KR20050005250A - Rapid determination of apoptotic cells by acridine orange dye staining method - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 아크리딘 오렌지형광염색을 이용한 방사성 고사세포 신속검출방법에 관한 것으로서 보다 상세하게 기술하면 다음과 같다. 먼저, 감마선 발생장치를 이용하여 조사된 림프구를 원심분리 배양하고, 슬라이드를 제작한 후 고농도아크리딘 오랜지 보존액(0.1%)을 소렌센 인산완충용액으로 희석한 다음 슬라이드에 떨어뜨리고, 커버글라스 포배하여 고사세포 사멸체를 형광현미경으로 확인하는 것이다. 본 발명의 결과로 살아있는 세포와 고사세포 그리고, 괴사세포로 명확하게 구분이 가능하고, 단시간에 다량의 세포를 분석할 수 있게 되어 경제적이면서 작업시간을 대폭 줄일 수 있는 아크리딘 오렌지형광염색을 이용한 방사성 고사세포 신속검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for rapid detection of radioactive apoptosis cells using acridine orange fluorescence staining. First, the lymphocytes irradiated with a gamma ray generator were centrifuged and cultured. After the slides were prepared, the diluted acryldin orange stock solution (0.1%) was diluted with Sorensen phosphate buffer solution, dropped on the slides, and cultivated with cover glass. Apoptotic apoptosis is confirmed by fluorescence microscopy. As a result of the present invention, it is possible to clearly distinguish between living cells and apoptosis cells and necrotic cells, and to analyze large amounts of cells in a short time using acridine orange fluorescent staining, which is economical and can significantly reduce working time. It relates to a method for rapid detection of radioactive dead cells.
일반적으로 방사선에 대한 생물학적 영향, 특히 인체영향을 판단하는데 있어서 혈액이나 조직세포의 형태ㆍ조직학적 변화를 관찰하는 방법이 이용되고 있는데, 관찰방법 중 검출 예민도가 높은 염색법이 선택되어 활용된다. 이런 측면에서 볼 때, 기존에 개발되어 이용되고 있는 생물학적 선량-반응 측정법들은 염색체 이상을 기준으로 보다 간편하고, 짧은 시간에 대량의 시료를 분석하고자 노력한 산물이라고 할 수 있다.In general, a method of observing the morphological and histological changes of blood or tissue cells is used to determine biological effects on radiation, in particular, human effects. Among the observation methods, a staining method having a high detection sensitivity is selected and used. In this respect, the existing biological dose-response assays that have been developed and used are simpler, based on chromosomal aberrations, and are the product of efforts to analyze large samples in a short time.
그러나, 이들 방법들을 이용하여 세포 형태학적 변화를 관찰하는 경우에는 전문적인 지식과 고가의 장비, 시간적 소용이 없이는 분석이 어려웠을 뿐만 아니라 다량의 시료를 처리하는데 한계를 보였다. 다시 말해서, 선량-반응관계를 관찰하기 위해서는 민감성이 높고, 간편하면서 빠른 시간에 대량의 시료를 처리할 수 없는 문제점이 있었다.However, when observing cell morphological changes using these methods, the analysis was difficult without the expert knowledge, expensive equipment, and time use, and showed a limitation in processing a large amount of samples. In other words, in order to observe the dose-response relationship, there is a problem that a large amount of samples cannot be processed in a high sensitivity and simple and fast time.
한편, 현재 세포고사기전의 증명을 위하여 사용되고 있는 방법론으로는 유세포 분석기 활용법, in situ DNA결합법, 전기영동에 의한 DNA단편물 확인법 등이 단독 또는 혼용되어 이용되고 있으나, 유세포 분석기를 이용하는 경우에는 데이터의해석에 개인적인 주관이 개입될 수가 있고, in situ DNA결합법과 전기영동법 등을 활용하는 경우에는 시약 및 기구가 고가일 뿐 아니라 관찰자의 전문적인 지식이 요구되기 때문에 방사선에 대한 피폭선량 평가나 생물학적 인체영향 평가를 위하여 요구되는 신속, 정확, 간편이라는 충족요건을 만족시키기에는 많은 불편한 점이 있었다.On the other hand, as the methodology currently used for the demonstration of cell death mechanism, flow cytometry, in situ DNA binding, electrophoresis and DNA fragment identification method are used alone or in combination, but in the case of using flow cytometry, Individual subjects can be involved in the seat, and in situ DNA binding and electrophoresis methods require reagents and instruments to be expensive, and require expert knowledge of the observer. There have been many inconveniences in meeting the requirements for speed, accuracy and simplicity required for impact assessment.
이를 개선하기 위한 본 발명의 목적은 방사선에 대한 생물학적 영향을 세포수준에서 정밀하게 해석하기 위해서는 기존에 개발되어 활용화되고 있는 방법론들에 비교하여 간편하면서 장소에 구애를 받지 않고, 누구나 손쉽게 이용할 수 있으면서 관찰오차를 줄이는 데 있다.The purpose of the present invention to improve this is to compare the methodologies that have been developed and utilized in order to precisely interpret the biological effect on radiation at the cellular level, it is simple and can be used anywhere, and can be easily used by anyone. To reduce observation errors.
도1a 또는 도 1b는 본 발명에 따른 방사성 고사세포 사멸체 검출방법을 도시한 블록도.Figure 1a or Figure 1b is a block diagram showing a method for detecting radioactive apoptosis according to the present invention.
도2a 또는 도2b는 본 발명에 따른 아크리딘 오렌지(A)와 롸이트-김사(B) 염색 후 사람 림프구내 고사세포체.Figure 2a or Figure 2b is a dead cell in human lymphocytes after acridine orange (A) and Wright-Gimsa (B) staining according to the present invention.
도3a 또는 도3b는 본 발명에 따른 방사선 조사 (2Gy)후 0Gy를 대조로 24시간 후에 변화되는 세포주기를 도시한 그래프.Figure 3a or Figure 3b is a graph showing the cell cycle changed after 24 hours in contrast to 0Gy after irradiation (2Gy) according to the present invention.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 방사선에 대한 혈액이나 조직세포의 형태, 조직학적 변화에 따른 고사세포를 검출하는 검출방법에 있어서, 말초혈액세포에 감마선을 조사하는 단계와, 조사 후 림프구를 히스토파크액을 이용하여 원심분리하고 배양하는 단계와, 배양된 림프구를 세포핵 단편물 고정법에 따라 처리하고 슬라이드 제작하는 단계와, 제작된 슬라이드에 아크리딘 오렌지 염색하는 단계 그리고, 염색된 고사세포 사멸체를 형광현미경으로 확인하는 단계를 포함하여 이루어진다.In order to achieve the above object, the present invention, in the detection method for detecting apoptosis according to the morphology, histological changes of blood or tissue cells for radiation, the step of irradiating gamma rays to the peripheral blood cells, and lymphocytes after irradiation Centrifuging and culturing using histopark solution, treating and culturing the cultured lymphocytes according to the nuclear nucleus fragment fixation method, staining the acridine orange on the prepared slide, and staining dead cells It includes the step of identifying the dead body with a fluorescence microscope.
이때, 제작된 슬라이드를 아크리딘 오렌지 염색하는 단계는, 0.1% 아크리딘 오렌지 염색액을 소렌센 인산완충용액으로 30배 희석한 후, 제작된 슬라이드 위에 희석된 염색액을 30ul 떨어뜨리고, 커버글라스를 포배하는 것을 특징으로 한다.At this time, the acridine orange staining step of the produced slide, the diluted 0.1% acridine orange dye solution with Sorensen phosphate buffer solution 30 times, drop the diluted dye solution 30ul on the produced slide, cover glass Characterized by blasting.
또한, 염색된 고사세포 사멸체를 형광현미경으로 확인하는 단계에서는, 진노랑색에서 녹황색의 형광으로 발하는 세포사멸체가 적어도 두개 이상 관찰될 때 고사세포로 인정하고, 핵과 세포막이 결여되면서 확산되어 관찰되는 경우에는 괴사세포로 정의함으로서 살아있는 세포와 고사세포 및, 괴사세포를 구분한다.In addition, in the step of confirming the stained dead apoptosis by fluorescence microscopy, when at least two or more apoptosis is emitted from dark yellow to green yellow fluorescence is recognized as dead cells, and when the nucleus and cell membranes are observed to diffuse and observed In the definition of necrotic cells, living cells, dead cells and necrotic cells are distinguished.
이하 첨부된 도면에 따라서 본 발명의 기술적 내용을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the technical details of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.
본 발명은 도1a에서 도시된 바와 같이, 먼저 건강한 사람으로 부터 제공된 말초혈액을 선량에 따라 나누고 감마선을 조사한 후 림프구를 히스토파크액으로 원심분리하고 배양한다.In the present invention, as shown in Figure 1a, the peripheral blood provided from a healthy person first divided by dose and irradiated with gamma rays, then lymphocytes are centrifuged with histopark solution and cultured.
계속하여, 배양이 완료된 림프구를 세포핵 단편물 고정법에 따라 처리하고 슬라이드 제작하고, 제작된 슬라이드을 아크리딘 오렌지 염색액으로 염색한다.Subsequently, the cultured lymphocytes are treated according to the nucleus fragment fixation method and slides are prepared, and the prepared slides are stained with acridine orange stain.
이때, 도1b에서 도시된 바와 같이, 아크리딘 오렌지 염색액은 0.1% 보존용액을 준비한 후, 소렌센 인산완충용액(pH 6.8)으로 30배 희석한 후, 제작된 슬라이드 위에 이 희석된 아크리딘 오렌지 염색액을 30ul 떨어뜨린 후, 커버글라스를 포배하게 된다.At this time, as shown in Figure 1b, the acridine orange stain solution prepared 0.1% preservation solution, after diluting 30 times with Sorensen phosphate buffer solution (pH 6.8), the diluted acridine on the produced slide After dropping 30ul of orange stain, cover glass is bred.
그리고, 염색된 세포의 세포사멸체를 형광현미경으로 확인하게 되는데, 이때 진노랑색에서 녹황색의 형광을 발하는 세포사멸체가 적어도 두개 이상 관찰될 때고사세포로 인정하고, 핵과 세포막이 결여되면서 확산되어 관찰되는 경우에는 괴사세포를 구분하게 된다.In addition, the apoptosis of the stained cells is confirmed by fluorescence microscopy, wherein at least two or more apoptosis cells that emit green-yellow fluorescence in dark yellow are recognized as dead cells and are diffused and observed as lacking a nucleus and cell membrane. In the case of necrotic cells will be distinguished.
여기서, 도2a은 아크리딘 오렌지 염색후의 사람 림프구내 세포사멸체(▲)를 도시한 것인 바, 붉은색 세포질을 배경으로 한 녹황색의 핵 단편물이 명확하게 인정되고, 도2b는 롸이트-김사염색 후 세포질을 배경으로 고사세포체가 진한 청색으로 관찰된다.Here, Figure 2a shows a human lymphocyte apoptosis (▲) after acridine orange staining, the greenish yellow nuclear fragment on the background of red cytoplasm is clearly recognized, Figure 2b is a white After dying, the dead apoptosis is observed in dark blue in the cytoplasm.
또한, 도3a과 도3b는 사람 혈액에 방사선을 조사한 후 24시간 후 림프구를 순수분리하여 출현하는 고사세포를 세포주기별로 확인한 것으로 조사 24시간 후 림프구에 일차성 보다는 이차성 세포고사가 선량에 따라서 증가함을 알 수 있다.In addition, Figures 3a and 3b confirmed the death of apoptotic cells appearing by pure separation of lymphocytes after 24 hours after irradiation to human blood by the cell cycle, secondary cell death increases in accordance with the dose rather than primary to lymphocytes 24 hours after irradiation It can be seen.
이와같은 본 발명의 실시예를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.When explaining the embodiment of the present invention in more detail as follows.
본 발명의 공정의 첫 단계로서 건강한 사람 5명으로부터 말초혈액을 제공받은 후 조사선량에 따라 6개 그룹(0, 10, 50, 100, 200, 400cGy)으로 나누어 선원을 Cs-137(0.8Gy/min)으로 하는 감마선 발생장치를 이용하여 조사한다.As a first step in the process of the present invention After receiving peripheral blood from 5 healthy people, a gamma ray generator with Cs-137 (0.8 Gy / min) was divided into 6 groups (0, 10, 50, 100, 200, 400 cGy) according to the irradiation dose. Investigate using
방사선 조사 후 림프구를 히스토파크액을 이용하여 원심분리하고 배양하고. 배양액은 RPMI 1640(Gibco, USA)에 FBS(15%), PWM(2.5㎕/ml) 그리고 PHA(20㎕/ml)를 첨가하여 만들며 배양기(5% CO2, 37oC)에서 24시간 동안 세포배양을 한다.After irradiation, lymphocytes were centrifuged using histopark solution and incubated. The culture was made by adding FBS (15%), PWM (2.5 μl / ml) and PHA (20 μl / ml) to RPMI 1640 (Gibco, USA) and incubating the cells for 24 hours in an incubator (5% CO2, 37oC). do.
배양이 끝난 림프구는 통상적인 핵 단편물 고정법에 따라 처리하고 슬라이드로 제작하여 관찰하고, 정상세포 핵의 형태와 비교하여 핵의 단편물인 고사세포체가 적어도 두개 이상 관찰될 때 고사세포로서 인정하며, 핵과 세포막이 결여되면서 확산되어 관찰되는 경우는 괴사세포로 구분한다.The cultured lymphocytes are treated according to the usual nuclear fragment fixation method, prepared as slides, and observed as at least two apoptotic bodies, which are fragments of the nucleus, compared to the normal cell nuclei. If the cell membrane is lacking in diffusion and observed is classified as necrotic cells.
제작된 슬라이드에 대하여 아크리딘 오렌지 염색과 롸이트-김사(Wright-Giemsa)염색을 한 후 고사 세포 사멸체를 갖는 세포의 출현빈도를 비교한다.0.1%의 아크리딘 오렌지(Wako, Japan) 보존용액을 준비한 후, 소렌센 인산완충용액(pH 6.8)을 이용하여 30배 희석하고, 제작된 슬라이드 위에 희석용액을 30ul 떨어뜨리고 커버글라스를 포배하여 형광현미경(BA-2필터장착)아래서 고사세포 사멸체를 갖는 세포를 확인한다. 이때, 아크리딘 오렌지 염색된 고사세포체는 진노랑색에서 녹황색의 형광을 발하며, 갈적색의 세포질을 배경으로 구별되어 관찰된다.Acredine orange staining and Wight-Giemsa staining of the prepared slides were performed to compare the frequency of appearance of cells with apoptotic cell death bodies. 0.1% of acridine orange (Wako, Japan) After preparing the preservation solution, dilute 30 times with Sorensen phosphate buffer solution (pH 6.8), drop 30ul of the dilution solution on the prepared slide, and cover the glass to kill dead cells under the fluorescence microscope (BA-2 filter mounting). Identify cells with sieves. At this time, the acridine orange stained dead cell body emits fluorescence of yellowish green to dark yellow, and is distinguished from the background of brownish red cytoplasm.
또한, 비교대상인 롸이트-김사염색 후 고사세포 출현빈도를 확인하기 위하여, 동일 시료 슬라이드에 롸이트-김사액(Merck)를 인산완충액(pH 6.8)으로 최종농도(4%)로 희석하여 염색하고 광학현미경하에서 관찰하면 진청색의 고사세포 사멸체가 확인된다.In addition, in order to confirm the frequency of the death of dead cells after the comparison of white-Gimsa staining, the white-Gimsa solution (Merck) was diluted with a phosphate buffer (pH 6.8) to a final concentration (4%) and stained on the same sample slide. Observation under an optical microscope reveals dark blue apoptosis.
[표1]과 [표2]를 통해 롸이트-김사와 아크리딘 오렌지 염색을 비교하면 다음과 같다.[Table 1] and [Table 2] to compare the white-kimsa and acridine orange stains are as follows.
[표 1] 롸이트-김사와 아크리딘 오렌지 염색 후 관찰되는 세포사멸체를 갖는 고사세포의 출현빈도차이Table 1 Frequency of appearance of apoptosis with apoptotic bodies observed after white-kimsa and acridine orange staining
상기 표1에 의하면, 동일 시료에 대하여 롸이트-김사와 아크리딘 오렌지 염색 한 후 세포사멸체를 갖는 고사세포의 관찰빈도를 기록한 것으로 아크리딘 오렌지 염색 후에 관찰 표준편차가 작게 관찰됨을 알 수 있다.According to Table 1, the frequency of observation of apoptosis cells having apoptotic bodies after staining of white-Gimsa and acridine orange was recorded for the same sample, and the standard deviation observed after acridine orange was observed to be small. have.
[표 2] 본 발명에서 활용한 아크리딘 오렌지 염색법과 롸이트-김사 염색법의 염색 절차 비교[Table 2] Comparison of the dyeing procedure of the acridine orange staining method and the white-kimsa staining method utilized in the present invention
상기 표2에 의하면, 기존에 개발되어 이용되고 있는 롸이트-김사염색법에 비교하여 아크리딘 오렌지 염색법은 시료 관찰 전단계인 슬라이드 제작과정 중 건조, 염색, 세척, 건조 그리고 관찰에 필요한 시간을 적어도 26시간 정도 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 검출 예민도 역시 높일 수 있다. According to Table 2, the acridine orange staining method compared with the conventionally developed and used white-kimsa staining method, the time required for drying, dyeing, washing, drying and observing during the slide manufacturing process before the sample observation was at least 26 Not only can the time be shortened, but the detection sensitivity can also be increased.
한편, 고사세포체의 존재를 Annexin V-FITC Kit (Immunotech, France) 염색방법을 통해 유세포분석기로 확인할 수 있다. 즉, 방사선 조사 후 배양한 림프구를 PBS로 4oC에서 500g, 5분동안 원심분리 후 상층액을 버리고, 5×106- 5×106세포수/ml로 완충용액을 이용해 희석한다. 림프구가 포함된 100㎕ 완충용액에 Annexin V-FITC 1㎕ 와 Propidium iodide 5㎕를 첨가한 후 4℃에서 차광하여 10분 동안 염색한다. 염색된 림프구를 유세포분석기로 세포주기를 확인 한 후 System IITM XLTM 프로그램을 이용하여 분석한다.On the other hand, the presence of apoptosis can be confirmed by flow cytometry through the staining method of Annexin V-FITC Kit (Immunotech, France). That is, after irradiation, and then centrifuged for 500g, 5 minutes at 4oC to cultured lymphocytes in PBS discard the supernatant, 5 × 10 6 - Dilute with a 5 × 10 6 cells in a buffer number / ml solution. Add 1 μl of Annexin V-FITC and 5 μl of Propidium iodide to 100 μl buffer solution containing lymphocytes, and then stain at 10 ° C. for 10 minutes. Stained lymphocytes are analyzed by flow cytometry and analyzed using the System II XL XL program.
이상에서 살펴본 바와 같이, 세포고사기전을 해석하는데 있어서, 아크리딘오렌지 염색액에 의해 세포내 고사세포체뿐만 아니라 핵 단편물의 존재가 세포질의 색깔을 배경으로 명확히 구별할 수 있는 장점이 있다.As described above, in the analysis of apoptosis, the presence of nuclear fragments as well as intracellular apoptosis by acridine orange staining solution has the advantage that can be clearly distinguished against the background of the cytoplasm color.
또한, 본 발명을 통해 아크리딘 오렌지 염색법에 의해서 고사세포를 염색하는 방법론적 단순화하고, 사람 림프구에 나타나는 세포고사 기전을 유세포분석기로 확인하여, 아크리딘 오렌지 염색에 의하여 관찰되는 세포고사가 일차 및 이차성 고사세포라는 것을 알 수 있다.In addition, the present invention simplifies the methodological method of staining dead cells by acridine orange staining method, Apoptosis mechanisms appearing in human lymphocytes can be confirmed by flow cytometry, indicating that the apoptosis observed by acridine orange staining is primary and secondary apoptosis.
아울러, 본 발명은 상기의 발명기법을 방사선 피폭에 대한 영향평가법으로 확대 적용하였고, 인체 혈액 림프구를 대상으로 10cGy이하 뿐만 아니라 고선량 방사선 영역에 대한 피폭 선량-반응관계를 확인하여, 방사선 생물학적 선량평가법으로 정립하였다고 할 수 있다.In addition, the present invention was extended to the impact assessment method for the radiation exposure, the radiation biological dose assessment method by confirming the dose-response relationship in the high dose radiation region as well as 10cGy or less in human blood lymphocytes It can be said that it was established as.
따라서, 본 발명은 1) 세포고사 기전중에 나타나는 고사세포체 뿐만 아니라 핵 단편을 선택적으로 형광염색하여 명확히 구분할 수 있게 되었으며, 2) 세포의 사멸기전을 살아있는 세포, 고사세포, 괴사세포로 명확히 구분할 수 있게 되었을 뿐만 아니라 세포를 선택적으로 구분하여 분석하는 경우에 표준편차를 줄일 수 있다. 또한, 3) 기술습득의 어려움이 없이 단시간에 대량의 세포를 분석할 수 있게 되었으며, 4) 기존에 개발되어 이용되고 있는 방법론들에 비교하여 기구나 시료의 처리절차가 불필요하기 때문에 경제적이면서 작업시간을 대폭 줄일 수 있는 것이다.Accordingly, the present invention can be clearly distinguished by 1) selectively fluorescently staining nuclear fragments as well as apoptosis bodies appearing in the cell death mechanism, and 2) to clearly distinguish the death mechanism of cells into living cells, apoptosis cells, and necrotic cells. In addition, the standard deviation can be reduced when cells are selectively separated and analyzed. In addition, 3) it is possible to analyze a large amount of cells in a short time without difficulty in acquiring technology, and 4) it is economical and working time because the processing procedure of instruments or samples is unnecessary as compared to the existing methodologies developed and used. This can greatly reduce.
본 발명은 특정한 실시 예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 정신이나 분야를 벗어나지 않는 한도내에서본 발명이 다양하게 개량 및 변화 될 수 있다는 것을 당업계에서 통상의 지식을 가진자는 극히 용이하게 알 수 있음을 밝혀 두고자 한다.While the invention has been shown and described with respect to specific embodiments thereof, it will be appreciated that the invention can be variously modified and modified without departing from the spirit or scope of the invention as provided by the following claims. It will be clear to those skilled in the art that it is extremely easy to know.
이와같이 본 발명에 의하면, 첫째 방사선에 대한 세포고사 기전 중에 있는 세포를 신속하게 검출할 수 있고, 둘째 세포고사 기전 중에 있는 세포를 살아있는 세포, 고사세포, 괴사세포로 구분할 수 있고, 셋째 세포질이 조금만 남아도 고사세포체의 존재를 파악할 수 있고, 넷째 세포고사 분석을 위한 전문적인 지식 및 기술이 필요치 않고, 다섯째 시료의 준비절차가 간단하며 짧은 시간에 대량의 시료를 처리할 수 있으며, 여섯째 시료염색 절차가 간편화되어 실험실적인 제한을 받지 않고, 일곱째 방법적인 단점에 기인한 실험오차를 줄일 수 있으며, 여덟째 고가의 분석장비나 시약이 필요치 않아 경제적으로도 우수한 효과가 있는 것이다.Thus, according to the present invention, the cells in the cell death mechanism for the first radiation can be detected quickly, and the cells in the cell death mechanism can be classified into living cells, dead cells, and necrotic cells, and the third cytoplasm remains little. The presence of dead apoptosis can be identified, the fourth expert does not require specialized knowledge and skills for the analysis of apoptosis, the preparation of the fifth sample is simple, the large amount of sample can be processed in a short time, and the sixth sample staining procedure Simplified and not subject to laboratory limitations, it is possible to reduce the experimental errors caused by the seventh method drawback, and the eighth expensive analysis equipment or reagents are not necessary economically excellent effect.
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|---|---|
| KR20050005250A true KR20050005250A (en) | 2005-01-13 |
Family
ID=37219661
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020030044267A KR20050005250A (en) | 2003-07-01 | 2003-07-01 | Rapid determination of apoptotic cells by acridine orange dye staining method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20050005250A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113670696A (en) * | 2021-07-28 | 2021-11-19 | 上海睿钰生物科技有限公司 | Staining solution for cell staining and preparation method thereof |
-
2003
- 2003-07-01 KR KR1020030044267A patent/KR20050005250A/en not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113670696A (en) * | 2021-07-28 | 2021-11-19 | 上海睿钰生物科技有限公司 | Staining solution for cell staining and preparation method thereof |
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