KR20050022811A - A transgenic mouse having a lean phenotype - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 여윈 표현형(lean phenotype)을 갖는 유전자 이식 생쥐(transgenic mouse)에 관한 것이다.The present invention relates to transgenic mice having a lean phenotype.
유전자 이식 생쥐는 특정 유전자 단편을 생쥐의 수정란에 미세주입하고, 이를 다른 쥐의 자궁에 착상시켜 출산시킨 후 3주 정도 지난 생쥐의 꼬리 DNA를 검사하여 외부에서 넣어준 유전자가 생쥐 세포내의 DNA에 성공적으로 삽입되었는가를 확인하는 과정을 거쳐 탄생된다. 유전자 이식 생쥐는 유전자의 기능을 생체내에서 알아볼 수 있는 방법으로서 인체 각종 질환의 모델 개발과 이에 따른 각종 치료제의 개발 및 생쥐의 몸을 생체공장(bioreactor)으로서 사용이 기대되는 분야이다.Transgenic mice microinject certain gene fragments into the fertilized eggs of mice, implant them into the uterus of other mice, examine the tail DNA of mice about three weeks after giving birth, and successfully insert genes from the cells inside the mouse cells. It is born through the process of checking whether it is inserted into the Transgenic mice are a field that can recognize the function of genes in vivo, and are expected to develop models for various diseases of the human body, to develop various therapeutic agents, and to use the body of a mouse as a bioreactor.
유전자 이식 생쥐의 예로서는 인체 백혈병의 모델이 될 수 있는 c-myc 암유전자가 삽입된 유전자 이식 생쥐 (미국특허 제 5,087,571호), 전립선이 비대해진 생쥐 (미국특허 제5,175,383호), 성숙 T-세포가 생성되지 않는 생쥐 (미국특허 제5,175,384호) 및 인간 베타 인터페론을 생산하는 생쥐 (미국특허 제5,175,385호) 등이 공지되어 있으며, 국내에도 당뇨병 발생 유전자 이식 생쥐 (한국특허 등록 제268,714호) 및 T-세포가 결핍된 유전자 이식 생쥐 (한국특허 등록 제268,713호) 등이 공지된 바 있다.Examples of transgenic mice include transgenic mice with inserted c-myc oncogenes that can be a model of human leukemia (US Pat. No. 5,087,571), mice with enlarged prostate (US Pat. No. 5,175,383), mature T-cells Non-producing mice (US Pat. No. 5,175,384) and mice producing human beta interferon (US Pat. No. 5,175,385) are known. Diabetes-producing transgenic mice (Korean Patent No. 268,714) and T- Transgenic mice lacking cells (Korean Patent Registration No. 268,713) and the like have been known.
Unc5h3 유전자는 네트린(netrin) 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 단백질을 코딩하는 유전자로서 신경세포의 이동을 제어하는 것으로 알려져 있다. Unc5h3 유전자는 뇌에서 비교적 높은 발현을 보이며 배발생에서 뇌의 정상적인 발달에 필수적인 것으로 알려져 있다. 또한, 뇌 이외에도 폐에서 비교적 높은 발현을 보이며, 고환, 난소, 지라, 흉선 등의 조직에서도 발현되나 그 기능은 아직 명확하지 않다 (Ackerman 등, 1997, Nature, 386, 838∼842).The Unc5h3 gene is a gene encoding a receptor protein that specifically binds a netrin ligand and is known to control the movement of nerve cells. Unc5h3 gene is relatively high in the brain and is known to be essential for normal brain development in embryonic development. In addition to the brain, the lungs have relatively high expression and are expressed in tissues such as testes, ovaries, spleen and thymus, but its function is not yet clear (Ackerman et al., 1997, Nature, 386, 838-842).
상기 Unc5h3 유전자의 돌연변이가 일어나 Unc5h3 유전자가 전혀 발현되지 않는 생쥐의 뇌는 해부학적으로 비정상적인 형태를 가지며 조직학적으로도 비정상적인 신경세포의 분포를 보이게 되며, 이러한 비정상적인 신경조직의 발생이 활동항진(hyperactivity) 및 운동실조(ataxia) 등의 표현형으로 나타난다 (Ackerman 등, 1997, Nature, 386, 838∼842; Lane 등, 1992, J.Hered., 83, 315∼318).When the Unc5h3 gene is mutated, the brain of a mouse in which the Unc5h3 gene is not expressed at all is anatomically abnormal in shape and histologically shows abnormal distribution of neurons. And ataxia and the like (Ackerman et al., 1997, Nature , 386, 838-842; Lane et al. , 1992, J. Hered. , 83, 315-318).
본 발명자들은 생쥐 텔로머라제 유전자 이식 생쥐를 생산하여 텔로머라제의 기능에 관한 연구를 수행하던 중, 우연히 Unc5h3 유전자의 인트론 부위에 돌연변이를 포함하는 유전자 이식 생쥐가 성체가 되어도 여윈 표현형(lean phenotype)을 유지한다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors produced a mouse telomerase transgenic mouse and conducted a study on the function of telomerase, and even when a transgenic mouse containing a mutation in the intron region of the Unc5h3 gene became an adult, a lean phenotype It has been found that to maintain the present invention was completed.
따라서, 본 발명은 여윈 표현형을 갖는 유전자 이식 생쥐를 제공하는 것을 목적으로 한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a transgenic mouse having a thin phenotype.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Unc5h3 유전자의 1번 엑손과 2번 엑손 사이의 인트론에 돌연변이(mutation)를 포함하는 여윈 표현형(lean phenotype)을 갖는 유전자 이식 생쥐(Mus musculus)를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a transgenic mouse ( Mus musculus ) having a lean phenotype including a mutation in the intron between exon 1 and exon 2 of the Unc5h3 gene.
본 발명의 유전자 이식 생쥐(Mus musculus)는 상기 인트론 서열의 중간 부위 약 50kb가 제거된 돌연변이를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 제거부위에 생쥐 텔로머라제를 코딩하는 DNA가 안정하게 삽입된 것이 더욱 바람직하다.The musculus transgenic mice of the present invention preferably include a mutation in which about 50 kb of the intermediate region of the intron sequence is removed, and more preferably, DNA encoding the mouse telomerase is stably inserted into the removal region. Do.
본 발명의 유전자 이식 생쥐 (Mus musculus)는 수탁번호가 KCTC 10456BP 인 수정란으로부터 발생되는 유전자 이식 생쥐 (Mus musculus)가 더욱 바람직하다.Transgenic mice (Mus musculus) of the present invention are more preferred transgenic mice (Mus musculus) the accession number of KCTC 10456BP generated from the fertilized egg.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 명세서에서 "안정하게 삽입된"이란 게놈 내에 삽입되어 후대로 전달될 수 있도록 삽입되는 것을 의미한다. As used herein, "stablely inserted" means inserted into the genome so that it can be delivered later.
본 발명의 유전자 이식 생쥐는 Unc5h3 유전자의 1번 엑손과 2번 엑손 사이의 인트론에 돌연변이(mutation)를 포함한다. The transgenic mice of the present invention comprise a mutation in the intron between exon 1 and exon 2 of the Unc5h3 gene.
Unc5h3 유전자의 1번 엑손과 2번 엑손 사이의 인트론은 길이가 212,992bp (젠뱅크 등록번호 NT_039242: 이하 편의상 1번 엑손에 연결되어 있는 염기를 1번이라 하고, 2번 엑손에 연결되어 있는 염기를 212,992번이라 한다)인 것으로 알려져 있다. 상기 돌연변이는 상기 인트론 서열중 80,503번∼131,168번 뉴클레오티드 서열이 제거된 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 범위가 바람직한 범위의 뉴클레오티드 서열이 제거된 유전자 이식 생쥐에 한정되는 것은 아니다.The intron between exon 1 and exon 2 of the Unc5h3 gene is 212,992 bp in length (Genbank Accession No. NT_039242 : for convenience, the base connected to exon 1 is called 1 and the base connected to exon 2 is 212,992). Preferably, the mutation is a nucleotide sequence of Nos. 80,503 to 131,168 of the intron sequence is removed. However, the scope of the present invention is not limited to the transgenic mice from which the nucleotide sequence of the preferred range has been removed.
또한, 상기 돌연변이는 상기 뉴클레오티드 서열의 제거부위에 생쥐 텔로머라제를 코딩하는 DNA가 안정하게 삽입된 것이 바람직하다. 텔로머라제(telomerase)는 RNA와 단백질로 구성된 효소로서, 염기를 하나씩 첨가함으로써 텔로미어(telomere)의 한 가닥의 반복단위를 만들게 된다. 상기 텔로미어는 염색체의 끝을 이루는 단순 반복 서열로 되어 있는 DNA를 말한다.In addition, it is preferable that the mutation stably inserts the DNA encoding the mouse telomerase at the site of removal of the nucleotide sequence. Telomerase is an enzyme made up of RNA and protein that adds bases one by one to form repeats of one strand of telomere. The telomeres refer to DNA consisting of simple repeating sequences that form the ends of chromosomes.
생쥐 텔로머라제를 코딩하는 DNA로는 공지의 DNA를 사용할 수 있으며, 예를들어 젠뱅크 등록번호(gene bank accession number) AF051910의 DNA를 사용할 수 있다. 텔로머라제를 코딩하는 DNA는 예를 들면, (a) 5 발현 조절 서열; (b) 생쥐 텔로머라제를 코딩하는 DNA; 및 (c) 3 발현 조절 서열을 포함하는 유전자 구조체로서, (a) (b) 및 (c)는 생쥐에서 상기 텔로머라제가 발현될 수 있도록 연결된 유전자 구조체를 사용하여 삽입시킬 수 있다.As the DNA encoding the mouse telomerase, a known DNA can be used. For example, a DNA of the gene bank accession number AF051910 can be used. DNA encoding telomerase includes, for example, (a) 5 expression control sequences; (b) DNA encoding mouse telomerase; And (c) 3 expression control sequences, wherein (a) (b) and (c) can be inserted using linked genetic constructs to allow the telomerase to be expressed in mice.
상기 5 발현 조절 서열은 프로모터를 포함하며, 예를 들어, 닭의 베타 액틴 프로모터를 사용할 수 있고, 상기 (c) 3 발현 조절 서열에는 폴리아데닐레이션 부위가 포함되며, 상기 폴리아데릴레이션 부위는 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐레이션 부위인 것이 바람직하다. The 5 expression control sequence includes a promoter, for example, beta actin promoter of chicken can be used, (c) 3 expression control sequence includes a polyadenylation site, the polyadelation site is rabbit beta It is preferably a globin polyadenylation site.
상기 유전자 구조체는 원형 또는 선형의 DNA 또는 벡터가 포함되며, 바람직하게는 닭의 베타 액틴 프로모터, 젠뱅크 등록번호 AF051910의 DNA, 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐레이션 부위를 5′ 말단으로부터 3′ 말단 방향으로 순서대로 포함하는 원형 또는 선형의 DNA 또는 벡터인 것이 바람직하다. The gene construct includes a circular or linear DNA or vector, and preferably the beta actin promoter of chicken, the DNA of Genbank Accession No. AF051910, and the rabbit beta globin polyadenylation site in the direction from 5 'to 3' end. It is preferable that it is a circular or linear DNA or vector containing as it is.
본 발명의 유전자 이식 생쥐는 수탁번호가 KCTC 10456BP 인 수정란으로부터 발생되는 유전자 이식 생쥐가 더욱 바람직하다.The transgenic mice of the present invention are more preferably transgenic mice generated from fertilized eggs with accession number KCTC 10456BP.
본 발명의 유전자 이식 생쥐는 고환을 제외한 대부분의 조직에서 Unc5h3의 발현이 거의 되지 않으며, 활동항진(hyperactivity)과 운동실조 (ataxia)의 표현형을 나타내며, 야생형 생쥐에 비하여 여윈 표현형을 나타낸다. 또한, 과식증 (hyperphagia)을 보이면서도 생체내 지방조직은 오히려 거의 보이지 않는 특이한 표현형을 나타낸다. The transgenic mice of the present invention show little expression of Unc5h3 in most tissues except testes, and exhibit a phenotype of hyperactivity and ataxia, and a thin phenotype compared to wild-type mice. In addition, while showing hyperphagia, adipose tissue in vivo shows a rather unusual phenotype.
특히, 본 발명의 유전자 이식 생쥐의 여윈 표현형은 유아기로부터 성체가 되어도 유지되는데, 이는 종래 Unc5h3 유전자 전체가 발현되지 않을 경우(Ackerman 등, 1997, Nature, 386, 838∼842) 유아기 때에는 여윈 표현형을 보이다가 성체가 될 경우 다시 정상 생쥐와 같이 몸무게를 회복하여 여윈 표현형이 없어지는 것과는 대조되는 형질이다. 그외 종래에는 Unc5h3가 돌연변이된 생쥐의 경우 수컷 불임이 보고되었지만, 본 발명의 생쥐에서는 수컷 불임이 관찰되지 않았다.In particular, the thin phenotype of the transgenic mice of the present invention is maintained even in adulthood, which shows a thin phenotype in early childhood when the entire Unc5h3 gene is not expressed (Ackerman et al., 1997, Nature, 386, 838-842). If the adult is a trait that contrasts with the loss of the thin phenotype by restoring weight like normal mice. In the past, male infertility was reported in mice mutated with Unc5h3, but male infertility was not observed in mice of the present invention.
따라서, 본 발명의 유전자 이식 생쥐는 비만(obesity) 등의 분자생물학적 연구 및 치료제 개발에 유용하다.Therefore, the transgenic mice of the present invention are useful for molecular biological research such as obesity and the development of therapeutic agents.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, these examples are intended to illustrate the present invention by way of example, the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. 생쥐 텔로머라제 유전자 구조체의 구축 및 유전자 이식 생쥐의 생산. Example 1 Construction of Mouse Telomerase Gene Construct and Production of Transgenic Mice.
1. 생쥐 텔로머라제 유전자 구조체의 구축1. Construction of the Mouse Telomerase Gene Structure
생쥐의 텔로머라제 DNA (젠뱅크 등록번호 번호 AF051911)를 닭의 베타 액틴 프로모터와 토끼의 베타-글로빈 폴리아데닌 형성 부위에 삽입함으로써 발현벡터를 제작하였다. 양쪽 끝에 EcoRI 접착성 말단을 갖는 생쥐의 텔로머라제 cDNA (젠뱅크 등록번호 AF051911)를 pCAGGS 벡터(Niwa 등, 1991, Gene, 108, 193∼199) 내에 닭의 베타 액틴 프로모터와 토끼의 베타-글로빈 폴리아데닌 형성 부위 사이의 멀티클로닝사이트내 EcoRI 위치에 삽입함으로써 발현 벡터를 제작하였다. 이 발현 벡터로 대장균을 형질전환시키고, 그로부터 추출된 DNA를 통하여 재조합이 제대로 되었는지를 확인하였다. 상기 형질전환 대장균을 대량 배양하여 다량의 DNA를 분리하였다. 다음으로, 상기 DNA를 SalI과 HindIII로 잘라낸 후 약 5.7kb 크기의 원하는 DNA를 아가로즈 겔 상에서 추출하였다. 상기 DNA를 페놀 클로로포름 과정을 통하여 정제하고, 그 결과 얻어지는 DNA를 미세주입 버퍼 용액 (5∼10mM Tris pH 7.4 및 0.1∼0.25mM EDTA)에 약 2∼4ng/㎕의 농도로 희석하여 미세주입 DNA를 준비하였다. Expression vectors were constructed by inserting mouse telomerase DNA (Genbank Accession No. AF051911) into the beta actin promoter of chickens and the beta-globin polyadenine formation site of rabbits. The telomerase cDNA (Genbank Accession No. AF051911) of mice with EcoRI adhesive ends at both ends was immobilized in the pCAGGS vector (Niwa et al., 1991, Gene, 108, 193-199) and beta-globin in rabbits. Expression vectors were constructed by inserting at EcoRI sites in the multicloning sites between polyadenine forming sites. E. coli was transformed with this expression vector, and it was confirmed whether recombination was properly performed through DNA extracted therefrom. The transformed Escherichia coli was cultured in large quantities to separate a large amount of DNA. Next, the DNA was cut with SalI and HindIII, and the desired DNA of about 5.7 kb was extracted on an agarose gel. The DNA was purified through a phenol chloroform process, and the resulting DNA was diluted in a concentration of about 2 to 4 ng / μl in a microinjection buffer solution (5 to 10 mM Tris pH 7.4 and 0.1 to 0.25 mM EDTA). Ready.
2. 생쥐 수정란에의 미세주입2. Microinjection into Mouse Embryos
상기 발현벡터를 순수 정제하여 생쥐의 수정란에 미세주입하였다. 생쥐의 수정란은 다음과 같이 준비하였다. FVB/NJ 종의 암컷 생쥐로부터 과배란을 유도하기 위하여 PMSG(배란유도)와 HCG(난포자극) 성선자극 호르몬 각각 5 IU를 복강내에 투여하였다. 다음으로, 팽대부를 터트려 적은 수의 공급자 생쥐로부터 많은 수의 수정란을 얻었다. 얻어진 수정란에 히알우로니다제(300 ng/ml)를 2분 동안 처리하여 난구세포를 제거하였다. 수정란 중에서 핵이 잘 보이는 수정란을 선별하였고, 선별된 수정란을 웅성 전핵이 잘 보이는 위치에 고정하고 미세조작기를 이용하여 웅성 전핵에 미세주입 버퍼 용액 (5∼10mM Tris pH 7.4 및 0.1∼0.25mM EDTA)에 약 2∼4ng/㎕의 농도로 준비된 발현 벡터 DNA를 웅성 전핵의 부풀림(swelling)이 일어날 때까지 주입하였다. The expression vectors were purified purely and injected into the fertilized eggs of mice. Fertilized eggs were prepared as follows. To induce hyperovulation from female mice of FVB / NJ species, 5 IU of PMSG (ovulation induction) and HCG (follicular stimulation) gonadotropin were administered intraperitoneally. Next, the bulge was blown to obtain a large number of fertilized eggs from a small number of supplier mice. The obtained fertilized egg was treated with hyaluronidase (300 ng / ml) for 2 minutes to remove the oocytes. Among the fertilized eggs, the fertilized eggs with good nuclei were selected, and the selected fertilized eggs were fixed to the positions where the male pronucleus was well visible and the microinjection buffer solution (5 to 10 mM Tris pH 7.4 and 0.1 to 0.25 mM EDTA) was inserted into the male pronucleus using a micromanipulator. Expression vector DNA prepared at a concentration of about 2 to 4 ng / μl was injected until swelling of the male pronucleus occurred.
3. 미세주입된 수정란의 대리모 생쥐의 수란관내에 삽입3. Microinjection of Embryos Inserted into Surrogate Tubes of Surrogate Mother Mouse
DNA가 주입된 수정란 중 건강한 것과 용해된 것을 분류하여 용해된 것을 버리고, 건강한 것을 M16 배지에 넣고 37 배양기에서 배양하였다. 대리모와 교배시키는 수컷 생쥐는 ICR 순계(inbred) 주를 사용하였다. 상기 수컷 생쥐는 정관 수술한 뒤 다른 암컷 생쥐와 교배시켰을 때 질전(vaginal plug)이 있어도 새끼가 태어나지 않는 것을 확인하였다. 배란기에 가까운 ICR 암컷 생쥐를 정관 수술한 수컷 생쥐와 교배시켜 질전이 있으면 대리모로 사용하였다. 수술은 Avertin (100%)을 완충용액(TDW : 3차 증류수)으로 40 배 희석한 마취약을 생쥐 몸무게 10g 당 0.14ml를 복강내에 주사하고, DNA가 주입된 수정란 20∼25개를 양쪽 수란관 내로 삽입한 뒤 수술부위를 봉합하였다.Among the fertilized eggs injected with DNA, the healthy and the dissolved ones were classified and discarded. The healthy ones were placed in M16 medium and cultured in 37 incubators. Male mice mating with surrogate mothers used ICR inbred strains. The male mouse was confirmed that the baby is not born even if there is a vaginal plug when crossed with other female mice after the vasectomy. ICR female mice near the ovulation phase were crossed with male mice that had undergone vas deferens and used as surrogate mothers if they had vagina. Surgery was performed by injecting an anesthetic drug diluted 40-fold with Avertin (100%) in buffer solution (TDW: tertiary distilled water) into the abdominal cavity by injecting 0.14ml per 10g of mouse's weight into the abdominal cavity. The surgical site was then sutured.
4. 유전자 이식 생쥐의 사육4. Breeding of Transgenic Mice
태어난 생쥐 꼬리의 게놈 DNA를 이용하여 PCR과 서던 블롯팅(Southern blotting)을 실시하여 생쥐 텔로머라제 유전자가 염색체내에 삽입되었는지를 확인하였다. 그 결과, 5번, 23번 및 27번 라인의 3 종류의 유전자 이식 생쥐(tg/+, 반접합체)가 생산되었다. 이들 중 5번 라인의 반접합 유전자 이식 생쥐(hemizygous transgenic mouse) 간의 교배로 태어난 동형 접합 유전자 이식 생쥐(tg/tg)에서 다른 종류들에선 나타나지 않는 독특한 형질이 확인되었고, 이에 이 동형 접합체 유전자 이식 생쥐에 대하여 표현형 및 유전형을 분석하였다. PCR and Southern blotting were performed using genomic DNA of the born mouse tail to confirm that the mouse telomerase gene was inserted into the chromosome. As a result, three kinds of transgenic mice (tg / +, semizygote) of lines 5, 23 and 27 were produced. Of these, homozygous transgenic mice (tg / tg) born from crossing between line 5 hemizygous transgenic mice showed unique traits that did not appear in other species. Phenotype and genotype were analyzed for.
5번 라인의 반접합 유전자 이식 생쥐간의 교배에 의하여 태어난 동형접합 유전자 이식 생쥐(tg/tg)를 사육하여 그 표현형을 관찰하였다. 그 결과, 운동실조증세(ataxia)와 활동항진상태(hyperactivity)의 독특한 표현형을 나타내는 것을 발견하였다. 또한, 이들은 유아기로부터 성체기까지 여윈 형질을 나타내었으며, 수컷 불임은 관찰되지 않았다. Homozygous transgenic mice (tg / tg) born by crossing between transgenic mice in line 5 were bred and their phenotypes were observed. As a result, it was found that they exhibited a distinctive phenotype of ataxia and hyperactivity. In addition, they showed thin traits from infancy to adulthood, and no male infertility was observed.
실시예 2. 유전자 이식 생쥐의 유전형의 분석Example 2. Analysis of Genotypes of Transgenic Mice
실시예 1에서 발견된 운동실조증세 및 활동항진상태의 표현형을 갖는 텔로머라제 유전자 이식 생쥐의 유전형을 분석하기 위하여, 먼저 어느 염색체에 삽입되었는지를 분석하였다. In order to analyze the genotypes of telomerase transgenic mice with phenotypes of ataxia and hyperactivity found in Example 1, it was first analyzed which chromosomes were inserted.
텔로머라제 유전자 이식 생쥐 중 상기와 같은 표현형을 갖지 않는 생쥐(27번 라인)와 상기 표현형을 갖는 생쥐(5번 라인)로부터 얻어진 시료를 사용하여 서던 블롯팅을 수행하여, 상기 표현형을 갖는 텔로머라제 이식 생쥐에서 특이적으로 나타나는 DNA 조각을 검출하였다. 상기 DNA 조각을 아가로즈 겔 상에서 추출한 후 자가-결합(self-ligation) 반응을 통하여 원형 DNA를 만들었다. 다음으로, 상기 DNA를 주형으로 하여 역방향-PCR(inverse PCR)을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머의 서열은 센스 프라이머로서 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드, 안티센스 프라이머로서 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 그 결과, 특정 크기의 PCR 산물이 생성되었고, 이 PCR 산물을 염기서열 분석하였다. 상기 염기서열 분석 결과 얻어진 서열 정보를 토대로 생쥐 게놈 데이터베이스를 검색하였다.Among the telomerase transgenic mice, blotting was performed by Southern blotting using a sample obtained from a mouse having no such phenotype (line 27) and a mouse having the phenotype (line 5). DNA fragments specific to the first transplanted mice were detected. The DNA fragments were extracted on an agarose gel and then produced circular DNA through a self-ligation reaction. Next, reverse-PCR (inverse PCR) was performed using the DNA as a template. The oligonucleotides of SEQ ID NOs: 1 and 2 were used as sense primers and the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 3 and 4 were used as antisense primers. As a result, a PCR product of a specific size was produced, and the PCR product was sequenced. The mouse genome database was searched based on the sequence information obtained as a result of the sequencing.
그 결과, 이식에 사용된 텔로머라제 유전자가 Unc5h3라는 유전자의 인트론 1에 삽입되었음을 확인하였다. 또한, 상기 텔로머라제 유전자가 Unc5h3 유전자에 단순하게 삽입된 것이 아니라, 인트론 서열의 일부분을 제거하면서 삽입되었음을 확인하였다. 구체적으로는, Unc5h3 유전자의 1번 엑손과 2번 엑손 사이의 인트론(212,992bp)(이하 1번 인트론이라 한다)의 80,503번 뉴클레오티드로부터 131,168번 뉴클레오티드까지가 제거되었음을 확인하였다. 다음으로 실제로 이와 같이 삽입되었는지를 확인하기 위하여, 제거가 일어난 부분에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물을 전기영동하여 분석하였다. 그 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, Unc5h3 유전자의 인트론 내에 텔로머라제 유전자가 삽입되었고(PCR 산물 a′ 과 b′ ), 그와 함께 약 50kb가 제거되었음을 확인하였다 (PCR 산물 i-1 내지 i-5 참조). 도 1b는 도 1a의 결과를 도식적으로 나타낸 것이다. PCR에 사용된 프라이머는 다음 표 1과 같다.As a result, it was confirmed that the telomerase gene used for transplantation was inserted into intron 1 of a gene called Unc5h3. In addition, it was confirmed that the telomerase gene was inserted by removing a part of the intron sequence, not simply inserted into the Unc5h3 gene. Specifically, it was confirmed that up to 131,168 nucleotides were removed from nucleotides 80,503 of intron (212,992 bp) (hereinafter referred to as intron 1) between exons 1 and 2 of the Unc5h3 gene. Next, in order to confirm whether the insertion was actually performed in this way, PCR was performed using primers on the removed portion, and the obtained PCR product was analyzed by electrophoresis. The results are shown in Figure 1a. As shown in FIG. 1A, it was confirmed that the telomerase gene was inserted into the intron of the Unc5h3 gene (PCR products a 'and b'), and about 50 kb was removed with it (see PCR products i-1 to i-5). ). FIG. 1B schematically illustrates the results of FIG. 1A. Primers used for PCR are shown in Table 1 below.
표 1. PCR 산물과 프라이머Table 1. PCR Products and Primers
실시예 3. 유전자 이식 생쥐에서의 Unc5h3의 발현 양상 Example 3 Expression of Unc5h3 in Transgenic Mice
실시예 1에서 발견된 유전자 이식 생쥐의 여러 조직으로부터 RNA 시료를 얻고, 상기 RNA 시료를 주형으로 하여 역전사-PCR(RT-PCR)을 수행함으로써, 각 조직에서의 Unc5h3의 발현 수준을 확인하였다. RNA samples were obtained from various tissues of the transgenic mice found in Example 1, and reverse transcription-PCR (RT-PCR) was performed using the RNA samples as a template to confirm the expression level of Unc5h3 in each tissue.
RT-PCR은 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 각 조직을 분쇄기로 분쇄한 후 트리졸 용액을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 DNaseI 처리한 다음, 약 1㎍ 정도를 역전사 반응에 사용하였다. 랜덤헥사머를 이용하여 역전사 반응을 수행하고, 그로부터 얻어지는 산물을 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 프라이머로서 센스 프라이머로서 서열번호 19 및 안티센스 프라이머로서 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 그 결과, 약 100bp의 PCR산물을 확인할 수 있었다. RNA 품질 표준(quality control)으로써 대표적 하우스키핑 유전자인 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제(GAPDH) 유전자의 cDNA를 함께 증폭하였다. RT-PCR was performed under the following conditions. Each tissue was ground with a grinder and total RNA was extracted using Trizol solution. The extracted RNA was treated with DNaseI, and about 1 μg was used for reverse transcription. Reverse transcription was performed using a random hexamer, and PCR was performed using the product obtained as a template. Oligonucleotides of SEQ ID NO: 19 as sense primers and SEQ ID NO: 20 as antisense primers were used as primers. As a result, the PCR product of about 100bp could be confirmed. As a RNA quality control, the cDNA of the typical housekeeping gene, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene, was amplified together.
그 결과를 도 2a에 나타내었다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 고환을 제외한 소뇌(cerebellum), 폐(lung), 지라(spleen) 및 난소(ovary)에서 Unc5h3 발현이 거의 되지 않음을 알 수 있었다.The results are shown in Figure 2a. As shown in Figure 2a, it was found that the expression of Unc5h3 in the cerebellum (ceunglum), lung (lung), spleen and ovary except for the testicles is hardly.
또한, 유아기 생쥐와 성체 생쥐의 뇌로부터 mRNA를 추출하고, 전기영동을 실시한 후 노던블롯팅(Nothern blotting)을 실시함으로써, 유아기와 성체의 뇌에서의 Unc5h3의 발현 수준을 확인하였다. In addition, mRNA was extracted from the brains of infancy mice and adult mice, followed by electrophoresis, followed by Northern blotting to confirm the expression level of Unc5h3 in the brains of infants and adults.
노던 블롯팅은 다음과 같은 조건에서 수행하였다. 유아기 생쥐(약 1 주령)와 성체 생쥐(약 12 주령)로부터 뇌 조직을 분리한 후 조직 분쇄기로 분쇄하고, 트리졸 용액을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 정량한 후 약 40∼60㎍의 RNA를 이용하여 블롯을 제조하였다. 이 블롯을 Unc5h3의 엑손 1번 단편을 프로브로 하여 Unc5h3의 발현량을 확인하였다. Northern blotting was performed under the following conditions. Brain tissues were separated from infant mice (approximately 1 week old) and adult mice (approximately 12 weeks old), crushed by a tissue mill, and total RNA was extracted using a trizol solution. After quantifying the extracted RNA, a blot was prepared using about 40 to 60 µg of RNA. In this blot, the expression level of Unc5h3 was confirmed using the exon 1 fragment of Unc5h3 as a probe.
그 결과를 도 2b에 나타내었다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 유아기와 성체의 뇌 모두에서 Unc5h3의 발현 수준이 야생형 생쥐에 비하여 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다. The results are shown in Figure 2b. As shown in Figure 2b, it was found that the expression level of Unc5h3 in both the infant and adult brain is significantly suppressed compared to wild-type mice.
이상과 같은 결과는, 비록 텔로머라제 이식유전자(transgene)가 Unc5h3의 인트론 부위에 삽입되어 있지만, 그에 의하여 유전자의 발현에 관여하는 조절 부위가 영향을 받아 Unc5h3 유전자의 발현이 억제되고 있기 때문인 것으로 여겨진다.The above results are thought to be due to the fact that the telomerase transgene is inserted into the intron region of Unc5h3, whereby the regulatory site involved in gene expression is affected and the expression of the Unc5h3 gene is suppressed. .
실시예4. 유전자 이식 생쥐의 해부학적 조직학적 분석Example 4. Anatomical Histological Analysis of Transgenic Mice
야생형 생쥐(FVB/NJ, 12 주령)와 실시예 1에서 발견된 유전자 이식 생쥐(12 주령)로부터 뇌를 채취하여 뇌의 구조를 비교하였다. Brains were collected from wild-type mice (FVB / NJ, 12 weeks old) and transgenic mice (12 weeks old) found in Example 1, and the brain structures were compared.
도 3은 야생형 생쥐와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐로부터 채취한 뇌의 사진이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 생쥐의 뇌는 야생형 생쥐에 비하여 소구(colliculus) 부분이 돌출되어 있으며(도 3a), 소뇌(cerebellum)의 크기가 작고 소뇌의 소엽(lobule)의 수도 줄어들었음을 알 수 있다(도 3b). 또한, 뇌 조직 절편을 크레실 비올렛(cresyl violet) 염색을 통한 분석에서, 소뇌의 세포가 제1차 청각반사와 관계가 있는 하구(inferior colliculus)에 침투해 있음을 알 수 있다 (도 3c). 도 3에서 도 3a는 뇌의 구조를 비교하기 위하여 전체 뇌를 적출하여 바로 사진을 찍은 것이고, 도 3b는 전체 뇌에서 소뇌 부분만 부각시킨 사진이다. 도 3a 및 3b에서 나타낸 바와 같이, 소뇌의 크기가 서로 다르고, 소엽(lobule)의 구조도 다름을 알 수 있다. 도 3c는 뇌를 분리한 후 시상봉합 절편(sagital section)을 준비한 후 크레실 비올렛 시약으로 염색한 사진으로서, 전체 절편에서 소뇌의 세포가 하구에 침투한 것이 부각되어 있다. 도 3에서는 화살표는 소구(Colliculus), Cb는 소뇌(Cerebellum), Cbl은 소뇌 소엽(Cerebellum lobule), IC는 하구(inferior colliculus) 및 Mes는 중뇌(Mesencephalon)을 나타낸다. Figure 3 is a photograph of the brain taken from wild-type mice and the transgenic mice according to Example 1. As shown in FIG. 3, the brain of the mouse of the present invention has a prominent part of the globules (colliculus) as compared to wild-type mice (FIG. 3A), the size of the cerebellum is small, and the number of lobules of the cerebellum is reduced. It can be seen (Fig. 3b). In addition, analysis of brain tissue sections through cresyl violet staining shows that the cells of the cerebellum penetrate the inferior colliculus associated with primary auditory reflection (FIG. 3C). . In FIG. 3, FIG. 3A is a picture taken by extracting the whole brain to compare the structure of the brain, and FIG. As shown in Figure 3a and 3b, the size of the cerebellum is different, it can be seen that the structure of the lobules (lobule) is also different. Figure 3c is a photograph of the sagittal suture (sagital section) after separation of the brain and stained with Cresyl violet reagent, the whole section is highlighted that the cells of the cerebellum infiltrate the estuary. In FIG. 3, an arrow represents a colloid, Cb represents a cerebellum, Cbl represents a cerebellum lobule, an IC represents an inferior colliculus, and Mes represents a mesencephalon.
실시예 5. 유전자 이식 생쥐의 몸무게와 지방 조직의 무게 측정Example 5 Measurement of Body Weight and Adipose Tissue Weight in Transgenic Mice
야생형 생쥐와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐의 몸무게를 생후 10일부터 약 100일까지 측정하였다. 또한, 야생형 생쥐와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐(동형접합체 tg/tg 및 반형접합체 tg/+)의 생식선 지방조직(gonadal fat pad)의 무게를 측정하였다. The weights of wild-type mice and transgenic mice according to Example 1 were measured from 10 days after birth to about 100 days. In addition, the weight of the gonadal fat pad (gonadal fat pad) of wild type mice and transgenic mice according to Example 1 (homozygotes tg / tg and hemizygotes tg / +) was measured.
도 4는 야생형 생쥐와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐의 몸무게와 생식선 지방조직의 무게의 측정 결과를 나타낸다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐(tg/tg)는 야생형 생쥐(WT)에 비하여 몸무게가 적고, 종래 동일한 유전자에 돌연변이가 발생한 생쥐의 경우와는 달리 저체중 상태는 유아기부터 성체 시기까지 계속 지속되었다.Figure 4 shows the measurement results of the weight of the body type and gonad adipose tissue of wild-type mice and transgenic mice according to Example 1. As shown in Figure 4a, the transgenic mice according to Example 1 (tg / tg) is less weight than the wild-type mice (WT), unlike in the case of mice with mutations in the same gene conventionally low body weight from infancy It continued until adulthood.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 야생형 생쥐와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐(동형접합체 tg/tg)의 생식선 지방조직 무게가 야생형에 비하여 현저히 적음을 알 수 있다. 이는 상기 몸무게의 감소가 생식선 지방 조직의 무게의 감소와 밀접한 관계가 있음을 나타내는 것이다. In addition, as shown in Figure 4b, it can be seen that the germline adipose tissue weight of the wild-type mouse and the transgenic mouse according to Example 1 (homogenous conjugate tg / tg) is significantly less than the wild type. This indicates that the decrease in weight is closely related to the decrease in the weight of the gonad adipose tissue.
도 5는 각각 야생형 생쥐(WT)와 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐(동형접합체 tg/tg)의 사진(도 5a)과 생식선 지방조직의 사진(도 5b)이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에 따른 유전자 이식 생쥐(동형접합체 tg/tg)와 그의 생식선 지방조직이 야생형에 비하여 현저하게 작은 것을 확인할 수 있다.FIG. 5 is a photograph of wild type mice (WT) and transgenic mice (homogenous conjugate tg / tg) according to Example 1 (FIG. 5A) and a photograph of germline adipose tissue (FIG. 5B). As shown in FIG. 5, it can be seen that the transgenic mice (homozygote tg / tg) and its germline adipose tissue according to Example 1 are significantly smaller than the wild type.
본 발명에 따른 Unc5h3 유전자의 1번 엑손과 2번 엑손 사이의 인트론에 돌연변이를 포함하는 여윈 표현형(lean phenotype)을 갖는 유전자 이식 생쥐는 여윈 표현형 또는 비만(obesity)과 관련된 분자생물학적 연구, 그를 이용한 비만 치료제의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.Transgenic mice with a lean phenotype comprising a mutation in the intron between exon 1 and exon 2 of the Unc5h3 gene according to the present invention are molecular biological studies related to a thin phenotype or obesity, obesity using the same It can be usefully used for the development of therapeutic agents.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 유전자 이식 생쥐의 유전형의 분석 결과이다.1A and 1B show results of genotyping of transgenic mice of the present invention.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 유전자 이식 생쥐에서의 Unc5h3 유전자의 발현 양상을 나타내는 도면이다.Figure 2a and Figure 2b is a view showing the expression of Unc5h3 gene in transgenic mice of the present invention.
도 3a, 도 3b 및 도 3c는 본 발명의 유전자 이식 생쥐로부터 유래한 뇌의 해부학적 사진이다.Figures 3a, 3b and 3c is an anatomical picture of the brain derived from the transgenic mice of the present invention.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 유전자 이식 생쥐의 생후 일정기간 동안의 몸무게 및 생식선 지방조직 무게를 관찰 결과를 나타내는 도면이다.Figures 4a and 4b is a view showing the results of observation the weight and gonad adipose tissue tissue weight for a certain period of time after birth of the transgenic mice of the present invention.
도 5는 본 발명의 유전자 이식 생쥐의 성체 및 생식선 지방조직을 나타내는 도면이다.Figure 5 shows the adult and gonad adipose tissue of the transgenic mice of the present invention.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO.LTD. <120> A transgenic mouse having a lean phenotype <130> SB00010 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER pCA5F1 : FORWARD <400> 1 ggccctataa aaagcgaagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER pCA5F2 : FORWARD <400> 2 gctcgtttct tttctgtggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER pCA5R1 : REVERSE <400> 3 ggaaagtccc tattggcgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER pCA5R2 : REVERSE <400> 4 tcacctcgac ccatggtaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER A-F : FORWARD <400> 5 gccttgttag acagcagaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER A-R : REVERSE <400> 6 ctttagcatt tgcagagccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-1F : FORWARD <400> 7 ctacccatcc cacatgttac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA 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pCA5R1: REVERSE <400> 3 ggaaagtccc tattggcgtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER pCA5R2: REVERSE <400> 4 tcacctcgac ccatggtaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER A-F: FORWARD <400> 5 gccttgttag acagcagaag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER A-R: REVERSE <400> 6 ctttagcatt tgcagagccc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-1F: FORWARD <400> 7 ctacccatcc cacatgttac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-1R: REVERSE <400> 8 ggactctgtt catctcaagg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-2F: FORWARD <400> 9 gacttgcaac cttctctggc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-2R: REVERSE <400> 10 atacaggatg gcaccaaagc 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PRIMER I-3F: FORWARD <400> 11 gcctgctgtc atagggtca 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2003
- 2003-08-30 KR KR1020030060548A patent/KR20050022811A/en not_active Application Discontinuation
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2004
- 2004-08-30 WO PCT/KR2004/002173 patent/WO2005020682A1/en active Application Filing
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005020682A1 (en) | 2005-03-10 |
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