KR20050011909A - Recombinant VP2 Protein Comprising Canine Parvovirus Neutralization Antigen Epitope And Vaccine Composition Comprising The Same - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A recombinant VP2 protein comprising a canine Parvovirus neutralization antigen epitope and a vaccine composition comprising the same protein are provided, thereby effectively preventing and treating infection of canine Parvovirus. CONSTITUTION: The recombinant VP2 protein comprising a canine Parvovirus neutralization antigen epitope comprises the amino acid sequence selected from SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 and SEQ ID NO:29. An expression vector pGEM-4T contains a gene encoding the recombinant VP2 protein. A method for producing the recombinant VP2 protein comprises the steps of: (a) constructing an expression vector containing the gene encoding the recombinant VP2 protein operatively linked to an expression control sequence; (b) transforming a host cell with the recombinant expression vector; and (c) culturing the transformed cell in a medium and recovering the substantially pure recombinant VP2 protein.

Description

개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 ＶＰ2 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물{Recombinant VP2 Protein Comprising Canine Parvovirus Neutralization Antigen Epitope And Vaccine Composition Comprising The Same}Recombinant VP2 Protein Comprising Canine Parvovirus Neutralization Antigen Epitope And Vaccine Composition Comprising The Same}

본 발명은 개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포, 상기 단백질을 포함하는 백신 및 상기 단백질을 이용하여 제조된 항체를 포함하는 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 조성물에 관한 것이다.The present invention provides a VP2 recombinant protein comprising a canine parvovirus neutralizing antigen determinant, a gene encoding the protein, an expression vector comprising the gene, a host cell transformed with the expression vector, a vaccine comprising the protein and the protein. The present invention relates to a composition for treating or preventing a canine parvovirus infection comprising an antibody prepared by using the present invention.

개 파보바이러스(Canine parvovirus)는 1978년에 보고된 이후로 전세계적으로 개 질병에 있어 중요 전염 병원체로 알려져 있다. 우리나라에서는 1980년에 경기도지방에서 최초로 개 파보바이러스 감염증이 유행된 것이 보고된 바 있으며, 그 후 전국적으로 발병하여 많은 개를 폐사시키게 하였다.Canine parvovirus has been known worldwide as an important infectious agent for dog disease since it was reported in 1978. In 1980, the first case of canine parvovirus infection was reported in Gyeonggi-do province, and after that, it developed nationwide and caused many dogs to die.

개 파보바이러스에 의한 증상으로는 개의 소화기관, 특히 소장에 장염을 일으켜 구토, 출혈성 설사 및 급격한 탈수 등의 증상을 나타내며, 감염초기에는 급격한 혈구 감소현상이 나타나기도 한다. 또한 어린 강아지에서는 심근염 등을 유발시켜 2 내지 3일만에 폐사하게 된다. 폐사율은 6개월 미만의 강아지에서 높은 것으로 알려져 있다.Symptoms of canine parvovirus include gastroenteritis in the digestive tract of the dog, especially the small intestine, resulting in vomiting, hemorrhagic diarrhea, and sudden dehydration. In addition, young dogs cause myocarditis, etc., and die in 2 to 3 days. Mortality is known to be high in dogs less than six months old.

한편, 개 파보바이러스는 고양이 파보바이러스와 항원성이 같은 점으로 보아 고양이 파보바이러스의 변이독주일 가능성이 높다고 여러 학자들이 시사하고 있다.On the other hand, several studies suggest that dog parvoviruses are likely to be mutaviruses of cat parvoviruses because they have the same antigenicity as cat parvoviruses.

개 파보바이러스 감염증의 치료 및 예방에 대한 연구는 오래 전부터 전세계적으로 많이 진행되어 왔으나 현재까지도 이의 해결을 위한 뚜렷한 진전은 없으며 재조합 단백질 백신, DNA 백신 및 약독화 백신이 시도 중이나 아직까지 확실한 백신의 개발은 이루어지지 않고 있는 실정이다. 최근에는 변형된 생 약독화 바이러스 (modified live attenuated virus) 또는 재조합 합성 단백질(synthetic peptide)등을 이용한 백신을 개발하려는 연구가 시도 중인 것으로 알려져 있다. 이와 관련하여, 대한민국특허등록 제 0000905호에는 개 파보바이러스를 개 콩팥세포에 접종하여 증식시킨 후, 불활화제인 포르말린으로 처리하여 개 파보바이러스 불활화 백신을 조제하는 방법에 대해 개시되어 있으며, 대한민국특허등록 제 0200324호에는 개 파보바이러스의 캡시드 단백질을 코딩하는 유전자인 VP2 유전자 전체를 이용하여 재조합 단백질을 생산하고, 이를 포함하는 백신을 개시하고 있다. 그러나 상기 불활화 백신은 불활화가 완벽하게 이루어지지 않을 수 있어 백신을 접종시켜도 질병이 유발되는 상태(vaccination brake)가 발생할 수 있으며, 또한 상기 VP2 유전자 전체를 이용한 재조합 단백질을 포함하는 백신은 상기 단백질의 분자량이 크고 당단백질로 되어 있어 발현 시스템 등의 이유로 직접 산업화에 이용하기가 어려운 점이 있다.Although research on the treatment and prevention of canine parvovirus infection has long progressed worldwide, there has been no clear progress to solve the problem. Recombinant protein vaccines, DNA vaccines and attenuated vaccines have been tried, but the development of definitive vaccines is still underway. Is not happening. Recently, research is being conducted to develop a vaccine using a modified live attenuated virus or a synthetic peptide. In this regard, Korean Patent Registration No. 0000905 discloses a method for preparing a canine parvovirus inactivating vaccine by inoculating canine parvovirus into canine kidney cells and then proliferating the same, and treating the canine parvovirus inactivated vaccine with formalin, an inactivating agent. Registration No. 0200324 discloses a recombinant protein produced using the entire VP2 gene, which is a gene encoding the capsid protein of canine parvovirus, and discloses a vaccine comprising the same. However, the inactivated vaccine may not be completely inactivated, and thus, even when the vaccine is inoculated, a disease-causing condition may occur. Also, a vaccine including a recombinant protein using the entire VP2 gene may be used. Because of its high molecular weight and glycoprotein, it is difficult to use for direct industrialization due to expression systems.

따라서, 상기 문제점들을 해결할 수 있는 보다 효율적이고 경제적인 백신이개발되어져야 할 것이다.Therefore, a more efficient and economical vaccine to solve the above problems should be developed.

이에, 본 발명자들은 개 파보바이러스의 VP2 단백질에 해당하는 항원 유전자로부터 중화항원 결정기를 분석하여 7개의 단편 유전자, VP2 재조합 단백질 및 항체를 제조할 수 있었다. 상기 제조된 유전자, 단백질 및 항체는 개 파보바이러스 감염증을 보다 효율적이며 경제적으로 치료 및 예방할 수 있다.Thus, the present inventors were able to prepare 7 fragment genes, VP2 recombinant protein and antibody by analyzing neutralizing antigen determinants from the antigen gene corresponding to the canine parvovirus VP2 protein. The prepared genes, proteins and antibodies can more effectively and economically treat and prevent canine parvovirus infection.

따라서, 본 발명의 목적은 개 파보바이러스의 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a VP2 recombinant protein comprising a neutralizing antigenic determinant of canine parvovirus, a gene encoding the same, an expression vector comprising the gene, and a host cell transformed with the expression vector.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 제조하는 방법, 상기 단백질로부터 항체를 제조하는 방법, 상기 단백질을 포함하는 백신 및 상기 항체를 포함하는 조성물을 제공한다.Another object of the present invention to provide a method for producing the protein, a method for producing an antibody from the protein, a vaccine comprising the protein and a composition comprising the antibody.

도 1은 개 파보바이러스 DNA를 주형으로 PCR 증폭하여 제조된 VP2 유전자를 전기영동한 사진이다(레인 1: 개 파보바이러스 DNA 1㎕를 증폭한 결과, 레인 2: 개 파보바이러스 DNA 3㎕를 증폭한 결과, 레인 3: 개 파보바이러스 DNA 5㎕를 증폭한 결과).1 is a photograph of electrophoresis of the VP2 gene prepared by PCR amplification of canine parvovirus DNA as a template (lane 1: amplified 1 μl of canine parvovirus DNA, and lane 2: amplified 3 μl of canine parvovirus DNA). Lane 3: amplified 5 μl of canine parvovirus DNA).

도 2는 개 파보바이러스 VP2 유전자를 주형으로 PCR 증폭하여 7개의 VP2 단편 유전자를 제조한 결과를 전기영동으로 나타낸 사진이다(레인 1: CPV2a, 레인 2: CPV2b, 레인 3: CPV2c, 레인 4: CPV2d, 레인 5: CPV2e, 레인 6: CPV2f, 레인 7: CPV2g).FIG. 2 is a photograph showing electrophoresis of the production of seven VP2 fragment genes by PCR amplification of the dog parvovirus VP2 gene into a template (lane 1: CPV2a, lane 2: CPV2b, lane 3: CPV2c, lane 4: CPV2d). Lane 5: CPV2e, lane 6: CPV2f, lane 7: CPV2g).

도 3은 개 파보바이러스 VP2 유전자 전체서열과 7개의 VP2 단편 유전자의 염기서열을 비교하여 각각의 위치를 나타낸 것이다.Figure 3 shows the position of each parvovirus VP2 gene compared with the base sequence of the seven VP2 fragment genes.

도 4는 개 파보바이러스 VP2 유전자를 삽입하여 제조된 재조합 바이러스에서 추출한 재조합 바이러스 DNA를 주형으로 PCR 증폭하여 VP2 유전자의 삽입을 확인한 결과를 전기영동으로 나타낸 사진이다(레인 1: 청색 프라그에서 추출한 재조합 바이러스 DNA를 증폭한 결과, 레인 2, 3, 4: 흰색 프라그에서 추출한 재조합 바이러스 DNA를 증폭한 결과).Figure 4 is a photograph showing the results of electrophoresis by PCR amplification of recombinant viral DNA extracted from a recombinant virus prepared by inserting the dog parvovirus VP2 gene into a template (lane 1: recombinant virus extracted from blue plaque) DNA amplification resulted in amplification of recombinant viral DNA extracted from lanes 2, 3 and 4: white plaques).

도 5는 도 4의 레인 1에 나타낸 재조합 바이러스 DNA를 포함하는 재조합 바이러스를 계대배양한 후, 이로부터 추출한 재조합 바이러스 DNA를 PCR 증폭하여 VP2 유전자의 삽입을 확인한 결과를 전기영동으로 나타낸 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing the results of confirming the insertion of the VP2 gene by PCR amplification of the recombinant virus DNA extracted from the recombinant virus including the recombinant viral DNA shown in lane 1 of FIG. 4 by electrophoresis.

도 6은Sf9 세포에 재조합 바이러스를 감염시켜 경과시간에 따라 수득한 VP2 단백질을 전기영동하여 확인한 사진이다.Figure 6 is a photograph confirmed by electrophoresis of the VP2 protein obtained according to the elapsed time by infecting the recombinant virus to Sf 9 cells.

도 7은 VP2 단백질의 발현을 확인하기 위해 모노클로날 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(Western blot)을 수행한 사진이다.7 is a photograph of Western blot using monoclonal antibody to confirm the expression of VP2 protein.

도 8은 7개의 VP2 단편 유전자를 발현 벡터 pGEX-4T에 삽입하여 전기영동한 사진이다(레인 1: pGEX-4T-CPV2a, 레인 2: pGEX-4T-CPV2b, 레인 3: pGEX-4T-CPV2c, 레인 4: pGEX-4T-CPV2d, 레인 5: pGEX-4T-CPV2e, 레인 6: pGEX-4T-CPV2f, 레인 7: pGEX-4T-CPV2g).FIG. 8 is a picture of electrophoresis by inserting seven VP2 fragment genes into the expression vector pGEX-4T (lane 1: pGEX-4T-CPV2a, lane 2: pGEX-4T-CPV2b, lane 3: pGEX-4T-CPV2c, Lane 4: pGEX-4T-CPV2d, lane 5: pGEX-4T-CPV2e, lane 6: pGEX-4T-CPV2f, lane 7: pGEX-4T-CPV2g).

도 9는 7개의 VP2 재조합 단백질의 발현을 확인하기 위해 레빗-항-GST를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸 사진이다.Figure 9 is a photograph showing the results of Western blot using the Levitt-anti-GST to confirm the expression of seven VP2 recombinant proteins.

도 10은 7개의 VP2 재조합 단백질이 일반 개 혈청 또는 VP2 단백질의 항혈청과 반응하는지를 웨스턴 블럿을 수행하여 나타낸 사진이다.FIG. 10 is a photograph showing Western blots showing whether seven VP2 recombinant proteins react with antiserum of normal dog serum or VP2 protein.

도 11은 개 파보바이러스를 고양이 유래 신장세포에 감염시킨 후 파쇄하여 수득한 단백질을 전기영동한 것을 항혈청을 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석한 결과를 나타낸 사진이다(레인 1: 항-CPV2a와의 결합, 레인 2: 항-CPV2c와의 결합, 레인 3: 항-CPV2d와의 결합, 레인 4: 항-CPV2e와의 결합, 레인 5: 항-CPV2f와의 결합,레인 6: 일반 개 혈청과의 결합, 레인 7: 항-개 파보바이러스와의 결합).Figure 11 is a photograph showing the results of analysis by Western blot using the anti-serum electrophoresis of the protein obtained by infecting the dog parvovirus to cat-derived kidney cells (lane 1: binding to anti-CPV2a, lanes) 2: binding to anti-CPV2c, lane 3: binding to anti-CPV2d, lane 4: binding to anti-CPV2e, lane 5: binding to anti-CPV2f, lane 6: binding to normal dog serum, lane 7: anti- Binding to canine parvovirus).

도 12는 7개의 VP2 재조합 단백질로부터 제조한 항혈청의 항체가를 분석하기 위해 ELISA(효소 면역학적 분석)를 실시하여 GMT값을 나타낸 그래프이다.FIG. 12 is a graph showing GMT values by ELISA (enzyme immunological analysis) to analyze antibody titers of antiserum prepared from seven VP2 recombinant proteins.

본 발명은 개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포를 제공한다.The present invention provides a VP2 recombinant protein comprising a canine parvovirus neutralizing antigen determinant, a gene encoding the protein, an expression vector comprising the gene, and a host cell transformed with the expression vector.

본 발명에서 용어 "VP2 재조합 단백질"은 개 파보바이러스의 캡시드 단백질을 형성하는 VP2 전체 유전자를 분석하여 중화항원 결정기를 포함하도록 부분적인단편(partial fragment)으로 클로닝 한 후, 이를 발현 벡터에 삽입하여 제조한 VP2 단백질을 의미한다.In the present invention, the term "VP2 recombinant protein" is prepared by analyzing the entire VP2 gene forming the capsid protein of canine parvovirus, cloning it into partial fragments to include neutralizing antigen determinants, and inserting the same into an expression vector. Means one VP2 protein.

또한, 본 발명에서 용어 "중화항원 결정기(epitope region)"란 바이러스 및 세균 등의 항원에 항체가 결합하는 부위를 의미한다. 일반적으로, 중화항원 결정기는 폴리펩타이드 단편들로 이루어져 있으며 크기도 작다.In addition, in the present invention, the term "epitope region" refers to a site where an antibody binds to antigens such as viruses and bacteria. In general, neutralizing antigenic determinants consist of polypeptide fragments and are small in size.

바이러스나 세균 등의 항원 단백질은 당단백질(glycoprotein)인 경우가 대부분이며 이를 재조합 단백질로 생산할 경우, 당단백질로 발현하기 위해서는 번역후 변형(posttranslational modification) 등의 문제 때문에 진핵세포시스템(eukaryotic system)을 이용하여 원래의 항원성과 면역원성이 유지되는 항원 단백질을 생산할 수 있다. 그러나 진핵세포시스템을 이용할 경우, 당화(glycosylation)등의 번역후 변형은 해결이 가능하나 단백질을 생산하는 비용이 매우 비싸며, 특히 세포배양에 의해 단백질을 생산할 경우 다른 동물 바이러스에 의한 감염 우려도 있다. 한편, 중화항원 결정기를 재조합 단백질로 생산할 경우, 원핵세포시스템(prokaryotic system)인 대장균 등에서 발현시켜 이를 동물체내에 주입하여도 원래의 항원 단백질과 동일한 항원성과 면역원성을 나타낼 수 있다. 이러한 장점 등으로 인해 최근에는 바이러스나 세균 등에 항체가 결합하는 부위인 중화항원결정기를 확인하여 이를 재조합 유전자 및 단백질을 생산하는 기술 등으로 사용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.Antigen proteins such as viruses and bacteria are mostly glycoproteins, and when they are produced as recombinant proteins, eukaryotic systems are used to express glycoproteins due to problems such as posttranslational modification. Can be used to produce antigenic proteins that retain their original antigenicity and immunogenicity. However, when using a eukaryotic cell system, post-translational modifications such as glycosylation can be solved, but the cost of producing proteins is very high. In particular, when the protein is produced by cell culture, there is a fear of infection by other animal viruses. Meanwhile, when the neutralizing antigenic determinant is produced as a recombinant protein, even when expressed in E. coli, which is a prokaryotic system, and injected into an animal body, the same antigenicity and immunogenicity as the original antigenic protein can be exhibited. Due to these advantages, researches to identify neutralizing antigenic determinants that bind antibodies to viruses or bacteria and to use them as technologies for producing recombinant genes and proteins have been actively conducted.

이러한 관점에서, 본 발명은 중화항원 결정기를 포함하는 개 파보바이러스 VP2 재조합 단백질을 제조하여 이를 이용한 백신 및 항체 등의 개발에 응용하고자하는 것이다.In this regard, the present invention is to produce a canine parvovirus VP2 recombinant protein comprising a neutralizing antigen determinant and to apply to the development of vaccines and antibodies using the same.

본 발명의 개 파보바이러스 VP2 재조합 단백질은 개 파보바이러스를 동물세포에 감염시켜 이를 원심분리한 후, 수득한 개 파보바이러스 DNA를 주형으로 하여 통상적으로 사용되는 PCR 증폭방법으로 VP2 유전자를 제조한 다음, 상기 VP2 유전자를 클로닝하여 전체 서열을 분석하고, 상기 분석된 VP2 유전자를 주형으로 하여 PCR 증폭방법으로 중화항원 결정기를 포함하도록 VP2 단편 유전자를 설계하여 이를 발현시킴으로써, VP2 재조합 단백질을 제조할 수 있다.After the dog parvovirus VP2 recombinant protein of the present invention is infected with the animal parvovirus virus and centrifuged, the VP2 gene is prepared by a PCR amplification method which is commonly used by using the obtained dog parvovirus DNA as a template. Cloning the VP2 gene to analyze the entire sequence, VP2 fragment protein can be prepared by designing and expressing the VP2 fragment gene to include the neutralizing antigen determinant by PCR amplification method using the analyzed VP2 gene as a template.

상기 VP2 단편 유전자를 제조하기 위해서는 특이 프라이머(specific primer)를 사용하여 PCR 증폭방법으로 제조할 수 있다. 용어 "특이 프라이머"란 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 단편 유전자를 PCR 증폭방법으로 제작하기 위한 인공 염기서열을 의미한다. 상기 특이 프라이머는 GenBank의 데이터베이스를 기초로 하여 제작할 수 있다. 또한, 상기 특이 프라이머에는 제한효소 인식부위가 삽입되어 있는데, 이는 특이 프라이머로 PCR 증폭된 VP2 단편 유전자를 발현 벡터내로 삽입시키기 위한 전 단계로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법이다. 제작된 특이 프라이머는 표 1과 같다.In order to prepare the VP2 fragment gene, it can be prepared by PCR amplification using a specific primer. The term "specific primer" refers to an artificial base sequence for preparing a VP2 fragment gene containing a neutralizing antigen determinant by PCR amplification. The specific primer can be prepared based on GenBank's database. In addition, a restriction enzyme recognition site is inserted into the specific primer, which is a method commonly used in the art as a previous step for inserting the PCR amplified VP2 fragment gene into the expression vector. Specific primers produced are shown in Table 1.

VP2 단편 유전자를 제조하기 위한 특이 프라이머.Specific primers for preparing VP2 fragment genes. 프라이머primer 염기 서열(5' - 3')Base sequence (5'-3 ') 서열번호SEQ ID NO: PCR 증폭 후크기(bp)PCR amplification hook (bp) CPV2aFCPV2aF CTGGATCCAGTGATGGAGCAGTTCAACT GGATCC AGTGATGGAGCAGTTCAA 1One 339339 CPV2aRCPV2aR CTGTCGACTTACCAAGGTGTTACAATTTGTGCCT GTCGAC TTACCAAGGTGTTACAATTTGTGC 22 CPV2bFCPV2bF CTGGATCCTCATTGGCTGATGCAAATGCCT GGATCC TCATTGGCTGATGCAAATGC 33 297297 CPV2bRCPV2bR CTGTCGACTTATATGGTTGGTTTCCATGGATACT GTCGAC TTATATGGTTGGTTTCCATGGATA 44 CPV2cFCPV2cF CTGGATCCCCAACTCCATGGAGATATTACT GGATCC CCAACTCCATGGAGATATTA 55 240240 CPV2cRCPV2cR CTGTCGACTTATTGCCATGTATGTGTTAGTCCT GTCGAC TTATTGCCATGTATGTGTTAGTC 66 CPV2dFCPV2dF CTGGATCCACAAATAGAGCATTGGGCTTACT GGATCC ACAAATAGAGCATTGGGCTTA 77 252252 CPV2dRCPV2dR CTGTCGACTTATCCTGCTGCAATAGGTGTTTTACT GTCGAC TTATCCTGCTGCAATAGGTGTTTTA 88 CPV2eFCPV2eF CTGGATCCGCGCAAACAGATGAAAATCAACT GGATCC GCGCAAACAGATGAAAATCAA 99 153153 CPV2eRCPV2eR CTGTCGACTTATGGATATCTTCCTGTATCCT GTCGAC TTATGGATATCTTCCTGTATC 1010 CPV2fFCPV2fF CTGGATCCGAAGGAGATTGGATTCAACT GGATCC GAAGGAGATTGGATTCAA 1111 222222 CPV2fRCPV2fR CTGTCGACTTATGGTTTTAAGTCAGTATCCT GTCGAC TTATGGTTTTAAGTCAGTATC 1212 CPV2gFCPV2gF CTGGATCCAGACTTCATGTAAATGCACCCT GGATCC AGACTTCATGTAAATGCACC 1313 317317 CPV2gRCPV2gR CTGTCGACCTAGGTGCTAGTTGATATGCT GTCGAC CTAGGTGCTAGTTGATATG 1414

* 볼드체 : 제한효소 인식부위* Bold: restriction enzyme recognition site

표 1의 특이 프라이머를 이용하여 7개의 VP2 단편 유전자를 제조할 수 있으며, 이를 클로닝하고 그 서열을 분석하기 위해서는 통상의 벡터시스템(예: pGEM-T 벡터 시스템)을 이용한 방법으로 수행할 수 있다.Seven VP2 fragment genes can be prepared using the specific primers of Table 1, and can be cloned and analyzed using conventional vector systems (eg, pGEM-T vector systems) to clone and analyze the sequences thereof.

분석된 개 파보바이러스 VP2 전체 유전자 및 7개의 VP2 단편 유전자의 염기서열을 각각 "VP2 유전자(서열번호 15)", "CPV2a"(서열번호 16), "CPV2b"(서열번호 18), "CPV2c"(서열번호 20), "CPV2d"(서열번호 22), "CPV2e"(서열번호 24), "CPV2f"(서열번호 26), "CPV2g"(서열번호 28)로 명명하였다.The base sequences of the entire canine parvovirus VP2 gene and seven VP2 fragment genes were analyzed as "VP2 gene (SEQ ID NO: 15)", "CPV2a" (SEQ ID NO: 16), "CPV2b" (SEQ ID NO: 18), and "CPV2c". (SEQ ID NO: 20), "CPV2d" (SEQ ID NO: 22), "CPV2e" (SEQ ID NO: 24), "CPV2f" (SEQ ID NO: 26), and "CPV2g" (SEQ ID NO: 28).

상기 7개의 VP2 단편 유전자는 VP2 유전자 서열에 부분적으로 포함되는 유전자로서, VP2 유전자는 총 1748bp이고, 이에 포함되는 상기 VP2 단편 유전자 CPV2a는 1 부터 327bp, CPV2b는 328 부터 612bp, CPV2c는 613 부터 840bp, CPV2d는841 부터 1080bp, CPV2e는 1090 부터 1230bp, CPV2f는 1231 부터 1440bp, CPV2g는 1441 부터 1745bp에 해당된다.The seven VP2 fragment genes are partially included in the VP2 gene sequence, and the VP2 gene is 1748 bp in total. CPV2d corresponds to 841 to 1080bp, CPV2e corresponds to 1090 to 1230bp, CPV2f corresponds to 1231 to 1440bp, and CPV2g corresponds to 1441 to 1745bp.

한편, 본 발명의 VP2 재조합 단백질은 상기 7개의 VP2 단편 유전자가 삽입된 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 제조할 수 있다.On the other hand, the VP2 recombinant protein of the present invention can be prepared by transforming the host cell with the expression vector into which the seven VP2 fragment genes are inserted.

용어 "발현 벡터"는 적합한 숙주세포내에서 유전자를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된(operatively linked) 핵산서열을 함유하는 제조물을 의미한다.The term "expression vector" refers to a preparation containing a nucleic acid sequence operatively linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing a gene in a suitable host cell.

용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"이란 핵산서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다.The term "operatively linked" means that the binding between nucleic acid sequences is functionally related.

용어 "숙주세포"란 세포내 도입된 유전자가 세포 유전자에 복제가능하도록 연결되어 세포자체의 메카니즘으로 형질전환되는 원핵 또는 진핵생물 세포를 의미한다.The term "host cell" refers to a prokaryotic or eukaryotic cell in which a gene introduced into the cell is linked so that it can replicate to a cell gene and is transformed by the mechanism of the cell itself.

따라서, 본 발명의 7개의 단편 유전자를 각각 발현시키기 위해서 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물 숙주세포에 적합한 발현 벡터로는 베큘로바이러스, SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 사용할 수 있으며, 원핵생물 숙주세포에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX-2T, pGEX-4T pUC벡터, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함하는 세균성 플라스미드를 사용할 수있다. 바람직하게는 베귤로바이러스에서 유래된 폴리헤드린 프로모터(polyhedrin promoter)를 갖는 베귤로바이러스 발현 벡터 또는 글루타치온 에스-트렌스퍼제(glutathio S-transferase; 이하 "GST"라 한다.)를 코딩하는 서열을 갖는 pGEX-4T 발현 벡터를 사용할 수 있다.Therefore, various expression vectors can be used to express each of the seven fragment genes of the present invention. For example, suitable expression vectors for eukaryotic host cells include expression control sequences derived from baculovirus, SV40, bovine papilloma virus, adenovirus, adeno-associated virus, cytomegalovirus and retrovirus. A vector including the above can be used, and expression vectors that can be used in prokaryotic host cells include bacterial plasmids including pBluescript, pGEX-2T, pGEX-4T pUC vectors, colE1, pCR1, pBR322, pMB9 and derivatives thereof. Can be. Preferably pGEX having a sequence encoding a baculovirus expression vector or glutathione S-transferase (hereinafter referred to as "GST") having a polyhedrin promoter derived from the baculovirus. -4T expression vectors can be used.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환되는 숙주세포로는 유전자의 도입효율이 높고, 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주세포가 통상적으로 사용된다. 예를 들면 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 원핵 또는 진핵 세포,Sf9(Spodoptera frugiperda9)과 같은 곤충 세포, CHO(Chinese Hamster Ovary) 및 생쥐 세포같은 동물 세포 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서는Sf9 또는 대장균을 숙주세포로 사용하는 것이 바람직하다.As the host cell transformed by the above-described expression vector, a host cell having a high gene transfer efficiency and a high expression efficiency of the introduced gene is commonly used. For example, E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, fungi, prokaryotes, such as yeast or eukaryotic cells, Sf 9 (Spodoptera frugiperda 9) and insect cells, CHO (Chinese Hamster Ovary) and rat cells the like, such as an animal cell, such as Can be. In the present invention, it is preferable to use Sf 9 or E. coli as host cells.

상기 발현 벡터를 숙주세포로 도입하여 형질전환시키는 방법은 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 혹은 감염(infection) 등을 사용할 수 있으며, 이러한 방법으로 형질전환체를 수득할 수 있다.The transformation method by introducing the expression vector into the host cell is calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, Cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction or infection can be used. In this way, a transformant can be obtained.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, GST를 코딩하는 서열을 갖는 pGEX-4T 발현 벡터에 상기 7개의 단편 유전자를 각각 삽입시킨 후, 이를 대장균 JM109에 도입시켜 형질전환체를 수득할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the seven fragment genes are respectively inserted into a pGEX-4T expression vector having a sequence encoding GST, and then introduced into E. coli JM109 to obtain a transformant.

상기 형질전환체로부터 본 발명의 VP2 재조합 단백질을 분리 정제하는 방법은 형질전환체를 적당한 시간동안 배양하고 세포를 파괴한 후 크로마토그래피, 투석 및/또는 여과를 통한 통상적인 방법으로 VP2 재조합 단백질을 순수분리 할 수 있다.The method for isolating and purifying the VP2 recombinant protein of the present invention from the transformant is to culture the transformant for a suitable time, destroy the cells, and then purify the VP2 recombinant protein in a conventional manner by chromatography, dialysis and / or filtration. Can be separated

상기 7개의 VP2 단편 유전자를 이용하여 제조된 본 발명의 VP2 재조합 단백질을 각각 "CPV2a 단백질"(서열번호 17), "CPV2b 단백질"(서열번호 19), "CPV2c 단백질"(서열번호 21), "CPV2d 단백질"(서열번호 23), "CPV2e 단백질"(서열번호 25), "CPV2f 단백질"(서열번호 27), "CPV2g 단백질"(서열번호 29)로 명명하였다.The VP2 recombinant protein of the present invention prepared using the seven VP2 fragment genes was respectively "CPV2a protein" (SEQ ID NO: 17), "CPV2b protein" (SEQ ID NO: 19), "CPV2c protein" (SEQ ID NO: 21), " CPV2d protein "(SEQ ID NO: 23)," CPV2e protein "(SEQ ID NO: 25)," CPV2f protein "(SEQ ID NO: 27), and" CPV2g protein "(SEQ ID NO: 29).

한 가지 관점으로, 본 발명은 상기 VP2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a vaccine composition for the treatment or prevention of canine parvovirus infection comprising the VP2 recombinant protein as an active ingredient.

VP2 재조합 단백질은 상기에서 언급한 바와 같이, 상기 7개의 VP2 단편 유전자가 각각 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시키며, 생성된 형질전환체를 상기 유전자가 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 VP2 재조합 단백질을 회수함으로써 제조할 수 있다.As mentioned above, the VP2 recombinant protein is incorporated into a vector comprising one or more expression control sequences, wherein the seven VP2 fragment genes are each operatively linked to regulate their expression. Inserting, transforming the host cell with the recombinant expression vector formed therefrom, culturing the resulting transformant under medium and conditions appropriate for the gene to be expressed, and recovering the substantially pure VP2 recombinant protein from the culture. It can manufacture.

본 발명의 방법에 따라 제조되는 VP2 재조합 단백질은 개의 장염 및 심근염을 유발시키는 개 파보바이러스의 캡시드 단백질의 중화항원 결정기를 포함하도록제조된 단백질이므로, 기존의 개 파보바이러스의 VP2 단백질 전체를 이용한 백신에 비해 개 파보바이러스 감염증을 보다 효율적이며 경제적으로 치료 및 예방할 수 있다.Since the recombinant VP2 protein prepared according to the method of the present invention was prepared to include the neutralizing antigen determinant of the capsid protein of canine parvovirus, which causes canine enteritis and myocarditis, the vaccine using the entire VP2 protein of canine parvovirus was used. Compared to dog parvovirus infection, it can be more efficiently and economically treated and prevented.

다른 관점으로서, 본 발명은 개 파보바이러스를 인식함을 특징으로 하는 항체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an antibody characterized by recognizing canine parvovirus.

본 발명의 VP2 재조합 단백질을 항원으로 하여 개 파보바이러스에 특이적인 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다. 본 발명의 VP2 재조합 단백질을 면역원으로서 사용하여 하이브리도마의 표준 제조 방법을 통해 항체를 제조한다. 생성된 항체는 샘플중의 개 파보바이러스를 검출하는데 특히 유용하다. 폴리클로날 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 래빗, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나에 의해 용이하게 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 VP2 재조합 단백질을 사용하여 전형적으로 복강내, 근육내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시킨다. 한편, 본 발명의 VP2 재조합 단백질의 면역성을 어쥬번트(adjuvant), 예를 들어 프러인드스 컴플리트(Freund's complete) 또는 인컴플리트(incomplete) 어쥬번트를 사용하여 증가시킬 수 있다. 여러 면역방법에 따라, 상기 면역화된 동물 혈청의 샘플을 수집하고 VP2 재조합 단백질에 대한 반응, 즉 항체가를 측정한다. 항체가 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)등을 이용하여 확인한 다음 다량의 폴리클로날 면역혈청을 1주마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 용이하게 수득할수 있다.Monoclonal and polyclonal antibodies specific for canine parvoviruses can be prepared using the VP2 recombinant protein of the present invention as an antigen. Antibodies are prepared via standard methods of preparing hybridomas using the VP2 recombinant protein of the invention as an immunogen. The resulting antibodies are particularly useful for detecting canine parvoviruses in a sample. Polyclonal antibodies can be readily produced by one of ordinary skill in the art from several warm-blooded animals such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice or rats. For example, the VP2 recombinant protein of the invention is used to immunize an animal typically via intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous injection. On the other hand, the immunity of the VP2 recombinant protein of the present invention can be increased using an adjuvant, for example, Freund's complete or incomplete adjuvant. According to various immunization methods, samples of the immunized animal serum are collected and the response to the VP2 recombinant protein, ie antibody titer, is determined. Antibody titration can be easily obtained by using an ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) or the like, and then a large amount of polyclonal immune serum is easily obtained by bleeding or bleeding animals every week.

모노클로날 항체도 익히 공지된 기술을 사용하여 용이하게 생성시킬 수 있다 (Kennett et al. Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980.).Monoclonal antibodies can also be readily produced using well known techniques (Kennett et al. Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980.).

한 양태로서, 본 발명은 VP2 재조합 단백질을 산란계에 주사하여 면역화시키고, 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수하고, 회수된 알의 난황으로부터 분리함을 특징으로 하는 난황항체의 제조방법을 제공한다.In one aspect, the present invention provides a method for producing an egg yolk antibody, characterized by injecting a VP2 recombinant protein into a laying hen to immunize, recovering the eggs laid from the immunized hen, and separating the eggs from the recovered egg yolk.

상기에서 분리한 난황 중 수용성 단백질을 동결 건조하여 분말화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The freeze-dried powder of the water-soluble protein in the yolk separated from the above may be further included.

본 발명에 따라 제조된 VP2 재조합 단백질을 항원으로 사용하여 산란계에 면역화시키는 방법은 당 분야의 통상적인 기술에 따라 실시할 수 있다. 본 발명에 이용되는 산란계로는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 산란율이 높은 백색레그혼계, 로드아일랜드계, 하이라인 브라운계 등을 이용하는 것이 바람직하다. 산란계에 항원 단백질을 투여하는 경로로는 복강내, 근육내 또는 피하 주사 등이 포함된다. 본 발명의 항원 단백질은 어쥬번트, 예를 들어 프러인드스 컴플리트 또는 인컴플리트 어쥬번트를 사용하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.Immunization to laying hens using the VP2 recombinant protein prepared according to the invention as an antigen can be carried out according to conventional techniques in the art. It does not specifically limit as a scattering system used for this invention, For example, it is preferable to use a white leg horn system, a Rhode island type, a high-line brown type etc. with a high scattering rate. Routes for administering antigenic proteins to laying hens include intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous injection. Antigen proteins of the invention can be used to increase their immunity using an adjuvant such as Freund's Complete or Incomplete Adjuvant.

추가항원접종(booster)은 충분한 항체가 얻어질 때까지 실시할 수 있다. 바람직하게는 약 2주 간격으로 3회 내지 4회 면역을 실시하고, 다음 접종은 약 8주 간격으로 실시한다. 면역화된 산란계로부터 알을 수집하고 이로부터 목적하는 단백질을 분리한 다음 유도된 단백질의 항체가를 측정하여 그 증가량이 정체 상태에도달하면, 최종적으로 알을 회수한다.Additional antigen boosters can be performed until sufficient antibodies are obtained. Preferably, three to four immunizations are performed at about 2 week intervals, and the next inoculation is at about 8 week intervals. Eggs are collected from the immunized laying hens, the desired proteins are separated therefrom, the antibody titers of the derived proteins are measured, and when the increase reaches a steady state, the eggs are finally recovered.

제조된 난황항체는 항체가 측정을 통하여 분말형태의 항체 내에 VP2 재조합 단백질에 대한 특이적 항체를 포함하고 있음을 확인한 후 사용할 수 있다.The prepared yolk antibody can be used after confirming that the antibody includes a specific antibody to the VP2 recombinant protein in the antibody in powder form.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 상기 VP2 재조합 단백질을 포함하는 백신 및 상기 난황항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a vaccine comprising the VP2 recombinant protein and a pharmaceutical composition comprising the yolk antibody.

본 발명에 따른 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 악학 조성물은 예방적(즉, 감염의 예방에 사용됨) 또는 치료적(즉, 감염 이후 질병의 치료에 사용됨)으로 사용할 수 있다. 상기 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 약학 조성물은 개 파보바이러스가 감염된 동물에 사용할 수 있지만, 바람직하게는 개과 동물, 가장 바람직하게는 개, 고양이, 너구리 및 족제비류 등에 사용할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the protein vaccine composition and yolk antibody according to the present invention can be used prophylactically (ie used for the prevention of infection) or therapeutically (ie used for the treatment of disease after infection). The pharmaceutical composition comprising the protein vaccine composition and the yolk antibody can be used in an animal infected with canine parvovirus, but is preferably used in canine, most preferably dogs, cats, raccoons and weasels.

본 발명의 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 약학 조성물은 경구, 비후내, 피하, 복강내 또는 근육내 경로와 같은 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the protein vaccine composition and yolk antibody of the present invention may be administered by a suitable route such as oral, thickening, subcutaneous, intraperitoneal or intramuscular route.

상기 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 약학 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 하나 이상의 약제학적으로 허용 담체 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 이러한 담체는 그 자체로 조성물을 투여받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체를 포함한다. 적합한 담체는 통상적으로 크고 느리게 대사화되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체(예를 들어, 오일 소적 또는 리포좀) 및 불활성 바이러스 입자를 포함한다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 이들 담체는 면역자극제 또는 면역보강제로서 작용할 수 있다.The pharmaceutical composition comprising the protein vaccine composition and the yolk antibody may include one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or diluents, according to a method which can be easily carried out by those skilled in the art. Can be. Such carriers include any carrier which by itself does not cause a deleterious reaction to the individual receiving the composition. Suitable carriers are typically large and slow metabolized macromolecules such as proteins, polysaccharides, polylactic acid, polyglycolic acid, polymeric amino acids, amino acid copolymers, lipid aggregates (eg oil droplets or liposomes) and inert virus particles. It includes. Such carriers are well known to those skilled in the art. In addition, these carriers can act as immunostimulants or adjuvant.

상기 단백질 백신 조성물 및 난황항체를 포함하는 약학 조성물의 투여량은 동물의 연령, 체중, 성별, 신체상태 등을 고려하여 선택된다. 별다른 부작용없이 동물에 면역보호반응을 유도하기에 필요한 양은 면역원으로서 사용된 재조합 단백질 및 부형제의 임의 존재에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 각각의 용량은 본 발명의 재조합 단백질 또는 항체의 면역원량의 멸균용액 ㎖당 0.1 내지 1000㎍의 단백질, 바람직하게는 0.1 내지 100㎍을 함유한다. 필요한 경우 초기용량에 이어 임의로 반복된 항원자극을 수행할 수 있다.The dosage of the pharmaceutical composition comprising the protein vaccine composition and the yolk antibody is selected in consideration of the age, weight, sex, physical condition, etc. of the animal. The amount necessary to induce an immunoprotective response in an animal without any adverse side effects may vary depending on the presence of any recombinant protein and excipient used as immunogen. In general, each dose contains 0.1 to 1000 μg of protein, preferably 0.1 to 100 μg, per ml of sterile solution of the immunogenic amount of the recombinant protein or antibody of the invention. If desired, an initial repeated dose followed by an optionally repeated antigen stimulation can be performed.

한편, 본 발명의 난황항체를 포함하는 조성물은 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물로 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 조성물은 상기 VP2 재조합 단백질의 난황항체를 통상의 사료와 혼합하여 제조할 수 있다. 동물 사육에 사용되는 사료는 일반 사료원을 혼합하여 열과 압력을 가하여 펠렛형태로 제작한 배합사료(extruded pellet, EP), 동물의 먹이로 사용 가능한 물질을 펠렛형태로 만들어 그대로 사료로 사용하는 생사료 및 생사료와 가루사료(일반 사료원을 단순히 혼합한 사료)를 혼합하여 펠렛형태로 만든 습사료(moisture pellet, MP) 등이 있다.On the other hand, the composition comprising the yolk antibody of the present invention can be prepared as a feed composition for treating or preventing canine parvovirus infection. Feed composition of the present invention can be prepared by mixing the yolk antibody of the VP2 recombinant protein with a conventional feed. Feed used in animal breeding is extruded pellet (EP) made of pellets by applying heat and pressure by mixing general feed sources, raw feed that is used as feed by making pellets of materials that can be used as animal feed. Wet feed (moisture pellet, MP) is made of pellets by mixing raw feed and powdered feed (simply mixed with a general feed source).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it is to those of ordinary skill in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. Will be self explanatory.

<실시예><Example>

실시예 1Example 1

개 파보바이러스 DNA의 추출 및 정제Extraction and Purification of Canine Parvovirus DNA

MEM 배지(Gibco Co., U.S.A.)를 이용하여 단층으로 배양한 고양이 유래 신장세포(crunell feline kidney cell; CRFK)에 개 파보바이러스(Canine parvovirus , ATCC 780916)를 감염시킨 후, CO25%, 37℃에서 3일간 배양하였다. 상기 3일간 배양한 개 파보바이러스를 포함한 시료로부터 개 파보바이러스 DNA를 수득하는 방법은 DNeasyTM키트(Qiagen Co., Germany)를 이용하여 수행하였다. 즉, 단백질 가수분해 효소 K(Proteinase K) 20㎕를 포함하는 1.5㎖ 미세원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 상기 배양한 시료 200㎕를 주입한 후, 용해 완충액(AL Buffer) 200㎕를 넣고 15초 동안 혼합하였다. 이를 56℃ 항온수조에 10분간 방치한 후, 무수 에탄올 200㎕를 넣고 15초간 혼합하여 스핀 컬럼(Spin Column)에 주입한 다음 8,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상기 컬럼을 새로운 튜브로 이동시켜 세척 완충액 1(AW1 Buffer) 500㎕를 넣고 8,000rpm에서 1분간 원심분리한 후, 또 다른 새로운 튜브로 옮겨서 세척 완충액 2(AW2 Buffer) 500㎕를 넣고 8,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상기 최종 컬럼을 새로운 1.5㎖ 미세원심분리 튜브에 옮겨 용리 완충액(AE Buffer) 200㎕를 넣고 1분간 실온에서 방치한 후, 8,000 rpm, 1분간 원심분리하여 개 파보바이러스 DNA를 수득하였다.After infection with canine parvovirus (ATCC 780916) in the cat feline kidney cells (CRFK) cultured in monolayers using MEM medium (Gibco Co., USA), CO 2 5%, 37 Incubated for 3 days at ℃. The method for obtaining canine parvovirus DNA from the sample containing the canine parvovirus cultured for 3 days was performed using the DNeasy ™ kit (Qiagen Co., Germany). That is, after injecting 200 µl of the cultured sample into a 1.5 ml microcentrifuge tube containing 20 µl of proteasease K, 200 µl of lysis buffer (AL Buffer) was added thereto for 15 seconds. Mixed during. This was allowed to stand in a 56 ° C. constant temperature water bath for 10 minutes, 200 μl of anhydrous ethanol was added, mixed for 15 seconds, injected into a spin column, and centrifuged at 8,000 rpm for 1 minute. Transfer the column to a new tube, add 500 μl of Wash Buffer 1 (AW1 Buffer) and centrifuge for 1 minute at 8,000 rpm, then transfer to another new tube, add 500 μl of Wash Buffer 2 (AW2 Buffer), and add 1 8000 rpm. Centrifuged for a minute. The final column was transferred to a new 1.5 ml microcentrifuge tube, 200 µl of elution buffer (AE Buffer) was added, and left at room temperature for 1 minute, followed by centrifugation at 8,000 rpm for 1 minute to obtain dog parvovirus DNA.

실시예 2Example 2

개 파보바이러스 VP2 유전자의 염기서열 결정Sequence Determination of Canine Parvovirus VP2 Gene

실시예 1에서 수득한 개 파보바이러스 VP2 유전자를 VP2 특이 프라이머(표 1 참조)를 사용하여 PCR 증폭하였다. VP2 특이 프라이머는 GenBank의 데이터베이스를 기초로 하여 개 파보바이러스 VP2 유전자 전체(1.8kb)를 증폭할 수 있도록 제작하였다. 개 파보바이러스 VP2 유전자의 PCR 증폭방법은 실시예 1의 개 파보바이러스 DNA 1, 3, 5㎕, 25mM 염화마그네슘(MgCl2) 3㎕, 10 x PCR 완충액 5㎕, 10mM dNTP 4㎕, 정방향 프라이머 (CPV2aF: 5'-CTGGATCCAGTGATGGAGCAGTTCAA-3', 서열번호 1) 5㎕, 역방향 프라이머 (CPV2gR: 5'-CTGTCGACCTAGGTGCTAGTTGATATG-3', 서열번호 14) 5㎕ 및 Taq-중합효소(5U/㎕)(QIAGEN. Inc., Germany) 0.5㎕를 포함하여 전체반응용량이 50㎕가 되도록 증류수를 가한 후 수행하였다. 상기 PCR은 95℃에서 5분간 예열 단계, 95℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃ 2분을 1 주기로 하여 총 35회 반복 수행 및 72℃에서 10분간 최종 신장반응을 MiniCycler™ 핵산증폭기(MJ Research. Inc.,U.S.A.)를 이용하여 실시하였다. 증폭된 PCR 반응물은 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 60분간 전기영동 한 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 밴드를 확인하였으며, 증폭된 PCR 반응물의 크기는 1kb DNA 레더(Promega Co., U.S.A.)를 마커로 하여 전기영동 함으로써 확인하였다.The canine parvovirus VP2 gene obtained in Example 1 was PCR amplified using VP2 specific primers (see Table 1). VP2 specific primers were designed to amplify the entire canine parvovirus VP2 gene (1.8 kb) based on GenBank's database. The PCR amplification method of the dog parvovirus VP2 gene was carried out in Example 1 of dog parvovirus DNA 1, 3, 5 μl, 25 mM magnesium chloride (MgCl 2 ) 3 μl, 10 × PCR buffer 5 μl, 10 mM dNTP 4 μl, forward primer ( CPV2aF: 5'-CT GGATCC AGTGATGGAGCAGTTCAA- 3 ', SEQ ID NO: 1) 5㎕, reverse primer (CPV2gR: 5'-CT GTCGAC CTAGGTGCTAGTTGATATG -3', SEQ ID NO: 14) and 5㎕ Taq- polymerase (5U / ㎕) (QIAGEN. Inc., Germany) It was performed after adding distilled water so that the total reaction capacity was 50 μl, including 0.5 μl. The PCR was repeated for 5 minutes at 95 ° C. for 5 minutes, 95 ° C. 1 min, 58 ° C. 1 min, and 72 ° C. 2 min. For 1 cycle. Research. Inc., USA). The amplified PCR reaction was electrophoresed at 100V for 60 minutes on a 1% agarose gel, and stained with ethidium bromide to confirm the band. The size of the amplified PCR reaction was 1 kb DNA (Promega Co., USA) as a marker and confirmed by electrophoresis.

또한, 상기 PCR로 증폭된 개 파보바이러스 VP2 유전자를 TA-클로닝 벡터인 pGEM-T 벡터를(Promega Co., U.S.A.)를 이용하여 클로닝 시킨 후, ABI PRISM　3700 DNA 분석기(Applied Biosystems, U.S.A.)에 의뢰하여 염기서열을 확인하였다.In addition, after cloning the pGEM-T vector, which is a TA-cloning vector (Promega Co., USA), canine parvovirus VP2 gene amplified by PCR, ABI PRISM 　 The base sequence was confirmed by requesting a 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems, USA).

도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 개 파보바이러스 DNA를 1, 3, 5㎕로 하여 각각 PCR 증폭을 수행한 결과, 1.8kbp에서 개 파보바이러스 VP2 유전자 밴드를 확인할 수 있었다. 한편, 실시예 1에서 수득한 개 파보바이러스 DNA의 양을 3㎕로 하여 PCR 증폭한 유전자를 적정조건으로 판단하여(참조: 도 2의 레인 2), 이를 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 후, 양성클론을 선별하여 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열의 상동성을 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 제공하는 BLAST 프로그램으로 비교한 결과, 개 파보바이러스 VP2 유전자와 98%의 유사성을 나타내었다.As shown in FIG. 1, PCR amplification was performed using 1, 3, and 5 μl of the dog parvovirus DNA obtained in Example 1, respectively. As a result, the dog parvovirus VP2 gene band was confirmed at 1.8 kbp. Meanwhile, the gene amplified by PCR using the amount of the dog parvovirus DNA obtained in Example 1 as 3 μl was determined under the appropriate conditions (see lane 2 of FIG. 2), which was cloned into a TA-cloning vector, and then positive. Clones were selected and analyzed for sequencing. The homology of the analyzed sequences was compared with the BLAST program provided by the US National Center for Biotechnology Information (NCBI), showing 98% similarity to the canine parvovirus VP2 gene.

상기 PCR 증폭으로 제조된 개 파보바이러스 VP2 유전자의 염기 서열을 서열번호 15에 기재하였다.The base sequence of the canine parvovirus VP2 gene prepared by the PCR amplification is described in SEQ ID NO: 15.

실시예 3Example 3

개 파보바이러스 VP2 단편 유전자의 제조 및 확인Preparation and Identification of Canine Parvovirus VP2 Fragment Gene

상기 실시예 2에서 확인된 개 파보바이러스 VP2 유전자를 주형으로 하여 PCR 증폭방법으로 7개의 VP2 단편 유전자를 제조하였다.Seven VP2 fragment genes were prepared by PCR amplification using the dog parvovirus VP2 gene identified in Example 2 as a template.

7개의 VP2 단편 유전자를 각각 제조하기 위한 PCR 증폭방법은, 실시예 2에서 확인된 VP2 유전자 0.5㎕, 25mM 염화마그네슘 3㎕, 10 x PCR 완충액 5㎕, 10mM dNTP 4㎕, 정방향 프라이머 5㎕, 역방향 프라이머 5㎕, Taq-중합효소(5U/㎕) 0.5㎕를 포함하여 전체반응용량이 50㎕가 되도록 증류수를 가한 후 수행하였다.PCR amplification method for preparing each of the seven VP2 fragment genes, 0.5 μl VP2 gene, 3 μl 25 mM magnesium chloride, 5 μl 10 × PCR buffer, 4 μl 10 mM dNTP, 5 μl forward primer, reverse 5 μl of primer and 0.5 μl of Taq-polymerase (5 U / μl) were added to distilled water so that the total reaction volume was 50 μl.

한편, 이때 사용된 프라이머는 7개의 VP2 단편 유전자마다 각각 다르게 설계된 프라이머를 사용하였으며, 효율적인 클로닝을 위하여 5' 말단에BamHI, 3' 말단에SalI을 삽입하였다(참조: 표 1).Meanwhile, the primers used were primers designed differently for each of the seven VP2 fragment genes, and Bam HI was inserted at the 5 'end and Sal I was inserted at the 3' end for efficient cloning (see Table 1).

상기 PCR의 수행조건, 증폭된 PCR 반응물의 밴드 및 크기의 확인, 염기서열분석은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.Performance conditions of the PCR, identification of the band and size of the amplified PCR reaction, sequencing was performed in the same manner as in Example 2.

도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 확인된 개 파보바이러스 VP2 유전자 및 각각의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 수행한 결과, 339, 297, 240, 252, 153, 222 및 317bp에서 7개의 VP2 단편 유전자를 각각 확인할 수 있었다. 한편, 상기 7개의 VP2 단편 유전자를 TA-클로닝 벡터에 클로닝 한 후, 양성클론을 선별하여 염기서열을 분석하였다. 또한 개 파보바이러스 VP2 유전자 전체서열과 VP2 단편 유전자의 염기서열을 비교, 검토하여 일치함을 확인하였다(참조: 도 3).As shown in FIG. 2, PCR amplification was carried out using the canine parvovirus VP2 gene and the respective primers identified in Example 2, resulting in seven VP2 fragments at 339, 297, 240, 252, 153, 222 and 317 bp. Each gene could be identified. Meanwhile, the seven VP2 fragment genes were cloned into the TA-cloning vector, and the positive clones were selected for sequencing. In addition, the entire sequence of the dog parvovirus VP2 gene and the nucleotide sequence of the VP2 fragment gene were compared and examined to confirm that they matched (see FIG. 3).

실시예 4Example 4

개 파보바이러스 VP2 단백질의 발현Expression of Canine Parvovirus VP2 Protein

실시예 2의 VP2 유전자를 발현시켜 단백질을 제조하기 위해 베귤로바이러스 시스템을 이용하였다.The baculovirus system was used to produce the protein by expressing the VP2 gene of Example 2.

① 재조합 바이러스 생산① Recombinant virus production

폴리헤드린 프로모터를 포함하고 있는 베귤로바이러스 발현 벡터인 pBlueBacHis2(Invitrogen Co., U.S.A.)에 VP2 유전자를 삽입하여 제조한 발현 벡터 pBlueBacHis2-VP2는 Bac-N-blueTM트렌스펙션 키트(invitrogen Co., U.S.A.)를 이용하여 제작하였다. 즉, Bac-N-BlueTMDNA 10㎕(0.5㎍)에 pBlueBacHis2-VP2(1㎍/㎕) 4㎕, CellFECTIN　시약 20㎕를 잘 혼합한 다음 실온에서 15분간 반응시켰다(형질전환 혼합액). 소 태아 혈청(FBS)이 함유되지 않은 그레이스 곤충조직 배양 배지(Grace's insect culture medium)로 3회 세척한Sf9 단층세포를 부착시킨 플레이트에 상기 형질전환 혼합액을 한 방울씩 적하한 후, 실온에서 4시간 동안 천천히 흔들어 배양한 다음, 10% 소 태아 혈청이 첨가된 그레이스 곤충 배지 1㎖를 넣어 플레이트를 밀봉한 후, 27℃에서 72시간 동안 배양하여 재조합 바이러스를 제조하였다.The expression vector pBlueBacHis2-VP2 prepared by inserting the VP2 gene into pBlueBacHis2 (Invitrogen Co., USA), a baculovirus expression vector containing a polyhedrin promoter, is a Bac-N-blue TM transfection kit (invitrogen Co., USA). It was produced using). That is, 10 µl (0.5 µg) of Bac-N-Blue TM DNA, 4 µl of pBlueBacHis2-VP2 (1 µg / µl), CellFECTIN 　 20 μl of the reagent was mixed well and then reacted at room temperature for 15 minutes (transformation mixture). After dropping the transfection mixture drop by drop onto the plate attached with Sf 9 monolayer cells washed three times with Grace's insect culture medium containing no fetal bovine serum (FBS), 4 After shaking slowly for incubation, 1 ml of Grace insect medium to which 10% fetal calf serum was added was sealed to seal the plate, and then cultured at 27 ° C. for 72 hours to prepare a recombinant virus.

상기 재조합 바이러스는 10% 소 태아 혈청이 첨가된 그레이스 곤충조직 배양배지를 이용하여 10배 희석법(10-fold dilution)으로 희석한 다음, X-Gal을 이용한 플라그 분석법(plaque assay)으로 순수 분리하였다. 즉,Sf9 세포를 5×106이 되도록 100㎜ 플레이트에 부착시킨 후, 여기에 희석한 형질전환 바이러스 1㎖ 씩 플레이트 전체에 한 방울씩 적하한 후, 1시간 동안 실온에서 천천히 흔들며 배양하여 바이러스를 세포에 흡착시켰다. 1시간 배양 후 접종액을 제거하고 1% 아가로스와 X-Gal이 함유되어 있는 10% 소 태아 혈청이 첨가된 그레이스 곤충조직 배양 배지를 10㎖씩 분주하였다. 플레이트의 아가로스가 완전히 굳은 후 5mM EDTA에 적신 종이타올이 들어있는 용기에 플레이트를 넣어 27℃에서 5일간 배양한 후, 청색과 흰색의 프라그를 선별하였다. 즉,Sf9 세포를 5×105이 되도록 12-웰 마이크로티터(microtiter) 플레이트에 부착시킨 후, 여기에 파스퇴르 피펫(Pasteur pipett, B.D. Biosciences, U.S.A.)을 이용해 선별된 청색과 흰색 프라그를 각각 접종하여 27℃에서 3일간 배양하였다.The recombinant virus was diluted by 10-fold dilution using Grace insect tissue culture medium to which 10% fetal bovine serum was added, and then purely separated by a plaque assay using X-Gal. That is, Sf 9 cells were attached to a 100 mm plate to be 5 × 10 6 , and then 1 ml of the transformed virus diluted therein was added dropwise to the whole plate, and then shaken and cultured slowly at room temperature for 1 hour. Was adsorbed to the cells. After incubation for 1 hour, the inoculum was removed, and 10 ml of Grace insect tissue culture medium containing 10% fetal bovine serum containing 1% agarose and X-Gal was dispensed. After the agarose of the plate was completely hardened, the plate was placed in a container containing paper towels soaked in 5 mM EDTA, and incubated at 27 ° C. for 5 days, and blue and white plaques were selected. That is, Sf 9 cells were attached to 12-well microtiter plates to be 5 × 10 5 , and then inoculated with blue and white plaques selected using Pasteur pipett (BD Biosciences, USA), respectively. And incubated at 27 ° C. for 3 days.

배양 후, 세포 및 배양액을 회수하여 3,000rpm에서 10분간 원심하여 상층액 즉, 재조합 바이러스(P-1 viral stocks)를 수득하였고, 이를 하기 실시예에서 사용하기 위해 4℃를 유지하면서 보관하였다.After incubation, cells and cultures were collected and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to obtain supernatants, ie recombinant viruses (P-1 viral stocks), which were stored at 4 ° C. for use in the following examples.

② 재조합 바이러스의 VP2 유전자 확인② Identification of VP2 gene of recombinant virus

재조합 바이러스의 VP2 유전자의 유무를 PCR 증폭을 사용하여 확인하였다. 즉, 상기 실시예 4의 ①에서 수득한 재조합 바이러스(P-1 viral stocks) 0.75 ㎖을20 % PEG(polyethylene glycol) 용액 및 Easy-DNATM키트(Invitrogen Co., U.S.A.)를 이용하여 바이러스의 DNA를 분리하였고 이를 주형으로 사용하였다. 재조합 바이러스의 VP2 유전자의 유무를 확인하기 위한 PCR 증폭방법은 DNA 주형 5㎕, 증류수 28.5㎕, 25mM 염화마그네슘 3㎕, 10 x PCR 완충액 5㎕, 10mM dNTP 4㎕, 정방향 프라이머(5'- TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG -3', 서열번호 30) 5㎕, 역방향 프라이머(5'- CAACAACGCACAGAATCTAGC -3', 서열번호 31) 5㎕, Taq-중합효소(5U/㎕) 0.5㎕를 포함하여 전체반응용량 50㎕가 되도록 증류수를 가한 후 수행하였다.The presence or absence of the VP2 gene of the recombinant virus was confirmed using PCR amplification. That is, 0.75 ml of the recombinant virus (P-1 viral stocks) obtained in ① of Example 4 was prepared using a 20% PEG (polyethylene glycol) solution and an Easy-DNA ™ kit (Invitrogen Co., USA). Was separated and used as a template. PCR amplification method to confirm the presence or absence of the VP2 gene of the recombinant virus was 5 μl DNA template, 28.5 μl of distilled water, 3 μl of 25mM magnesium chloride, 5 μl of 10 × PCR buffer, 4 μl of 10mM dNTP, forward primer (5′- TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG − 3 ', SEQ ID NO: 30) 5 µl, reverse primer (5'-CAACAACGCACAGAATCTAGC -3', SEQ ID NO: 31) 5 µl, Taq-polymerase (5U / µl) 0.5 µl of distilled water It was performed after adding.

상기 PCR은 95℃에서 2분간 예열 단계, 95℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 3분을 1 주기로 하여 총 30회 반복 수행 및 72℃에서 7분간 최종 신장반응을 핵산증폭기를 이용하여 실시하였다. 증폭된 PCR 반응물은 1% 아가로스 겔 상에서 100V로 60분간 전기영동 한 후, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 밴드를 확인하였으며, 증폭된 PCR 반응물의 크기는 2kb DNA 레더(Promega Co., U.S.A.)를 마커로 하여 확인할 수 있었다.The PCR was repeated for 30 minutes at 95 ° C for 2 minutes, 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 3 minutes for 1 cycle. It was. The amplified PCR reaction was electrophoresed at 100V for 60 minutes on a 1% agarose gel, and stained with ethidium bromide to confirm the band. USA) as a marker.

도 4에 나타낸 바와 같이, 수득된 재조합 바이러스 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과, 1번 레인에서는 2.1kb(청색 프라그), 2, 3, 4번 레인에서는 2.1kb과 0.8kb의 DNA(흰색 프라그)가 각각 확인되었다. 따라서, 고역가의 재조합 바이러스 제조를 위해 분리가 확인된 1번 레인에서 분석한 DNA를 포함하는 프라그를 연속 계대배양 하였다. 한편, 도 5에 나타낸 바와 같이, 계대배양 후 수득한 재조합 바이러스 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과, 2번 계대배양한 재조합 바이러스 및 3번계대배양한 재조합 바이러스의 레인에서 약 2.1kb의 DNA가 각각 확인되었다. 이로써, 재조합 바이러스에 VP2 유전자가 있음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 4, PCR was performed on the obtained recombinant viral DNA as a template. As a result, 2.1 kb (blue plaque) in lanes 1, 2.1 kb and 0.8 kb DNA (white plaque in lanes 2, 3 and 4) were obtained. ) Were respectively confirmed. Therefore, the plaque containing the DNA analyzed in lane 1 was confirmed to be serial passage for the production of high titer recombinant virus. On the other hand, as shown in Figure 5, PCR of the recombinant viral DNA obtained after passage as a template, as a result, about 2.1kb of DNA in lanes of the recombinant virus passaged two times and the recombinant virus passaged three times Each was confirmed. This confirmed that the recombinant virus had a VP2 gene.

③ VP2 단백질의 발현③ Expression of VP2 Protein

VP2 단백질의 발현을 위해 상기 실시예 4의 ①에서 수득한 재조합 바이러스(P-1 viral stocks)를 가지고 고농도의 재조합 바이러스(P-2 viral stocks)를 제조하였다. 즉,Sf9 세포를 2×106이 되도록 T-25 플라스크에 부착시키고 실시예 4의 ①에서 수득한 재조합 바이러스(P-1 viral stocks)를 20㎕ 접종하여 27℃에서 3일간 배양하였다. 배양 후, 세포 및 배양액을 회수하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액, 즉 고농도의 재조합 바이러스(P-2 viral stocks)를 4℃에서 보관하였다. 그 후,Sf9 세포를 1×107이 되도록 T-75 플라스크에 부착시키고 고농도의 재조합 바이러스(P-2 viral stocks)을 MOI(multiplicity of infection) 10이 되도록 감염시켜 27℃에서 배양하면서 12시간 간격으로 배양물을 수득하였다. 배양된 세포 및 배양액을 회수하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포만 수득하였다. 회수한 세포는 ProBondTM정제 시스템(Invitrogen Co., U.S.A.)을 이용하여 단백질을 정제하였다. 즉, 회수한 세포를 8㎖의 구아니디니움 용해 완충액(Guanidinium Lysis Buffer)으로 재부유시킨 다음 3,000×g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 시료로 사용하였다. 이를 변성 결합 완충액(Denaturing Binding Buffer)로 세척한 레진(resin)이 들어있는 컬럼에 넣어 실온에서 30분간반응시킨 후, 800×g 에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 레진을 4㎖의 변성 결합 완충액으로 재부유 시켰다. 이를 다시 800×g 에서 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 4㎖의 세척 완충액(pH 6.0)으로 재부유 시켜 800×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 최종적으로 4㎖ 세척 완충액(pH 5.3)으로 재부유 시키고 원심분리한 후, 5㎖의 변성 용리 완충액 (Denaturing Elution Buffer)를 첨가하여 분획하였다. 이를 투석망에 넣어 10mM 트리스(Tris, pH8.0), 0.1 % 트리톤 X-100(Triton X-100)를 첨가하고 4℃로 하여 하룻밤 동안 방치한 후, 요소를 제거하여 VP2 단백질을 수득하였고 이를 전기영동으로 확인하였다. 상기 VP2 단백질의 크기는 45kDa 및 65kDa 단백질 마커(Promega Co., U.S.A.)로 확인할 수 있었다.A high concentration of recombinant virus (P-2 viral stocks) was prepared using the recombinant virus (P-1 viral stocks) obtained in ① of Example 4 for expression of the VP2 protein. That is, Sf 9 cells were attached to a T-25 flask to be 2 × 10 6 , and 20 μl of the recombinant virus (P-1 viral stocks) obtained in ① of Example 4 was inoculated and incubated at 27 ° C. for 3 days. After incubation, cells and cultures were collected and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to store supernatant, ie, high concentration of recombinant virus (P-2 viral stocks) at 4 ° C. Subsequently, Sf 9 cells were attached to T-75 flasks to 1 × 10 7 and infected with high concentrations of recombinant virus (P-2 viral stocks) to a multiplicity of infection (MOI) 10 and incubated at 27 ° C. for 12 hours. Cultures were obtained at intervals. The cultured cells and cultures were recovered and centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to obtain only cells. The recovered cells were purified using a ProBond ™ purification system (Invitrogen Co., USA). In other words, the recovered cells were resuspended in 8 ml of Guaniidinium Lysis Buffer, and then centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes to use the supernatant as a sample. This was added to a column containing resin washed with a Denaturing Binding Buffer and reacted at room temperature for 30 minutes, followed by centrifugation at 800 × g for 5 minutes to remove the supernatant, and the resin to 4 ml of denaturation. Resuspend with binding buffer. This was again centrifuged at 800 × g for 5 minutes to discard the supernatant and resuspended with 4 ml of wash buffer (pH 6.0) to remove the supernatant by centrifugation at 800 × g for 5 minutes. Finally it was resuspended with 4 ml wash buffer (pH 5.3) and centrifuged and fractionated by the addition of 5 ml Denaturing Elution Buffer. 10 mM Tris (pH 8.0) and 0.1% Triton X-100 were added to the dialysis network and allowed to stand at 4 ° C. overnight, after which urea was removed to obtain VP2 protein. It was confirmed by electrophoresis. The size of the VP2 protein was confirmed by 45kDa and 65kDa protein markers (Promega Co., USA).

도 6에 나타낸 바와 같이,Sf9 세포에 고농도의 재조합 바이러스(P-2 viral stocks)를 감염시켜 수득한 개 파보바이러스 VP2 단백질을 전기영동하여 확인한 결과, 72시간이 경과한 후에 많은 양의 단백질이 발현되었다. 그러나 96, 120시간이 경과한 후에는 오히려 감소하는 경향이 나타났다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 발현된 단백질이 VP2임을 확인하기 위하여 모노클로날 항체(anti-Xpress™ antibody, Invitrogen Co., U.S.A.)를 이용하여 웨스턴 블럿(Western blot)을 수행한 결과, 약 65kDa의 위치에서 단백질이 나타났다.As shown in FIG. 6, electrophoresis of the dog parvovirus VP2 protein obtained by infecting Sf 9 cells with a high concentration of recombinant virus (P-2 viral stocks) resulted in a large amount of protein after 72 hours. Expressed. However, after 96 and 120 hours, it tended to decrease. In addition, as shown in FIG. 7, Western blot was performed using a monoclonal antibody (anti-Xpress ™ antibody, Invitrogen Co., USA) to confirm that the expressed protein was VP2. The protein appeared at the position of 65 kDa.

실시예 5Example 5

개 파보바이러스 VP2 재조합 단백질의 발현Expression of Canine Parvovirus VP2 Recombinant Protein

실시예 3의 VP2 단편 유전자를 발현 벡터에 삽입하여 이를 대장균에 형질전환시켜 VP2 재조합 단백질을 제조하였다.The VP2 fragment gene of Example 3 was inserted into an expression vector and transformed into E. coli to prepare a VP2 recombinant protein.

① 발현 벡터의 제작① Construction of Expression Vector

상기 실시예 3에서 제조한 7개의 VP2 단편 유전자(CPV2a, CPV2b, CPV2c, CPV2d, CPV2e, CPV2f, CPV2g)를 각각 pGEM-T(Promega Co., U.S.A.)에 삽입시켜 숙주세포인 대장균 JM109에 형질전환 시킨 후 플라스미드를 분리하였다. 분리된 7개의 VP2 단편 유전자를 각각 포함하는 플라스미드를 제한 효소BamHI 과SalI으로 절단하여 340bp(CPV2a), 300bp(CPV2b), 244bp(CPV2c) 256bp(CPV2d), 157bp(CPV2e), 208bp(CPV2f) 및 376bp(CPV2g)의 VP2 단편 유전자로 분리하였고, 이를 상기 동일한 제한효소로 절단하여 준비한 GST를 코딩하는 서열을 갖는 발현 벡터인 pGEX-4T(Promega Co., U.S.A.)에 삽입하여 전기영동으로 확인하였다(참조: 도 8). 이를 대장균 JM109에 형질전환시켜 양성클론을 선택하였다.Seven VP2 fragment genes (CPV2a, CPV2b, CPV2c, CPV2d, CPV2e, CPV2f, CPV2g) prepared in Example 3 were inserted into pGEM-T (Promega Co., USA) to transform E. coli JM109 as a host cell. After the plasmid was separated. Plasmids containing each of the seven isolated VP2 fragment genes were digested with restriction enzymes Bam HI and Sal I and then 340bp (CPV2a), 300bp (CPV2b), 244bp (CPV2c) 256bp (CPV2d), 157bp (CPV2e), and 208bp (CPV2f). ) And 376 bp (CPV2g) of VP2 fragment gene, which was inserted into pGEX-4T (Promega Co., USA), an expression vector having a sequence encoding GST prepared by cleaving with the same restriction enzyme, and confirmed by electrophoresis. (See FIG. 8). This was transformed into E. coli JM109 to select a positive clone.

② VP2 재조합 단백질의 발현② Expression of VP2 recombinant protein

상기 실시예 5의 ②에서 선택된 양성클론을 취하여 10㎖의 LB 배양액(LB broth, DUCHEFA Co., Netherland)에 접종한 후, 하룻밤 동안 37℃에서 진탕 배양하였다. 준비된 100㎖의 LB 배양액에 밤새 배양된 세균을 접종하여 흡광도(A600)가0.6이 되도록 진탕 배양하고 여기에 0.5mM의 IPTG(isopropyl-??-D-thio-galactopyranoside)를 가한 후 4시간 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 균주를 회수한 후, 용해 완충액(100mM 인산화나트륨(NaH2PO4), 10mM 트리스-염소(Tris-Cl), pH 8.0)로 재부유시킨 다음 용해된 세균을 10,000×g에서 20분동안 원침시켜 상층액을 제거하고 침전물로부터 7개의 VP2 재조합 단백질을 수득하였다. 수득된 단백질을 웨스턴 블럿으로 확인하였다The positive clone selected in ② of Example 5 was taken and inoculated into 10 ml of LB broth (LB broth, DUCHEFA Co., Netherland), followed by incubation at 37 ° C. overnight. Inoculate the cultured bacteria overnight in the prepared 100ml LB broth to shake the absorbance (A 600 ) to 0.6 and add 0.5 mM IPTG (isopropyl-??-D-thio-galactopyranoside) to the culture for 4 hours It was. The strain was recovered using a centrifuge, then resuspended in lysis buffer (100 mM sodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), 10 mM Tris-chlorine (Tris-Cl), pH 8.0) and the lysed bacteria at 10,000 × g. The supernatant was removed by centrifugation for 20 minutes and seven VP2 recombinant proteins were obtained from the precipitate. The obtained protein was confirmed by Western blot.

도 9에 나타낸 바와 같이, 레빗 항-GST(Amersham Pharmacia Co., U.S.A.)를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과, 7개의 VP2 재조합 단백질의 발현을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 9, Western blot was performed using Levitt anti-GST (Amersham Pharmacia Co., U.S.A.), and the expression of seven VP2 recombinant proteins was confirmed.

실시예 6Example 6

항혈청의 제조Preparation of Antisera

상기 실시예 4 및 5에서 발현시킨 VP2 단백질, VP2 재조합 단백질 및 개 파보바이러스의 항혈청을 제조하기 위해 뉴질렌드 화이트 레빗(New Zealand white rabbit) 10마리에 상기 단백질을 각각 주입하였다. 즉, 발현된 단백질 8종(VP2 단백질, CPV2a 단백질, CPV2b 단백질, CPV2c 단백질, CPV2d 단백질, CPV2e 단백질, CPV2f 단백질 및 CPV2g 단백질) 및 개 파보바이러스를 각각 프러인드스 컴플리트 어쥬번트(Freund's complete adjuvant, Sigma Chemical. Co., U.S.A.)와 동량으로혼합하여 유화시켰다. 8개의 단백질 각각을 유화시킨 유화액은 150㎍, 개 파보바이러스를 유화시킨 유화액은 1㎖로 하여 레빗의 4곳의 근육에 주사하여 1차 접종하였으며, 추가접종은 1차 접종 후 3주 간격으로 프러인드스 인컴플리트 어쥬번트로 유화하여 1차 접종과 동일한 방법으로 총 2회 실시하였다. 그 후, 각 레빗의 혈청을 채혈하여 분리한 후, 이를 -20℃에 저장하여 사용하였다. 한편, 대조군 실험을 위해 일반 개 혈청 및 개 파보바이러스에 감염된 개 혈청도 확보하였다.To prepare antiserum of VP2 protein, VP2 recombinant protein and canine parvovirus expressed in Examples 4 and 5, 10 New Zealand white rabbits were injected with the protein, respectively. That is, eight expressed proteins (VP2 protein, CPV2a protein, CPV2b protein, CPV2c protein, CPV2d protein, CPV2e protein, CPV2f protein and CPV2g protein) and canine parvoviruses were respectively found in Freund's complete adjuvant, Sigma. Chemical. Co., USA) and mixed in the same amount to emulsify. 150 µg of each of the eight proteins was emulsified, and 1 ml of the canine parvovirus was emulsified. Emulsification with Inds incomplete adjuvant was performed twice in the same manner as the first inoculation. Thereafter, the serum of each rabbit was collected and separated, which was then stored and used at -20 ° C. Meanwhile, normal dog serum and dog serum infected with dog parvovirus were also obtained for control experiments.

실시예 7Example 7

항혈청을 이용한 웨스턴 블럿 분석Western blot analysis using antiserum

상기 실시예 4 및 실시예 5에서 발현시킨 VP2 단백질 및 7개의 VP2 재조합 단백질을 전기영동 한 것 또는 개 파보바이러스를 고양이 유래 신장세포(CRFK)에 72시간 동안 감염시킨 후 감염된 세포를 회수 및 파쇄하여 전기영동한 것을 웨스턴 블럿(Towbin et al. 1979.)으로 상기 실시예 6에서 제조한 항혈청과의 반응을 분석하였다. 즉, 니트로셀룰로오즈 종이(nitrocellulose paper)에 상기 단백질 및 개 파보바이러스에 감염된 고양이 유래 신장세포로부터 수득한 단백질을 블럿시킨 후, 5%의 탈지유 완충액(skim milk buffer, Carnation Co., U.S.A.)으로 1시간 30분동안 실온에서 방치하였다. 상기 실시예 6의 항혈청을 1 : 50 내지 혹은 1 : 100으로 희석하여 1차 항체로 사용하여 1시간 30분동안 반응시켰다. 2차 항체로는 알카라인 인산화효소-접합 고우트 항-레빗 면역글로불린(alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin, Jackson Co., U.S.A.)을 1 : 2,000으로 희석하여 1차 항체와 동일한 조건으로 반응시켰다. 그 후, BCIP(5-bromo-4chloro-indolyl phosphate, Sigma Chemical. Co., U.S.A.)및 NBT(ρ-nitro blue tetrazolium chloride, Sigma Chemical. Co., U.S.A.)을 사용하여 맴브레인(membrane)을 가시화 하였으며 필요에 따라 ECL 시스템 키트(A.P. Biotech Co., U.K.)를 이용하였다. 희석용액(dilution buffer)으로는 TBS-T(Tris-buffered saline - 0.05% Tween 20)를 사용하였고 모든 세척은 5분간 3회 실시하였다.After electrophoresis of the VP2 protein and the seven VP2 recombinant proteins expressed in Examples 4 and 5 or the dog parvovirus infected with cat-derived kidney cells (CRFK) for 72 hours, the infected cells were recovered and crushed. Electrophoresis was performed by Western blot (Towbin et al. 1979.) to analyze the reaction with the antiserum prepared in Example 6. That is, after blotting the nitrocellulose paper and the protein obtained from the cat-derived kidney cells infected with the dog parvovirus on the nitrocellulose paper, it was 1 hour with 5% skim milk buffer (Carnation Co., USA). It was left at room temperature for 30 minutes. The antiserum of Example 6 was diluted 1:50 to 1: 100 and used as a primary antibody for 1 hour 30 minutes. As a secondary antibody, alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin (Jackson Co., USA) was diluted 1: 2,000 and reacted under the same conditions as the primary antibody. . The membrane was then visualized using BCIP (5-bromo-4chloro-indolyl phosphate, Sigma Chemical. Co., USA) and NBT (ρ-nitro blue tetrazolium chloride, Sigma Chemical. Co., USA). ECL system kit (AP Biotech Co., UK) was used as needed. As dilution buffer, TBS-T (Tris-buffered saline-0.05% Tween 20) was used, and all washings were performed three times for 5 minutes.

도 10에 나타낸 바와 같이, 웨스턴 블럿으로 VP2 재조합 단백질에 대한 항혈청 반응을 분석한 결과, 일반 개 혈청과의 반응은 음성으로 나타났으나, VP2 단백질의 항혈청과 반응에서는 CPV2b 단백질, CPV2c 단백질, CPV2d 단백질 및 CPV2f 단백질에서 반응하였다.As shown in FIG. 10, Western blot analysis of the antiserum response to the VP2 recombinant protein showed a negative reaction with normal dog serum, but the antiserum response of the VP2 protein was CPV2b protein, CPV2c protein, CPV2d protein. And CPV2f protein.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 개 파보바이러스를 고양이 유래 신장세포에 감염시킨 후 파쇄하여 수득한 단백질을 전기영동한 것을 항혈청을 이용하여 웨스턴 블럿으로 분석한 결과, 실시예 6의 항혈청 중 일반 개 혈청을 제외하고 약 65kDa 위치에서 뚜렷한 반응을 나타내었다.In addition, as shown in FIG. 11, the protein obtained by crushing the dog parvovirus infected with cat-derived kidney cells and then electrophoresed was analyzed by Western blotting using antiserum. Except for serum, there was a clear response at about 65 kDa position.

실시예 8Example 8

항혈청의 항체가 확인Antiserum Antibody Checked

상기 실시예 6에서 제조한 항혈청의 항체가를 분석하기 위해 ELISA(효소 면역학적 분석, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)을 실시하였다.In order to analyze the antibody titer of the antiserum prepared in Example 6, an ELISA (enzyme immunological assay, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) was performed.

상기 실시예 4에서 발현시킨 VP2 단백질을 5㎍/㎖이 되도록 카보네이트-바이카보네이트 완충액(carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6)으로 희석하여 마이크로플레이트(MicrotestⅢ flexble Assay plate(Falcon 3911), B.D. Biosciences, U.S.A.)의 각 웰에 100㎕씩 넣어 4℃에서 하룻밤 동안 피복하였다. 피복이 완료된 플레이트를 세척용액(0.02M 인산 완충액, 0.13M 염화나트륨, 0.05% 트윈20, pH 7.2)으로 3회 세척한 후 5% 탈지유 용액(pH 7.3, Difco. Co., U.S.A.)을 각 웰에 175㎕씩 분주한 후 2시간 동안 실온에서 방치하였다. 5% 탈지유 용액과 세척용액(PBST, phosphate buffered saline-Tween 20)을 동량으로 섞은 희석용액을 이용하여 실시예 6의 항혈청을 각각 5,000배 희석하여 3배씩 단계적으로 희석한 후, 상기 VP2 단백질이 피복된 웰에 접종하여 37℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 2차 항체로는 알카라인 인산화효소-접합 레빗 항-치킨 면역글로불린G(AP-rabbit anti-chicken IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., U.S.A.) 또는 알카라인 인산화효소-접합 덩키 항-레빗 면역글로불린 G(AP-donkey anti-rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., U.S.A.)를 5,000배로 희석하여 37℃에서 1시간 30분동안 상기 웰에 접종하여 반응시켰다. 기질용액으로는 인산 기질 용액(Phosphate substrate tablets, ρ-nitrophenyl phosphate, Sigma Chemical. Co., U.S.A.)을 10% 디에탄올아민(diethanolamine, 0.5mM 염화마그네슘(MgCl2)포함, pH 9.8)에 녹인 용액을 사용하여 15분간 반응시켰다. 반응 억제제로는 5M 수산화나트륨(NaOH)을 사용하여 마이크로플레이트리더(microplate reader; E-Max, Molecular Devices, U.S.A.)로 405nm에서 반응을 조사하였다. 항체가는 GMT(geometric mean titer)로 나타내었다.The VP2 protein expressed in Example 4 was diluted with a carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6) to 5 µg / ml, and then a microplate (Microtest III flexble assay plate (Falcon 3911), BD Biosciences, USA) 100 μl of each well was coated at 4 ° C. overnight. The coated plate was washed three times with washing solution (0.02M phosphate buffer, 0.13M sodium chloride, 0.05% Tween20, pH 7.2) and 5% skim milk solution (pH 7.3, Difco. Co., USA) was added to each well. 175 μl was dispensed and left at room temperature for 2 hours. After diluting the antiserum of Example 6 by 5,000 times and diluting three times by 3 times using a diluted solution of 5% skim milk solution and a washing solution (PBST, phosphate buffered saline-Tween 20), the VP2 protein was coated. The wells were inoculated and reacted at 37 ° C. for 1 hour 30 minutes. Secondary antibodies include alkaline kinase-conjugated rabbit anti-chicken immunoglobulin G (AP-rabbit anti-chicken IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) or alkaline kinase-conjugated dunk anti-rabbit immunoglobulin G (AP- donkey anti-rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA) was diluted 5,000-fold and reacted by inoculating the wells at 37 ° C. for 1 hour 30 minutes. As a substrate solution, a solution obtained by dissolving Phosphate substrate tablets (ρ-nitrophenyl phosphate, Sigma Chemical. Co., USA) in 10% diethanolamine (0.5 mM magnesium chloride (MgCl 2), pH 9.8) The reaction was carried out for 15 minutes. The reaction was investigated at 405 nm with a microplate reader (E-Max, Molecular Devices, U.S.A.) using 5M sodium hydroxide (NaOH) as a reaction inhibitor. Antibody titer was expressed as GMT (geometric mean titer).

도 12에 나타낸 바와 같이, CPV2e의 항혈청에서 가장 높은 항체가(600000)를 나타내었다. 한편 VP2 단백질의 항혈청은 항체가가 450000으로 나타났으며, 나머지 단백질의 항혈청의 역가는 250000, 70000, 300000, 200000, 450000, 80000 (CPV2a, CPV2b, CPV2c, CPV2d, CPV2f, CPV2g)으로 나타났다.As shown in FIG. 12, the highest antibody titer (600000) was shown in the antiserum of CPV2e. The antiserum of VP2 protein was found to have an antibody titer of 450000, and the titers of antiserum of the remaining proteins were 250000, 70000, 300000, 200000, 450000, 80000 (CPV2a, CPV2b, CPV2c, CPV2d, CPV2f, CPV2g).

실시예 9Example 9

항혈청의 중화실험Antiserum neutralization experiment

실시예 6의 항혈청을 50배부터 4배씩 희석한 후, 준비된 개 파보바이러스와 동량으로 혼합하여 37℃에서 1시간 30분동안 중화반응을 유도하였다. 상기 혼합액을 96-웰 플레이트의 1×104의 농도로 단층 배양된 고양이 유래 신장세포에 분주하여 세포와의 흡착반응을 37℃에서 1시간동안 유도한 후, 바이러스 용액을 제거하였다. 이에 신선한 개 파보바이러스 배양액을 분주하여 37℃, CO25% 조건에서 3일간 배양하였다. PBS로 상기 플레이트를 세척한 후 80% 아세톤으로 실온에서 20분간 고정하였고 1시간 동안 실온에서 방치하였다. 상기 플레이트에서 항혈청과 개 파보바이러스의 결합을 확인하기 위해서 개 파보바이러스에 감염된 개 혈청을 1차 항체로 이용하였으며, 2차 항체로는 FITC(fluorescein isothiocyanate)-항-레빗 면역글로불린 G를 이용하였다.After diluting the antiserum of Example 6 from 50 to 4 times, it was mixed with the prepared dog parvovirus in the same amount to induce neutralization reaction at 37 ° C. for 1 hour and 30 minutes. The mixed solution was dispensed to cat-derived kidney cells cultured monolayer at a concentration of 1 × 10 4 in a 96-well plate to induce an adsorption reaction with the cells at 37 ° C. for 1 hour, and then the virus solution was removed. The fresh dog parvovirus culture was dispensed and cultured for 3 days at 37 ° C. and 5% CO 2 . The plates were washed with PBS and then fixed with 80% acetone for 20 minutes at room temperature and left at room temperature for 1 hour. In order to confirm the binding of antiserum and canine parvovirus on the plate, dog serum infected with canine parvovirus was used as a primary antibody, and fluorescein isothiocyanate (FITC) -anti-rabbit immunoglobulin G was used as a secondary antibody.

중화실험 분석수치로 사용할 바이러스의 적정농도를 Karber 방법으로 TCID50(50% Tissue Culture Infection Does)을 조사하는 하기 수학식 1로 계산하였다. 예를 들어, 중화실험 분석수치가 200이면 항혈청을 200배 희석할 때까지 항혈청이 바이러스에 대해 중화효과가 있다는 희석배수인 것이다.The titer of virus to be used as an analysis value of neutralization experiment was calculated by the following equation 1 to investigate TCID 50 (50% Tissue Culture Infection Does) by Karber method. For example, if the analysis value of the neutralization experiment is 200, the antiserum has a neutralizing effect on the virus until the antiserum is diluted 200 times.

t* : 희석배수 중 세포병변효과(CPE)를 나타내는 최종 희석배수t *: final dilution factor showing the cytopathic effect (CPE) in the dilution factor

Δt : (t*에서 감염된 웰 수 + t*이상의 희석배수에서 감염된 웰 수)-1/2Δt: (number of wells infected at t * + number of wells infected at dilutions greater than t *)

하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 7개의 VP2 재조합 단백질의 항혈청 중 항-CPV2e에서 가장 좋은 중화성적을 나타내었다.As shown in Table 2 below, among the antiserum of the seven VP2 recombinant proteins, the best neutralization score was shown in anti-CPV2e.

항혈청의 중화실험Antiserum neutralization experiment 항혈청Antiserum GMT(×1000)GMT (× 1000) VP2 단백질과항혈청의 반응Response of VP2 Protein to Antiserum 중화실험 분석Neutralization experiment analysis 대조군Control -- <50<50 VP2 단백질VP2 Protein 450450 ++ 5050 항-CPV2aAnti-CPV2a 250250 ++ <50<50 항-CPV2cAnti-CPV2c 300300 ++ <50<50 항-CPV2dAnti-CPV2d 200200 ++ 200200 항-CPV2eAnti-CPV2e 600600 ++ 800800 항-CPV2fAnti-CPV2f 450450 ++ 200200 일반 개 혈청Normal dog serum -- <50<50 개 파보바이러스에감염된 개 혈청Dog Serum Infected with Canine Parvovirus ++ 1,6001,600

본 발명은 개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포, 상기 단백질을 포함하는 백신 및 상기 단백질을 이용하여 제조된 난황항체를 포함하는 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 조성물에 관한 것으로, 중화항원 결정기를 포함하는 개 파보바이러스 VP2 재조합 단백질을 제조하여 이를 이용한 백신 등의 개발에 응용될 수 있으며, 개 파보바이러스에 의한 감염증을 보다 효율적으로 치료 또는 예방할 수 있다.The present invention provides a VP2 recombinant protein comprising a canine parvovirus neutralizing antigen determinant, a gene encoding the protein, an expression vector comprising the gene, a host cell transformed with the expression vector, a vaccine comprising the protein and the protein. The present invention relates to a composition for treating or preventing a canine parvovirus infection including an egg yolk antibody prepared by using the same, and can be applied to the development of a vaccine using a canine parvovirus VP2 recombinant protein including a neutralizing antigenic determinant. In addition, the infection caused by canine parvovirus can be more effectively treated or prevented.

<110> DAN Biotech <120> Recombinant VP2 Protein Comprising Canine Parvovirus Neutralization Antigen Epitope And Vaccine Composition Comprising The Same <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2aF <400> 1 ctggatccag tgatggagca gttcaa 26 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2aR <400> 2 ctgtcgactt accaaggtgt tacaatttgt gc 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2bF <400> 3 ctggatcctc attggctgat gcaaatgc 28 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2bR <400> 4 ctgtcgactt atatggttgg tttccatgga ta 32 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2cF <400> 5 ctggatcccc aactccatgg agatatta 28 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2cR <400> 6 ctgtcgactt attgccatgt atgtgttagt c 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2dF <400> 7 ctggatccac aaatagagca ttgggctta 29 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2dR <400> 8 ctgtcgactt atcctgctgc aataggtgtt tta 33 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2eF <400> 9 ctggatccgc gcaaacagat gaaaatcaa 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2eR <400> 10 ctgtcgactt atggatatct tcctgtatc 29 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2fF <400> 11 ctggatccga aggagattgg attcaa 26 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2fR <400> 12 ctgtcgactt atggttttaa gtcagtatc 29 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2gF <400> 13 ctggatccag acttcatgta aatgcacc 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2gR <400> 14 ctgtcgacct aggtgctagt tgatatg 27 <210> 15 <211> 1748 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> gene <222> (1)..(1748) <223> Canine Parvovirus of full length VP2 gene <400> 15 atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60 acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120 tctacgggta ctttcaataa tcagacagaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180 atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240 agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300 actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360 tttaatccag gagattggca actaattgtt aacactatga gtgagttgca tttagttagt 420 tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480 ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagcaat 540 aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600 aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660 tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720 gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780 tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840 acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900 actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960 aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020 ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080 cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140 ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200 atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260 aaccttcctg taacaaatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320 ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380 ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440 agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500 aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560 attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620 gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680 tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaag attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740 agaaataa 1748 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(333) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2a <400> 16 ggatcc atg agt gat gga gca gtt caa cca gac ggt ggt caa cct gct 48 Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala 1 5 10 gtc aga aat gaa aga gct aca gga tct ggg aac ggg tct gga ggc ggg 96 Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly 15 20 25 30 ggt ggt ggt ggt tct ggg ggt gtg ggg att tct acg ggt act ttc aat 144 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn 35 40 45 aat cag aca gaa ttt aaa ttt ttg gaa aac gga tgg gtg gaa atc aca 192 Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr 50 55 60 gca aac tca agc aga ctt gta cat tta aat atg cca gaa agt gaa aat 240 Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn 65 70 75 tat aga aga gtg gtt gta aat aat ttg gat aaa act gca gtt aac gga 288 Tyr Arg Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly 80 85 90 aac atg gct tta gat gat act cat gca caa att gta aca cct tgg 333 Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp 95 100 105 gtcgac 339 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 17 Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg 1 5 10 15 Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln 35 40 45 Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn 50 55 60 Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg 65 70 75 80 Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met 85 90 95 Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp 100 105 <210> 18 <211> 297 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(291) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2b <400> 18 ggatcc tca ttg gtt gat gca aat gct tgg gga gtt tgg ttt aat cca 48 Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro 1 5 10 gga gat tgg caa cta att gtt aac act atg agt gag ttg cat tta gtt 96 Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val 15 20 25 30 agt ttt gaa caa gaa att ttt aat gtt gtt tta aag act gtt tca gaa 144 Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu 35 40 45 tct gct act cag cca cca act aaa gtt tat aat aat gat tta act gca 192 Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala 50 55 60 tca ttg atg gtt gca tta gat agc aat aat act atg cca ttt act cca 240 Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro 65 70 75 gca gct atg aga tct gag aca ttg ggt ttt tat cca tgg aaa cca acc 288 Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr 80 85 90 ata gtcgac 297 Ile 95 <210> 19 <211> 95 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 19 Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp 1 5 10 15 Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe 20 25 30 Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala 35 40 45 Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu 50 55 60 Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala 65 70 75 80 Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile 85 90 95 <210> 20 <211> 240 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(234) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2c <400> 20 ggatcc cca act cca tgg aga tat tat ttt caa tgg gat aga aca tta 48 Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu 1 5 10 ata cca tct cat act gga act agt ggc aca cca aca aat ata tac cat 96 Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His 15 20 25 30 ggt aca gat cca gat gat gtt caa ttt tat act att gaa aat tct gtg 144 Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val 35 40 45 cca gta cac tta cta aga aca ggt gat gaa ttt gct aca gga aca ttt 192 Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe 50 55 60 ttt ttt gat tgt aaa cca tgt aga cta aca cat aca tgg caa gtcgac 234 Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln 65 70 75 gtcgac 240 <210> 21 <211> 76 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 21 Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro 1 5 10 15 Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val 35 40 45 His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe 50 55 60 Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln 65 70 75 <210> 22 <211> 252 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(246) <223> Nucleotides Sequence of CPV capcid Segment gene CPV2d <400> 22 ggatcc aca aat aga gca ttg ggc tta cca cca ttt cta aat tct ttg 48 Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu 1 5 10 cct caa gct gaa gga ggt act aac ttt ggt tat ata gga gtt caa caa 96 Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln 15 20 25 30 gat aaa aga cgt ggt gta act caa atg gga aat aca aac tat att act 144 Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr 35 40 45 gaa gct act att atg aga cca gct gag gtt ggt tat agt gca cca tat 192 Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr 50 55 60 tat tct ttt gag gcg tct aca caa ggg cca ttt aaa aca cct att gca 240 Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala 65 70 75 gca gga gtcg ac 252 Ala Gly 80 <210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 23 Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys 20 25 30 Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala 35 40 45 Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser 50 55 60 Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly 65 70 75 80 <210> 24 <211> 153 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(147) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2e <400> 24 ggatcc gcg caa aca gat gaa aat caa gca gca gat ggt gat cca aga 48 Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg 1 5 10 tat gca ttt ggt aga caa cat ggt caa aaa act acc aca aca gga gaa 96 Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu 15 20 25 30 aca cct gag aga ttt aca tat ata gca cat caa gat aca gga aga tat 144 Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 cca gtc gac 153 Pro <210> 25 <211> 47 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 25 Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala 1 5 10 15 Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro 20 25 30 Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro 35 40 45 <210> 26 <211> 222 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(216) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2f <400> 26 ggatcc gaa gga gat tgg att caa aat att aac ttt aac ctt cct gta 48 Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val 1 5 10 aca aat gat aat gta ttg cta cca aca gat cca att gga ggt aaa aca 96 Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr 15 20 25 30 gga att aac tat act aat ata ttt aat act tat ggt cct tta act gca 144 Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala 35 40 45 tta aat aat gta cca cca gtt tat cca aat ggt caa att tgg gat aaa 192 Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys 50 55 60 gaa ttt gat act gac tta aaa cca gtcg ac 222 Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro 65 70 <210> 27 <211> 70 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 27 Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn 1 5 10 15 Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile 20 25 30 Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn 35 40 45 Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe 50 55 60 Asp Thr Asp Leu Lys Pro 65 70 <210> 28 <211> 317 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS <222> (7)..(309) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2g <400> 28 ggatcc aga ctt cat gta aat gca cca ttt gtt tgt caa aat aat tgt 48 Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys 1 5 10 cct ggt caa tta ttt gta aaa gtt gcg cct aat tta aca aat gaa tat 96 Pro Gly Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr 15 20 25 30 gat cct gat gca tct gct aat atg tca aga att gta act tac tca gat 144 Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 ttt tgg tgg aaa ggt aaa tta gta ttt aaa gct aaa cta aga gcc tct 192 Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser 50 55 60 cat act tgg aat cca att caa caa atg agt att aat gta gat aac caa 240 His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln 65 70 75 ttt aac tat gta cca agt aat att gga ggt atg aag att gta tat gaa 288 Phe Asn Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu 80 85 90 aaa tct caa cta gca cct aga a agtcgac 317 Lys Ser Gln Leu Ala Pro Arg 95 100 <210> 29 <211> 101 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 29 Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly 1 5 10 15 Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp 35 40 45 Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr 50 55 60 Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn 65 70 75 80 Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser 85 90 95 Gln Leu Ala Pro Arg 100 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 tttactgttt tcgtaacagt tttg 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 caacaacgca cagaatctag c 21<110> DAN Biotech <120> Recombinant VP2 Protein Comprising Canine Parvovirus          Neutralization Antigen Epitope And Vaccine Composition Comprising          The Same <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2aF <400> 1 ctggatccag tgatggagca gttcaa 26 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2aR <400> 2 ctgtcgactt accaaggtgt tacaatttgt gc 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2bF <400> 3 ctggatcctc attggctgat gcaaatgc 28 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2bR <400> 4 ctgtcgactt atatggttgg tttccatgga ta 32 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer CPV2cF <400> 5 ctggatcccc aactccatgg agatatta 28 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2cR <400> 6 ctgtcgactt attgccatgt atgtgttagt c 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2dF <400> 7 ctggatccac aaatagagca ttgggctta 29 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2dR <400> 8 ctgtcgactt atcctgctgc aataggtgtt tta 33 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2eF <400> 9 ctggatccgc gcaaacagat gaaaatcaa 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2eR <400> 10 ctgtcgactt atggatatct tcctgtatc 29 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2fF <400> 11 ctggatccga aggagattgg attcaa 26 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2fR <400> 12 ctgtcgactt atggttttaa gtcagtatc 29 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2gF <400> 13 ctggatccag acttcatgta aatgcacc 28 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer CPV2gR <400> 14 ctgtcgacct aggtgctagt tgatatg 27 <210> 15 <211> 1748 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> gene (222) (1) .. (1748) <223> Canine Parvovirus of full length VP2 gene <400> 15 atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60 acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120 tctacgggta ctttcaataa tcagacagaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180 atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattataga 240 agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300 actcatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360 tttaatccag gagattggca actaattgtt aacactatga gtgagttgca tttagttagt 420 tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480 ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagcaat 540 aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600 aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660 tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720 gttcaatttt atactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780 tttgctacag gaacattttt ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840 acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900 actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960 aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020 ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080 cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140 ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200 atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260 aaccttcctg taacaaatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320 ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380 ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440 agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500 aaagttgcgc ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560 attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620 gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatta atgtagataa ccaatttaac 1680 tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaag attgtatatg aaaaatctca actagcacct 1740 agaaataa 1748 <210> 16 <211> 339 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (333) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2a <400> 16 ggatcc atg agt gat gga gca gtt caa cca gac ggt ggt caa cct gct 48            Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala              1 5 10 gtc aga aat gaa aga gct aca gga tct ggg aac ggg tct gga ggc ggg 96 Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly  15 20 25 30 ggt ggt ggt ggt tct ggg ggt gtg ggg att tct acg ggt act ttc aat 144 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn                  35 40 45 aat cag aca gaa ttt aaa ttt ttg gaa aac gga tgg gtg gaa atc aca 192 Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr              50 55 60 gca aac tca agc aga ctt gta cat tta aat atg cca gaa agt gaa aat 240 Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn          65 70 75 tat aga aga gtg gtt gta aat aat ttg gat aaa act gca gtt aac gga 288 Tyr Arg Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly      80 85 90 aac atg gct tta gat gat act cat gca caa att gta aca cct tgg 333 Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp  95 100 105    gtcgac 339 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 17 Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg   1 5 10 15 Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly              20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln          35 40 45 Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn      50 55 60 Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg  65 70 75 80 Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met                  85 90 95 Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp             100 105 <210> 18 <211> 297 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (291) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2b <400> 18 ggatcc tca ttg gtt gat gca aat gct tgg gga gtt tgg ttt aat cca 48            Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro              1 5 10 gga gat tgg caa cta att gtt aac act atg agt gag ttg cat tta gtt 96 Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val  15 20 25 30 agt ttt gaa caa gaa att ttt aat gtt gtt tta aag act gtt tca gaa 144 Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu                  35 40 45 tct gct act cag cca cca act aaa gtt tat aat aat gat tta act gca 192 Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala              50 55 60 tca ttg atg gtt gca tta gat agc aat aat act atg cca ttt act cca 240 Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro          65 70 75 gca gct atg aga tct gag aca ttg ggt ttt tat cca tgg aaa cca acc 288 Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr      80 85 90 ata gtcgac 297 Ile  95 <210> 19 <211> 95 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 19 Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp   1 5 10 15 Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe              20 25 30 Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala          35 40 45 Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu      50 55 60 Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala  65 70 75 80 Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile                  85 90 95 <210> 20 <211> 240 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (234) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2c <400> 20 ggatcc cca act cca tgg aga tat tat ttt caa tgg gat aga aca tta 48            Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu              1 5 10 ata cca tct cat act gga act agt ggc aca cca aca aat ata tac cat 96 Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His  15 20 25 30 ggt aca gat cca gat gat gtt caa ttt tat act att gaa aat tct gtg 144 Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val                  35 40 45 cca gta cac tta cta aga aca ggt gat gaa ttt gct aca gga aca ttt 192 Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe              50 55 60 ttt ttt gat tgt aaa cca tgt aga cta aca cat aca tgg caa gtcgac 234 Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln          65 70 75     gtcgac 240 <210> 21 <211> 76 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 21 Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro   1 5 10 15 Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr              20 25 30 Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val          35 40 45 His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe      50 55 60 Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln  65 70 75 <210> 22 <211> 252 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (246) <223> Nucleotides Sequence of CPV capcid Segment gene CPV2d <400> 22 ggatcc aca aat aga gca ttg ggc tta cca cca ttt cta aat tct ttg 48            Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu              1 5 10 cct caa gct gaa gga ggt act aac ttt ggt tat ata gga gtt caa caa 96 Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln  15 20 25 30 gat aaa aga cgt ggt gta act caa atg gga aat aca aac tat att act 144 Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr                  35 40 45 gaa gct act att atg aga cca gct gag gtt ggt tat agt gca cca tat 192 Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr              50 55 60 tat tct ttt gag gcg tct aca caa ggg cca ttt aaa aca cct att gca 240 Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala          65 70 75 gca gga gtcg ac 252 Ala gly      80 <210> 23 <211> 80 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 23 Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln   1 5 10 15 Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys              20 25 30 Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala          35 40 45 Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser      50 55 60 Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly  65 70 75 80 <210> 24 <211> 153 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (147) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2e <400> 24 ggatcc gcg caa aca gat gaa aat caa gca gca gat ggt gat cca aga 48            Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg              1 5 10 tat gca ttt ggt aga caa cat ggt caa aaa act acc aca aca gga gaa 96 Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu  15 20 25 30 aca cct gag aga ttt aca tat ata gca cat caa gat aca gga aga tat 144 Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr                  35 40 45 cca gtc gac 153 Pro <210> 25 <211> 47 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 25 Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala   1 5 10 15 Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro              20 25 30 Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro          35 40 45 <210> 26 <211> 222 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (216) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2f <400> 26 ggatcc gaa gga gat tgg att caa aat att aac ttt aac ctt cct gta 48            Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val              1 5 10 aca aat gat aat gta ttg cta cca aca gat cca att gga ggt aaa aca 96 Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr  15 20 25 30 gga att aac tat act aat ata ttt aat act tat ggt cct tta act gca 144 Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala                  35 40 45 tta aat aat gta cca cca gtt tat cca aat ggt caa att tgg gat aaa 192 Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys              50 55 60 gaa ttt gat act gac tta aaa cca gtcg ac 222 Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro          65 70 <210> 27 <211> 70 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 27 Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn   1 5 10 15 Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile              20 25 30 Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn          35 40 45 Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe      50 55 60 Asp Thr Asp Leu Lys Pro  65 70 <210> 28 <211> 317 <212> DNA <213> canine parvovirus <220> <221> CDS (222) (7) .. (309) <223> Nucleotides Sequence of CPV VP2 Segment gene CPV2g <400> 28 ggatcc aga ctt cat gta aat gca cca ttt gtt tgt caa aat aat tgt 48            Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys              1 5 10 cct ggt caa tta ttt gta aaa gtt gcg cct aat tta aca aat gaa tat 96 Pro Gly Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr  15 20 25 30 gat cct gat gca tct gct aat atg tca aga att gta act tac tca gat 144 Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp                  35 40 45 ttt tgg tgg aaa ggt aaa tta gta ttt aaa gct aaa cta aga gcc tct 192 Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser              50 55 60 cat act tgg aat cca att caa caa atg agt att aat gta gat aac caa 240 His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln          65 70 75 ttt aac tat gta cca agt aat att gga ggt atg aag att gta tat gaa 288 Phe Asn Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu      80 85 90 aaa tct caa cta gca cct aga a agtcgac 317 Lys Ser Gln Leu Ala Pro Arg  95 100 <210> 29 <211> 101 <212> PRT <213> canine parvovirus <400> 29 Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly   1 5 10 15 Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro              20 25 30 Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp          35 40 45 Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr      50 55 60 Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn  65 70 75 80 Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser                  85 90 95 Gln Leu Ala Pro Arg             100 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 tttactgttt tcgtaacagt tttg 24 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 caacaacgca cagaatctag c 21

Claims (14)

개 파보바이러스 중화항원 결정기를 포함하는 VP2 재조합 단백질.VP2 recombinant protein comprising a canine parvovirus neutralizing antigenic determinant. 제 1항에 있어서, 상기 중화항원 결정기를 포함하는 단백질이 서열번호 17번; 서열번호 19번; 서열번호 21번; 서열번호 23번; 서열번호 25번; 서열번호 27번; 및 서열번호 29번으로 이루어진 아미노산 서열중에서 선택된 어느 하나를 포함함을 특징으로 하는 VP2 재조합 단백질.According to claim 1, wherein the protein comprising a neutralizing antigen determinant is SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27; And an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 29. 11. 제 1항 또는 제 2항에 따른 VP2 재조합 단백질을 코딩하는 유전자.The gene encoding the VP2 recombinant protein according to claim 1. 제 3항에 따른 VP2 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.An expression vector comprising a gene encoding a VP2 recombinant protein according to claim 3. 제 4항에 있어서, 발현 벡터가 pGEM-4T임을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.The recombinant expression vector of claim 4, wherein the expression vector is pGEM-4T. 제 4항 또는 제 5항에 따른 발현 벡터로 형질전환되는 숙주세포.A host cell transformed with the expression vector according to claim 4. 제 6항에 있어서, 상기 숙주 세포가 대장균임을 특징으로 하는 숙주세포.The host cell of claim 6, wherein the host cell is Escherichia coli. ⒜ 제 3항에 따른 유전자를 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키는 단계;삽입 inserting the gene according to claim 3 into a vector comprising one or more expression control sequences operatively linked to regulate their expression; ⒝ ⒜로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및Transforming the host cell with a recombinant expression vector formed from VII; And ⒞ 생성된 형질전환체를 제 3항에 따른 유전자가 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 실질적으로 순수한 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 VP2 재조합 단백질의 제조방법.Iii) culturing the resulting transformant under appropriate medium and conditions so that the gene according to claim 3 is expressed, and recovering substantially pure protein from the culture. 제 1항 또는 제 2항에 따른 VP2 재조합 단백질을 산란계에 투여하여 면역화시키고, 면역화된 산란계로부터 산란된 알을 회수한 다음, 회수된 알의 난황으로부터 분리함을 특징으로 하는 VP2 재조합 단백질에 대한 난황항체 제조방법.Egg yolk for VP2 recombinant protein, characterized in that the VP2 recombinant protein according to claim 1 or 2 is administered to a laying hen for immunization, the eggs laid from the immunized laying hen are recovered and separated from the egg yolk of the recovered eggs. Antibody Production Method. 제 1항 또는 제 2항에 따른 VP2 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증의 치료 또는 예방을 위한 백신 조성물.A vaccine composition for the treatment or prevention of canine parvovirus infection comprising the recombinant VP2 protein according to claim 1 as an active ingredient. 제 9항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.A pharmaceutical composition for treating or preventing canine parvovirus infection, comprising the yolk antibody according to claim 9 as an active ingredient. 제 9항에 따른 난황항체를 유효성분으로 포함하는 개 파보바이러스 감염증을치료 또는 예방하기 위한 사료 조성물.Feed composition for the treatment or prevention of canine parvovirus infection comprising the yolk antibody according to claim 9. 제 10항에 따른 백신 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.A method of treating or preventing canine parvovirus infection by administering the vaccine composition according to claim 10 to an animal other than a human. 제 11항에 따른 약학 조성물을 인간을 제외한 동물에 투여함으로써 개 파보바이러스 감염증을 치료 또는 예방하는 방법.A method for treating or preventing canine parvovirus infection by administering the pharmaceutical composition according to claim 11 to an animal other than a human.
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