KR20050022276A - Extract of plant dendrobii caulis and preparing process thereof - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: An extract of plant Dendrobii caulis and a preparation process thereof are provided, which extract enhances the activity of retinal pigment epithelium, and reduces AGE(advanced glycation end product) content in a biological object. CONSTITUTION: The extract of plant Dendrobii caulis is prepared by extraction of Dendrobii caulis with water-soluble organic solvent or a mixture of the water-soluble organic solvent and water, wherein the water-soluble organic solvent is C1-C8 alcohol, alkyl or ester; and the extract comprises physiologically acceptable carrier. The process for preparing the extract of plant Dendrobii caulis comprises the steps of: (a) extracting Dendrobii caulis with first alcohol; (b) extracting the first alcohol extract with water and alkyl to prepare a first water-soluble extract and alkyl extract; (c) extracting the first water-soluble extract with ester to prepare the ester extract and a second water-soluble extract; and (d) extracting the second water-soluble extract with second alcohol to prepare a second alcohol extract and a third water-soluble extract.

Description

곽산 석곡 추출물 및 그 제조 방법{EXTRACT OF PLANT DENDROBII CAULIS AND PREPARING PROCESS THEREOF} Kwaksan Seokgok Extract and its manufacturing method {EXTRACT OF PLANT DENDROBII CAULIS AND PREPARING PROCESS THEREOF}

본 발명은 망막흑색소 상피(網膜黑色素上皮;retinal pigment epithelium; RPE)의 조제를 제어하는 세포작용을 갖는 추출물 및 그 제조 프로세스에 관한 것이며, 특히, 곽산 석곡(石斛;Dendrobii Caulis) 추출물 및 그 제조 프로세스에 관한 것이다.TECHNICAL FIELD The present invention relates to an extract having a cellular action for controlling the preparation of retinal pigment epithelium (RPE) and a process for preparing the same, and in particular, a extract of Kwaksan Dendrobii Caulis and its preparation It's about the process.

현재 민간에서 가장 중요한 안과용 중국약초는 석곡이며, 이 석곡은 난초과에 속하며 그 약용부위는 줄기이다. 감미로운 맛이 있으면서도 소금기가 있다. 어느 일부 중국의 약물사본에는 석곡 종류가 예를 들면 타액분비장애(salivary defects), 위통 및 안과장해(眼科障害)와 같은 병의 치료에 효과가 있는 것이 개시되고 있다. 우리의 이전의 연구조사의 경험에 의하면 석곡은 가장 약효가 있는 것이다.At present, the most important ophthalmic Chinese herbal medicine in the private sector is Seokgok, which belongs to Orchidaceae, and its medicinal part is stem. It has a sweet taste and is salty. In some Chinese drug copies, it is disclosed that the types of grains are effective in the treatment of diseases such as salivary defects, stomach pain and ocular disorders. According to our previous research, Seokgok is the most effective.

RPE 세포는 망막(網膜)의 최외층(最外層)에 위치하고, 브르크막(Bruch's membrane)과 광수용체(photoreceptors) 사이에 배열되어 하나의 단층세포(1)를 형성하고 있다. RPE 세포의 상단부의 길고 부드러운 모(毛) 형상의 돌기(villous process)는 광수용체의 바깥쪽 단과 서로 접촉하고, 그 하단에는 많은 브르크막을 통과하여 맥락막(脈絡膜;choroid)과 긴밀하게 연접된 베이설 인플로이딩(basal inflodings)이 있다. 이것은 효과적으로 맥락막 및 망막 신경층의 유독물질 및 대사물(代謝物)을 청소 또는 수송하므로, RPE 세포도 매우 중요한 망막혈관 배리어(blood-retinal barrier)를 구성한다.RPE cells are located in the outermost layer of the retina and are arranged between Bruch's membrane and photoreceptors to form a single monolayer cell (1). The long, smooth villous process at the top of the RPE cells contacts each other with the outer ends of the photoreceptors, and at the bottom they pass through many of the Brux membranes and are intimately connected to the choroid. There are basal inflodings. This effectively cleanses or transports toxicants and metabolites of the choroid and retinal nerve layers, so RPE cells also constitute a very important blood-retinal barrier.

그 외에, RPE도 광선을 흡수하는 기능을 갖는 것 외에, 탐식포(貪食胞; phagosome) 형상의 세포 및 추상세포(錐狀細胞;cone cell)가 광선의 자극을 받아 몰락한 외절(rod outer segments;ROS), 탐식포의 분해, 세포외기질(extracellular matrix)과 멜라닌의 합성, 광수용체의 외단의 재생시에 필요한 물질의 제공, 비타민A의 저장 및 운송, 로드프신의 합성(rhodopsin), 망막의 접착력 등의 작용과 연관된다. 통계에 따르면, 쥐(rat)의 하나의 RPE 세포는 하루에 25,000개의 간상세포(rod cell) 및 추상세포가 광선의 자극을 받아서 몰락한 외절을 청소하지 않으면 안된다. 이것은 이와 같이 빈번한 탐식기능의 중요성을 말하는 것이다(2). RPE 세포의 정상적인 탐식작용은 망막 중의 광수용체의 건강유지에 대하여 큰 관련성을 가지므로, 일단 탐식기능이 저하하면 광수용체의 퇴화(degeneration)를 초래한다(3). 그것은 RPE 세포는 연령의 증가에 따라서 사망 또는 다른 곳으로 유리되므로로, 예를 들어 노화된 RPE 세포가 탐식능력을 갖는다고 하여도 그 소화흡수(digestion) 능력은 벌써 명확하게 저하하고 있다(4). 1995년 Panda-Jonas 등의 사람들은 이미 사람의 광수용체는 매년 0.2-0.4% 손실되는 동시에, 간상세포의 손실은 추상세포의 손실보다도 많다고 지적하고 있다(5). 이것은 노인들의 시력감퇴 및 병의 발생을 초래하므로, RPE 세포의 기능유지는 시각계통에 대하여 매우 중요하다.In addition, the RPE also has a function of absorbing light, and rod outer segments in which phagosome-shaped cells and abstract cells collapsed due to light stimulation. (ROS), degradation of phagocytes, synthesis of extracellular matrix and melanin, provision of substances necessary for the regeneration of photoreceptors, storage and transport of vitamin A, synthesis of rhodopsin, and retinal Associated with the action of adhesion and the like. According to statistics, one RPE cell in a rat must clean up the extinction of 25,000 rod cells and abstract cells a day due to light stimulation. This speaks of the importance of this frequent phagocytosis (2). Since normal phagocytosis of RPE cells is highly related to the maintenance of photoreceptor health in the retina, once the phagocytosis decreases, photoreceptor degeneration occurs (3). That is because RPE cells are released to death or elsewhere with age, so even if aged RPE cells have phagocytosis, their digestive capacity is already clearly deteriorated (4). . In 1995, Panda-Jonas et al. Already pointed out that human photoreceptors lose 0.2-0.4% annually, while the loss of rods is more than the loss of abstract cells (5). Since this causes deterioration of vision and disease in the elderly, maintaining the function of RPE cells is very important for the visual system.

또한, 산화질소(NO)는 성질이 불안정하고 반감기가 수초밖에 되지 않는 불안정한 가스분자(6)이지만, 여러 종류의 생리기능을 갖고 있다. 이 산화질소(NO)는 전기중성이므로 자유롭게 세포막을 투과하여 진출할 수 있다(7). 한편 산화질소는 홀전자(unpaired electron)를 갖고 있으므로, 자유 라디칼과 유사하여 고도의 반응력을 가지며, 일단 형성하면 신속하게 세포막을 통과하여 작용을 발생시킨다(8). 면역계통에 있어서 산화질소는 세포독성을 방어 및 제어하는 역할을 한다. 그리고 혈관계통에 있어서 산화질소는 소위 내피세포 이완인자(EDRF)이고, 중추신경계통에 있어서 신경전도물질(Neurotransmitter)(7)로서 작용한다.In addition, nitrogen oxide (NO) is an unstable gas molecule 6 having an unstable property and having only a half life of several seconds, but has various physiological functions. Since nitric oxide (NO) is electroneutral, it can freely penetrate the cell membrane (7). On the other hand, since nitric oxide has unpaired electrons, it has a high reaction force similar to free radicals and, once formed, rapidly passes through the cell membrane to generate action (8). In the immune system, nitric oxide serves to defend and control cytotoxicity. Nitric oxide in the vascular system is called endothelial cell relaxor (EDRF) and acts as a neurotransmitter (7) in the central nervous system.

산화질소는 산화질소 신타아제(nitric oxide synthase;NOS)에 있어서, L-알기닌(L-arginine)을 L-시트룰린(L-citrulline)으로 전환하는 과정 중에서 석방되지만, 눈앞에 도달하기까지 상세한 산화질소 합성기제는 또한 완전하고 명백하게 알려져 있지 않다. 산화질소 신타아제에는 3종류의 이구체(異構體i;soforms)가 있으며, 그 중 neuronal NOS 및 endothelial NOS는 기본형이고 cNOS로 약칭한다. 그 활성으로서 칼슘이온 Ca++ 및 칼모듈린(calmodulin)의 조절을 받아서 발생하는 산화질소는 nM(10-9M) 레벨에 속한다. 어떤 종류는 immunologic NOS로서 유발가능형(inducible form)에 속하고 iNOS로 약칭한다. 그러나 그 활성은 Ca++ 및 칼모듈린의 조절을 받지 않고, 발생한 산화질소는 mM(10-6M) 레벨에 속한다. 그 중, cNOS 및 iNOS의 유전자(gene)는 다른 염색체 상에 위치한다(인류라면, endothelial on chromosome 7, Neuronal on chrosome 12, iNOS on chromosome17)(8,9).Nitric oxide is released during nitric oxide synthase (NOS) in the process of converting L-arginine to L-citrulline, but detailed nitric oxide until reaching the eye Synthetic bases are also completely unknown. There are three types of nitric oxide synthase (체 formi; soforms), of which neuronal NOS and endothelial NOS is the basic form, abbreviated as cNOS. As its activity, nitric oxide produced by the control of calcium ions Ca ++ and calmodulin belongs to nM (10 -9 M) level. Some are immunologic NOS, in inducible form and abbreviated iNOS. However, its activity is not regulated by Ca ++ and calmodulin, and the generated nitric oxide belongs to the mM ( 10-6 M) level. Among them, genes of cNOS and iNOS are located on different chromosomes (if human, endothelial on chromosome 7, Neuronal on chrosome 12, iNOS on chromosome17) (8,9).

현재 이미 망막 속의 망막신경세포(retinal neuron), RPE 세포, 무축삭세포 및 신경절세포(amacrine and ganglion cells), 뮐러세포(Muller cells) 등, 모두 산화질소 신타아제(NOS)의 존재가 있는 것을 발견하였다. 또한, 현재에 이르기까지, 이미 산화질소가 생리 및 병리상태에 있어서 모두 중요한 역할을 하는 동시에, 눈의 기능관계와 밀접한 것이 뒷받침되었다(10). 1994년, Kurenny 등의 사람들은 산화질소는 광수용체 상의 전압-게이트 이온 채널의 기능을 갖고 있음을 지적하였다. 따라서, 산화질소는 광선정보의 전달과 관련될 가능성이 있는 것으로 추측되었다(11). 1993년 Deussen 등의 사람들은 기초환경(basal condition) 또는 국소빈혈(局所貧血;ischmia) 하에서 산화질소는 망막혈류량의 제어능력을 갖는 것을 발견하였다(12). Tilton 등의 사람들도 산화질소는 당뇨병에 의해 기인된 망막내혈관이 받는 손실의 정도를 조절하는 것이 가능하다는 것을 지적하였다(13). 그리고, 1994년 Goureau 등의 사람들은 망막신경 아교세포(retinal glial cells) 및 망막색소 상피세포가 LPS, IFN-g, TNF-a의 자극을 받으면 NOS(nitric oxide synthase)의 표현을 촉진시키게 되고, 마침내 산화질소(NO)를 대량생산한다고 지적하고 있다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, 산화질소는 망막이 염증을 입거나 또는 감염된 경우에는 방어역할을 할 수 있다(14). 그러나, 현재에 이르기까지, cNOS의 광수용체에서의 위치 및 특성은 아직 명확하지 않은 점이 있고, 어떤 문헌에서는 광수용체 본체에는 cNOS 활성이 있다고 지적하고 있지만, 또 어떤 문헌에서는 광수용체 외단에야말로 cNOS 활성이 있으며, 산화질소를 발생시킴으로써 광선의 전도(傳導), 신경시냅스(neuron synapse)의 신호전달, 생리상태하 또는 허혈상태하에서의 망막의 혈류량 등을 조절할 수 있다고 지적하고 있다(10). iNOS의 활성도 망막의 어떤 세포 중에 표현되고 있고, 예를 들면, RPE 세포 및 뮐러세포 등에서는 문헌에 보빈 RPE(bovine RPE) 배양에서, 만일 IFN-τ, LPS, TNF-α의 자극 후 약 12시간 경과하면 대량의 산화질소를 발생시킴과 함께 적어도 96시간 동안 지속된다고 지적하고 있다(15). 사이토킨(cytokines)의 RPE 세포의 iNOS 활성시의 영향은 상당히 복잡하다. 예를 들면, 보빈 RPE에 있어서는, LPS 및 IFN-τ 또는 IFN-α의 자극을 받게 되고, 이 자극이 있고 나서 대량의 산화질소가 발생할 수 있다. 그리고, bFGF는 NOS를 억제하는 작용을 가지며, TGF-β는 얼마의 촉진작용을 갖고 있다(18). 또한, 인간의 RPE 세포에 있어서는 반드시 Interleukin-1β의 자극이 있고 나서 비로소 대량의 NO를 발생시킬 수 있으며, LPS는 영향이 없고, TGF-β는 명백하게 산화질소를 발생시키는 것을 억제할 수 있다.Currently, retinal neurons, RPE cells, amacrine and ganglion cells, Muller cells, etc. in the retina are all present in the presence of nitric oxide synthase (NOS). It was. In addition, to date, nitric oxide has already played an important role in both physiology and pathology, and it is supported by close relationship with the functional relationship of the eyes (10). In 1994, Kurenny et al. Pointed out that nitric oxide functions as a voltage-gate ion channel on photoreceptors. Therefore, it was assumed that nitric oxide may be related to the transmission of light information (11). In 1993, Deussen et al. Found that nitric oxide had control of retinal blood flow under basal conditions or ischmia (12). Tilton et al. Also pointed out that nitric oxide is able to control the degree of loss of endothelial blood vessels caused by diabetes (13). And in 1994, people like Goureau promoted expression of nitric oxide synthase (NOS) when retinal glial cells and retinal pigment epithelial cells were stimulated by LPS, IFN-g, and TNF-a. It is pointed out that the mass production of nitric oxide (NO) finally. As can be seen, nitric oxide may act as a defense when the retina is inflamed or infected (14). However, to date, the location and properties of cNOS in the photoreceptor are not yet clear, and some documents indicate that the photoreceptor body has cNOS activity, while others have cNOS activity outside the photoreceptor. It is pointed out that the generation of nitric oxide can regulate the conduction of light rays, the signaling of neuronal synapse, and the retinal blood flow under physiological or ischemic conditions (10). The activity of iNOS is also expressed in some cells of the retina, for example, in RPE cells and Müller cells, etc., in the culture of bovine RPE (bovine RPE), if about 12 hours after stimulation of IFN-τ, LPS, TNF-α It has been pointed out that it generates a large amount of nitric oxide and lasts for at least 96 hours (15). The effect of cytokine RPE cells on iNOS activity is quite complex. For example, in the bobbin RPE, stimulation of LPS and IFN-? Or IFN-? May occur, and a large amount of nitric oxide may occur after this stimulation. BFGF has a function of inhibiting NOS, and TGF-β has some promoting action (18). In addition, in human RPE cells, a large amount of NO can be generated only after stimulation of Interleukin-1β, LPS is not affected, and TGF-β can suppress the generation of nitric oxide clearly.

세균에 감염된 경우, iNOS의 표현(expressions)은 릴리스된 산화질소가 침입한 미생물을 살균하기 때문에 유리한 점이 있지만, 그 반면에 어떤 상황하에서는 릴리스된 산화질소가 과도하게 다량으로 생길 경우에는, 자가면역병 또는 패혈성(敗血性) 쇼크를 초래하게 된다. 1994년 Tilton 등의 사람들은 산화질소가 안저(眼底)의 염증반응과 관계가 있음을 설명하기 위해 제1 증거를 제출하였지만, 본 출원인은 iNOS 억제제(inhibitor)가 내독소(endotoxin)에 의해 초래된 포도막염(葡萄膜炎)을 차단할 수 있음을 발견하였다(18). 한편, Goureau 등의 사람들은 IFN-τ 및 LPS로 처리하여 대량의 산화질소를 발생시키지만, 이 작용은 aFGF, bFGF에 의해 억제된다고 지적하면서, iNOS에서의 표현에 있어 iNOS mRNA의 안정성을 제어하지는 않는 것으로 지적하였으므로, 본 출원인은 FGF는 내독소 또는 사이토킨에 의해 초래된 상해를 면하도록 보호할 수 있다고 추측하였다(19). 그밖에 1994년 Becquet 등의 사람들의 연구에 있어서, 소의 RPE 세포 배양시 SIN-1(NO의 공급자로 함)을 첨가 또는 사이토킨을 이용하여 세포를 자극하여 대량의 산화질소를 발생시키면 RPE 세포의 탐식활성이 억제되고, 이러한 작용은 산화질소 스캔벤져(예를 들면, 헤모그로브린) 또는 L-알기닌 유사물에 의해 회복되며, 또한, cGMP와 관련되지 않는다고 지적하였다. 이로부터 알 수 있는 바와 같이, iNOS는 망막에서도 면역조절의 역할을 하고 있다.In bacterial infections, the expression of iNOS is advantageous because the released nitric oxide sterilizes the invading microorganisms, while under certain circumstances, if the released nitric oxide is excessively large, autoimmune disease Or septic shock. In 1994, Tilton et al. Presented first evidence to explain that nitric oxide is associated with fundus inflammatory reactions, but Applicants found that iNOS inhibitors were caused by endotoxins. It was found that it could block uveitis (18). Goureau et al., On the other hand, treated with IFN-τ and LPS to generate large amounts of nitric oxide, but indicated that this action was inhibited by aFGF and bFGF, but did not control the stability of iNOS mRNA in expression in iNOS. Applicants have speculated that FGF can protect against injury caused by endotoxin or cytokines (19). In addition, in 1994, a study by Becquet et al. Showed that RPE cells are phagocytic activity when bovine RPE cells are cultured by adding SIN-1 (producing NO) or stimulating cells with cytokines to generate large amounts of nitric oxide. It is pointed out that this action is inhibited, and that this action is recovered by nitric oxide scanbenzers (eg hemoglobulin) or L-arginine analogs and is not related to cGMP. As can be seen from this, iNOS also plays a role in immunoregulation in the retina.

잘 알려져 있는 망막변성은 당뇨병에 의해 초래된 증식당뇨망막병증(proliferative diabetic retinopathy), 증식유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy) 및 노인성황반변성(aged-macular degeneration) 등이 있고(20), 그리고 망막변성은 모든 안과질환에 있어서 가장 치료하기 어려운 것이다. 고혈당(hyperglycemia)이 당화작용(glycation)의 발생을 가속화하여 AGE(advanced glycation end products)를 발생시키는 것은, 계속 당뇨병 후기에 초래된 각종 혈관, 신경 합병증(neuronal complication)과 밀접하게 관련되어 있는 것으로 인정되고 있다(21-25). AGE는 환원당(reducing sugar)의 알데히드기 또는 케톤기와 단백질의 프라이머리 아민산이 비효소의 작용을 경유하여 불안정한 시프당기(schiff base)를 발생시키고, 다시 아마드리 전위(Amadori rearrangement)에 의해 아마드리 생성물을 발생시키도록 형성되어 있다(26). 공지의 비효소 작용은 비가소반응이고 대체로 반감기가 긴 단백질 상에 발생하고 있으므로(27) AGE의 형성에 의해 단백질 교차결합(cross-linking)을 초래한 후, 단백질을 단백효소(protease)에 대하여 저항성을 발생시키므로 AGE의 누적은 노화의 표기이다(28,29). 연령의 증가에 따라서 뇌부의 추상신경, 브루크막(Bruch's membrane), 콜라겐 중의 AGE의 함유량도 상승한다. 비효소당화작용의 속률은 초급반응을 나타내고, 반응속율은 환원당 및 단백질의 농도에 의해 결정된다. 당뇨병 환자의 혈당농도는 일반 건강인에 비해 높으므로 더욱 당화작용의 발생을 가속시킨다. 당뇨병이 동맥죽상경화(動脈粥狀硬化)를 가속시키고, 신장을 파손시키고(25), 혈관을 손상시키고, 신경이 변질(26)되고, 망막변성 및 당뇨병환자가 건강인보다도 중풍에 걸리기 쉬운 것은(30) 모두 AGE와 직접적으로 관련된다(26,28,29). 당뇨병이 적혈구의 응집을 초래하는 것은, 주로 알부민이 당화된 후 제3 구조 변경을 초래하는 것에 의해 응집억제(anti-aggregation) 기능이 상실되는 데 있다(22). 또한 연구에 의하면, 당뇨병이 신장계사구체 투과성의 변경을 유발하는 것은 알부민이 당화되었기 때문이고, 신장계사구체기저막(glomerular basement membrane)의 당화는 아니다(23). Poduslo 등의 사람들도 1994년에 당화된 단백질은 그 투과 혈뇌 장벽(blood brain barrier)의 능력을 증가시킨다고 지적하였다.Well-known retinal degenerations include proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy and aged-macular degeneration caused by diabetes (20), and retinal degeneration It is the most difficult to cure for all eye diseases. It is recognized that hyperglycemia accelerates the development of glycation and develops advanced glycation end products (AGEs), which are closely related to various blood vessels and neuronal complications that occur in later diabetes. (21-25) AGE generates an unstable schiff base through the action of a non-enzyme of a reducing sugar aldehyde group or ketone group and a protein, and in turn, forms an amide product by an Amadori rearrangement. It is formed so that it may generate | occur | produce (26). Known non-enzymatic actions are non-plastic and generally occur on long-lived proteins (27), which lead to protein cross-linking by the formation of AGEs, and then to protein protease. Accumulation of AGEs is a notation of aging because it creates resistance (28,29). As the age increases, the brain's abstract nerve, Bruch's membrane, and collagen content increase. The rate of non-enzymatic glycosylation represents a beginner reaction, and the rate of reaction is determined by the concentrations of reducing sugars and proteins. Blood sugar levels of diabetics are higher than those of general health people, thus accelerating the occurrence of glycosylation. Diabetes accelerates atherosclerosis, damages the kidneys (25), damages blood vessels, deteriorates nerves (26), and makes retinal degeneration and diabetics more susceptible to stroke. (30) All are directly related to AGE (26, 28, 29). Diabetes causes red blood cell aggregation mainly due to loss of anti-aggregation function due to the third structural alteration after albumin is glycosylated (22). In addition, studies have shown that diabetes causes renal glomerular permeability alteration because of albumin glycosylation and not glycation of the glomerular basement membrane (23). Poduslo et al. Also pointed out that glycated proteins in 1994 increase the ability of the blood brain barrier.

AGE로 망막 표면상의 얼마의 수용체, 단백질과 결합가능한 것으로서, 이미 청소 수용체(scavenger receptors)나 제1 형 및 제2 형, AGE의 수용체(RAGE, the receptor for AGE), OST-48(AGE-R1), 80K-H phosphoprotein(AGE-R2) 및 galectin-3(AGE-R3)이 알려져 있다(32). 또한, 모노사이트, 대식세포, 내피세포, 신경아교세포 등에는 모두 AGE 수용체가 발견되고 있다. 그리고 세포가 AGE에 활성화되면, 항상 세포외기질단백질(extracellular matrix protein), 혈관접착분자(Vascular adhesion molecules) 및 성장인자(growth factor) 표현량을 증가시키고, 다른 세포종류 및 정보전달에 의해서 화학주성(chemotaxis), 혈관형성(angiogenesis), 산화압력, 세포증가성, 세포 프로그램 사망(programmed cell death)을 동반한다(34). 이미, 인류뇌부의 각종 세포 표현이, 다른 RAGE는 AGE를 청소할 수 있지만, 이 능력이 상실하면 세포외 AGE의 누적을 초래하고, 중추신경계통의 염증반응을 유발하는 것이 알려져 있다. AGE는 RPE 세포의 망막혈관 내피세포 성장인자(retinal vascular endothelial growth factor)(21) 및 PDGF-β(34)의 표현량을 증가시킬 수 있다. 이 AGE는 노화과정에 있어서 중요한 역할을 하므로, 우리들은 당화 알부민으로 1개의 병리모델로서 새로운 연구와 탐색을 행할 수 있기를 희망하고 있다.Some of the receptors on the surface of the retina with AGE can bind proteins, which are already scavenger receptors, type 1 and type 2, AGE receptors (RAGE, the receptor for AGE), OST-48 (AGE-R1). ), 80K-H phosphoprotein (AGE-R2) and galectin-3 (AGE-R3) are known (32). In addition, AGE receptors are found in monosite, macrophages, endothelial cells, glial cells and the like. When cells are activated in AGE, they increase the expression of extracellular matrix proteins, vascular adhesion molecules and growth factors, and chemotaxis by different cell types and information transfer. (chemotaxis), angiogenesis, oxidative pressure, cytostaticity, and programmed cell death (34). Already, various cellular expressions of the human brain can clear AGEs from other RAGEs, but loss of this ability leads to the accumulation of extracellular AGEs, leading to inflammatory responses in the central nervous system. AGE can increase the expression levels of retinal vascular endothelial growth factor 21 and PDGF-β 34 in RPE cells. Since this AGE plays an important role in the aging process, we hope to be able to conduct new research and exploration as a pathology model with glycated albumin.

HGF/SF(Hepatocyte growth factor)는 간장에서 가장 중요한 성장인자이고, 60 KDa의 알파체인(αChain) 및 30 KDa의 베타체인(βChain)을 디설피드결합으로 연접함으로써 구성되어 있다. 체내에서 바로 합성된 HGF/SF는 prepro HGF/SF이고, 효소를 통해 변형된 후 다른 형식(heterodimeric form)으로 형성되고 나서야 비로소 생물활성을 갖는다. HGF는 다기능 성장인자이고, 조직수리 및 기관재생에 있어서 중요한 역할을 한다. HGF는 체내에서의 분포가 충분히 넓고, 그 중 간장이 최대이다. 다음에, 췌장, 가슴샘, 혈액, 소장, 태반 등에 보여진다(35). 1996년 눈의 조직, 예를 들면 눈물, 눈물샘 및 각막 중에 HGF/SF 또는 HGF/SF 수용체의 존재가 발견되고, 이것에 의해 HGF/SF에는 눈 안에 조절제어의 역할을 하는 특징이 있는 것으로 인정되었다(36). 1998년 He 등의 사람들은 다시 망막색소 상피세포에는 동시에 HGF 및 HGF 수용체(c-Met)를 갖고 있을 뿐만 아니라, c-Met의 티로신 인산화반응(tyrosine phosphorylation)도 계속 유지되어 표현되고 있으므로, HGF의 망막색소 상피세포에 대하여 말하면, 1개 자체작용의 성장인자이고, 또한, 망막발육(37), 상처치유 및 증식당뇨망막병증과 관련된다(38). 상기한 내용으로 알 수 있는 바와 같이, RPE의 촉진 또는 억제를 물문하고 세포활성의 영향인자는 모두 바로 돌파하지 않으면 안되는 분야이다.HGF / SF (Hepatocyte growth factor) is the most important growth factor in the liver, and is composed by concatenating an alpha chain (αChain) of 60 KDa and a beta chain (βChain) of 30 KDa by disulfide bonds. HGF / SF, synthesized directly in the body, is prepro HGF / SF, and is not bioactive until after it has been transformed through an enzyme and formed into a heterodimeric form. HGF is a multifunctional growth factor and plays an important role in tissue repair and organ regeneration. HGF has a wide enough distribution in the body, of which the liver is the largest. Next, it is shown in the pancreas, thymus, blood, small intestine, placenta and the like (35). In 1996, the presence of HGF / SF or HGF / SF receptors in the tissues of the eye, such as tears, tear glands, and corneas, was discovered, which led to the recognition that HGF / SF has the characteristic of regulating control in the eye. (36). In 1998, He et al. Not only possessed HGF and HGF receptors (c-Met) in retinal pigment epithelial cells, but also expressed and maintained tyrosine phosphorylation of c-Met. As for retinal pigment epithelial cells, it is a growth factor of one self action and is also associated with retinal development (37), wound healing and proliferative diabetic retinopathy (38). As can be seen from the above, all factors influencing cellular activity, regardless of the promotion or inhibition of RPE, must break through immediately.

요약하면, RPE 세포는 망막발육 및 그와 관련된 조절제어상 매우 중요한 역할을 하므로, 간접적으로 RPE 세포와 관련된 메카니즘을 파악제어하기 위해서 어떻게 RPE 세포의 활성을 조절제어할지는 이미 요즘의 관련연구의 중요과제로 되고 있다.In summary, RPE cells play a very important role in retinal development and its associated regulatory controls, so how to regulate and regulate the activity of RPE cells indirectly to identify and control the mechanisms involved in RPE cells is an important topic of recent research. It is becoming.

따라서, 본 출원인은 상기 선행기술의 결점을 감안하여, 예의 시험과 연구를 거듭한 결과, 마침내 본 발명의 「곽산 석곡 추출물 및 그 제조방법」을 안출하였다.Therefore, in view of the drawbacks of the prior art, the present applicant has made intensive tests and studies, and finally, "Kwaksan Seokgok Extract and its manufacturing method" of the present invention have been devised.

본 발명의 목적은, 수용성 유기용제 또는 상기 수용성 유기용제와 물의 혼합물에 의해 석곡을 추출한, 생리활성을 갖는 곽산 석곡 추출물을 제공하는 데 있다. SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a Kwaksan Seokgok Extract, which has a physiological activity, obtained by extracting Seokok by a water-soluble organic solvent or a mixture of the water-soluble organic solvent and water.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 수용성 유기용제는 탄소 함유수가 1~8에 개재하는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류이다.According to an aspect of the present invention, the water-soluble organic solvent is an alcohol, an alkyl or an ester having a carbon containing number of 1 to 8.

본 발명의 일 측면에 따르면, 그 중의 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다.According to one aspect of the invention, the alcohols therein are methanol or ethanol.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retinal pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the extract has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE).

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 생물체 속의 AGE(advanced glycation end product) 함유량을 감소하는 작용을 갖는다. According to one aspect of the invention, the extract has an action of reducing the content of the advanced glycation end product (AGE) in the organism.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어(Physilogically acceptable carrier) 및 상기 어느 한 항에 기재된 추출물 또는 상기 추출물의 이성질체(isomer)를 포함하고 있다.In addition, the present invention also provides a composition having a physiological activity, the composition comprises a physiologically acceptable carrier (Physilogically acceptable carrier) and the extract according to any one of the above-mentioned or isomers of the extract.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiologically water solubility is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 심혈관질환에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against cardiovascular diseases.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 심혈관질환은 동맥경화, 혈관손상 및 중풍으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만 이들에 한정되지는 않는다.According to an aspect of the present invention, the cardiovascular disease is selected from the group consisting of atherosclerosis, vascular injury, and stroke, but is not limited thereto.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신경변성에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against neurodegeneration.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 신경변성은 망막신경세포 변성, RPE세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경야교세포 변성 및 뇌부 추상신경변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.According to an aspect of the present invention, the neurodegeneration is selected from the group consisting of retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal neuroglial cell degeneration and brain abstract neural degeneration. However, it is not limited to these.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신장병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to one aspect of the invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against kidney disease.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 신장병은 신장계사구체 변성 및 신장계사구체기저막 변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.According to an aspect of the present invention, the kidney disease is selected from the group consisting of nephrocytic degeneration and nephrocytic basement membrane degeneration, but is not limited thereto.

본 발명의 일 측면에 따르면, 생리활성을 갖는 조성물은 눈병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to one aspect of the invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against the eye disease.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 눈병은 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 광수용체의 퇴화, 망막염증 및 브르크막 변성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.According to an aspect of the present invention, the eye disease is selected from the group consisting of uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, photoreceptor degeneration, retinopathy and Brk membrane degeneration, but is not limited thereto. .

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 췌장병에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to one aspect of the invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against pancreatic disease.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 췌장병은, 당뇨병 및 그 합병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이고, 다만, 이들에 한정되지는 않는다.According to one aspect of the present invention, the pancreatic disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus and its complications, but is not limited thereto.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 자가면역병(autoimmune disease) 또는 패혈성 쇼크에 대하여 약리활성을 갖는 조성물이다.According to one aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against autoimmune disease or septic shock.

본 발명은 또한 물, 수용성 유기용제, 또는 물과 상기 수용성 유기용제의 혼합물에 의해 식물을 추출하는 단계를 구비한 곽산 석곡 추출물의 방법을 제공하였다.The present invention also provides a method of Gwaksan Seokgok Extract, which comprises extracting a plant by water, a water-soluble organic solvent, or a mixture of water and the water-soluble organic solvent.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 수용성 유기용제는 탄소 함유수가 1~8에 개재하는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류 중 하나이다. According to an aspect of the present invention, the water-soluble organic solvent is one of alcohols, alkyls or esters containing 1 to 8 carbon atoms.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다. According to one aspect of the invention, the alcohols are methanol or ethanol.

본 발명에는 또한 식물 추출물을 조제하는 방법이 제공되고, (a) 제1 알콜류로 상기 식물을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 생성하는 단계와, (b) 물과 알킬류로 동시에 상기 제1 알콜류 추출물을 추출하여 제1 수층(水層) 추출물 및 알킬류 추출물을 생성하는 단계와, (c) 에스테르류로 상기 수층을 추출하여 에스테르 추출물 및 제2 수층 추출물을 생성하는 단계와, (d) 제2 알콜류로 상기 제2 수층 추출물을 추출하여 제2 알콜류 추출물 및 제3 수층 추출물을 생성하는 단계를 구비하고 있다.The present invention also provides a method for preparing a plant extract, comprising the steps of: (a) extracting the plant with a first alcohol to produce a first alcohol extract; and (b) simultaneously extracting the first alcohol with water and alkyls. (A) extracting the first aqueous layer extract and an alkyl extract to extract the aqueous layer, and (c) extracting the aqueous layer with esters to produce an ester extract and a second aqueous extract; Extracting the second aqueous layer extract with an alcohol to produce a second alcohol extract and a third aqueous layer extract.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 식물은 난초과 식물이다.According to one aspect of the invention, the plant is an orchid family.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 난초과 식물은 덴드로븀과(Genus Dendrobium)에 속한다.According to one aspect of the invention, the orchid family belongs to the genus Dendrobium.

본 발명의 일 측면에 따르면, 단계(a)는 다시 a1) 상기 식물의 건조물을 제공하는 단계와, a2) 분쇄기로 건조물을 분쇄하는 단계와, a3) 상기 제1 알콜류로 분쇄된 상기 물질을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어진다.According to one aspect of the invention, step (a) is again a1) providing a dry matter of the plant, a2) grinding the dry matter with a grinder, a3) extracting the material pulverized with the first alcohols It comprises a step of obtaining a first alcoholic extract.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 알콜류의 탄소 함유수는 1~8이다.According to an aspect of the present invention, the carbon-containing water of the first alcohols is 1-8.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이다. According to an aspect of the present invention, the first alcohols are methanol or ethanol.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 알콜류는 탄소 함유수 1~8의 알콜류이다.According to an aspect of the present invention, the second alcohols are alcohols having 1 to 8 carbon atoms.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 알콜류는 부탄올 또는 n-부탄올이다. According to an aspect of the present invention, the second alcohols are butanol or n-butanol.

본 발명의 일 측면에 따르면, 단계(b)는 다시 b1) 감압, 농축, 흡기 등으로 제1 알콜류 추출물을 건조하는 단계를 구비하고 있다.According to an aspect of the present invention, step (b) is further provided with a step of drying the first alcoholic extract by b1) reduced pressure, concentration, intake, and the like.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 알킬류 추출물은 n-헥산 추출물이다.According to one aspect of the invention, the alkyl extract is n-hexane extract.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 단계(c)는 다시 c1) 상기 에스테르류 추출물을 건조하는 단계와, c2) 헥산과 메탄올로 건조한 후의 상기 에스테르류 추출물을 추출하여 헥산 추출물과 에탄올 추출물을 생성하는 단계를 구비하여 이루어진다.According to an aspect of the invention, the step (c) is again c1) drying the ester extract, c2) extracting the ester extract after drying with hexane and methanol to produce a hexane extract and ethanol extract A step is made.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 헥산 추출물은 감압, 농축, 흡기 등의 단계를 통해 건조된다.According to one aspect of the invention, the hexane extract is dried through a step such as reduced pressure, concentration, intake.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 에스테르류는 에틸아세테이트이다.According to one aspect of the invention, the esters are ethyl acetate.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 방법은 다시 (e) 색층분석법으로 상기 제2 알콜류 추출물을 색층분석하여 명칭을 DCMPbL6,7로 칭한 제1 용출물을 얻는 단계와, (f) 제1 용출제로 상기 DCMPbL6,7을 용출하여 제2 용출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어진다.According to an aspect of the present invention, the method further comprises (e) chromatographic analysis of the second alcoholic extract by chromatographic method to obtain a first eluate named DCMPbL6,7, and (f) as a first eluent Eluting the DCMPbL6,7 to obtain a second eluate.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 단계(e)는 제2 용출제에 의해 실시된다.According to one aspect of the invention, step (e) is carried out with a second eluent.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제2 용출제는 체적비가 1:1인 메탄올과 물의 혼합물에 의해 조성된다.According to one aspect of the invention, the second eluent is composed of a mixture of methanol and water with a volume ratio of 1: 1.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 20:80으로 조성한 혼합물이고, 상기 제2 용출물은 DCMPbL6,7D2로 칭한다.According to an aspect of the present invention, the first eluent is a mixture of isopropanol and water in a volume ratio of 20:80, and the second eluate is referred to as DCMPbL6, 7D2.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D2는 다시 메탄올/물/아세트산을 체적비 30:65:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제2 용출물 DCMPbL6,7D2H2를 생성한다.According to an aspect of the present invention, the DCMPbL6, 7D2 is further chromatographed with a mixture of methanol / water / acetic acid in a volume ratio of 30: 65: 1 to produce a second eluate DCMPbL6, 7D2H2.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출물은 이소프로판올과 물을 제척비 30:70으로 조성한 혼합물이고, 그리고 상기 제2 용출물의 명칭은 DCMPbL6,7D3으로 칭한다.According to an aspect of the present invention, the first eluate is a mixture of isopropanol and water in a ratio of 30:70, and the second eluate is called DCMPbL6, 7D3.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D3은 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 40:60:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제4 용출물 DCMPbL6,7D3H3을 생성한다.According to an aspect of the present invention, the DCMPbL6, 7D3 is further chromatographed with a mixture of one methanol / water / acetic acid in a volume ratio of 40: 60: 1 to produce a fourth eluate DCMPbL6, 7D3H3.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 40:60으로 조성한 혼합물이고, 그리고, 상기 제2 용출제의 명칭은 DCMPbL6,7D4로 칭한다.According to one aspect of the invention, the first eluent is a mixture of isopropanol and water in a volume ratio of 40:60, and the name of the second eluent is called DCMPbL6, 7D4.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 DCMPbL6,7D4은 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 45:55:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제5 용출물 DCMPbL6,7D4H3을 생성한다.According to an aspect of the present invention, the DCMPbL6, 7D4 is further chromatographed with a mixture of one methanol / water / acetic acid in a volume ratio of 45: 55: 1 to produce a fifth eluate DCMPbL6,7D4H3.

나아가서는, 본 발명도 상기 방법에 의해 생성된 각 추출물 중 어느 하나의 다른 종류의 석곡 추출물을 제공한다. Furthermore, the present invention also provides a different type of grain extract of any one of each extract produced by the method.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 식물 추출물은 망막흑색소 상피세포를 촉진하는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the plant extract has the action of promoting retinal black pigment epithelial cells.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 추출물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소하는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the extract has a function of reducing the AGE content in the organism.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였다. 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 식물 추출물 또는 상기 추출물의 이성질체(isomer)를 구비하고 있다.In addition, the present invention also provides a composition having a physiological activity. The composition comprises a carrier having physiologically water solubility and the plant extract or an isomer of the extract.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiological activity is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기의 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느하나의, 약리반응을 갖는 의약조성물이다.According to one aspect of the invention, the composition is any one selected from the group consisting of the following cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease, a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절 세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성, 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨병막병증, 증식유리체망막병증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 병이다.According to an aspect of the present invention, the disease is atherosclerosis, vascular injury, palsy, retinal nerve cell degeneration, RPE cell degeneration, adolescent cell degeneration, optic nerve ganglion cell degeneration, viscous cell degeneration, retinal glial cell degeneration, cerebrospinal nerve Degeneration, renal glomerular degeneration, nephropathy glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, aging macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinitis inflammation, blue membrane degeneration, diabetes and its complications and septic shock It is a bottle selected from the group consisting of.

본 발명은 그외에 다른 종류의 조성물인, 얻어진 상기 제2 용출물을 제공하였다.The present invention further provides the above obtained second eluate, which is another kind of composition.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.According to an aspect of the present invention, the composition has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE).

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the composition has the effect of reducing the AGE content in the organism.

또한, 본 발명도 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였다. 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 상기 조성물의 이성질체(isomer)이다.In addition, the present invention also provides a composition having a physiological activity. The composition is a carrier having physiologically water solubility and an isomer of the composition or the composition.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiologically water solubility is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 병의 약리반응을 갖는 의약조성물이고, 그 질환은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병을 포함하고 있다.According to one aspect of the invention, the composition is a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction of any one disease selected from the group consisting of the following diseases, the disease includes cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease Doing.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성, 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. According to an aspect of the present invention, the disease is atherosclerosis, vascular damage, palsy, retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic nerve ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal glial cell degeneration, cerebrospinal nerve Degeneration, renal glomerular degeneration, nephrolithic glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, aging macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinitis inflammation, degeneration of blue membranes, diabetes and its complications and septic shock It is selected from the group consisting of.

본 발명도 상기 얻어진 제3 용출물인 화합물을 제공하였다.This invention also provided the compound which is the said 3rd eluate obtained.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화합물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.According to an aspect of the present invention, the compound has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE).

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화합물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the compound has a function of reducing the AGE content in the organism.

또한, 본 발명도 별도의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 어느 한 항에 기재된 화합물 또는 상기 화합물의 이성질체를 포함한다.In addition, the present invention also provides a composition having a separate physiological activity, the composition comprises a carrier having a physiologically water-soluble and the compound described in any one of the above or an isomer of the compound.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiologically water solubility is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 병의 약리반응을 갖는 의약조성물이고, 그 질환은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병을 포함하고 있다.According to one aspect of the invention, the composition is a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction of any one disease selected from the group consisting of the following diseases, the disease includes cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease Doing.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경야교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. According to an aspect of the present invention, the disease is atherosclerosis, vascular injury, palsy, retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, adolescent cell degeneration, optic ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal nerve glial cell degeneration, cerebrospinal Nerve degeneration, renal glomerular degeneration and nephropathy glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, age-related macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinitis inflammation, diabetes mellitus and its complications and septic It is selected from the group consisting of shock.

본 발명은 또한 상기 얻어진 제4 용출물인 조성물을 제공하였다.The present invention also provided a composition which is the fourth eluate obtained above.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.According to an aspect of the present invention, the composition has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE).

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 화합물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the compound has a function of reducing the AGE content in the organism.

또한, 본 발명도 다른 종류의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만, 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성분 또는 조성분의 이성질체를 포함한다. In addition, the present invention also provides a composition having another kind of physiological activity, the composition comprises a carrier having physiologically water soluble and the composition or isomer of the composition.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiologically water solubility is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 병의 약리반응을 갖는 의약조성물이고, 그 질환은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병을 포함하고 있다.According to one aspect of the invention, the composition is a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction of any one disease selected from the group consisting of the following diseases, the disease includes cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease Doing.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. According to an aspect of the present invention, the disease is atherosclerosis, vascular damage, palsy, retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic nerve ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal glial cell degeneration, cerebrospinal nerve Degeneration, renal glomerular degeneration and nephropathy glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, age-related macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinitis, degeneration of blue membranes, diabetes and its complications and septic shock It is selected from the group consisting of.

또한, 본 발명은 상기 얻어진 제5 용출물인 조성물을 제공하였다.Moreover, this invention provided the composition which is the 5th eluate obtained above.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retianl pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 갖는다.According to an aspect of the present invention, the composition has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE).

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 생물체 중의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는다.According to one aspect of the invention, the composition has a function of reducing the AGE content in the organism.

또한, 본 발명도 다른 종류의 생리활성을 갖는 조성물을 제공하였지만 이 조성물은 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 조성물의 이성질체를 포함한다.In addition, although the present invention also provides a composition having another kind of physiological activity, the composition includes a carrier having physiologically water solubility and an isomer of the composition or composition.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이다.According to an aspect of the present invention, the composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이다.According to an aspect of the present invention, the carrier having physiologically water solubility is a carrier having pharmacological activity.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 조성물은 하기 질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 병의 약리반응을 갖는 의약조성물이고, 그 질환은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병을 포함하고 있다.According to one aspect of the invention, the composition is a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction of any one disease selected from the group consisting of the following diseases, the disease includes cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease Doing.

본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성 및 신강계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 유증식유리체망막변증, 노화성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병과 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다. According to an aspect of the present invention, the disease is atherosclerosis, vascular damage, palsy, retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic nerve ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal glial cell degeneration, cerebrospinal nerve Degeneration, renal glomerular degeneration and nephropathy glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, aging macular degeneration, photoreceptor degeneration, retinitis inflammation, diabetes mellitus and its complications and septic It is selected from the group consisting of shock.

<실시예><Example>

본 발명의 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물 및 그 제조 프로세스는 이하의 실시예의 설명에 의해 충분히 이해할 수 있는 동시에, 본 기술에 숙련된 당업자라면 이것에 기초하여 실시할 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시예는 하기의 실시예에 국한되는 것은 아니다.The Dendrobii Caulis extract of the present invention and its manufacturing process can be fully understood by the description of the following examples, and can be carried out based on this by those skilled in the art. However, embodiments of the present invention are not limited to the following examples.

(1) 망막색소 상피세포의 배양 (1) Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells

도살장에서 소의 눈을 취득하고, 요오드용액으로 표면을 소독하고나서 다시 인산완충액(PBS)으로 2회 세정하고, 해부하여 수정체, 유리체, 망막 등을 제거한 후 0.1% EDTA(ethylene diamine tetra-acetic acid)로 40분간 처리하고, 다시 5% 트리프신으로 15분간 처리하여 원형핀셋으로 가볍게 누르고, 흡입관으로 가볍게 수회 흡입한 후 단일의 RPE 세포를 얻었다. 용액을 흡출하여 10%의F FCS(fetal calf serum)의 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 속에 두고, 37℃에서 5% CO2 포화습도의 배양 상자 속에서 배양한다. 5~6일마다 새로운 배양액으로 바꾸고, 충분히 성장시키려면 0.05% 트립신 및 0.02%의 EDTA로 계속 처리한다. 본 실험은 주로 제5 세대, 제6 세대로 생리활성 테스트를 진행한다.The eye of the slaughterhouse was obtained, the surface was sterilized with iodine solution, washed twice with phosphate buffer (PBS), dissected to remove the lens, vitreous body and retina, and then 0.1% EDTA (ethylene diamine tetra-acetic acid). After 40 minutes of treatment with 5% trypsin for 15 minutes, lightly pushed with a circular tweezers, lightly suctioned several times with a suction tube to obtain a single RPE cells. The solution is aspirated and placed in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% F FCS (fetal calf serum) and incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 saturated humidity culture box. Every 5-6 days, change to a new culture and continue to treat with 0.05% trypsin and 0.02% EDTA for sufficient growth. This experiment is mainly conducted for the fifth generation and sixth generation bioactivity test.

(2) ROS의 조제(2) Preparation of ROS

도살장에서 신선한 소의 눈을 취득하고, 얼음 위에서 30분간 광을 조사한 후 우선 요오드로 표면을 소독하고 다음에 행크버퍼(Hank's buffer)로 2회 세정하였다. 다음에 해부하여 수정체, 유리체를 제거하고, 망막을 조각으로 잘라서 20%의 설탕을 함유한 20mM Tris-Hcl용액 속에 두고, 4℃의 얼음상자에서 3시간 교반하여 각각 No.300,220,110,74,53,10그물의 여과막으로 여과한다. 여과 중의 세포수를 계산하여, 관마다 1×108 ROS 세포의 수로 나눠서 -20℃의 얼음상자에 두고 보존시킨다.Fresh cattle eyes were taken from the slaughterhouse, irradiated with light for 30 minutes on ice, first disinfected with iodine and then washed twice with Hank's buffer. Next, dissection was performed to remove the lens and vitreous body, and the retina was cut into pieces and placed in a 20 mM Tris-Hcl solution containing 20% sugar. The mixture was stirred for 3 hours in an ice box at 4 ° C., and then No. 300, 220, 110, 74, 53, 10 Filtration with a net filtration membrane. The number of cells in the filtration is calculated, divided by the number of 1 × 10 8 ROS cells per tube, and stored in an ice box at -20 ° C.

(3) FITC-ROS의 조제(3) Preparation of FITC-ROS

ROS 해동 후 제거한 부유액을 취출하고, 700㎖(설탕 10% 함유)의 붕산염완충액(pH8.0)을 첨가하여 혼합한 후, 다시 ROS의 1/1000중량의 FITC(fluorescein isothiocyanate) 분말을 첨가하여 4℃ 온도에서 1.5시간 회전시켰다. 설탕 20% 함유의 20mM 트랜스-아세테이트(pH7.2)를 이용하여 ROS와 혼합되어 있지 않은 FITC를 세정하여 제거하고, 10000rpm으로 10분간 원심분리하여 수회 중복하여 다시 설탕의 DMEM 속에 용해하였다.The suspended solids removed after thawing ROS were taken out, 700 ml (containing 10% sugar) borate buffer solution (pH8.0) was added and mixed, and then 1/1000 weight FITC (fluorescein isothiocyanate) powder of ROS was added again. It was rotated at a temperature of 1.5 hours. FITC that was not mixed with ROS was removed using 20 mM trans-acetate (pH 7.2) containing 20% of sugar, centrifuged at 10000 rpm for 10 minutes, and repeatedly dissolved in DMEM of sugar.

(4) 망막색소 상피세포 탐식기능의 측정(4) Measurement of retinal pigment epithelial cell phagocytosis

RPE 세포를 5×104cells/ml로 조제하여 200㎖를 96웰플레이트(96 well plate) 속에 흡착시키고, 충분히 성장시킨 후 새로운 배양액으로 바꾸고, 다시 다른 농도의 테스트용 약물 20㎖를 각 웰에 첨가하는 동시에 FCS(fetal calf serum)의 함량을 2%~5% 사이에 두고, 4시간 배양한 후, 50㎖의 2×107FITC-ROS/ml를 각 웰 속에 첨가하여 4시간 배양하였다.RPE cells were prepared at 5 × 10 4 cells / ml, 200 ml were adsorbed into 96 well plates, fully grown and replaced with new culture medium, and 20 ml of test drug of different concentration was added to each well. At the same time, the content of FCS (fetal calf serum) was placed between 2% and 5%, incubated for 4 hours, and then, 50 ml of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added to each well and incubated for 4 hours.

그런 후, 부유액을 청소하는 동시에 2.5% 설탕/PBS로 수회 세정하고, 마지막으로 100㎕ PBS를 첨가하여, 세포형광측정기Cyto-Fluorometer (Exfilter:485/20nm, Fm filter 530/25nm)를 이용하여, RPE 표면에 점착되고 또한 탐식된 FITC-ROS량을 측정하였다. 각 웰에 5ml의 FluroQuench를 첨가하여, 배양상자 속에서 1시간 반응 후 그 형광독치를 측정하여 탐식된 FITC-ROS량으로 하였다.Then, the suspension was cleaned and washed several times with 2.5% sugar / PBS, and finally, 100 μl PBS was added, using a Cyto-Fluorometer (Exfilter: 485 / 20nm, Fm filter 530 / 25nm). The amount of FITC-ROS adhered to the RPE surface and also detected was measured. 5 ml of FluroQuench was added to each well, and after 1 hour reaction in the culture box, the fluorescence reading was measured to obtain the amount of FITC-ROS detected.

(5) 망막색소 상피세포 산화질소 생성의 측정(DAN assay)(39)(5) Measurement of retinal pigment epithelial cell nitric oxide production (DAN assay) (39)

100ml 세포 배양 부유액에 50ml의 2,3-디아미노나프탈린(DAN)를 첨가하여 실온 속에서 10분간 작용한 후, 25ml의 2.8N의 NaOH를 첨가하여 반응을 중지시키고, 다시 세포형광측정기(cyto-Fluorometer 2300(기능 360±400nm, 격태 400±40nm)로 측정하였다. 얻어진 값은 공지의 농도, 아초산나트륨(NaNO2)에 의해 만들어진 표준곡선으로부터 산화질소 농도를 환산하여 산출한 것이다.50 ml of 2,3-diaminonaphthalin (DAN) was added to 100 ml cell culture suspension, and the mixture was allowed to operate at room temperature for 10 minutes. Then, 25 ml of 2.8N NaOH was added to stop the reaction. It was measured by -Fluorometer 2300 (function 360 ± 400 nm, abortion 400 ± 40 nm) The obtained value was calculated by converting nitric oxide concentration from a standard curve made by a known concentration of sodium acetate (NaNO 2 ).

(6) 망막색소 상피세포 리보핵산(RNA)의 조제(6) Preparation of Retinal Pigment Epithelial Cell Ribonucleic Acid (RNA)

망막색소 상피세포를 100mm 배양판(1×106 cells in DMEM+10%FCS)에서 배양하고, 충분히 성장시킨 후 새로운 배양액(2.5% 함유 PCS의 DMEM)으로 바꾸고, 곽산 석곡 화학 용매 분층법의 구분물을 0.1㎍/ml 첨가하여 48시간 배양하였다. 우선 배양액을 제거하고, 얼어 붙은 PBS 완충액으로 2회 세정한 후, 1ml/105-106 cells의 RNAzolTMB 첨가하여 5분간 정치하였다. 다음에 스크레이퍼(scraper)로 세포를 조직 배양판의 위에서 아래로 긁고, 1.5ml의 원신분리관 내로 옮겨서 1/10배의 체적량의 클로로포름을 첨가하였다. 그리고 쾌속으로 바로 혼합되어 균일하게 한 후, 얼음 위에 5분간 정치하여 4℃의 온도하에서 12000rpm의 고속 원심분리를 15분간 행하였다. 그런 후 주의깊게 상층의 투명 수층을 흡착하고, 다른 1.5ml의 원심분리관 내로 옮겨서 동일한 체적의 이소프로판올을 첨가하여 균일하게 혼합하고, 다시 얼음 위에서 5분간 정치하였다. 그리고, 4℃의 온도에서 12000rmp의 고속도로 10분간 원심분리하여 부유액을 제거하고, 70%의 에탄올로 침전부분을 세정하였다. 나아가서는 4℃의 온도 및 7500rpm을 통해 8분간 원심분리를 행하고, 에탄올을 제거건조하였다. 그런 후, 0.1% 함유 DEPC의 이미 4회처리한 물을 용해하고 그 일부를 취하여, 0D260로 양을 평가하는 동시에 OD260/OD280로 순도를 판정하였다. 잉여의 부분은 70%의 에탄올로 보존하고, -20℃의 온도하에 두었다.Retinal pigment epithelial cells were incubated in a 100mm culture plate (1 × 10 6 cells in DMEM + 10% FCS), fully grown, and then replaced with a new culture medium (DMEM of PCS containing 2.5%). 0.1 µg / ml of water was added and incubated for 48 hours. First, the culture medium was removed, washed twice with frozen PBS buffer, and then allowed to stand for 5 minutes by adding 1 ml / 10 5 -10 6 cells of RNAzol TM B. The cells were then scraped down from the top of the tissue culture plate with a scraper and transferred into 1.5 ml centrifuge tubes to add 1 / 10-fold volume of chloroform. Then, the mixture was immediately mixed at high speed, uniformed, and left on ice for 5 minutes, and then subjected to high-speed centrifugation at 12000 rpm for 15 minutes at a temperature of 4 ° C. Then, the upper transparent water layer was carefully adsorbed, transferred into another 1.5 ml centrifuge tube, added with the same volume of isopropanol, mixed uniformly, and left still on ice for 5 minutes. Then, the suspension was removed by centrifugation at 12000 rpm for 10 minutes at a temperature of 4 ° C., and the precipitate was washed with 70% ethanol. Furthermore, centrifugation was carried out for 8 minutes at a temperature of 4 ° C. and 7500 rpm, and ethanol was removed and dried. Thereafter, water which had already been treated four times of 0.1% -containing DEPC was dissolved and a part thereof was taken, and the purity was determined by OD 260 / OD 280 while the amount was evaluated by 0D 260 . The excess portion was stored in 70% ethanol and placed at a temperature of -20 ° C.

(7) RPE 세포의 성장인자의 역전사 및 중합연쇄반응(Reverse Transcription and polymerase chain reaction;RT-PCR)(7) Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) of Growth Factors in RPE Cells

각각 실험군과 대조군의 RPE 세포로부터 추출된 모든 RNA 5㎎을 취하고, 2.5㎎의 Obligo dT를 첨가하여 70℃의 온도에서 10분간 후 실온에서 10분간 두었다. 그리고 다시 10mM시약(dNTP) 2㎖, rRNasin 1㎖, AMV(AVian Myeloblastosis Virus), reverse trascriptase 1㎖(10unit) 및 그 완충액을 첨가하여 반응체적을 20㎖로 하였다. 그런 후 42℃의 온도에서 50분간 반응시키고, 다시 90℃의 온도에서 5분간 가열시킨 후 얼음 위에 10분간 두었다. 마지막으로, rRNAaseH 1㎖ 첨가하여 37℃의 온도에서 30분간 반응시켰다. 역전사반응의 cDNA 및 부동배수(不同倍數;various diluted concentrations) 희석한 cDNA를 취하고, 2 mM dNTP 5㎖ 첨가하며, 각 관에 검출하고자 하는 인자(primer):β-actin 및 각종 타켓의 sense 및 antisense Primer 0.1㎎/㎖ 각 1㎖, 폴리머레이스 1㎖(2unit) 및 그 완충액을 첨가하였다. 작용체적은 20㎖이고, 조건은 변성처리(denaturing)가 94℃에서 1.5분간 행해지고, 어닐링(annealing)이 57℃에서 1.5분간 행해지고, 연장(extension)이 72℃에서 2분간 행해지고, DNA 증폭기(Perkin-Elmer-Cetus)로 PCR반응을 행한다. β-actin반응은 25 사이클, HGF반응은 35 사이클이다. 5 mg of all RNA extracted from the RPE cells of the experimental and control groups were taken, and 2.5 mg of Obligo dT was added, followed by 10 minutes at a temperature of 70 ° C., followed by 10 minutes at room temperature. Then, 2 ml of 10 mM reagent (dNTP), 1 ml of rRNasin, AVV (AVian Myeloblastosis Virus), 1 ml of reverse trascriptase (10 units) and a buffer thereof were added to make the reaction volume 20 ml. Then, the mixture was reacted for 50 minutes at a temperature of 42 ° C., heated for 5 minutes at a temperature of 90 ° C., and then placed on ice for 10 minutes. Finally, 1 ml of rRNAaseH was added and reacted for 30 minutes at a temperature of 37 ° C. Take cDNA and variable diluted concentrations of reverse transcription reactions, add 5 ml of 2 mM dNTP, and detect the primers: beta-actin and various targets. 1 ml of Primer 0.1 mg / ml, 1 ml of polymerlace (2 units) and buffer thereof were added. The working volume is 20 ml, and the conditions are denatured at 94 ° C for 1.5 minutes, annealing at 57 ° C for 1.5 minutes, extension at 72 ° C for 2 minutes, and a DNA amplifier (Perkin). PCR reaction is performed with Elmer-Cetus. β-actin reaction is 25 cycles, HGF reaction is 35 cycles.

1. HGF는 Gibco(Gaithersburg,MD,USA)로부터 인도된 것이다.HGF was derived from Gibco (Gaithersburg, MD, USA).

sense, 21 mer:5'-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3'sense, 21 mer: 5'-GGG ATT CTC AGT ATC CTC ACA-3 '

Antisense, 21 mer:5'-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3'Antisense, 21 mer: 5'-CCT ACA TTT GTT CGT GTT GGA-3 '

2. VEGF primer:2.VEGF primer:

Sense, 24 mer:5'-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3'Sense, 24 mer: 5'-AGA AAC CCC ACG AAG TGG TGA AGT-3 '

Antisense, 24 mer:5'-CGT TTA ACT CAA GCT GCC TCG CCT-3'Antisense, 24 mer: 5'-CGT TTA ACT CAA GCT GCC TCG CCT-3 '

3. bFGF primer:BFGF primer:

Sense, 19 mer:5'-CCA AGC GGC TGT ACT GCA A-3'Sense, 19 mer: 5'-CCA AGC GGC TGT ACT GCA A-3 '

Antisense, 24 mer:5'-GAT CAG ATG CTG CCA TTA AGA TCA-3'Antisense, 24 mer: 5'-GAT CAG ATG CTG CCA TTA AGA TCA-3 '

4. TFG-βprimer:4.TFG-βprimer:

Sense, 24 mer:5'-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3'Sense, 24 mer: 5'-CCT GGA CAC CAA CTA CTG CTT CAG-3 '

Antisense, 24 mer:5'-ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC TCC-3'Antisense, 24 mer: 5'-ACG ATC ATG TTG GAC AAC TGC TCC-3 '

(8) 당화알부민(glycated albumin)의 제조(8) Preparation of glycated albumin

(a) 소 당화알부민의 제작(a) Preparation of bovine glycated albumin

1배의 PBS로 알부민(프랙션V)을 1mM로 희석하고, 0.22㎛의 무균여과막으로 여과한 후, 0.22㎛ 무균여과막으로 여과한 250mM 글루코스를 37℃의 배양기 속에 두고 당화작용을 진행하였다. 3주후 반응액을 투석하여 남은 글루코스를 제거한 후, Cona-Sepharose 겔로 순화(純化)를 행하고 투석 후 냉동건조로 보존하였다.Albumin (fraction V) was diluted to 1 mM with 1x PBS, filtered through a 0.22 μm sterile filtration membrane, and 250 mM glucose filtered through a 0.22 μm sterile filtration membrane was placed in an incubator at 37 ° C. for saccharification. After 3 weeks, the reaction solution was dialyzed to remove the remaining glucose, and then purified by Cona-Sepharose gel.

(b) 쥐 당화알부민의 제작(b) Preparation of Rat Glycosylated Albumin

1배의 PBS(pH7.4)로 알부민(프랙션V)을 100mg/m1(1.51mM)으로 희석하고, 0.22㎛의 무균여과막으로 여과한 후, 등체적의 1배의 PBS(pH7.4)를 0.22㎛ 무균여과막으로 여과한 후의 1.8g/m1(1M)의 D-글루코스를 유리관 내에 용해시키고, 37℃배양기에 두고 어둠속에서 당화반응을 행하고, 60일 후 반응액을 투석자루 속에 두고 남은 글루코스를 제거한다. 그런 후, 다시 0.22㎛ 무균여과막으로 여과하여 단백질농도를 측정한 후 분장(分裝)하고, 냉동건조 후 -20℃의 온도로 보존하여 사용한다.Dilute albumin (fraction V) to 100 mg / m1 (1.51 mM) with 1x PBS (pH7.4), filter through 0.22 µm sterile filtration membrane, and then 1x PBS (pH7.4) Was dissolved in a glass tube, 1.8 g / m1 (1M) of D-glucose was filtered through a 0.22 μm sterile filtration membrane, placed in a 37 ° C. incubator, and saccharified in the dark. After 60 days, the reaction solution was left in a dialysis bag. Remove glucose After that, the resultant was filtered again with a 0.22 μm sterile filtration membrane to measure the protein concentration, and then divided and stored at -20 ° C. after freeze-drying.

(9) FITC 테스트에 의한 AGE-BSA(40)의 정량(9) Quantification of AGE-BSA 40 by FITC Test

알부민 100mg, FITC 1.8mg을 취하고, 15ml 0.1M 탄산나트륨 완충액(Sodium carbonate buffer, pH9.5)에 용해하여, 25℃의 온도에 있어서 광을 피하면서 5시간 교반하였다. 그리고 HW-55F(1.6×100cm) 분자 낡은 기둥으로 분리를 진행하고, 전 공정적으로 광을 피하면서 5%(V/V)의 n-부탄올 용출완충액으로 하고, 자연유속으로 분리를 행한다. 분리한 샘플을 3회 물로 투석하고, 단백질 정량 후 무균여과하고 냉동건조로 분장하여 형광을 측정하는 동시에 형광의 당량비를 계산 정량하였다.100 mg of albumin and 1.8 mg of FITC were taken, dissolved in 15 ml of 0.1 M sodium carbonate buffer (pH 9.5) and stirred for 5 hours while avoiding light at a temperature of 25 ° C. Separation is carried out with a column of HW-55F (1.6 × 100 cm) molecules, and the solution is n-butanol elution buffer of 5% (V / V) while avoiding light at all stages, and separation is performed at a natural flow rate. The separated sample was dialyzed three times with water, protein quantitated, aseptic filtered and freeze-dried, and measured for fluorescence, and the equivalent ratio of fluorescence was calculated and quantified.

(10) RPE 세포 감성(減成) FITC-labeled AGE-BSA의 관찰(10) Observation of RPE Cell Susceptibility FITC-labeled AGE-BSA

사전에 멸균청소한 유리편을 24조 배양판(24 well culture plate) 속에 두고 300㎕ 0.5% 겔로 30분간 도포하고, 다시 배양액으로 도포한 겔을 세정하였다. RPE 세포는 매 조 5×104개 세포(5×104 cell/well)의 세포수로 10% PCS/DMEM을 이용하여 유리편을 덮어씌운 24조 판 속에 배양하였다. 각 판내에는 0.7㎖의 배양액이 있고, 48 시간 후에 세포가 충분히 성장한 후 배양액을 흡입하여 제거하고, 0.5㎖ 배양액으로 3회 세정하여, 30~300㎍/㎖ 여러 농도의 FITC-BSA DMEM을 배양액 0.5㎖ 속에 두었다. PBS에서 이 세포를 4회 세정하여 아직 탐식되어 있지 않거나 또는 결합된 형광을 세정하여 제거한다. 유리편을 취출하여 1% 함유 FQEB의 PBS로 습윤하고, 밀봉 후 바로 형광현미경으로 관찰하였다.The glass pieces sterilized and cleaned in advance were placed in a 24 well culture plate and coated with 300 µl 0.5% gel for 30 minutes, and the applied gel was washed again with the culture solution. RPE cells were cultured in 24 trillion plates covered with glass pieces using 10% PCS / DMEM with a cell count of 5 × 10 4 cells (5 × 10 4 cells / well). Each plate contains 0.7 ml of the culture medium, and after 48 hours, the cells are sufficiently grown, the culture medium is aspirated and removed, washed three times with 0.5 ml culture medium, and 30-300 µg / ml of various concentrations of FITC-BSA DMEM are cultured. Placed in 0.5 ml. The cells are washed four times in PBS to remove fluorescence that is not yet phagocyted or bound fluorescence. The glass pieces were taken out, wetted with PBS of 1% containing FQEB, and immediately observed with a fluorescence microscope after sealing.

(11) 곽산 석곡 추출물 및 순화 활성 성분의 분리(11) Isolation of Kwaksan Seokgok Extract and Purified Active Ingredients

1) 곽산 석곡 추출물의 조제 1) Preparation of Kwaksan Seokgok Extract

분쇄기로 2kg의 석곡을 분쇄한 후 메탄올 또는 에탄올을 첨가하여 밤새 침윤한 후 필터로 잔사를 제거하는 동시에 흡기여과방식으로 여과한 후 감압농축을 행하고, 반복하여 3회 침윤하였다. 메탄올 또는 에탄올이 완전하게 흡기건조된 후, 석곡이 알콜류로부터 추출하여 얻은 것으로부터, 알콜류 추출물을 DeCaM으로 칭한다.2 kg of grains were crushed by a pulverizer, and the resultant was infiltrated overnight by adding methanol or ethanol, and then the residue was removed by a filter, filtered by an intake filtration method, concentrated under reduced pressure, and repeatedly infiltrated three times. After methanol or ethanol is completely intake-dried, the alcoholic extract is called DeCaM from the grains obtained by extraction from alcohols.

2) 곽산 석곡 화학용매 추출물의 조제 2) Preparation of Kwaksan Seokgok Chemical Solvent Extract

400ml의 물로 3회 용해한 후 등량의 n-핵산으로 3회 분할하여 DCMph로 칭하였다. 수층은 에틸아세테이트로 4회 분할하여 EtOAc층을 얻어 DCMPe로 칭하였다. 수층은 다시 n-부탄올로 3회 분할하여 n-부탄올층 및 수층을 얻고, 각각 DCMPb 및 DCMPw로 칭하였다. After dissolving three times with 400 ml of water, the mixture was divided three times with an equal amount of n-nucleic acid to be referred to as DCMph. The aqueous layer was partitioned four times with ethyl acetate to obtain an EtOAc layer called DCMPe. The aqueous layer was further divided three times with n-butanol to obtain an n-butanol layer and an aqueous layer, which were called DCMPb and DCMPw, respectively.

3) 곽산 석곡 순화성분의 추출 및 분리3) Extraction and Separation of Purified Components of Kwaksan Seokgok

다음의 분리방법으로 곽산 석곡 활성성분을 분리하였다. 우선 에탄올로 곽산 석곡 1.9kg을 메탄올로 3회 약 16리터 추출하였다. 감압농축후 건조하여 DCM으로 칭하는 샘플을 얻었다. 우선 에틸아세테이트(EtOAc)로 2리터 용해한 후, 다시 등체적의 물로 분배추출을 행하고, 그리고 수층은 다시 등체적의 에틸아세테이트로 2회 추출하여 에틸아세테이트(EtOAc)층과 제2 수층을 얻었다. 이 EtOAc 추출층을 혼합수집한 후 감압농축건조하고, 다시 핵산 4리터 및 메탄올 2리터로 3회 분배추출하여 2층을 얻고, 감압농축후 핵산층(DCMPe/h으로 칭함) 및 메탄올층(DCMPe/m)샘플을 얻었다. 제2 수층을 2리터로 조정하고, 다시 부탄올 2리터로 분배추출하고, 감압농축후 부탄올층(DCMPb라 칭함) 및 제3 수층(DCMPw) 샘플을 얻었다 PCMPb 샘플은 LH20 아교로 분자관 기둥 색층분석(2.5x107cm, 이동층은 메탄올:물=50:50)을 행하고, 액티브한 절분을 행한 후, 얻어진 8개 크로마토그래픽 속의 제6 크로마토그래픽과 제7 크로마토그래픽의 추출물을 수집하여 PCMPbL6,7 샘플로 칭하였다. 다음에, 다시 Diaion SP-20 SS로 흡착관 기둥 색층분석(1x30cm)을 행하고, 이소프로판올:물=20:80(체적비)의 용출액으로 제2 크로마토그래픽을 용출하고, DCMPbL6, 7D2로 칭하였다. 그리고 이소프로판올:물=30:70(체적비)의 용출액으로 제3 크로마토그래픽의 용출을 DCMPbL6,7D3라 칭하였다. 또한, 이소프로판올:물=40:60(체적비)의 용출액으로 제4 크로마토그래픽의 용출을 DCMPbL6, 7D4로 칭하였다.Kwaksan Seokgok's active ingredient was isolated by the following separation method. First, about 16 liters of Kwaksan Seokgok 1.9kg was extracted three times with methanol. Concentrated under reduced pressure and dried to obtain a sample called DCM. First, after dissolving 2 liters of ethyl acetate (EtOAc), the mixture was extracted again with equal volume of water, and the aqueous layer was extracted twice with equal volume of ethyl acetate to obtain an ethyl acetate (EtOAc) layer and a second aqueous layer. The EtOAc extract layer was combined, collected and concentrated under reduced pressure, and then dried under reduced pressure. Then, the mixture was extracted three times with 4 liters of nucleic acid and 2 liters of methanol to obtain two layers. The concentrated nucleic acid layer (hereinafter referred to as DCMPe / h) and methanol layer (DCMPe) / m) samples were obtained. The second aqueous layer was adjusted to 2 liters, and again extracted with 2 liters of butanol, and concentrated under reduced pressure to obtain a butanol layer (called DCMPb) and a third aqueous layer (DCMPw). PCMPb samples were LH20 glue molecular tube column chromatographic analysis. (2.5x10 7 cm, the moving layer was methanol: water = 50: 50), and then subjected to active cleavage, and then the extracts of the sixth and seventh chromatography in the eight chromatographs obtained were collected and PCMPbL6,7 Called a sample. Next, adsorption tube column chromatography (1 × 30 cm) was again performed with Diaion SP-20 SS, and the second chromatograph was eluted with an eluate of isopropanol: water = 20: 80 (volume ratio), and was referred to as DCMPbL6 and 7D2. The elution of the third chromatograph with an eluate of isopropanol: water = 30: 70 (volume ratio) was called DCMPbL6, 7D3. In addition, the elution of 4th chromatography with the eluate of isopropanol: water = 40: 60 (volume ratio) was called DCMPbL6 and 7D4.

그 중, DCMPbL6,7D2는 다시 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=35:65:1(체적비)일 때에 용출하고, 그 중의 제2 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6, 7D2H2로 칭하였다.Among them, DCMPbL6, 7D2 was eluted again through an HPLC reversed-phase C18 tube column when the eluate was methanol: water: acetic acid = 35: 65: 1 (volume ratio), and the second chromatograph therein was collected and called DCMPbL6, 7D2H2. It was.

DCMPbL6,7D3은 다시 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=40:60:1(체적비)일 때에 용출하고, 그 중의 제3 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6,7D3H3이라 칭하였다. 그리고 DCMPbL6,7D4는 HPLC 역상 C18 관기둥을 통해 용출액이 메탄올:물:아세트산=45:55:1(체적비) 일 때 용출을 행하고, 그 중의 제3 크로마토그래픽을 수집하여 DCMPbL6,7D4H3으로 칭하였다. 그 분리의 흐름도는 도1에 도시한 바와 같다.DCMPbL6,7D3 was again eluted through an HPLC reversed phase C18 tube when the eluate was methanol: water: acetic acid = 40: 60: 1 (volume ratio), and the third chromatograph therein was collected and called DCMPbL6,7D3H3. DCMPbL6,7D4 was eluted when the eluate was methanol: water: acetic acid = 45: 55: 1 (volume ratio) through an HPLC reversed-phase C18 tube, and the third chromatography therein was collected and named DCMPbL6,7D4H3. The flow of separation is as shown in FIG.

(12) 곽산 석곡 알콜 추출물의 RPE 탐식작용에 대한 영향(12) Effect of Kwaksan Seokgok Alcohol Extract on RPE Phagocytosis

도 2는 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포 탐식작용에 대한 영향을 보여주는 그래프(주형도)이다. 이 도2에 도시한 바와 같이, 여러 농도의 곽산 석곡의 메탄올 추출물(0.1,1,10,100㎍/ml)의 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진효과를 갖는다. 그리고, 농도가 10%의 FCS도 현저하게 RPE 세포의 탐식작용을 촉진할 수 있다. 이들에 관련한 조작의 흐름도를 이하에 나타낸다.Figure 2 is a graph (template) showing the effect on RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok Extract. As shown in FIG. 2, the phagocytosis of methanol extracts (0.1,1,10,100 µg / ml) of Kwaksan Seokgok at various concentrations has a significant promoting effect on RPE cells. In addition, FCS at a concentration of 10% can significantly promote phagocytosis of RPE cells. The flowchart of the operation concerning these is shown below.

104개 RPE 세포를 96조 배양판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 48시간 배향하였다. 다음에 2% FCS를 포함하는 DMEM을 배향액으로 하여 각각 여러 농도의 곽산 석곡 메탄올 추출물을 첨가하였다. 48시간 후, 각 조 내에 농도가 2x107 FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 4시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하여 제거하고, 마지막으로 다기능 측정 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도의 테스트를 진행하였다. 그 중, 2% PCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 현저수준 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 상기한 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 메탄올 추출물을 갖는 조성물, 조성분 또는 그 외 생리활성을 갖는 조성은, 예를 들어, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어가 있어도, 해당 조성은 곽산 석곡 메탄올 추출물을 포함하고 있는 것에 의해 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들어, 타블렛(tablet)(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다.)이어도 좋다.10 4 RPE cells were placed in 96 well culture plates and oriented for 48 hours with DMEM containing 10% FCS. Next, Kwaksan Seokgok methanol extract of various concentrations was added using DMEM containing 2% FCS as an orientation liquid, respectively. After 48 hours, 50 μl of a solution of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added to each bath. After 4 hours, excess FITC-ROS cells were removed by washing with PBS, and finally, the fluorescence intensity test was performed with a 1420 Multilabel counter (PE) measure system. Among them, on the basis of the phagocytosis-promoting effect obtained using 2% PCS treated RPE cells, the sign "#" indicates that the degree of difference obtained by comparison with the above basis reached a remarkable level of 0.05, and the sign "*" is different. The degree reaches a remarkable level of 0.01. As can be seen from the above description, the composition having the Kwaksan Seokgok methanol extract, the composition or other physiologically active composition is, for example, even if there are other carriers having physiologically water soluble, the composition is Kwaksan Seokgok methanol extract It has a promoting effect on the phagocytosis of RPE cells by containing. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

도 3은 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 탐식작용을 예시한 그래프이다. 3 is a graph illustrating the RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok Extract.

도 3에 도시한 바와 같이, 여러 곽산 석곡 추출물(1.10㎍/ml의 DCMPe/h 및 1.10㎍/ml의 DCMPe/m 및 0.1,1,10㎍/ml의 DCMPb)이 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진효과를 갖는다. 관련 조작 흐름도를 이하에 설명한다. 우선 104개 RPE 세포를 96조 배향판(96 well culture plate) 속에 두고 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS의 DMEM을 배향액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x107 FITC-ROS/ml의 용액 50㎕을 첨가하였다. 48시간 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 중량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도의 테스트를 행하였다. 그 중, 2% FCS로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 상기한 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물(DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb)을 갖는 조성물, 조성분 또는 그 외 생리활성을 갖는 조성은 예를 들어, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어가 있어도 상기 조성은 곽산 석곡 추출물(DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb)을 포함하고 있는 것에 의해, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들어 이어도 좋다(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 장입하고 있다).As shown in Figure 3, several kwaksan Seokgok extracts (1.10 μg / ml of DCMPe / h and 1.10 μg / ml of DCMPe / m and 0.1,1,10 μg / ml of DCMPb) were observed for RPE cells. All have a marked facilitating effect. The related operation flowchart is described below. First, 10 4 RPE cells were placed in a 96 well culture plate and incubated with DMEM containing 10% FCS for 48 hours. Next, DMEM of 2% FCS was used as an alignment liquid. Then, 48 hours after the addition of each concentration of Kwaksan Seokgok extract, 50 μl of a solution of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added to each bath. After 48 hours, excess FITC-ROS cells were washed with PBS, and finally the fluorescence intensity was tested with a multifunctional weight cold light detection system (1420 Multilabel counter (PE) measure system). Among them, on the basis of the phagocytosis-promoting effect obtained by treating RPE cells with 2% FCS, the sign "#" indicates that the degree of difference obtained by comparison with the above basis reaches 0.05, and the sign "*" is the degree of difference It represents the outstanding level of 0.01. As can be seen from the above, the composition having a Kwaksan Seokgok extract (DCMPe / h, DCMPe / m, DCMPb), the composition or other physiologically active composition is, for example, other carriers having physiologically water soluble Even if the composition contains the Kwaksan Seokgok Extract (DCMPe / h, DCMPe / m, DCMPb), it has a promoting effect on the phagocytosis of RPE cells. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or isomer of the extract. For example, it may be (internally, the extract or an isomer of the extract is charged).

상기한 순화 후의 곽산 석곡 추출물Kwaksan Seokgok Extract after Purification

DCMPbL6,7D2H2, DCMPbL6,7D3H3, DCMPbL6,7D4H3도 현저하게 RPE 세포의 탐식작용을 촉진할 수 있다. DCMPbL6,7D2H2를 예를 들면, 여러 농도의 DCMPbL6,7D2H2(0.1,1,10,100㎍/ml)의 RPE 세포의 탐식작용에 대한 작용은 모두 현저한 촉진작용을 가지며, 도 4에 관련 결과가 도시되어 있다. 조작 프로그램은 우선, 104개 RPE 세포를 96조 배양기판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배향액으로 하여 각각 여러 농도의 석곡 추출물(DCMPbL6,7D2H2)을 첨가하여 48시간 후, 각 조 내에 농도가 2x107 FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 48시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 그 중, 2% FCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 화학구조는 오늘에 이르러서도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 이미 확실하게 도 5 내지 도 10에 나타낸 결과(600-MHZ의 NMP,DEPT,HMQC,HMBC,COSY 스펙트럼 도표 및 UV 분광도)로부터 입증되고 있다. 그 중, 도 5 내지 도 10은 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d6, DMS0-d6)를 용제로 하여 600-MHz 또는 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2에 대하여 분석을 행하여 얻어진 NMR,DEPT,HMQC,HMBC,COSY(500-MHz) 스펙트럼 도표이고, 그리고 도 11은 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 UV 분광도이다. 요약하면, 곽산 석곡 조성물 DCMPbL6,7D2H2를 갖는 것에 의해 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성을 갖는 캐리어를 포함하지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 포함하므로 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떠한 물질이다. 예를 들면 곽산이어도 좋다.(내부에는 상기 추출물질 또는 상기 추출물의 이성체가 장입되어 있다)DCMPbL6,7D2H2, DCMPbL6,7D3H3, DCMPbL6,7D4H3 can also significantly promote phagocytosis of RPE cells. For example, DCMPbL6,7D2H2, for example, at various concentrations of DCMPbL6,7D2H2 (0.1,1,10,100 µg / ml) on the phagocytosis of RPE cells, all have marked facilitation, and the results shown in FIG. . The manipulation program first put 10 4 RPE cells in a 96 well culture plate and incubated for 48 hours with DMEM containing 10% FCS. Next, various concentrations of dendrite extracts (DCMPbL6,7D2H2) were added using DMEM containing 2% FCS as an alignment solution, and 48 µl of solution having a concentration of 2x10 7 FITC-ROS / ml was added to each tank after 48 hours. . After 48 hours, excess FITC-ROS cells were washed with PBS, and finally, fluorescence intensity test was performed with a multifunctional quantitative cold light detection system (1420 Multilabel counter (PE) measure system). Among them, on the basis of the phagocytosis promoting effect obtained using 2% FCS treated RPE cells, the sign "#" indicates that the degree of difference obtained by comparison with the above basis reaches 0.05, and the sign "*" is the degree of difference It represents the outstanding level of 0.01. Among them, the chemical structure of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D2H2 has not yet been determined even today, but its presence is clearly shown in Figures 5 to 10 (NMP, DEPT, HMQC, HMBC, COSY spectrum of 600-MHZ). Chart and UV spectroscopy). Among them, FIGS. 5 to 10 show NMR and DEPT obtained by analyzing the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D2H2 at 600-MHz or 500-MHz with dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide-d 6 , DMS0-d 6 ) as a solvent. , HMQC, HMBC, COSY (500-MHz) spectral plot, and FIG. 11 is a UV spectrogram of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D2H2. In summary, some compositions that have physiological activity by having the Kwaksan Seokgok composition DCMPbL6,7D2H2 include carriers with other physiologically water soluble properties, but all of the above compositions include Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D2H2 for the phagocytosis of RPE cells. Has a promoting action against. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or an isomer of the extract. For example, Kwaksan may be used. (The extract or the isomer of the extract is charged therein.)

또한 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3에 있어서는, 여러 농도의 DCMPbL6,7D3H3(0.1·1㎍/ml)는 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 모두 현저한 촉진작용을 갖는다. 도 12에 그 관련 결과를 나타내고 있다. 이 관련 조작 프로그램을 간단하게 설명하면, 우선 104개 RPE 세포를 96조 배양액판(96 well culture plate) 속에 넣고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하여 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x107 FITC-ROS/ml의 용액 50㎕을 첨가하였다. 4시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 중량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE)measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 그 중 2% FCS 처리 RPE 세포를 이용하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3의 화학구조는 오늘에 이르러도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 이미 확실하게 도 13 내지 도 17에 나타낸 결과로부터 증명되고 있다. 그것은 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d6, DM-d6)를 용제로하여 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3에 대하여 분석을 행하여 얻어진 NMR,DEPT,NMBC,COSY 스펙트럼 도표이다. 요약하면, 이것은 DCMPbL6,7DH3가 RPE 세포의 탐식작용에 대하여 현저한 촉진작용을 가지고 있으므로, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성의 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 포함함으로써, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.Also, in the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D3H3, various concentrations of DCMPbL6,7D3H3 (0.1 · 1 µg / ml) have a significant promoting effect on phagocytosis of RPE cells. The related result is shown in FIG. Briefly describing this related manipulation program, 10 4 RPE cells were first placed in 96 well culture plates and incubated for 48 hours with DMEM containing 10% FCS. Next, DMEM containing 2% FCS was used as a culture medium, and various concentrations of Guksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D3H3 were added for 48 hours, and then 50 μl of a solution of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added in each bath. . After 4 hours, excess FITC-ROS cells were washed with PBS, and finally, fluorescence intensity test was performed with a multifunctional weight cold light detection system (1420 Multilabel counter (PE) measurement system). Based on the phagocytosis-promoting effect obtained using 2% FCS-treated RPE cells, the sign "#" indicates that the difference obtained by comparison with the base reached 0.05, and the sign "*" was markedly different. The level reaches 0.01. Among them, the chemical structure of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D3H3 has not yet been determined even today, but its existence has already been proved from the results shown in FIGS. 13 to 17. It is a NMR, DEPT, NMBC, COSY spectral plot obtained by analyzing the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D3H3 at 500-MHz with dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide-d 6 , DM-d 6 ) as a solvent. In summary, this suggests that DCMPbL6,7DH3 has a marked facilitating effect on phagocytosis of RPE cells, so that some compositions that have the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D3H3 and are also bioactive, may have different physiologically acceptable carriers, All of the above compositions include Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D3H3, thereby promoting phagocytosis of RPE cells. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

또한, 그외에, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3에 있어서는, 여러 농도의 DCMPbL6,7D4H3(0.1·1.10㎍/ml)이 RPE 세포에 대한 탐식작용은 모두 현저한 촉진작용을 갖는다. 관련 결과는 도 18을 참조하면서 관련된 흐름도를 이하에 설명한다. 우선 104개 RPE 세포를 96조 배양판(96 well culture plate) 속에 두고, 10% FCS를 포함하는 DMEM으로 48시간 배향하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3를 첨가하고 48시간 경과후, 각 조 내에 각각 농도가 2x107 FITC-ROS/ml인 용액 50㎕를 첨가하였다. 4시간 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하여 제거하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter (PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 진행하였다. 그 중, 2% FCS로 RPE세포를 처리하여 얻어진 탐식작용 촉진효과를 기초로 하여, 부호 「#」은 상기 기초와 비교하여 얻어진 차이도가 0.05에 달하는 것을 나타내고, 부호 「*」는 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다. 그 중, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3의 화학구조는 오늘에 이르러도 아직 확정할 수 없지만 그 존재는 확실하게 도19 내지 도24에 나타낸 결과로부터 증명되고 있다. 그 중, 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide-d6, DM s0-d6)를 용제로하여 500-MHz로 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3에 대하여 분석을 행하고, NMR,DEPT,HMQC,HBMC,COSY 스펙트럼 도표가 얻어졌다. 요약하면, DCMPbL6,7D4H3은 RPE 세포에 대한 탐식작용에 현저한 촉진작용을 가지므로, 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 가지고 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 다른 생리수용성을 갖는 캐리어를 포함하지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 포함함으로써, RPE 세포의 탐식작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.In addition, in the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D4H3, the phagocytosis of DCMPbL6,7D4H3 (0.1 · 1.10 µg / ml) at various concentrations has a significant promoting effect on RPE cells. Related results are described below with reference to FIG. 18. First 10 4 RPE cells were placed in a 96 well culture plate and oriented for 48 hours with DMEM containing 10% FCS. Next, DMEM containing 2% FCS was used as a culture solution. Then, each of the various concentrations of Guksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D4H3 was added and after 48 hours, 50 μl of a solution having a concentration of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added to each bath. After 4 hours, excess FITC-ROS cells were removed by washing with PBS, and finally, fluorescence intensity test was performed with a multifunctional quantitative cold light detection system (1420 Multilabel counter (PE) measure system). Among them, on the basis of the phagocytosis-promoting effect obtained by treating RPE cells with 2% FCS, the sign "#" indicates that the degree of difference obtained by comparison with the above basis reaches 0.05, and the sign "*" is the degree of difference It represents the outstanding level of 0.01. Among them, the chemical structure of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6, 7D4H3 has not yet been determined even today, but its existence is certainly proved from the results shown in Figs. Among them, Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D4H3 was analyzed at 500-MHz using dimethylsulfoxide (dimethylsulfoxide-d 6 , DM s0-d 6 ), and NMR, DEPT, HMQC, HBMC, COSY spectrum diagrams were analyzed. Obtained. In summary, DCMPbL6,7D4H3 has a significant facilitating effect on phagocytosis on RPE cells, so that some compositions with Kwak Seok Seokgok extract DCMPbL6,7D4H3 and also have biological activity include carriers with other physiologically water soluble properties. All include the Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D4H3, thereby promoting phagocytosis of RPE cells. Among them, the carrier is a substance which can carry and carry the extract or the isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

(13) 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향(13) Effect of Kwaksan Seokgok Extract on RPE Cell-to-Nitric Oxide Production

도 25는 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향을 나타내는 그래프이다. 이 도 25로부터 알 수 있는 바와 같이, 여러개의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)이 RPE 세포 대 산화질소 생성작용에 대한 영향은 동일하지 않다. 그 중 부호 「#」 및 「*」은 각각 얻어진 결과와 2% FCS로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 산화질소 생성작용의 촉진효과를 비교했을 때 얻어진 차이도가 현저수준 0.05와 0.01에 달하는 것을 나타내고 있다. 이 도 25에 도시한 바와 같이, 농도가 100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 메탄올 추출물 DCM, 농도가 10,100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe, 농도가 10 또는 1000㎍/ml의 곽산 석곡 추출물 n-부탄올 추출물 PCMPb 및 농도가 100,1000㎍/ml의 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh는 모두 현저하게 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대한 영향을 촉진한다. 관련된 조작 프로그램은 이하에 나타낸다. 우선, 104개 RPE 세포를 96조 배항판(96 well culture plate) 중에 두고, 10% FCS를 포함한 DMEM으로 48시간 배양하였다. 다음에 2% FCS를 포함한 DMEM을 배향액으로 하였다. 그런 후, 각각 여러 농도의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMpb)을 첨가하여 48시간 경과 후, 각 조 내에 각각 농도가 2x107 FITC-ROS/ml의 용액 50㎕를 첨가하였다. 48시간 경과 후, PBS로 여분의 FITC-ROS 세포를 세정하고, 마지막으로 다기능 정량 냉광 검출 시스템(1420 Multilabel counter(PE) measure system)으로 형광강도 테스트를 행하였다. 여기서 여러 농도의 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)이 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대하여 현저한 촉진작용을 갖는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고, 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 그 외 생리수용성의 캐리어를 가질 가능성이 있지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고 있으므로, RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.FIG. 25 is a graph showing the effects of Kwaksan Seokgok Extract on RPE cells versus nitric oxide production. As can be seen from FIG. 25, the effects of several Kwaksan Seokgok extracts (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb) on RPE cells versus nitric oxide production are not the same. Among them, the symbols "#" and "*" indicate that the difference obtained when the RPE cells were treated with 2% FCS and the promoting effect of the nitric oxide producing effect, respectively, reached the remarkable level of 0.05 and 0.01, respectively. . As shown in FIG. 25, the concentration of 100,1000 µg / ml Guksan Seokok methanol extract DCM, the concentration of 10,100,1000 µg / ml Guksan Seokok ethyl acetate extract DCMPe, and the concentration of 10 or 1000 µg / ml Seokgok extract n-butanol extract PCMPb and Kwaksan Seokgok n-nucleic acid extract DCMPh with a concentration of 100,1000 µg / ml markedly promote the effect on nitric oxide production of RPE cells. The related operation program is shown below. First, 10 4 RPE cells were placed in 96 well culture plate and incubated for 48 hours with DMEM containing 10% FCS. Next, DMEM containing 2% FCS was used as an alignment liquid. Then, 48 hours after adding various concentrations of Guksan Seokgok Extract (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMpb), 50 μl of a solution of 2 × 10 7 FITC-ROS / ml was added to each bath. After 48 hours, excess FITC-ROS cells were washed with PBS, and finally, fluorescence intensity test was performed with a multifunctional quantitative cold light detection system (1420 Multilabel counter (PE) measure system). Here, the various concentrations of Kwaksan Seokgok Extracts (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb) include the Kwaksan Seokgok Extracts (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb), which have a significant promoting effect on the nitric oxide production of RPE cells. In addition, some compositions having physiological activity may have other physiologically soluble carriers, but all of the above compositions include Kwaksan Seokgok Extract (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb). Has a promoting action against. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

(14) 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin과 HGF 표현에 대한 촉진작용(14) Kwaksan Seokgok Extract Promotes Hepatic Growth Factor β-actin and HGF Expression in RPE Cells

도 26(A)-(B)는 곽산 석곡 메탄올 추출물로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin(A) 및 (B)를 표현하는 전기영동도이다. 그 중, 이들 성장인자의 표현은 RT-PCR의 방법에 의해 표현된다. 도 26으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물은 명백하게, RPE 세포의 간 기능인자 β-actin 및 HCF 표현에 대한 작용을 촉진한다. 그 관련된 조작 프로그램을 간단하게 설명하면, 우선 2% FCS 및 1000㎍/㎖을 포함한 곽산 석곡 추출물의 DMEM에 있어서 24시간 배양 후 전기영동을 행하였다. 그 중, 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 CDNA를 β-actin(A)의 형판(template)(1X)로 하고, 0.5㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 CDNA량을 HGF(B)의 형판으로 하였다(1X). 제1 레인(lane)은 X174/Hae111을 표기(marker)하여 얻은 결과이다. 제2 레인은 1배 형판의 전기영동 결과이다. 제3 레인은 형판을 2배로 희석하여 얻어진 전기영동 결과이다. 제4 레인형판을 4배 희석한 후 얻어진 전기영동 결과이다. 제5 레인은 형판을 8배 희석한 후에 얻어진 전기영동 결과이다. 제6 레인은 형판을 16배로 희석한 후에 얻어진 전기영동 결과이다.26 (A)-(B) are electrophoresis diagrams representing β-actin (A) and (B) obtained by treating RPE cells with Guksan Seokgok methanol extract. Among them, expression of these growth factors is expressed by the method of RT-PCR. As can be seen from FIG. 26, the Kwaksan Seokgok extract apparently promotes the action on liver function factor β-actin and HCF expression in RPE cells. The related operation program will be briefly described. First, electrophoresis was performed after 24 hours of culturing in DMEM of the Kwaksan Seokgok extract containing 2% FCS and 1000 µg / ml. Among them, CDNA generated by all 1 μg RNA was used as a template of β-actin (A) (1X), and the amount of CDNA generated by 0.5 μg all RNA was used as a template of HGF (B). 1X). The first lane is a result obtained by marking X174 / Hae111. Lane 2 is the result of electrophoresis of the 1x template. Lane 3 is the result of electrophoresis obtained by diluting the template twice. It is the result of electrophoresis obtained after diluting the fourth lane plate four times. Lane 5 is the result of electrophoresis obtained after diluting the template 8-fold. Lane 6 is the result of electrophoresis obtained after diluting the template 16 times.

다음에 도 27은 여러개의 곽산 석곡 추출물이 RPE 세포의 HGF에 대한 mRNA 표현의 전기영동도이다. 이 도 27로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh는 명백하게 RPE 세포가 간 기능인자 β-actin 및 HGF 표현에 대하여 촉진하는 작용을 갖는다. 그 관련 조작 프로그램을 간단히 설명하면, 우선 RPE 세포를 2% FCS와 0.1㎍/ml를 포함한 여러개의 곽산 석곡 추출물(n-핵산 추출물 DCMPh, 에틸아세테이트 추출물 DCMPe 및 n-부탄올 추출물 DCMPb)의 DMEM 중으로 옮겨진다. 48시간 경과 후 전기영동을 행하고, 그 중, 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생된 cDNA량을 형판으로 하였다(1X). 제1 레인(lane)은 X174/Hae111을 표기(marker)로서 얻어진 결과이다. 제2 레인은 HGF 제어그룹의 전기영동 결과이다. 제3 레인은 β-actin 제어그룹의 전기영동 결과이다. 제4 레인은 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제5 레인은 곽산 석곡 n-핵산 추출물 DCMPh로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동 결과이다. 제6 레인은 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제7 레인은 곽산 석곡 에틸아세테이트 추출물 DCMPe로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동결과이다. 제8 레인은 곽산 석곡 n-부탄올 추출물 DCMPb로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 HGF 표현의 전기영동 결과이다. 제9 레인은 곽산 석곡 n-부틸 추출물 DCMPb로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 β-actin 표현의 전기영동 결과이다.Next, FIG. 27 is a diagram illustrating electrophoresis of mRNA expression for HGF in RPE cells of several Kwaksan Seokgok extracts. As can be seen from FIG. 27, the Kwaksan Seokgok n-Nucleic Acid extract DCMPh apparently has an effect of promoting RPE cells on liver function factor β-actin and HGF expression. Briefly describing the relevant manipulation program, RPE cells were first transferred into DMEM of several Kwaksan Seokgok extracts (n-nucleic acid extract DCMPh, ethyl acetate extract DCMPe and n-butanol extract DCMPb) containing 2% FCS and 0.1 μg / ml. Lose. After 48 hours, electrophoresis was performed, and the amount of cDNA generated by 1 μg of all RNA was used as a template (1 ×). The first lane is the result obtained as a marker of X174 / Hae111. Lane 2 is the result of electrophoresis of the HGF control group. Lane 3 is the result of electrophoresis of β-actin control group. Lane 4 is the result of electrophoresis of HGF expression obtained by treating RPE cells with Kwaksan Seokgok n-Nucleic Acid Extract DCMPh. Lane 5 is the result of electrophoresis of β-actin expression obtained by treating RPE cells with Kwaksan Seokgok n-Nucleic Acid Extract DCMPh. Lane 6 is the result of electrophoresis of HGF expression obtained by treating RPE cells with Kwaksan Seokgok Acetate Extract DCMPe. Lane 7 is a result of the electrophoresis of β-actin expression obtained by treating RPE cells with Kwaksan Seokgok ethyl acetate extract DCMPe. Lane 8 is the result of electrophoresis of HGF expression obtained by treating RPE cells with Guksan Seokgok n-butanol extract DCMPb. Lane 9 is the result of electrophoresis of β-actin expression obtained by treating RPE cells with Guksan Seokgok n-butyl extract DCMPb.

또한, 여러 농도의 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)은 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin 및 HGF의 표현에 대하여 현저한 촉진작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있지만, 상기 조성은 모두 곽산 석곡 추출물(DCM,DCMPh,DCMPe,DCMPb)을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 간 성장인자 β-actin 및 HGF의 표현에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.In addition, various concentrations of stone extracts (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb) have a significant promoting effect on the expression of hepatic growth factor β-actin and HGF in RPE cells, and thus, Kwaksan Stone Extract (DCM, DCMPh, DCMPe). Some compositions having DCMPb and physiological activity may possibly have carriers having physiologically soluble water. However, since all of the compositions contain Guksan Seokgok Extract (DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb), It has a promoting effect on the expression of hepatic growth factors β-actin and HGF. Among them, the carrier is any substance capable of carrying the extract or an isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

(15) 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포에 대하여, 정상 및 산소결핍의 상황하에서 bFGF,VEGF 및 TGF-β 표현에 대한 억제작용(15) Inhibition of bFGF, VEGF and TGF-β expression in the RPE cells of Kwaksan Seokgok Extract under normal and oxygen deficiency

도 28(A) 내지 도 29(B)는 곽산 석곡 추출물 DeCaM이 RPE 세포에 대하여, 정상상황하에서 β-actin, bFGF, VEGF 및 TFG-β 표현에 대한 작용을 나타내고, 그 중 β-actin의 mRNA표현을 대조군으로 한다. 도 28(A) 내지 도 29(B)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 정상의 RPE 세포의 경우, 그 bFGF, mRNA의 표현량은 곽산 석곡 추출물에 4배 억제되어 있다. 그리고 VFGF,mRNA의 표현량은 2배로 억제되어 있다. TGF-β mRNA의 표현량이 되면 특수적인 변화가 없다. 이 관련된 조작 프로그램을 다음에 간단하게 설명하면, 우선, RPE 세포를 2% FCS 및 1000㎍/ml를 포함한 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 DMEM 중에 옮겨서 배양하였다. 48시간 경과 후 RNA를 추출하고, RT-PCR 방법에 의해 분석을 촉진하고, 그 중의 1㎍ 모든 RNA에 의해 발생한 CDNA량을 형판(template)(1X)으로 하였다. 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 100bp 사닥다리형(ladder)을 표기로 하여 얻은 결과이고, 제3 레인은 1배형판의 전기영동 결과이고, 제4 레인은 형판을 2배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제5 레인은 형판을 4배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제6 레인은 형판을 8배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제7 레인은 형판을 16배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제8 레인은 형판을 32배 희석한 후 얻은 전기영동 결과이다.28 (A) to FIG. 29 (B) show that the Kwaksan Seokgok Extract DeCaM, on RPE cells, acts on β-actin, bFGF, VEGF and TFG-β expression under normal conditions, among which β-actin mRNA Expression is a control. As can be seen from the results of Figs. 28 (A) to 29 (B), in the case of normal RPE cells, the expression level of the bFGF and mRNA is suppressed four times by Kwaksan Seokgok Extract. In addition, the expression level of VFGF and mRNA was doubled. There is no specific change in the expression level of TGF-β mRNA. This related manipulation program will be briefly described below. First, RPE cells were first transferred and cultured in DMEM of Kwaksan Seokok Extract DeCaM containing 2% FCS and 1000 μg / ml. After 48 hours, RNA was extracted, the analysis was accelerated by RT-PCR method, and the amount of CDNA generated by 1 μg of all RNA therein was used as a template (1 ×). Lane 1 is the result obtained by the notation of 4X174, lane 2 is the result obtained by the notation of 100 bp ladder, lane 3 is the result of electrophoresis of the 1-fold plate, and lane 4 is the template. Electrophoresis result obtained by diluting 2 times, lane 5 is electrophoresis result obtained by diluting the template 4 times, lane 6 is electrophoresis result obtained by diluting the template 8 times, and lane 7 16 times the template. Electrophoresis results obtained by dilution, lane 8 is the electrophoresis results obtained after diluting the template 32 times.

여기서, 곽산 석곡 추출물 DeCaM은 정상상황하에서는 RPE 세포의 bFGF, VEFG에 대하여 현저한 억제작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 bFGF,VEGF의 표현에 대하여 억제작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.Here, the Kwaksan Seokgok Extract DeCaM has a significant inhibitory effect on the bFGF and VEFG of RPE cells under normal circumstances, so that any composition having the Kwaksan Seokgok Extract DeCaM and also having a physiological activity has a carrier having a physiologically water soluble activity. Even if possible, all of the above compositions contained the Kwaksan Seokgok Extract DeCaM, and therefore, had an inhibitory effect on the expression of bFGF and VEGF in RPE cells. Among these, the carrier may be any substance capable of carrying and carrying the extract or the isomer of the extract. For example, the carrier may be a tablet (in which the extract or the isomer of the extract is enclosed).

도 30(A) 내지 도 31(B)는 석곡 추출물 DeCaM을 RPE 세포에 대하여 산소결핍상태(hypoxia)하에서 β-actin, bFGF, VEGF 및 TGF-β 표현에 대한 작용이고, 그 중 β-actin의 mRNA 표현을 대조군으로 한다. 도 30(A) 내지 도 31(B)의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 산소결핍 RPE 세포의 경우, 그 bFGF mRNA의 표현량은 곽산 석곡 추출물에 2배 억제되어 있고, VEGF, mRNA의 표현량을 2배 억제되어 있으며, TGF-β, mRNA의 표현량은 4배 억제되어 있다. 그 관련된 조작 프로그램을 다음에 나타내면, 우선 RPE 세포를 2% FCS 및 1000㎍/ml의 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함한 DMEM 중에 옮겨져서 48시간 배양 후 RNA을 추출하였다. RT-PCR 방법에 의해 분석을 행하고, 그 중의 1㎍ 모든 RNAL에 의해 발생한 cDNA량을 형판(template)(1X)로 하였다. 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 100bp 사닥다리형(ladder)을 표기로 하여 얻은 결과이고, 제3 레인은 1배 판의 전기영동 결과이고, 제4 레인은 형판을 2배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제5 레인은 형판을 4배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제6 레인은 형판을 8배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제7 레인은 형판을 16배 희석하여 얻은 전기영동 결과이고, 제8 레인은 형판을 32배 희석한 후 얻은 전기영동 결과이다.30 (A) to FIG. 31 (B) show the action of β-actin, bFGF, VEGF and TGF-β expression under the oxygen deficiency (hypoxia) of the Rhodifolium extract DeCaM, among which mRNA expression is used as a control. As can be seen from the results of Figs. 30 (A) to 31 (B), in the case of oxygen-deficient RPE cells, the expression amount of the bFGF mRNA was suppressed twice by the Kwaksan Seokgok extract, and the expression amount of VEGF and mRNA. The expression of TGF-β and mRNA is suppressed four-fold. The related manipulation program is shown below. First, RPE cells were first transferred into DMEM containing 2% FCS and 1000 μg / ml of Kwaksan Seokok Extract DeCaM, followed by culture for 48 hours, and RNA was extracted. The analysis was performed by the RT-PCR method, and the amount of cDNA generated by all 1 µg of RNAL therein was set as a template (1X). Lane 1 is the result obtained by marking 4X174, lane 2 is the result obtained by marking 100bp ladder, lane 3 is the result of electrophoresis of the 1 st plate, and lane 4 is the template. Electrophoresis result obtained by diluting 2 times, lane 5 is electrophoresis result obtained by diluting the template 4 times, lane 6 is electrophoresis result obtained by diluting the template 8 times, and lane 7 16 times the template. Electrophoresis results obtained by dilution, lane 8 is the electrophoresis results obtained after diluting the template 32 times.

여기서, 곽산 석곡 추출물 DeCaM은 산소결핍상황하에서 RPE 세포의 bFGF, VEFG 및 TGF-β의 표현에 대하여 현저한 억제작용을 갖고 있는 것에 의해, 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 가지며 또한 생리활성을 갖는 어떤 조성은 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 추출물 DeCaM을 포함하고 있으므로 RPE 세포의 bFGF,VEGF 및 TGF-β의 표현에 대하여 억제작용을 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다. 이상의 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 곽산 석곡 추출물은 선택적으로 눈병 중에서 중요한 역할을 하는 유전자, 예를 들면 bFGF,VEGF, TFG-β 등 mRNA의 표현을 조절할 수 있다.Here, the Kwaksan Seokgok Extract DeCaM has a significant inhibitory effect on the expression of bFGF, VEFG and TGF-β in RPE cells under oxygen deprivation conditions. Even if there is a possibility of having a carrier having physiologically water solubility, since all of the above compositions include Kwaksan Seokgok Extract DeCaM, it has an inhibitory effect on the expression of bFGF, VEGF and TGF-β in RPE cells. Among these, the carrier may be any substance capable of carrying and carrying the extract or the isomer of the extract. For example, the carrier may be a tablet (in which the extract or the isomer of the extract is enclosed). As can be seen from the above, the Kwaksan Seokgok extract can selectively regulate the expression of genes such as bFGF, VEGF, TFG-β, etc., which play an important role in eye disease.

(16) 테스트 파이프 내 당화알부민(AGE-BSA)의 제작(16) Preparation of glycated albumin (AGE-BSA) in test pipes

0.1g/ml 보빈 세럼 알부민(bovin serum albmin;BSA)의 플랙션V 및 180mg/ml 글루코스를 함유한 PBS를 배치하고, 구경이 0.22㎛의 무균여과막으로 여과하여, 각각 5ml 취하여 15ml 테스트 파이브 속에 첨가하였다(반응농도는 760mM BSA 및 0.5M 글루코스). 또한 그외에 글루코스를 포함하지 않는 대조군을 제작하고, 밀봉후 암흑 37℃ 배양기 속에 두었다. 2,4,8,12,16주 방치 후 취출하였다. 4℃에 있어서 100배 체적의 3차 물로 4회 투석하고, 완전하게 글루코스를 제거하여 무균여과로 냉동건조한 후, 정량으로 평량하여 회용 분리후 다시 냉동건조하고, -20℃ 온도에 두고 보존하였다.PBS containing fraction V and 0.1 mg / ml bovin serum albmin (BSA) and 180 mg / ml glucose were placed, filtered through a sterile filtration membrane of 0.22 μm in diameter, 5 ml each, and added into a 15 ml test five. (Reaction concentrations were 760 mM BSA and 0.5 M glucose). In addition, a control group containing no glucose was prepared and placed in a dark 37 ° C. incubator after sealing. It was taken out after 2,4,8,12,16 weeks standing. It was dialyzed four times with 100 times volume of tertiary water at 4 ° C, completely freed from glucose and lyophilized by aseptic filtration, and then weighed by quantitative determination, lyophilized again and stored at -20 ° C.

(17) 곽산 석곡 추출물과 HGF이 RPE 세포에 대하여 AGE-BSA 능력을 감성하는 영향 관련된 조작 흐름도를 다음에 설명한다.(17) A flow chart of the operation related to the effects of Kwaksan Seokgok Extract and HGF on sensitizing AGE-BSA ability to RPE cells is described below.

96조의 배양판(96 well culture plate) 중에 1x106개 RPE 세포를 옮기고, 10% PCS를 포함한 DMEM을 배양액으로 하여 37℃의 온도에서, 대기 중 5% CO2를 포함하는 조건하에서 48시간 배양하였다. 아울러 5군의 실험처리로 각 군 2판 처리하고, 36,48시간 실험처리 후 0.01% EDTA 처리로 세포를 DMEM 속에 던져두고, 세포수를 계산하였다. 5군의 처리조건은 각각 다음의 표에 나타낸다.1 × 10 6 RPE cells were transferred into 96 well culture plates, and cultured for 48 hours under conditions including 5% CO 2 in the air at 37 ° C. using DMEM containing 10% PCS as a culture medium. . In addition, each group was treated with two groups by experimental treatment of five groups, and after 36,48 hours of experimental treatment, cells were thrown into DMEM by 0.01% EDTA treatment, and the number of cells was calculated. The treatment conditions of the five groups are shown in the following table, respectively.

군별Group DCM(㎍/ml) DCM (μg / ml) HGF(ng/ml) HGF (ng / ml) 1One 100100 00 22 1010 00 33 1One 00 44 00 5050 55 00 00

용액은 1200rpm 원심분리 5분간 후, 세포를 다시 10ml DMEM 속에 2회 현탁시키고, 다시 0.7ml 균질완충액(50mM 아세트산나트륨 완충액〔50mM 아세트산나트륨 완충액, pH4.5, 1mM DTT, 0.15M 염화나트륨, 3mM 질화나트륨NaN3〕로 원심분리되어, 0.1%를 포함한 TritonX-100로 현탁한 후 초음파진동기로 4회, 매회 15초로 철저하게 세포를 타파하였다. 그것으로부터 13000rpm으로 15분간 원심분리하고, 다시 15초X4회로 초음파진동을 행하고, 11000rpm으로 15분간 원심분리 부유액을 수집하였다. 무균여과하여 단백질 농도를 계산하여 AGE 및 AGE-BSA 감성의 형식 및 정도를 전기 영동 관찰하였다.After 5 minutes at 1200 rpm centrifugation, the cells were again suspended twice in 10 ml DMEM and again in 0.7 ml homogeneous buffer (50 mM sodium acetate buffer [50 mM sodium acetate buffer, pH4.5, 1 mM DTT, 0.15 M sodium chloride, 3 mM sodium nitride). Centrifuged with NaN 3 ], suspended with TritonX-100 containing 0.1%, and thoroughly blasted the cells four times with an ultrasonic vibrator for 15 seconds each time, and then centrifuged for 15 minutes at 13000 rpm, followed by 15 seconds X 4 cycles. Ultrasonic vibration was performed and centrifuged suspension was collected at 11000 rpm for 15 minutes, protein concentration was calculated by aseptic filtration and electrophoresis was observed for the type and degree of AGE and AGE-BSA sensitivity.

(18) 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자 HGF가 RPE 세포의 단백질분해활성에 대한 영향(18) Effects of Kwaksan Seokgok Methanol Extract and Liver Growth Factor HGF on Proteolytic Activity of RPE Cells

도 32는 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자 HGF의 RPE 세포에 대한 단백질분해활성 영향의 전기영동도이다. 이 도 32에서는 분해활성은 각 처리조 사이에서 차이가 크지 않지만, 10㎍/㎖ DCM 및 50ng/㎖ HGF로 RPE 세포를 처리하여 얻어진 분해작용과 처리를 받지 않은 제어군과를 비교한 바, RPE 세포의 분해작용이 어느정도 증가하고 있는 것이 확실히 보였다. 다음에 관련된 조작단계를 설명한다. 106개 RPE 세포를 직경 10cm의 배양접시 속에 옮겨넣고, 우선 10%를 포함한 FCS의 DMEM 속에서 RPE 세포를 48시간 배양한 후, 다시 2%를 포함한 FCS 및 여러 농도의 곽산 석곡 메탄올 추출물 또는 HGF〔(a)100㎍/ml, (b)10㎍/ml DCM, (c)1㎍/ml DCM, (d)50ng/ml HGF 및 (e)제어군의 DMEM〕로 48시간 배양하였다. 그런 후, 세포의 단백질(cellular extracts)를 추출하여 세분하지 않고, 우선 단백질을 정량하여 다시 AGE-BSA와 공동반응시킨 바, 반응농도는 세포추출물(추출된 단백질) 및 AGE-BSA가 모두 500mg/ml이고, 즉 효소(세포추출물)와 반응기질(AGE-BSA) 비는 1:1로 82시간 배양하였다. 그 중, 제1 레인은 4X174를 표기로 하여 얻은 결과이고, 제2 레인은 세포추출물로부터 얻어진 결과이고, 제3 내지 제 8레인은 0~82시간의 전기영동 결과이고, 제9 내지 제10 레인은 전기영동을 행하여 얻어진 결과이다.32 is an electrophoresis diagram of the effect of proteolytic activity on RPE cells of Kwaksan Seokgok methanol extract and liver growth factor HGF. In FIG. 32, the degradation activity was not significantly different between treatment tanks. However, the degradation activity obtained by treating RPE cells with 10 µg / ml DCM and 50ng / ml HGF was compared with that of the untreated control group. It was clearly seen that the degradation of the cells was somewhat increased. Next, related operation steps will be described. 106 RPE cells were transferred into a 10 cm diameter dish, first incubated for 48 hours with RPE cells in DMEM of FCS containing 10%, FCS containing 2% and Kwaksan Seok-Gok Methanol Extract or HGF [ (a) 100 μg / ml, (b) 10 μg / ml DCM, (c) 1 μg / ml DCM, (d) 50 ng / ml HGF, and (e) DMEM of control group]. Then, the cellular extracts were not extracted and subdivided. First, the proteins were quantified and co-reacted with AGE-BSA. The reaction concentration was 500 mg / g for both the cell extract (extracted protein) and AGE-BSA. ml, that is, the ratio of enzyme (cell extract) and reactive (AGE-BSA) was incubated at 1: 1 for 82 hours. Among them, the first lane is the result obtained by designating 4X174, the second lane is the result obtained from the cell extract, the third to eighth lanes are the electrophoresis results of 0 to 82 hours, and the ninth to tenth lanes. Is the result obtained by performing electrophoresis.

또한, 도 33은 도면에 기초하여 묘사되었다. 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질분해활성 영향의 절선도(折線圖)이다. 도 33에 도시한 바와 같이, 분해작용의 속율(速率)은 12에서 48시간의 작용시간 중 속도가 비교적 빠르고, 그리고 48과 82시간 사이에 배양한 감성형식은 부동처리 사이에서 약간의 차이를 봤다. 그리고 48시간 배양했을 때, 10㎍/ml DCM이 RPE 세포분해활성에 대한 영향이 가장 강하고, 그리고 100㎎/ml DCM 및 50ng/ml HGF의 효과는 그다음에 이어진다.33 is also depicted based on the drawing. A diagram showing the effects of proteolytic activity on the RPE cells of Kwaksan Seokgok methanol extract and liver growth factor. As shown in FIG. 33, the rate of degradation was relatively fast during 12 to 48 hours of action time, and the emotional form cultured between 48 and 82 hours showed slight differences between immobility treatments. . And when incubated for 48 hours, 10 µg / ml DCM had the strongest effect on RPE cytolytic activity, followed by the effects of 100 mg / ml DCM and 50 ng / ml HGF.

이와 같이, 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자가 RPE 세포의 단백질분해활성에 대하여 촉진작용을 갖고 있는 것으므로, 곽산 석곡 추출물 또는 HGF를 가지며 또한 생리활성을 갖는 조성은, 그외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 곽산 석곡 추출물 DCM 또는 HGF를 포함하고 있으므로, RPE 세포의 단백질분해활성에 대하여 촉진작용을 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대할 수 있는 어떤 물질이다. 예를 들면, 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.As such, the Kwaksan Seokgok Methanol Extract and Liver Growth Factor have a promoting effect on the proteolytic activity of RPE cells, and thus, the composition having Kwakseok Seokgok Extract or HGF and also having physiological activity is a carrier having physiologically water soluble properties. Even if it has a possibility that the composition contains the Kwaksan Seokgok extract DCM or HGF, it has a promoting effect on the proteolytic activity of RPE cells. The carrier is any substance that can carry the extract or isomer of the extract. For example, it may be a tablet (the extract or an isomer of the extract is enclosed therein).

(19) 낮은 조제량의 STZ(streptozotocin)로 자가면역 당뇨병 합병증을 유도연립하는 동물 모델(19) Animal models inducing coalition of autoimmune diabetes complications with low-dose STZ (streptozotocin)

도 34는 곽산 석곡 메탄올 추출물이 당뇨병을 갖는 쥐의 체내의 AGE 함량에 대한 영향을 나타내는 도면이다. 도 34에 도시한 바와 같이, 곽산 석곡 추출물 DCM으로 당뇨병을 가진 쥐를 처리한 후, 상기 쥐 체내의 AGE 함량은 명확하게 저하되고, 즉 이 동물실험에 의해 곽산 석곡 메탄올 추출물은 확실하게 AGE 함량을 감소시키는 효과를 갖는다. 그 관련된 조작 프로그램을 설명하면, 우선 6주 크기의 C57BL/6J 쥐를 취하고, pH4.5, 농도가 0.15M의 레몬산 완충액(Citric acid buffer)에 의해 STZ를 매일 1kg 체중마다 50mg의 조제량으로 쥐 체내에 유입하여 연속 5일 주사하였다. 이와 같이 12~14일 주사한 후 안와혈액(orbital blood;眠寮探血)으로 측정한 바, 혈당농도가 250mg/d1보다도 커지고 나서야 비로서 수요에 달하였다. 이 수용에 부합하는 쥐를 4군으로 나눠서, 각각 체중의 차이에 따라서 여러 조제량을 포함한 석곡 메탄올 추출물의 사료(0mg/kg/day,1g/kg/day, 200mg/kg/day 및 40mg/㎏/day)로 키우고, 매주 1회 혈당을 관찰하고, 만약 혈당이 내려가면 다시 200mg2/kg2/day의 조제량으로 STZ를 주사형 쥐를 고혈당의 환경 속에 두고, 약 4~8주 후, 안와혈을 취하여 혈당 및 AGB AB를 측정하였다. 또한 안청, 간, 신장을 취하고, He staining 하여, 파라핀으로 처리한 후, 절편화하여 병리변화를 관찰하였다. 실험 중에 있어서는 체중, 음료수, 사료의 소모량을 기록하였다. 동시에 쥐의 외관, 표면 털의 변화, 네 다리 및 모혈액순환상황에 주의하여 사진을 찍어서 기록하였다. 그 부호 「*」에서 상기 제어군과 비교하여 얻은 차이가 현저수준 0.05에 달하는 것을 나타내고, 「**」에서 차이도가 현저수준 0.01에 달하는 것을 나타낸다.34 is a view showing the effect of the Kwaksan Seokgok methanol extract on the AGE content in the body of a rat with diabetes. As shown in FIG. 34, after treating rats with diabetes with the Kwaksan Seokgok extract DCM, the AGE content in the rat body is clearly lowered, that is, the Kwaksan Seokgok Methanol extract reliably increases the AGE content. Has a reducing effect. To explain the associated manipulation program, first take a 6-week-old C57BL / 6J rat, and then, with a pH4.5, 0.15M Citric acid buffer, STZ was added to the rat at a dose of 50 mg / kg daily. It was introduced into the body and injected for 5 consecutive days. As such, after 12-14 days of injection, orbital blood (眠 寮 探 血) was measured, and blood glucose concentrations were greater than 250 mg / d1, and the demand was not met. The rats meeting this acceptance were divided into 4 groups, and the diets of Seok-Guk Methanol extracts containing various preparations (0mg / kg / day, 1g / kg / day, 200mg / kg / day and 40mg / kg) were prepared according to the body weight difference. / day) and monitor blood glucose once a week, and if the blood sugar goes down, put the STZ at a dosage of 200 mg 2 / kg 2 / day again and put the rat in the environment of hyperglycemia, about 4-8 weeks later, Orbital blood was taken to measure blood glucose and AGB AB. In addition, the cornea, liver and kidney were taken, he stained, treated with paraffin, and then sectioned to observe the pathological changes. During the experiment, body weight, drink, and feed consumption were recorded. At the same time, photographs were recorded by paying attention to the appearance of the rats, changes in the surface hair, four legs, and blood circulation. The symbol "*" indicates that the difference obtained in comparison with the control group reaches the remarkable level 0.05, and the "**" indicates that the difference reaches the remarkable level 0.01.

또한 곽산 석곡 메탄올 추출물은 확실하게 AGE량을 효과를 갖고 있으므로, 곽산 석곡 메탄올 DCM을 가지며 또한 생리활성을 갖고 있는 어떤 조성은, 그 외에 생리수용성을 갖는 캐리어를 가질 가능성이 있어도, 상기 조성이 모두 곽산 석곡 메탄올 추출물 DCM을 포함하고 있으므로, 체내의 AGE 함량을 저하시키는 것에 효과를 갖는다. 그 중 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들어 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.In addition, since the Kwaksan Seokgok Methanol extract reliably has an effect of AGE, any composition having Kwaksan Seokgok Methanol DCM and also having physiological activity may have a carrier having other physiologically water soluble properties. Since the Seokkok methanol extract contains DCM, it is effective in lowering the AGE content in the body. The carrier may be any substance which can carry and carry the extract or the isomer of the extract. For example, the carrier may be a tablet (in which the extract or the isomer of the extract is enclosed).

이상의 내용으로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 출원인은 예의 시험과 연구를 거듭한 결과, 마침내 곽산 석국 추출물은 확실하게 망막흑색소 상피세포의 작용을 조절제어할 수 있는 동시에, 간접적으로 그 관련 메카니즘에 영항을 준다. 본 발명에 의해 제출된 곽산 석곡 추출물은 RPE 세포의 탐식작용, 산화질소 생성작용, 간 성장인자 표현 등 작용에 대하여 촉진효과를 갖는 것 외에, 체내의 AGE 함량을 감소시킬 수 있다. 또한 그 외에, 정상 또는 산소결핍을 물문하고, 곽산 석곡 추출물은 RPE 세포내의 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth faction;VEGF), 성정인자를 변환(transforming growth faction-beta;TEG-β) 및 섬유 모세포 성장소(basic fibroblast growth faction;bFGF)의 유전자 표현에 대하여 모두 현저한 억제작용을 갖는다. 따라서, 곽산 석곡 추출물을 포함하는 어떤 조성물, 예를 들면 곽산 석곡 추출물 및 그 생리수용성 캐리어의 생리활성을 갖는 조성물은 모두 본 발명에 의해 제출된 각 곽산 석곡 추출물을 갖고 있으므로 상기의 효과를 갖는다. 그 중, 상기 캐리어는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 휴대하여 이동할 수 있는 어떤 물질이고, 예를 들면 타블렛(내부에는 상기 추출물 또는 상기 추출물의 이성체가 봉입되어 있다)이어도 좋다.As can be seen from the above, the Applicant has made intensive tests and studies, and finally, Kwaksan Seokguk extract can reliably regulate and control the action of retinal pigment epithelial cells and indirectly affect the related mechanism. Gives. The Kwaksan Seokgok Extract submitted by the present invention may reduce the AGE content in the body in addition to promoting effects on phagocytosis, nitric oxide production, liver growth factor expression, etc. of RPE cells. In addition, in addition to normal or oxygen deficiency, Kwaksan Seokgok Extract can transform vascular endothelial growth faction (VEGF), transforming growth factor (TEG-β) and fibroblasts in RPE cells. Both gene expression of basic fibroblast growth faction (bFGF) has a significant inhibitory effect. Therefore, any composition comprising the Kwaksan Seokgok Extract, for example, the Kwaksan Seokgok Extract and a composition having the physiological activity of its biosoluble carrier, have all the Kwaksan Seokgok Extracts submitted by the present invention and thus have the above effects. Among these, the carrier may be any substance which can carry and move the extract or the isomer of the extract. For example, the carrier may be a tablet (in which the extract or the isomer of the extract is enclosed).

또한, 망막흑색소 상피세포, 체내의 산화질소 생성작용, 간 성장인자, 체내의 AGE 함량, RPE 세포 내의 혈관내피 성장인자(VEGF)와 섬유 모세포 생성소(bFGF)의 작용 및 변환 성장인자(TGF-β)의 유전자 표현은 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병과 관련된다(본 출원의 선행기술 내용을 참조하기 바란다).In addition, retinal pigment epithelial cells, nitric oxide production in the body, hepatic growth factor, AGE content in the body, vascular endothelial growth factor (VEGF) and fibroblast production (bFGF) in RPE cells and transforming growth factor (TGF) gene expression of -β) is associated with diseases such as cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease (see prior art contents of this application).

그리고, 본 발명의 곽산 석곡 추출물은 또한 망막흑색소 상피세포량, 산화질소 생성작용, 간 성장인자 작용, 체내 AGE량, RPE 세포 내의 혈관내피 생산인자(VEGF)와 유모세포생장소(bFGF)의 작용 및 변환 성장인자(TGF-β)의 유전자 표현과 관련하므로, 본 발명의 곽산 석곡 추출물도, 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부추상신경 변성, 신장계사구체 변성과 신장계사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식성세포 변성, 노화성황반 변셩, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르트막 변성, 당뇨병 및 그 합병증 및 패혈성 쇼크 등의 병에 대하여 영향을 갖는다. 또한, 본 발명의 실제 응용 범위도 매우 넓고, 망막상피세포와 체내 AGE함량의 작용에 한정되지 않는다. 그리고 본 발명은 관련 추출물 응용의 최초의 예이므로, 본 발명이 현저한 신규성 및 진보성을 가지고 있는 것은 말할 필요도 없다.In addition, the Kwaksan Seokgok extract of the present invention is also characterized in that the retinal black pigment epithelial cell volume, nitric oxide production, liver growth factor action, AGE amount in the body, vascular endothelial production factor (VEGF) and hair cell growth factor (bFGF) in RPE cells As related to the gene expression of action and transformation growth factor (TGF-β), Kwaksan Seokgok extract of the present invention, arteriosclerosis, vascular injury, stroke, retinal nerve cell degeneration, RPE cell degeneration, adolescent cell degeneration, ganglion cell Degeneration, mucosal cell degeneration, retinal glial degeneration, cerebrospinal neural degeneration, nephrocytic degeneration and renal glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative cell degeneration, age-related macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinitis It has an effect on diseases such as retrograde degeneration, diabetes mellitus and its complications, and septic shock. In addition, the practical application range of the present invention is also very wide, and is not limited to the action of retinal epithelial cells and AGE content in the body. And since the invention is the first example of a related extract application, it goes without saying that the invention has significant novelty and inventiveness.

상기한 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이므로, 당연히 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않고, 첨부 청구범위을 벗어나지 않는 한 당업자에 의한 단순한 설계변경, 부가, 수식, 치환은 모두 본 발명의 기술적 범위에 속한다.Since the above-described embodiments are intended to explain the present invention in more detail, of course, the present invention is not limited to these embodiments, and all simple design changes, additions, modifications, and substitutions made by those skilled in the art are provided without departing from the scope of the appended claims. Belongs to the technical scope of the.

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(40) Hayashi, Y. and Makino, M.Fluorometric measurement of glycosylated albumin in human serum. Clinica. Chimica. Acta, 149: 13-19, 1985.(40) Hayashi, Y. and Makino, M. Fluorometric measurement of glycosylated albumin in human serum. Clinica. Chimica. Acta, 149: 13-19, 1985.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물의 분리흐름도.1 is a flow chart of separation of Kwakseok Seokgok extract in accordance with a preferred embodiment of the present invention.

도 2는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 추출물인 곽산 석곡 메탄올 추출물의 RPE 세포 탐식작용을 예시하는 그래프.Figure 2 is a graph illustrating the RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok methanol extract which is an extract according to a preferred embodiment of the present invention.

도 3은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPe/h, DCMPe/m, DCMPb의 RPE 세포 탐식작용을 예시한 그래프.Figure 3 is a graph illustrating the RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok extract DCMPe / h, DCMPe / m, DCMPb according to a preferred embodiment of the present invention.

도 4는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 DCMPbL6,7D2H2의 RPE세포 탐식작용을 예시한 그래프.Figure 4 is a graph illustrating the RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment of the present invention.

도 5는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 1 H-NMR 스펙트럼 도표.Figure 5 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract using DCMPbL6,7D2H2 in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as the solvent, 1 H-NMR spectrum chart obtained it was analyzed using a 600-MHz in accordance with the present invention.

도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 13 C-NMR 스펙트럼 도표.6 is a 13 C-NMR spectrum chart by using the gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as the solvent, obtained it was analyzed using a 600-MHz of the present invention.

도 7은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.7 is a DEPT spectrum chart obtained by using the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as a solvent, it was analyzed using a 600-MHz.

도 8은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 HMQC 스펙트럼 도표.HMQC spectrum Figure 8 is obtained by using the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as a solvent, it was analyzed using a 600-MHz.

도 9는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 600-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.9 is HMBC spectrum chart obtained by using the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as a solvent, it was analyzed using a 600-MHz.

도 10은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2를 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 1 H-1H COSY 스펙트럼 도표.Figure 10 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract using DCMPbL6,7D2H2 in dimethylsulfoxide -d 6, DMSO-d 6 as a solvent, 1 obtained it was analyzed using a 500-MHz 1 H H- COSY according to the spectrum of the present invention Figure .

도 11은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D2H2의 UV 분광도.11 is a UV spectrogram of the Kwaksan Seokgok extract DCMPbL6,7D2H2 according to a preferred embodiment of the present invention.

도 12는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3의 RPE 세포 탐식작용에 대한 영향을 나타내는 그래프.12 is a graph showing the effect on RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D3H3 according to a preferred embodiment of the present invention.

도 13은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 1 H-NMR 스펙트럼 도표.Figure 13 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D3H3 in dimethylsulfoxide -d 6, 1 H-NMR spectrum chart obtained using DMSO-d 6 as a solvent, it was analyzed using a 500-MHz in accordance with the present invention.

도 14는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 13 C-NMR 스펙트럼 도표.14 is a 13 C-NMR spectrum chart obtained by analyzing the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D3H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 15는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.15 is a DEPT spectrum chart obtained by analyzing the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D3H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 16은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 1 H-1H COSY 스펙트럼 도표.Figure 16 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D3H3 in dimethylsulfoxide according to -d 6, DMSO-d 6 by using as a solvent one obtained it was analyzed using a 500-MHz 1 H H- COSY spectrum of the present invention Figure .

도 17은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D3H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.17 is a chart obtained by analyzing the HMBC spectrum gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D3H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 18은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3의 RPE 세포 탐식작용 대한 영향을 나타내는 그래프.18 is a graph showing the effect on RPE cell phagocytosis of Kwaksan Seokgok Extract DCMPbL6,7D4H3 according to a preferred embodiment of the present invention.

도 19는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 1 H-NMR 스펙트럼 도표.Figure 19 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D4H3 in dimethylsulfoxide -d 6, 1 H-NMR spectrum chart obtained using DMSO-d 6 as a solvent, it was analyzed using a 500-MHz in accordance with the present invention.

도 20은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 13 C-NMR 스펙트럼 도표.20 is a 13 C-NMR spectrum chart obtained by analyzing the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D4H3 according to a preferred embodiment in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz of the present invention.

도 21은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 DEPT 스펙트럼 도표.21 is a DEPT spectrum chart obtained by analyzing the extracts gwaksan seokgok DCMPbL6,7D4H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 22는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMQC 스펙트럼 도표.22 is a chart obtained by analyzing the HMQC spectrum gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D4H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 23은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 1 H-1H COSY 스펙트럼 도표.Figure 23 is a preferred embodiment gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D4H3 in dimethylsulfoxide according to -d 6, DMSO-d 6 by using as a solvent one obtained it was analyzed using a 500-MHz 1 H H- COSY spectrum of the present invention Figure .

도 24는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCMPbL6,7D4H3을 디메틸설폭시드-d6, DMSO-d6을 용제로서 이용하여, 500-MHz로 분석해서 얻은 HMBC 스펙트럼 도표.24 is a chart obtained by analyzing the HMBC spectrum gwaksan seokgok extract DCMPbL6,7D4H3 according to a preferred embodiment of the invention in dimethylsulfoxide -d 6, using the DMSO-d 6 as a solvent, 500-MHz.

도 25는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb가 RPE 세포의 산화질소 생성작용에 대한 영향을 나타내는 그래프.25 is a graph showing the effects of the Kwaksan Seokgok extract DCM, DCMPh, DCMPe, DCMPb on the nitric oxide production of RPE cells according to a preferred embodiment of the present invention.

도 26(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 RPE 세포를 처리하여 얻은 β-actin(A) 및 HGF(B)의 유전자 표현 전기영동도.Figure 26 (A)-(B) is a gene expression electrophoresis of β-actin (A) and HGF (B) obtained by treatment of Guksan Seokgok methanol RPE cells according to a preferred embodiment of the present invention.

도 27은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물의 RPE 세포의 HGF에 대한 mRNA 표현의 영향 결과 전기영동도.27 is an electrophoresis result of the mRNA expression of HPE of RPE cells of the Kwaksan Seokgok extract according to a preferred embodiment of the present invention.

도 28(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 정상상황하의 RPE 세포에 대한 VEGF(A) 및 TGF-β(B) 유전자 표현 작용 결과 전기영동도.28 (A)-(B) are electrophoresis results of VEGF (A) and TGF-β (B) gene expression on RPE cells under normal conditions of Kwaksan Seokgok Extract DeCaM according to a preferred embodiment of the present invention.

도 29(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 정상상황하의 RPE 세포에 대한 β-actin(A) 및 bFGF(β) 유전자 표현 작용 결과전기영동도.29 (A)-(B) are electrophoresis results of β-actin (A) and bFGF (β) gene expression on RPE cells under normal conditions of Kwaksan Seokgok Extract DeCaM according to a preferred embodiment of the present invention.

도 30(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 산소 결핍 상황하의 RPE 세포에 대한 β-actin(A) 및 bFGF(B) 유전자 표현 작용결과 전기영동도.Figure 30 (A)-(B) is an electrophoretic result of β-actin (A) and bFGF (B) gene expression action on RPE cells under oxygen deprivation conditions of Kwaksan Seokgok Extract DeCaM according to a preferred embodiment of the present invention.

도 31(A)-(B)는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 추출물 DeCaM의 산소 결핍상황하의 RPE 세포에 대한 VEGF(A) 및 TGF-β(B) 유전자 표현 작용 결과 전기영동도.Figure 31 (A)-(B) is an electrophoresis result of the expression of VEGF (A) and TGF-β (B) genes on RPE cells under oxygen deprivation of Kwaksan Seokgok Extract DeCaM according to a preferred embodiment of the present invention.

도 32는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질 분해 활성 영향 전기영동도.32 is an electrophoretic effect of proteolytic activity on RPE cells of Kwaksan Seokgok methanol extract and liver growth factor according to a preferred embodiment of the present invention.

도 33은 도 32에 기초하여 도시한 곽산 석곡 메탄올 추출물 및 간 성장인자의 RPE 세포에 대한 단백질 분해 활성 영향을 나타내는 그래프.FIG. 33 is a graph showing the effect of proteolytic activity on RPE cells of Kwaksan Seokgok methanol extract and liver growth factor shown on the basis of FIG.

도 34는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 곽산 석곡 메탄올 추출물의 당뇨병을 가진 쥐의 체내 AGE 함량에 대한 영향을 나타내는 그래프.34 is a graph showing the effect on the body AGE content of rats with diabetes of the Kwaksan Seokgok methanol extract according to a preferred embodiment of the present invention.

Claims (19)

수용성 유기용제 또는 상기 수용성 유기 용제와 물의 혼합물에 의해, 생리 활성을 갖는 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 식물을 추출한 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물.A dendrobii Caulis extract from which a Dendrobii Caulis plant having physiological activity is extracted by a water-soluble organic solvent or a mixture of the water-soluble organic solvent and water. 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 수용성 유기 용제는 탄소 함유 갯수가 1 내지 8로 개재되는 알콜류, 알킬류 또는 에스테르류이고,The water-soluble organic solvents are alcohols, alkyls or esters containing 1 to 8 carbon atoms, 상기 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이며,The alcohols are methanol or ethanol, 상기 추출물은 망막흑색소 상피세포(RPE;retinal pigment epithelium cell)를 촉진하는 작용을 가지며, 그리고The extract has an action of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE), and 상기 추출물은 생물체 중의 AGE(advanced glycation end product) 함유량을 감소하는 작용을 갖는 석곡 추출물.The extract is a grain extract having an action of reducing the content of the advanced glycation end product (AGE) in the organism. 제1항 또는 제2항에 있어서,The method according to claim 1 or 2, 생리 수용성을 갖는 캐리어(physilogically acceptable carrier) 및 상기 어느 한 항에 기재된 추출물 또는 상기 추출물의 이성체를 포함하여 이루어지는 석곡 추출물.A grain extract comprising a physilogically acceptable carrier and an extract according to any one of the preceding claims or an isomer of the extract. 제3항에 있어서,The method of claim 3, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이고,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity, 상기 생리 수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이며,The carrier having physiological water solubility is a carrier having pharmacological activity, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 심혈관질환에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against cardiovascular diseases, 상기 심혈관질환은 동맥경화, 혈관손상 및 중풍으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며,The cardiovascular disease is selected from the group consisting of atherosclerosis, vascular damage and stroke. 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신경병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against neuropathy, 상기 신경병은 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 세포신경아교세포 변성 및 뇌부추상신경세포 변성으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며, The neuropathy is selected from the group consisting of retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, cytoglial degeneration and cerebrospinal nerve cell degeneration, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 신장병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against kidney disease, 상기 신장병은 신장사구체 변질 및 신장사구체기저막 변질로 이루어지는 군에서 선택된 것이고, 다만, 이들 군에 한정되지 않으며,The kidney disease is selected from the group consisting of renal glomerular degeneration and renal glomerular basement membrane degeneration, but not limited to these groups, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 상기 눈병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against the eye disease, 상기 눈병은 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 노인성황반 변성 및 브르크막 변성으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며, 다만, 이들 군에 한정되지 않으며,The ocular disease is selected from the group consisting of uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, photoreceptor degeneration, retinopathy, senile macular degeneration and Brk membrane degeneration, but is not limited thereto. 상기 생리활성을 갖는 조성물은 췌장병에 대해 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity against pancreatic disease, 상기 췌장병은 당뇨병 및 그 합병증으로 이루어지는 군에서 선택된 것이며, 다만, 이들에 한정되지 않으며, 및The pancreatic disease is selected from the group consisting of diabetes mellitus and its complications, but is not limited thereto, and 상기 생리활성을 갖는 조성물은 자가면역병(autoimmune disease) 또는 패혈성 쇼크에 대해 약리활성을 갖는 조성물인 석곡 추출물.The composition having a physiological activity is a composition that has pharmacological activity against autoimmune disease or septic shock. 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 추출물을 제조하는 방법으로서, 적어도 물, 수용성 유기용제 또는 물과 상기 수용성 유기용제와의 혼합물에 의해 식물을 추출하는 단계를 구비하여 이루어진 식물추출물의 제조방법.A method of preparing a extract of Kwaksan Seokgok (Dendrobii Caulis), comprising: extracting a plant by at least water, a water-soluble organic solvent or a mixture of water and the water-soluble organic solvent. 식물 추출물을 제조하는 방법으로서,As a method of preparing a plant extract, (a) 제1 알콜류로 상기 식물을 추출하여 제1 알콜류 추출물을 발생시키는 단계와;(a) extracting the plant with a first alcohol to generate a first alcohol extract; (b) 물과 알킬류로 동시에 상기 제1 알콜류 추출물을 추출하여 제1 수층 추출물 및 알킬류 추출물을 발생시키는 단계와;(b) extracting the first alcohol extract simultaneously with water and alkyls to generate a first aqueous layer extract and an alkyl extract; (c) 에스테르류로 상기 수층을 추출하여 에스테르 추출물 및 제2 수층 추출물을 발생시키는 단계와;(c) extracting the aqueous layer with esters to generate an ester extract and a second aqueous extract; (d) 제2 알콜류로 상기 제2 수층 추출물을 추출하여 제2 알콜류 추출물 및 제3 수층 추출물을 발생시키는 단계를 구비하여 이루어진 식물 추출물의 제조 방법.(d) extracting the second aquatic extract with a second alcohol to produce a second alcohol extract and a third aquatic extract. 제6항에 있어서,The method of claim 6, 상기 식물은 난초과 식물이며,The plant is an orchidaceae, 상기 난초과 식물은 덴드로븀과(Dendrobium)에 속하며,The orchid family belongs to Dendrobium, 상기 단계 a)는 다시 a1) 상기 식물의 건조물을 제공하는 단계와, a2) 분쇄기로 상기 건조물을 분쇄하는 단계와, a3) 상기 제1 알콜류로 분쇄된 상기 물질을 추출하여 상기 제1 알콜류 추출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어지며,The step a) is again a1) providing a dry matter of the plant, a2) pulverizing the dry matter with a pulverizer, a3) extracting the material pulverized with the first alcohol to extract the first alcohol extract And obtaining the step 상기 제1 알콜류의 탄소 함유갯수는 1 내지 8이고,Carbon number of the said 1st alcohol is 1-8, 상기 제1 알콜류는 메탄올 또는 에탄올이며,The first alcohols are methanol or ethanol, 상기 제2 알콜류는 탄소 함유갯수 1 내지 8의 알콜류이고,The second alcohols are alcohols having 1 to 8 carbon atoms, 상기 제2 알콜류는 부탄올 또는 n부탄올이며,The second alcohol is butanol or n butanol, 상기 단계 b)는 다시 b1) 감압, 농축, 흡기 등으로 상기 제1 알콜류 추출물을 건조하는 단계를 포함하며,Step b) again comprises the step of drying the first alcoholic extract b1) under reduced pressure, concentration, intake, etc., 상기 알킬류 추출물은 n-핵산 추출물이며,The alkyl extract is n-nucleic acid extract, 상기 단계 c)는 다시 c1) 상기 에스테르류 추출물을 건조하는 단계와, c2) 핵산과 메탄올로 건조한 후의 상기 에스테르류 추출물을 추출하여 핵산 추출물과 메탄올 추출물을 발생시키는 단계를 포함하고,The step c) further comprises c1) drying the ester extract, and c2) extracting the ester extract after drying with nucleic acid and methanol to generate a nucleic acid extract and a methanol extract, 상기 핵산 추출물은 감압, 농축, 흡기 등의 단계를 통해 건조되며, 및The nucleic acid extract is dried through steps such as reduced pressure, concentration, intake, and 상기 에스테르류는 에틸아세테이트인 식물 추출물의 제조 방법.The ester is a method for producing a plant extract is ethyl acetate. 식물 추출물의 제조 방법은 (e) 색층분쇄법으로 상기 제2 알콜류 추출물을 색층분석하여 명칭을 DCMPbL6,7으로 칭한 제1 용출물을 얻는 단계와,The method for preparing a plant extract includes the steps of (e) chromatographic analysis of the second alcoholic extract using a chromatographic method to obtain a first eluate named DCMPbL6,7; (f) 제1 용출제로 상기 DCMPbL6,7을 용출하여 제2 용출물을 얻는 단계를 구비하여 이루어지는 식물 추출물의 제조 방법.(f) eluting the DCMPbL6, 7 as a first eluent to obtain a second eluate. 제8항에 있어서, The method of claim 8, 상기 식물 추출물의 제조방법에 있어서,In the production method of the plant extract, 단계 (e)는 제2 용출제에 의해 실시되고,Step (e) is carried out with a second eluent, 상기 제2 용출제는 체적비가 1:1인 메탄올과 물의 혼합물에 의해 생성되고,The second eluent is produced by a mixture of methanol and water with a volume ratio of 1: 1, 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 물을 체적비 20:80으로 조성한 혼합물이며, 또한, 상기 제2 용출제는 DCMPbL6,7D2라 칭하고,The first eluting agent is a mixture of isopropanol and water in a volume ratio of 20:80, and the second eluting agent is called DCMPbL6, 7D2, 상기 DCMPbL6,7D2는 다시 메탄올/물/아세트산을 체적비 30:65:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제3 용출물 DCMPbL6,7D2H2를 발생시키고,The DCMPbL6, 7D2 was further chromatographed with a mixture of methanol / water / acetic acid at a volume ratio of 30: 65: 1 to generate a third eluate DCMPbL6,7D2H2. 상기 제1 용출물은 이소프로판올과 물을 체적비 30:70으로 조성한 혼합물이며, 그리고 상기 제2 혼합물은 DCMPbL6,7D3라 칭하고,The first eluate is a mixture of isopropanol and water in a volume ratio of 30:70, and the second mixture is called DCMPbL6, 7D3, 상기 DCMPbL6,7D3은 하나의 메탄올/물/아세트산을 체적비 40:60:1로 하여 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제4 용출물 DCPPbL6,7D3H3을 발생시키며,The DCMPbL6,7D3 generates a fourth eluate DCPPbL6,7D3H3 by chromatographic analysis with a mixture composed of one methanol / water / acetic acid at a volume ratio of 40: 60: 1. 상기 제1 용출제는 이소프로판올과 이소프로판올과 물을 체적비 40:60으로 조성한 혼합물이며, 그리고, 상기 제2 용출물의 명칭은 DCMPbL6,7D4라 칭하며,The first eluent is a mixture of isopropanol, isopropanol, and water in a volume ratio of 40:60, and the name of the second eluate is called DCMPbL6, 7D4, 상기 DCMPbL6,7D4는 다시 1개의 메탄올/물/아세트산을 체적비 45:55:1로 조성한 혼합물로 색층분석을 행함으로써 제5 용출물 DCMPbL6,7D4H3을 발생시키는 식물 추출물의 제조방법.The DCMPbL6, 7D4 is a method of producing a plant extract to generate the fifth eluate DCMPbL6,7D4H3 by performing chromatographic analysis with a mixture of one methanol / water / acetic acid in a volume ratio of 45: 55: 1. 제6항에 의해 발생된 각 추출물 중 어느 하나의 곽산 석곡(Dendrobii Caulis) 식물 추출물로서,As a extract of the endrobii Caulis plant of any one of the extracts generated by claim 6, 상기 식물 추출물은 망막흑색소 상피세포(retinal pigment epithelium cell;RPE)를 촉진하는 작용을 가지며, 및 The plant extract has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE), and 상기 추출물은 생물체 중의 고도당화 종산물(AGE: Advanced Glycation End product) 함유량을 감소시키는 곽산 석곡 식물 추출물.The extract is a Kwaksan Seokgok plant extract that reduces the content of advanced glycation end product (AGE: Advanced Glycation End product) in the organism. 제10항에 있어서,The method of claim 10, 생리 수용성의 캐리어 및 제10항에 기재된 식물 추출물은 상기 식물 추출물의 이성체를 포함하고,The carrier which is physiologically water-soluble and the plant extract of Claim 10 contains the isomer of the said plant extract, 상기 생리활성을 갖는 조성물은 약리활성을 갖는 조성물이며,The composition having physiological activity is a composition having pharmacological activity, 상기 생리수용성을 갖는 캐리어는 약리활성을 갖는 캐리어이며,The carrier having physiological water solubility is a carrier having pharmacological activity, 상기 조성물은 하기의 심혈관질환, 신경병, 신장병, 간장병, 눈병 및 자가면역병 등의 병으로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나의, 약리반응을 갖는 의약 조성물이며,The composition is any one selected from the group consisting of the following cardiovascular disease, neuropathy, kidney disease, liver disease, eye disease and autoimmune disease, a pharmaceutical composition having a pharmacological reaction, 상기 병은 동맥경화, 혈관손상, 중풍, 망막신경세포 변성, RPE 세포 변성, 무축돌세포 변성, 시신경절세포 변성, 점질세포 변성, 망막신경아교세포 변성, 뇌부 추상신경세포 변성, 신장사구체 변성, 신장사구체기저막 변성, 포도막염, 증식당뇨망막병증, 증식유리체망막병증, 노인성황반 변성, 광수용체의 퇴화, 망막염증, 브르크막 변성, 당뇨병 및 그 합병증 및 패혈성 쇼크로 이루어진 그룹에서 선택된 병인 식물 추출물.The disease includes atherosclerosis, vascular injury, stroke, retinal neuronal cell degeneration, RPE cell degeneration, atrophic cell degeneration, optic ganglion cell degeneration, mucosal cell degeneration, retinal glial cell degeneration, brain abstract neural cell degeneration, renal glomerular degeneration, kidney Pathogenic plant extract selected from the group consisting of glomerular basement membrane degeneration, uveitis, proliferative diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy, age-related macular degeneration, degeneration of photoreceptors, retinopathy, Brk membrane degeneration, diabetes mellitus and its complications and septic shock. 제8항에서 얻어진 제2 용출물로서,As the second eluate obtained in claim 8, 상기 조성물은 망막흑색소 상피세포(retinal pigment epithelium cell;RPE)를 촉진하는 작용을 가지며,The composition has a function of promoting retinal pigment epithelium cells (RPE), 상기 조성물은 생물체 속의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.The composition has a function of reducing the AGE content in the organism. 제12항에 있어서,The method of claim 12, 생리활성을 갖는 조성물로서, 생리수용성을 갖는 캐리어 및 상기 조성물 또는 상기 조성물의 이성체를 구비한 생리활성을 갖는 조성물.A composition having a physiological activity, the composition having a physiological activity comprising a carrier having physiologically water solubility and an isomer of the composition or the composition. 제9항으로 얻어진 제3 용출물인 조성물로서,As a composition which is a 3rd eluate obtained by Claim 9, 상기 화합물은 망막흑색소 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및The compound has an action of promoting retinal melanocyte epithelial cells, and 상기 화합물은 생물체 중의 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.The compound has a function of reducing the AGE content in the organism. 제14항에 있어서,The method of claim 14, 생리활성을 갖는 조성물로서, 1개의 생리수용성을 갖는 캐리어와, 제14항 기재의 화합물 또는 상기 화합물의 이성체를 구비한 조성물.A composition having a physiological activity, comprising a carrier having one physiologically water soluble property and a compound according to claim 14 or an isomer of the compound. 제9항에 의해 얻어진 제4 용출물인 조성물로서,As a composition which is a 4th eluate obtained by Claim 9, 상기 조성물은 망막흑색 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및The composition has an action of promoting retinal black epithelial cells, and 상기 조성물은 생물체 중 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.The composition has a function of reducing the AGE content in the organism. 생리활성을 갖는 조성물로서, 생리수용성을 갖는 캐리어 및 제16항 기재의 조성물 또는 상기 조성물의 이성체를 함유하여 이루어지는 조성물.A composition having a physiological activity, the composition comprising a carrier having physiologically water solubility and a composition according to claim 16 or an isomer of the composition. 제9항에 의해 얻어진 제5 용출물인 조성물로서,As a composition which is the 5th eluate obtained by Claim 9, 상기 조성물은 망막흑색 상피세포를 촉진하는 작용을 가지며, 및The composition has an action of promoting retinal black epithelial cells, and 상기 조성물은 생물체 중 AGE 함유량을 감소시키는 작용을 갖는 조성물.The composition has a function of reducing the AGE content in the organism. 제18항에 있어서,The method of claim 18, 생리활성을 갖는 조성물로서, 1개의 생리수용성을 갖는 캐리어와, 제18항 기재의 조성분 또는 상기 조성분의 이성체를 포함하여 이루어지는 조성물.A composition having a physiological activity, comprising a carrier having one physiologically water soluble composition and a composition according to claim 18 or an isomer of the composition.
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