KR20050026488A - 리간드의 동정 방법 - Google Patents

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디오니시오스 렌트제페리스
호세인 아스카리
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Abstract

본 발명은 일반적으로 단백질-단백질 상호작용을 조정하는 리간드를 동정하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 조직 선택적인 방식으로 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 기초하여, 보조 조절자 의존적 표적 분자의 작동제 또는 길항제를 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

리간드의 동정 방법{METHOD FOR THE IDENTIFICATION OF LIGANDS}
본 출원은 미국 가출원 제60/398,023호(2002. 7. 24 제출), 및 제60/413,866호 및 제60/413,843호(둘 다 2002. 9. 27 제출)에 우선권의 이익을 주장한 것으로, 본 명세서에 그 전체로 참조 문헌으로 포함되어 있다.
본 발명은 일반적으로 리간드나 알로스테릭 조절자에 의해 그 친화도가 조정되는 단백질-단백질 상호작용에 대해 리간드를 동정하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 보조 조절자(coregulator)가 존재하는 경우 수용체의 안정성을 변화시키는 리간드의 능력에 기초한, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
신호 전달과 유전자 발현에서 중심적인 테마는 단백질-단백질 모듈 도메인들의 구성적이거나 유도적인 상호작용이다. 이들 상호작용을 강화시킬 수 있는 리간드에 대한 지식은 생물학적 현상을 일으키는 분자적 메카니즘의 특징과 질병 치료에 대한 치료학적 접근법의 개발에 대한 정보를 제공해 줄 것이다. 현존하는 리간드의 동정 방법은 성가신 일이며, 특히 기능이 알려지지 않은 단백질의 경우에는 이 방법이 제한된다.
핵 수용체는 생식, 성장 분화 및 지질 및 당 항상성을 비롯한 세포 기능을 통제하는 전사 인자의 슈퍼패밀리의 멤버들이다. 이들의 기능은 여러 셋트의 리간드들(생체이물, 호르몬, 지질 및 기타 공지된 리간드 및 밝혀지지 않은 리간드)에 의해 조절된다. 현재까지 48개의 핵 수용체가 동정되었으며, 이 중 28개는 공지된 리간드이고, 나머지 20개는 고아(orphan)로 분리되었다. 수용체의 생물학은 복잡하며, 조직 특이적이고(Shang & Brown, Science 295: 2465-2468, 2002), 작용의 분자 메카니즘은 보조 조절자로 언급되는 악세사리 단백질을 우선적으로 모집하는 기능(리간드 비의존적 또는 의존적 방식으로 이들 수용체의 기능을 조정함)을 하는 것으로 여겨진다. 적절한 보조 조절자의 모집은 유전자 전사나 억제를 초래할 수 있다.
판베라(Panvera)는 에스트로겐 수용체 서브타입 베타에 대한 길항제 리간드로부터 작동제를 구별하는 시약을 제공하며, 보조 활성자(coactivator) 단백질을 우선적으로 모집하는 것에 대한 데이타를 공개하였다. 예컨대, [Bolger 등, Environmental Health Perspectives 106: 1-7 (1998)] 및 [산 디에고에서 2002년 6월에 열린 고아 수용체 미팅(Orphan Receptor Meeting)에서 발표된 판베라사의 발표 자료]를 참조하라. 판베라의 시약은 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 기초한 분석법에서 사용된다.
FRET에 기초한 다른 핵 수용체들(ER-α, ERR 및 PPAR 패밀리)에 대한 유사한 분석법도 출판되었다. 예컨대, [Zhou 등, Molecular Endocrinology 12: 1594-1604 (1998)] 및 [Coward 등, 98: 8880-8884, (2001)]을 참조하라. 유사한 실험들이 비아코어(Biacore) 기술을 사용하여 수행되었다. 예컨대, [Cheskis 등, J. Biological Chemistry 11384-11391 (1997)] 및 [Wong 등, Biochemistry 40: 6756- 6765 (2001)]을 참조하라.
세포 분석법은 유전자 발현이 판독되어야 존재한다. 예컨대, [Camp 등, Diabetes 49: 539-547 (2001)] 및 [Kraichely 등, Endocrinology, 141: 3534-3545, (2000)]을 참조하라. 예컨대, 카로-바이오(Karo-Bio)는 핵 호르몬 수용체에 대한 길항제 리간드로부터 작동제를 구별하는 형태 민감성 펩티드 프로브를 포함하는 유전자 발현 판독 분석법을 개발하였다. 예컨대, [Paige 등, PNAS 96: 3999-4004 (1999)] 및 [산 디에고에서 2002년 6월에 열린 고아 수용체 미팅에서 발표된 카로-바이오의 발표 자료]를 참조하라.
[Greenfield 등, Biochemistry 40: 6446-6652 (2001)]은 에스트라디올의 존재시 ER-α수용체의 열 안정성에 대해 보고한다. 그러나, 이 문헌은 ER-α수용체의 작동제나 길항제인 분자의 동정에 대해서는 밝히고 있지 않다.
전술된 선행 기술들은 여러 결점을 가지고 있다, 예컨대, 핵 수용체 분석법, 유전자 발현 판독 분석법 및 세포에 기초한 분석법들의 경우, 신호 전달 또는 유전자 활성/억제 분석법 판독을 낼 수 있는 다른 단백질을 통해서가 아니라, 동정된 리간드나 보조 조절자가 흥미있는 수용체와 직접 상호작용하는지를 확인하기 위한 역스크리닝이 요구된다. 덧붙여, 세포 판독 기술은 약한 리간드를 동정하는 민감도가 낮으며(전형적으로 1 μM 이하의 친화도를 갖는 화합물은 거의 검출되지 않음), 뛰어난 세포 투과성 프로파일을 갖는 화합물에 대해서만 적용 가능하다. 다른 상업적인 시험관내 분석법들은 경쟁적 치환 분석법을 위한 리간드에 대한 지식이 필요하며, FRET에 기초한 보조 조절자 분석법을 확인하는 수단으로서 리간드의 사용을 필요로 한다.
따라서, 보조 조절자 의존적 수용체에 대한 리간드를 신속하고 고처리량으로 동정하는 것을 용이하게 하고, 보조 조절자가 존재하는 경우 이들의 효과에 대한 추가적 동정을 용이하게 하는(특히 조직 선택적 방식이나 유전자 선택적 방식으로) 정확하고 신뢰성 높은 기술이 요구된다.
도 1은 보조 활성자의 존재시 작동제 리간드의 동정에 대해 예측되는 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 보조 활성자의 존재시 길항제 리간드의 동정에 대해 예측되는 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 ER-α리간드의 존재시 보조 활성자 단백질인 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3에 대한 결합 상수, Ka를 나타낸다.
도 4는 ER-β리간드의 존재시 보조 활성자 단백질인 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3에 대한 결합 상수, Ka를 나타낸다.
도 5는 부분적 작동제의 동정에 대해 예측되는 실험 결과를 나타낸다.
도 6A는 PPAR-γ리간드의 부존재 및 존재시 보조 활성자 펩티드 SRC-2-NR2에 대한 계산된 결합 상수를 나타낸다.
도 6B는 PPAR-γ리간드의 부존재 및 존재시 보조 억제자 펩티드 NCoR-1에 대한 계산된 결합 상수를 나타낸다.
도 6C는 도 6A 및 6B의 보조 활성자 및 보조 억제자 펩티드에 대한 계산된 친화도의 비를 나타낸다.
본 발명의 개요
본 발명은 1개 이상의 이러한 요구들을 충족시킨다. 본 발명은 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 셋트의 리간드 및 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 것은 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내 주어, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정해준다.
본 발명은 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 다른 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 셋트의 리간드 및 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트는 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내 주어, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정해준다.
본 발명의 장점은 유전자 발현 판독 및 세포에 기초한 분석법이나 분석을 수행하도록 알려진 리간드의 사용이 요구되지 않는다는 것이다. 이러한 직접적 방식으로 정보를 산출하는 능력은 치료적 가정을 시험하고 고아 수용체를 판독하기 위한 소정의 성질을 갖는 약물의 발견을 가능케한다.
하나의 단일화된 분석법에서 분리된 및/또는 정제된 단백질 및 펩티드를 사용함으로써, 단백질-단백질 상호작용을 조정하는데 포함된 리간드를 동정하고, 생물학적 반응을 예측할 수 있다. 리간드를 동정할 뿐만 아니라, 표적 단백질에 대한 본질적 친화도 또한 계산할 수 있으며, 이를 생물학적 활성과 관련시키는데 사용할 수 있다. 산출된 정보를 또한 약물의 약리학 및 조직 특이성을 예측하거나 결정하고, 고아 수용체에 대한 리간드를 동정하는 데 사용할 수 있으며, 즉 이를 치료적 가설을 시험하는 이들 단백질의 생물학을 평가하는 도구로서 사용할 수 있다. 더욱 상세하게, 본 발명은 흥미있는 조직에 따라 작동제 및 길항제인 조직 선택적 약물의 발견을 유전자 선택적 약물의 발견과 함께 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 산출된 데이타는 표적 분자(예, 단백질)의 융점의 변화가 흥미있는 단백질에 대한 고분자와 리간드의 결합 에너지의 열역학적 연계의 직접적 결과이므로, 역 스크리닝을 요구하지 않는다. 더욱이, 리간드의 표적 분자에 대한 친화도는 보다 민감하다(pM 내지 mM의 친화도가 측정됨). 게다가, 본 발명은 낮은 세포 투과성을 갖는 화합물로 제한되지 않는다. 또한, 전술한 바와 같이, 본 발명은 분석을 수행하기 위해 공지된 리간드를 요구하지 않으므로, 고아 수용체의 평가를 매우 효과적이도록 해준다.
본 발명의 추가적 특징 및 장점을 첨부된 도면을 참고로 하여 이하 보다 상세히 서술한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
이하 설명에서, 생화학 및 약리학 분야의 당업자에게 알려진 다양한 용어 및 방법론을 참조할 것이다. 이러한 알려진 용어 및 방법론을 설명하는 출판물 및 기타 재료들은 상세히 설명되었음에도 불구하고 그 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
본 발명의 구체예에서, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 분자에 기초하여, 언폴딩이 가능한 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법을 제공한다. 표적 분자의 안정성을 변화시키는 리간드는 표적 분자 및 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 표적 분자의 안정성이 추가로 변화되는지 여부는 조직 특이적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타낸다. 이 정보에 기초하여, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성이 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 열 변화로 인한 표적 분자의 언폴딩을 포함하는 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법을 제공한다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 리간드는 표적 분자 및 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선이 추가로 쉬프트되는 것은 조직 특이적 보조 조절자가 존재하는 경우, 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타낸다. 이 정보에 기초하여, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성이 결정될 수 있다.
표적 분자에 대한 리간드의 "조직 특이성" 또는 "조직 선택성"이라는 용어는 특정 조직에서 리간드가 표적 분자에 영향을 주는 것, 예컨대, 특정 조직에서 리간드가 표적 분자의 작동제로 또는 길항제로 작용하는지 여부를 나타낸다. 리간드의 특정 분자에 대한 영향은 예컨대, 흥미있는 조직에 존재하여 발현되는 보조 조절자의 존재, 성질 및 수치에 의해 조절될 수 있다.
용어 "표적 분자"는 펩티드, 단백질, 핵산 및 기타 수용체를 포함한다. 이 용어는 효소 및 효소가 아닌 단백질을 포함한다. 이 용어는 단량체 및 다량체 단백질을 포함한다. 다량체 단백질은 호모머이거나 헤테로머일 수 있따. 이 용어는 2개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 예컨대, 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 핵산은 단일 가닥, 이중 가닥 또는 삼중 가닥일 수 있다. 이 용어는 합성 올리고뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자의 일부분, 염색체 DNA의 일부분인 핵산을 포함한다.
용어 "표적 분자"는 또한 폴딩, 코일링 또는 트위스팅에 의해 2차, 3차, 또는 4차 구조를 획득할 수 있는 펩티드, 단백질 및 기타 수용체의 일부분을 포함한다.
이 표적 분자는 보조 인자, 보조 효소, 보결 분자단, 지질, 올리고당 또는 인산기를 포함하나 이로 제한되지 않는 치환기로 치환될 수 있다. 용어 "표적 분자"와 "수용체"는 동의어이다.
더욱 상세하게, 본 발명에 사용되는 표적 분자는 보조 조절자 의존적이다. "보조 조절자 의존적"이란 표적 분자가 1개 이상의 리간드 및 1개 이상의 보조 조절자에 결합할 수 있음을 의미한다. 더욱이, 표적 분자의 활성은 리간드 의존적 또는 비의존적 기능인지간에, 적어도 부분적으로는 보조 조절자에 의존적이다. 보조 조절자 의존적 표적 분자에는 핵 수용체가 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
핵 수용체, 및 이와 관련된 보조 조절자의 역할은 [Aranda and Pascual, Physiological Reviews 81: 1269-1304 (2001); Collingwood 등, Journal of Molecular Endocrinology 23: 255-275 (1999); Robyr 등, Molecular Endocrinology 23: 329-347 (2000); 및 Lee 등, Cellular and Molecular Life Sciences 58: 289-297(2001)]에 서술되어 있으며, 그 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
추가적으로, 보조 조절자 의존적 표적 분자는 척추동물(인간을 포함하나 이로 제한되지 않음) 및 비척추동물(곤충을 포함하나, 이로 제한되지 않음)을 포함한다.
상세하게, 곤충은 리간드가 작동제 또는 길항제로 동정될 수 있는 수백개의 핵 수용체들을 포함한다. 척추동물, 선충류 및 절지동물에 존재하는 핵 수용체에 관해 서술하는 [Laudet, J. Molecular Endocrinology 19: 207-226 (1997) 및 Maglich 등, Genome Biology 2: 1-7 (2001)]를 참고하며, 이 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
용어 "단백질"은 전체 길이 또는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 용어 "펩티드"는 단백질 단편, 합성 또는 펩티드 라이브러리에서 유래된 것들을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"과 "폴리펩티드"는 동의어이다.
용어 "보조 조절자"는 리간드 의존적 또는 비의존적 방식으로 표적 분자를 조정하는 DNA와 RNA와 같은 핵산, 및 펩티드를 포함하나, 이로 제한되지 않는 어떠한 구조의 화학 화합물을 나타낸다. 이 용어는 천연, 합성 및 가상 분자를 나타낸다. 더욱 상세하게, 이 용어는 리간드 의존적 또는 비의존적 방식으로 표적 분자를 조정하는 펩티드 또는 폴리펩티드/단백질, 천연 또는 합성을 나타낸다. 이 용어는 천연 서열 또는 파아지 디스플레이 라이브러리에서 유래된 펩티드를 포함한다. 이 펩티드는 본래 단백질의 단편일 수 있다. 더욱 상세하게, 이 용어는 보조 활성자 및 보조 억제자(corepressor)를 나타낸다.
용어 "보조 활성자"는 표적 분자에 결합하여, 표적 분자의 활성화를 초래하거나 표적 분자의 활성을 증가시키는 분자를 나타낸다. 본 발명의 구체예에서, 이 용어는 표적 분자에 결합하여, 유전자 전사를 유도하거나 신호 기능(예, 신호 전달)을 유도하는 분자를 나타낸다.
용어 "보조 억제자"는 표적 분자에 결합하여, 표적 분자의 역활성화를 초래하거나 표적 분자의 활성을 감소시키는 분자를 나타낸다. 본 발명의 구체예에서, 이 용어는 표적 분자에 결합하여, 유전자 전사를 억제하거나 신호 기능(예, 신호 전달)을 억제하는 분자를 나타낸다.
용어 "작동제"는 표적 분자에 결합하여, 표적 분자에 결합하게 하기 위해 보조 활성자를 유도하거나 모집하는 분자를 나타낸다.
본 발명의 구체예에서, 용어 "작동제"는 핵 수용체에 결합하여 보조 활성자를 모집하는 분자를 나타낸다. 이 구체예에서, 이 용어는 보다 상세하게는 보조 활성자와의 직접적 상호작용을 촉진하는 핵 수용체에서의 형태 변화를 유도함으로써 유전자 발현을 변화시키는 분자를 나타낸다.
용어 "길항제"는 표적 분자에 결합하여, 표적 분자에 결합하게 하기 위해 보조 억제자를 유도하거나 모집하는 분자를 나타낸다.
본 발명의 구체예에서, 용어 "길항제"는 핵 수용체에 결합하여 보조 억제자를 모집하는 분자를 나타낸다. 이 구체예에서, 이 용어는 보다 상세하게는 보조 억제자와의 직접적 상호작용을 촉진하는 핵 수용체에서의 형태 변화를 유도함으로써 유전자 발현을 변화시키는 분자를 나타낸다.
용어 "부분적 작동제"는 표적 분자에 결합하여, 표적 분자에 결합하게 하기 위해 보조 활성자와 보조 억제자를 유도하거나 모집하는 능력을 가지는 분자를 나타낸다. 이 용어는 보조 억제자 보다 보조 활성자를 보다 강하게 모집할 수 있는 분자, 보조 억제자와 동일한 친화도를 갖는 보조 활성자를 모집할 수 있는 분자, 및/또는 보조 활성자 보다 보조 억제자를 더욱 강하게 모집할 수 있는 분자를 포함함을 이해해야 한다. 부분적 작동의 개념은 이하 보다 자세히 서술한다.
용어 "리간드"는 부가적인 화합물(예, 보조 조절자)의 존재 또는 부존재하에 표적 분자에 결합하는지 시험되는 화합물을 나타낸다. 이 용어는 핵산(예,DNA 및 RNA) 및 펩티드를 포함하나, 이로 제한되지 않는 어떠한 구조를 갖는 화학 화합물을 포함한다. 이 용어는 천연, 합성 및 가상 분자를 나타낸다. 이 용어는 화합물 라이브러리 또는 조합 라이브러리의 화합물을 포함한다. 용어 "리간드"와 "분자"는 동의어이다.
용어 "조직 선택적 보조 조절자" 또는 "조직 특이적 보조 조절자"는 표적 분자와 상호작용할 수 있는 다른 조직에 걸쳐 우선적으로 또는 선택적으로 특정 조직에서 발현되거나 존재하는 보조 조절자를 나타낸다.
용어 "다수의 분자", "다수의 화합물" 또는 "다수의 용기"는 2개 이상의 분자, 화합물 또는 용기를 나타낸다.
용어 "기능"은 표적 분자(예, 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드)의 생물학적 기능을 나타낸다.
"열 언폴딩 곡선"은 단백질이나 핵산의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 온도의 함수로 플랏한 것이다.
용어 "결합한다" 및 "결합"은 2개 이상의 분자들 간의 상호작용을 나타낸다. 더욱 상세하게, 이 용어는 리간드와 표적 분자 간의, 또는 보조 조절자와 표적 분자 간의, 또는 리간드, 표적 분자와 보조 조절자 간의 비공유 결합과 같은 상호작용을 나타낸다.
용어 "안정성의 변화"는 어떠한 리간드의 부재하에 표적 단백질의 물리적 변화와 동일한 정도의 변화를 초래하는 데 요구되는, 압력의 양, 열의 양, 세정제의 농도, 또는 변성제의 농도에 비교하여, 1개 이상의 리간드가 결합한 표적 단백질에서 주어진 정도의 물리적 변화를 초래하는 데 요구되는, 압력의 양, 열의 양, 세정제의 농도, 또는 변성제의 농도에 있어서의 변화를 나타낸다. 안정성의 변화는 안정성의 증가 또는 감소로 나타날 수 있다. 리간드에 의한 표적 분자의 안정성의 변화는 리간드가 표적 분자에 결합하는 것을 나타낸다.
용어 "안정성의 추가 변화"는 표적 분자와 1개 이상의 부가적인 분자의 안정성을 변화한다고 알려진 분자가 존재하는 경우, 표적 분자의 안정성의 부가적인 변화를 나타낸다. 보다 상세하게, 1개 이상의 부가적인 분자는 보조 조절자일 수 있다.
용어 "언폴딩"은 아미노산 측면 사슬의 결정 순서, 2차, 3차 또는 4차 단백질 구조와 같은, 구조의 소실을 나타낸다. 단백질과 같은 표적 분자는 변성제(예, 우레아, 구아니디니엄 히드로클로라이드 또는 구아니디니엄 티오숙시니네이트), 세정제로 처리함으로써, 표적 분자를 압력으로 처리함으로써, 표적 분자를 가열함으로써, 또는 어떠한 기타 적절한 변화에 의해 언폴딩될 수 있다.
용어 "물리적 변화"는 빛이나 열의 형태인 에너지의 방출, 빛이나 열의 형태인 에너지의 흡착, 탁도의 변화, 및 빛의 극성의 변화를 포함한다. 상세하게, 이 용어는 형광 방출, 형광 에너지 전이, 자외선이나 가시광선의 흡착, 적외선 흡광법이나 다른 흡광법에 의해 측정가능한 변화, 빛의 편광성의 변화, 형광 방출의 편광성의 변화, 시간에 따른 형광성의 변화 속도의 변화(즉, 형광성 수명), 형광 비등방성의 변화, 형광 공명 에너지 전이의 변화, 탁도의 변화, 및 효소 활성의 변화를 나타낸다. 바람직하게 이 용어는 형광성을 나타내며, 더욱 바람직하게 형광 방출을 나타낸다. 형광 방출은 단백질에 본질적인 것이거나, 형광 레포터 분자로 인한 것일 수 있다. 단백질 언폴딩을 모니터링하는 형광 기술의 사용은 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, [Eftink, M. R., Biophysical J. 66: 482-501 (1994)]를 참조하라.
"언폴딩 곡선"은 단백질의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 온도, 변성제 농도 및 압력과 같은 변수들의 함수로 플랏한 것이다.
용어 "열 안정성의 변화"는 어떠한 리간드의 부재하에 표적 단백질의 물리적 변화와 동일한 정도의 변화를 초래하는 데 요구되는 열 에너지의 양에 비교하여, 1개 이상의 리간드가 결합한 표적 단백질에서 주어진 정도의 물리적 변화를 초래하는 데 요구되는 열 에너지의 양에 있어서의 변화를 나타낸다. 열 안정성의 변화는 열 안정성의 증가 또는 감소로 나타날 수 있다. 리간드에 의한 표적 분자의 열 안정성의 변화는 리간드가 표적 분자에 결합하는 것을 나타낸다.
용어 "열 언폴딩 곡선에서의 쉬프트"는 리간드의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에 비교하여, 리간드에 결합하는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 쉬프트를 나타낸다.
용어 "열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트"는 표적 분자와 1개 이상의 부가적인 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다고 알려진 분자가 존재하는 경우, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선의 부가적 쉬프트를 나타낸다. 더욱 상세하게, 1개 이상의 부가적인 분자는 보조 조절자일 수 있다.
용어 "표적 분자를 접촉"은 개괄적으로 용액내 표적 분자를 결합에 대해 스크리닝되는 분자와 함께 두는 것을 나타낸다. 덜 개괄적으로, 접촉은 결합에 대해 스크리닝되는 분자와 표적 분자의 용액을 턴닝, 스월링, 쉐이킹 또는 바이브레이팅하는 것을 나타낸다. 보다 상세하게, 접촉은 표적 분자를 결합을 시험하기 위한 분자와 혼합하는 것을 나타낸다. 혼합은 예컨대, 피펫 팁을 통해 빨아내고 빨아들이는 것을 반복하여 수행될 수 있다. 바람직하게, 접촉은 표적 단백질과 결합을 시험하기 위한 분자 간의 결합의 평형을 나타낸다. 접촉은 용기에서 일어나거나 또는 스크리닝되는 분자와 표적 분자를 용기에 두기 이전에 일어날 수 있다.
용어 "용기"는 결합에 대해 시험될 분자와 수용체가 위치할 수 있는 어떠한 그릇 또는 챔버를 나타낸다. 용어 "용기"는 반응 튜브(예, 시험 튜브, 마이크로튜브, 바이알, 큐벳 등)를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 용어 "용기"는 멀티웰 마이크로플레이트나 마이크로타이터 플레이트의 웰을 나타낸다.
본 발명의 구체예에서, 표적 분자에 결합하는 리간드는 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 용어 "스크리닝"은 일반적으로 변성이나 언폴딩될 수 있는 표적 분자에 결합하는 능력에 대해 분자나 화합물을 시험하는 것을 나타낸다. 스크리닝 과정은 반복적 또는 되풀이되는 공정일 수 있으며, 분자는 언폴딩 분석에서 단백질에 결합하는지 시험된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 구체예에 따라, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성은 표적 분자의 안정성의 변화에 기초하여 동정될 수 있다. 표적 분자의 안정성을 변화시키는 리간드는 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
구체예에서, 스크리닝을 수행하기 위해, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 1개 이상의 리간드(예, 한 셋트의 리간드)는 다수의 용기 각각에서 표적 분자와 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자와 접촉할 수 있다. 그 후, 용기 각각에서 표적 분자를 처리하여 표적 분자를 언폴딩할 수 있다. 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정할 수 있다. 그 후, 용기 각각에 대한 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출할 수 있다. 각각의 언폴딩 곡선을 (1) 다른 언폴딩 곡선의 각각 및/또는 (2) (i) 셋트의 분자 중 어떤 것 및/또는 (ii) 보조 조절자의 부재하에 표적 분자의 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다.
산출된 데이타에 기초하여, 스크리닝된 리간드가 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타낸다. 표적 분자의 안정성의 추가 변화는 표적 분자의 얼 폴딩 곡선에서의 추가 변화로 나타난다.
본 발명의 다른 구체예에서, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 특이성을 표적 분자의 열 안정성을 변화시키는, 더욱 상세하게는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 분자를 분석하여 결정할 수 있다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 리간드를 1개 이상의 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 스크리닝은 다수의 용기 각각에서 표적 분자를 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자로 쉬프트하는 1개 이상의 리간드(예, 한 셋트의 리간드)와 접촉함으로써 수행할 수 있다. 다수의 용기를 가열할 수 있으며, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선과 연관된 물리적 변화를 온도의 함수로 용기 각각에 대해 측정할 수 있다. 그 후, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로 산출할 수 있다. 산출된 열 언폴딩 곡선을 (1) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각 및/또는 (2) (i) 셋트의 분자 중 어떤 것 및/또는 (ii) 보조 조절자의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다.
스크리닝 방법의 구체예에서, 용기를 온도의 범위에 걸쳐 틈틈히 가열할 수 있다. 다수의 용기를 자발적으로 가열할 수 있다. 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 각각의 가열 간격 이후 측정할 수 있다. 이 방법의 선택적 구체예에서, 용기를 연속적 방식으로 가열할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 표적 분자에 대한 언폴딩 곡선을 산출하면서, 열 언폴딩 곡선은 용기 각각에서의 표적 분자에 대해 온도의 함수로 플랏할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 열 언폴딩 곡선의 비교는 각각의 언폴딩 곡선의 중앙 온도, Tm을 비교함으로써 수행할 수 있다. "중앙 온도, Tm"은 열 언폴딩 곡선의 온도 중앙이다. Tm은 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 예컨대, [Weber, P. C. 등, J. Am. Chem. Soc. 116: 2717-2724 (1994); 및 Clegg, R. M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 2994-2998 (1993)]를 참조하라.
예컨대, 각각의 열 언폴딩 곡선의 Tm을 동정하고, 용기에서 (1) 다른 열 언폴딩 곡선 및/또는 (2) (i) 셋트의 분자 중 어떤 것 및/또는 (ii) 보조 조절자의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에 대해 얻어진 Tm과 비교할 수 있다.
선택적으로 또는 부가적으로, 전체 열 언폴딩 곡선은 유사하게 컴퓨터 분석 도구를 사용하여 다른 전체적인 열 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다. 예컨대, 각각의 전체 열 언폴딩 곡선은 용기에서 (1) 다른 열 언폴딩 곡선 및/또는 (2) (i) 셋트의 분자 중 어떤 것 및/또는 (ii) 보조 조절자의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다.
산출된 데이타에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 어떤 것이 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 변화시키는지 여부를 결정할 수 있으며, 이는 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 분자가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타낸다. 이러한 방법으로, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정할 수 있다.
리간드가 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트, 및/또는 추가로 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트 및/또는 추가로 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하지 않는 방법과 구별되며, 이에는 예컨대, 단백질 분해에 대한 민감성 분석, 단백질에 의한 표면 결합, 단백질에 의한 항체 결합, 단백질의 분자 샤페론 결합, 고정화된 리간드에 차별적 결합, 및 단백질 집합화가 있다. 이러한 분석법은 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제5,585,277호; 및 미국 특허 제5,679,582호를 참조하라. 미국 특허 제5,585,277호 및 제5,679,582호에 공개된 접근법들은 결합이 시험될 분자의 존재 및 부존재하에 단백질의 폴딩 및/또는 언폴딩의 정도를 비교하는 단계를 포함한다. 이들 접근법들은 표적 분자에 결합한 리간드 중 어떤 것이 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하지 않는다.
전술한 바와 같이, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 리간드를 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 예컨대, 표적 분자의 안정성을 변화한다고 알려진 리간드를 한 패널의 동정된 표적 분자의 조직 선택적 보조 조절자(보조 활성자 및/또는 보조 억제자를 포함)에 대해 스크리닝할 수 있다. 편리를 위해, 표적 분자의 안정성을 변화한다고 알려진 리간드를 한 "셋트"의 분자로 나타낸다.
만약 셋트의 리간드 및 표적 분자의 조직 선택적 보조 활성자의 존재하에, 표적 분자의 안정성이 셋트의 리간드 단독 및 표적 분자에 비교하여 추가로 변화되었다면, 이는 조직 선택적 보조 활성자가 존재하는 경우 셋트의 리간드가 표적 분자의 작동제임을 나타낸다. 이러한 방법으로, 보조 활성자를 발현하는 조직에서 표적 분자에 대해 리간드는 작동제로 작용할 수 있음을 결정할 수 있다.
만약 셋트의 리간드 및 표적 분자의 조직 선택적 보조 억제자의 존재하에, 표적 분자의 안정성이 셋트의 리간드 단독 및 표적 분자에 비교하여 추가로 변화되었다면, 이는 조직 선택적 보조 억제자가 존재하는 경우 셋트의 리간드가 표적 분자의 길항제임을 나타낸다. 이러한 방법으로, 보조 억제자를 발현하는 조직에서 표적 분자에 대해 리간드는 길항제로 작용할 수 있음을 결정할 수 있다.
유사하게, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 리간드를 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 예컨대, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다고 알려진 리간드를 한 패널의 동정된 표적 분자에 대한 조직 특이적 보조 조절자(보조 활성자 및/또는 보조 억제자를 포함)에 대해 스크리닝할 수 있다. 편리를 위해, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다고 알려진 리간드를 한 "셋트"의 분자로 나타낸다.
만약 셋트의 리간드 및 표적 분자의 조직 선택적 보조 활성자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선이 셋트의 리간드 단독 및 표적 분자에 비교하여 추가로 쉬프트되었다면, 이는 조직 선택적 보조 활성자가 존재하는 경우 셋트의 리간드가 표적 분자의 작동제임을 나타낸다. 이러한 방법으로, 보조 활성자를 발현하는 조직에서 표적 분자에 대해 리간드는 작동제로 작용할 수 있음을 결정할 수 있다.
만약 셋트의 리간드 및 표적 분자의 조직 선택적 보조 억제자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선이 셋트의 리간드 단독 및 표적 분자에 비교하여 추가로 쉬프트되었다면, 이는 조직 선택적 보조 억제자가 존재하는 경우 셋트의 리간드가 표적 분자의 길항제임을 나타낸다. 이러한 방법으로, 보조 억제자를 발현하는 조직에서 표적 분자에 대해 리간드는 길항제로 작용할 수 있음을 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 표적 분자의 안정성의 추가 변화의 결여 및/또는 표적 분자의 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트의 결여에 기초하여, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법을 제공한다.
"표적 분자의 안정성의 추가 변화의 결여" 또는 "표적 분자의 안정성을 추가 변화시키지 않음"은 셋트의 리간드 및 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성의 추가적 변화가 하찮거나 없는 것을 의미한다(표적 분자 및 셋트의 리간드에 비교시).
"표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트의 결여" 또는 "표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서 추가 쉬프트하지 않음"은 셋트의 리간드 및 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선의 추가적 쉬프트가 하찮거나 없는 것을 의미한다(표적 분자 및 셋트의 리간드에 비교시).
본 발명의 구체예에서, 조직 선택적 보조 활성자가 존재하는 경우 표적 분자의 안정성의 추가 변화의 결여 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트의 결여에 기초하여, 리간드가 조직에서 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대해 길항제로 작용하는지 여부를 결정할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 리간드가 조직에서 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대해 작동제로 작용하는지 여부는 조직 선택적 보조 억제자가 존재하는 경우 표적 분자의 안정성의 추가 변화의 결여 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트의 결여에 기초하여, 결정할 수 있다.
1개 이상의 조직 선택적 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 1개 이상의 한 셋트의 리간드를 스크리닝함으로써, 조직에서 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대해 길항제로 작용하는 리간드를 동정할 수 있다. 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 데 영향을 주는 셋트의 리간드를 스크리닝하는 방법은 전술하였다. 만약 셋트의 리간드 및 조직 선택적 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키지 않는다면, 이는 보조 활성자를 발현하는 조직에서 이러한 셋트의 리간드가 표적 분자에 대해 길항제로 작용할 수 있음을 나타낸다.
1개 이상의 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 1개 이상의 한 셋트의 리간드를 스크리닝함으로써, 또한 길항제를 동정할 수 있다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 셋트의 리간드를 스크리닝하는 방법은 전술하였다. 만약 셋트의 리간드 및 조직 선택적 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 변화시키지 않는다면, 이는 보조 활성자를 발현하는 조직에서 이러한 셋트의 리간드가 표적 분자에 대해 길항제로 작용할 수 있음을 나타낸다.
1개 이상의 조직 선택적 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 1개 이상의 한 셋트의 리간드를 스크리닝함으로써, 조직에서 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대해 작동제로 작용하는 리간드를 동정할 수 있다. 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 데 영향을 주는 셋트의 리간드를 스크리닝하는 방법은 전술하였다. 만약 셋트의 분자 및 조직 선택적 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키지 않는다면, 이는 보조 억제자를 발현하는 조직에서 이러한 셋트의 리간드가 표적 분자에 대해 작동제로 작용할 수 있음을 나타낸다.
1개 이상의 조직 선택적 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 1개 이상의 한 셋트의 리간드를 스크리닝함으로써, 또한 작동제로 작용하는 리간드를 동정할 수 있다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 추가로 쉬프트하는 1개 이상의 셋트의 리간드를 스크리닝하는 방법은 전술하였다. 만약 셋트의 리간드 및 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하지 않는다면, 이는 보조 억제자를 발현하는 조직에서 이러한 셋트의 리간드가 표적 분자에 대해 작동제로 작용할 수 있음을 나타낸다.
보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하기 위해 본 발명을 사용하는 능력은 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 동정하는 본 발명의 능력에 기초한다.
예시적으로, 한 특정 조직, 예컨대, 조직 1은 특정 보조 조절자, 예컨대, 보조 조절자 1을 발현할 수 있다. 제2의 특정 조직, 예컨대, 조직 2는 보조 조절자 1을 발현하지 않거나, 이를 상이한, 즉 낮은 수치로 발현한다. 만약 리간드가 보조 조절자 1의 존재하에 본 발명의 방법에 의해 표적 분자의 작동제로 결정된다면, 보조 조절자 1이 실질적으로 조직 2에서가 아니라 조직 1에서 활성이 있기 때문에, 리간드는 조직 2가 아니라, 조직 1에서 표적 분자에 작동하리라 예측될 수 있다.
다른 예시에서, 한 특정 조직, 예컨대, 조직 3은 특정 보조 조절자, 예컨대, 보조 조절자 3을 발현할 수 있다. 다른 조직, 예컨대, 조직 4는 보조 조절자 3 및 다른 보조 조절자, 예컨대, 보조 조절자 4를 발현한다. 만약 리간드가 본 발명의 방법에 의해 보조 조절자 3의 존재하에 표적 분자의 작동제로, 보조 조절자 4의 존재하에 표적 분자의 길항제로 결정된다면, 리간드는 조직 3에서는 작동제로, 조직 4에서는 부분적 작동제로 작용하리라 예측될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하여 이들 예시의 다양한 조합이나 변형을 계획할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 방법을 일부 조직에서는 작동제이나, 다른 조직에서는 길항제인 리간드, 일부 조직에서는 부분적 작동제이나 다른 조직에서는 작동제인 리간드, 일부 조직에서는 길항제이나 다른 조직에서는 부분적 작동제인 리간드, 등을 결정하는 데 사용할 수 있다.
리간드의 생물학적 반응은 조직 특이적 방식으로 존재하는 특이적 보조 조절자에 의존할 수 있다. 리간드가 작동제, 길항제 또는 부분적 작동제인지의 결정은 적절한 3차 복합체의 형성(리간드, 표적 분자 및 보조 조절자)에 의존하며, 조직 특이적일 수 있다. 본 발명의 방법을 조직 선택적 방식으로 표적 분자에 대한 리간드의 영향을 동정하는 데(예, 작동제, 길항제 또는 부분적 작동제를 동정하는 데) 사용할 수 있다. 본 발명은 특정 조직에 대해 약물 유래 리간드의 생체내 효능, 즉, 흥미있는 조직에 따른 작동제와 길항제의 조직 선택적인 발견을 예측하는 데 특히 유용하다.
표적 분자의 안정성을 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다고 알려진 리간드를 제공하는 단계, 및 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 이러한 리간드를 스크리닝하는 단계에 기초한, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법은 전술하였다. 본 발명은 또한 리간드의 조직 선택성을 동정하기 위해 이러한 리간드를 제공하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 수용체에 결합하는 리간드가 알려지지 않은 고아 수용체에 대한 리간드를 동정하는 데 특히 유용하다.
표적 분자의 안정성을 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 리간드(상기, 편리를 위해 한 "셋트"로 언급함)는 다수의 상이한 분자를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 예컨대, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 리간드는 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 분자를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 유사하게, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 분자는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 분자를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 스크리닝될 수 있는 분자의 수는 약 천개 내지 백만개의 범위이다.
리간드의 조직 선택성을 결정하는 전술된 스크린닝 방법과 유사한 방법에 의해, 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝할 수 있다. 예컨대, 표적 분자를 다수의 용기 각각에서 1개 이상의 다수의 상이한 분자와 접촉할 수 있다. 다수의 용기 각각에서 표적 분자를 처리하여 표적 분자를 언폴딩할 수 있다. 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정할 수 있다. 용기 각각에 대해 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출할 수 있다. 이들 언폴딩 곡선의 각각을 (1) 다른 언폴딩 곡선의 각각 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 어떤 것의 부재하에 표적 분자의 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다.
산출된 데이타에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 어떤 것이 표적 분자의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정할 수 있다. 표적 분자의 안정성의 변화는 표적 분자의 언폴딩 곡선의 변화로 나타난다. 만약 분자가 표적 분자의 안정성을 변화시킨다면, 전술된 방법에 의해 표적 분자에 대한 이의 조직 선택성을 결정하도록 스크리닝할 수 있다.
유사하게, 조직 선택성을 결정하는 스크리닝 방법과 유사한 방법에 의해, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해 분자를 스크리닝할 수 있다. 예컨대, 표적 분자를 다수의 용기 각각에서 1개 이상의 다수의 상이한 분자와 접촉할 수 있다. 용기를 가열하고, 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 용기 각각에서 측정할 수 있다. 용기 각각에 대해 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로 산출할 수 있다.
이 열 언폴딩 곡선을 (1) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 어떤 것의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 각각의 열 언폴딩 곡선의 Tm을 확인하고, (1) 다른 열 언폴딩 곡선 및/또는 (2) 다수의 분자 중 어떤 것의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에 대해 얻어진 Tm과 비교할 수 있다. 선택적으로, 각각의 전체 열 언폴딩 곡선을 (1) 다른 열 언폴딩 곡선 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 어떤 것의 부재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선과 비교할 수 있다.
산출된 데이타에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 어떤 것이 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는지 여부를 결정할 수 있다. 만약 분자가 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다면, 전술된 방법에 의해 표적 분자에 대한 이의 조직 선택성을 결정하도록 스크리닝할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 수용체에 결합하는 리간드가 알려지지 않은 고아 수용체에 대한 리간드를 동정하는 데 특히 유용하다. 유사하게, 본 발명은 조직 선택적 방식으로 알려지지 않은 기능을 갖는 표적 분자의 작동제 및 길항제를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 구체예에서, 알려지지 않은 기능을 갖는 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공한다. 이 셋트의 리간드는 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 안정성을 변화시킨다. 표적 분자의 안정성을 변화시키는 셋트의 리간드는 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해, 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 안정성을 변화시키는 1개 이상의 패널의 분자를 스크리닝함으로써 제공될 수 있다. 이러한 한 셋트의 리간드를 제공하는 방법은 미국 특허 공개 제US 2001/0003648호에 보다 상세히 서술되어 있으며, 이는 그 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
셋트의 1개 이상의 리간드를 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 상세히 서술한 바와 같이, 셋트의 분자 및 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성의 추가 변화는 조직 선택적 방식으로 분자가 표적 분자에 대해 작동제로 또는 길항제로 작용하는지 여부를 나타낸다. 본 발명의 구체예는 또한 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키지 않는 것에 기초하여, 조직 선택적 방식으로 작동제 및 길항제 리간드를 동정하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 알려지지 않은 기능을 갖는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공한다. 이 셋트의 리간드는 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트한다. 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 셋트의 리간드는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해, 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 1개 이상의 패널의 분자를 스크리닝함으로써 제공될 수 있다. 이러한 한 셋트의 분자를 제공하는 방법은 미국 특허 공개 제US 2001/0003648호에 보다 상세히 서술되어 있다.
셋트의 1개 이상의 분자를 1개 이상의 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 상기 상세히 서술한 바와 같이, 셋트의 분자 및 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선의 추가 쉬프트는 조직 선택적 방식으로 분자가 표적 분자에 대해 작동제로 또는 길항제로 작용하는지 여부를 나타낸다. 본 발명의 구체예는 또한 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하지 않는 것에 기초하여, 조직 선택적 방식으로 작동제 및 길항제 리간드를 동정하는 것을 포함한다.
본 발명의 구체예에서, 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법은 리간드를 동정하고, 이러한 리간드가 보조 조절자 의존적 표적 분자의 조직 선택적 작동제이지 또는 길항제인지를 동정하는 데 특히 유용한 수단이다. 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법은 1개 이상의 분자가 표적 수용체의 열 안정성에 미치는 영향을 분석하는 직접적이고 정량적인 기술이다.
마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법의 이론, 개념 및 응용, 및 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법을 수행하는 데 유용한 기기는 미국 특허 제6,020,141호; 제6,036,920호; 제6,291,191호; 제6,268,218호; 제6,232,085호; 제6,268,158호; 제6,214,293호; 제6,291,192호; 및 제6,303,322호에 서술되어 있으며, 이는 그 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다. 이 참조 문헌에 서술된 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법을 전술된 스크리닝 방법을 수행하는 데 사용할 수 있다.
마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법은 리간드 결합 친화도에 대한 열역학적 판독을 제공한다. 이 분석법은 각각의 기능적으로 활성있는 표적 분자가 각각의 표적 분자에 대해 특징적이고 이의 안정화 에너지를 대표하는 온도에서 협동적으로 녹는 고도의 조직화된 구조라는 사실에 근거한다. 분자가 표적 분자에 결합하는 경우, 표적 분자는 리간드 결합 친화도에 비례하는 양으로 안정화되어, 중앙 온도를 더 높은 온도로 쉬프트한다.
열 쉬프트 분석법을 사용하면, 이 분석법이 결합을 모니터링하기 위해 방사활성 표지된 화합물이나 형광 표지 또는 기타 염색소성 표지를 필요로 하지 않기 때문에 많은 장점을 가진다. 이 분석법은 생체분자의 열 언폴딩, 전부는 아니지만, 많은 약물 표적 생체분자에 본질적인 일반적 물리 화학 반응의 장점을 가진다. 일반적 응용성은 이 분석법의 중요한 양태로, 이것이 매번 새로운 분석법을 발명할 필요를 제거해 주고, 새로운 치료적 수용체 단백질이 사용가능하게 된다.
추가적으로, 열 쉬프트 분석법의 사용은 Tm 및 리간드 결합 친화도에 비례하기 때문에, 10 마이크로몰 이상 내지 1 나노몰 이하 범위의 결합 친화도를 갖는 리간드가 단일 웰 실험에서 측정될 수 있다. 따라서, 열 쉬프트 분석법은 표적 분자 단독 존재시 및/또는 보조 조절자의 존재시 표적 분자에 대한 리간드 결합 친화도를 정량적으로 검출하는 데 사용될 수 있다.
추가적으로, 열 쉬프트 분석법은 리간드와 표적 분자, 및 리간드, 표적 분자와 보조 조절자 사이의 Tm의 변화에 기초한 정량적 기초 상에서, 조직 선택적 작동제 및 길항제(부분적 작동제는 물론)의 동정에 사용될 수 있다. 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법은 표적 분자의 융점의 추가적 또는 부가적 증가로 단일 표적 분자 상의 다중 리간드 결합을 측정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 리간드를 동정하고, 이러한 리간드가 조직 선택적 방식으로 핵 수용체에서 작동제 또는 길항제인지를 동정하는 데 특히 유용하다. 예컨대, 본 발명은 핵 수용체 리간드에 대한 결합 친화도를 결정하여 생체내 효율을 예측하고, 리간드가 작동제 또는 길항제인지를 구별하여 생물학적 반응을 예측하며, 고아 수용체에 대한 리간드를 동정하여 이들의 생물학적 기능을 밝히고, 보조 조절자의 우선적 모집을 분석함으로써 조직 특이성을 결정하는 데 사용될 수 있다.
예컨대, 본 발명은 에스트로겐 수용체 패밀리의 두 서브타입인 ER-α및 ER-β의 리간드 결합 도메인과 상호작용하는 리간드를 동정하는 데 사용될 수 있다. 이들 도메인은 2개의 알려진 결합 부위(하나는 에스트로겐 유사 화합물, 다른 하나는 보조 조절자 단백질)를 가진다. 본 발명은 에스트로겐 수용체와 상호작용하는 리간드를 동정하는 데 사용될 수 있다. 이들 리간드는 리간드의 본래 친화도에 비례하여 수용체의 안정성을 증가시킴이 관찰된다.
핵 수용체의 리간드 결합 도메인 및 보조 조절자 단백질을 표준 재조합 방법을 사용하여 대장균에서 발현시킬 수 있다. 보조 조절자 펩티드는 표준 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 흥미있는 정제된 단백질의 융점은 소분자 리간드의 부재 및 존재하에 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법에 의해 결정될 수 있다.
흥미있는 표적 분자를 안정화하는 분자를 제공한다. 이러한 소분자는 상기 언급한 바와 같은 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법에서 스크리닝하여 얻을 수 있다. 이 스크리닝에서 소분자의 수는 약 천개 내지 백만개의 범위일 수 있다. 소분자는 천연 또는 합성일 수 있다.
한편, 흥미있는 단백질을 안정화하는 한 셋트의 분자를 동정한 후, 이들 분자를 단백질이나 펩티드 단편과 같은 한 패널의 보조 조절자에 대해 스크리닝하여, 단백질의 열 안정성에 미치는 영향을 측정할 수 있다. 상승 효과가 관찰되는 경우, 화합물은 작동제 또는 길항제로 분류될 수 있다. 생물학적 반응에 관련된 평형 상수를 리간드와 보조 조절자 모두에 대해 계산한다.
고아 수용체에 대한 생물학적 기능을 평가하기 위해, 수단 화합물에 대해 속도 제한 단계를 산출하였다. 흥미있는 수용체를 한 패널의 화합물에 대해 스크리닝하고, 전술한 방법에 의해 흥미있는 수용체를 안정화하는 리간드를 동정할 수 있다. 리간드가 일단 동정되면, 동정된 리간드가 작동제 또는 길항제인지 여부를 결정하기 위해 전술한 방법으로 보조 조절자에 대해 스크리닝하며, 최고 반응을 내는 바람직한 보조 조절자를 동정할 수 있다.
흥미있는 수용체를 함유하는 세포주(예컨대, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 결정됨)를 동정된 리간드로 처리할 수 있다. 그 후, 리간드가 처리된 세포주는 DNA 칩으로 유전자 발현을 프로파일하고, 비처리된 세포주와 비교할 수 있다. 동정된 리간드가 작동제인 경우, 유전자의 수는 비처리된 세포주에 비교하여 상향 조절되리라 예측된다. 동정된 리간드가 길항제인 경우, 유전자의 수는 비처리된 세포주와 비교시 하향 조절되리라 예측된다. 일단 이러한 정보가 산출되면, 수용체의 생물학적 기능이 결정될 수 있다. 화학-정보 및 생물-정보를 조합한 이 정보는 또한 치료적 가설을 개발하고, 이들을 질병의 치료에 시험하는 데 도움을 줄 수 있다(예컨대, 이 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된, [Giguere, Endocrine Reviews 20: 689-725 (1999)]를 참조).
본 발명은 또한 유전자 특이성을 결정하기 위한 전술한 스크리닝 방법의 사용을 포함한다. "유전자 특이적", "유전자 특이성", "유전자 선택적" 또는 "유전자 선택성"은 표적 분자와 상호작용하고(예, 핵 수용체), 특정 유전자의 전사를 활성화하거나 억제하는 특이적 보조 조절자의 모집에 기초한, 특정 유전자의 발현이나 억제를 표적할 수 있는 것을 의미한다.
예컨대, 표적 분자의 안정성의 변화, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선의 쉬프트에 기초한, 보조 조절자 의존적 표적 분자의 작동제 또는 길항제를 동정하는 방법을 상기 상세히 서술한 바 있다. 예시적으로, 본 발명을 사용하여, 표적 분자의 안정성을 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 분자를 제공하고, 특정 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 셋트의 분자를 스크리닝함으로써, 특정 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 결정할 수 있다.
특정 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부의 동정에 기초하여, 표적 분자에 대한 리간드의 유전자 특이성을 결정할 수 있다. 예컨대, 특정 유전자, 예컨대, "유전자 A"는 표적 분자가 조직에 존재하거나 조직에서 발현되는 특정 보조 활성자, 예컨대, "보조 활성자 A"와 상호작용하는 경우 생산될 수 있다. 제2의 유전자, 예컨대, "유전자 B"는 표적 분자가 조직에 존재하거나 조직에서 발현되는 제2의 보조 활성자, 예컨대, "보조 활성자 B"와 상호작용하는 경우 생산될 수 있다.
만약 다른 것의 실질적 자극없이 유전자 A나 유전자 B 중 어느 하나의 생산만을 자극하기를 원한다면, 본 발명을 사용하여, 리간드가 보조 활성자 중 하나의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키고, 및/또는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하며, 다른 보조 활성자의 존재하에는 실질적으로 그러하지 않는지는 결정할 수 있다(및 이에 따라 리간드는 보조 활성자에 대한 작동제로 동정될 수 있다). 이러한 수단으로, 리간드가 특이적 유전자의 생산에 선택적으로 영향을 줄 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.
핵 수용체의 리간드 결합 도메인, 리간드 및 이 도메인과 상호작용하는 보조 조절자가 서술되었음에도, 본 발명은 부가적 조절자의 존재하에 및 최종적으로는 DNA의 존재하에, 전체 길이의 단백질로 확장될 수 있다.
추가적으로, 본 방법 및 데이타 분석에 대한 열역학적 원리를 친화도가 리간드나 알로스테릭 조절자에 의해 조절되는 어떠한 단백질-단백질 상호작용에 대해 사용할 수 있음은 역설되어야만 한다. 예에는 길항제 리간드에서 작동제를 구별하는 GPCR의 G-단백질과의 상호작용; SH2 도메인을 단백질 티로신 키나제의 인산화 형태에 회합시키는 것을 길항하는 화합물의 구별; 효소의 올리고머 상태에 영향을 줌으로써, PKA 홀로효소를 작동 또는 길항하는 화합물의 동정; NF-κB의 IκB에 대한 회합을 촉진 또는 저해하는 화합물의 구별; 또는 전사 인자의 올리고머화를 촉진 또는 저해하는 화합물의 구별이 있을 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 이러한 연구는 단백질-단백질 상호작용으로만 제한되는 것이 아니라, 펩티드가 흥미있는 단백질과 우선적으로 상호작용하는 짧은 선형 서열 대표 단백질 도메인을 나타내는 경우에는, 단백질-펩티드 상호작용에 대해서도 사용될 수 있다.
조직 특이성 및 부분적 작동에 대한 추가적 서술
유전자 활성화 또는 억제는 단일 조직으로 제한될 수 있다. 따라서, 보조 활성자와 보조 조절자의 패밀리 이내인지의 구별은 유전자 특이적 반응을 요구한다. 갈색 지방 조직에만 존재하는 커플링되지 않은 단백질-1(UCP1)의 전사가 이러한 예이며, 핵 수용체 PPAR-γ및 보조 활성자 PGC-1을 요구한다(Oberkofier H., 등, J. Biol. Chem. 277: 16750-16757 (2002)).
그러나, PPAR-γ에 의해 갈색 지방 조직에서 활성화되는 모든 유전자가 PGC-1을 통해 매개되는 것은 아니다(Puigserver, P. 등, Cell 92: 829-839 (1998); Wu 등, Cell 98: 115-124 (1999); Rosen E. D. 등, Genes & Devel., 14: 1293-1307 (2000)). 페록시좀의 맴버를 활성화하는 리간드, 증식자 활성화된 핵 수용체 패밀리(PPAR's)와 같이, 한 셋트의 유전자를 부분적으로 활성화하거나 억제하는 한 셋트의 핵 수용체 리간드가 존재하며, 이들을 부분적 작동제로 언급한다(Camp, H. S. 등, Diabetes 49: 539-547 (2000)).
부분적 작동의 분자적 기초는 명확히 이해되지는 않으나, 이하 3개의 메카니즘 중 하나로 설명할 수 있다: i) 리간드가 보조 활성자에 대한 감소된 친화도를 갖는 수용체의 형태 변화를 유도하거나, ii) 감소된 생물학적 반응을 초래하는 주어진 조직에서 특이적 보조 활성자의 부존재를 유도하거나, 또는 (iii) 리간드가 채워지거나 리간드가 없는 핵 수용체에 대해 경쟁하는 보조 활성자와 보조 저해자의 상대적 발현 수치를 유도한다. 그러므로, 핵 수용체 상에 리간드에 의해 유도된 생물학적 반응은 주어진 보조 조절자에 대한 조직 선택성의 정황 및 또한 주어진 조직에 존재하는 주어진 보조 활성자와 보조 억제자 단백질의 상대적 수치로 조절될 수 있다.
본 발명의 추가적 구체예
핵 수용체와 같은 수용체는 리간드의 부재시 생물학적 기능을 할 수 있다. 이 기능은 보조 조절자와 상호작용하는 능력에 따라 기능의 억제나 활성화일 수 있다.
리간드의 부재시 유전자 발현을 활성화하는 수용체는 보조 활성자 단백질과 상당한 친화도로 상호작용할 것이다. 이러한 수용체를 구조적으로 활성있다고 언급할 수 있다. 반대로, 리간드의 부재시 유전자 발현을 저해하는 수용체는 보조 억제자 단백질과 상당한 친화도로 상호작용할 것이다. 이러한 수용체를 억제자라고 언급한다.
본 발명의 방법을 사용함으로써, 한 패널의 보조 조절자의 부재하에 수용체를 스크리닝하여, 조직 특이적 방식으로 수용체의 천연 상태를 결정할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 방법을 사용하여, 리간드의 부재하에 수용체의 안정성을 변화시키고, 수용체의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해, 전술한 방법에 의해 한 패널의 보조 활성자 및/또는 보조 억제자를 스크리닝할 수 있다. 만약 보조 활성자가 존재하는 경우에 수용체의 안정성이 변화되거나 수용체의 열 언폴딩 곡선이 쉬프트된다면, 보조 활성자가 존재하는 경우 이 수용체가 구조적으로 활성이 있다고 결론내릴 수 있다. 만약 보조 억제자가 존재하는 경우에 수용체의 안정성이 변화되거나 수용체의 열 언폴딩 곡선이 쉬프트된다면, 보조 억제자가 존재하는 경우 이 수용체가 비리간드된 상태인 억제자라고 결론내릴 수 있다.
본 발명을 사용하여 조직 선택적 방식으로 수용체의 천연 상태를 결정하는 능력은 수용체의 안정성 또는 열 언폴딩 곡선이 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 영향을 받는지 여부를 동정하는 본 발명의 능력에 기초한다.
예시적으로, 한 특정 조직, 예컨대, 조직 1은 특정 보조 조절자, 예컨대, 보조 조절자 1을 발현할 수 있다. 제2의 특정 조직, 예컨대, 조직 2는 보조 조절자 1을 발현하지 않거나 이를 상이한 낮은 수치로 발현한다. 만약 보조 조절자 1의 존재시 수용체의 안정성이 변화되거나 수용체의 열 언폴딩 곡선이 쉬프트된다면, 보조 조절자 1이 조직 1에서는 활성이 있으나, 조직 2에서는 실질적으로 활성이 없기 때문에, 이 수용체는 조직 1에서 구조적으로 활성있으나 조직 2에서는 그렇지 않다고 예측할 수 있다.
본 발명에 대해 일반적으로 서술하였음에도, 본 발명은 달리 설명한 바 없다면 본 발명을 제한하기 위한 것이 아닌, 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 본 명세서에 포함된 이하 특정 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이다.
핵 수용체에 대한 실험 결과
전술한 바와 같이, 핵 수용체의 생물학적 반응은 DNA 결합 및 적절한 보조적인 전사 인자(예, 보조 조절자)의 모집에 의해 매개된다. 예컨대, [Robyr D., 등, MoL Endo. 14: 329-347 (2000)]; [Lee, J. W., 등, Cell. Mol. Life Sci. 58: 289-297 (2001)]; 및 [Rosenfeld, M. G. & Glass, C. K.,R Biol. Chem. 276: 36865-36868 (2001)]를 참조하라. 보조 조절자는 (보조 활성자) 유전자 발현을 활성화하고, (보조 억제자) 유전자 발현을 억제한다. 리간드가 핵 수용체에 결합하는 경우, 리간드는 보조 조절자 단백질을 우선적으로 모집할 수 있는 형태적 변화를 유도한다. 작동제 리간드의 경우, 보조 활성자가 모집되어 유전자 활성화를 초래한다. 길항제 리간드의 경우, 보조 억제자가 모집되어 유전자 억제를 초래한다.
보조 활성자의 존재시 작동제 반응 대 길항제 반응에 대해 예측되는 실험 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 작동제 리간드의 경우 보조 활성자 단백질/펩티드가 존재시, 수용체의 안정성의 증가가 예측되는 반면(도 1), 길항제의 경우, 부가적인 안정화가 관찰되지 않았다(도 2).
실시예 1
이하 나타낸 표 1은 보조 활성자 단백질 SRC-3의 존재하에; 보조 활성자 SRC-1 및 SRC-3의 서열에서 유래된 2개의 보조 활성자 펩티드 SRC1-NR2 및 SRC3-NR2의 존재하에; 및 보조 억제자 NCoR-1에서 유래된 보조 억제자 펩티드 NCoR-1의 존재하에, 4개의 알려진 작동제와 3개의 알려진 길항제의 패널의 연구에 대한 ER-α 및 ER-β에 대해 얻어진 데이타를 요약한 것이다.
모든 실험에서 ER-α 및 ER-β의 농도는 8 μM, 리간드 농도는 20 μM, SRC-3은 11 μM, 보조 조절자 펩티드 SRC1-NR2, SRC3-NR2, 및 NCoR-1은 100 μM이었다. 이 실험은 25 mM HEPES 완충액(pH 7.9), 200 mM NaCl, 5 mM DTT 및 25 μM 답폭실 설폰아미드 또는 ANS 염료(Molecular Probes, Inc.에서 구매, Eugene, OR)의 존재하에 수행하였다.
최종 농도의 2배인 2 μL 리간드 용액을 384 웰 검은 벽 그레이너(Greiner) 플레이트에 마이크로피펫으로 분배하였다. 그 후, 2 μL의 단백질 염료 용액을 384 웰 플레이트의 리간드 용액 위에 분배하였다. 이 플레이트를 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 위해 스핀하고, 샘플의 가열 동안 증발을 방지하기 위해 1 μL의 실리콘 오일로 층을 이루어 주었다. 데이타는 써모플루오르(Thermofluor) 기기에서 얻었으며(예컨대, 미국 특허 제6,020,141호; 제6,036,920호; 제6,291,191호; 제6,268,218호; 제6,232,085호; 제6,268,158호; 제6,214,293호; 제6,291,192호; 및 제6,303,322호를 참조), 비선형 최소 제곱법 핏팅 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이하 나열된 결과는 4번의 실험의 평균이다. 보조 조절자에 대한 값은 수용체-리간드 ΔTm 값으로부터 Tm 안정화의 변화를 나타낸다.
리간드와 보조 조절자의 존재시 에스트로겐 수용체의 관찰되는 ΔTm 안정화
- SRC-3 SRC1-NR2 SRC3-NR2 NCoR1-NR1
ER-α 0.0 1.5 0.8 0.9 0.0
에스트라디올 14.8 3.8 4.9 4.3 0.0
에스트론 7.7 3.5 3.0 2.3 -0.3
17-α-에틸렌-E2 15.5 4.5 4.5 3.9 -0.1
2-메톡시-E2 3.5 5.3 5.5 4.3 -0.7
탐옥시펜 8.5 1.1 -0.5 0.0 0.1
4-OH-탐옥시펜 17.7 0.2 0.2 0.7 0.1
ICI-182780 13.9 0.5 0.2 0.2 -0.6
ER-β 0.0 0.9 0.7 0.9 -0.4
에스트라디올 17.5 1.7 3.4 3.5 0.0
에스트론 11.3 1.6 3.8 3.7 -0.3
17-α-에틸렌-E2 15.3 2.6 2.6 2.6 -0.7
2-메톡시-E2 2.9 2.5 4.4 4.4 -0.7
탐옥시펜 9.8 1.3 0.2 0.4 0.4
4-OH-탐옥시펜 18.2 1.2 0.2 0.8 0.3
ICI-182780 16.7 0.9 0.4 0.6 0.3
상기 결과에서, 보조 활성자 단백질/펩티드의 존재하에, 에스트로겐 유사 화합물의 존재하에, 역 스크리닝으로부터 두 수용체에 대해 부가적 안정화가 관찰되었다. 따라서, 이들 화합물은 문헌과 일치하게 작동제와 유사하게 작용한다. 탐옥시펜과 ICI 화합물은 공지된 길항제이며, 이들은 보조 활성자를 모집하는 능력을 가지지 않는다. 이 또한 문헌과 일치한다.
또한, 보조 활성자 SRC-3은 ER-α대 ER-β에 의해 우선적으로 모집된다. 따라서, 에스트로겐 유사 화합물이 SRC-3의 존재시 ER-α대 ER-β를 함유하는 세포주에서 더 높은 생물학적 반응을 가짐이 예측된다.
추가적으로, 에스트로겐 수용체는 보조 억제자 펩티드를 모집하는 능력을 가지지 않으므로, 생물학적 관점에서, 유전자 억제가 리간드 의존적 방식으로 일어날 것임이 예측된다.
실시예 2
ER-α를 한 패널의 스테로이드 유사 리간드에 대해 스크리닝하여, 리간드를 결정하는 본 발명의 방법의 능력, 및 ER-α의 기능(이 수용체가 고아로 분류되는 경우, 예컨대, 미국 특허 출원 제US 2001/0003648 A1호 참조)을 확인하였다. ER-α와 상호작용 한다고 알려진 리간드는 수용체의 안정성의 증가로 동정된다(밑줄쳐진 화합물 대 밑줄쳐지지 않은 화합물).
모든 실험에서 ER-α의 농도는 8 μM, 리간드 농도는 20 μM이었다. 이 실험은 25 mM 인산(pH 8.0), 200 nM NaCl, 10% 글리세롤 및 25 μM 답폭실 설폰아미드 염료(Molecular Probes, Inc.에서 구매, Eugene, OR)의 존재하에 수행하였다.
최종 농도의 2배인 2 μL 리간드 용액을 384 웰 검은 벽 그레이너 플레이트에 마이크로피펫으로 분배하였다. 그 후, 2 μL의 단백질 염료 용액을 384 웰 플레이트의 리간드 용액 위에 분배하였다. 이 플레이트를 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 위해 스핀하고, 샘플의 가열 동안 증발을 방지하기 위해 1 μL의 실리콘 오일로 층을 이루어 주었다. 데이타는 써모플루오르 기기에서 얻었으며(예컨대, 미국 특허 제6,020,141호; 제6,036,920호; 제6,291,191호; 제6,268,218호; 제6,232,085호; 제6,268,158호; 제6,214,293호; 제6,291,192호; 및 제6,303,322호를 참조), 비선형 최소 제곱법 핏팅 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이하 나타낸 표 2에 나열된 결과는 4번의 실험의 평균이다.
한 패널의 스테로이드 리간드의 존재시 ER-α에 대한 데이타의 요약
스테로이드 리간드 ΔTm 표적화된 수용체
4-안드로스텐 -0.23 안드로겐 수용체
안드로스테론 0.23 안드로겐 수용체
코르티코스테론 -0.27 글루코코르티코이드 수용체
코르티손 0.01 글루코코르티코이드 수용체
β-에스트라디올 15.19 에스트로겐 수용체
에스트론 9.91 에스트로겐 수용체
17-α-에틸렌-에스트라디올 18.72 에스트로겐 수용체
17-α-히드록시프로게스테론 -0.21 프로게스테론 수용체
2-메톡시-에스트라디올 5.98 에스트로겐 수용체
쿠아바인 -0.21 프로게스테론 수용체
프로게스테론 -0.19 프로게스테론 수용체
4-OH-탐옥시펜 19.99 에스트로겐 수용체
만약 ER-α가 고아 수용체인 경우, 데이타는 이 수용체가 에스트로겐 수용체 패밀리의 멤버임을 나타낸다. 수용체에 결합하는 동정된 리간드를 실시예 1에 나타낸 한 패널의 보조 조절자에 대해 스크리닝한 경우, β-에스트라디올, 에스트론, 17-α-에틸렌에스트라디올, 및 2-메톡시에스트라디올은 이 수용체에 대한 작동제인 반면, 4-히드록시탐옥시펜은 길항제이다. 이 데이타는 고아 수용체에 대한 리간드의 동정을 위해, 마이크로플레이트 열 쉬프트 분석법을 사용한 것이다.
실시예 3
본 발명을 사용하여 분석할 수 있는 다른 단백질-단백질 상호작용의 예를 이하 나타낸 표 3에 나타내었다.
흥미있는 단백질 단백질 파트너 (보조 조절자) 리간드 표현형 관련 생물학적 활성
GPCR Gsα 작동제 cAMP를 증가시키거나 Ca2+채널의 조절을 자극함
GPCR Giα 작동제 cAMP를 감소시킴
GPCR Goα 작동제 Ca2+채널의 조절을 자극함
GPCR Gtα 작동제 cGMP 및 포스포디에스터라제 활성을 증가시킴
GPCR Gqα 작동제 포스포리파제 Cβ활성을 증가시킴
GPCR Gsα 길항제 기초적 활성에 영향을 주지 않거나 cAMP를 감소시키거나 Ca2+채널 자극을 저해함
GPCR Giα 길항제 기초적 활성에 영향을 주지 않거나 cAMP를 증가시킴
GPCR Goα 길항제 기초적 활성에 영향을 주지 않거나 Ca2+채널 자극을 저해함
GPCR Gtα 길항제 기초적 활성에 영향을 주지 않거나 cGMP 및 포스포디에스터라제 활성을 감소시킴
GPCR Gqα 길항제 기초적 활성에 영향을 주지 않거나 포스포리파제 Cβ활성을 감소시킴
Src SH2 길항제 뼈의 용골세포 매개된 흡수를 저해함
Src SH2 작동제 뼈의 용골세포 매개된 흡수를 자극함
Jac SOCS 작동제 유전자 전사
Jac SOCS 길항제 유전자 억제
NF-κB IκB 길항제 유전자 전사
NF-κB IκB 작동제 유전자 억제
본 발명의 상이한 구체예는 상기 실시예를 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 이 실시예들의 일반적 성질은 흥미있는 단백질, 단백질이나 펩티드 파트너(보조 조절자, 예, 보조 활성자 또는 보조 억제자)의 상호작용, 및 조직 선택적 방식으로 상호작용을 증강하거나(작동제), 저해할 수 있는(길항제) 리간드를 포함한다.
실시예 4
스테로이드 수용체 보조 활성자 패밀리(SRC)는 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3로 나타내는 3개의 멤버로 구성된다. SRC-3는 조직 선택적 방식으로 발현하며, 유선, 난모 세포, 평활근, 간세포 및 질 상피에 주로 존재한다(Xu 등, Nat. Acad. Sci. USA 97: 6379-6384 (2000)). 한편, SRC-1은 심근과 신피질에서 고도로 발현되는 반면, SRC-3은 이들 조직에 존재하지 않으며(Misiti, S. 등, Endocrinology 140: 1957-1960(1999)); SRC-3은 유선 세포에서 발현되는 반면, SRC-1은 그렇지 않다(Shang, Y. and Brown, M., Science 295: 2465-2468 (2002)). 4개의 스테로이드 반응성 조직에서 기관 성장의 감소가 SRC1이나 SRC2가 결핍된 마우스에서는 관찰되는 반면, SRC3 넉아웃 마우스는 결핍된 호르몬 신호 경로를 가진다. 이러한 데이타는 이 보조 활성자가 기능적 특이성을 가짐을 나타낸다.
이하 나타낸 표 4는 보조 활성자 단백질 SRC-1 SRC-2 및 SRC-3의 존재 및 7개의 리간드 존재시, ER-α및 ER-β에 대해 얻어진 데이타를 요약한 것이다. 모든 실험에서 ER-α의 농도는 8 μM, 리간드 농도는 40 μM, SRC-1 및 SRC-3은 20 μM이었다. 이 실험은 25 mM HEPES(pH 7.9), 200 mM NaCl, 5 mM DTT 및 25 μM 답폭실 설폰아미드 또는 ANS 염료(Molecular Probes, Inc.에서 구매, Eugene, OR)의 존재하에 수행하였다.
최종 농도의 2배인 2 μL 리간드 용액을 384 웰 검은 벽 그레이너 플레이트에 마이크로피펫으로 분배하였다. 그 후, 2 μL의 단백질 염료 용액을 384 웰 플레이트의 리간드 용액 위에 분배하였다. 이 플레이트를 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 위해 스핀하고, 샘플의 가열 동안 증발을 방지하기 위해 1 μL의 실리콘 오일로 층을 이루어 주었다. 데이타는 써모플루오르 기기에서 얻었으며, 비선형 최소 제곱법 핏팅 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 보고된 결과는 4번의 실험의 평균이다. 보조 조절자에 대한 값은 수용체-리간드 ΔTm 값으로부터 Tm 안정화의 변화를 나타낸다.
리간드와 보조 활성자 단백질 SRC-1 및 SRC-3의 존재시 ER-α의 관찰되는 ΔTm 안정화.
리간드 - SRC1 SRC2 SRC3
ER-α 1.1 1.0 1.5
작동제
에스트라디올 14.8 1.6 3.9 3.8
에스트론 7.7 1.4 2.2 3.5
17-α-에틸렌-에스트라디올 15.5 1.6 3.7 4.9
2-메톡시-에스트라디올 3.5 2.1 4.2 5.3
길항제
탐옥시펜 8.5 1.1 0.7 1.1
4-OH-탐옥시펜 17.1 0.2 0.2 0.2
ICI-182780 13.9 0.4 0.5 0.5
ER-β 0.7 0.9 0.9
작동제
에스트라디올 17.5 0.5 1.9 1.7
에스트론 11.3 0.7 1.5 1.5
17-α-에틸렌-에스트라디올 15.3 1.1 2.5 2.6
2-메톡시-에스트라디올 2.9 1.0 2.4 2.5
길항제
탐옥시펜 9.8 1.1 1.1 1.3
4-OH-탐옥시펜 18.2 0.9 1.0 1.2
ICI-182780 16.7 0.5 0.6 0.9
도 3은 ER-α리간드의 존재하에 보조 활성자 단백질 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3에 대한 결합 상수, Ka를 나타낸다. 도 4는 ER-β리간드의 존재하에 보조 활성자 단백질 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3에 대한 결합 상수, Ka를 나타낸다. 결합 상수들은 유도된 리간드 및 보조 조절자가 핵 수용체를 안정화하는 것을 관찰하여 계산하였다. 작동제의 존재하에 SRC-3에 대한 결합 상수는 SRC-1 보다 평균 5 내지 20배 더 크다. 작동제의 존재하에 SRC-1에 대한 관찰되는 결합 상수는 길항제의 존재하에 보조 활성자에 대한 결합 상수와 같거나 2배 정도 크다.
표 4 및 도 3과 4로부터, 우리는 이하와 같은 결론을 내릴 수 있다:
a) 보조 활성자 단백질 SRC-1, SRC-2 및 SRC-3의 존재하에 및 에스트로겐 유사 화합물의 존재하에 역 스크리닝하여, 두 수용체에 대한 부가적인 안정화가 관찰된다. 실험 결과에 기초한 이 결론은 이들 화합물이 ER-β와 SRC-1의 상호작용을 제외하고는 ER-α및 ER-β에 대한 작동제처럼 작용한다는 것이다.
b) 탐옥시펜, 4-OH-탐옥시펜 및 ICI-182,780은 공지된 길항제이며, 보조 활성자를 수집하는 능력이 거의 없다(이는 문헌과 일치하는 것임).
c) ER-α에 대한 보조 활성자의 우선적인 모집은 에스트라디올 리간드 SRC-3과 SRC-2의 상호작용이 동일한 것을 제외하고는 SRC-3 > SRC-2 > SRC-1의 순서이다.
d) ER-β에 대한 보조 활성자의 우선적인 모집은 SRC-3 = SRC-2 > SRC-1의 순서이다.
e) 작동제는 ER-α와 ER-β모두에 대한 SRC-1와 SRC-3의 길항제는 물론, 동일하게 SRC-1을 모집한다.
f) 에스트라디올 리간드는 3차 복합체 ER-α:작동제:SRC-3 대 ER-α:길항제:SRC-1; ER-β:작동제:SRC-3 대 ER-β:길항제:SRC-1; ER-α:작동제:SRC-2 대 ER-α:길항제:SRC-1; ER-β:작동제:SRC-2 대 ER-β:길항제:SRC-1라는 면에서, SRC-1보다 SRC-3와 SRC-2의 존재하에 보다 강력한 작동제이다.
g) SRC-3과 SRC-2는 ER-β작동제 복합체보다 ER-α작동제 복합체에 의해 우선적으로 모집된다.
h) 평균적으로, ER-α작동제는 길항제 리간드의 부재 또는 존재시 수용체보다 20-100배 정도 많이 보조 활성자의 SRC 패밀리를 모집하는 반면, ER-β의 경우 친화도는 단지 5배 개선된다.
ER-α작동제 리간드는 SRC-3 대 SRC-1의 모집을 선호한다. 관찰에 기초하여, 이들 작동제가 SRC-3가 존재하는 조직에서 유전자를 보다 효율적으로 활성화할 것임이 예측된다. 탐옥시펜과 4-OH-탐옥시펜은 공지된 ER-α에 대한 길항제로, 작동제가 SRC-1을 모집하는 것처럼 효과적으로 SRC-3과 SRC-1을 모집하므로, 이들 작동제 리간드가 SRC-1를 발현하고, SRC-3을 발현하지 않는 조직에서 생물학적 반응을 갖지 않음이 예측된다.
작동제 에스트론의 존재하에, ER-α는 다른 작동제 리간드 보다 덜 단단히 SRC-3에 결합한다. 이 리간드는 다른 작동제 리간드와 비교시, SRC-3가 존재하는 조직에서 ER-α에 대한 부분적 작동제일 수 있음이 예측된다. 채워진 작동제와 리간드가 없는 수용체에 대한 보조 활성자의 친화도에 있어서의 차이는 ER-α의 생물학적 활성이 리간드의 내생 농도에 의해 보다 단단히 조절되는 반면, ER-β는 거의 영향을 받지 않음을 내포한다. 따라서, 작동제 리간드의 구별되는 생물학적 반응은 적절한 3차 복합체의 형성, 리간드가 채워진 수용체의 보조 조절자에 대한 친화도, 및 단백질과 내생 리간드의 상대적 농도에 고도로 의존할 것이다.
실시예 5
부분적 작동제는 완전히 수용체가 채워져도 중최대 반응을 나타내는 리간드이다. 이는 또한 완전한 작동제를 길항시켜 이 자신의 자극된 생물학적 반응의 수치로 낮추어 준다. 이의 분자적 기초는 알려져 있지 않으나, 보조 활성자와 보조 억제자의 상대적 발현 수치 및 보조 조절자에 대한 상대적 친화도에 의존적일 수 있다고 여겨진다.
도 5에 나타낸 도식의 실험 가설에 기초하여, 부분적 작동제는 핵 수용체에 형태 변화를 유도하여, 상이한 친화도를 갖는 보조 활성자나 보조 억제자를 모집할 수 있다. 이들 친화도의 비는 생물학적 반응이 관찰되는지 여부를 나타낼 것이다.
예컨대, 리간드가 보조 활성자의 상호작용을 강화시키고 보조 억제자의 상호작용을 약화시킨다면, 이는 부분적 작동제의 생물학적 반응을 가질 것이다. 만약 리간드가 보조 활성자의 상호작용을 강화시키고 보조 억제자의 결합을 제거한다면, 이는 작동제의 생물학적 반응을 가질 것이다. 만약 리간드가 보조 활성자와 보조 억제자의 결합에 동일하게 영향을 준다면, 생물학적 반응은 일어나지 않을 것이다.
이하 나타낸 표 5는 보조 활성자 펩티드 SRC1-NR2 및 보조 억제자 펩티드 NCoR-1의 존재하에 및 리간드의 존재하에, PPAR-γ에 대해 얻어진 데이타를 요약한 것이다.
모든 실험에서 PPAR-γ의 농도는 8 μM, 리간드 농도는 40 μM, SRC-2-NR2 및 NcoR-1 펩티드는 200 μM이었다. 보조 활성자 펩티드 SRC-2-NR2는 보조 활성자 단백질 SRC-2의 서열에서 유래되었으며, 보조 억제자 펩티드 NCoR-1은 보조 억제자 단백질 NCoR-1에서 유래되었다.
이 실험은 25 mM HEPES(pH 7.9), 200 mM NaCl, 5 mM DTT 및 50 μM 답폭실-2-아미노-에틸 설폰아미드의 존재하에 수행하였다. 최종 농도의 2배인 2 μL 리간드 용액을 384 웰 검은 벽 그레이너 플레이트에 마이크로피펫으로 분배하였다. 그 후, 2 μL의 단백질 염료 용액을 384 웰 플레이트의 리간드 용액 위에 분배하였다. 이 플레이트를 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 위해 스핀하고, 샘플의 가열 동안 증발을 방지하기 위해 1 μL의 실리콘 오일로 층을 이루어 주었다. 데이타는 써모플루오르 기기에서 얻었으며, 비선형 최소 제곱법 핏팅 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 보고된 결과는 4번의 실험의 평균이다.
리간드와 보조 활성자 펩티드 SRC2-NR2 및 보조 억제자 펩티드 NCoR-1의 존재시 PPAR-γ의 관찰되는 안정화.
리간드 SRC1-NR2 NCoR-1
리간드가 존재하지 않는 경우 N/A 1.2 5.7
트로글리타존 2.5 2.7 3.9
로시글리타존 5.6 2.1 1.3
WY14643 1.0 1.5 5.0
GW9662 5.9 1.2 3.5
BADGE 1.1 1.1 5.5
도 6A는 PPAR-γ리간드의 부존재 및 존재하에, 보조 활성자 펩티드 SRC-1NR2에 대한 계산된 결합 상수를 나타낸다. 도 6B는 PPAR-γ리간드의 부존재 및 존재하에, 보조 억제자 펩티드 NCoR-1에 대한 계산된 결합 상수를 나타낸다. 도 6C는 활성화 형태인 수용체에 대한 계산된 통계적 개연성을 나타낸다.
표 5 및 도 6A, 6B 및 6C로부터, 우리는 이하와 같은 결론을 내릴 수 있다:
a) 모든 리간드는 보조 활성자와 보조 저해자 펩티드를 구별적으로 모집하는 데 영향을 준다.
b) 트로글리타존과 로시글리타존의 존재하에 PPAR-γ는 리간드가 없는 수용체 보다 또는 다른 리간드의 존재시 보다 더욱 효율적으로 보조 활성자 펩티드를 모집한다(도 6A).
c) 어떤 화합물도 리간드가 없는 수용체 보다 더욱 효율적으로 보조 억제자 펩티드를 모집하지 않는다.
d) 트로글리타존은 보조 활성자 펩티드의 모집에 가장 극적으로 영향을 주고, 로시글리타존이 그 다음이다. 로시글리타존은 보조 억제자 펩티드 결합에는 더욱 극적인 효과를 준다. 다른 표현으로, 두 리간드는 보조 활성자 펩티드 SRC1-NR2에 대한 결합 친화도를 증가시키고, 보조 억제자 펩티드 NCoR-1에 대한 친화도를 감소시킨다. 펩티드에 대한 친화도로부터, 주어진 리간드의 작동제 상태인 수용체의 통계적 개연성을 계산할 수 있다(작동제 상태의 개연성 = (SRCl-NR2에 대한 Ka) / (SRC1-NR2에 대한 Ka + NcoR1-NR1에 대한 Ka). PPAR-γ:로시글리타존 복합체의 작동제 상태에서의 상대적 통계적 개연성은 70%인 반면, PPAR-γ:트로글리타존 복합체는 25%이다. 이 실시예에서의 모든 다른 PPAR-γ:리간드 복합체는 10% 이하이다.
실시예 6
도 6C 및 표 6으로부터, 작동체 상태인 수용체에 대한 통계적 개연성이 리간드의 친화도를 막강하게 예측할 수 있음을 관찰할 수 있다. 로시글리타존은 PPAR-γ에 대한 완전한 작동제로 알려져 있는 반면, 트로글리타존은 PPAR-γ에 대한 공지된 부분적 작동제인다. 모든 다른 리간드는 길항제로 여측된다.
본 명세서에 언급된 모든 출판물과 특허는 그 전체로 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
앞서 본 발명은 본 발명을 명확하게 하고 이해를 돕기 위해 일부 상세하게 서술되었으므로, 본 기술 분야의 당업자라면 이 명세서를 읽음으로서 본 발명 및 부가된 청구항의 원래 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부 사항을 다양히 변화시킬 수 있음을 이해할 것이다.
문헌에 보고된 리간드의 프로파일 및 상대적 친화도에 기초한 써모플루오르 예측(부분적 = 부분적 작동제).
리간드 문헌 써모플루오르 예측(PPAR-γ)
트로글리타존 부분적 γ 부분적
로시글리타존 완전한 작동제 작동제
GW9662 길항제 γ 길항제
WY14643 부분적 α, 길항제 γ 길항제
BADGE 길항제 γ 길항제

Claims (59)

  1. (a) 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자(coregulator)의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 것은 상기 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내 주어, 이로써 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩(unfolding)시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성을 변화시키는 것은 상기 언폴딩 곡선의 변화로 나타나는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 분자를 1개 이상의 상기 보조 조절자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 조절자의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성을 추가로 변화시키는 것은 상기 언폴딩 곡선의 추가 변화로 나타나는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 1개 이상의 보조 조절자가 보조 활성자(coactivator) 및/또는 보조 억제자(corepressor)를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 셋트의 1개 이상의 리간드가 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시켜하여, 보조 활성자가 존재하는 경우 표적 분자의 작동제인 리간드를 동정하게 하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 작동제가 부분적 작동제인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 셋트의 1개 이상의 분자가 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시켜, 보조 억제자가 존재하는 경우 표적 분자의 길항제인 리간드를 동정하게 하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 길항제가 부분적 작동제인 방법.
  10. (a) 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선에서의 추가 쉬프트는 상기 조직 선택적 보조 조절자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내 주어, 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정해주는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 상기 다수의 상이한 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  13. 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 1개 이상의 상기 보조 조절자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 조절자의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 분자 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 1개 이상의 보조 조절자가 보조 활성자 및/또는 보조 억제자를 포함하는 것인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 셋트의 1개 이상의 리간드가 보조 활성자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시켜, 보조 활성자가 존재하는 경우 표적 분자의 작동제인 리간드를 동정하게 하는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 작동제가 부분적 작동제인 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 셋트의 1개 이상의 리간드가 보조 억제자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시켜, 보조 억제자가 존재하는 경우 표적 분자의 길항제인 리간드를 동정하게 하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 길항제가 부분적 작동제인 방법.
  19. (a) 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 활성자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 활성자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키지 않는 것은 상기 조직 선택적 보조 활성자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 길항제임을 나타내는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성의 변화는 상기 언폴딩 곡선의 변화로 나타나는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  22. 제19항 또는 제21항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 분자를 1개 이상의 상기 보조 활성자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드의 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 활성자의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성의 추가 변화는 상기 언폴딩 곡선의 추가 변화로 나타나는 것인 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 길항제가 부분적 작동제인 방법.
  24. (a) 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 활성자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 활성자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하지 않는 것은 리간드가 표적 분자의 길항제임을 나타내는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 상기 다수의 상이한 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  27. 제24항 또는 제26항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 1개 이상의 상기 보조 활성자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 활성자의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  28. 제24항에 있어서, 상기 길항제가 부분적 작동제인 방법.
  29. (a) 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 억제자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 억제자의 존재하에, 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키지 않는 것은 상기 조직 선택적 보조 억제자가 존재하는 경우 리간드가 표적 분자의 작동제임을 나타내는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성의 변화는 상기 언폴딩 곡선의 변화로 나타나는 것인 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  32. 제29항 또는 제31항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 분자를 1개 이상의 상기 보조 조절자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 처리하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 표적 분자의 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선을 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 억제자의 부재하에, 상기 표적 분자의 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이 때, 안정성의 추가 변화는 상기 언폴딩 곡선의 추가 변화로 나타나는 것인 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 작동제가 부분적 작동제인 방법.
  34. (a) 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계; 및
    (b) 표적 분자에 대한 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 보조 억제자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 조직 선택적 보조 조절자의 보조 억제자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하지 않는 것은 리간드가 표적 분자의 작동제임을 나타내는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 언폴딩 곡선을 쉬프트하는 능력에 대해 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 1개 이상의 다수의 상이한 리간드를 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 1개 이상의 상기 다수의 상이한 리간드와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 다수의 상이한 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  37. 제34항 또는 제36항에 있어서, 상기 스크리닝하는 단계가
    (a) 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자와 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 1개 이상의 상기 보조 조절자와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각에서 상기 표적 분자를 가열하여, 상기 표적 분자를 언폴딩시키는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 가열로 초래된 상기 표적 분자의 열 언폴딩과 연관된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 온도의 함수로서 산출하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열 언폴딩 곡선의 각각을 하기 (i) 및/또는 (ii)와 비교하는 단계:
    (i) 다른 열 언폴딩 곡선의 각각;
    (ii) (1) 상기 셋트의 상기 리간드의 어떤 것 및/또는 (2) 상기 보조 억제자의 부재하에, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선; 및
    (f) 상기 셋트의 상기 리간드 중 어떤 것이 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 쉬프트하는지 여부를 결정하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 작동제가 부분적 작동제인 방법.
  39. (a) 알려지지 않은 기능을 갖는 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계로서, 이 때, 상기 셋트의 리간드는 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 열 언폴딩 곡선을 변화시키는 것인 단계; 및
    (b) 1개 이상의 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 알려지지 않은 기능을 갖는 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 보조 조절자의 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 열 언폴딩 곡선의 추가 변화는 상기 보조 조절자가 존재하는 경우 분자가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계가 표적 분자의 열 언폴딩 곡선을 변화시키는 능력에 대해, 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 열 언폴딩 곡선을 변화시키는 1개 이상의 패널의 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 리간드가 보조 활성자가 존재하는 경우 표적 분자의 부분적 작동제인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 리간드가 보조 억제자가 존재하는 경우 표적 분자의 부분적 작동제인 방법.
  43. (a) 알려지지 않은 기능을 갖는 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 리간드를 제공하는 단계로서, 이 때, 상기 한 셋트의 리간드는 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 안정성을 변화시키는 것인 단계; 및
    (b) 1개 이상의 보조 조절자의 존재하에 표적 분자의 안정성을 추가로 변화시키는 능력에 대해 상기 셋트의 1개 이상의 리간드를 스크리닝하는 단계
    를 포함하는, 알려지지 않은 기능을 갖는 보조 조절자 의존적 표적 분자에 대한 리간드의 조직 선택성을 결정하는 방법으로서,
    상기 셋트의 리간드 및 상기 1개 이상의 보조 조절자의 보조 조절자의 존재하에, 표적 분자의 안정성의 추가 변화는 상기 보조 조절자가 존재하는 경우 분자가 표적 분자의 작동제인지 또는 길항제인지 여부를 나타내는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 표적 분자의 안정성을 변화시키는 한 셋트의 분자를 제공하는 단계가 표적 분자의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 생물학적 기능을 공유하는 수용체의 안정성을 변화시키는 1개 이상의 패널의 리간드를 스크리닝하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기 리간드가 보조 활성자가 존재하는 경우 표적 분자의 부분적 작동제인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 리간드가 보조 억제자가 존재하는 경우 표적 분자의 부분적 작동제인 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, GPCR, NF-κB, 스테로이드 수용체 보조 활성자(src), 및 Jac에서 선택되는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 핵 수용체인 방법.
  49. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 G-단백질과 커플링된 수용체인 방법.
  50. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 에스트로겐 수용체인 방법.
  51. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 ER-α인 방법.
  52. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 ER-β인 방법.
  53. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 PPAR-γ인 방법.
  54. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 티로신 키나제인 방법.
  55. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 표적 분자가 NF-κB인 방법.
  56. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1개 이상의 보조 조절자가 SRC-1, SRC-2, 및 SRC-3에서 선택되는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 보조 조절자가 Gsα, Giα, Gtα, Gqα, Goα, Gqα, IκB, SH2 및 SOCS에서 선택되는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드가 스테로이드인 방법.
  59. 제1항 내지 제46항 중 어느 하나의 항에 있어서, 리간드가 비스테로이드 리간드인 방법.
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