KR20050021366A - 표적 핵산내 돌연변이 도입 방법 - Google Patents

Abstract

역방향 반복 서열를 갖는 DNA의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 상동성이고 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이를 포함하는, 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 제조하는 단계; 및 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산의 염기 서열내로 돌연변이를 도입하는 방법; 및 상기 방법을 위한 키트.

Description

표적 핵산내 돌연변이 도입 방법{METHOD OF TRANSFERRING MUTATION INTO TARGET NUCLEIC ACID}

돌연변이의 유전자내로의 도입 및 유전자내 돌연변의 수복에 유용한 표적 핵산내로 돌연변이를 도입하는 방법에 관한 것이다.

바이러스 벡터 등을 사용하여 현재 유전자 요법에 사용되는 방법에 따라 유전자를 세포중 유전자의 결실 또는 돌연변이에 기인하여 기능이 비정상적인 세포내로 세포내로 도입한다. 이로써 세포의 정상적인 기능이 회복되고, 세포는 그의 본래 역할을 수행할 수 있다. 이는 유전자 치환 요법으로 명명될 수 있다.

바이러스 벡터를 사용하는 유전자 도입 방법은 하기와 같은 문제점을 안고 있다. 뮤턴트 유전자는 실제로 염색체상에 존재한다. 뮤턴트 유전자로부터 유래된 뮤턴트 단백질은 정상 유전자로부터 유래된 정상 단백질의 구조와 유사한 구조를 갖고, 뮤턴트 단백질은 정상 단백질의 기능을 방해할 수 있다.

최근, 바이러스-매개 DNA 도입과는 다른 세포내 관심의 대상이 되는 유전자의 뉴클레오티드를 변환시키는 유전자 표적 방법에 주목하고 있다. Eric B. Kmiec(Thomas Jefferson University (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.2071-2076 (1996))에 의해 개발된 키메라 형성 방법은 유전자 표적 방법의 특정 일례이다. 이 방법은 변화시키고자 하는 뉴클레오티드를 포함하는 부분이 DNA를 구성하고, RNA 스트레치는 위치 결정을 위해 양 말단에 위치하는 키메라성 올리고뉴클레오티드를 사용한다. RNA-DNA 결합이 DNA-DNA 결합보다 더욱 강하다. 따라서, 키메라성 올리고뉴클레오티드를 세포내로 도입하는 경우, 양 말단의 RNA 뉴클레오티드 서열은 상응하는 뉴클레오티드 서열을 찾음으로써 이중쇄를 형성하게 된다. 이어서 불일치하는 수복의 결과로서 목적 부위에 돌연변이가 도입된다. 키메라성 올리고뉴클레오티드는 복잡한 환상 구조를 갖는다. 특히, 구조를 유지하기 위하여 추가로 8개의 티민 잔지를 사용하는 것으로 필요로 하고, 이는 표적 DNA의 결합 능력에 상당 수준으로 부작용을 일으킨다.

O. Igoucheva 등은 싱글 스트랜드 올리고뉴클레오티드 (또는 이하 ss 올리고로도 언급함) 형성 방법(Gene Therapy, Vol.8, p.391-399 (2001))을 개발하였다. 이 방법에 따라 수십개의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 돌연변이화되는 표적 핵산내 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 중앙에 위치하고, 세포내 뉴클레아제로 쉽게 분해되지 않는 수개의 메틸화된 우라실 잔기는 양 말단에 결합한다.

상기 언급한 두개의 돌연변이화 방법의 수복 효율은 여전히 낮다. 둘 중 더욱 우수한 수복 효율을 초래하는 싱글 스트랜드 올리고뉴클레오티드 (ss 올리고) 형성 방법도 여전히 명확한 결점을 갖고 있다. 구체적으로 이 방법을 사용하여 표적 핵산에 결합한 후 불일치한 수복과정에서 더블-스트랜드 DNA의 센스 및 안티센스 스트랜드 양쪽의 뮤턴트 뉴클레오티드를 동시에 수복시킬 수 없다. 뮤턴트 뉴클레오티드중 단 하나가 수복되고, 상보적인 스트랜드상의 남은 뮤턴트 뉴클레오티드는 세포의 불일치 수복 메카니즘에 의해 추가로 수복되어야 하다.

Kmiec et al.등에 따라 환상 구조를 유지하기 위하여 표적 DNA와 관련이 없는 서열이 키메라성 올리고뉴클레오티드 (키메라 올리고)에 포함된다. 관련이 없는 서열이 10% 이상의 올리고 서열을 차지하고 있다. 이는 키메라성 올리고의 표적 DNA를 표적화하는 활성을 감소시킨다.

또다른 중요한 포인트는 키메라 올리고 또는 ss 올리고를 사용하는 수복 메카니즘 및 사용되는 올리고뉴클레오티드의 구조와 관련하여 거리를 두고 위치하는 2개 이상의 뉴클레오티드를 동시에 수복시킬 수 없다는 것이다. 거리를 두고 위치하는 2개 이상의 뉴클레오티드를 수복시키고자 하거나, 돌연변이를 거리를 두고 위치하는 2개 이상의 부위에 도입하고자 하는 경우, 수회에 걸쳐 올리고뉴클레오티드 도입 후 클로닝을 수행하여야 한다. 상기 공정은 자연적으로 많은 시간과 노동력을 필요로 한다. 또한, 세포내로 DNA를 도입하는 현 기술은 세포를 상당 부분 손상시킨다. 따라서, 원하는 기능을 유지하는 생존가능한 세포를 수득하는 것은 어렵다. 염색체상의 뮤턴트 뉴클레오티드를 세포내에서 수복시키고자 하는 경우 수복용 DNA를 세포질내로 도입한다. 수복용 DNA는 농도 구배에 따라 자유 확산의 결과로서 핵으로 이동하게 된다. 이 경우 다수의 수복 DNA 분자를 세포내로 도입하여야 한다. 그러나, 최종적으로는 단지 몇몇 분자만이 핵내로 들어가게 되고, 이는 불만족스러운 돌연변이 수복 효율을 초래하게 된다.

유전자 요법 개발과 함께, 복수개의 뉴클레오티드를 동시에 수복시킬 수 있고 수복용 DNA를 핵내로 능동 수송할 수 있는 고도로 효과적인 방법이 복잡한 메카니즘에 기초한 상기 언급된 덜 효과적인 수복 방법에 대한 대체 방법으로서 요구되어 왔다.

발명의 요약

상기 언급한 목적을 달성하기 위하여 집중적으로 연구한 결과 본 발명자들은 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 사용하여 표적 핵산내 뉴클레오티드를 효율적으로 돌연변이화시킬 수 있음을 발견하게 되었다. 이로써 본 발명은 완성되었다.

본 발명의 제 1면은

(1) 역방향 반복 서열를 갖는 DNA의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 상동성이고 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이를 포함하는, 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 제조하고;

(2) 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열내로 돌연변이를 도입하는 방법에 관한 것이다.

제 1면에 따라, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA는 전사인자에 대한 결합 모티프 서열과 같은 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열을 가질 수 있다. DNA는 적절하게 수식된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.

제 1면에 따라, 표적 핵산은 세포질내 위치하는 핵산 또는 핵내 위치하는 핵산일 수 있다. 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 더블-스트랜드 DNA 또는 싱글-스트랜드 DNA일 수 있다.

제 1면의 방법에 따라, 복수개의 돌연변이는 표적 핵산내로 동시에 도입될 수 있다. 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이는 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입으로 예시된다.

본 발명의 제 2면은 역방향 반복 서열를 갖는 DNA의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 상동성이고 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이를 포함하는, 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 포함하는, 제 1면의 방법에 의해 표적 핵산내로 돌연변이를 도입하기 위한 키트에 관한 것이다.

제 2면의 키트에 포함되는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA는 전사인자에 대한 결합 모티프 서열 또는 적절하게 수식된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 더블-스트랜드 DNA 또는 싱글-스트랜드 DNA일 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 따라 제조된 각각 역방향 반복 서열을 갖는 플라스미드의 도식이다.

본 발명에 따라 "표적 핵산"과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 돌연변이 도입이 바람직한 어느 핵산이든 포함될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 세포내 DNA내로 돌연변이를 도입시키기 위하여 사용될 수 있다. 세포질내 위치하는 DNA(에피좀 DNA, 플라스미드, 미토콘드리아 DNA 등) 또는 핵내 위치하는 DNA(염색체 DNA)가 표적 핵산으로서 작용한다.

본 발명에 따라 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 염기 치환, 결실 또는 삽입과 같이 돌연변이를 도입할 수 있다. 이러한 경우 상기 돌연변이를 갖는 뉴클레오티드 서열은 사용하고자 하는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA내 포함될 수 있다.

실제로, 본 발명에 따라 돌연변이를 도입하는 것은 정상적인 일반적인 뉴클레오티드내로 돌연변이를 도입하는 것으로만 제한하지 않고, 자연발생된 돌연변이를 갖는 뉴클레오티드 서열을 정상 서열로 회복시키는 일례도 포함시킨다.

본 발명에 따라 사용되는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA(이하 역방향 반복 서열로 언급함)는 표적 핵산과 상동성인 뉴클레오티드 서열을 갖고 표적 핵산 내로 도입되는 돌연변이를 포함하는 DNA이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "상동성"은 표적 핵산과 이중쇄를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열 또는 그에 상보적인 스트랜드를 언급하고, 뉴클레오티드 서열이 완전하게 일치하는 것을 의미하지는 않는다. 즉, 염기쌍을 통해 표적 핵산과 이중쇄를 형성하기에 충분한 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 제조하는 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 화학적 합성, 효소적 합성 (핵산 증폭 반응 등) 또는 생물학적 합성 (자가 복제를 할 수 있는 핵산(예: 플라스미드)을 사용하는 방법)을 사용할 수 있다. 역방향 반복 서열를 갖는 DNA는 표적 핵산의 센스 스트랜드 서열 및 안티센스 스트랜드 서열이 나란히(in tandem) 배열된 것이다. 임의 서열(스페이서)는 생성된 DNA가 표적 핵산내로 돌연변이를 도입하기 위하여 사용될 수 있는 이들 서열 사이에 삽입될 수 있다.

역방향 반복 서열을 갖는 더블-스트랜드 DNA를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 더블-스트랜드 DNA를 변성시켜 수득한 싱글 스트랜드 DNA 또한 사용할 수 있다. 싱글 스트랜드 DNA의 센스 스트랜드 부위 및 안티센스 스트랜드 부위는 서로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖기 때문에 이들 부위의 염기쌍 결과로서 DNA는 헤어핀 구조일 것으로 판단된다.

예를 들면, 역방향 반복 서열을 갖고 헤어핀 구조를 형성하는 DNA는 United States Patent Nos. 5,643,762, 5,714,323 및 6,043,028에 기술된 slDNA로 명명되는 싱글 스트랜드 DNA를 제조하는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 따라 표적 핵산내 2개 이상의 부위에 돌연변이를 동시에 도입할 수 있다. 가능한 한 역방향 반복 서열을 갖는 DNA는 이러한 목적을 위해서 사용되는 것이 바람직하다고 판단된다. 세포 사이클중 DNA 합성기(S기)동안 DNA 상동적 재조합 수복이 발생한다. 모 DNA로부터 딸(daughter) DNA를 복제하는 동안, 모 DNA의 나선은 풀리고 복제 포크가 형성된다. 이 때 포크 부위의 DNA의 센스 및 안티센스 스트랜드 모두에 동시에 결합할 수 있는 DNA의 표적 활성은 고도한 것이어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 표적 DNA의 센스 및 안티센스 스트랜드 서열을 갖는 싱글 스트랜드, 즉 표적 DNA의 센스 및 안티센스 스트랜드 모두에 결합할 수 있는 싱글 스트랜드 역방향 반복 서열 DNA를 제조하였다.

2개의 동일한 유전자 또는 그의 단편이 반대 방향으로 배열된 역방향 반복 서열 DNA를 포함하는 플라스미드가 본 제조 방법에서 먼저 작제된다. 실시예 2에 기술하는 플라스미드 작제 방법은 상기 방법을 예시한다. 플라스미드는 플라스미드로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포를 배양하여 다량으로 수득될 수 있다. 역방향 반복 서열 DNA는 플라미드에서 역방향 반복 서열 DNA 인서트를 상기 인서트의 양 말단에서 제한 효소에 대한 부위를 사용하는 벡터로부터 절단하여 수득할 수 있다. 다르게는, 역방향 반복 서열 DNA는 주형으로서 플라스미드를 사용하여 PCR에 의해 증폭될 수 있다.

본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 일반적으로 플라스미드 작제를 위해 역방향 반복 서열 DNA내로 삽입되는 유전자 또는 그의 단편의 길이는 500 bp 내지 1500 bp인 것이 바람직하다. 길이가 500 bp 미만인 경우, 2개의 동일한 DNA 단편을 벡터 플라스미드내 반대 방향으로 삽입하는 것이 어려울 수 있다. 이러한 경우, 관심의 대상이 되는 DNA를 상이한 방법(예: 화학적 또는 효소적 방법)을 사용하여 합성할 수 있다.

하기 역방향 반복 서열 DNA를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. DNA는 돌연변이가 도입되는 표적 핵산상의 상류 부위 및 하류 부위에 위치하는 10개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게 100개 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 결과 상동적 재조합이 용이하게 발생한다.

본 발명에 따른 역방향 반복 서열 DNA를 사용하여 돌연변이가 표적 핵산내로 도입되는 경우(예: 유전자내 뮤턴트 뉴클레오티드를 보정하기 위하여) 뮤턴트 뉴클레오티드는 하기와 같이 수복될 수 있다. 뮤턴트 뉴클레오티드에 상보적인 부위에 정상적인 뉴클레오티드를 포함하는 야생형 유전자의 서열을 갖는 역방향 반복 서열 DNA를 제조한다. 이어서 예로서 인산칼슘 방법, 일렉트로포레이션 또는 지질-매개 혈질감염 방법과 같은 공지된 DNA 도입 방법을 사용하여 세포내로 도입한다.

한편, 돌연변이를 야생형 유전자내로 도입하고자 하는 경우, 돌연변이는 하기와 같이 표적 유전자내로 도입할 수 있다. 유전자내로 도입되는 뉴클레오티드(뉴클레오티드 서열)을 포함하는 역방향 반복 서열 DNA를 제조한 후, 상기 언급한 DNA 도입 방법을 사용하여 세포내로 도입한다.

뉴클레아제에 의한 DNA의 분해를 방지하기 위하여 본 발명에 따른 역방향 반복 서열을 갖는 DNA의 5' 말단 및 3'말단을 뉴클레아제의 작용으로부터 보호할 수 있다. 본 발명을 제한하고자 하는 것을 아니지만, 예를 들면, 말단의 보호는 DNA를 물리적 또는 화학적으로 폐환하여 수행될 수 있다. 다르게는, 수식된 뉴클레오티드, 예로서 수식된 데옥시뉴클레오티드, 수식된 리보뉴클레오티드 또는 LNA (WO 99/14226)가 DNA가 포함될 수 있다. 바람직하게, 메틸화된 리보뉴클레오티드, 황화 데옥시뉴클레오티드 등을 도입하여 말단을 보호한다. 뉴클레오티드는 하기 실시예에 기술하는 화학적 수단, 또는 효소적 수단에 의해 역방향 반복 서열을 갖는 DNA의 말단 부위내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 역방향 반복 서열을 갖는 DNA는 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열, 즉, 단백질에 결합할 수 있는 DNA 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 핵 수송 시그날을 갖는 단백질과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 자연발생된 것 또는 인공적인 것을 사용할 수 있다. 그의 예로서 전사인자, SV40 라지 T 항원, 히스톤, 뉴클레오플라스민 및 더블-스트랜드 RNA-결합 단백질 NF90을 포함한다. 또한, [Biochim. Biophys. Acta, Vol.1071, p.83-101 (1991)]에 기술된 핵 수송 시그날을 갖는 단백질을 사용할 수 있다.

핵 수송 시그날을 갖는 단백질이 특정 DNA 서열과 결합할 수 있는 경우, 단백질에 대한 결합 모티프는 본 발명에 따른 역방향 반복 서열을 갖는 DNA에 포함될 수 있다.

본 발명에 따라 사용할 수 있는 결합 모티프 서열과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 돌연변이가 도입되는 세포에서 발현되는 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 서열이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 핵 수송 시그날을 갖는 단백질이 DNA 결합 부위를 갖지 않거나 결합 부위를 갖는다고 알려져 있지 않더라도 핵 수송 시그날외에 적절한 DNA 결합 서열을 갖는 키메라성 단백질을 제조하여 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

핵 수송 시그날을 갖는 단백질이 돌연변이가 도입되는 세포에서 발현되는 경우, 단백질에 대한 결합 모티프를 갖는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA를 세포내로 도입한다. 이어서 도입된 DNA는 단백질에 결합하고 핵으로 수송되고 관심의 대상이 되는 돌연변이가 염색체 DNA내도 도입될 수 있다. 핵 수송 시그날을 갖는 단백질이 돌연변이가 도입되는 세포에서 발현되지 않거나, 인공적으로 제조된 것이 경우, 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 세포내로 도입하여 본 발명의 방법을 수행할 수 있다. 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 세포내로 도입하는 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 리포좀 등을 이용하는 방법, 또는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 이용하는 방법과 같이 공지된 방법을 사용할 수 있다. 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 단백질에 대한 결합 모티프 서열을 갖는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA와 함께 세포내로 동시에 도입할 수 있다.

본 발명에서 바람직하게 사용되는 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 서열은 전사인자에 결합할 수 있는 DNA 서열에 의해 예시된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 전사인자는 RNA 폴리머라제에 의해 DNA 또는 RNA로부터 전사 효율에 영향을 주는 인자를 언급한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전사인자에 대한 결합 모티프 서열의 예로서 제한하는 것은 아니지만, 전사인자에 결합할 수 있는 서열, 예로서 NF-κB, Sp1, AP1, NF-IL6(C/EBPβ), AP2, Oct-1, SRF 및 Ets-1이다. 예를 들면, 전사 인자에 대한 결합 모티프 서열을 하기 문헌에 기술되어 있다: Eur. J. Biochem, Vol. 268.p 1828-1836(2001); Biochem, Vol. 263.p 3372-3379(1998); Cell, Vol. 49, p741-752(1987); EMBO J. Vol.9, p.1987-1906(1990); Proc. Natl, Acad. Sci. USA. Vol 88. p 7948-7952(1991);Genes Dev. Vol 2, p1582-1599(1988); Nucleic Acids Res., Vol 20 p.3297-3303(1992); Genes.,Vol 4. p 1451-1453(1990).

본 발명에 따른 역방향 반복 서열을 갖는 DNA에 포함되는 결합 모티프의 카피 수와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 1개의 카피 또는 복수개의 서열 카피가 사용될 수 있다. 서열의 위치와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. DNA의 5'- 또는 3'- 말단에 위치할 수 있다. 예를 들면, 카피수 두개이상의 결합 모티프 서열이 5'- 및 3'-말단 양 말단 부위에 포함될 수 있다. 바람직하게, 결합 모티프 서열은 역방향 반복 서열 부위 중앙, 즉, 반복 서열 사이에 혼입된다.

핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프를 포함하는 역방향 반복 서열을 갖는 DNA는 핵내로 능동 수송될 수 있다. 따라서, 염색체내로의 돌연변이 도입 또는 돌연변이의 수복에 고도로 효과적이다.

본 발명의 방법을 사용하여 유전자를 넉 아웃(knock out)시킬 수 있다. 예를 들면, 이러한 경우 개시 코돈 "ATG"내 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 치환하여 단백질로 해독되는 것을 방해할 수 있다. 다르게는 표적 유전자내 적절한 위치에 종결 코돈을 도입하여 전장의 해독 산물이 생산되는 것을 저해할 수 있다. 추가로, 1개 또는 2개의 뉴클레오티드(들)이 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열로 삽입(또는 그로부터 결실)된 역방향 반복 서열 DNA를 제조하고 이를 사용하여 표적 유전자내 단백질-코딩 부위의 뉴클레오티드 서열에서 프레임 쉬프트를 유발시킴으로써 유전자의 넉아웃을 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자중 개시 코돈내 뉴클레오티드, 개시 코돈으로부터 2-30개의 뉴클레오티드내 뉴클레오티드, (효소 단백질인 경우) 효소의 활성 부위를 구성하는 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드, 또는 (형광-방출 단백질인 경우) 형광의 결정 요인인 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드를 돌연변이화시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 가장 중용한 특성은 거리를 두고 위치하는 2개 이상의 뉴클레오티드를 동시에 수복시키기 위하여 사용할 수 있다는 점이다. 복수개의 돌연변이는 역방향 반복 서열 DNA를 사용하는 단일 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복을 위한 것과 유사한 방식으로 수복될 수 있다. 그러한 DNA는 수백 내지 수천개의 뉴클레오티드로 구성되고 수백 내지 수천개의 뉴클레오티드의 부위중 표적 핵산내 복수개의 뮤턴트 뉴클레오티드를 수복시키기 위한 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 유전자내 약 200개 뉴클레오티드의 거리를 두고 위치하는 2개의 뮤턴트 뉴클레오티드는 실시예 5에서 기술하는 바와 같은 시점에서 수복될 수 있다.

돌연변이가 2개 이상의 부위에 도입되는 상기 언급한 일례에서 그 부위의 거리와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 상기 부위는 수백의 뉴클레오티드만큼 떨어져 있을 수 있다. 돌연변이화 효율과 관련하여, 부위는 바람직하게 200개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 100개의 뉴클레오티드내, 가장 바람직하게 30개의 뉴클레오티드내 위치한다.

본 발명은 본 발명에 따란 돌연변이를 도입하기 위하여 사용되는 키트를 제공한다. 일례로, 키트는 표적 핵산내로 돌연변이를 도입하기 위한 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 포함한다. 또한, 키트는 DNA를 세포내로 도입하기 위한 시약을 포함하나.

추가로, 본 발명의 방법에 따라 돌연변이가 유전자내로 도입되는 세포는 생체내로 이식될 수 있다. 따라서, 뮤턴트 유전자 또는 돌연변이가 수복된 유전자가 생체내에서 발현되는 유전자 요법을 수행할 수 있다.

세포의 일례로 제한하는 것을 아니지만, 혈액 세포(조혈 세포, 조혈 줄기 세포, 골수 세포, 탯줄 혈액 세포, 말초 혈액 줄기 세포, 단핵 세포, 림프구, B 세포, T 세포 등), 섬유모세포, 신경모세포, 신경 세포, 내피 세포, 혈관내피 세포, 간 세포, 근육모세포, 골격근 세포, 평활근 세포, 암 세포 및 백혈병 세포를 포함한다.

예를 들면, 표적 세포로서 조혈 줄기 세포를 사용하는 유전자 요법은 하기와 같이 수행될 수 있다. 먼저, 조혈 줄기 세포-함유 재료(예: 골수 조직, 말초 혈액 또는 탯줄 혈액)을 기증자로부터 채취한다. 상기 재료를 실제로 유전자 도입 방법에 사용할 수 있다. 그러나, 일반적으로 조혈 줄기 세포를 포함하는 단핵 세포 분획을 밀도 구배 원심분리법 등에 의해 제조하거나, 조혈 줄기 세포를 추가로 적절한 세표 표면 표지 분자를 사용하여 정제된다. 이어서 조혈 줄기 세포-함유 재료를 본 발명의 방법을 사용하여 돌연변이 도입 또는 돌연변이 수복에 사용한다. 그렇게 수득한 세포는 예를 들면, 정맥 투여와 같은 방법에 의해 수혜자에게 이식될 수 있다. 수혜자가 기증자 본인인 것이 바람직하지만, 동종이형 이식을 수행할 수 있다. 예를 들면, 재료로서 탯줄 혈액을 사용하는 경우 동종이형 이식을 수행한다.

본 발명의 유전자 요법은 돌연변이에 기인하여 그의 작용이 저하되었거나 손실되었거나 환자에서 그의 발현이 항진된 유전자에 대한 것으로 예시된다. 예를 들면, 단일 뉴클레오티드 치환에 기인한 유전자 질환(예: 겸상적혈구성 빈혈)은 바람직하게 본 발명의 방법에 따라 치료된다.

상기 언급한 유전자 요법은 인간뿐만 아니라 인간이 아닌 척추동물 및 무척추동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 적용 일례는 표적 세포로서 생식 세포(예: 배아줄기 세포, 원시종자세포, 난모세포, 난조세포, 난자, 정모세포 또는 정자)를 사용하여 인간이 아닌 형질전환된 동물(예: 마우스, 래트, 개, 돼지, 소, 닭, 개구리 또는 미다커(medaka))의 통상적인 생산이다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 유전자의 발현만이 특이적으로 억제된 유전자 넉아웃 동물은 본 발명의 방법에 따라 생산될 수 있다. 넉아웃 동물은 유전자의 기능 분석, 유전자의 기능과 관련된 시약 선별 등에 매우 유용하다.

하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하며, 그의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1

레드-쉬프트(red-shift) 그린 형광 단백질 유전자내로의 뮤턴트 뉴클레오티드 도입

플라스미드pQBI25 (Quantum Biotechnologies Inc.)에 삽입된 레드-쉬프트 그린 형광 단백질(이하 GFP로 언급함)-코딩 유전자(서열번호 :1)의 뉴클레오티드 서열중 단일 뉴클레오티드를 치환시켜 상기 유전자가 발현되지 못하도록 하였다. 66번 내지 68번 위치의 아미노산 잔기가 GFP의 형광에 중요하다. 시험관내 돌연변이화 키트 (Takara Bio)에서 PCR을 사용하여 그중 67번 위치의 티로신을 코딩하는 코돈 "TAT"를 종결 코돈 "TAG"로 바꾸었다. 상기 기술한 바와 같이 제조된 뮤턴트 GFP (mGFP) 유전자 및 돌연변이를 포함하지 않는 GFP-코딩 유전자를 플라스미드pDON-AI (Takara Bio)내로 독립적으로 삽입하여 각각 pDON-mGFP 및 pDON-GFP를 작제하였다. 이들 플라스미드중 하나를 1μg 포함하는 50㎕의 TE 완충액을 1μg의 리포펙트아민 2000(LF2000, Gibo BRL)을 포함하는 50㎕의 Optime 배지(Gibco BRL)과 혼합하였다. 혼합물을 사용하여 293 세포를 형질감염시켰다. 4일 후 세포를 형광 현미경하에서 관찰하였다. pDON-GFP이 첨가된 세포에 대하여 강한 녹색 형광이 관찰된 반면, pDON-mGFP을 포함하는 세포에 대해서는 어떤 형광도 관찰되지 않았다. 이러한 결과에 기초하여, 세포에서 형광을 발하지 않는 뮤턴트 유전자를 작제하였다. mGFP 유전자를 하기 시험에 사용하였다.

실시예 2

GFP 유전자의 뉴클레오티드 서열을 갖는 역방향 반복 서열 DNA (이하 irDNA로서 언급함)을 제조하기 위하여, 먼저 irDNA의 증폭을 위한 주형으로서 반대 방향의 2개의 GFP 유전자 단편 세트를 플라스미드내로 도입하였다. 플라스미드 pQBI25내로 삽입된 GFP 유전자의 전장 서열의 단편을 프라이머 Us-EcoRI (서열번호 :2) 및 DEND (서열번호 :3)을 사용하여 증폭시켰다. EcoRI 및 BamHI (모두 Takara Bio)로 단편을 분해하여 수득된 760-bp DNA 단편을 플라스미드pUC19 (Takara Bio)중 EcoRI 및 BamHI 부위 사이에 도입하였다. 프라이머 Us-hindIII (서열번호 :4) 및 DEND를 사용하여 증폭에 의해 GFP 유전자의 전장 서열의 DNA 단편을 수득하였다. DNA 단편을 HindIII (Takara Bio) 및 BamHI로 분해하여 수득한 760-bp DNA 단편을 이 플라스미드내 HindIII 및 BamHI 부위 사이에 도입하였다. 상기 기술한 바와 같이 작제된 플라스미드를 pucGFP0-0으로 명명하였다.

추가로, 프라이머 Us-EcoRI 및 DEND를 사용하여 GFP 유전자의 전장 서열의 DNA 단편을 증폭시켰다. 단편을 EcoRI 및 PvuII (Takara Bio)로 분해하여 수득한 714-bp DNA 단편을 플라스미드 pUC19내 EcoRI 및 SmaI 부위 사이에 도입하였다. 프라이머 Us-hindIII 및 DEND을 사용하여 증폭에 의해 GFP 유전자의 전장 서열의 DNA 단편을 수득하였다. DNA 단편을 HindIII 및 BamHI로 분해하여 수득한 760-bp DNA 단편을 이 플라스미드내 HindIII 및 BamHI 부위 사이에 도입하였다. 상기 기술한 바와 같이 작제된 플라스미드를 pucGFP0-2으로 명명하였다.

추가로, 프라이머 U100hindIII (서열번호 :5) 및 U100bamhI (서열번호 :6)를 사용하여 GFP 유전자로부터 DNA 단편을 증폭시켰다. 110-bp DNA 단편은 DNA 단편을 HindIII 및 BamHI로 분해하여 제조하였다. 플라스미드 pucGFP0-0에서 760-bp HindIII-BamHI 단편을 110-bp DNA 단편으로 치환하여 플라스미드pucGFP0-6을 작제하였다.

pucGFP0-0은 전장 GFP-코딩 유전자에 대한 역방향 반복 서열을 갖는다. 인서트 DNA의 길이는 1518 bp이다. 종결 코돈으로부터 38개의 뉴클레오티드 부위는 pucGFP0-2내 반복 서열중 하나에서 결실되어 있다. 인서트 DNA의 길이는 1479 bp이다. 플라스미드 pucGFP0-6은 전장 GFP-코딩 유전자 및 GFP 유전자의 150번 위치 내지 250번 위치의 뉴클레오티드로 구성된 역방향 반복 서열을 갖는다. 인서트 DNA의 길이는 868 bp이다. 도 1A, 1B 및 1C는 각각 pucGFP0-0, pucGFP0-2 및 pucGFP0-6을 도시한다.

역방향 반복 서열 DNA, 0-0 irDNA, 0-2 irDNA 및 0-6 irDNA은 주형으로서 pucGFP0-0, pucGFP0-2 및 pucGFP0-6을 사용하여 PCR에 의해 제조하였다. 프라이머 Us-ecoRI-1 (서열번호 :7) 및 Us-hindIII-1 (서열번호 :8)을 사용하여 0-0 irDNA 및 0-2 irDNA을 제조하였다. 프라이머 Us-ecoRI-1 및 U100hindIII-1 (서열번호 :9)을 사용하여 0-6 irDNA를 제조하였다. mGFP 유전자내로 도입된 뮤턴트 뉴클레오티드 "G" 및 "C"를 복원하기 위한 야생형 GFP 유전자의 뉴클레오티드 "T" 및 "A"는 0-0 irDNA, 0-2 irDNA 및 0-6 irDNA에서 각각 센스 스트랜드의 5' 말단으로부터 또는 안티센스 스트랜드의 3' 말단으로부터(EcoRI) 237번째 및 1282번째 뉴클레오티드, 237번째 및 1243번째 뉴클레오티드, 및 237번째 및 813번째 뉴클레오티드에 위치한다. mGFP 유전자의 센스 또는 안티센스에서 뮤턴트 뉴클레오티드 수복에 관여하는 뉴클레오티드의 위치는 도 1에서 마크 "*" 및 "#"로 나타낸다.

실시예 3

에피좀 실험 모델에서 mGFP 유전자의 단일 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복

역방향 반복 서열 DNA을 사용하여 유전자 수복 실험을 수행하고, 표적 핵산과의 결합 및 표적 핵산에서 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복을 조사하였다. 수회의 DNA 도입에 기인한 세포에 대한 독성 영향은 표적 핵산으로서 도입된 mGFP 유전자(pcep-mGFP), 및 대조군으로으로서 ss 올리고 또는 3개의 역방향 반복 서열 DNAs(irDNAs)중 하나를 갖는 플라스미드를 세포질내로 동시에 도입하여 예방하였다.

ss 올리고의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 :10에 나타낸다.

(1) 열-변성 irDNA를 사용한 에피좀 mGFP의 수복

실험 모델을 제조하기 위하여 mGFP 유전자를 포함하는 760-bp HindIII-BamHI 단편을 실시예 1에섯 작제된 pDON-mGFP으로부터 분리하고, 포유동물의 에피좀 발현 벡터 pCEP4 (Invitrogen)중 HindIII 및 BamHI 사이에서 서브클로닝하여 플라스미드pcep-mGFP를 제조하였다. 293 세포(8 x 10⁴)를 48-웰 플레이트에 시딩하고 10% FBS을 포함하는 DEME 배지에서 밤새도록 배양하였다. 2μg의 각 0-0 irDNA, 0-2 irDNA, 및 0-6 irDNA를 5분동안 94℃에서 열변성시키고 빙수에서 신속하게 냉각시켰다. 2μg의 ss 올리고, 0-0 irDNA, 0-2 irDNA, 또는 0-6 irDNA, 1.5μg의 prep-mGFP 또는 pUC19(음성 대조군)의 37.5㎕의 Optimen 배지로 희석하였다. 혼합물을 2μg의 LF2000을 포함하는 동량의 Optimen 배지와 혼합하였다. 단지 3.5μg의 prep-mGFP만을 포함하는 37.5㎕의 Optimen 배지 및 2μg의 LF2000을 포함하는 동량의 Optimen 배지와 혼합하여 제조된 혼합물을 음성 대조군 2로 사용하였다.

20분동안 인큐베이션시킨 후, 각각의 DNA-LF2000 시약 컴플렉스를 세포에 가하였다. 혼합물을 30분동안 실온에 방치시켰다. 150㎕의 Optimen 배지를 추가로 가하였다. 6시간동안 형질감염시킨 후, 10% FBS를 포함하는 1ml의 DEME 배지를 가하였다. 48시간 후, 음성 대조군 1 및 2에서는 어떤 녹색 형광-방출 세포(GFP-양성 세포)도 관찰되지 않았다. 한편, GFP-양성 세포는 ss 올리고 또는 표적 DNA를 포함하는 pcep-mGFP 및 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복을 위한 3개의 irDNAs중 하나를 형질감염에 사용한 웰에서는 관찰되었다. 최대의 GFP-양성 세포는 4일째 관찰되었다. 트립신화하여 플레이트로부터 세포를 분리하고, GFP-양성 세포를 FACS를 사용하여 측정하였다. 배경으로서 음성 대조군 1에 대한 값을 측정치로부터 감하여 수득한 결과를 표 1에 나타낸다.

mGFP 유전자내 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복 인덱스로서 10⁴개의 293 세포당 GFP-양성 세포의 수에 대한 최대치를 0-0 irDNA에서 관찰하였다. 수복 효과는 ss올리고를 사용한 경우에서 관찰된 것보다 약 3배 높았다. 4회의 독립적인 실험동안 Mann-Whitney U 시험 결과로서 0-0 irDNA 및 ss 올리고의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다.

표 1

DNA	104개의 세포당 GFP-양성 세포의 갯수
0-0 irDNA	18.21±4.22
0-2 irDNA	11.79±2.84
0-6 irDNA	5.26±0.74
ss 올리고	5.40±2.64

(2) 열변성을 갖지 않는 irDNA를 사용한 에피좀 mGFP 유전자의 수복

PCR 증폭에 의해 제조된 irDNAs를 열변성시키지 않고 사용하였다는 것을 제외하고 실시예 3-(1)에 기술된 바와 같이 mGFP 유전자 수복을 조사하였다. 10⁴개의 293 세포에서 출현한 GFP-양성 세포의 갯수를 표 2에 나타낸다. 열변성을 갖지 않는 irDNA를 사용하여 ss 올리고에서의 것보다 높은 수복 효율이 관찰되었다. 4회의 독립적인 실험동안 Mann-Whitney U 시험 결과로서 0-0 irDNA 또는 0-2 irDNA 및 ss 올리고의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다.

표 2

DNA	104개의 세포당 GFP-양성 세포의 갯수
0-0 irDNA	39.27±9.21
0-2 irDNA	20.78±2.80
0-6 irDNA	13.12±2.15
ss 올리고	6.54±2.64

6시간의 시간 간격으로 수행된 이후 형질감염을 위해 표적 핵산으로서 pcep-mGFP 및 돌연변이 수복용으로 0-0 irDNA를 사용하고, ss 올리고를 사용하여 관찰된 것보다 높은 수복 효율이 관찰되었다.

상기 (2)에 기술된 시험에서 표적 핵산으로서 플라스미드가 사용된 모든 세포내로 도입되지 않았음이 나타났다. pcep-GFP 및 0-0 irDNA는 동일한 조건하에서 293 세포내로 도입되었고 GFP-양성 세포의 세포를 측정하였다. 결과, 21.22±4.67%의 세포가 플라스미드를 수반(harbor)하는 것으로 나타났따. 표 2에 나타낸 결과를 플라스미드를 포함하지 않는 세포를 제거하여 변환시켰다.

도입된 pcep-mGFP를 갖는 10⁴개의 세포당 뮤턴트 뉴클레오티드가 수복된 GFP-양성 세포의 수를 표 3에 나타낸다. 4회의 독립적인 실험동안 Mann-Whitney U 시험 결과로서 0-0 irDNA 및 ss 올리고의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다.

표 3

DNA	도입된 pcep-mGFP를 갖는 104개의 세포당 GFP-양성 세포의 갯수
0-0 irDNA	201.42±58.42
0-2 irDNA	109.12±27.48
0-6 irDNA	72.24±23.97
ss 올리고	39.76±20.94

상기 언급한 실험에서 형질감염에 사용된 3개의 irDNAs 및 ss 올리고의 양(2μg)은 529nmol(ss 올리고), 9.5nmol(0-0 irDNA), 10.1mnol(0-2irDNA) 및 16.6nmol(0-6irDNA)과 일치하다. 세개의 irDNA에 의한 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복율은 ss 올리고에 의한 것보다 높았다. 변성시키지 않고 형질감염을 수행하였을 때도 열-변성된 irDNA를 사용하여 형질감염시켰을 때 관찰된 것과 유사한 고도한 수복율은 전장 GFP 유전자 부위를 포함하는 0-0 irDNA를 사용하여 관찰되었다. 상기 수복율은 ss 올리고에 의한 것보다 5배 높았다. 0-0 irDNA 분자의 수가 ss 올리고 분자의 수보다 수십배 적은 경우에도 0-0 irDNA에 의한 수복율은 ss 올리고에 의한 것보다 수배 높았다. 이 실험을 통해 irDNA의 표적 핵산을 표적하는 활성은 ss 올리고보다 현저히 높고, 이는 수복율을 증가시킨다는 결과가 제시되었다.

실시예 4

세포의 염색체내로의 mGFP 유전자의 도입

세포의 염색체내로 mGFP 유전자를 도입하기 위한 레트로바이러스 입자를 레트로바이러스 패킹 키트 ampho (Takara Bio)를 사용하여 제조하였다. 실시예 1에 기술된 재조합 레트로바이러스 벡터 pDON-mGFP를 인산칼슘법에 따라 키트에서 패킹 벡터와 함께 293 세포내로 동시에 도입하였다. 48시간동안 배양한 후, 배양 상등액을 수거하고 여과하였다. 배양 상등액(레트로바이러스 현탁액)을 희석하고 293 세포에 대한 배지에 가하였다. PCR-증폭 DNA 단편 서열 분석에 의해 클로닝 세포(293-10 세포)가 mGFP 유전자를 포함하고 있음을 확인하였다. 게놈 DNA를 293-10세포로부터 추출하고 레트로바이러스 벡터에 대한 인테그레이션 부위의 서열 및 상기 부위에 인접한 세포 염색체 DNA를 분석하였다. 1개의 GFP 유전자 카피가 세포내 도입되었음을 확인하였다. 이 클로닝 세포를 하기 실험에서 사용하였다.

실시예 5

메틸화된 리보뉴클레오티드로 수식된 수복 및 mGFP에서 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복에 대한 0-0 irDNA의 제조

포스포아미다이트 방법에 따라 2'-O-메틸 RNA 포스포아미다이트 및 CE-포스포아미다이트를 사용하여 합성된 5' 프라이머 RNA-ecoRI 및 3' 프라이머 RNA-hindIII의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호:11 및 12에 나타낸다. 각 프라이머에서 처음 6개의 뉴클레오티드가 메틸화된다. 주형으로서 이들 두개의 프라이머 및 pcuGFP0-0를 사용하여 PCR을 수행하여 수득된 0-0 irDNA의 센스 스트랜드 및 안티센스 스트랜드의 5' 말단에 6개의 메틸화된 리보뉴클레오티드를 결합시켰다. 세포에서 뉴클레아제에 의해 분해되기 어려운 0-0 irDNA를 R0-0 irDNA로 명명하였다.

4 x 10⁵의 293-10 세포 또는 293 세포(음성 대조군)를 24-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고 10% FBS를 포함하는 DEME 배지에서 밤새도록 배양하였다. 4μg의 ss 올리고, 0-0 irDNA 또는 R0-0 irDNA를 75㎕의 Optimen 배지로 희석하였다. 혼합물을 4μg의 LF2000을 포함하는 동량의 Optimen 배지와 혼합하였다. 20분동안 인큐베이션시킨 후, 각각의 DNA-LF2000 시약 컴플렉스를 직접 세포에 가하였다. 형질감염을 위해 10% FBS를 포함하는 90㎕의 DEME 배지를 추가로 가하였다. 배지내 ss 올리고, 0-0 irDNA 및 R0-0 irDNA의 양(mole)은 992.00nmol, 17.83nmol 및 17.82nmol였다. 6시간 후, 10% FBS를 포함하는 1.5ml의 DEME 배지를 가하였다. 16-18시간 후, 배지를 3% FBS를 포함하는 DEME 배지로 교환하였다. 2일 및 1/2일간 32℃에서 계속하여 배양하였다.

GFP-양성 세포를 정확하게 계수하기 위하여, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신화하여 분리하고 배지를 포함하는 새 웰 플레이트의 웰로 이동시키고 각 웰중 GFP-양성 세포의 수(세포수 1.6 내지 1.9 x 10⁶)를 형광 현미경하에서 계수하였다. 대조군으로서 293 세포중 GFP-양성 세포에 대한 배경 값을 수복용 DNA가 첨가된 293-10 세포중 GFP-양성 세포에 대한 값으로부터 감산하였다. 결과 ss 올리고, 0-0 irDNA 및 R0-0 irDNA를 포함하는 웰당 GFP-양성 세포의 평균 갯수는 약 54, 2300 및 3800이었다. 10⁴의 293-10 세포당 GFP-양성 세포의 수를 표 4에 나타낸다.

4회의 독립적인 실험동안 Mann-Whitney U 시험 결과로서 두개의 irDNA 및 ss 올리고의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다.

표 4

DNA	104개의 세포당 GFP-양성 세포의 갯수
0-0 irDNA	12.32±4.08
R0-0 irDNA	24.20±3.84
ss 올리고	0.31±0.08

상기 기술한 바와 같이, R0-0 irDNA를 포함하는 293-10 세포이 염색체중 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복율은 ss 올리고 또는 0-0 irDNA를 포함하는 것보다 높았다. 실험 결과를 통해 0-0 irDNA를 포함하는 것과 비교하여 뉴클레아제 등에 의한 분해에 대하여 메틸화된 리보뉴클레오티드의 내성에 의하여 돌연변이 수복율이 증가하였고 핵 또는 세포질내 R0-0 irDNA 정체 시간이 연장되었음을 시사한다.

실시예 6

전사인자에 결합할 수 있는 서열을 포함하는 irDNA를 사용한 뮤턴트 뉴클레오티드 수복

전사인자는 핵내 신호전달에 관여하고 유전자 발현을 조절하는 작용을 하는 중요한 인자이다. 다수의 전사인자는 세포질에서 합성되고 항상 세포질내에서 그의 차례를 기다리고 있다. 전사인자가 활성화 신호를 받으면, 핵으로 수송되고 작용한다.

전사인자 NF-κB 및 NF-κB의 활성을 억제시키는 I-κB은 주로 서로 결합되어 세포질내 존재한다. TNF-α와 같은 사이토카인에 의해 자극을 받아 I-κB가 인산화되면 NF-κB는 활성화되고 핵내로 수송된다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol, Vol 91, p 11884-11888(1994)). NF-κB는 유전자의 상류에 위치하는 NF-κB 모티프로 명명되는 단쇄 DNA 서열에 결합한다.

293 세포내 NF-κB의 존재 및 그에 결합할 수 있는 DNA 서열이 보고되었다(Eur. J. Biochem. Vol 268, p.1828-1836(2001)). irDNA 중앙의 역방향 반복 서열내로 이 서열을 도입하기 위하여 세개의 프라이머 GFP-κB1 (서열번호 :14), GFP-κB2 (서열번호 :15) 및 GFP-κB3 (서열번호 :16)를 합성하였다. 먼저 GFP-κB1 및 상기 언급한 프라이머 Us-EcoRI 및 주형 DNA로서 GFP 유전자를 포함하는 pucGFP 0-0으로부터 절단된 EcoRI-BamHI 단편을 사용하여 PCR 반응을 수행하여 증폭된 DNA 단편을 수득하였다. 이어서, 주형으로서 이 증폭된 단편 및 GFP-κB2 및 Us-EcoRI을 사용하여 PCR을 수행하여 증폭된 단편을 수득하였다. 추가로, 주형으로서 이 증폭된 단편 및 GFP-κB3 및 Us-EcoRI을 사용하여 PCR을 수행하여 증폭된 단편을 수득하였다. 생성된 증폭 단편을 EcoRI 및 BamHI로 분해하고 pucGFR0-0중 EcoRI-BamHI 단편을 분해로부터 생성된 단편으로 대체하였다. 상기 기술된 바와 같이 작제된 플라스미드를 pucGFP0nf-0으로 명명하였다.

pucGFP0nf-0은 GFP에 대한 역방향 반복 서열 및 NF-κB-결합 모티프 서열을 포함하는 인서트를 포함한다. 인서트의 길이는 1548bp이다. 주형으로서 이 플라스미드 및 프라이머 RNA-ecoRI 및 RNA-hindIII, 또는 S-ecoRI 및 S-hindIII를 사용하여 PCR을 수행하였다. S-ecoRI 및 S-hindIII은 그의 서열이 각각 프라이머 RNA-ecoRI 및 RNA-hindIII과 일치하는 프라이머이고, 각 프라이머의 5' 말단으로부터 6개의 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드로 바뀌고, 그들 사이의 포스페이트 그룹은 황 분자로 수식된다. 증폭된 단편은 각각 R0nf-0 irDNA 및 S0nf-0 irDNA로 명명하였다.

293-10 세포 및 293 세포(음성 대조군)에 대한 사전 배양 조건 및 수복용 DNA의 형질감염 방법은 TNF-α를 ss 올리고, R0-0 irDNA, R0nf-0 irDNA 또는 S0nf-0 irDNA을 도입한 후 6시간째 첨가된 배지에서 8ng/ml의 농도로 6시간동안 배양하는 것을 제외하고 실시예 5에 기술한 바와 동일하였다.

세포를 처리하고, 각 웰의 GFP-양성 세포 수로르 형광 현미경하에서 계수하고, 대조군으로서 293 세포에서의 GFP-양성 세포에 대한 배경 값을 실시예 5에 기술된 바와 같이 수복용 DNA가 첨가된 세포에서의 GFP-양성 세포에 대한 값으로부터 감산하였다. 결과, ss 올리고, R0-0 irDNA, R0nf-0 irDNA 및 S0nf-0 irDNA을 포함하는 GFP-양성 세포의 평균 갯수는 각각 88개, 약 6000개, 10,000개 이상 및 10,000개이상이었다. ss 올리고, R0-0 irDNA, R0nf-0 irDNA 또는 S0nf-0 irDNA를 포함하는 10⁴ 개의 293-10 세포당 GFP-양성 세포의 수는 표 5에 나타낸다. S0nf-0 irDNA를 사용하여 관찰된 가장 높은 수복율은 ss 올리고를 사용하여 관찰된 것보다 138배 높았다.

4회의 독립적인 실험동안 Mann-Whitney U 시험 결과로서 3개의 irDNA 및 ss 올리고의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다. 또한, R0-0 irDNAs 및 전사인자에 대한 결합 모티프 서열이 도입된 R0nf-0 irDNA 및 S0nf-0 irDNA의 수복 효율 사이에서 유의차(p<0.05)가 관찰되었다.

표 5

DNA	104개의 세포당 GFP-양성 세포의 갯수
R0-0 irDNA	28.19±6.54
R0nf-0 irDNA	61.02±13.72
S0nf-0 irDNA	67.58±20.31
ss 올리고	0.49±0.14

리포펙트아민을 사용하여 세포질내로 도입된 ss 올리고 또는 0-0 irDNA는 농도 구배에 따라 자유 확산 결과로서 수동 확산 방식으로 핵으로 이동한다. 0-0 irDNA의 농도는 ss 올리고보다 수십배 낮고, 따라서 핵으로 수송되는 0-0 irDNA의 카피수도 더욱 적기 때문에, 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복율은 ss 올리고의 것보다 낮을 것으로 예상되었다. 그러나, 실제 결과는 0-0 irDNA를 포함하는 수복율이 ss 올리고의 것보다 높은 결과가 나타났다. 이 결과는 세포 핵내로 수송되는 카피의 수가 더욱 적음에도 불구하고 높은 0-0 irDNA의 표적 활성에 기인하여 0-0 irDNA를 포함하는 뮤턴트 뉴클레오티드의 수복율이 높게 나타났다는 것을 나타냈다. 효과는 추가로 뉴클레아제에 의해 쉽게 분해되지 않는 메틸화된 리보뉴클레오티드 또는 황화 데옥시뉴클레오티드로 5' 말단에서 irDNA를 수식하여 증가된다.

NB-κB-결합 모티프 서열이 결합하는 역방향 반복 서열 구조를 포함하지 않는 표적 DNA로서 동일한 서열을 갖는 DNA의 수복 효과는 역방향 반복 서열 DNA(0-nf-0 irDNA)의 것보다 수배 낮았다. NB-κB-결합 모티프 서열 2분자가 0-0 irDNA 중앙에 반대 방향으로 도입된 DNA의 효과는 NB-κB-결합 모티프 서열 서열 1분자가 도입된 0nf-0 irDNA의 효과의 1/2이었다.

실시예 7

이중 돌연변이를 갖는 GFP 유전자의 수복

시험관내 돌연변이화 방법에서 PCR을 적용시켜 GFP 유전자의 개시 코돈 "ATG"중 잔기 "G"를 "T"로 바꾸었다. 뮤턴트 GFP(m1GFP) 유전자를 pCEP4내로 서브클로닝하고 293 세포를 형질감염시키기 위하여 사용하고, 형광이 관찰되지 않음을 확인하였다. 추가로, 실시예 1에서 제조된 mGFP 유전자의 상류 부위의 HindIII-NheI 단편 (-36-174)을 m1GFP 유전자의 HindIII-NheI 단편 (-36-174)으로 대체하여 이중 뮤턴트 GFP (dmGFP) 유전자를 작제하였다.

dmGFP 유전자는 198개의 뉴클레오티드에 의해 떨어져 있는 두개의 뮤턴트 뉴클레오티드(3번 위치의 "T" 및 201번 위치의 "G")를 갖는다. dmGFP 유전자의 760-bp HindIII-BamHI 단편을 pCEP4내 HindIII 및 BamHI 사이세어 서브클로닝하여 표적 핵산으로 사용하고자 하는 플라스미드, pcep-dmGFP를 제조하였다

0-0 irDNA을 사용하여 동시에 이중 돌연변이를 수복시키는 효율을 실시예 3에 기술된 실험 조건하에서 조사하였다. 결과, 2개의 뮤턴트 뉴클레오티드의 동시 수복을 나타내는 GFP-양성 세포는 10⁴ 세포당 15.85± 2.00의 비율로 관찰되었다.

산업상 이용가능성

본 발명은 고효율로 유전자상의 뉴클레오티드 서열내로 돌연변이를 도입할 수 있는 방법을 제공한다. 세포내 DNA내로 인공 돌연변이를 도입하거나 돌연변이에 기인한 비기능성 유전자의 수복은 본 발명에 따라 가능하다. 본 발명의 방법은 유전자 요법, 넉아웃 생물체의 작제, 유전자 등의 기능 분석에 유용하다.

서열 목록 프리 텍스트

서열번호 :1; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자

서열번호 :2; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 Us-EcoRI

서열번호 :3; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 DEND

서열번호 :4; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 Us-HindIII

서열번호 :5; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 U100HindIII

서열번호 :6; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자부위 를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 D100BamHI

서열번호 :7; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 Us-EcoRI-1

서열번호 :8; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 Us-HindIII-1.

서열번호 :9; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 U100HindIII-1.

서열번호 :10; 키메라성 올리고뉴클레오티드 ss 올리고. "뉴클레오티드 1 내지 4 및 50 내지 53은 2'-O-메틸우리딘이다".

서열번호 :11; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 RNA-ecoRI. 뉴클레오티드 1 내지 6은 2'-O-메틸리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드이다"

서열번호 :12; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 RNA-hindIII. "뉴클레오티드 1 내지 6은 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드이고-다른 뉴클레오티드는 데옥시뉴클레오티드이다"

서열번호 :14; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 GFP-κB1.

서열번호 :15; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 GFP-κB2.

서열번호 :16; 레드-쉬프트 그린 형광 단백질을 코딩하는 유전자 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머 GFP-κB3.

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for introducing mutation into target nucleic acid <130> 663910 <150> JP 2002-204887 <151> 2002-07-12 <150> JP 2003-113534 <151> 2003-04-18 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 1 atggctagca aaggagaaga actcttcact ggagttgtcc caattcttgt tgaattagat 60 ggtgatgtta acggccacaa gttctctgtc agtggagagg gtgaaggtga tgcaacatac 120 ggaaaactta ccctgaagtt catctgcact actggcaaac tgcctgttcc atggccaaca 180 ctagtcacta ctctgtgcta tggtgttcaa tgcttttcaa gatacccgga tcatatgaaa 240 cggcatgact ttttcaagag tgccatgccc gaaggttatg tacaggaaag gaccatcttc 300 ttcaaagatg acggcaacta caagacacgt gctgaagtca agtttgaagg tgataccctt 360 gttaatagaa tcgagttaaa aggtattgac ttcaaggaag atggaaacat tctgggacac 420 aaattggaat acaactataa ctcacacaat gtatacatca tggcagacaa acaaaagaat 480 ggaatcaaag tgaacttcaa gacccgccac aacattgaag atggaagcgt tcaactagca 540 gaccattatc aacaaaatac tccaattggc gatggccctg tccttttacc agacaaccat 600 tacctgtcca cacaatctgc cctttcgaaa gatcccaacg aaaagagaga ccacatggtc 660 cttcttgagt ttgtaacagc tgctgggatt acacatggca tggatgaact gtacaactga 720 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer Us-EcoRI to amplify a gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 2 cttgaattcg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa 40 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer DEND to amplify a gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 3 cactggcggc cgttactagt 20 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer Us-HindIII to amplify a gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 4 cttaagcttg gtaccgagct cggatcgggc gcgcaagaaa 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer U100HindIII to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 5 ctaagcttct ggcaaactgc ctgttccatg gccaacacta 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer D100BamHI to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 6 tcggatccaa gtcatgccgt ttcatatgat ccgggtatct 40 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer Us-EcoRI-1 to amplify a gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 7 gaattcggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37 <210> 8 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer Us-HindIII-1 to amplify a gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 8 aagcttggta ccgagctcgg atcgggcgcg caagaaa 37 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer U100HindIII-1 to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 9 aagcttctgg caaactgcct gttccatggc caacacta 38 <210> 10 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <222> (1)..(4) <223> um <220> <221> modified_base <222> (50)..(53) <223> um <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric oligonucleotide ss Oligo. <400> 10 uuuuatcttg aaaagcattg aacaccatag cacagagtag tgactagtgu uuut 54 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer RNA-ecoRI to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein.“nucleotides 1 to 6 are 2’-O-methyl ribonucleotides ? other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 11 gaauucggta ccgagctcgg atcgggcgcg caaga 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer RNA-hindIII to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. “nucleotides 1 to 6 are 2’-O-methyl ribonucleotides ? other nucleotides are deoxyribonucleotides” <400> 12 aagcuuggta ccgagctcgg atcgggagag caaga 35 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> homo sapience <400> 13 gattgcttta gcttggaaat tccggagctg 30 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer GFP-kB1 to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 14 agctaaagca atctcagttg tacagttcat ccatgccatg 40 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer GFP-kB2 to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 15 tccggaattt ccaagctaaa gcaatctcag ttgtacagtt 40 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer GFP-kB3 to amplify a portion of gene encoding red-shifted green fluorescence protein. <400> 16 ttttggatcc cagctccgga atttccaagc taaagcaatc 40 663910 10/9

Claims (16)

1. (1) 역방향 반복 서열를 갖는 DNA의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 상동성이고 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이를 포함하는, 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 제조하고;

   (2) 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는, 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열내로 돌연변이를 도입하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열을 갖는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열이 전사인자에 대한 결합 모티프 서열인 방법.
4. 제 1항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 수식된 뉴클레오티드를 갖는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 더블-스트랜드 DNA인 방법.
6. 제 1항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 싱글-스트랜드 DNA인 방법.
7. 제 1항에 있어서, 표적 핵산이 세포질내 위치하는 핵산인 방법.
8. 제 1항에 있어서, 표적 핵산이 핵내 위치하는 핵산인 방법.
9. 제 1항에 있어서, 복수개의 돌연변이가 표적 핵산내로 동시에 도입되는 방법.
10. 제 1항에 있어서, 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이가 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입인 방법.
11. 역방향 반복 서열를 갖는 DNA의 뉴클레오티드 서열이 표적 핵산과 상동성이고 표적 핵산내로 도입되는 돌연변이를 포함하는, 역방향 반복 서열를 갖는 DNA를 포함하는, 제 1항의 방법에 의해 표적 핵산내로 돌연변이를 도입하기 위한 키트.
12. 제 11항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열을 갖는 키트.
13. 제 12항에 있어서, 핵 수송 시그날을 갖는 단백질에 대한 결합 모티프 서열이 전사인자에 대한 결합 모티프 서열인 키트.
14. 제 11항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 수식된 뉴클레오티드를 갖는 키트.
15. 제 11항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 더블-스트랜드 DNA인 키트.
16. 제 11항에 있어서, 역방향 반복 서열을 갖는 DNA가 싱글-스트랜드 DNA인 키트.