많은 연구원들은 동물 모델의 FcγR 신호전달경로 억제가 해당 질환의 발병 및 빈도를 획기적으로 낮추었음을 증명하였다.
7.18.1 쥐 아르튀스(Arthus) 반응에 효능있는 화합물
IC에 의한 염증 순차반응을 억제하는 R921302, R926891, R940323, R940347 및 R921303 화합물의 생체내 효과를 쥐 모델을 대상으로 한 역수신 아르튀스 반응(RPA 반응)으로 증명하였다.
7.18.1.1 모델
면역착체(IC) 매개에 따른 급성염증성 조직손상은 혈관염 증후군, 전신성 홍반성 루프스(SLE), 류마티스성 관절염, 굳패스처 증후군 및 사구체신염을 포함하는 여러 가지 인체의 자가면역질환과 관계있다. IC 매개 조직 손상에 대한 전형적인 실험 모델은 역수신 아르튀스 반응이다. RPA 반응 모델은 IC에 의해 유도된 국소 염증반응을 연구하는 편리한 생체 내 방식으로, 전신효과가 없다. 닭의 난 알부민(토끼 항-OVA IgG)에 특이적인 항체(Abs)를 피내 주사로 투여한 후, 닭 난 알부민(OVA)에 특이적인 항원(Ags)을 정맥(IV) 주사로 투여했을 때, IC에 의한 혈관주위 침착 증상, 그리고 부종, 호중구 침윤, 폐출혈과 같은 신속한 염증 반응이 주사를 투여한 위치에 나타났다. 쥐 RPA 반응 모델은 류마티스성 관절염, SLE 및 사구체신염 환자의 염증 반응과 흡사하다.
7.18.1.2 연구 프로토콜
본 모델 시스템에서는, Abs 및 Ags를 투여하기 전에 실험 화합물을 여러 차례 투여하였다. 토끼 항-OVA lgG용액(50(g in 25(l/mouse)을 피내 주사로 투어한 후, 1% Evans blue dye 용액에 넣은 닭의 난 알부민(체중의 20 mg/kg)을 바로 정맥 주사로 투여하였다. 부종 및 사구체염 증상의 정도를 국부 조직 손상 표시자인 Evan Blue dye를 사용하여 C57BL/6 쥐의 등쪽 피부에서 측정하였다. 정제한 다클론성 토끼 IgG는 대조로서 사용하였다.
Ab/Ag 공격 전에 실험 화합물을 투여하는 전처리 시간은 각, 화합물의 약동학(PK) 물성에 따라 결정된다. 아르튀스 반응을 유도하고 4시간이 경과한 후에 쥐를 안락사 시키고, 부종 분석을 위해 조직을 채취하였다. 이 모델 시스템은 많은 억제제의 생체 내 활동을 신속하게 선별할 수 있도록 한다.
7.18.1.3 결과
실험한 모든 화합물을 구강을 통해 투여했다.
C57Bl6 쥐에 대한 Ab/Ag 공격을 실시하기 60분 전에, R921302 화합물을 50mg/kg, 100 mg/kg, 및 200 mg/kg씩 투여하여 용량에 따른 부종 형성의 억제율(각각 49.9 %, 93.2 % 및 99.1 %)을 관찰할 수 있었다. 그리고 R921302 화합물은 부종의 예방적 억제뿐 아니라 화합물100mg/kg을 투여하고 30분이 경과하였을 때 77.5%의 억제율을 나타내는 치료 효과를 관찰할 수 있었다.
R940323 및 R926891 화합물을 공격 60분 전에 200 mg/kg씩 투여했을 때, 각각 32.4% 및 54.9%의 억제율을 보이는 치료 효과가 있었다. 이 화합물들은 구강으로 투여했을 때 생체이용 가능성이 훨씬 떨어지게 되며 전신흡수 수준이 R921302 화합물(자료 없음) 투여 결과에 비해 50배 정도 낮게 나타났다. R940347 화합물을 검사 2시간 전에 100 mg/kg을 투여했을 때 부종을 89% 억제하는 효과가 나타났다.
R921303 화합물을 200mg/kg의 용량으로 공격 30분, 60분, 120분 전에 용량 투여했을 때, 부종 증상에 대한 억제율이 각각 100%, 100%, 93.6%로 나타났다. 이 화합물을 50 mg/kg, 100 mg/kg 및 200 mg/kg 투여했을 때 억제율이 각각 65.4%, 81.2% 및 100%로 측정되어 억제율이 투여량에 비례한다는 것을 알 수 있었다. 화합물 실험 결과는 표7에 요약되어 있다.
*nd=미결정
7.18.2 쥐 콜라겐 항체에 의해 유도된 관절염에 대한 화합물의 효과
콜라겐 항체에 의해 유도된 관절염(CAIA) 관련 쥐 모델을 대상으로 자가면역질환에 대한 R921302 화합물의 생체내 효과를 증명하였다.
7.18.2.1 모델
설치류에서 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA)은 IC-매개 조직 손상에 대한 실험 모델로 자주 사용된다. 쥐를 대상으로 제2형 콜라겐을 투여한 결과 원위 관절(distal joints)의 연골과 골의 염증성 파괴로 주위 조직에 수반성 종창 증세가 나타나는 면역반응을 보였다. CIA는 일반적으로 화합물이 류마티스성 관절염 및 기타 만성 염증성 질환의 치료제로 사용할 수 있는지 여부를 가리기 위해 사용된다.
최근 항체 매개 CIA를 유도하기 위해 항제2형 콜라겐 항체를 적용한 CIA 모델에 대한 신기술이 개발되었다. 이 방법의 장점은 다음과 같다. 질환 유도 시간이 짧고(항체를 정맥(IV) 주사한 후 24-48시간 내에 발병); 관절염이 CIA 감염 및 CIA 저항 쥐에서 모두 유도되며; 항염증 치료제의 신속한 선별에 이상적인 과정이다.
Arthrogen-CIA(R) 관절염에 의해 유도된 단일클론 항체 칵테일(Chemicon International Inc.)을 제0일째 Balb/c 쥐(2mg/쥐)에 투여하였다. 48시간 경과 후 LPS(25㎍) 100㎕을 복강내 주사하였다. 4일 경과 후, 발가락에 부종이 나타날 수 있다. 5일 경과 후, 두 발(특히 뒷발)이 붉게 변하고 부종이 나타나기 시작한다. 6일 경과 후에는 최소 1-2주간 부종과 붉게 변하는 증상이 지속된다. 연구하는 동안 발에 나타난 부종의 중증도를 평가하기 위해 염증의 임상 증세를 계산하였다. 관절염 심도는 각 동물의 두 뒷발 점수를 합산하여 기록된다(가능한 최고 점수는 8). 발에 나타난 염증 정도는 발의 직경을 측정한 수치로 평가된다. 체중 변화를 관찰하였다. 동물들은 제0일째 시작하여 관절염 유도 시기에 치료하였다. 실험 화합물 및 대조 화합물을 최근 구축된 PK 프로파일에 따라 하루 1회(q.d) 또는 2회(b.i.d) 구강 투여(PO)하였다.
연구 마지막 단계(관절염 유도 후 1-2주)에 쥐를 안락사시키고 단두기(guillotine)를 사용하여 원위 경골 부위를 절개하고 무게를 측정하였다. 각 그룹에 대한 평균(SEM)의 평균 ± 표준 오류는 각 동물의 임상 점수를 매일 확인하고 각 실험 구룹에 대한 뒷발 무게를 계산하여 연구 종료시 기록하였다. 발에 대한 조직병리학적 평가를 얻었다.
7.18.2.2 결과
R921302 화합물을 투여하여 관절염의 발병 및 질병 정도(p<0.005)가 탁월하게 억제되었으며, 이는 평균 일일 관절염 임상 점수 변화로 관찰할 수 있다(그림 12). 치료 그룹의 4일~14일째까지의 평균 일일 관절염 점수를 용매 대조군의 점수와 비교했을 때 71 ~ 92 % 감소했다. 발의 무게로 측정한 발에 나타난 염증 정도는 R921302 화합물로 치료한 동물이 용매 대조군과 비교했을 때 감소했다(그림 13). 연구 마지막 단계에서, 발의 무게로 측정한 부종 정도는 R921302 화합물로 치료한 그룹이 용매 대조군(p<0.002)의 평균 발 무게와 비교했을 때 99.9% 감소했다.
절개한 발의 조직병리학적 평가를 한 결과 CIA에서 기대하는 뚜렷한 활막염을 발견하였다. 뚜렷한 병변이 염수 또는 부형제로 치료한 동물에서 발견되었으며, R921302 화합물 치료 그룹에서는 병변이 훨씬 적게 발견되었다. 활막 세포의 현저한 증식으로 관절이 두꺼워졌다. 섬유아세포의 증가로 호중구, 림프구, 단구, 마이크로파지 및 플라즈마 세포가 조밀하게 침윤된다. 혈관세포의 증식으로 울혈, 폐출혈 및 부종이 발현된다. 관절에 판누스가 형성되고 연골 파괴 현상이 나타났다. 약물 치료 그룹에서는 관절이 정상에 가깝거나 연골과 관계없는 제한적인 염증이 나타났다.
관절염 임상 점수 및 발 부종은 R050 100mg/kg을 1일 2회 투여받은 동물의 경우 무처치 대조군(부형제, p = 0.1)에 비해 평균 20% 감소되었다. 뒷발 굵기로 측정한 발 부종의 정도는 무처치 대조군(부형제)에 비해 26% 더 억제되었다(p = 0.1). R050를 30mg/kg 투약한 경우에는 관절염이 발현되지 않았다.
R070, R050의 염형태 50 또는 100mg/kg을 1일 2회 투여한 결과, 평균적으로 무처치 대조군에 비해 임상 질환이 각각 39.75%(p < 0.0002) 또는 35.28%(p < 0.0004) 더 억제되었다. 발의 굵기가 50% 정도 감소되었다.
R429, R363의 염 50 또는 100mg/kg을 1일 2회 투여한 결과, 평균적으로 무처치 대조군(용매)에 비해 관절염 임상 점수가 각각 23.81%(p < 0.05) 및20.82%(p = 0.05) 더 억제되었다. 마찬가지로 발의 굵기가 감소되었다.
R347을 30 및 100mg/kg을 1일 2회 투여한 경우에는 관절염 점수에 아무 영향이 없었다.
7.18.3 쥐 콜라겐에 의해 유도된 관절염에 효과적인 화합물
콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA) 쥐 모델을 대상으로 자가면역질환에 대한 R921302 화합물의 생체내 효과를 증명하였다.
7.18.3.1 모델 설명
류마티스성 관절염(RA)는 만성 관절 염증 질환이며 결국 비가역적 연골 파괴를 초래한다 RA 환자의 활막 조직에서 IgG을 포함하는 IC를 많이 발견할 수 있었다. 이 착체들이 이 질환의 병인학 및 병리학 측면에서 어떤 역할을 하는지 아직 논쟁 중에 있지만, IC는 FcγR를 통해 조혈세포와 의사소통을 한다.
CIA는 판누스 형성 및 관절 퇴행이 특징인 만성 활막염 증상을 나타나는 RA에 대해 널리 수용되는 동물 모델이다. 이 모델에는 천연 제2형 콜라겐을 피내 면역 주사하고 불완전 프로인트 보조액(Freund's adjuvant)으로 에멀젼화하여 10 또는 11일내에 염증성 다발성 관절염과 3 - 4주 이내에 속발성 관절 손상을 유발시켰다.
7.18.3.2 연구 프로토콜
동계 LOU 쥐를 0일째 천연 제2형 콜라겐으로 면역시켜 R921302의 효능을 예방 요법 및 치료 요법 측면에서 평가하였다. 예방 프로토콜에서, 면역 접종 시작일(제0일)에 부형제 또는 다양한 투여량의 R021302 화합물을 경구 위관(oral gavage) 주입하였다. 처치 프로토콜에서, 제10일째 발현된 관절염의 임상적 징후가 나타난 후 R921302로 처치를 시작(300mg/kg을 경구 위관 주입, qd)하고 제28일째 사망할 때까지 계속 진행하였다. 두 프로토콜 모두에서, 임상 점수를 매일 얻었고 체중은 주당 2회 측정하였다. 제28일째, 방사선 점수를 얻었고, 콜라겐 II 항체의 혈청 레벨를 ELISA로 측정하였다.
7.18.3.3 결과
쥐에게 면역 접종시키고 10일 경과되었을 때 관절 점수가 증가하여 임상적 CIA가 발현되었음을 알 수 있었다(그림14). 부형제만 사용하여 처치된 쥐의 평균 관절 점수를 제10일째 점차적으로 증가하여 제28일에는 평균 임상 점수가 6.75 ± 0.57에 도달하였다. 면역 접종 첫날(제0일째) R92302를 다량 투여(300mg/kg/일)한 동물들의 제10일 ~ 28일째의 평균 임상 점수는 부형제 대조군에 비해 눈에 띌 정도로 감소되었다. 발병 초기에 R921302를 300mg/kg 투여한 쥐들은 제16일째부터 관절 점수가 눈에 띄게 낮아졌고, 연구 마지막 날인 제28일째까지 이 변화를 계속 관찰할 수 있었다. CIA 발현 제28일째 얻은 맹검 방사선 점수(0-6)는 부형제 대조군의 경우4.8 ± 0.056로 나타났고, 투여량 75, 150, 300 mg/kg/day를 예방 요법 차원에서 1일1회 투여한 동물의 경우 각각 2.5 ± 0.0.16, 2.4 ± 0.006, 0.13 ± 0.000001를 얻었으며, 발병 초기에 300 mg/kg/day를 1일1회 투여한 동물의 경우 0.45 ± .031를 얻었다. R921302를 300mg/kg/day 투여한 경우, 예방적(면역접종)으로, 또 발병 이후에도 침식 발현을 막고 연조직이 붓는 것을 억제시켰다. 이와 유사하게, R921302를 투여한 결과, 혈청 항콜라겐 II 항체(자료 없음)가 눈에 띄게 감소했다.
7.18.4 쥐의 실험적 자가면역성 뇌척수염에 효능이 있는 화합물
실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE) 쥐 모델을 대상으로 자가면역질환에 대한 R921302 화합물의 생체 내 효과를 증명하였다.
7.18.4.1 모델 설명
EAE는 CNS백색질의 면역세포 침윤으로 인한 자가면역성질환인 다발성 경화증(MS)에 유용한 모델이다. 미엘린(myelin)의 염증 및 속발성 손상으로 인해 진행성 마비 증상이 나타난다. EAE는 인간 질환과 마찬가지로 미엘린 염기성 단백질(MBP), 단백지질 단백질(PLP) 또는 미엘린 희소돌기아교세포 단백질과 같은 미엘린 단백질과 자가 반응을 하는 T 세포의 말초 활성과 연관있다. 활성화된 신경항원 특이 T 세포는 혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 소병소성 단핵세포침윤 및 탈수질을 유발한다. EAE는 미엘린 특이 단백질과 면역보강제 혼합제를 감염된 쥐에게 주사하여 유도할 수 있다. 본 연구에 사용한 SJL 쥐 모델은 면역화 10일 후에 뒷다리 및 꼬리 마비가 나타났으며, 질환 중증도 정점이 제10일 및 제14일째 관찰되었으며, 부분 자연 치유와 재발이 반복되는 것을 제35일째까지 관찰할 수 있었다. 아래 결론에는 질환 중증도를 완화하고 면역세포에서 FcγR 매개 사이토카인이 방출되어 나타날 수 있는 질환의 재발 방지하는 실험 시약(R921392)의 잠재된 효능을 증명하였다.
7.18.4.2 연구 프로토콜
EAE의 SJL 쥐(murine) 모델에서, 쥐를 각각 PLP/CFA로 감작시켰다.
(PLP139-151 150㎍ CFA 200㎍를 추가한 호모지네이트 0.05ml
억제 프로토콜에서, 면역 접종 시작일(제0일)에 부형제 또는 다양한 투여량의 R021302 화합물을 경구 위관(oral gavage) 주입하였다. 발병 초기의 처치 프로토콜에서, 초기에 비슷한 평균 임상 점수를 가지는 동물들을 분류하여 경구 위관을 통해 다양한 용량의 시험 물질을 주입했다. 두 프로토콜 모두에서, 임상 점수는 매일 기록하고 체중은 주당 2회 관찰하였다.
7.18.4.3 결과
SJL 쥐를 PLP 면역화한 후10일이 경과되었을 때 평균 임상 점수가 증가하여 임상적 EAE가 발현되었음을 알 수 있었다(그림15). 면역화 부형제로만 처치한 동물의 마비 점수는, 당일(제0일)에서 시작하며 점차적으로 증가하였으며 제14일째는 평균 점수가 정점인 5.1 + 0.3에 도달하였다. 질환 정점(제14일)에서, 100 mg/kg를 1일1회 또는 1일 2회 투여한 동물들의 평균 임상 점수는 눈에 띄게 감소되었다(각각 p < 0.05, 4.3 + 1.3 및 4.3 + 1.4). 제 16일째, 모든 동물들은 평균 임상 중증도의 부분 치유 현상이 나타났으며 이는 SJL 모델의 특징이다. R921302를 100mg/kg씩 1일2회 투여한 동물에게 나타난 현저하게 낮은 임상 점수는, 동물들이 죽기(제30일) 전 실험 기간 동안 계속 유지되었다(p < 0.05). 처치 기간 동안에 측정된 낮은 점수들은 현저하게 낮은 누적 질병 지수(CDI)에 반영되고 누적 체중 지수(CWI)를 증가시켰다(표9 참조). 부형제로만 처치한 그룹에 속한 쥐의 2/5가 재발했다. 1일 1회 100mg/kg씩 투여한 그룹에 속한 쥐의 3/8이 재발했다. 1일 2회 100mg/kg씩 투여한 그룹에서는 재발한 쥐가 발견되지 않았다.
발병한 날(11일째) R921302를 200mg/kg씩 1일 2회 처치한 SJL 쥐는 CDI수치(R921302로 처치한 동물은 53.5 ± 16.9, 부형제로만 처치한 동물은 72.9 ± 8.9)가 현저하게 감소(p = 0.003)되었다. R921302로 처치한 동물들 중 재발한 동물 수(2/12)는 부형제로 처치한 동물들 중 재발한 동물 수(7/11)에 비해 극적으로 감소되었다. 결과는 표 10 및 그림 16에 요약되어 있다.
7.18.5 T 세포 활성을 억제하는 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물
7.18.5.1 설명
본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 T 세포 활성의 억제 효능을 Jurkat T 세포 세포주 및 1차 T 세포 배양을 활용한 여러 실험을 통해 나타냈다. T-세포 수용체(TCR)의 자극으로 발생한 Jurkat T-세포 활성의 억제 작용은 세포 표면 표식인자 CD69의 상향조절을 정량화하여 측정되었다. 1차 T 세포 활성의 억제 작용은 TCR/CD28 공동자극인자로 인한 종양괴사인자 알파(TNF), 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 (IL-4), 인터페론 감마(IFNg) 및 과립성 대식세포 군체 자극 인자(GMSCF)를 포함한 사이토카인의 방출을 정량화하여 나타내었다.
7.18.5.2 Jurkat T 세포 활성의 억제 작용에 대한 선별
인간 Jurket T 세포(콜론 N)은 10% 소태아혈청(F BS)(Hyclone), 페니실린 및 스트렙토마이신을 보충한 RPMI 1640 배지(Mediatech)에서 정규적으로 배양되었다. 선별 과정은 3일 이상 소요되었다.
선별 1일째, 배양된 세포를 고속원심분리기(1000rpm, 5분)에서 회전시키고, RPMI + 5% FBS에서 3.0 X 105 cell/ml로 재현탁시켰다. 선별 2일째, 세포를 1000 rpm에서 5분간 회전시키고 RPMI + 5% FBS에서 1.3 X 105 cell/ml로 재현탁시켰다. 85㎕의 세포 현탁액을 U-bottom 96 well plates(Corning)에 추가하였다. 85μl의 화합물 또는 희석한 RPMI + 5% FBS(대조)만 각 웰(well)에 추가하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 다음, 25 ㎕의 8X 용액을 분주한 세포에 추가하여 500ng/ml에서 세포를 안티 TCR(C305)로 자극하였다. 세포를 37°C에서 20시간 동안 배양했다.
선별 3일째, 플레이트를 Beckman GS-6R 고속원심분리기에서 2500 RPM으로 1분간 회전시킨 결과, 배지가 제거되었다. 50㎕의 염색 용액(PBS + 2% FBS에 포함된 안티-CD69-APC 항체(Becton Dickenson)를 1:100으로 희석)을 각 웰에 추가한 후 플레이트를 어둠속에서 20분 동안 4°C에서 배양했다. 150㎕의 완충액(PBS + 2% FBS)을 각 웰에 추가한 다음, 플레이트를 3000 RPM으로 1분간 회전시켰다. 상층액을 다시 제거하고 펠렛을 조심스럽게 흔들어 재현탁시켰다. 75㎕의 PBS + 2% FBS + Cytofix(1:4로 희석)를 추가하고 플레이트를 조심스럽게 흔들어 알루미늄 박지에 쌌다. 플레이트에 있는 세포를 자동액상분주장치와 짝지어진 유세포 분류기를 사용하여 측정하였다.
각 화합물의 T 세포 활성 IC50 억제 작용을 결정하기 위해 여러 농도의 화합물을 부형제와 비교하였다. 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 대표적인 IC50은 표11에 나와 있다.
7.18.5.3 1차 T-세포의 분리
2E8-4E8 PBMC 또는 건강한 인간 기증자의 rIL-2에서 증식한 T 세포를 PBS에 현탁, 회전(1500rpm, 8-10분)시킨 후, 100ml의 RPMI 완전 배지(1% Pen-Strep, 1% L-글루타민, 10 mM HEPES)에 재현탁시켰다. 세포들을 T175 플라스크(37℃, 5% CO2)에 분주하고 단핵세포들은 2-3시간 동안 유착할 수 있었다. 단핵세포가 유착된 후, 비부착 세포을 얻어 혈구계수기로 측정하고 PBS로 몇번 세척하여 Yssels 완전 배지(1% 인간AB 혈청이 첨가된 변형된 IMDM 배지, 1% Pen-Strep, 1% L-글루타민, 10 mM HEPES)에 1.5 4E6 cells/mL로 재현탁하였다. 90uL의 희석된 세포를Yssel 배지에서 2배로 희석된 화합물에 추가하고 30분 동안 5% CO2및37℃에서 배양했다. 이 전배양 절차 후, 화합물/세포 혼합물을 아래 설명한 자극용 플레이트로 옮겼다.
7.18.5.4 자극된 1차 T세포의 사이토카인 생성 억제에 대한 선별
자극용 플레이트는 96 well 플레이트를 PBS(Ca2+/Mg2+ 없음)에서 5(g/ml (CD3CD3(BD PharMingen, Catalog# 555336) + 10(g/ml (CD28(Beckman Coulter, Catalog# IM1376)로 37(C (5% CO2)에서 3-5시간 동안 코팅하여 준비하였다. 자극항체를 배양한 후, 칵테일을 제거하고 1차 T 화합물/세포 혼합물를 추가하기 전에 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다.
화합물/세포 혼합물을 자극용 플레이트로 옮겨 18시간 동안 37℃(5% CO2)에서 배양하였다. 세포를 자극한 후, 각 웰(well)에서 ~150 ㎕의 상층액을96-well 필터 플레이트(Corning PVDF Filter Plates)에 옮겨 회전(2000rpm, 2-3분) 시킨 후 ELISA 또는 LUMINEX로 즉시 정량하거나, 나중에 사용하기 위해 -80℃로 냉동시켰다.
제조업체의 설명에 따라 Quantikine Human IL-2 ELISA kit (R&D Systems, Catalog# D2050)를 이용하여 IL-2 ELISA를 수행하고, 분광광도계로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시료 값을 빼고 표준 곡선을 기준으로 흡광도를 pg/mL로 변환하였다.
TNF, IL-2, GMSCF, IL-4 및 IFNg 에 대한 Luminex면역분석 다중화를 제조업체의 설명에 따라 본질적으로 수행하였다(Upstate Biotechnology). 본질적으로 50uL의 시료를 분석 희석제 50uL 및 배양 완충액 50uL으로 희석한 후, 희석한 1차 항체(detection antibody) 100uL로 1시간 동안 실온의 암실에서 배양하였다. 필터 플레이트를 세척 완충액으로 2회 세척하고 희석된 2차 시약(SAV-RPE) 100uL로 30분 동안 실온의 암실에서 배양하였다. 마지막으로, 플레이트를 3회 세척하고 Luminex 기구로 비드 동정 및 RPE 형광을 측정하였다.
각 화합물의 T 세포 활성 IC50 억제 작용을 확인하기 위한 용도로 여러 농도의 화합물을 부형제와 비교하였다. 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 대표적인 IC50은 표11에 나타나 있다.
7.18.6 B세포 활성을 억제하는 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물
7.18.6.1 설명
형광 세포 분리기(FACS: fluorescence activated cell sorter)를 이용한 1차 B세포에 대한 세포 표면 표식인자 분석으로 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 B-세포 활성 억제 능력을 보여 주었다. B-세포 수용체(BCR)의 자극으로 발생한 1차 B-세포 활성의 억제 작용은 세포 표면 표식인자 CD69의 상향조절을 정량화하여 측정되었다.
7.18.6.2 1차 B-세포의 분리
1차 인간 B 세포는 항응고처리된 혈액을 원심분리했을 때 적혈구와 혈소판 사이에 형성되는 백혈구인 백혈구연층(buffy coat)에서 분리하거나 신선혈액에서 CD19-Dynal(R) 비드 및 FAC로 분리하였다. 백혈구연층은 Stanford Medical School Blood Centre가 제공하였으며, 이는 동일한 날짜에 혈액은행에서 제조, 보관 및 저온상태로 우송(얼음처리)한 것이다. 백혈구연층(약 35mL)을500mL의 위생 원심분리기 용기에 넣어 얼음으로 온도를 낮춘 후, 0.2% BSA(Sigma: A7638) 및 구연산나트륨(0.1%, Sigma: S-5570)(P-B-C)을 포함하는 저온의 PBS로 희석(총부피 200mL)하고 서서히 혼합하였다. 기증자의 신선혈액을 헤파린을 포함하는 10mL의 진공채혈관에 수집했다(진공채혈관 용량: 약 8.5mL). 혈액 온도를 얼음으로 낮춘 후, 50mL의 활콘관(20mL/tube) 또는 500mL의 위생 원심분리기 용기에 옮겨 동량 P-B-C로 희석하였다.
25mL의 희석한 혈액 또는 백혈구연층을 15mL의 저온 ficoll층 위에 쌓고 용기를 다시 얼음에 묻었다. ficall층 위에 쌓은 혈액층을 45분 동안 2000 rpm, 4°C에서 원심분리(Beckman GS-6R)시켜 적혈구(RBC) 및 과립구로부터 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리시켰다. 최상단의 수용층을 흡입하여 PBMC층보다 1인치 높은 지점에 도달하도록 하였다. PBMC가 들어있는 모든 ficoll 튜브를 2개씩 통합하여 각각 멸균된 50mL falcon 튜브(약 10mL/tube) 1개로 옮겼다. 옮긴 PBMC를 0.2% BSA (P-B)를 포함하는 차가운 PBS로 5배 희석하고 20분 동안 1400rpm, 4°C에서 원심분리시켰다. 상층액(흐릴수 있음)을 흡입한 후, PMBC를 25 mL P-B로 재현탁하여 세포수를 측정(1.5 희석액 사용)하고 얼음에 묻어 놓았다.
제조업체 설명에 따라 자석 비드(Dynal(R)) 와 짝지어진 anti-CD19 항체를 사용하여 양성 세포를 선택하였다. CD19-Dynal(R) 비드CD19-coated dyna beads M-450 (pabB), Dynal(R)) 필요량의 근사치는 PBMC의 5%를 측정한 값에 비드 스탁(4x108 beads/mL)의 세포당 약 10개의 비드를 더해 추정한 B 세포수로 계산하였다. CD19-Dynal(R) 비드를 Dynal(R) 자석을 사용하여 P-B로 2회 세척한 후, 현탁 PBMC에 추가하였다. 이 혼합물을 Dynal(R) 자석에 통과시킨 후 여러 번 세척하여 비드에 결합된 세포를 분리하였다.
7.18.6.3 B 세포 활성 억제를 위한 화합물 선별
분리한 다음 Dynal(R) CD19-DETACHaBEAD(R)를 사용하여 45분 동안 30°C에서 비드와 항체를 제거하였다. 일반적으로 백혈구연층 당 2X107 B 세포를 채취할 수 있다. B 세포를 세척하고 RPMI1640+10%FBS+ 페니실린/스트렙타비딘 + 1 ng/mL IFN8에서 1E6 cells/mL가 되도록 재현탁하였다. 세포를 하룻밤동안 37°C, 5% CO2에서 방치해 두었다.
그 다음날, 세포를 세척하고 RPMI+2.5% FBS에서 1X106 cells/mL로 재현탁하였다. 세포를 V-bottom 96-well plate(Corning)의 각 웰 당 65uL 세포가 되도록 분취하였다. 로봇(robot)으로 최종 농도 0.2% DMSO로 처리한 세포에 65uL의 2x 화합물을 첨가하였다. 세포를 Jackson Laboratories(최종 5ug/mL)에서 24시간 동안 20uL 7.5x α-IgM로 자극하였다. 3일째, 세포를 원심분리하고 CD69로 표식하기 위해 착색한 후, 생체세포의 광산란을 FACS(유세포 분석법)으로 분석하였다.
각 화합물의 B 세포 활성 IC50 억제 작용을 결정하기 위해 여러 농도의 화합물을 부형제와 비교하였다. 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 대표적인 IC50은 표11에 나타나 있다.
7.18.7 대식세포 활성을 억제하는 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물
7.18.7.1 설명
분화된 대식세포의 활성을 억제하는 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 효능을, 자극받은 대식세포로부터 방출된 사이토카인을 양을 측정하여 나타내었다. IgG 또는 LPS 자극을 받아 종양괴사인자 알파(TNF) 및 인터루킨 6(IL-6)을 방출한 양을 정량화하였다.
7.18.7.2 인간 대식세포의 정제 및 배양
단핵세포 분리 키트(Miltenyi biotec #130-045-501)를 제조업체의 설명에 따라 사용하여, CD14+ 단핵세포를 PBMC (Allcells # PB002)로부터 정제하였다. 유세포 분류기(flow cytometry)로 CD14+ 세포의 백분율을 측정하여 순도를 얻었다. 일반적으로 90% 이상의 순도를 얻을 수 있다. 정제된 CD14+ 세포를 M-CSF(Pepro Tech #300-25) 100mg/ml로 대식세포-SFM(Gibco #12065-074)에 분주(15mls 배지에 6x106 세포/150cm TC 접시)하고 5일간 분화시켰다. 이 기간의 마지막에, 세포 형태학 및 세포 표면 표식인자(CD14, HLA-DR, B7.1, B7.2, CD64, CD32 및 CD16)는 성숙한 분화된 대식세포의 존재를 나타냈다.
7.18.7.3 IgG에 의한 자극
Immulon 4HBX 96 well 플레이트(VWR #62402-959)를10ug/well, 4℃에서 하루밤 동안 또는370C에서 한시간 동안 혼합 인간 IgG(Jackson Immunoresearch lab#009-000-003)으로 도포하였다. 배경 자극을 검정하기 위해 F(ab')2 단편이 함유된 음성 대조도 도포하였다. 결합되지 않은 항체는 2X의 200ul PBS로 씻어 제거했다. 각 웰에 5X의 20ul 화합물이 추가되었고, 이후 플레이트에서 건져낸 15k 세포수의 80uL 대식세포를 추가하였다. 세포를 37°C에서 16시간동안 배양하고, 위에서 1차 T-세포로 설명한 IL-6 및 TNF의 Luminex 분석을 위해 상층액을 수집하였다.
7.18.7.4 LPS에 의한 자극
LPS로 자극하기 위해 10X 저장 용액 10uL를, 사전 배양된 세포화합물의 혼합물에 최종 농도가 10 ng/mL이 되도록 추가하였다. 그 다음, 세포를 37°C에서 16시간동안 배양하고 상층액을 위에 설명한 것과 같이 분석하였다.
각 사이토카인에 대한 각 화합물의 IC50를 확인하기 위해 다양한 농도의 화합물을 부형제와 비교하였다. 본 발명 2,4-피리미딘디아민 화합물의 대표적인 IC50은 표11에 나타나 있다.
이해를 돕기 위해 상기 발명에 대한 설명을 상세히 하였지만, 다음에 나오는 특허 청구항들의 범위 내에서의 변경이나 수정을 실행할 수 있음은 분명하다. 따라서 명시된 구체적인 내용은 제한적이 아닌 사례로 간주해야 하며, 본 발명은 여기서 명시된 세부사항에 제한되지 않으며 다음의 특허 청구항 및 동일 내용의 범위 내에서 수정할 수 있다.
본 출원에서 인용된 모든 문헌과 특허 참조들은 참조 자료로서 모든 목적을 위한 출원서에 포함된다.
1. 관련 용도에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 다음 출원의 혜택을 주장한다. 2002년 7월 29일 접수한 출원번호 60/399,673; 2003년 1월 31일 접수한 출원번호 60/443,949; 2003년 3월 6일 접수한 출원번호 60/452,339.
2. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 2,4-피리미딘디아민 화합물, 이 화합물을 구성하는 약품 성분, 이 화합물의 중간체와 그 합성 방법, 그리고 다양한 환경에서 이 화합물과 성분을 자가면역질환 및(또는) 관련 증상의 치료 및 예방에 사용하는 방법에 관한 것이다.
3. 발명의 배경
IgE (FcεRI)에 대한 고친화성 수용체 및/또는 IgG (FcγRI)에 대한 고친화성 수용체와 같은 Fc 수용체들의 교차 결합은 비만 세포, 호염기구 및 다른 면역 세포들에 대한 신호전달 순차반응(signaling cascade)을 활성화 시킴으로써 여러 부작용의 요인이 되는 화학 매개물질을 방출하도록 한다. 예를 들어, 이러한 교차 결합에 의해 과립에 저장되어 있던 히스타민과 같은 제1형(즉시형) 아니필락시형 과민 반응의 사전 형성된 매개물질이 방출된다. 또한, 염증 반응에서 중요한 역할을 하는 류코트리엔, 프로스타글란딘, 혈소판 활성화 인자(PAF) 등의 다른 매개물질의 합성과 방출도 초래한다. Fc 수용체의 교차 결합에 의해 합성되어 방출되는 다른 매개물질에는 사이토카인과 산화 질소가 포함된다.
FcεRI 및/또는 FcγRI와 같이 교차 결합하는 Fc 수용체에 의해 활성화되는 신호전달 순차반응(signaling cascade)은 세포성 단백질의 배열로 이루어진다. 가장 중요한 세포 내 신호 증식자에는 티로신 키나제가 포함된다. 그리고 FcεRI 및/또는 FcγRI 수용체의 교차 결합과 연관 있는 신호전달경로, 그리고 그 밖의 신호전달체계(signal transduction cascade)에 관여하는 중요한 티로신 키나제는 Syk 키나제이다 (참고: Valent 등, 2002, Intl. J. Hematol. 75(4):257-362).
FcεRI와 FcγRI 수용체의 교차 결합의 결과로 방출되는 매개물질은 다수의 부작용을 발생시키는 원인 또는 중요한 역할을 하기 때문에, 이러한 방출에 책임이 있는 신호 전달 순차반응을 억제할 수 있는 화합물을 제공하는 것은 매우 바람직할 것이다. 더욱이, 이와 그 밖의 수용체 신호전달 순차반응에 관여하는 Syk 키나제의 중요한 역할 때문에 Syk 키나제에 대한 억제 기능이 있는 화합물의 이용도 또한 매우 바람직할 것이다.

Claims (48)

  1. 자가면역질환을 앓고 있거나 자가면역 증상이 나타날 위험이 있는 피험자에게 효과적인 양으로 다음 구조식 (I) 2,4-피리미딘디아민 화합물 및 이들의 염, 수화물, 용매화합물 및 질소산화물을 투여하는 절차를 포함하는 자가면역질환 및/또는 이와 관련된 하나 이상의 증상의 치료 또는 예방 방법으로,
    여기서, 상기식의 L1과 L2은 각각 직접 결합과 연결자(linker)로 구성된 군에서 선택되며;
    R2 는 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되며;
    R4 는 수소, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C3-C8) 시클로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 시클로헥실, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C15) 아릴, R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐 및 탄소수 5-15인 헤테로아릴로 이루어진 그룹에서 선택되며;
    R5는 R6 , R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C6) 알킬, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C1-C4) 알카닐, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알케닐 및 R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C2-C4) 알키닐로 이루어진 그룹에서 선택되며;
    각 R6 는 수소, 전기음전성 그룹, -ORd, -SRd, (C1-C3) 할로알킬옥시, (C1-C3) 퍼할로알킬옥시, -NRcRc, 할로겐, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 퍼할로알킬, -CF3, -CH2CF3, -CF2CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, -N3, -S(O)Rd, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc; -S(O)2NRcRc, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)NRc Rc, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRc Rc, -C(NH)NRcRc, -OC(O)Rd, -SC(O)Rd, -OC(O)ORd, -SC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -SC(O)NRcR c, -OC(NH)NRcRc, -SC(NH)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NHC(O)]nNRc Rc 및 -[NHC(NH)]nNRcRc, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C5-C10) 아릴, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 페닐, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 (C6-C16) 아릴알킬, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 5-10인 헤테로아릴, R8과 동일하거나 다른 알킬기 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 탄소수 6-16인 헤테로아릴알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되며;
    R8 은 Ra, Rb, Ra 또는 Rb와 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 Ra, Ra 또는 Rb와 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 치환된 -ORa, -B(ORa)2, -B(NRcRc)2, -(CH2)m-R b, -(CHR2)m-Rb, -O-(CH2)m-Rb , -S-(CH2)m-Rb, -O-CHRaRb, -O-CRa(Rb)2, -O-(CHR2) m-Rb, -O- (CH2)m-CH[(CH2)mRb ]Rb, -S-(CHRa)m-Rb, -C(O)NH-(CH2)m-Rb, -C(O)NH-(CHRa)m-Rb, -O-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -S-(CH2) m-C(O)NH-(CH2)m-Rb, -O-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa )m-Rb, -S-(CHRa)m-C(O)NH-(CHRa)m -Rb, -NH-(CH2)m-Rb, -NH-(CHRa)m-Rb, -NH[(CH 2)mRb], -N[(CH2)mRb]2, -NH-C(O)-NH-(CH2)m-Rb, -NH-C(O)-(CH2)m-CHRbRb 및 -NH-(CH2)m-C(O)-NH-(CH2) m-Rb 로 구성된 그룹에서 선택되며;
    각 Ra는 수소, (C1-C6) 알킬, (C3-C8) 시클로알킬, 시클로헥실, (C4-C11) 시클로알킬알킬, (C5-C10) 아릴, 페닐, (C6-C16) 아릴알킬, 벤질, 탄소수 2-6 인 헤테로알킬, 탄소수 3-8인 시클로헤테로알킬, 모폴리닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 피페리디닐, 탄소수 4-11인 시크로헤테로알킬알킬, 탄소수 5-10인 헤티로아릴 및 탄소수 6-16인 헤테로아릴알킬로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되며;
    각 Rb는 O, -ORd, (C1-C3) 할로알킬옥시, =S, -SRd, =NRd, =NOR d, -NRcRc, 할로겐, -CF3, -CN, -NC, -OCN, -SCN, -NO, -NO2, =N2, -N3, -S(O)R d, -S(O)2Rd, -S(O)2ORd, -S(O)NRcRc, -S(O)2NRcR c, -OS(O)Rd, -OS(O)2Rd, -OS(O)2ORd, -OS(O)2NRcRc, -C(O)Rd, -C(O)ORd, -C(O)NRcRc, -C(NH)NRcRc , -C(NRa)NRcRc, -C(NOH)Ra, -C(NOH)NRcR c, -OC(O)Rd, -OC(O)ORd, -OC(O)NRcRc, -OC(NH)NRcR c, -OC(NRa)NRcRc, -[NHC(O)]nRd, -[NRaC(O)]nRd, -[NHC(O)]nORd, -[NRaC(O)] nORd, -[NHC(O)]nNRcRc, -[NRaC(O)] nNRcRc, -[NHC(NH)]nNRcRc 및 -[NRaC(NRa)] nNRcRc로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된 적당한 기이며;
    각 Rc은 독립적으로 보호기이거나 Ra, 또는 다른 방식으로, 각 Rc는 동일하거나 다른 추가 헤테로원자들 중에서 한 개 이상을 선택적으로 포함시킬 수 있고 동일하거나 다른 Ra 또는 적당한 Rb 그룹 중에서 한 개 이상을 선택적으로 치환할 수 있는 탄소수 5-8인 시클로헤테로알킬 또는 헤테로아릴을 형성하기 위해 결합한 질소 원자와 결합하며;
    각 Rd는 독립적으로 Ra이며;
    각 m은 독립적으로 1부터 3까지의 정수이며;
    각 n은 독립적으로 0과 3 사이의 정수이고, 조건은 다음과 같다:
    (1) L1이 직접 결합이고 R6이 수소인 경우, R2는 3,4,5-트리(C1-C6) 알콕시페닐이 아니다.
    (2) L1 과 L2 이 각각 직접 결합이며, R2가 치환된 페닐, R6이 수소인 경우, R이 수소 또는 (C1-C6) 알킬일때 R5 은 시아노 또는 -C(O)NHR이 아니다.
    (3) L1 과 L2 이 각각 직접 결합, R2 과 R4 이 각각 독립적으로 치환되었거나 비치환 피롤 또는 인돌인 경우, R2 과 R4 은 고리 탄소 원자를 통해 분자 나머지 부분과 결합한다.
    (4) 본 화합물은 다음 구조식에 따른 화합물이 아니다.
    여기서, Re가 (C1-C6) 알킬, Rf와 Rg가 각각 독립적으로 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상과 선택적으로 치환된 직쇄 또는 가지 달린 (C1-C6) 알킬인 경우이고 R8은 상기 정의한 바와 같다.
  2. 제 1항에 있어서, L1과L2이 각각 독립적으로 직접 결합, R9 과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상으로 선택적으로 치환된 (C1-C3) 알킬디일 및 R9 과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개 또는 그 이상으로 선택적으로 치환된 탄소수 1-3인 헤테로알킬디일로 구성된 그룹에서 선택되는 방법으로,
    여기서, R9 은 (C1-C3) 알킬, -ORa, -C(O)ORa, 할로겐과 동일하거나 같은 그룹 중 선택적으로 치환된 (C5-C10) 아릴, 할로겐과 동일하거나 같은 그룹 중 선택적으로 치환된 페닐, 할로겐과 동일하거나 같은 그룹 중 선택적으로 치환된 탄소수 5-10인 헤테로아릴 및 할로겐과 동일하거나 같은 그룹 중 선택적으로 치환된 탄소수 6인 헤테로아릴로 구성된 그룹에서 선택되며,
    Ra 은 제 1항에 정의되어 있다.
  3. 제 2항에 있어서, L1과L2 을 각각 독립적 R9 그룹과 선택적으로 단가 치환될 수 있는 메타노, 에타노 및 프로파노로 이루어진 그룹에서 선택하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, R9이 -ORa, -C(O)ORa, 할로페닐 및 4-할로페닐로 구성된 그룹에서 선택하는 방법(Ra 은 청구항 1에 정의되어 있음).
  5. 제 1항에 있어서, R6이 수소인 방법
  6. 제 1항 혹은 제 5항에 있어서, R5를 할로, -F, -CN, -NO2, -C(O)Ra, -C(O)ORa, -C(O)CF3, -C(O)OCF3, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 퍼할로알킬 (C1-C3) 할로알콕시, (C1-C3) 퍼할로알콕시, -OCF3 및 -CF3R5으로 구성된 그룹에서 선택하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, L1 또는 L2가운데 적어도 하나가 직접 결합인 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 2,4-피리미딘디아민 화합물이 구조식 (Ia)에 따른 화합물
    그리고 이들의 염, 수화물, 및 용매화합물인 방법으로, 여기서 R2, R4, R5 및 R6은 제 1항에 정의된 바와 같다.
  9. 제 8항에 있어서, R2를 R8과 동일하거나 다른 그룹 중에 한 개 또는 그 이상과 각각 선택적으로 치환된 페닐, 나프틸, 탄소수 5-10인 헤테로아릴, 벤조디옥산일, 1,4-벤조디옥산-(5 또는 6)-일, 벤조디옥솔일, 1,3-벤조디옥솔-(4 또는 5)-일, 벤족사지닐, 1,4-벤족사진-(5,6,7 또는 8)-일, 벤족사졸일, 1,3-벤족사졸-(4,5,6 또는 7)-일, 벤조피라닐, 벤조피란-(5,6,7 또는 8)-일, 벤조트리아졸일, 벤조트라졸-(4,5,6 또는 7)-일, 1,4-벤족사지닐2-온, 1,4-벤족사진-(5,6,7 또는 8)-일-2-온, 2H-1,4-벤족사지닐-3(4H)-온, 2H-1,4-벤족사진-(5,6,7 또는 8)-일-3(4H)-온, 2H-1,3-벤족사지닐-2,4(3H)-디온, 2H-1,3-벤족사진-(5,6,7 또는 8)-일-2,4(3H)-디온, 벤족사졸일-2-온, 벤족사졸-(4,5,6 또는 7)-일-2-온, 디히드로쿠마리닐, 디히드로쿠마린-(5,6,7 또는 8)-일, 1,2-벤조피로닐, 1,2-벤조피론-(5,6,7 또는 8)-일, 벤조푸라닐, 벤조푸란-(4,5,6 또는 7)-일, 벤조[b]푸라닐, 벤조[b]푸란-(4,5,6 또는 7)-일, 인돌일, 인돌-(4,5,6 또는 7)-일, 피롤 및 피롤-(1 또는 2)-일로 이루어진 그룹에서 선택하는 방법(R8은 제 1항에서 정의한 바와 같음).
  10. 제 8항에 있어서, R2 및(또는) R4을 다음으로 구성된 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택하여 선택적으로 치환된 헤테로아릴인 방법:
    여기서
    p는 1에서 3까지의 정수이다;
    - - -는 각각 독립적으로 단일 결합이나 이중 결합을 나타낸다;
    R35는 수소 또는 R8이고 R8은 제 1항에 이미 정의되어 있다;
    X는 CH, N 및 N-O로서 구성된 그룹에서 선택된다;
    각 Y는 O, S 및 NH로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다;
    각 Y1는 O, S, SO, SO2, SONR36, NH 및 NR37로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다;
    각 Y2는 CH, CH2, O, S, N, NH 및 NR37으로써 구성된 그룹에서 독립적으로 선택된다;
    R36은 수소 또는 알킬이다;
    R37 은 수소와 프로그룹으로 이루어진 그룹에서 선택되며, 바람직하게는 수소 또는 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, Ra, Rb-CRaRb-O-C(O)R 8, -CRaRb-O-PO(OR8)2, -CH2-O-PO(OR8) 2, -CH2-PO(OR8)2, -C(O)-CRaRb-N(CH 3)2, -CRaRb-O-C(O)-CRaRb-N(CH3)2, -C(O)R 8, -C(O)CF3 및 -C(O)-NR8-C(O)R8 으로 이루어진 그룹에서 선택되는 프로그룹이다;
    R38은 알킬과 아릴로 구성된 그룹에서 선택된다;
    A는 O, NH 및 NR38로 구성된 그룹에서 선택된다;
    R9, R10, R11 및 R12는 알킬, 알콕시, 할로겐, 할로알콕시, 아미노알콕시 및 하이드로알콕시로 구성된 그룹에서 각각 서로 독립적으로 선택되거나 또는 R9및 R10 그리고/또는 R11 및 R12는 케탈에서 선택된다;
    각 Z는 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 에스테르, 카밤산염 및 술포닐로 구성된 그룹에서 각각 선택된다;
    Q는 -OH, OR8, -NRcRc, -NHR39-C(O)R8, -NHR39 -C(O)OR8, -NR39-CHR40-Rb, -NR39-(CH2)m-Rb 및 -NR39-C(O)-CHR40-NR cRc로 구성된 그룹에서 선택된다;
    R39과 R40는 수소, 알킬, 아릴, 알킬아릴, 아릴알킬 및 NHR8로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택된다;
    Ra, Rb 및 Rc는 제 1항에 이미 정의되어 있다.
  11. 제 10항에 있어서, R2과 R4이 동일한 방법.
  12. 제 10항 혹은 제 11항에 있어서, R35가 Rd, -NRcRc, -(CH2 )m-NRcRc, -C(O)NRcRc, -(CH2)m-C(O)NRcRc, -C(O)ORd, -(CH2) m-C(O)ORd 및 -(CH2)m-ORd로 이루어진 그룹에서 독립적으로 선택되는 방법(m, Rc 및 Rd은 제 1항에서 정의한 바와 같음).
  13. 제 12항에 있어서, 각 m이 1인 방법.
  14. 제 8항에 있어서, R2가 고리 탄소 원자로 분자 나머지와 결합한, 선택적으로 치환된 헤테로아릴인 방법.
  15. 제 8항에 있어서, R4가 고리 탄소 원자로 분자 나머지와 결합한, 선택적으로 치환된 헤테로아릴인 방법.
  16. 제 8항에 있어서, R2 및(또는) R4이 각각, 독립적으로 R8 그룹 중 한 개, 두 개 또는 세 개와 선택적으로 치환된 페닐인 방법(R8은 제 1항에서 정의한 바와 같음).
  17. 제 16항에 있어서, R2과 R4이 각각 동일하거나 다른 그룹에서 선택적으로 치환된 페닐인 방법.
  18. 제 16항 혹은 제 17항에 있어서, 선택적으로 치환된 페닐이 단일치환된 방법.
  19. 제 18항에 있어서, R8 치환기가 오쏘, 메타, 파라 위치에 있는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, R8이 (C1-C10) 알킬, (C1-C10) 가지달린 알킬, -ORd, -O-(CH2)m-NRcRc, -O-C(O)NRcRc, -O-(CH 2)m-C(O)NRcRc, -O-C(O)ORa, -O-(CH2) m-C(O)ORa, -O-C(NH)NRcRc, -O-(CH2)m-C(NH)NRcRc, -NH-(CH2)m-NRcRc, -NH-C(O)NRcRc 및 -NH-(CH2)m-C(O)NRcRc로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법(m, Ra, Rc 및 Rd 는 제 1항에서 정의한 바와 같음).
  21. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 선택적으로 치환된 페닐이 이중치환된 페닐인 방법.
  22. 제 21항에 있어서, R8 치환기가 2,3-; 2,4-; 2,5-; 2,6-; 3,4- 또는 3,5- 위치에 있는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, R8이 (C1-C10) 알킬, (C1-C10) 가지달린 알킬, Ra 또는 Rb 와 동일하거나 다른 그룹 중에서 한 개 또는 그 이상으로 선택적으로 치환된 -ORa, -O-(CH2)m-NRcRc, -O-C(O)NRcRc, -O-(CH 2)m-C(O)NRcRc, -O-C(O)ORa, -O-(CH2) m-C(O)ORa, -O-C(NH)NRcRc, -O-(CH2)m-C(NH)NRcRc, -NH-(CH2)m-NRcRc, -NH-C(O)NRcRc 및 -NH-(CH2)m-C(O)NRcRc로 이루어진 그룹에서 독립적으로 선택되는 방법(m, Ra, Rb 및 Rc 은 청구항 1에서 정의한 바와 같음).
  24. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 선택적으로 치환된 페닐이 삼중치환된 페닐인 방법.
  25. 제 24항에 있어서, R8 치환기가 2,3,4; 2,3,5; 2,3,6; 2,4,5; 2,4,6; 2,5,6; 또는 3,4,5 위치에 있는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, R8이 (C1-C10) 알킬, (C1-C10) 가지달린 알킬, Ra 또는 Rb 와 동일하거나 다른 그룹 중에서 한 개 또는 그 이상으로 선택적으로 치환된 -ORa, --O-(CH2)m-NRcRc, -O-C(O)NRcRc, -O-(CH 2)m-C(O)NRcRc, -O-C(O)ORa, -O-C(NH)NRc Rc, -O-(CH2)m-C(O)ORa, -O-(CH2)m-C(NH)NRc Rc, -NH-(CH2)m-NRcRc, -NH-C(O)NRc Rc 및 -NH-(CH2)m-C(O)NRcRc로 이루어진 그룹에서 독립적으로 선택되는 방법(m, Ra, Rb 및 Rc 는 제 1항에서 정의한 바와 같음).
  27. 제 24항에 있어서, 삼중치환된 페닐이 다음과 같은 화학식인 방법으로:
    여기서, R31은 메틸 또는 (C1-C6) 알킬, R32는 수소, 메틸 또는 (C1-C6) 알킬; 그리고 R33은 할로기이다.
  28. 제 17항에 있어서, R2과 R4이 동일한 방법.
  29. 제 8항에 있어서, 구조식 (Ib) 및
    이들의 염, 수화물, 용매화합물 및 질소산화물에 따른 방법으로, 여기서 R11, R12, R13 및 R14가 각각, 독립적으로 수소, 히드록시, (C1-C6) 알콕시 및 -NRcRc로 이루어진 그룹에서 선택되며, R5, R6 및 Rc는 제 1항에서 정의한 바와 같다.
  30. 제 29항에 있어서, R11, R12, R13 및R14가 각각 수소인 방법.
  31. 제 29항에 있어서, R12 과 R13이 각각 수소인 방법.
  32. 제 8항에 있어서, 2,4-피리미딘디아민 화합물이 구조식 (Ic)에 따른 화합물 그리고
    이들의 염, 수화물, 용매화합물 및 질소산화물인 방법으로,
    여기서, R4는 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개에서 세 개로 선택적으로 치환되는 페닐이거나 R8과 동일하거나 다른 그룹 중 한 개에서 네 개로 선택적으로 치환되는 탄소수 5-14인 헤테로아릴이며;
    R5은 전기 음성 그룹, R 또는 CF3이며;.
    R18은 -O(CH2)m-Rb이며, m과 Rb는 제 1항에서 정의된 바와 같다.
  33. 제 32항에 있어서, R4가 선택적으로 치환되는 헤테로아릴인 방법.
  34. 제 32항에 있어서, R18이 -O-CH2-C(O)-NHCH3인 방법.
  35. 제 1항에 있어서, 2,4-피리미딘디아민 화합물이 구조식 (Id)에 따른 화합물 및
    이들의 염, 수화물, 용매화합물 및 질소산화물인 방법으로,
    여기서, R2와 R4는 제 1항에 정의한 바와 같으며,
    R15는 전기 음성 그룹이며,
    그 조건은 다음과 같다:
    (1) R2가 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시페닐이고 R15가 할로겐인 경우, R4는 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시페닐이 아니며;
    (2) R2가 치환된 페닐 그룹인 경우, R15는 시아노 또는 -C(O)NHR가 아닌 그룹이고 여기서 R은 수소 또는 (C1-C6) 알킬이다.
  36. 제 37항에 있어서, R15가 할로겐 또는 니트로인 경우, R2는 3,4,5-트리 (C1-C6) 알콕시페닐이 아닌 방법.
  37. 제 38항에 있어서, R15가 CN, -NC, -NO2, 할로겐, -F, (C1-C3) 할로알킬, (C1-C3) 퍼할로알킬, (C1-C3) 플루오로알킬, (C1-C3) 퍼플루오로알킬, -CF3, (C1-C3) 할로알콕시, (C1-C3) 퍼할로알콕시, (C1-C3) 플루오로알콕시, (C1-C3) 퍼플루오로알콕시 및 -OCF3로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  38. 제 39항에 있어서, R15가 할로, Br, F, -CF3 및 -NO2로 이루어진 그룹에서 선택되는 방법.
  39. 제 1항에 있어서, 2,4-피리미딘디아민 화합물이 R921302, R926891, R940323, R940347 및 R921303 화합물로 구성된 구룹에서 선택되는 방법.
  40. 제 1-39항의 하나에 있어서, 해당 화합물이 그 화합물과 의약적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 첨가제를 포함하는 의약적 조성물의 형태로 투여되는 방법.
  41. 제 1-39항의 하나에 있어서, 치료 목적으로 실시되는 방법.
  42. 제 1-39항의 하나에 있어서, 치료 대상이 인간인 방법.
  43. 제 1-39항의 하나에 있어서, 자가 면역 질환이 대개 단일 기관 또는 단일 세포형 자가면역장애 및 전신성 자가면역장애를 일으키는 자가면역질환들로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 자가면역질환이 하시모토 갑상선염, 자가면역성 용혈성 빈혈, 악성 빈혈과 관련된 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 뇌척수염, 자가면역성 고환염, 굳패스처(Goodpasture) 질환, 자가면역성 혈소판 감소증, 교감성 안결막염, 중증근무력증, 그레이브스(Graves) 병, 일차성 담즙성 간경변, 만성공격성 간염, 궤양성 대장염 및 막성 사구체병증으로 구성된 그룹에서 선택되는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 자가면역질환을 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 라이트 중후군, 다발성 근염/피부염, 전신성 경화증, 다발동맥염, 다발성경화증 및 유전포창을 포함하는 그룹에서 선택되는 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 자가면역질환이 전신성 홍반성 루푸스인 방법.
  47. 제 45항에 있어서, 자가면역질환이 류마티스성 관절염인 방법.
  48. 제 45항에 있어서, 자가면역질환이 다발성 경화증인 방법.
KR1020057001685A 2002-07-29 2003-07-29 2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료및 예방 방법 KR101297924B1 (ko)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39967302P 2002-07-29 2002-07-29
US60/399,673 2002-07-29
US44394903P 2003-01-31 2003-01-31
US60/443,949 2003-01-31
US45233903P 2003-03-06 2003-03-06
US60/452,339 2003-03-06
PCT/US2003/024087 WO2004014382A1 (en) 2002-07-29 2003-07-29 Methods of treating or preventing autoimmune diseases with 2,4-pyrimidinediamine compounds
US10/631,029 2003-07-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050046714A true KR20050046714A (ko) 2005-05-18
KR101297924B1 KR101297924B1 (ko) 2013-08-20

Family

ID=51751655

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057001685A KR101297924B1 (ko) 2002-07-29 2003-07-29 2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료및 예방 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101297924B1 (ko)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9523675D0 (en) * 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
GB9828511D0 (en) * 1998-12-24 1999-02-17 Zeneca Ltd Chemical compounds
EP1165545A1 (en) * 1999-03-26 2002-01-02 AstraZeneca AB Novel compounds
EP1246823A1 (en) * 1999-12-28 2002-10-09 Pharmacopeia, Inc. Pyrimidine and triazine kinase inhibitors

Also Published As

Publication number Publication date
KR101297924B1 (ko) 2013-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101201603B1 (ko) 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한2,4-피리미딘디아민 화합물
EP1534286B1 (en) Methods of treating or preventing autoimmune diseases with 2,4-pyrimidinediamine compounds
JP5095409B2 (ja) スピロ２，４−ピリミジンジアミン化合物およびその使用
US7550460B2 (en) 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
JP2005516046A5 (ko)
KR101297924B1 (ko) 2,4-피리미딘디아민 화합물을 이용한 자가면역질환의 치료및 예방 방법
RU2376992C2 (ru) Способы лечения или профилактики аутоиммунных заболеваний с помощью соединений 2,4-пиримидиндиамина
EP2316459A1 (en) Methods of treating or preventing autoimmune diseases with 2,4-pyrimidinediamine compounds

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
E902 Notification of reason for refusal
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160803

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170821

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180801

Year of fee payment: 6