KR20050007540A - 바이오필름의 평가 방법 - Google Patents
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Abstract
a) 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기적 방사선의 빔을 형성하기 위한 방사원 시스템; b) 물체의 하나 이상의 평면 상에 상기 빔을 배향하고 초점을 맞추는 광학적 시스템; c) 상기 물체로부터 방사된 전자기적 방사선을 검출하여 영상 데이터를 생성하기 위한 검출 장치; 및 d) 상기 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 물체를 주사하기 위한 주사 시스템을 포함하는 공초점 영상 시스템을 이용하여 복수의 표면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위하여, i) 상기 바이오필름을 상기 복수의 표면 상에 성장시키고; ii) 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 바이오필름을 주사하여 복수의 영상을 생성시킴으로써 바이오필름 내 1종 이상의 형광 잔기의 존재를 검출하고; iii) 상기 영상을 컴퓨터 소프트 웨어의 제어 하에 데이터 처리 시스템으로 분석하여 바이오필름의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 표면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위한 자동화된 방법.
Description
미생물 바이오필름은 다당류로 된 세포외 매트릭스 내에 통상적으로 삽입된, 표면 또는 계면에 부착되는 균질 또는 불균질 미생물 개체군으로 구성된다(Costerton 등, 1995, Annual Review of Microbiology, 41, 435-464). 이러한 바이오필름은 거의 모든 젖은 표면 상에 신속하게 형성되어 환경에서 미생물의 군체형성의 통상적인 방식을 나타낼 수 있다(Wood 등, 2000, Journal of Dental Research, 79, 21-27). 세균이 바이오필름 생성과 빈번하게 연관되지만, 진균류 및 조류를 포함하는 많은 미생물들도 바이오필름을 형성한다.
미생물 바이오필름은 기계를 오염시키고, 배관을 막히게 하고 항해 장비 및 선박의 선체에 부착되는 등 산업에서 광범위한 문제점을 유발한다. 바이오필름은 치과적 카리에스(caries), 치주염 및 낭종 섬유증 폐렴과 같은 수많은 인체 감염에 연루되어 의학에 있어서도 중대한 문제이다(Costerton 등, 1999, Science, 284, 1318-1322). 의학적 장비의 오염에서 발생되는 감염은 종종 바이오필름으로 존재하는 세균으로 인한 것이다(Gorman 등, 1994, Epidemiological Journal, 112, 551-559).
바이오필름의 세균은 산업 및 의학에서 심각한 문제를 일으킬 수 있는 그들의 자유롭게 부유하는 플랑크톤성 상동체와 비교할 때 종종 현저하게 상이한 표현형을 나타낸다. 가장 중요한 것은 그들의 항생제 처치에 대한 증가된 내성이다. 수코스 등(Soukos 등, Pharmaceutical Research, 2000, 17, 405-409)은 바이오필름 내의 세균은 같은 종의 플라크톤성 세포에 비하여 항생제 처치에 1500 배나 덜 민감할 수 있다고 보고하였다.
최근의 연구는 '정족수-감지(quorum-sensing) 신호'라고 호칭되는 분자가 미생물에 의해 일정하게 분비되어 세포외 매트릭스의 생성 및 바이오필름 형성에 수반되는 유전자를 활성화한다는 것을 보여주었다(Chicurel, 2000, Nature, 408, 284-286). 미생물 수용체 부위에 결합되어 바이오필름 형성을 억제하도록 이러한 자연적으로 나타나는 신호의 분자적 모방을 제조하고자 하는 노력이 현재 진행되고 있다(Costerton & Stewart, 2001, Scientific American, July, 61-65).
따라서, 미생물 바이오필름의 억제가 식품, 건강, 소비 제품, 공학 및 제약 산업을 포함하는 많은 산업에 있어서 중대한 도전을 주고 있다. 지난 10년간, 이러한 문제점에 대처하기 위한 상당한 노력이 투입되었지만 바이오필름에 대하여 효과적인 신규의 항균제를 발견 및 개발하고자 하는 노력은 적절한 선별 분석의 부족으로 인하여 훼방되었다. 플라크톤성 미생물은 높은 처리량의 선별 기술에 의해 쉽게 처리될 수 있는 한편, 저해제에 대한 바이오필름의 민감성의 성장 및 평가, 정족수-감지 신호의 모방 또는 작용약은 노동집약적, 시간 소모적이며 기술적 난점을 수반한다.
하나의 시약이 바이오필름의 성장 및 진행에 갖는 영향을 측정하기 위한 임의의 분석 또는 방법은 필수적으로 그의 진행 및 구조의 평가를 수반한다. 전통적으로 전자 현미경이 그 높은 해상도 때문에 바이오필름의 조성 및 구조를 연구하기 위한 선택의 방법이었다(Listgarten, 1976, Journal of Periodontology, 47, 1-18). 그러나, 이 기술은 시간 소모적이고, 제조 공정을 통해 구조적 변형을 초래할 수 있으며 높은 처리량의 선별에는 적합하지 않다.
전자 현미경과 관련된 상기 문제점의 다수는, 바이오필름의 구조를 탈수, 고정 또는 염색의 필요가 전혀 없이 그 천연의 상태에서 연구를 가능케 하는 레이저-주사 공초점 현미경법(LSCM)의 출현에 의해 대처되었다. LSCM의 광학적 분할 성질은 바이오필름에 걸쳐 증가하는 깊이에서, 초점을 벗어나는 흐려짐이 없이, 매우 얇은 광학적 부분(약 0.3 μm)이 취해지는 것을 가능케한다. 본질적으로 형광인 분자(예, 녹색 형광 단백질) 또는 형광 표지된 프로브가 여기되고, 결과되는 형광이 광전자증폭관에 의해 검출되어 디지털 영상을 생성한다. 디지탈화된 데이터는 그후 다시 모아져 구조에 3-차원 (3D) 정보를 제공할 수 있다. 공초점 현미경법은 이제 바이오필름 구조(Wood 등, 2000, Journal of Dental Research 79, 21-27), 생리학 및 생화학(Palmer & Sternberg, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10, 263-268)을 연구하는 데 사용되고 있다. 그러나, 그러한 연구는 시간 소모적이고, 본질상 고도로 특이적이어서, 단 하나 또는 2 개의 특수화된 바이오필름 구조에 집중한다.
LSCM이 바이오필름 형태학, 구조 및 조성을 연구하는 우수한 도구를 제공하는 한편, 그 영상화 및 데이터 수집 과정이 매우 느리기 때문에 높은 처리량의 선별을 위한 기반으로서의 현저한 선택은 아니다. 쿠엔 등(Kuehn 등, Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64, 4115-4127)은 바이오필름의 분석을 위해 '자동화된' LSCM을 보고하고 있는데, 그 발명의 중점은 반-자동화된 영상 분석을 위한 컴퓨터 프로그램에 있다. 상기 시스템은 점 주사 검출법(point scan detection method)에 근거하며 사용자의 입력/개입을 필요로 하는 '오프-라인'의 반-자동화된 영상 분석을 수반한다. 상기 데이터 수집 및 분석 방법은, 바이오필름 성장을 위한 '유리 유동 셀'의 사용과 함께 상기 접근 방법의 자동화 및 높은 처리량 선별에 대한 적용가능성을 심각하게 제한한다. 바이오필름에 대한 시험 시약의 영향을 평가하기 위한 다른 선별 방법이 미국 특허 제 6,326,190 호에 개시되어 있는데, 여기에서는 군체 계수 및 생체 염색과 같은 다양한 방법이 바이오필름의 성장을 측정하기 위해 사용된다. 그러나, 특히 주목할 것은, 공초점 현미경법을 사용하는 임의의 분석을 자동화하는 데 두드러진 문제점들이다.
본 발명은 자동화가 용이한 바이오필름 진행의 LSCM에 근거한 분석 방법을 제공하는 것과 관련된 전술한 문제점들에 대처한다. 또한, 본 발명의 방법은 바이오필름 성장 및 진행의 새로운 조절기를 위한 높은 처리량의 선별을 위한 기반을 제공할 수 있다. 문헌에 기재된 (예, WO 96/01438) 영상 내용 분석을 기초로 하는 자동초점 방법과는 대조적으로, 본 발명은 위치 감지 분석을 이용한다.
WO 99/47963은 선-주사 공초점 영상 시스템 및 관련된 데이터 처리 경로를 사용하여 고등 생물의 세포 추출물, 세포 또는 조직 상에 다양한 분석을 수행함으로써 질병의 진단 및 치료에 유용한 약리학적 시약을 확인하기 위한 '공초점 현미경 영상 시스템'을 개시한다. 상기 영상 시스템은 화합물 선별을 위해 충분히 빠른 방식으로 단일 세포 및 개체군에 대한 다-변수 형광 영상화를 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이 시스템은 높은 해상도로 형광기(fluorophore)의 존재를 결정할 수 있다. 그러나, 상기 출원의 어디에도 미생물 개체군을 특징화하거나, 그의 3D 영상을 생성하거나 바이오필름 진행을 분석하기 위한 상기 시스템의 사용을 개시하고 있는 곳은 없다. 또한, WO 99/47963에 기재된 영상 분석 알고리즘은 복수의 평면이 아닌 단일 평면으로부터의 데이터를 분석하기 적합할 뿐이다.
본 출원인들은 WO 99/47963에 기재된 것과 같은 공초점 영상 시스템은, 본 발명의 영상 분석 방법과 조합하여 사용될 경우, 바이오필름을 특징화하고 바이오필름 진행을 조절하는 화합물에 대한 높은 처리량의 선별을 위한 기반으로 작용하도록 사용될 수 있음을 발견하였다. IN 세포 분석기 및 그를 높은 처리량의 선별 응용에 사용하는 것은 문헌[Goodyer 등, 2001, Society for Biomolecular Screening, 7thAnnual Conference and Exhibition, Baltimore, USAScreening and signalling events in live cells using novel GFP redistribution assays]에 보고되어 있다.
발명의 요약
본 발명의 한 국면에 따르면,
a) 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기적 방사선의 빔을 형성하는 수단;
b) 바이오필름의 하나 이상의 평면 상에 상기 빔을 배향하여 초점을 맞추는 수단;
c) 상기 바이오필름으로부터 방사된 전자기적 방사선을 검출하기 위한 검출 장치; 및
d) 상기 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 바이오필름을 주사하기 위한 주사 장치를 포함하는 공초점 영상 시스템을 이용하여 복수의 표면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위하여,
i) 바이오필름을 복수의 표면 상에 성장시키고;
ii) 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 바이오필름을 주사하여 복수의 영상을 생성시킴으로써 바이오필름 내 1종 이상의 형광 잔기의 존재를 검출하고;
iii) 상기 영상을 컴퓨터 소프트 웨어의 제어 하에 데이터 처리 시스템으로 분석하여 바이오필름의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 표면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위한 자동화된 방법이 제공된다.
바이오필름은 그들의 환경에 반응하는 동적 구조이다(Watnick & Kolter, 2000, Journal of Bacteriology, 182, 2675-2679). 본 발명의 맥락에서, 바이오필름과 관련하여 사용될 경우 '진행(development)'이라는 단어는 바이오필름의 성장, 정체 또는 쇠퇴를 표현하는 것으로 생각되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 데이터 획득의 속도를 증가시키기 위한 방법으로서:
a) 빔 형성 장치가 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기 방사선의 연장된 빔을 생성하여 상기 방사선이 진행되는 광학 축을 가로질러 연장시키고;
b) 배향 및 초점 장치가 상기 바이오필름이 위치하는 첫번째 평면의 첫번째 연장된 영역 위에 상기 연장된 빔을 초점 맞추고, 상기 바이오필름으로부터 방사된 전자기 방사선을 하나 이상의 두번째 연장된 영역으로 배향하며 (여기에서 각각의 두번째 연장된 영역은 첫번째 평면에 켤레를 이루는 상이한 두번째 평면 상에 있다);
c) 상기 두번째 켤레 평면의 적어도 하나에서, 또는 상기 두번째 켤레 평면의 적어도 하나와 켤레를 이루는 세번째 평면에서, 검출 장치가, 그 위에 상기 물체로부터 방사된 전자기 방사선이 일치하는 검출 요소의 직사각형 배열을 포함하며;
d) 주사 장치가 상기 연장된 빔을 상기 바이오필름에 대하여 이동시키거나, 상기 바이오필름을 상기 연장된 빔에 대하여 이동시켜, 상기 방사된 전자기 방사선이 검출 요소의 직사각형 배열로 전달되고 상기 검출 장치에 의해 주사와 동시에 방사된 전자기 방사선을 대표하는 복수의 전기 신호로 변환되도록 한다.
바람직하게는, 상기 방법은 영상 분석을 수행하기 전에 각각의 상을 복구하는 단계를 더 포함한다. 영상 복구는, 그 품질을 향상시키거나 관찰된 영상으로부터 곧바로 얻어질 수 없는 정보를 수득할 목적으로, 더럽혀지거나 노이즈가 있는 관찰로부터 상을 회수하는 문제를 의미한다. 공간 해상도에 영향을 주는 요인들은 주로 방출된 광자 및 영상 시스템으로부터 도입된 변형 및 왜곡을 산란시킨다. 영상화될 물체가 광원-시준기 거리에 비하여 작을 경우, 이러한 붕괴 현상은 거의 이동-불변(shift-invariant)인 것으로 생각되며, 노이즈를 무시하면, 왜곡되지 않은영상과 영상화 시스템의 전이 기능 사이의 나선 공정에 의해 모델링될 수 있다. 다수의 영상 복구의 유형이 문헌에 보고된 바 있다. 예를 들면, 비너(Wiener) 필터, 잔물결-기재 제어(wavelet-based regularisation), 통제된 탈나선(deconvolution) 법, 반복 맹검(blind) 탈나선 법 등이다. 상이한 방법들 간의 비교를 위해서는 예를 들면 문헌[Lixin Shen, 2002, Journal of Electronic Imaging, 11, 5-10 또는 Mignotte 등, 2002, Journal of Electronic Imaging (2002), 11, 11-24]을 참고하라.
적합하게는, 생성된 전자기 방사선의 빔은 350 내지 700 nm 범위에서 하나 이상의 파장을 포함한다. 바람직한 파장 범위는 354 내지 374 nm, 403 내지 423 nm, 478 내지 498 nm, 560 내지 580 nm, 637 내지 657 nm 및 680 내지 700 nm를 포함한다. 바람직한 파장은 364 nm, 413 nm, 488 nm, 570 nm, 647 nm 및 690 nm를 포함한다.
적합하게는, 형광 잔기는 바이오필름 내의 미생물의 고유한 특징이다.
바람직하게는, 상기 형광 잔기는 바이오필름 내 미생물에 의해 발현되는 유전자의 산물이다. 예를 들면, 상기 미생물은 유전적으로 변형되어 구성적인 또는 유도적인 방식으로 유전자를 발현했을 수도 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 유전자는 미생물 중 형광 잔기의 발현을 적정화하도록 변화된 코돈을 함유할 수 있다.
바람직하게는, 상기 유전자는 형광 단백질을 암호화한다. 형광 단백질 및 색소 단백질의 형광 단백질 유도체는 에쿠오리아 빅토리아(Aeguoria victoria), A. 마자노(majano) 및 A. 술카타(sulcata)와 같은 아네모니아(Anemonia) 종, 레닐라(Renilla) 종, 프틸로사르쿠스(Ptilosarcus) 종, 디스코소마(Discosoma) 종, 클라우라리아(Claularia) 종, 덴드론에프틸라(Dendronephthyla) 종, 리코르디아(Ricordia) 종, 스콜리미아(Scolymia) 종, 조안투스(Zoanthus) 종, 몬타스트라에(Montastraea) 종, 헤테락티스(Heteractis) 종, 코닐락티스(Conylactis) 종 및 고니오파라(Goniopara) 종을 포함하는 광범위한 미생물로부터 단리되어 왔다.
에쿠오레아 빅토리아로부터 유래된 녹색 형광 단백질(GFP)의 사용은 많은 세포 및 분자-생물학적 방법으로의 연구에 혁신을 가져왔다. 그러나, 야생 형(천연의) GFP(wtGFP)의 형광 특징은 세포 리포터(reporter)로서 사용되기 이상적으로 적합하지는 않으므로, 세포내 리포터로서 사용되기 더욱 적합한 성질을 갖는 GFP의 변종의 변이된 형태를 생성하기 위해 상당한 노력이 소모되어 왔다[Heim 등, 1994, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 91, 12501; Ehrig 등, 1995, FEBS Letters, 367, 163-6; WO96/27675; Crameri, A. 등, 1996, Nature Biotechnology, 14, 315-9; US 6172188; Cormack, B.P. 등, 1996, Gene, 173, 33-38; US 6194548; US 6077707 및 GB 특허 출원 제 0109858.1 호('Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.')]. GB 특허 출원 제 0109858.1 호에 개시된 바람직한 구현예는 F64L-V163A-E222G-GFP, F64L-S175G-E222G-GFP, F64L-S65T-S175G-GFP 및 F64L-S65T-V163A-GFP로 구성된 군에서 선택되는 GFP 유도체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 형광 단백질은 Y66H, Y66W, Y66F, S65T, S65A, V68L, Q69K, Q69M, S72A, T203I, E222G, V163A, I167T, S175G, F99S, M153T, V163A, F64L, Y145F, N149K, T203Y, T203Y, T203H, S202F 및 L236R로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변성된 GFP이다. 가장 바람직하게는, 상기 형광 단백질은 F64L-V163A-E222G, F64L-S175G-E222G, F64L-S65T-S175G 및 F64L-S65T-V163으로 구성된 군에서 선택되는 3 개의 돌연변이를 갖는 변성된 GFP이다.
바람직하게는, 형광 잔기는 바이오필름 내의 환경 변화 또는 효소 활성을 모니터링할 수 있는 바이오센서이다. 예를 들면, 상기 잔기는 pH 변화에 반응하는 형광 바이오센싱 단백질이거나(예, Llopsis 등, 1998, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 95, 6803-6808), 바이오필름 내의 칼슘 이온과 같은 특정 이온 농도에 민감한 것일 수 있다.
선택적으로, 상기 형광 잔기는 화합물에 대한 효소의 작용에 의해 생성된다. 바람직하게는, 상기 효소는 β-갈락토시다아제, 니트로환원효소, 알칼린 포스파타아제 및 β-락타마아제로 구성된 군에서 선택된다. 효소는 미생물에 의해 고유하게 발현되거나, 미생물이 유전적으로 변형되어 유도적 또는 구성적 방식으로 효소를 발현시켰을 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 상기 방법은 검출 단계를 수행하기 전에 바이오필름에 형광 화합물을 가하는 것을 추가로 포함한다.
바람직하게는, 상기 형광 화합물은 훽스트(Hoechst) 33342, Cy2, Cy3, Cy5, 시토(Cyto)Cy5, CypHer, 쿠마린, FITC, DAPI, 알렉사(Alexa) 633 드라크(DRAQ)5, 알렉사 488, 아크리돈, 퀸아크로돈, 형광 표지된 단백질, 형광 표지된 렉틴 및 형광 표지된 항체로 구성된 군에서 선택된다. '아크리돈' 및 '퀸아크리돈'은 각각 WO 02/099424 및 02/099432에 개시된 형광 화합물들을 의미한다. 선택적으로, 결합되지 않은 형광 화합물은 검출 단계를 수행하기 전에 각 용기로부터 제거될 수 있다.
바람직하게는, 형광 화합물은 바이오필름에 걸쳐 존재하는 환경적 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 즉, 예를 들면, 미생물 바이오필름의 산화환원 전위 및 pH는 본 발명을 이용하여 측정될 수 있는 국소적 환경적 변화를 받기 쉽다. 시다이(CyDye) 'CypHer' (cf. Amersham Biosciences, reference PA15405)와 같은 pH 민감성 염료가 바이오필름 내의 pH 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, Cy5와 비교할 때, CypHer는 pH 5.0에서 95% 형광을 갖지만 pH 7.4에서는 단지 5%의 형광을 가지며, 따라서 바이오필름 내 국소적 pH의 변동의 정량적 측정을 가능케한다.
선택적으로, 형광 화합물은 바이오필름 내부 또는 주변에서 화학물질의 농도, 예를 들면 산소 또는 칼슘, 또는 특정 단백질 또는 헥산의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 표면은 용기의 형태이다. 더욱 바람직하게는, 상기 용기는 미량 역가판이다. 상기 미량 역가판은 24, 96, 384 또는 그 이상의 웰의 밀도, 예를 들면 864 또는 1536 웰을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 미량 역가판은 바이오필름의 영상이 기재를 통해 수행될 때 투명한 기재를 갖는다(Gilbert 등, 2001, Journal of Applied Microbiology, 91, 248-254).
적합하게는, 상기 방법은 광학적으로 및 공초점으로 바이오필름을 절단한 다음 3D 부피 분석에 의해 바이오필름 내의 미생물 군체의 크기를 결정할 수 있다.
적합하게는, 상기 방법은 광학적으로 및 공초점으로 바이오필름을 절단한 다음 3D 부피 분석에 의해 바이오필름의 3D 구조를 결정할 수 있다.
적합하게는, 상기 방법은 광학적으로 및 공초점으로 바이오필름을 절단한 다음 3D 부피 분석에 의해 바이오필름 내 미생물 군체들 사이의 거리의 분포를 결정할 수 있다.
적합하게는, 상기 방법은 바이오필름의 구조 내 미생물 군체의 배향을 결정할 수 있다. 군체의 배향은 유체 유량, 중력, 전기장 등과 같은 외부의 힘에 의해 영향을 받을 수 있다.
적합하게는, 상기 방법은 바이오필름의 구조 내 임의의 채널의 존재여부 및 크기를 결정할 수 있다. 그러한 채널은 상기 바이오필름 내로 자양분을 위한 접근 경로 및 바이오필름으로부터 유해물질 배출을 위한 배출 경로를 제공한다.
따라서, 예를 들면, 채널은 검은 부분이 채널을 나타내는 도 16A, C 및 D에서 알 수 있듯이, 바이오필름 구조에서 쉽게 확인될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 바이오필름의 구조 내에 임의의 다른 채널과 상기 채널의 접속성을 결정할 수 있으며, 따라서 채널 그물구조를 정의할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 방법은 채널 그물구조의 프랙탈(fractal) 차원을 결정할 수 있다.
바이오필름은 미생물의 군체들 사이 채널의 그물구조에서 상이한 분자가 확산될 수 있는 다공성 매체로서 생각될 수 있다. 상기 그물구조의 기하학적 구조와 상기 그물구조를 통한 확산 성질을 관련시킬 수 있는 것이 중요한데, 그 이유는 후자가 자양분, 산소, 항생제 또는 다른 분자가 바이오필름 내에서 용이하게 움직일 수 있음을 나타낼 것이기 때문이다. 다공성 매체는 채널들이 무작위로 차단되어 있는 랜덤하게 다중-연결된 재료이다. 상기 채널이 차지하는 자유 공간의 분율을 다공성이라 부른다. 채널 그물구조의 다아시(Darcy) 투과율은 저항기의 그물구조의 전도성에 해당한다; 이는 액체가 상기 그물구조를 얼마나 쉽게 통과해 흐를 수 있는지를 표시한다. 임계 다공도 Ccr라 불리는 다공성의 값 위에서는, 상기 그물구조를 통한 연속적인 경로가 있고, 분자들이 그물구조의 한 말단에서 다른 말단으로 확산될 수 있다. 상기 채널의 분포가 랜덤하고, 장거리 연관관계가 무시할 만 하다면, 상기 침투성은 현미경적 세부사항, 접속의 성질 등에 의존하지 않는 Ccr에 가까운 일반적인 힘의 법칙을 따른다. 상기 그물구조를 통한 액체의 흐름은 그물구조의 투과율과 연관되어 있으며, 따라서 궁극적으로 그물구조의 구형인 기하학적 구조에서 그러하다. 많은 경우에, 그물구조의 기하학적 구조는 프랙탈로 표현될 수 있고, 프랙탈 차원이 상기 그물구조에 대하여 정의될 수 있다. 임계 값에서, 반지름 R인 구에 포함된 채널의 평균 질량은 RD에 비례하며, D < 3이다. 따라서 상기 그물구조는 통상의 3차원 고체보다 덜 효율적으로 3 차원 공간을 채우는 다공성 구조로서 생각될 수 있고, 상기 그물구조는 일반의 유클리드적 차원보다 적은 프랙탈 차원을 갖는다고 할 수 있을 것이다. 요약하면, 프랙탈 차원을 결정하는 것이 그물구조의 기하학적 구조를 표현하며 따라서 바이오필름의 다공성에 대한 표지를 제공한다. 더욱 상세한 내용은 예를 들면 문헌[Gouyet, Physique et Structure Fractales, Publisher Mason, 1992, Chapter 3]을 참고하라.
또다른 구현예에서, 바이오필름은 선택적으로 구별가능한 미생물 개체군을포함한다. 상기 개체들은 예를 들면, 형광 표지로 처리 시 상이한 표지 패턴을 기초로 분화될 수 있는 동일 또는 상이한 미생물 종을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이 방법은 상기 개체군의 공간적 분포를 결정할 수 있다.
또다른 구현예에서, 바이오필름은 유전적으로 구별가능한 미생물 개체군을 포함한다. 상기 개체군은 상이한 균주 또는 종을 포함할 수 있다; 예를 들면, 상기 개체군은 구성적으로 GFP를 발현하는 야생형 및 유전 공학으로 처리된 세균 균주로 구성되거나, 유도적 또는 구성적 방식으로 광학적으로 구별되는 형광 리포터 유전자를 발현하는 둘 이상의 균주 또는 종으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 그 방법은 유전자 발현 및 개체군의 공간적 분포를 결정할 수 있다.
본 발명의 두번째 국면에 따르면,
i) 시험 시약의 존재 하에 전술한 바와 같은 방법을 수행하고;
ii) 시험 시약의 부재 하에 바이오필름의 진행에 대한 알려진 값과 시험 시약의 존재 하에 바이오필름의 진행을 비교하는 단계를 포함하며, 여기에서 시험 시약의 존재 하에 바이오필름의 진행과 시험 시약 부재 하의 알려진 값 사이의 차이가 바이오필름의 진행에 대한 상기 시험 시약의 효과의 표시인, 바이오필름의 진행에 대한 효과가 결정되어야 할 시험 시약을 선별하기 위한 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 알려진 값은 광학적 또는 전자적 데이터베이스 상에 저장된다. 선택적으로, 그 값은 표준화되어 (예를 들면, 바이오필름의 100% 진행을 나타내도록) 시험 시약의 존재 하에 바이오필름의 표준화된 진행과 비교될 수 있다. 이러한 방식으로, 어떤 최소량에 의해 바이오필름 진행에 영향을 주는 시험 시약 만이 더 이상의 평가를 위해 선택될 것이다.
본 발명의 세번째 국면에서는,
i) 시험 시약의 존재 또는 부재 하에 바이오필름을 성장시키고,
ii) 전술한 방법에 따라 바이오필름의 진행을 측정하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 시약의 존재 및 부재 하에 바이오필름의 진행의 차이가 시험 시약이 바이오필름의 진행에 대하여 갖는 영향의 표시인, 바이오필름의 진행에 대한 효과가 결정되어야 할 시험 시약을 선별하기 위한 방법이 제공된다.
따라서, 예를 들면, 테트라사이클린, 앰피실린 및 클로르암페니콜 등의 항생제가 차별적으로 바이오필름 진행을 저해하는 것으로 보여질 수 있다(도 17 및 18 참고).
바람직하게는, 상기 시험 시약의 부재 및 존재 하에서 바이오필름의 진행의 차이를 표준화하고, 광학적으로 또는 전자적으로 저장하고, 표준 화합물의 값과 비교한다. 즉, 예를 들면, 진행에 있어서의 차이를 전자적 데이터베이스 상에 저해 백분율(또는 촉진 백분율)로 저장하고 상기 값을 문제가 되는 바이오필름의 표준 저해제 경우의 상응하는 값과 비교할 수 있다. 이러한 방식으로, 어떤 소정의 한계에 부합하는 시험 시약 만이 (예를 들면, 표준 화합물만큼 효과적이거나 더 효과적인 것 등) 더 이상의 시험을 위해 관심있는 것으로 선택될 수 있다.
적합하게는, 상기 시험 시약은 바이오필름 내의 유전자 발현에 영향을 준다. 바람직하게는, 상기 시험 시약은 바이오필름 내의 특정 미생물 개체의 유전자 발현에 영향을 준다.
적합하게는, 상기 시험 시약은 바이오필름 진행을 저해한다.
적합하게는, 상기 시험 시약은 바이오필름의 진행을 촉진한다. 그러한 화합물은 물 처리 및 오수처리 산업 등의 산업에서 특히 관심을 받을 것이다.
바람직하게는, 상기 시험 시약은 전자기 방사선, 이온화 방사선, 전기장, 소리 에너지 및 마모로 구성된 군에서 선택되는 물리적 시약이다. 전자기 방사선의 적합한 형태는 자외선 방사를 포함할 것인 한편, 이온화 방사선의 적합한 형태는 α-, β- 및 γ-방사선을 포함할 것이다. 마모는 브러쉬 또는 미립자 물질과 같은 기계적 물체의 형태를 갖는 물리적 실체를 바이오필름의 표면에 대하여 물리적으로 문지르거나 긁는 것을 수반할 것이다.
바람직하게는, 상기 시험 시약은 형광 화합물이거나 형광 표지된 화합물이어서, 바이오필름을 통해 그 분포의 측정을 용이하게 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 시험 시약은 유기 화합물, 무기 화합물, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 단백질 핵산으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 네번째 국면에 따르면, 여기에 기재된 바와 같은 공초점 영상 시스템의 바이오필름의 진행을 측정하기 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 다섯번째 국면에 따르면
a) 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기 방사의 빔을 형성하기 위한 방사원 시스템;
b) 상기 빔을 물체의 하나 이상의 평면 상에 배향하고 초점 맞추기 위한 광학 시스템;
c) 상기 물체로부터 방출된 전자기 방사선을 검출하고 영상 데이터를 생성하기 위한 검출 시스템; 및
d) 상기 전자기 방사선으로 복수의 평면에서 물체를 주사하기 위한 주사 시스템을 포함하는 형광 영상 시스템을 이용하여 주사된 물체의 3차원 구조를 분석하는 방법이 제공되며,
상기 방법은 물체의 3차원 구조에 관련된 데이터를 결정하기 위해 상기 영상 데이터를 처리하는 것을 포함하고, 이 방법은 자동화된 영상 데이터 한계화(thresholding) 단계를 포함하며, 상기 한계화 단계는
i) 영상 데이터의 명암도(intensity) 값을 분석하고;
ii) 상기 영상 데이터에 대한 한계 값을 계산하고; 및
iii) 상기 한계 값을 이용하여 영상 데이터를 처리하여 한계화된 영상 데이터를 생성하는 것을 포함한다.
복수의 상이한 영상의 각각에 대한 한계의 자동화된 결정은 형광 영상 시스템에 의해 생성된 영상 데이터의 3차원 구조를 분석하기 위한 높은 처리량의 영상 분석 시스템을 가능하게 한다. 특히 이러한 국면은 배타적으로는 아니지만 바이오필름에 적용된다. 각각의 영상을 기초로 한 자동화된 한계화에 의해, 또는 상이한 평면의 바이오필름에서 취해진 일련의 영상의 각각에 대하여, 상이한 염료 농도, 상이한 레이저 출력 또는 상이한 카메라 노출 시간과 같은 예를 들면 상이한 실험적 변수를 갖는 바이오필름의 상이한 시료에 대한 평균 영상 명암도의 변동; 시료 내 평면의 깊이의 차이로 인한 바이오필름 시료의 상이한 평면의 영상에 대한 영상 명암도의 변동; 및 예를 들면 시료의 불균일한 조명 또는 시료 두께 또는 밀도의 불균일한 변동으로 인한 영상의 국소적 명암도의 변동을 포함하는 문제점들을 극복하는 것이 가능하다.
본 발명의 여섯번째 및 일곱번째 국면에 따르면, 여기에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 소프트웨어 및 그러한 컴퓨터 소프트웨어를 저장하는 데이터 운반체가 각각 제공된다.
본 발명은 공초점 영상 시스템을 이용하여 미생물 바이오필름의 진행을 자동으로 측정하기 위한 방법 및 시험 화학약품의 미생물 유전자 발현 및 바이오필름 진행에 대한 효과를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 이하의 도면을 참고하여 더 기술하며, 여기에서:
도 1은 본 발명에 따라 바이오필름을 영상화하는 데 사용되는 선-주사 공초점 현미경의 개략도이다.
도 2(a) 및 2(b)는 각각, 주사 거울을 사용하지 않는 본 발명의 다색상 구현예의 광선 경로의 상면도 및 측면도이다.
도 2(c)는 단일 빔 자동초점 시스템의 광선 경로의 상면도이다.
도 3(a) 및 3(b)는 각각, 주사 거울을 사용하는 본 발명의 다색상 구현예의 광선 경로의 상면도 및 측면도이다.
도 3(c)는 단일 빔 자동초점 시스템의 광선 경로의 상면도이다.
도 4는 2개 빔 자동초점 시스템의 측면도이다.
도 5(a) 내지 5(c)는 직사각형 CCD 카메라 및 판독 등록기를 도시한다.
도 6은 영상 데이터 처리 시스템의 데이터 처리 요소를 개략적으로 도시한다.
도 7은 본 발명의 구현예에 따르는 영상 분석 과정의 순서도를 나타낸다.
도 8은 분석 과정의 영상 데이터 이진법화 단계의 순서도를 나타낸다.
도 9(a) 및 10(a)는 각각, 상이한 칼라 채널에서 주사된 바이오필름의 평면의 영상을 보여준다.
도 9(b) 및 10(b)는 각각, 도 9(a) 및 10(a)의 바이오필름의 평면 영상에 대한 명암도 히스토그램을 나타낸다.
도 9(c) 및 10(c)는 각각 도 9(a), 9(b), 10(a) 및 10(b)의 바이오필름의 평면의 이진법화된 영상을 나타낸다.
도 11은 분석 과정의 선택적 영상 데이터 한계화 단계를 나타낸다.
도 12는 도 7에 나타낸 과정의 서브루틴의 순서도를 나타낸다.
도 13은 3D 물체 분석 서브루틴의 순서도를 나타낸다.
도 14는 3D 물체 상호 관계 분석 하위-과정의 순서도를 나타낸다.
도 15는 형광 염료 훽스트 33342로 염색된 이. 콜리 바이오필름을 나타내는 현미경 사진이다.
도 16A-D는 GFP 발현 바이오필름의 3D 분석을 나타내는데; 도 16A, C 및 D는 4, 9 & 14 μm 슬라이스를 나타내고, 도 16B는 3D 영상을 나타낸다. 도 16E는 Z-평면에 있는 세포의 위치의 함수로서 녹색 및 비-녹색 세균의 부피 변동을 나타낸다.
도 17은 선택된 항생제를 이용한 유착된 배양물의 시차적 저해를 나타낸다. 검은 막대는 테트라사이클린 내성 XL1-블루 이. 콜리의 유착된 배양물 부피를 나타낸다. 회색 막대는 GFP 발현의, 앰피실린 내성 CL182E 이. 콜리의 유착된 배양물부피를 나타낸다. n = 4 에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다.
도 18은 GFP 발현 및 비-발현 세포의 구별을 나타낸다. 형광 녹색인 유착된 생물체의 부피를 청색 및 녹색인 양과 비교하면 같은 것으로 나타난다. 흰색 막대는 유착된 배양물 부피의 평균 녹색 형광을 나타내며, 검은 막대는 유착된 배양물 부피의 총 청색 형광을 나타내며 회색 막대는 청색 및 녹색 형광이 중첩되는 것으로 나타난 유착된 배양물의 부피를 나타낸다. 이는 상기 분석이 녹색 형광을 훽스트 33342 염색된 세균과 정확하게 일치시킴을 보여준다. n = 4에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타낸다.
본 발명은 결합되지 않은 형광기의 존재 하에 또는 강력한 의약 후보를 포함하는 고유의 형광을 갖는 화학적 화합물의 존재 하에 바이오필름 세포의 공초점 평면으로부터 형광 신호를 영상화할 수 있다. 이러한 분석은 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드, 아머샴(Amersham) 바이오사이언시즈 스테인(stain) Cy3, Cy5, Cy5.5 및 Cy7, 훽스트의 핵 스테인 및 쿠마린 스테인을 비제한적으로 포함하는 임의의 공지된 형광기 또는 형광 표지를 사용할 수 있다(Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Ed., 1996, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon 참고).
광학적 형태
도 1은 본 발명의 첫번째 구현예를 보여준다. 현미경은 예를 들면 350 내지 750 nm의 광학적 범위에서 전자기 방사선의 방사원(100 또는 110), 원통형 렌즈(120), 첫번째 슬릿 마스크(130), 첫번째 교체 렌즈(140), 2색성 거울(150), 대물 렌즈(170), 시료 웰(182)의 2-차원 배열을 포함하는 미량 역가판(180), 튜브 렌즈(190), 필터(200), 두번째 슬릿 마스크(210) 및 검출기(220)를 포함한다. 상기 요소들은 도 1의 평면에 수직으로 연장되는 마스크(130, 210) 내의 슬릿 구멍(132, 212)을 갖는 광학 축(OA)을 따라서 배열된다. 렌즈(140, 170 및 190)의 초점 길이 및 상기 렌즈들 사이의 간격, 뿐만 아니라 마스크(130)과 렌즈(140) 사이, 대물 렌즈(170)와 미량 역가판(180) 사이 및 렌즈(190)와 마스크(210) 사이의 간격도 공초점 현미경을 제공하도록 되어 있다. 상기 구현예에서, 램프(100) 또는 레이저(110)로부터의 전자기 방사선은 원통형 렌즈(120)를 사용하는 라인에 초점 맞추어진다. 라인의 형태는 첫번째 슬릿 마스크(130)에 의해 적정화된다.
슬릿 마스크(130)는 물체 평면에 켤레를 이루는 평면 내에 있는 광학적 시스템의 영상 평면에 묘사된다. 슬릿 마스크(130)의 구멍(132)에 의해 형성된 조명 스트라이프는 렌즈(140), 2색성 거울(150) 및 대물 렌즈(170)에 의해 시료 웰(182)의 2-차원 배열을 포함하는 미량 역가판(180) 상에 교체된다. 조명의 편의를 위해, 도 1의 광학적 요소를 단면으로 웰 플레이트를 수직으로 도시한다. 웰 플레이트(180) 상에 조명의 라인의 투시가 라인(184)로 도시되고, 또한 도 1의 평면에 수직인 것으로 이해된다. 화살표 A 및 B에 의해 나타내듯이, 웰 플레이트(180)는 나타내지 않은 수단에 의해 상기 배열의 차원에 평행한 두 차원(X, Y)에서 움직일 수 있다.
또다른 구현예에서, 슬릿 마스크(130)는 물체 배면 초점 평면(BFP)(160)에 켤레를 이루는 평면에 있는 광학 시스템의 푸리에(Fourier) 평면에 존재한다.
이 경우 구멍(132)이 도면의 평면에 놓여지고, 렌즈(140)는 대물 렌즈(170)의 배면 초점 평면(160) 상에 구멍(132)에 의해 형성된 조명 스트라이프를 교체하여, 이것이 그를 도 1의 평면에 수직인 물체 평면의 라인(184)으로 변형시킨다.
또다른 추가의 구현예에서, 슬릿 마스크(130)는 완전히 제거된다. 상기 구현예에 따르면, 조명원은 레이저(110)이고, 그로부터의 빛은 상기 대물 렌즈(170)의 배면 초점 평면(160) 내로 초점 맞추어진다. 이는 원통형 렌즈(120)와 구형 렌즈(140)를 도 1에 나타낸 바와 같이 조합함으로써 이루어질 수 있거나, 상기 조명은 원통형 렌즈(120)에 의해 상기 평면(160) 내로 직접 초점 맞추어질 수 있다.
예를 들면 시료 웰(182) 중 시료와 같은 시료 영역의 영상은 조명의 라인을 시료 내의 평면 상에 투영하고, 그로부터의 형광 방출을 검출기(220) 상에 영상화시킨 다음, 상기 검출기(220)의 판독과 동시에 상기 조명의 라인에 수직인 방향으로 상기 플레이트(180)를 움직임으로써 수득된다. 도 1에 나타낸 구현예에서, 형광 방사는 대물 렌즈(170)에 의해 수집되고, 2색성 빔스플리터(150)를 통해 투영되고, 무한-보정된 대물 렌즈(170)를 갖는 공초점 영상 시스템에 적절한 것과 같이, 필터(200) 및 두번째 슬릿 마스크(210)를 통하여 렌즈(190)에 의해 검출기(220) 상에 영상화된다. 2색성 빔스플리터(150) 및 필터(200)는 바람직하게는 상기 조명 파장에서 빛을 차단한다.
검출기(220)는 예를 들면 카메라이고 1차원 또는 2차원일 수 있다. 1차원 검출기가 사용되는 경우, 슬릿 마스크(210)는 필요하지 않다. 조명, 검출 및 해석 과정은 규정된 면적이 영상화될 때까지 계속된다. 기계적 운동은 시료가 연속적인속도로 해석될 경우 단순화된다. 연속적 운동은 카메라 판독-시간이 노출-시간에 비하여 작을 경우에 가장 유용하다. 바람직한 구현예에서, 상기 카메라는 연속적으로 판독된다. 노출-시간과 판독-시간의 합쳐진 동안 상기 시료의 변위 d는, 예를 들면 0.5W ≤ d ≤ 5W 로, 조명 라인의 폭 W보다 크거나 더 작을 수 있다. 다수웰 플레이트의 모든 웰이 유사한 방식으로 영상화될 수 있다.
그렇지 않으면, 현미경은 상기 광학 시스템의 시야에 의해 주로 한정되는 다수의 인접한 웰을 가로질러 조명의 라인을 초점 맞추도록 배열될 수 있다. 마지막으로, 두 개 이상의 현미경이 동시에 사용될 수 있다. 조명 스트라이프(184)의 크기 및 형태는 대물 렌즈 배면 초점 평면(160)의 푸리에 변환 스트라이프의 폭과 길이에 의해 결정된다. 예를 들면, 라인(184)의 길이는 160에 있는 라인의 폭에 의해 결정되고, 반대로 184의 폭은 160의 길이에 의해 결정된다. 회절-제한된 성능을 위해, 조명 스트라이프의 160에서의 길이는 대물 렌즈 배면 구멍을 가득 채우도록 선택된다. 조명 스트라이프(184)의 크기 및 형태는 상기 원통형 렌즈(120)의 초점 길이와 120에서의 빔 크기의 조합에 의해, 즉 각 차원에서 효과적인 수의 구멍에 의해, 상기 대물렌즈의 수차에 의해 강요된 한도 및 대물렌즈 시야 내에서 조절될 수 있음이 당업자에게는 명백할 것이다.
조명 라인(184)의 치수는 신호 대 노이즈 비를 적정화하도록 선택된다. 결과적으로, 이들은 시료에 의존한다. 분석에 따르면, 해상도는 회절-제한된 및 약 5 μm 사이에서 변할 수 있다. 빔 길이는 바람직하게는 대물렌즈 시야에 의해, 예를 들면 0.5 내지 1.5 mm 사이에서 결정된다. 예를 들어, 나이콘(Nikon) ELWD, 0.6NA, 40X 대물렌즈는 약 0.75 mm의 시야를 갖는다. 이 대물렌즈를 이용하는 633 nm 방사선에 대한 회절-제한된 해상도는 약 0.6 μm이거나 약 1100 해상도 요소이다.
효과적인 깊이 해상도는 슬릿 마스크(210)의 구멍(212)의 폭 또는 1차원 검출기의 폭 및 대물렌즈(170)과 렌즈(190)의 조합에 의해 창출된 상의 배율에 의해 주로 결정된다. 공초점 현미경의 가장 좋은 축 해상도는 1 μm에 접근한다. 공초점 핸드북(J.B. Pawley, Editor, Handbook of Biological Confocal Microscopy, 2nd Edition, Plenum, New York, 1995)은 축 해상도 dz에 대하여 여러 가지로 표현되어 있으나, 특히 두 가지가 가장 적절하다:
d z = 1.77.λ/ (NA)2
d z = 0.22.λ/ [n.sin2(α/2)]
상기 식 중,λ는 빛의 파장이고, NA는 현미경 대물렌즈의 구멍의 수이고, n은 매질의 굴절율이고, α는 NA를 계산하는 데 사용된 각을 의미한다. 두 식 모두 이상적인 또는 제로-크기의 핀홀을 가정한다. 첫번째 수학식은 광학 축(상기 방향은 일반적으로 z-방향을 의미하는 한편, 광학 축에 수직인 평면은 x-y 평면이다)을 따라 레일리(Rayleigh) 기준을 적용한다. 공기 중에서 초점 맞추어진 현미경 대물렌즈는 x-y 평면의 초점에서 에어리(Airy) 디스크 단면 및 x-z 또는 y-z 평면을 따라 또다른 분포를 갖는 3D 회절-제한된 지점을 만들 것이다. 상기 수학식은 광루미네슨스 영상에서의 축 해상도를 가장 잘 표현한다. 두번째 수학식은 보는 대상이완전 평면 거울임을 가정하는 이상축(paraxial)(작은 각) 이론을 이용하여 유도된다. 낮은 NA에서 첫번째 수학식은 거울 반사로 인하여 2의 역가를 제외하고는 두번째 수학식과 부합된다. 상기 수학식들은 어떤 경우에는 해상도를 정확하게 에측하는 데 실패하기도 하는 단지 근사치로만 고려되어야 한다.
효과적인 깊이 해상도를 실험적으로 결정하는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 이는 현미경의 해상도 한계보다 작은 직경을 갖는 형광 폴리스티렌 비드를 시료로 사용하여 수행될 수 있다. 따라서 비드를 통하여 초점 평면을 진행시킴으로써 수득된 상기 물체의 상은 해상도-아래(sub-resolution) 물체의 상이며, 상기 광학 시스템의 점 확장 기능(Point Spread Function)의 정의로서 사용될 수 있다. Z 방향(축 방향)에서의 절반 최대값에서 전체 폭이 상기 광학 시스템의 축 해상도의 정의로서 사용된다.
조명의 효과적인 구멍 수("NA")는 대물렌즈의 NA보다 적다. 그러나, 형광 방사는 대물 렌즈의 전체 NA로써 수집된다. 구멍(212)의 폭은 보다 큰 조명 볼륨로부터 방사를 검출하기 위해 증가되어야 한다. 회절 한계보다 몇 배 더 큰 구멍 폭에서, 기하학적 광학 기기는 검출-볼륨 요소의 크기에 대하여 적절한 근사를 제공한다:
측면 폭: ad= dd/m,
축방향 폭: zd= √2ad√tanα,
상기 식에서, m은 배율이고, dd는 구멍(212)의 폭이며, α는 대물렌즈(170)에의해 마주보는 반-각이다. 조명 구멍(132) 또는 구멍을 갖지 않는 구현예에서 그의 동등물 및 검출 구멍(212)이 독립적으로 제어가능한 것이 본 발명의 중요한 부분이다.
다-파장 형태
특정 유형의 분석의 경우 다-파장 형광 영상을 가능하게 하는 구현예가 바람직하다. 생물학적 반응에서 하나의 중요한 변수는 시간이므로 둘 이상의 측정이 동시에 이루어지는 것이 일반적으로 유리하며 종종 필요하다.
독립적인 파장 또는 색상의 수는 수행되는 특정 분석에 의존할 것이다. 한 구현예에서는 3 개의 조명 파장이 사용된다. 도 2(a) 및 2(b)는 3-색 라인-주사 공초점 영상 시스템에서의 광선 경로를 각각 상면도 및 측면도로써 보여준다. 일반적으로 상기 시스템은 전자기 방사선의 여러 원천 Sn, 조준 렌즈 Ln, 및 원통형 라인 CL에 의해 첫번째 공간 필터 SF1에서 연장된 빔 내로 초점 맞추어진 조준된 빔을 생성하기 위한 거울 Mn, 첫번째 공간 필터 SF1과 두번째 공간 필터 SF2사이의 공초점 현미경 및 영상 렌즈 IL, 빔스플리터 DM1및 DM2및 시료로부터 형광 방사선의 상이한 파장 성분을 분리하고 검출하기 위한 검출기 Dn을 포함한다. 공간 필터 SF1및 SF2는 바람직하게는 슬릿 마스크이다.
특히, 도 2(a)는 색상 λ1, λ2및 λ3를 위한 방사원 S1, S2및 S3, 및 각각의 방사원으로부터 빛을 조준하는 렌즈 L1, L2및 L3를 도시한다. 렌즈 L1, L2및 L3는시스템 내 다른 렌즈의 임의의 색도를 보상하도록 조절되는 것이 바람직하다. 거울 M1, M2및 M3는 방사원 Sn으로부터 조명 색상을 조합하기 위해 사용된다. 거울 M1및 M2는 부분적으로 투과시키며, 부분적으로 반사시키며 우선적으로는 2색성이다. M2는 예를 들면 우선적으로 λ3를 투과시키고 우선적으로 λ2를 반사시켜야 한다. 따라서 λ3가 λ2보다 큰 것이 우선적이다. 현미경을 공초점 방식으로 작동하는 것은 방사원 Sn으로부터의 합쳐진 여기 빔이 "선(line)"으로, 또는 물체 평면 OP에서 고도로 편심된 타원형에 초점 맞추어질 것을 필요로 한다. 상기 도 1과 관련하여 논의하였듯이, 이를 수행하기 위해 다양한 형태가 사용될 수 있다. 도 2에 도시된 구현예에서, 합쳐진 조명 빔은 원통형 렌즈 CL에 의해, 공간 필터 SF1의 슬릿과 일치하는 연장된 타원 내로 초점 맞추어진다. 도 2a 및 2b에 도시한 바와 같이, 슬릿 마스크 SF1은, 조명 빛의 진행에 수직으로 정렬되고 그 장축이 도 2a의 페이지의 평면에 있도록 상기 시스템의 영상 평면에 존재한다. 렌즈 TL 및 OL은 SF1을 포함하는 평면으로부터 물체 평면 OP로 조명 라인을 교체한다. 회전 거울 TM은 편의를 위한 것이다. 또다른 구현예에서, DM3는 TL과 OL 사이에 있고, CL이 조명 빛을 직접 BFP 내로 초점 맞춘다. 여타의 구현예들이 당업자에게 명백할 것이다.
도 2(b)를 참고하면, 시료에 의해 방사되고 대물 렌즈 OL에 의해 수집된 빛은 튜브 렌즈 TL에 의해 공간 필터 SF2상에 영상화된다. SF2는 우선적으로 상기 페이지의 평면에 수직으로 연장되도록 정렬된 슬릿이다. 따라서, 필터 SF2에 의해 통과된 빛은 실질적으로 한 라인의 조명이다. SF2는 주된 영상 평면 또는 거기에 켤레를 이루는 임의의 평면에 위치할 수 있다. DM3는 부분적으로 반사하며, 부분적으로 투과시키며 바람직하게는 "다색성"이다. 특정 파장 밴드를 우선적으로 반사시키고 다른 것들을 우선적으로 투과시키는 다-파장 "2색성" 거울 또는 "다색성" 거울이 수득될 수 있다.
여기에서, δλ1은 λ1에 의해 여기된 형광 방사로 정의될 것이다. 이는 일반적으로 λ1보다 약간은 긴 파장의 분포일 것이며 δλ2및 δλ3도 유사하게 정의된다. DM3는 우선적으로 λn을 반사시키며 δλn을 우선적으로 투과시킨다(여기에서 n = 1, 2, 3). SF2에 의해 투과된 빛은 상기 검출 장치 위에 영상화되고, 이것이 주된 영상 평면에 켤레를 이루는 평면에 존재한다. 도 2(a)에서, 공간 필터 SF2의 영상은 모든 3 개의 검출기 Dn상의 렌즈 IL에 의해 형성된다. 상기 구현예는 각각의 검출기에 의해 생성된 상들 사이의 거의-완전한 기록을 요구하는 응용에서 바람직하다. 또다른 구현예에서는, 개별적인 렌즈들 ILn이 상기 검출 장치와 연결되어, 렌즈 쌍 IL 및 ILn이 공간 필터 SF2의 상을 각각의 검출기 Dn위로 교체시키는 역할을 한다. 빛은 거울 DM1및 DM2에 의해 검출기들 사이에서 갈라진다. 거울은 부분적으로 투과시키고, 부분적으로 반사시키며 우선적으로는 이색성이다. DM1은 우선적으로 δλ1을 반사시키고, 우선적으로 δλ2및 δλ3를 투과시킨다. 차단 필터 BF1은 우선적으로 δλ1을 투과시키고, 존재하는 모든 다른 파장들을 효과적으로 차단한다. DM2는 우선적으로 δλ2를 반사시키고 우선적으로 δλ3를 투과시킨다. 차단 필터 BF2및 BF3는 각각 δλ2및 δλ3를 우선적으로 투과시키고, 존재하는 모든 다른 파장들을 효과적으로 차단한다.
자동초점
본 발명의 상기 구현예에 다르면, 시료는 주사 메카니즘에 의해 영상 시스템의 물체 평면 내로 이동할 수 있는 복수의 평면 각각에 놓여진다. 따라서, 본 발명은 그 시스템의 물체 평면 내에 있는 영상 시스템의 시야에서 시료의 현재 선택된 평면을 유지하는 자동초점 메카니즘을 제공한다. 평탄의 정밀도는 시스템의 시야 깊이(depth-of-field)에 의해 결정된다. 바람직한 구현예에서, 시야 깊이는 약 10 μm이고 시야는 약 1 mm2이다.
자동초점 시스템은 대물렌즈, 및 따라서 초점 평면의 정밀한 움직임을 가능하게 한다. 자동초점 시스템은 무시할만한 지연으로 작동되는데, 즉, 반응 시간이 영상 획득-시간에 비하여 짧으며, 예를 들면 0.01 내지 0.1 초이다. 또한, 자동 초점 광원은 조명 광원 및 시료 성질과는 독립적이다. 다른 장점들 중에서도, 상기 형태는 영상 시스템의 광학 축을 따라서 시료 운반체의 위치가 물체 평면의 위치와는 독립적으로 결정되는 것을 허용한다.
단일-빔 자동초점의 한 구현예가 도 2 및 도 3에서 제공되며, 여기에서는 파장 λ4를 갖는 별도의 광원 S4및 검출기 D4가 나타나 있다. 파장 λ4는 시료 형광, 및 우선적으로 시료에서 상당한 형광을 여기시킬 수 없는 파장으로부터 필수적으로 구별된다. 따라서, λ4은 우선적으로 근 영외선, 예를 들면 800 내지 1000 nm에 있다. 부분적으로 투과시키고 부분적으로 반사시키는 거울, DM4는 우선적으로 이색성이며, λ4를 반사시키고 λn과 δλn을 투과시킨다(여기에서 n = 1, 2, 3). 본 출원에 적합한 광학적-근거의 자동초점 메카니즘이 알려져 있다. 예를 들면, 서보 제어를 위해 적합한 위치 오차 신호의 생성을 위한 난시-렌즈에 근거한 시스템이 문헌[Applied Optics23, 565-570 (1984)]에 개시되어 있다. "비스듬한(skew) 빔"을 사용하는 초점 오차 검출 시스템이 문헌[SPIE200, 73-78 (1979)]에 개시되어 있다. 후자의 접근은 D4가 스플릿 검출기인 도 2 및 3에 의해 쉽게 수행된다.
그러나, 웰 바닥 상에 존재하는 바이오필름을 갖는 미량 역가판을 사용하기 위해서, 상기 서보 루프는 웰 사이에서 이동하기 위해 파괴되어야 한다. 이는 조명이 또다른 웰로 이동할 때마다 다시 초점을 맞추어야 할 필요가 있기 때문에 실질적인 시간 지연의 결과를 가져올 수 있다.
도 4에 도시된 본 발명의 바람직한 구현예에서는 시료 평면과 물체 평면의 상대적 위치의 연속적인 폐쇄-루프 제어가 제공된다. 상기 시스템은 전자기 방사의두 개의 독립적인 빔을 사용한다. S5로부터 유래되는 하나는 연속적 표면, 예를 들면 미량 역가판의 바닥 위에 초점 맞추어진다. S4로부터 유래되는 다른 것은 예를 들면 미량 역가판의 웰 바닥과 같은 비연속적 표면 위에 초점 맞추어진다. 하나의 구현예에서, S4및 S5로부터 유래되는 빔은 각각 λ4및 λ5의 파장을 갖는다. 파장 λ4의 빔은 L4에 의해 조준되고, 홍채 I4에 의해 구멍을 가지고, 대물 렌즈 OL에 의해 비연속적 표면 위에 초점 맞추어진다.
파장 λ5의 빔은 L5에 의해 조준되고, 홍채 I5에 의해 구멍을 가지고, 대물 렌즈 OL와 켤레를 이루는 렌즈 CFL에 의해 연속적 표면 위에 초점 맞추어진다. 반사된 빛은 렌즈 IL4및 IL5에 의해 각각 검출기 D4및 D5위에 초점 맞추어진다. 부분적으로 투과시키고, 부분적으로 반사시키는 거울, DM4는 우선적으로 2색성이며, λ4및 λ5를 반사시키고 λn과 δλn을 투과시킨다(여기에서 n = 1, 2, 3). 거울 M4, M5및 M6는 부분적으로 투과시키며, 부분적으로 반사시킨다. λ4및 λ5가 구별되는 경우에, M6는 우선적으로 2색성이다.
바이오필름이 미량 역가판에 존재하는 구현예에 따르면, λ4는 웰 바닥 위에 초점 맞추어진다. 물체 평면은 다양한 거리에 의해 웰 바닥으로부터 상쇄(offset)될 수 있다. 이는 L4를 조절함으로써, 그렇지 않으면 서보 제어 루프에서의 상쇄 조절에 의해 수행된다. 기재 상의 편의를 위해, λ4는 물체 평면에 초점 맞추어지는 것으로 가정할 것이다.
자동초점 시스템의 작동은 다음과 같다. 시료 웰의 바닥이 대물 렌즈 OL의 초점 평면에 있지 않은 경우, 검출기 D4는 오차 신호를 생성하고 이는 스위치 SW를 통해 Z 제어기로 공급된다. Z 제어기는 미량 역가판을 대물 렌즈 쪽으로 향하거나 그로부터 멀어지도록 움직이기 위한 모터(도시되지 않음)를 제어한다.
다음과 같이 작동되는 단일-빔 자동초점의 바람직한 구현예에서는 가성-폐쇄된 루프 제어기가 제공된다. 주사의 마지막에, 컴퓨터 말단이 SW를 작동시켜, Z 제어 출력을 일정한 수준으로 유지시키면서 상기 판을 다음 웰로 이동시키는 시료-및-고정 장치에 제어를 스위치하고, 그 후 SW를 D4로 되돌린다.
검출 장치
개시된 장치의 특징은 상기 물체 평면과 켤레를 이루는 평면에서 다양한 독립적 검출 요소를 갖는 검출 장치를 사용하는 데 있다. 전술한 바와 같이, 신속한 영상화를 필요로 하는 응용에서는 라인 조명이 대체로 유리하다. 그러나, 라인 조명을 점 조명과 비교하는 대비에서 고유한 강력한 속도의 증가는 상기 영상 시스템이 동시에 조명 라인을 따라 시료의 각 점으로부터 방사된 빛을 검출할 수 있을 경우에만 실현된다.
하나의 구현예는 연속-판독 라인-카메라를 사용하며, 바람직한 구현예에서는 라인-카메라로서 직사각형 CCD를 사용한다. 두 구현예 모두 영상들 내의 라인들 사이 또는 영상들 사이에 데드-타임(dead-time)이 없다. 본 발명의 추가의 장점은 후술하는 바와 같이 단계-주사 구현예에서 보다 큰 유효 시야가 수득될 수 있다는 것이다.
검출 장치의 요구되는 성질은 이하의 바람직한 구현예를 고려하면 더 명백해 질 수 있다. 대물 렌즈의 해상도 한계는 < 1 μm, 전형적으로 ~0.5 μm이고, 상기 검출기는 약 1000 개의 독립적 요소의 배열을 포함한다. 해상도, 시야(FOV) 및 영상 획득율은 독립적 변수가 아니므로, 상기 성능 변수들 간의 절충이 필요하다. 일반적으로, 광학 시스템의 배율은 해상도를 희생시키지 않으면서 가능한 한 큰 FOV를 영상화하도록 조정된다. 예를 들면, 약 1 mm의 시야는 1 μm 픽셀화에서 1000 개 요소의 배열 상에 영상화될 수 있다. 검출 요소가 20 μm 평방일 경우에는, 시스템 배율이 20X로 조정될 것이다. 이것이 1 μm 해상도의 결과를 가져올 것임에 주목하라.
픽셀화는 해상도와 동등하지 않다. 예를 들어, 대물 렌즈의 고유한 해상도 한계가 0.5 μm이고 물체 평면의 각 0.5 μm x 0.5 μm 영역이 픽셀 상에 배치할 경우, 수득되는 디지털 영상의 진정한 해상도는 0.5 μm가 아니다. 진정한 0.5 μm 해상도를 획득하기 위해서, 상기 픽셀화는 물체 평면에서 약 0.2 μm x 0.2 μm 영역에 상응해야 할 필요가 있을 것이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 영상 시스템의 배율은 광학 기기의 진정한 해상도를 획득하도록 조정된다.
바람직하게는 높은 검출 효능, 낮은 노이즈 및 충분한 판독 속도를 위해, 사용되는 검출기는 CCD 카메라이다. 도 5에는, 검출기 요소의 m x n 배열을 갖는 (여기에서 m은 실질적으로 n보다 작다) 직사각형 CCD 카메라가 도시되어 있다. 형광 방사의 영상이 바람직하게는 판독 등록기에 근접하는 하나의 열(row)을 커버한다. 이는 전이 시간을 최소화하고 조명된 열과 판독-등록기 사이의 열로부터 의사 계수(spurious counts)가 신호로 축적되는 것을 방지한다.
원리적으로, 도 5에 도시된 바와 같이 CCD 카메라 위의 슬릿 SF2의 영상 높이가 하나의 픽셀이도록 광학 시스템의 배율을 조정할 수 있다.
실제적으로, 조명 라인과 카메라 열-축(row-axis) 사이의 완전한 정렬을 유지하기는 어려우며, 도 2 및 3에 예시된 바와 같은 다-파장 구현예에서 3 대의 카메라와 조명 사이의 정렬을 유지하는 것은 훨씬 더 어렵다. 몇 개, 이를테면 2 내지 5 개의 검출기 요소를 카메라의 각 컬럼에 한데 넣음으로써, 판독-노이즈 또는 판독-시간에 최소의 희생을 감수하면서 정렬 상태가 이완될 수 있다.
각각이 물체 평면에 켤레를 이루는 평면에 배치된 변동-폭 검출 공간 필터인 도 2 및 3에서의 SF2및 도 1의 (210)과 결합된 검출 장치로서 하나 이상의 직사각형 CCD 카메라를 갖는 바람직한 구현예의 추가의 장점은 이하의 기술에 의해 명백해진다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 한 구현예에서는 검출 공간 필터가 생략되고 라인-카메라가 조합된 검출 공간 필터 및 검출 장치로 사용된다. 그러나 전술하였듯이, 변동-폭 검출 공간 필터는 시료-의존적 신호-대-노이즈 비를 적정화하도록 검출 볼륨의 적정화를 허용한다. 이하의 바람직한 구현예는 라인-카메라의 장점, 즉 속도, 및 변동성인 검출 볼륨의 유연성을 유지한다. 배율은 높이 h의 회절-제한된 라인을 카메라의 한 열 위에 영상화하도록 조정된다. 검출 공간 필터 d의 폭은 바람직하게는 h ≤ d ≤ 10 h 에서 변동가능하다.
판독 전에 카메라의 조명된 컬럼에 검출기를 넣는데, 이는 노출- 및 판독-시간에 비하여 무시할 만한 시간을 필요로 한다.
하나의 바람직한 구현예에서, 상기 카메라는 프린스톤 인스트루먼츠(Princeton Instruments) NTE/CCD-1340/100-EMD이다. 바람직한 구현예에서 판독-속도는 몇 개 전자의 판독-노이즈에서 1 MHz이다. 픽셀 포맷은 1340 x 100이고, 상기 카메라는 관심있는 영역으로부터 대부분의 열(80%)을 멀리 이동시키도록 연결되어, 카메라를 효과적으로 1340 x 20으로 만들 수 있다.
연속적 판독 카메라의 상기 언급된 장점, 소위 이어지는 획득 사이에 데드-타임이 없는 것 외에도, 추가의 장점은 그것이 시료의 크기에 의해서만 한정되는 길이를 갖는 직사각형의 영상의 획득을 가능하게 한다는 것이다. 그 길이는 보다 적은 카메라 폭 및 라인 조명의 정도에 의해 결정될 수 있다. 바람직한 구현예에서 상기 부착된 바이오필름은 직경이 7 mm인 96-웰 미량 역가판의 웰 바닥 상에 배치된다. 1 μm x 1 mm의 조각을 조명하고, 상기 조명된 면적으로부터 방사된 방사선을 상기 검출 장치 상에 영상화한다. 시야가 약 1 mm2이 되도록 광학적 열(optical train)이 고안된다. 웰-바닥의 영상은 1 x 7 mm 시야에 걸쳐 1 μm 픽셀화에서 생성될 수 있다.
환경의 제어
본 발명의 한 구현예에서는, 살아있는 바이오필름 상에 분석을 수행한다. 생-세포 분석은 적절하게 진행되기 위한 생리적 조건에 대한 합리적인 근사를 빈번하게 필요로 한다. 중요한 변수들 중에 온도가 있다. 온도를 높이거나 낮추는, 특히 시료의 온도를 37℃로 유지시키기 위한 수단을 도입하는 것이 바람직하다. 또다른 구현예에서는, 살아있는 바이오필름의 생존 능력을 유지하기 위해 상대 습도, 및/또는 CO2및/또는 O2에 대한 제어가 필요하다. 또한, 증발을 최소화하기 위한 습도 제어도 작은 시료 부피의 경우에 중요하다.
상기 공초점 영상 시스템과 조화되는, 상승된 온도, 바람직하게는 37℃에서 미량 역가판을 제공하는 세 가지 구현예는 다음과 같다.
영상 시스템은 차광된 구내에 존재하는 것이 바람직하다. 첫번째 구현예에서, 상기 시료판은 구내의 전체 내부를 그 온도로 유지하는 바람직한 온도에서 유지된다. 그러나, 37℃에서, 상승된 습도가 고의적으로 유지되지 않는 한, 증발 냉각이 시료 부피를 감소시켜 분석 시간을 제한할 것이다.
두번째 구현예는 마이크로웰 플레이트를 정적인 커버 아래에서 움직이도록 하는 마이크로웰 플레이트 용 가열된 커버를 제공한다. 상기 커버는 현미경의 광학 축과 함께 정렬된 웰 위로 하나의 구멍을 갖는다. 상기 구멍은 가열 및 판의 나머지에 대한 제한된 순환을 유지하면서 활성 웰 내로의 분배를 허용한다. 가열된 커버 판과 마이크로웰 플레이트 사이의 약 0.5 mm의 공간은 마이크로웰 플레이트의 자유로운 이동을 허용하고 증발을 최소화한다. 문제가 되는(interrogated) 웰의 내용물이 기껏해야 수 초 동안 상기 분배기 구멍을 통해 주위 상태에 노출되므로, 상기 내용물은 측정 도중 때문에 실질적인 온도 변화를 겪지 않는다.
세번째 구현예에서는, 얇은 가열된 사파이어 창이 플레이트 바닥 구내로서 사용된다. 웰 분리기를 따라 저항기 히터의 유형이 창의 온도를 원하는 수준으로 유지시킨다.
추가의 구현예에서, 상기의 세 가지 개시된 방법은 다양하게 조합될 수 있다.
일체화된 분배기
본 발명의 하나의 구현예는 일체화된 분배기를 제공한다. 96- 또는 384-웰 플레이트에서 진행되는 분석을 위해, 20 - 100 μL 범위의 첨가 부피가 바람직하다. 예를 들면 이온-채널 활성의 작용약의 첨가에 적절한 것과 같은, 단일 헤드 분배기는 이베크 디스펜스(IVEK Dispense) 2000이다. 그에 필적하는 장치가 카브로(CAVRO)에서도 시판된다. 더욱 일반적으로, 유일한 화합물을 각 웰 내에 분배할 수 있는 것이 바람직하다. 하나의 구현예는, 분석 스테이션 사이의 분배 헤드를 왕복하며, 원료 판은 유일한 화합물과 팁 세척 스테이션을 포함하는, 로봇형 움직임 장치 상의 단일 헤드 분배기를 제공한다. 후자는 고정된 팁 분배기를 위한 세척 스테이션 및 배치가능한 팁 분배기를 위한 팁 교환 스테이션이다. 상기 시스템은 비교적 저렴하게 원하는 기능성을 제공하지만, 낮은 처리량이어서, 화합물의 흡인-분배-세정 순환 당 약 30 초를 필요로 한다. 또다른 구현예는 헤밀턴 마이크로랩(Hamilton Microlab) MPH-96과 같은 다중-헤드 분배기를 상기 공초점 영상 시스템에일체화시켜서 제공된다. MPH-96은 전술한 흡인-분배-세척 순환을 수행할 수 있는 로봇형 움직임 장치에 놓여진 96 개의 독립적인 고정된 팁 분배기로 구성된다.
자동화된 선별 분석에 사용되는 본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 영상 시스템은 지마크 트위스터(Zymark Twister)와 같은 플레이트-취급 로봇과 일체화된다.
분석
하기 실시예 1 - 3에 기재된 분석 방법의 수많은 변법이 본 발명에 따라 실행될 수 있다. 일반적으로, 특징적인 명암도, 및/또는 공간 분포, 및/또는 1종 이상의 형광-표지된 화학종의 일시적 분포가 상기 분석을 정량화하기 위해 사용된다.
데이터 처리 시스템
도 6은 본 발명에 따라 배열된 시스템의 데이터 처리 성분의 개략도를 보여준다. 아머샴 바이오사이언시즈 IN 셀 어낼라이저 (Amersham Biosciences IN Cell AnalyzerTM) 시스템에 기초한 상기 시스템은 전술한 바와 같은 공초점 현미경 400을 포함하고, 이는 검출기 D1, D2, D3, D4, D5, 스위치 SW, 제어 단위(401), 영상 데이터 저장기(402) 및 입/출력 (I/O) 장치(404)를 포함한다. D4와 D5가 생략된 배열, D4가 생략된 배열 및 D5가 생략된 배열을 포함하는 다른 선택적인 배열이 가능함을 주목하라. 영상 데이터 저장기(402)는 저장 장치의 임의의 적합한 형태일 수 있거나, 그렇지 않으면 출력 데이터가 연결된 컴퓨터 말단(405) 상에 전송되어 저장되게끔 생략될 수도 있다. 연결된 컴퓨터 말단(405)은 중앙 처리 장치(CPU)(408), 메모리(410), 상기 컴퓨터와 현미경(400), 및 스크린 I/O 장치(430)을 통해 컴퓨터와 스크린(428)의 디스플레이 요소(432)의 상호접속을 각각 용이하게 하는 하드 디스크 드라이브(412) 및 I/O 장치(406)과 같은 데이터 저장 장치를 포함한다. 작동 시스템 프로그램(414)을 하드 디스크 드라이브(412) 상에 저장하고, 공지의 방식으로 상기 컴퓨터 말단(405)의 하위 작동을 제어한다. 프로그램 파일 및 데이터(420) 또한 하드 디스크 드라이브(412) 상에 저장되어, 공지의 방식으로 연결된 장치를 통해 작업자에 대한 출력 및 하드 디스크 드라이브 상에 저장되는 출력 데이터를 제어한다. 연결된 장치는 스크린(428)의 요소로서 디스플레이(432), 지시 장치(도시되지 않음) 및 키보드(도시되지 않음)를 포함하며, 이것이 추가의 I/O 장치(도시되지 않음)를 통하여 작업자로부터 입력을 수용하고 작업자에게 출력 정보를 준다. 하드 드라이브(412) 상에 저장된 프로그램 파일(420)에는, 영상 처리 및 분석 응용(416), 분석 제어 응용(418) 및 현미경(400)으로부터 수용된 이미지 데이터 및 데이터 처리 도중 생성된 출력 파일을 저장하기 위한 데이터베이스(422)가 포함되어 있다. 영상 처리 및 분석 응용(418)은 미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics)의 제품인 이미지-프로(Image-ProTM)와 같은 공지된 영상 처리 및 분석 소프트웨어 패키지의 적절하게 만들어진 형태일 수 있다.
공초점 현미경(400)을 사용하는 분석의 성능은 제어 응용(418)을 사용하여 제어되며, 영상 데이터가 획득된다. 적어도 하나의 검출기 D1, D2, D3에 의해 미량 역가판의 적어도 하나의 웰에 대하여 영상 데이터의 획득이 종료된 후, 상기 영상데이터는 컴퓨터(405)로 전송되고 상기 컴퓨터 말단 하드 드라이브(412) 상의 데이터베이스(422)에 저장되고, 상기 지점에서 영상 데이터는 이후에 더욱 상세히 기술하는 바와 같이 영상 처리 및 분석 응용(416)을 이용하여 처리될 수 있다.
데이터 분석
일반적으로 데이터의 획득 및 분석은 다수의 불연속 단계를 포함한다. 형광이 하나 이상의 디지털 영상으로 변환되고, 거기에서 디지털 값은 검출 장치의 각 픽셀 상에서 입사되는 형광 방사선의 명암도에 비례한다. 이 단계에서 시야를 가로질러 영상 시스템의 불균일한 반응에 대한 보정이 가해지며, 여기에서, 배경이 감해진 데이터가 소위 편평-장(flat-field) 파일에 의해 나누어진다.
데이터 분석은 영상 처리 및 분석 응용(416)에 의해 도 7 내지 14에 묘사된 것과 같이 수행된다. 도 7은 분석 알고리즘의 순서도를 나타낸다. 분석은 첫번째 웰(i = 1)의 첫번째 Z-평면(Z = 1)으로써 시작된다(500). 첫번째 웰의 첫번째 Z-평면의 영상이 컴퓨터(510)의 메모리 내에 로딩된다. 상기 영상은 기기의 3 개 카메라에 의해 기록된 영상에 상응하는 하나 이상의 색상 평면(예를 들면 적색(R), 녹색(G) 및 청색(B))으로 구성될 수 있다. 3 가지 색상 평면으로부터의 정보를 3 개의 영상으로 분리(520)하고, 각 상을 별도로 처리한다. 3 개의 영상 모두를 같은 방식으로 처리한다. 제일 먼저, 상기 영상을 광학 기기(처리 중인 적색 영상(541); 처리 중인 녹색 영상(542) 및 처리 중인 청색 영상(543))에 의해 도입된 왜곡 및 수차에 대하여 보상하도록 회복시킨다. 영상 회복은 예를 들면 탈나선(deconvolution) 또는 당 분야에 잘 알려진 임의의 다른 영상 회복 기술일 수 있다. 영상 회복 기술은 일반적으로 영상 시스템의 광학 성질에 관한 약간의 정보(530)를 입력할 것을 필요로 한다. 예를 들어, 탈나선 기술의 경우, 광학 시스템의 점 확장 기능(Point Spread Function, PSF)이 요구될 수 있다.
두번째로, 각각의 상은 영상 데이터 처리 알고리즘의 영상 데이터 한계화 단계에서 한계화된다. 상기 구현예에서 한계화 단계는 회색 스케일의 상을 바이너리 영상으로 변환하기 위해 각 영상을 이진법화하는 것(과정(551), (552) 및 (553))을 수반하며, 여기에서 예를 들면 1은 바이오필름 중 미생물이 차지하는 영상 픽셀을 나타내고 0은 미생물들 사이의 자유 공간이 차지하는 영상 픽셀을 나타낸다. 본 발명의 상기 구현예에서, 이진법화 한계의 값은 사용자의 개입 없이 결정된다. 이진법화 한계의 값은 각 영상에 대하여 개별적으로 결정된다. 그렇지 않으면, 하나의 한계가 계산되고 각 웰의 모든 영상에, 즉, 각각의 색상 채널에 대하여 별도로, 상이한 평면의 영상 스택(stack)에 적용될 수도 있다.
도 8은 분석 알고리즘의 영상 데이터 이진법화 과정(과정 551, 552 및 553)의 순서도이다. 도 9(a)-(c)는 적색 색상 평면 영상에 대한 이진법화 처리(551)의 단계를 도시하고 도 10(a)-(c)는 녹색 색상 평면 영상에 대한 이진법화 처리(552)의 단계를 도시한다.
도 9(a)는 적색(R) 색상 평면 영상(614)을 나타내고, 그 명암도 값은 이진법화 과정에서, 본 구현예에서는 도 9(b)에 도시된 것과 같은 명암도 히스토그램(616)을 계산(602)하여 분석된다. 명암도 히스토그램(616)은 첫번째 축(618) 상의 특정 명암도를 갖는 영상의 다수의 픽셀을 두번째 축(620) 위의 적색 영상(614)의 명암도에 대하여 플롯한다. 명암도 히스토그램(616)을 이용하여, 그 아래로 분석된 일련의 픽셀의 소정 비율의 명암도 값이 결정된다(604). 상기 소정의 변위치(quantile)는 70% 내지 95% 범위 내, 바람직하게는 85% 내지 95%의 범위 내, 더욱 바람직하게는 약 90%의 값(Q90)을 가질 것으로 예상된다. 상기 90% 변위치(Q90)는 그 밑에 영상(614)의 픽셀의 총 수의 90%가 놓이는 명암도 값을 나타낸다. 90% 변위치(Q90)로 나타낸 명암도는 적색 영상(614)를 위한 적정화된 이진법화 한계 TR(606)을 조정하기 위해 사용된다. 본 실시예에서 이진법화 한계 TR은 24의 명암도 값이다.
다음, 적색 영상(614)을 한계(TR)를 사용하여 이진법화하여(608) 바이너리 영상을 생성한다. 마스크에서, 상기 한계(TR)보다 큰 명암도를 갖는 적색 영상(614)의 임의의 픽셀을 1로 조정하고, 상기 한계(TR) 이하의 명암도를 갖는 적색 영상의 임의의 픽셀을 0으로 조정한다. 1로 조정된 픽셀은 일반적으로 적색 영상(614) 중 세균의 요소에 해당하고, 0으로 조정된 픽셀은 적색 영상(614) 중 배경 요소에 해당한다. 도 9(c)는 1로 조정된 픽셀은 백색으로 나타내고 0으로 조정된 픽셀을 검정으로 나타내는 적색 바이너리 영상(622)을 보여준다. 그후 이진법화 과정(551)은 종결된다(612).
전술한 바와 같은 적색(R) 색상 평면 영상(614)에 이진법화 단계를 적용하는 것과 유사한 방식으로, 한계화 수준을 조정하기 위한 동일한 소정의 변위치를 이용하여 녹색(G) 및 청색(B) 색상 평면 영상을 이진법화(552, 553)하여 녹색 및 청색바이너리 영상을 형성한다. 도 10(a)는 녹색(G) 색상 평면 영상(624)을 나타낸다. 도 10(b)는 적색 영상(614)의 경우에서와 동일한 첫번째 및 두번째 축(618, 620) 위에 플롯된 녹색 색상 평면 영상(624)에 대한 명암도 히스토그램(626)을 나타낸다. 본 실시예에서 이진법화 한계 TG는 거의 4의 명암도 값이고, 이 값은 녹색 색상 평면 영상(624)에 대하여 적정화된 것이다. 도 10(c)는 녹색 바이너리 영상(628)을 나타낸다. 1로 조정된 이진법화된 픽셀은 백색이고, 0으로 조정된 이진법화된 픽셀은 검정색이다.
도 11은 또다른 선택적인 영상 데이터 이진법화 과정을 도시한다. 상기 선택적인 이진법화 단계는 명암도에 있어서 국소적인 변동을 갖는 영상을 이진법화하는 데 적절하다. 이러한 명암도의 국소적 변동은 주사되는 바이오필름의 평면의 불균일한 조명, 또는 주사되는 바이오필름의 두께나 밀도의 변동에 기인할 수 있다. 불균일한 조명의 경우에는 명암도의 국소적 변동을 최소화하기 위해 편평장(flatfield) 보정과 같은 영상 보정 방법을 사용하는 것이 가능하다.
상기 선택적인 이진법화 과정에서, 영상의 하나의 픽셀, 예를 들면 적색(R) 색상 평면 영상(614)이 선택된다(630). 고정된 면적을 갖는 정사각형이 선택된 픽셀들의 중심에 위치하고, 따라서 영상의 상기 픽셀의 국소 면적을 선택한다(632). 시료를 주사하기 전에 상기 정사각형의 면적을 측정한다. 선택된 픽셀의 국소 면적에 대하여 평균 명암도(AI)를 계산하고(634) 또한 명암도의 표준 편차(636)를 계산한다. 그 후, 픽셀 이진법화 한계(TP)를 계산한다(638). 픽셀 이진법화 한계(TP)는다음과 같이 계산된다:
TP= AI + (M x SD)
여기에서 M은 0.2 내지 4의 범위, 바람직하게는 0.5 내지 3의 범위, 더욱 바람직하게는 약 1의 바람직한 값을 갖는 상수이다. M의 값은 상기 이진법화 과정이 다른 영상, 예를 들면 녹색 및 청색 색상 평면 영상에 적용될 경우 초기에는 같다.
다음, 선택된 픽셀을 이진법화한다(640). 선택된 픽셀의 명암도가 픽셀 한계(TP)보다 큰 명암도를 갖는 경우, 픽셀은 1로 조정된다. 선택된 픽셀의 명암도가 픽셀 한계(TP)보다 작은 명암도를 갖는 경우, 픽셀은 0으로 조정된다. 이진법화되지 않은 영상(614)의 다른 픽셀이 있는지를 결정하기 위해 검사(642)가 수행된다. 이진법화되지 않은 추가의 픽셀이 있는 경우, 영상 평면(630)의 추가의 상이한 픽셀을 선택하여 한계화 단계를 반복한다. 영상 평면의 각 픽셀의 이진법화에 이어, 이진법화 단계를 종결하고(644) 바이너리 영상을 수득한다.
세째로, 분석 알고리즘에서는 영상 분석의 임의의 공지된 기술(예, 쇠퇴-확장, 예를 들면 가우스 필터를 사용하는 여과)을 사용하여 영상으로부터 조준(shot) 노이즈를 제거한다(과정 (561), (562) 및 (563)). 네째로, 상기 3 개의 색상 평면의 처리된 영상을 메모리(572), (573), (574)에 저장한다. 하나의 웰에 대하여 각각의 Z-평면에 대한 모든 색상 평면의 영상은 다음 단계(과정 (581) 내지 (584) 참고)에서의 3D 분석을 위해 보존된다. 영상은 서브루틴(570)을 위한 입력으로서도 사용된다. 서브루틴(570)은 각 색상 평면의 바이오필름의 부피 및 색상 평면들 사이 중첩의 부피를 결정한다.
상기 서브루틴의 순서도를 도 12에 나타낸다. 다섯째로, 상기 프로그램은 상기 부피 측정의 결과를 디스크(571)에 저정한다. 여섯째로, 상기 프로그램은 상기 웰(575)의 경우 처리되어야 할 또다른 Z-평면이 있는지 여부를 결정한다. 만일 있다면, 다음 Z-평면(Z = Z +1)으로부터의 영상을 사용하여 전체 과정을 과정(510)에서부터 반복한다. 일곱째로, 다른 Z-플레이트가 없는 경우에, 프로그램은 그 웰(580)에 대한 최종 결과를 계산한다. 상기 최종 결과는 예를 들면 상이한 색상 평면에 대한 바이오필름의 총 부피 또는 미생물들 사이의 자유 공간의 총 부피를 포함한다. 여덟째로, 상기 프로그램은 3D 물체 분석을 수행한다. 색상 평면의 각 스택을 별도로 처리한다. 각각의 색상 스택에 대하여 동일한 서브루틴을 별도로 사용한다. 영상의 스택은 상기 프로그램의 초기 단계에서 저장된다. 과정(581)은 적색 스택(572)을 사용한다; 과정(582)는 녹색 스택(573)을 사용하며 과정(583)은 청색 스택(574)을 사용한다. 상기 서브루틴은 미생물 군체와 상기 군체들 사이의 채널을 동정한다. 이는 또한 미생물 군체와 상기 채널을 위한 기하학적 형태 변수의 통계적 분포를 결정한다. 상기 서브루틴의 순서도를 도 13에 나타내며, 이는 모든 색상 평면에 대하여 같은 순서도이다. 아홉째로, 상기 3D 물체 분석 서브루틴으로부터의 결과가 물체 상호 관련 서브-루틴(584)를 위한 입력으로 사용된다. 상기 서브루틴은 상이한 색상 평면에 존재하는 물체들 간의 임의의 상호관계를 정의한다. 상기 서브루틴에 대한 순서도를 도 14에 나타낸다.
열번째로, 상기 웰에 대한 모든 결과를 스크린(590) 상에 디스플레이하고 디스크(591) 상에 저장한다. 상기 스크린(590) 상에 결과를 디스플레이하기 전에, 품질 및 상기 이진법화 과정(551, 552, 553)의 성공을 결정하여 영상의 픽셀이 일반적으로 부정확하게 1 또는 0으로 조정되지 않았음을 확인하기 위한 비준 과정에서 그 결과를 비준한다. 이는 예를 들면 영상에 대하여 이진법화 한계가 정확히 적정화되지 않은 경우, 또는 예를 들면 조준 노이즈(561, 562, 563)의 제거와 같은 이진법화된 영상의 더이상의 영상 처리가, 비교적 큰 수의 1로 조정된 픽셀을 실수로 제거한 경우에 일어날 수 있다.
상기 비준 과정이 영상의 이진법화가 조악한 품질의 것이어서 성공적이지 못한 것으로 결정하는 경우, 분석 알고리즘이 상기 영상에 대하여 반복된다. 상기 분석 알고리즘의 반복에서 이진법화 한계는 변화된다. 따라서, 이진법화 한계를 결정하기 위해 소정의 변위치가 사용되는 구현예의 경우, 상기 변위치의 백분율은 원하는 대로 단계적으로 증가 또는 감소에 의해 수정된다. 또다른 선택의 이진법화 단계의 경우, 상수 M의 값이 반복 분석에서 유사하게 수정된다. 분석 알고리즘의 반복에 이어, 결과를 다시 비준 과정에 의해 비준하여 이진법화의 성공을 결정한다. 이진법화의 결과가 다시 조악한 품질이며 따라서 성공적이지 못한 것으로 생각될 경우에는, 변위치의 백분율 또는 M의 값을 적절하게 더 수정하여 분석 알고리즘을 반복한다. 일단 비준 과정이 이진법화의 결과가 성공적이었다고 간주하면, 그 결과는 스크린(590) 상에 디스플레이된다.
비준 과정은 하나 이상의 단계를 수반할 수 있으며, 이를 후술한다. 비준 과정에서 수행될 수 있는 단계의 예는 1로 조정된 분석 알고리즘의 최종 처리된 영상의 픽셀의 소정 비율, 예를 들면 약 80%보다 더 큰지를 검사하는 것을 수반한다. 소정 비율보다 많은 픽셀이 1로 조정되는 경우에, 상기 비준 과정은 한계 값이 너무 낮게 조정된 것을 나타낸다. 결과적으로, 상기 결과는 성공적이지 못한 것으로 간주되고 보다 높은 한계 값을 갖는 영상에 대하여 분석 알고리즘이 반복된다. 이진법화 한계가 90% 변위치(Q90)를 사용하여 조정되는 경우에는, 그러므로 영상의 가장 낮은 명암도를 갖는 픽셀의 약 90%가 0으로 조정되는 것으로 기재되었다. 조준 노이즈의 제거를 포함하는 이분법화된 영상의 더 이상의 처리는 픽셀의 작은 비율을 1에서 0으로 조정할 것이고, 따라서 픽셀의 약 10% 미만의 약간의 비율이 1로 조정될 것이다. 비준 과정에서 약 80%를 넘는 픽셀이 1로 조정된 것이 밝혀지는 경우에는, 이것이 그 후, 이진법화 한계 값이 수정되어야 하고 영상의 분석 알고리즘이 반복되어야 하는 것을 확인해 준다.
비준 과정에서 수행될 수 있는 단계의 또다른 예는 처리된 이미지의 픽셀의 소정 비율 미만, 예를 들면 약 9% 미만이 1로 조정되었는지 여부를 검사하는 것을 수반한다. 9% 미만의 픽셀이 1로 조정된 경우, 비준 과정은 한계 값이 너무 높게 조정된 것을 지적한다. 결과적으로, 그 결과는 성공적이지 못한 것으로 간주되고, 더 낮은 한계 값을 갖는 영상에 대하여 분석 알고리즘이 반복된다.
비준 과정에서 수행될 수 있는 단계의 또다른 예는 시료의 한 평면의 경우영상의 1로 조정된 픽셀의 비율을 그 시료의 두번째 상이한 평면의 1로 조정된 픽셀의 비율과 비교하는 것을 수반한다. 상기 두 비율 간에 상당한 차이가 있을 것이 예상되지는 않는다. 소정의 차이 값과 비교할 때 상기 차이가 통계적으로 유의한 것으로 결정되는 경우에는, 성공적인 결과를 수득하기 위해 한계의 적절히 수정된 값으로 영상에 대하여 분석 알고리즘이 그 후 반복된다.
비준 단계에서 수행될 수 있는 단계의 또다른 예는 1로 조정된 고립된 다수의 픽셀을 계수하는 것을 수반한다. 고립되었다는 것은 그 픽셀이 0으로 조정된 픽셀에 의해 완전히 둘러싸임을 의미한다. 이 숫자가 소정 값보다 큰 경우에, 그 비준 과정은, 영상의 배경 노이즈에 해당하는 픽셀이 부정확하게 1로 조정되었음을 지적하고, 증가된 한계 값으로 영상에 대한 분석 알고리즘을 반복해야 한다.
비준 과정에서 수행될 수 있는 단계의 또다른 예에서는, 통계적 성질, 예를 들면 처리된 영상의 동정된 세균의 평균 크기 또는 가장 유망한 크기를 상기 성질에 대한 소정의 예상되는 값과 비교한다. 상기 값들 사이에 유의한 차이가 있는 경우, 비준 과정은 이진법화 한계의 값이 수정되어야 하며 분석 알고리즘이 반복되어야 함을 지적한다. 비준 과정의 상기 예의 수정된 형태는 시료의 한 영상 평면에 대한 동정된 세균의 통계적 성질을, 유사성을 검사하기 위해 상기 시료의 두번째 상이한 영상 평면에 대한 동정된 세균의 통계적 성질과 비교하는 것을 수반한다.
다음, 상기 프로그램은 처리할 또다른 웰이 있는지를 결정한다(592). 또다른 웰이 있는 경우, 다음 웰(i = i + 1)의 Z-평면(Z = 1)을 사용하여 전체 과정을 과정(510)부터 다시 시작한다. 처리할 다른 웰이 없는 경우에, 프로그램은 종료된다(593).
도 12는 도 7의 서브루틴(570)의 순서도이다. 이 서브루틴은 각각의 색상채널에서 바이오필름의 부피를 결정한다. 서브루틴은 단계(686, 687 및 688)에서 입력으로서 과정(561), (562) 및 (563)으로부터 각 색상 채널의 영상을 수용한다. 먼저, 상기 서브루틴은 부피 요소(복셀, voxel)을 이용하여 나타난 3 개의 새로운 영상을 계산하고, 이는 두 개의 색상 평면(과정(690)에서 적색 및 녹색, 과정(691)에서 적색 및 청색, 과정(692)에서 녹색과 청색)에 동시에 존재한다. 이는, 예를 들면 두 색상 평면의 이미지 사이, 복셀-대-복셀의 논리적 "그리고(AND)"를 취하여 수행된다. 둘째로, 6 개의 상이한 부피가 계산된다: 각각의 색상 평면(과정(693)에서는 적색, 과정(696)에서는 녹색 및 과정(698)에서는 청색)의 바이오필름의 부피 및 두 색상 평면(과정 (694), (695), (697)) 사이에서 중첩되는 복셀의 부피. 이들 부피를 계산하기 위해 복셀의 부피를 알 필요가 있다. 이는 앞선 실험에서 결정되었고, 복셀 부피의 값은 컴퓨터 메모리(689)에 저장된다. 이어서, 상기 서브-루틴은 메인 프로그램의 과정(571)에 대한 부피의 값으로 되돌려진다(699).
도 13은 바이오필름 군체 및 상기 군체들 간의 채널의 기하학적 형태 변수의 통계적 분포를 결정하는 3D 물체 분석 서브루틴(581) 내지 (583)의 순서도이다. 상기 서브-루틴은 입력(700)으로서 루틴 (561), (562) 또는 (563) 중 어느 하나로부터 색상 채널의 하나에서 Z-스택의 영상을 수용한다. 미생물 군체 및 상기 자유 채널의 분석이 두 상이한 순서 과정에서 일어난다: 군체에 대하여 (720), (730) 및 (740), 그리고 채널에 대하여 (711), (721), (731) 및 (741). 먼저, 군체 분석의 경우, 각각의 별도의 군체가 과정(720)에서 별도 물체로서 확인된다. 물체는 복셀의 모든 다른 군으로부터 분리된 인접한 복셀의 군으로 정의된다. 복셀의 상기 군은 3-차원 공간의 부피를 차지한다. 과정(720)은 그 물체에 함유된 모든 복셀의 좌표를 함유하는 물체의 데이터베이스를 구축한다. 이 데이터베이스는 추후의 분석을 위해 과정(584)에 출력으로서 주어진다. 두번째로, 상기 데이터베이스 중 각 물체의 기하학적 성질이 과정(730)에서 결정된다. 상기 성질은 예를 들면, 물체의 부피, 물체의 장축 및 단축의 길이, 물체의 방향 코사인, 물체의 종횡비를 포함할 수 있다. 세째로, 상기 형태 변수의 통계적 분포는 과정(740)에서 상기 웰에 대하여 계산된다. 네째로, 상기 계산된 데이터는 과정(590)에 의해 나중에 사용되도록 저장된다. 한편, 자유 채널 분석 순서 과정에서는, 첫째 과정(711)이 영상을 반전시키는데, 즉 1을 0으로 변환하고 반대로 0은 1로 변환한다. 두번째로, 과정(721)은 노드의 위치 및 채널의 그물구조 중 접속하는 결합을 확인한다. 노드는 적어도 2 개의 채널이 만나는 지점으로 정의되고, 결합은 두 노드를 연결하는 채널의 부분으로 정의된다. 따라서 영상은 모든 노드와 모든 결합을 구성하는 복셀의 좌표로써 위상기하학적 데이터베이스로 변환된다. 세째로, 과정(731)은 노드에서 연결된 결합의 수, 결합의 길이, 결합의 직경, 결합의 곡률 등과 같은 모든 노드 및 결합의 기하학적 성질을 계산한다. 네째로, 과정(741)은 노드와 결합의 성질의 통계적 분포를 결정한다. 과정(741)은 또한 상기 그물구조의 연결성, 만곡성, 프랙탈 차원 등과 같은 그물구조의 어떤 포괄적인 디스크립터(descriptor)를 계산한다. 다섯째로, 모든 결과는 과정(590)에 출력으로서 주어진다.
도 14는 3D 물체 상호 관련 분석 하위-과정(584)의 순서도이다. 하위-과정은 3 개의 입력을 수용한다. 이들은 웰의 3 개 색상 평면에 대한 Z-스택이다. 적색 스택(801)은 (572)에서 이미 저장되었고, 녹색 스택(802)는 (573)에서 이미 저장되었으며, 청색 스택(803)은 (574)에서 이미 저장되었다. 먼저, 상기 프로그램은 과정(811)의 경우 적색 및 녹색 영상에서, 과정(812)의 경우 적색 및 청색 영상에서, 과정(813)의 경우 녹색 및 청색 영상에서 각각 동시에 존재하는 복셀에 해당하는 3 개의 새로운 영상을 계산한다. 상기 새로운 영상들은 각각 적-녹 중첩 영상 (RGO), 적-청 중첩 영상(RBO) 및 녹-청 중첩 영상(BGO)이라고 불리운다. 이는, 예를 들면, 두 색상 평면의 영상 스택 사이에 복셀-대-복셀로 논리적 "그리고"를 취함으로써 수행된다. RGO 영상의 분석은 과정 (821), (841), (851) 및 (861)에서 수행되며, 이하에 더욱 상세히 기재될 것이다. 과정(822), (842), (852) 및 (862)에서 RBO 영상에 대하여, 및 과정 (823), (843), (853) 및 (863)에서 GBO 영상에 대하여 동일한 분석이 수행된다. RGO 영상의 경우에는, 첫째로, 영상 스택 중 복셀의 각각의 별도 군체가 과정(821)에서 별도의 물체로서 확인된다. 물체는 복셀의 모든 다른 군으로부터 분리된 인접한 복셀의 군으로 정의된다. 복셀의 상기 군은 영상의 Z-스택에 의해 정의된 3-차원 공간에서 부피를 차지한다. 과정(821)은 그 물체에 포함된 모든 복셀의 좌표를 포함하는 물체의 데이터베이스를 구축한다. 둘째로, 과정(841)은 3 개 데이터베이스: 과정(821)에 의해 만들어진 데이터베이스, 과정(581)에 의해 만들어진 적색 물체(833)의 데이터베이스 및 과정(582)에 의해 만들어진 녹색 물체의 데이터베이스에 포함된 물체의 복셀 좌표를 비교한다. RGO 데이터베이스 중 물체의 복셀 좌표가 적색 물체 데이터베이스(833) 및 녹색 물체 데이터베이스(832)의 복셀 좌표와 동일한 경우에, 적색 및 녹색 스택의 물체 사이에 중첩이 있다고 말한다. RGO 데이터베이스에서 상응하는 물체가 물체가 선택된다. 그렇지 않으면, RGO 데이터베이스의 상응하는 물체를 삭제한다. 세째로, 과정(851)에서 RGO 데이터베이스로부터 물체의 기하학적 성질을 측정한다. 이러한 성질들은 예를 들면, 물체의 부피, 물체의 장축 및 단축의 길이, 물체의 방향 코사인, 물체의 종횡비, 상기 영상 스택의 X, Y 및 Z 축에 대한 그의 위치를 포함할 수 있다. 네째로, 형태 변수의 통계적 분포가 과정(861)에서 웰에 대하여 계산된다. (821), (841), (851) 및 (861)과 동일한 과정이 RBO 영상 및 GBO 영상 스택의 경우에도 일어난다.
마지막으로, 상기 RGO 데이터베이스, RBO 데이터베이스 및 GBO 데이터베이스가 과정(590)으로부터 출력으로 제공된다.
실시예 1
형광 염색에 의한 세균성 바이오필름의 시각화
에스케리키아 콜리(E. coli, JM109)의 비-형광 균주를 패커드(Packard) 미량 역가판(cf. 패커드 카탈로그 번호 6005182)의 웰에 37℃에서 3 시간 동안 부착되도록 두었다. 부착되지 않은 세균은 세척하여 제거하고, 부착된 세포는 표준 루리아(Luria) 매질(Amersham Biosciences) 중 37℃에서 밤새 성장하도록 두었다. 다음, 형광 DNA 스테인 훽스트 33342(1 μM; Sigma)를 가하여 상기 세균을 시각화하였다. 영상 시스템에서 시각화할 때, 세균은 밀도 높지만 균일하지는 않은, 패치 중에서 성장하는 염색 표시의 패턴을 나타내었다(도 15 참고). 형광 명암도를 바이오필름 깊이 내로 주사하면 상기 필름이 수 마이크로미터의 깊이를 가짐을 나타내었다.
실시예 2
GFP를 구성적으로 발현하는 이. 콜리의 부착된 개체군의 3D 시각화
두번째 실험은, 이. 콜리 JM109가 GFP-F64L-S175G-E222G 돌연변이를 가지고 GFP를 구성적으로 발현하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1에서와 같이 미량 역가판 내에서 이. 콜리를 성장시켜 수행되었다. 부착되지 않은 세포들을 세척에 의해 제거한 후, 남은 세포를 교반하지 않고 37℃에서 약 10 시간 동안 항온처리하였다. 과-성장되거나 단지 단-세포 두께의 것이 아닌, 전형적인 시료의 대표로 간주되는 바 잘-진행된 바이오필름을 주사하였다. 주사는 GFP를 시각화하도록 488 nm에서 수행되었다.
도 16A-D에 나타낸 영상은 0.75 x 0.75 mm의 면적을 커버한다. 깊이 정보는 기기의 초점 평면을 1 μm 단계로 상기 바이오필름 내로 움직임으로써 수득되었다. 도 16A, 16C 및 16D에 나타낸 3 개의 영상은 취해진 슬라이스 및 바이오필름 내의 각각의 z-위치를 나타낸다. 도 16B에 나타낸 영상은 취해진 30 개의 영상을 조합한 3-D 부여된 영상이다. 수평 및 수직 선은 영상의 왼쪽 및 바닥에 대한 연관된 절단 윤곽을 갖는 소프트웨어 '절단-선'을 나타낸다. 어두운 면적은 바이오필름의 부재 또는 도면 중 밝은 면적에서 보이는 미생물 군체 사이의 실질적인 채널의 존재를 나타낸다.
도 16E는 Z 평면의 위치의 함수로서 영상의 총 명암도의 변화를 그래프로 보여준다.
실시예 3
부착된 이. 콜리 배양물의 시차적 3D 분석
이. 콜리 CL182는 앰피실린 내성을 부여하는 낮은 복제 수 벡터(pGEX-6P-1)를 가지며 IPTG 반응성tac프로모터로부터 GFP(F64L, S175G, E222G)를 발현한다. 이. 콜리 XL1-블루는 트랜스포존 10을 가지며 테트라사이클린 내성을 부여하는 표준 균주이다. 상기 균주는 선택적인 항생제(테트라사이클린, 앰피실린 또는 클로르암페니콜)의 존재 하에 혼합 및 성장되고, 그 효과는 IN 세포 분석기를 이용하여 시각화되었다.
이. 콜리 배양물은 선택적인 압력 하에 37℃에서 16 시간 동안 배치 배양액 중 성장되었다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고, 세척한 다음 차가운 PBS 중에 재현탁시켰다. OD600nm를 두 배양액 모두에 대하여 표준화(1로)하고, 용액을 차가운 PBS 중 10 배로 희석하였다. 세포(100 μm)를 침강하도록 방치하고, 4℃에서 1 시간 동안 패커드 미량 역가판(Packard #6005182)의 표면에 부착시켰다. 부착된 이. 콜리를 PBS(100 μl)로 두 번 세척하였다. IPTG (0.2 μM)를 갖거나 갖지 않는 루리아 배양액(100 μl), 및 앰피실린 (100 μ/ml), 테트라사이클린(10 μg/ml) 및 클로르암페니콜(34 μg/ml)을 부착된 세포에 가하고, 37℃에서 4 시간 및 16 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척하고 훽스트 33342(PBS 중 0.1 μM) 중에서 10 분 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS에서 세척하고, 훽스트 33342 및 GFP를 각각 여기시키기 위해 UV(365 nm) 및 청색(488 nm) 레이저 선을 이용하여 잇따라 영상화하였다. 450BP65 및 565BP50 필터를 사용하여 방사광을 포집하고, 12 비트 영상으로 수집하였다; 조건 당, 그 사이 1 μm 간격을 갖는 24 개의 슬라이스를 획득하였다.
다음 영상을 도 7 내지 14에 기재된 알고리즘을 이용하여 분석하였다. 저-해상도 및 초-해상도 비드를 사용하는 실험을 수행하기 전에 복셀 디멘션을 확립하였다. 따라서, 상기 분석은 전술한 바와 같이 3차원의 두 색상 평면 모두에서 바이오필름의 양에 대한 데이터를 제공한다. 또한, 녹색 및 청색 형광 바이오필름 사이의 중첩을 3D로 계산하였다.
XL1-블루 및 CL182 세포 성장의 시차적 저해는 앰피실린과 테트라사이클린을 사용하여 명백하게 보여지며 정량화되었다(도 13). 예상대로, 클로르암페니콜은 XL1-블루 및 CL182의 성장을 모두 강하게 저해하였다. 또한, tac 프로모터로부터 GFP의 발현에서 CL182에 의한 ~25%의 감소가 IPTG의 부재 하에 관찰되었다. 복셀 중첩을 분석함으로써 바이오필름에 걸쳐 유전자의 발현에 대한 위치 정보가 획득된다. 도 17은 항생제의 존재 하에 이. 콜리의 두 상이한 균주의 평균 부착된 배양물 부피(mm3)를 나타낸다. 실험은 4 개의 별도 웰에서 반복되었고, 상기 웰들 사이의 표준 편차를 나타낸다.
CL182 세포를 LB + IPTG의 존재 하에 항온처리한 경우, 녹색 및 청색 방사 픽셀의 볼륨은 동일하였고, 이는 부착된 생물체 총 부피 내의 모든 세포가 GFP(녹색 : 청색 = 9.72 : 9.71)를 발현하고 있음을 시사한다. 이는 실제적으로 모든 청색인 픽셀이 또한 녹색임을 보여주는 추가의 분석에 의해서 확인되었다(도 18). 비-GFP 발현에서, XL1-블루 세포는 그럼에도 불구하고 LB + IPTG에서 성장할 경우 훽스트33342의 존재 하에 강한 청색 염색을 나타낸다. 이는 CL182 세포(GFP 발현)로부터 XL1-블루 세포의 구별을 가능케 한다.
이상의 구현예는 본 발명의 설명적 예로서 이해되어야 한다. 본 발명의 또다른 구현예들이 예상된다. 임의의 한 구현예에 관하여 기재된 임의의 양상은 단독으로 또는 기재된 다른 양상들과 조합되어 사용될 수 있으며, 임의의 다른 구현예 또는 임의의 다른 구현예의 임의 조합 중 하나 이상의 양상과 조합되어 사용될 수도 있음이 이해되어야 한다. 또한, 첨부하는 청구범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 위에 기재되지 않은 동등물 및 수정이 사용될 수도 있다.
Claims (54)
- a) 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기적 방사선의 빔을 형성하는 수단;b) 바이오필름의 하나 이상의 평면 상에 상기 빔을 배향하고 초점을 맞추는 수단;c) 상기 바이오필름으로부터 방사된 전자기적 방사선을 검출하기 위한 검출 장치; 및d) 상기 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 바이오필름을 주사하기 위한 주사 장치를 포함하는 공초점 영상 시스템을 이용하여 복수의 표면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위하여,i) 상기 바이오필름을 상기 복수의 표면 상에 성장시키고;ii) 전자기적 방사선으로 복수의 평면에서 상기 바이오필름을 주사하여 복수의 영상을 생성시킴으로써 바이오필름 내 1종 이상의 형광 잔기의 존재를 검출하고;iii) 상기 영상을 컴퓨터 소프트 웨어의 제어 하에 데이터 처리 시스템으로 분석하여 바이오필름의 구조를 결정하는 단계를 포함하는, 복수의 평면 상에서 바이오필름의 진행을 측정하기 위한 자동화된 방법.
- 제 1 항에 있어서,a) 상기 빔 형성 수단이 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기 방사선의 연장된 빔을 생성하여 상기 방사선이 진행되는 광학 축을 가로질러 연장시키고;b) 상기 배향 및 초점을 맞추는 수단이 상기 바이오필름이 위치하는 첫번째 평면의 첫번째 연장된 영역 위에 상기 연장된 빔을 초점 맞추고, 상기 바이오필름으로부터 방출된 전자기 방사선을 하나 이상의 두번째 연장된 영역으로 배향하며 (여기에서 각각의 두번째 연장된 영역은 첫번째 평면에 켤레를 이루는 상이한 두번째 평면 상에 있다);c) 상기 두번째 켤레 평면의 적어도 하나에서, 또는 상기 두번째 켤레 평면의 적어도 하나와 켤레를 이루는 세번째 평면에서, 상기 검출 장치가, 그 위에 상기 물체로부터 방사된 전자기 방사선이 일치하는 검출 요소의 직사각형 배열을 포함하며;d) 주사 장치가 상기 연장된 빔을 상기 바이오필름에 대하여 이동시키거나, 상기 바이오필름을 상기 연장된 빔에 대하여 이동시킴으로써 상기 바이오필름을 주사하여, 상기 방사된 전자기 방사선이 검출 요소의 직사각형 배열로 전달되고 상기 검출 장치에 의해 주사와 동시에 방사된 전자기 방사선을 대표하는 복수의 전기 신호로 변환되도록 하는 방법.
- 제 1 또는 2 항에 있어서, 단계 iii)의 영상 분석을 수행하기 전에 각 영상을 회복시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 내지 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 전자기 방사선의 빔이 350 내지 700 nm 범위에서 하나 이상의 파장을 포함하는 방법.
- 제 1 내지 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 시점에서 바이오필름의 진행을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 잔기가 유전자의 산물인 방법.
- 제 6 항에 있어서, 상기 유전자가 형광 단백질을 암호화하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 형광 단백질이 Y66H, Y66W, Y66F, S65T, S65A, V68L, Q69K, Q69M, S72A, T203I, E222G, V163A, I167T, S175G, F99S, M153T, V163A, F64L, Y145F, N149K, T203Y, T203Y, T203H, S202F 및 L236R로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변성된 녹색 형광 단백질(GFP)인 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 변성된 GFP가 F64L-V163A-E222G, F64L-S175G-E222G, F64L-S65T-S175G 및 F64L-S65T-V163으로 구성된 군에서 선택된 3 개의 돌연변이를 갖는 것인 방법.
- 제 6 내지 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 잔기가 바이오필름 내 환경 변화 또는 효소 활성을 모니터링할 수 있는 바이오센서인 방법.
- 제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 잔기가 화합물에 대한 효소의 작용에 의해 생성되는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 상기 효소가 β-갈락토시다아제, 니트로환원효소, 알칼린 포스파타아제 및 β-락타마아제로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 1 내지 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 검출 단계 ii)를 수행하기 전에 바이오필름에 형광 화합물을 가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제 13 항에 있어서, 상기 형광 화합물이 훽스트(Hoechst) 33342, Cy2, Cy3, Cy5, CypHer, 쿠마린, FITC, DAPI, 알렉사(Alexa) 633 DRAQ5, 알렉사 488, 아크리돈, 퀸아크리돈, 형광 표지된 단백질, 형광 표지된 렉틴 및 형광 표지된 항체로 구성된 군에서 선택되는 방법.
- 제 13 또는 14 항에 있어서, 상기 형광 화합물이 바이오필름 내의 환경 변화를 모니터링할 수 있는 것인 방법.
- 제 1 내지 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면이 용기를 형성하는 방법.
- 제 16 항에 있어서, 상기 용기가 미량 역가판인 방법.
- 제 1 내지 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이오필름 내의 미생물 군체의 크기를 결정할 수 있는 방법.
- 제 1 내지 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 바이오필름의 3-차원 구조를 결정할 수 있는 방법.
- 제 1 내지 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이오필름 내 미생물 군체들 사이의 거리의 분포를 결정할 수 있는 방법.
- 제 1 내지 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이오필름의 구조 내에서 미생물 군체의 배향을 결정할 수 있는 방법.
- 제 1 내지 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 바이오필름의 구조 내에서 임의의 채널의 존재 및 크기를 결정할 수 있는 방법.
- 제 22 항에 있어서, 상기 방법이 바이오필름의 구조 내에서 상기 채널과 임의의 다른 채널의 연관성을 결정하여 채널 그물구조를 정의할 수 있는 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 방법이 상기 채널 그물구조의 프랙탈 차원을 결정할 수 있는 방법.
- 제 1 내지 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오필름이 광학적으로 구별가능한 미생물 개체군을 포함하는 방법.
- 제 1 내지 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오필름이 유전적으로 구별가능한 미생물 개체군을 포함하는 방법.
- 제 25 또는 26 항에 있어서, 상기 방법이 상기 개체군의 공간적 분포를 결정할 수 있는 방법.
- i) 시험 시약의 존재 하에 제 1 내지 27 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하고;ii) 시험 시약의 부재 하에 바이오필름의 진행에 대한 알려진 값과 시험 시약의 존재 하에 바이오필름의 진행을 비교하는 단계를 포함하며, 여기에서 시험 시약의 존재 하에 바이오필름의 진행과 시험 시약 부재 하의 알려진 값 사이의 차이가 바이오필름의 진행에 대한 상기 시험 시약의 효과의 표시인, 바이오필름의 진행에 대한 효과가 결정되어야 할 시험 시약을 선별하기 위한 방법.
- 제 28 항에 있어서, 상기 알려진 값이 전자적 또는 광학적 데이터베이스 상에 저장되는 방법.
- i) 시험 시약의 존재 또는 부재 하에 용기 내에서 바이오필름을 성장시키고,ii) 제 1 내지 27 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 바이오필름의 진행을 측정하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 시약의 존재 및 부재 하에 바이오필름의 진행의 차이가 시험 시약이 바이오필름의 진행에 대하여 갖는 효과의 표시인, 바이오필름의 진행에 대한 효과가 결정되어야 할 시험 시약을 선별하기 위한 방법.
- 제 30 항에 있어서, 시험 시약의 부재 및 존재 하에 바이오필름의 진행 간의 상기 활성 차이를 표준화하고, 광학적 또는 전자적으로 저장하여 표준 화합물의 값과 비교하는 방법.
- 제 28 내지 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 바이오필름 내 유전자 발현에 영향을 주는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 시험 시약이 바이오필름 내 특정 미생물 개체군의 유전자 발현에 선택적으로 영향을 주는 방법.
- 제 28 내지 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 바이오필름의 진행을 저해하는 방법.
- 제 28 내지 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 바이오필름의 진행을 촉진하는 방법.
- 제 28 내지 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 전자기 방사선, 이온화 방사선, 전기장, 소리 에너지 및 마모로 구성된 군에서 선택된 물리적 시약인 방법.
- 제 28 내지 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 형광 화합물 또는 형광 표지된 화합물이어서 바이오필름에 걸쳐 그 분포의 측정을 용이하게 하는 방법.
- 제 28 내지 35 항 및 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 시약이 유기 화합물, 무기 화합물, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 단백질 핵산으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
- 제 1 내지 38 항 중 어느 한 항에 기재된 공초점 영상 시스템의 바이오필름의 진행을 측정하기 위한 용도.
- 물체의 3차원 구조에 관련된 데이터를 결정하기 위해 영상 데이터를 처리하는 것을 포함하고, 자동화된 영상 데이터 한계화(thresholding) 단계를 포함하며, 상기 한계화 단계는i) 영상 데이터의 명암도 값을 분석하고;ii) 상기 영상 데이터에 대한 한계 값을 계산하고; 및iii) 상기 한계 값을 이용하여 영상 데이터를 처리하여 한계화된 영상 데이터를 생성하는 것을 포함하는,a) 하나 이상의 파장을 포함하는 전자기 방사의 빔을 형성하기 위한 방사원 시스템;b) 상기 빔을 물체의 하나 이상의 평면 상에 배향하고 초점 맞추기 위한 광학 시스템;c) 상기 물체로부터 방사된 전자기 방사선을 검출하고 영상 데이터를 생성하기 위한 검출 시스템; 및d) 상기 전자기 방사선으로 복수의 평면에서 물체를 주사하기 위한 주사 시스템을 포함하는 형광 영상 시스템을 이용하여 주사된 물체의 3차원 구조를 분석하는 방법.
- 제 40 항에 있어서, 상기 방법의 단계 i)이 영상 데이터 중 명암도 값의 통계적 성질을 계산하도록 조처되는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 통계적 성질을 계산하는 도중에는 상기 방법이 명암도 히스토그램을 계산하도록 조처되며, 한계 값을 계산하는 상기 단계 도중에는 상기 방법이 상기 한계를 계산하기 위해 명암도 히스토그램을 사용하도록 조처되는 방법.
- 제 41 또는 42 항에 있어서, 통계적 성질을 계산하는 도중에는 상기 방법이 평균 명암도 및/또는 명암도 표준 편차를 계산하도록 조처되는 방법.
- 제 40 내지 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한계화된 영상 데이터가 이진법화된 영상 데이터인 방법.
- 제 40 내지 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상 데이터 한계화 단계가 적어도 하나의 비준 규칙을 저장하고 상기 적어도 하나의 비준 규칙을 이용하여 상기 한계화된 영상 데이터를 비준하는 것을 더 포함하는 방법.
- 제 45 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비준 규칙이 영상을 형성하는 픽셀의 총 수에 관계된 규칙을 포함하는 방법.
- 제 45 또는 46 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비준 규칙이 영상의 소정 부분을 형성하는 다수의 픽셀에 관계된 규칙을 포함하는 방법.
- 제 45 내지 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비준 규칙이 다수의 개별적으로 단리된 픽셀에 관계된 규칙을 포함하는 방법.
- 제 45 내지 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비준 규칙이 한계를 초과하거나 못미치도록 조정된 픽셀의 비율에 관계된 규칙을 포함하는 방법.
- 제 40 내지 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상 데이터 처리 알고리즘이 영상 데이터 회복 단계를 가지며, 상기 회복 단계는 상기 영상 데이터 한계화 단계를 수행하기 전에 영상 데이터를 회복시키는 것을 수반하는 방법.
- 제 40 내지 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물체가 바이오필름인 방법.
- 제 51 항에 있어서, 상기 방법이 시험 시약의 존재 및 부재 하에 바이오필름의 진행 사이에 활성의 차이를 비교하도록 적응된 방법.
- 제 40 내지 52 항 중 어느 한 항의 방법을 수행하도록 적응된 컴퓨터 소프트웨어.
- 제 53 항에 따르는 컴퓨터 소프트웨어를 저장하는 데이터 운반체.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100884935B1 (ko) * | 2007-10-29 | 2009-02-23 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 미생물의 통합적 분석 방법 및 이에 사용되는 생물막 칩 |
| WO2013192521A1 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The General Hospital Corporation | β-LACTAMASE TARGETED PHOTOSENSITIZER FOR PESTICIDE AND PEST DETECTION |
| KR101359268B1 (ko) * | 2012-12-06 | 2014-02-11 | 고려대학교 산학협력단 | 바이오 필름 모니터링 장치 |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2588122A1 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Helicos Biosciences Corporation | Tirf single molecule analysis and method of sequencing nucleic acids |
| US8084260B2 (en) * | 2004-11-24 | 2011-12-27 | Applied Biosystems, Llc | Spectral calibration method and system for multiple instruments |
| JP4500206B2 (ja) * | 2005-05-09 | 2010-07-14 | 株式会社三栄水栓製作所 | バイオフィルム評価方法 |
| JP2006337245A (ja) * | 2005-06-03 | 2006-12-14 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 蛍光読み取り装置 |
| FR2898363B1 (fr) * | 2006-03-10 | 2008-06-13 | Biofilm Control Sarl | Prodede de releves d'images, notamment pour l'etude du developpement d'un biofilm dans un milieu de culture |
| WO2008032106A2 (en) * | 2006-09-14 | 2008-03-20 | Oxford Gene Technology Ip Limited | Imaging of areas |
| US7871791B2 (en) * | 2007-01-18 | 2011-01-18 | Allegheny-Singer Research Institute | Biofilm preparation using potassium permanganate |
| US8712139B2 (en) * | 2008-03-21 | 2014-04-29 | General Electric Company | Methods and systems for automated segmentation of dense cell populations |
| GB0807466D0 (en) * | 2008-04-24 | 2008-05-28 | Univ Nottingham Trent | Improvements relating to assays including a labelled reagent |
| EP2409139A4 (en) * | 2009-03-18 | 2016-10-12 | Univ Utah Res Found | MICROSCOPY WITH NON-COHERENT LIGHT |
| JP5012873B2 (ja) * | 2009-10-14 | 2012-08-29 | カシオ計算機株式会社 | 画像処理装置 |
| US9915813B2 (en) | 2009-12-04 | 2018-03-13 | Koninklijke Philips N.V. | System and method for time-related microscopy of biological organisms |
| CN101839860A (zh) * | 2010-07-01 | 2010-09-22 | 湖南科技大学 | 激光拉曼光谱仪多波激发装置 |
| WO2012032955A1 (ja) * | 2010-09-10 | 2012-03-15 | オリンパス株式会社 | 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法 |
| FR2969298B1 (fr) * | 2010-12-21 | 2013-01-18 | Biofilm Control | Methode pour mesurer la resistance de films |
| JP2013223835A (ja) * | 2012-04-20 | 2013-10-31 | Nitto Denko Corp | 膜ファウリングの評価方法および分離膜の洗浄方法 |
| JP6394960B2 (ja) * | 2014-04-25 | 2018-09-26 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 画像形成装置および画像形成方法 |
| FR3030748B1 (fr) * | 2014-12-17 | 2017-01-27 | Commissariat Energie Atomique | Systeme d'observation d'objets |
| CN104928347B (zh) * | 2015-07-03 | 2018-05-01 | 北京科技大学 | 一种实时观测枯草芽孢杆菌生物膜生长过程中不同基因表现型细胞和分布的方法 |
| CN105184853B (zh) * | 2015-08-14 | 2018-04-10 | 深圳大学 | 一种基于光流分析的单细胞三维图像生成方法 |
| EP3350578B1 (en) | 2015-09-02 | 2022-03-09 | Inscopix, Inc. | Systems and methods for color imaging |
| CN107923849B (zh) * | 2015-09-09 | 2021-03-09 | 宝洁公司 | 用于评估含亚锡的口腔护理产品的荧光探针 |
| WO2017079688A1 (en) | 2015-11-05 | 2017-05-11 | Inscopix, Inc. | Systems and methods for optogenetic imaging |
| CN109642869B (zh) * | 2016-04-15 | 2022-04-12 | 伯克利之光生命科技公司 | 用于坞内测定的方法、***和试剂盒 |
| DE102016110407A1 (de) * | 2016-06-06 | 2017-12-07 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Digitales Mikroskop mit einem Objektiv und mit einem Bildsensor |
| WO2017216123A1 (en) | 2016-06-13 | 2017-12-21 | Nanolive Sa | Method of characterizing and imaging microscopic objects |
| US10280444B2 (en) | 2016-09-09 | 2019-05-07 | The Procter & Gamble Company | Method of quantitating sorption of stannous by microbial cells of a biofilm |
| US11361411B2 (en) * | 2016-09-16 | 2022-06-14 | Qiagen Gmbh | Neighbor influence compensation |
| EP3312593A1 (de) * | 2016-10-20 | 2018-04-25 | Hain Lifescience GmbH | Verfahren und vorrichtung zur optischen anregung einer mehrzahl von analyten in einem array von reaktionsgefässen und zur erfassung von fluoreszenzlicht aus dem analyten |
| EP3551745A4 (en) | 2016-12-12 | 2020-07-15 | Xcella Biosciences, Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR SCREENING USING MICROCAPILLAR ARRAYS |
| US11871978B2 (en) * | 2017-04-20 | 2024-01-16 | Boise State University | Plasma scalpel for selective removal of microbes and microbial biofilms |
| CN117288688A (zh) * | 2017-06-27 | 2023-12-26 | 生命科技控股私人有限公司 | 分析液体样品的方法、微板读数仪和计算机程序 |
| CN107462556B (zh) * | 2017-07-26 | 2020-01-21 | 广东省生态环境技术研究所 | 一种直观的生物膜电活性检测方法 |
| WO2019075476A2 (en) | 2017-10-15 | 2019-04-18 | Berkeley Lights, Inc. | METHODS, SYSTEMS AND KITS FOR ENCLOSED TESTS |
| JP7076698B2 (ja) | 2017-11-17 | 2022-05-30 | 国立研究開発法人国立がん研究センター | 画像解析方法、画像解析装置、プログラム、学習済み深層学習アルゴリズムの製造方法および学習済み深層学習アルゴリズム |
| JP7198577B2 (ja) | 2017-11-17 | 2023-01-04 | シスメックス株式会社 | 画像解析方法、装置、プログラムおよび学習済み深層学習アルゴリズムの製造方法 |
| WO2020018946A1 (en) * | 2018-07-19 | 2020-01-23 | University Of Washington | Systems and methods for accurate optical ph sensing of biofilms |
| CN109087272A (zh) * | 2018-10-17 | 2018-12-25 | 天津师范大学 | 用于采集模拟医学微光图像的降噪***及使用方法 |
| CN111122567B (zh) * | 2018-11-01 | 2022-09-16 | 华中科技大学苏州脑空间信息研究院 | 一种高通量光学层析三维成像*** |
| WO2020139629A1 (en) * | 2018-12-26 | 2020-07-02 | Colgate-Palmolive Company | Visualization method for analyzing oral biofilm growth |
| US11733251B2 (en) | 2019-02-01 | 2023-08-22 | Amgen Inc. | Methods and systems of performing an assay |
| JP7296239B2 (ja) * | 2019-04-10 | 2023-06-22 | オムロン株式会社 | 光学計測装置、光学計測方法、及び光学計測プログラム |
| CZ2019459A3 (cs) | 2019-07-09 | 2019-11-13 | Botanický ústav Akademie věd ČR, v.v.i. | Mobilní zařízení pro nedestruktivní fluorescenční rozlišení, zobrazení a kvantifikaci mikroorganismů na povrchu materiálů |
| CN110823863A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-02-21 | 中国南方电网有限责任公司电网技术研究中心 | 一种绝缘材料表面的藻类检测方法、装置和设备 |
| CN113075232A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-06 | 深圳中科飞测科技股份有限公司 | 一种检测设备及检测方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5474910A (en) * | 1993-10-15 | 1995-12-12 | Alfano; Robert R. | Method and device for detecting biological molecules and/or microorganisms within a desired area or space |
| US5796478A (en) * | 1997-07-25 | 1998-08-18 | Nalco Chemical Company | Monitoring of film forming living desposits |
| CA2324262C (en) * | 1998-03-16 | 2010-05-25 | Praelux Incorporated | Confocal microscopy imaging system |
| AT410718B (de) * | 1998-10-28 | 2003-07-25 | Schindler Hansgeorg Dr | Vorrichtung zur visualisierung von molekülen |
| DE19906047C2 (de) * | 1999-02-12 | 2001-10-18 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion biotischer Kontaminationen auf einer Oberfläche |
| US6153400A (en) * | 1999-03-12 | 2000-11-28 | Akzo Nobel N.V. | Device and method for microbial antibiotic susceptibility testing |
-
2002
- 2002-05-14 GB GBGB0211068.2A patent/GB0211068D0/en not_active Ceased
-
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-
2004
- 2004-11-03 IL IL16500804A patent/IL165008A0/xx unknown
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100884935B1 (ko) * | 2007-10-29 | 2009-02-23 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | 미생물의 통합적 분석 방법 및 이에 사용되는 생물막 칩 |
| WO2013192521A1 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-27 | The General Hospital Corporation | β-LACTAMASE TARGETED PHOTOSENSITIZER FOR PESTICIDE AND PEST DETECTION |
| KR101359268B1 (ko) * | 2012-12-06 | 2014-02-11 | 고려대학교 산학협력단 | 바이오 필름 모니터링 장치 |
| WO2014088249A1 (ko) * | 2012-12-06 | 2014-06-12 | 고려대학교 산학협력단 | 바이오 필름 모니터링 장치 |
| US10018568B2 (en) | 2012-12-06 | 2018-07-10 | Korea University Research And Business Foundation, Sejong Campus | Device for monitoring biofilm |
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