KR20050004207A

KR20050004207A - Method for Creating Polynucleotide Molecules

Info

Publication number: KR20050004207A
Application number: KR10-2004-7018944A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠스 마투스체크; 베른하르트 허이어
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2005-01-12
Also published as: JP2005529596A; CN1656221A; WO2003100058A2; WO2003100058A3; MXPA04011554A; AU2003240683A1; EP1511842A2; DE10223057A1; CA2485218A1

Abstract

본 발명은,The present invention,

(a) 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 집단을 제공하며, 상기 분자 집단의 개별 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 상동성 서열 절편 및 하나 이상의 이종성 서열 절편을 갖는 것인 단계,(a) providing a double stranded polynucleotide molecule or a double stranded polynucleotide molecule population, wherein individual polynucleotides of the molecular population have one or more homologous sequence segments and one or more heterologous sequence segments,

(b) 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에서 단일 가닥 절단부를 생성시키는 단계,(b) generating a single stranded cleavage in the double stranded polynucleotide molecule,

(c) 상기 단일 가닥 절단부에서 시작해서 5' → 3' 방향으로 핵용해성 분해를 수행하고 동시에 5' → 3' 방향으로 새로 합성을 수행하여 상기 단일 가닥 절단부를 3' 말단의 방향으로 이동시키는 단계,(c) starting the single-strand cut and performing nucleolytic digestion in the 5 '→ 3' direction and simultaneously performing a new synthesis in the 5 '→ 3' direction to move the single strand cut in the direction of the 3 'end ,

(d) 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는 단계,(d) preparing a single stranded polynucleotide molecule,

(e) 단계 (d)에 의해 제공되는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는 단계, 및(e) preparing a polynucleotide molecule that is partially double stranded with respect to the single stranded polynucleotide molecule provided by step (d), and

(f) 단계 (e)에서 제조된 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 분자에서 시작해서 템플레이트-지정된 핵산 합성을 수행하는 단계(f) performing template-designated nucleic acid synthesis starting from the partially double stranded polynucleotide molecule prepared in step (e)

를 포함하는 사이클을 수행하는 것을 포함하며, 단계 (b) 및 (c)를 연속적으로 또는 동시에 수행할 수 있는 것인, 변화된 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다.It relates to a method of producing a polynucleotide molecule having changed properties, comprising performing a cycle comprising; and wherein the steps (b) and (c) can be carried out continuously or simultaneously.

Description

폴리뉴클레오티드 분자의 제조 방법 {Method for Creating Polynucleotide Molecules}Method for Creating Polynucleotide Molecules {Method for Creating Polynucleotide Molecules}

본 발명은 변화된 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자의 제조 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for the preparation of polynucleotide molecules with altered properties.

생분자, 특히 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 폴리사카라이드 등과 같은 생중합체는 알려져 있는 바와 같이 생명의 근간을 이룰뿐만 아니라, 다양한 산업 분야 전반에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 근대 생물공학의 주제는 신규 기능성 생분자, 그의 단리 및 제조, 및 그의 산업적 이용에 대한 연구이다. 최근에는, 자연에서 목적하는 특성을 갖는 기지의 생분자를 우연히 찾아내는 것 이외에도, 실험실에서 자연 진화의 원리를 모방하는 방법들이 등장하고 있다.Biomolecules, in particular biopolymers such as polynucleotides, polypeptides, polysaccharides and the like, are not only the basis of life as is known, but are also increasingly used throughout various industries. The subject of modern biotechnology is the study of novel functional biomolecules, their isolation and manufacture, and their industrial use. In recent years, in addition to accidentally finding known biomolecules with the desired properties in nature, methods have also emerged that mimic the principles of natural evolution in laboratories.

(염기의 교환, 결실 및 삽입 형태의) 점 돌연변이를 생성시키는 방법 이외에도, 서열 절편을 재조합하는 것은 자연에서 점 돌연변이를 조합하는데 있어서 매우 성공적인 전략이며, 중합체내의 도메인, 이종다합체의 서브유닛, 유전자 클러스터내의 유전자 변이체 또는 게놈내 유전자를 조합할 수도 있다. 상동성 재조합, 즉 상이한 변이체로부터 유래하지만 배향 및 리딩 프레임을 유지하는 상응하는 서열 절편의 조합이 특히 중요하다.In addition to generating point mutations (in the form of base exchange, deletion, and insertion), recombination of sequence fragments is a very successful strategy in combining point mutations in nature, including domains in polymers, subunits of heteromultimers, genes Gene variants in clusters or genes in genomes may be combined. Of particular interest is homologous recombination, ie the combination of corresponding sequence fragments derived from different variants but retaining the orientation and reading frame.

실험적으로, 재조합은 다양한 방법으로 수행할 수 있다: 먼저, 시험관내에서 효소 프로세싱 단계의 개별 효소 기능 또는 정해진 혼합물 또는 서열을 사용하고, 다음으로는 생체내에서 세포 재조합 및(또는) 복구 프로세스를 이용한다.Experimentally, recombination can be performed in a variety of ways: first, using individual enzyme functions or defined mixtures or sequences of enzyme processing steps in vitro, and then using cell recombination and / or repair processes in vivo. .

산업 규모의 시험관내 방법에서는 주로 PCR-기초의 방법들이 이미 사용되어 왔다. 본원에서 언급할 첫번째 방법은 세큐얼(secual) PCR이라고도 부르는 DNA 셔플링(shuffling) 방법 [WO 95/22625; Stemmer, Nature 370 (1994), 389]이다. 이 경우, 중첩하는 서열을 갖는 랜덤 유전자 단편을 생성시킨 다음, 프라이머를 부가하지 않고 PCR에 의해 재구성하여 본래 길이의 생성물을 얻는다. 따라서, 각 PCR 사이클에서, 상이한 기원의 단편들이 서로를 프라이밍함으로써 랜덤하게 상동성으로 조합하여 생성물 분자를 얻는다. 원칙적으로, DNA 셔플링에서는 단편 길이를 조정함으로써 재조합 반응의 빈도수를 제한할 수 있다. 그러나, 이러한 방법은 먼저 핵산 단편을 생성시키기 위한 반응 조건을 확립해야하기 때문에 실험적으로 복잡하다. 시험관내에서 재조합 DNA를 제조하는 다른 방법은 문헌 [Shao et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998), 681]에 보고되어 있다. 이 방법은 랜덤화된 서열을 갖는 프라이머를 사용하며, 중합 반응이 폴리뉴클레오티드내의 랜덤 부위에서 시작할 수 있도록 한다. 따라서, DNA 셔플링과 유사하게, 서로를 프라이밍함으로써 서로 재조합할 수 있는 짧은 폴리뉴클레오티드 단편들이 생성된다. 이 방법을 이용하면 재조합 빈도수를 조절하는 것은 거의 불가능하다. 게다가, 비-특이적 프라이머는 상대적으로 높은 고유의 에러율을 일으키는데, 이는 민감한 서열 절편 및(또는) 긴 유전자에 있어서 문제가 될 수 있다. 이러한 방법에 대한 대안으로서, 스태거드 (staggered) 연장 방법 [WO 98/42728; Zhao et al., Nat. Biotechnol.(1998), 258]은 변형된 PCR 프로토콜을 이용하여 PCR 증폭 동안 가닥(strand)의 교환을 자극한다. 중합 온도에서 용융 상(phase)과 어닐링 상 사이의 매우 짧은 상을 이용함으로써, 불완전한 생성물이 새로운 템플레이트와 혼성화하여 더 연장될 수 있다. 재조합 빈도수는 중합 시간 및 사이클 수를 미리 설정함으로써 조절할 수 있다. 여기서 기술적인 한계는 특정 온도에서 매우 짧은 상을 정확히 설정하는 것이다. 이러한 PCR 기초의 방법에 대한 대안으로서, 돌연변이를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열의 집단으로부터 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 생성시킨 다음, 상기 헤테로듀플렉스를 세포에 도입하여 생체내에서 랜덤 복구하거나 또는 상기 헤테로듀플렉스를 세포 추출물과 함께 시험관내에서 인큐베이션함으로써, 출발 집단내의 재조합 분자 변이체의 상대적 빈도에 따라 소정 비율의 상기 변이체를 얻는 방법이 개시되었다 (WO 99/29902). 이 방법은, 쌍을 형성하지 않은 염기를 특이적으로 인식하고 이중 가닥에서 두 가닥의 각각을 랜덤하게 복구하는 세포 복구 시스템의 사용을 특징으로 한다. 이 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하는데 있어서의 제한된 효율 및 복구 프로세스의 오류 조절능에서의 한계가 있다. 또한, 결정적인 단점은 각 복구 단계에서 단지 2개의 출발 분자만이 서로 재조합할 수 있다는 사실이다.In industrial scale in vitro methods, mainly PCR-based methods have already been used. The first method to be mentioned herein is the DNA shuffling method, also called secrual PCR [WO 95/22625; Stemmer, Nature 370 (1994), 389. In this case, random gene fragments with overlapping sequences are generated and then reconstituted by PCR without addition of primers to obtain products of original length. Thus, in each PCR cycle, fragments of different origins are combined in random homology by priming each other to obtain product molecules. In principle, DNA shuffling can limit the frequency of recombination reactions by adjusting fragment length. However, this method is experimentally complex because it first requires establishing reaction conditions for generating nucleic acid fragments. Other methods of making recombinant DNA in vitro are described in Shao et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998), 681. This method uses primers with randomized sequences, allowing the polymerization reaction to start at random sites in the polynucleotide. Thus, similar to DNA shuffling, short polynucleotide fragments are produced that can be recombined with each other by priming each other. Using this method, it is almost impossible to control the recombination frequency. In addition, non-specific primers produce relatively high inherent error rates, which can be problematic for sensitive sequence fragments and / or long genes. As an alternative to this method, the staggered extension method [WO 98/42728; Zhao et al., Nat. Biotechnol. (1998), 258, uses modified PCR protocols to stimulate strand exchange during PCR amplification. By using a very short phase between the molten phase and the annealing phase at the polymerization temperature, the incomplete product can hybridize with the new template and be further extended. Recombination frequency can be adjusted by presetting polymerization time and cycle number. The technical limitation here is to correctly set a very short phase at a certain temperature. As an alternative to such PCR based methods, heteroduplexes are generated from a population of polynucleotide sequences with mutations, and then the heteroduplexes are introduced into cells to randomly recover in vivo or the heteroduplexes are cell extracts. By incubating with in vitro, a method has been disclosed for obtaining a predetermined ratio of such variants depending on the relative frequency of recombinant molecular variants in the starting population (WO 99/29902). This method features the use of a cell repair system that specifically recognizes unpaired bases and randomly repairs each of the two strands in the double strand. This method has limited efficiency in introducing polynucleotides into cells and limitations in error control of the repair process. In addition, a crucial disadvantage is the fact that only two starting molecules can recombine with each other in each repair step.

본 발명의 목적은 변화된 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공하는데 있는데, 이 방법은 상기 기술한 공지된 방법의 단점을 갖지 않으며, 폴리뉴클레오티드 분자의 유전자형을 효과적으로 재조합함으로써 변화된 표현형을 나타낼 수 있다.It is an object of the present invention to provide a method for preparing a polynucleotide having altered properties, which does not have the disadvantages of the known methods described above, and can exhibit a changed phenotype by effectively recombining the genotype of the polynucleotide molecule. .

본 발명자들은 상기 목적이 청구의 범위에 기재된 실시양태를 제공함으로써 달성됨을 밝혀냈다.The inventors have found that this object is achieved by providing the embodiments described in the claims.

따라서, 본 발명은Therefore, the present invention

(c) 상기 단일 가닥 절단부에서 시작해서 5' → 3' 핵용해성 분해를 수행하고 동시에 5' → 3' 드-노보(de-novo) 합성을 수행하여 상기 단일 가닥 절단부를 3' 말단의 방향으로 이동시키는 단계,(c) starting at the single strand cut and performing 5 '→ 3' nucleolytic digestion, and simultaneously performing 5 '→ 3' de-novo synthesis to perform the single strand cut in the direction of the 3 'end. Moving,

를 포함하는 사이클을 1회 이상 수행하는 것을 포함하며, 단계 (b) 및 (c)를 연속적으로 또는 동시에 수행할 수 있는 것인, 변화된 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다.It relates to a method of producing a polynucleotide molecule having changed properties, comprising performing one or more cycles comprising, and being able to perform steps (b) and (c) continuously or simultaneously.

따라서, 본 발명의 방법은 본 발명 이전에 기술된 어떤 방법에 의해서도 달성할 수 없는, 여러 이점이 조합된 우수한 방법이다. 본 발명의 방법의 추가의 이점은 실험적으로 별로 복잡하지 않고, 적은 시간이 소요되며, 자동화할 수 있다는 점이다.Thus, the method of the present invention is an excellent method that combines several advantages that cannot be achieved by any of the methods described before the present invention. A further advantage of the method of the present invention is that it is not experimentally complex, takes less time and can be automated.

본 발명의 방법은 동시적 핵용해성 분해 및 핵산 합성, 즉 "닉 번역(nick translation)"에 의해 과량의 핵산 단편화 및 재조합가능한 핵산의 분해 둘 다를 방지할 수 있다는 점에서 우수하다. 원칙적으로는, 사용된 DNA의 전량을 이후에 시험관내에서 상기 핵산을 재조합하는데 이용할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내에서 핵산을 재조합하는데 있어서 이전에 기술된 방법에 비해 재조합 효율을 증가시킬 수 있다.The method of the present invention is excellent in that it can prevent both excessive nucleic acid fragmentation and degradation of recombinable nucleic acid by simultaneous nucleolytic digestion and nucleic acid synthesis, ie "nick translation". In principle, the entire amount of DNA used can then be used to recombine the nucleic acid in vitro. Such methods can increase recombination efficiency compared to previously described methods for recombining nucleic acids in vitro.

바람직한 실시양태는 상기 언급한 단계 (a) 내지 (d)를 포함하는 사이클을 1회 초과, 즉 2회 이상, 바람직하게는 5회 이상, 특히 바람직하게는 10회 이상, 매우 특히 바람직하게는 20회 이상 수행하는 것을 포함한다.Preferred embodiments comprise more than one, ie at least two, preferably at least 5, particularly preferably at least 10, very particularly preferably 20 cycles comprising the abovementioned steps (a) to (d) Involves performing more than once.

따라서, 본 발명의 방법의 사이클을 적용하여 관련된 폴리뉴클레오티드 서열의 시작 분포로부터 새롭게 수회 조합된 서열 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 특히, 상기 사이클을 적용하여 복수개의 상이한 이종성 서열 절편을 서로 조합할 수 있다. 또한, 사이클의 횟수를 통해 폴리뉴클레오티드 가닥 당 재조합 빈도수를 정확하게 조절할 수 있다. 이러한 방식으로 사이클을 적용해서 하나의 사이클로부터 다른 사이클 사이의 재조합 반응 사이의 평균 간격을 조절할 수도 있다.Thus, the cycles of the methods of the invention can be applied to produce polynucleotides having sequence regions that have been newly combined several times from the starting distribution of related polynucleotide sequences. In particular, the cycle can be applied to combine a plurality of different heterologous sequence fragments with each other. In addition, the number of cycles allows precise control of the frequency of recombination per polynucleotide strand. Cycles may be applied in this manner to adjust the average interval between recombination reactions from one cycle to another.

더 바람직한 실시양태에서, 선별 단계는 본 발명의 방법의 한 사이클, 몇몇사이클 또는 모든 사이클 이후에 수행한다. 상기 선별 단계는 폴리뉴클레오티드의 유전자형 또는 표현형, 또는 유전자형 및 표현형 둘 다와 관련될 수 있다.In a more preferred embodiment, the screening step is carried out after one, several or all cycles of the process of the invention. The selection step may involve genotypes or phenotypes of polynucleotides, or both genotypes and phenotypes.

이와 관련해서, 폴리뉴클레오티드의 유전자형은 상기 폴리뉴클레오티드에서 상이한 단량체들의 서열이다. 표현형은 폴리뉴클레오티드 분자와 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 전사 또는 번역 생성물의 기능 및 특성의 합이다.In this regard, the genotype of a polynucleotide is the sequence of different monomers in said polynucleotide. Phenotypes are the sum of the functions and properties of polynucleotide molecules and transcriptional or translational products encoded by the polynucleotides.

선별 단계는, 예를 들어 증폭과 연결된 (자연적인) 선별, 물리적 분리에 의한 선별 또는 스크리닝에 의한 선별로서 수행할 수 있다 [Koltermann and Kettling, Biophys. Chem. 66 (1999), 159; Kettling et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 243 (1999), 173; Koltermann, Dissertation, TU Berlin (1998), Zhao et al., in Manual of Ind. Microbiol. and Biotechnol. Chapter 49, pp. 597604, ASM Press, Washington, DC, 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 113, 292-320]. 본 발명의 방법의 단계 (a)는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 집단을 제공한다.The screening step can be performed, for example, as (natural) screening linked to amplification, screening by physical separation or screening by screening [Koltermann and Kettling, Biophys. Chem. 66 (1999), 159; Kettling et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol. 243 (1999), 173; Koltermann, Dissertation, TU Berlin (1998), Zhao et al., In Manual of Ind. Microbiol. and Biotechnol. Chapter 49, pp. 597604, ASM Press, Washington, DC, 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 113, 292-320. Step (a) of the method of the present invention provides a double stranded polynucleotide molecule or a double stranded polynucleotide population.

본 발명의 방법의 단계 (a)에 따라 제공되는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 집단은 2 종 이상의 유형의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 하나 이상의 상동성 서열 절편 및 하나 이상의 이종성 서열 절편을 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 임의의 집단일 수 있다. 이와 관련해서, "이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 집단"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 분자의 양을 의미하는데, 상기 분자들 사이에서 특정 염기쌍을 형성하는 형태의 분자간 상호작용은 방지되거나 또는 존재하지 않는다. 본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드" (핵산, 올리고뉴클레오티드)라는 용어는 DNA 및 RNA 둘 다를 포함하며, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태일 수 있는, 선형의 배향된 (5' → 3') 헤테로중합체이다. 이중 가닥에서, 2 개의 단일 가닥들이 특정 염기쌍을 형성하는 형태의 상호작용을 통해 서로 결합한다. 원칙적으로, 폴리뉴클레오티드는 변형된 단량체를 갖는 DNA 또는 RNA일 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 유사하게 구성된 인공 중합체에 적용할 수도 있고, DNA-RNA 하이브리드 이중 가닥에 적용할 수도 있다.The population of double-stranded polynucleotide molecules provided according to step (a) of the method of the present invention is a double-stranded strand comprising one or more homologous sequence segments and one or more heterologous sequence segments, comprising two or more types of polynucleotide molecules. It can be any population of polynucleotide molecules. In this regard, the term “double stranded polynucleotide molecule population” refers to the amount of polynucleotide molecules, in which the intermolecular interactions that form specific base pairs between the molecules are prevented or absent. The term "polynucleotide" (nucleic acid, oligonucleotide) as used herein includes both DNA and RNA, wherein the polynucleotide is a linearly oriented (5 '→ 3') heteropolymer, which may be in single stranded or double stranded form. to be. In a double strand, two single strands bind to each other through an interaction in the form of a specific base pair. In principle, the polynucleotide may be DNA or RNA with modified monomers. In general, the methods of the present invention may be applied to similarly constructed artificial polymers or to DNA-RNA hybrid double strands.

"상동성 절편"이라는 용어는 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에서 동일하거나 또는 상보적인 절편, 즉 상응하는 위치에서 동일한 정보를 함유하는 절편을 의미한다. "이종성 절편"이라는 용어는 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자에서 동일하지 않거나 상보적이 아닌 절편, 즉 상응하는 위치에서 상이한 정보를 함유하는 절편을 의미한다. 본 명세서에서 폴리뉴클레오티드 분자의 정보 (유전자형)는 폴리뉴클레오티드 분자에서 상이한 단량체의 서열을 의미한다. 이종성 서열 영역의 길이는 뉴클레오티드 1 개 이상의 길이이지만, 실질적으로는 이보다 더 길 수도 있다. 이종성 서열 영역의 길이는 특히 뉴클레오티드 2 개의 길이, 또는 뉴클레오티드 3개 (예, 코돈)의 길이, 바람직하게는 뉴클레오티드 5 개 초과의 길이, 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 10 개 초과의 길이일 수 있다. 원칙적으로, 이종성 영역의 길이는 상한을 갖지 않는다. 그러나, 바람직하게는, 이종성 영역은 뉴클레오티드 10,000 개 이하, 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 5,000 개 이하, 보다 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 2,000 개 이하, 매우 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 1,000 개 이하이어야 한다. 상대적으로 긴 길이의 이러한 종류의 서열 절편은, 예를 들어 항체, 단백질 도메인을 코딩하는 서열의 초가변 영역, 유전자 클러스터내의 유전자 또는 게놈의 영역일 수 있다. 이종성 영역은 폴리뉴클레오티드 분자가 각 염기에서 서로 다른 서열 영역인 것이 바람직하다. 그러나, 이종성 영역은 폴리뉴클레오티드 분자내에 존재하거나 상기 분자에서 발생하는 결실, 복제, 삽입, 역위 또는 기타의 것을 기초로 할 수도 있다.The term “homologous fragments” means fragments that are identical or complementary in two or more polynucleotide molecules, ie, fragments containing the same information at corresponding positions. The term “heterologous fragment” means a fragment that is not identical or complementary in two or more polynucleotide molecules, ie, fragments containing different information at corresponding positions. Information (genotype) of a polynucleotide molecule herein means a sequence of different monomers in the polynucleotide molecule. The length of the heterologous sequence region is one or more nucleotides in length, but may be substantially longer. The length of the heterologous sequence region can be in particular two nucleotides in length, or three nucleotides (eg, codons) in length, preferably more than five nucleotides in length, particularly preferably more than ten nucleotides in length. In principle, the length of the heterologous region does not have an upper limit. However, the heterologous region should preferably be at most 10,000 nucleotides, particularly preferably at most 5,000 nucleotides, more particularly preferably at most 2,000 nucleotides, very particularly preferably at most 1,000 nucleotides. Sequence fragments of this kind of relatively long length can be, for example, hypervariable regions of sequences encoding antibodies, protein domains, regions of genes or genomes in gene clusters. The heterologous region is preferably a sequence region in which the polynucleotide molecule is different at each base. However, heterologous regions may be based on deletions, duplications, insertions, inversions or the like present in or occurring in a polynucleotide molecule.

본 발명의 방법의 단계 (a)에 따라 제공되는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자는 본 발명에 따라 하나 이상의 상동성 서열 영역 및 하나 이상의 이종성 서열 영역을 갖는다. 그러나, 바람직하게는, 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자는 다수개의 상동성 및 이종성 절편을 갖는다. 원칙적으로, 상동성 및 이종성 절편의 수에 있어서의 상한은 없다.The double stranded polynucleotide molecule provided according to step (a) of the method of the present invention has at least one homologous sequence region and at least one heterologous sequence region according to the present invention. Preferably, however, the double stranded polynucleotide molecule has a plurality of homologous and heterologous fragments. In principle, there is no upper limit in the number of homologous and heterologous fragments.

상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자내 이종성 절편에는 각 경우에서 상동성 절편이 개재되어 있다. 이와 관련해서, 상동성 절편의 길이는 주로 뉴클레오티드 5 개 이상, 바람직하게는 10 개 이상, 특히 바람직하게는 20 개 이상의 길이를 갖는다. 그러나, 이종성 절편과 유사하게, 상동성 절편은 실질적으로 이보다 더 길 수 있으며, 원칙적으로 길이에 있어서의 상한은 없다. 상동성 절편의 길이는 주로 뉴클레오티드 50,000 개 이하, 바람직하게는 뉴클레오티드 20,000 개 이하, 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 10,000 개 이하, 매우 특히 바람직하게는 뉴클레오티드 1,000 개 이하의 길이이어야 한다.The heterologous fragment in the double-stranded polynucleotide molecule is interposed with a homologous fragment in each case. In this regard, the homologous fragments have a length of at least 5 nucleotides, preferably at least 10 and particularly preferably at least 20. However, similar to heterologous fragments, homologous fragments can be substantially longer than this, and in principle there is no upper limit in length. Homologous fragments should be predominantly up to 50,000 nucleotides long, preferably up to 20,000 nucleotides, particularly preferably up to 10,000 nucleotides, very particularly preferably up to 1,000 nucleotides.

이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자는 당업자에게 공지된 방법에 의해 본 발명의 방법의 단계 (a)에 따라 제공될 수 있다. 이러한 방법으로는 예를 들어 물리적, 화학적, 생화학적 및 생물학적 방법이 포함된다. 그러한 방법으로는 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의한 핵산의 합성, 플라스미드, 코스미드, 파아지, BAC (박테리아 인공 염색체), YAC (효모 인공 염색체) 또는 염색체 DNA의 제조와 같은 합성 방법 및 제조 방법 모두가 포함된다.Double stranded polynucleotide molecules can be provided according to step (a) of the methods of the invention by methods known to those skilled in the art. Such methods include, for example, physical, chemical, biochemical and biological methods. Such methods include, for example, chemical synthesis of oligonucleotides, synthesis of nucleic acids by polymerase chain reaction (PCR), plasmids, cosmids, phages, BAC (bacterial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes) or chromosomal DNA. Both synthetic methods such as preparation and preparation methods are included.

본 발명의 방법의 특히 바람직한 실시양태에서, 유사종(quasispecies)의 돌연변이체 분포로부터 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 사용함으로써 상동성 및 이종성 절편을 갖는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 집단을 제공한다. 본 명세서에서 "관련된"이라는 용어는 특히, 상동성 및 이종성 절편이 둘 다 존재하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 유사종은 서로 관련된 분자 변이체(돌연변이체)의 동적 집단을 의미하며, 이는 에러를 범하기 쉬운(error-prone) 복제에 의해 제조된다. 유사종 원리에 따르면 선별 대상은 야생형 (유사종 집단의 중심부)이 아니라 전체 분포라는 것을 보일 수 있었다. 변화된 선별 조건에서, 이러한 돌연변이체 분포는 적합도(fitness value)에 따라 유리한 변이체를 이미 함유하며, 따라서 이후에 랜덤 돌연변이에 의해 우선하여 제조할 필요는 없다. 선별 파라미터가 연속하여 변하는 경우, 진화적 발생은 이후에 적합도 배경의 능선부(ridge)를 따른 상기 유사종의 음함수 방향의 변화와 유사하다. WO 92/18645는 유사종의 제조, 및 진화 생물공학에서 상기 원리의 적용에 대하여 기술한다.In a particularly preferred embodiment of the method of the invention, a double stranded polynucleotide population having homologous and heterologous fragments is provided by using relevant polynucleotide sequences from mutant distributions of quasispecies. The term “related” herein relates in particular to polynucleotides in which both homologous and heterologous fragments are present. An analogous species refers to a dynamic population of molecular variants (mutants) that are related to one another, which are produced by error-prone replication. According to the principle of similar species, it was possible to show that the screening target was the entire distribution, not the wild type (central part of the similar species group). In altered screening conditions, such mutant distributions already contain advantageous variants depending on the fitness value, and therefore do not need to be made preferentially by random mutations afterwards. If the selection parameter changes continuously, evolutionary development is then similar to a change in the implicit function direction of the similar species along the ridge of the goodness of fit background. WO 92/18645 describes the preparation of analogous species and the application of these principles in evolutionary biotechnology.

유사종의 생성은 분자 변이체의 에러를 범하기 쉬운 복제를 기초로 한다. 폴리뉴클레오티드를 사용하는 경우, 복제는 복제 효소, 즉 폴리뉴클레오티드 분자의 템플레이트-조절된 합성을 행할 수 있는 폴리머라제를 사용해서 수행하는 것이 바람직하다. 에러의 도입, 즉 분자 정보의 변화는 에러를 범하기 쉬운 고유의 카피 프로세스 단독에 의해 또는 폴리머라제 부정확성의 특이적 증가 (예를 들어, 특이적으로 불균형화된 단량체 부가, 염기 유사체의 부가, 에러를 범하기 쉬운 PCR, 에러율이 매우 높은 폴리머라제)에 의해, 폴리뉴클레오티드의 합성후 화학적 변형에 의해, 단량체 혼합물 및(또는) 뉴클레오티드 유사체를 적어도 일부 사용하는 완전한 폴리뉴클레오티드 합성에 의해, 그리고 상기 방법들의 조합에 의해 달성할 수 있다. 유사종의 돌연변이체 분포를 이용하는 것이 바람직한데, 상기 유사종의 각 돌연변이체의 목적하는 분자 기능의 표현형 특성은 야생형에 비해 이미 개선되었다. "폴리뉴클레오티드 분자의 표현형"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드 분자와 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 전사 또는 번역 생성물의 기능 및 특성의 합을 의미한다.Generation of analogous species is based on replication prone to error of molecular variants. When using polynucleotides, replication is preferably carried out using a replication enzyme, ie a polymerase capable of template-controlled synthesis of polynucleotide molecules. The introduction of errors, i.e. changes in molecular information, can be attributed to inherent copying processes that are prone to errors or to specific increases in polymerase inaccuracy (e.g., specifically unbalanced monomer additions, addition of base analogs, errors Pervasive PCR, high error rate polymerase), post-synthetic chemical modification of polynucleotides, complete polynucleotide synthesis using at least some monomer mixtures and / or nucleotide analogues, and combinations of the above methods. Can be achieved by Preference is given to using mutant distributions of analogous species, in which the phenotypic characteristics of the desired molecular function of each mutant of the analogous species have already been improved over the wild type. The term "phenotype of a polynucleotide molecule" means the sum of the functions and properties of the polynucleotide molecule and the transcription or translation product encoded by the polynucleotide.

또한, 상이한 기원의 서열, 특히 상이한 종 유래의 유전자 군의 폴리뉴클레오티드 서열, 생체내에서 (예를 들어, 바이러스, 돌연변이 박테리아, UV 조사하의 박테리아에 의해) 또는 시험관내에서 (예를 들어, Qβ-레플리카제 반응, 에러를 범하기 쉬운 PCR에 의해) 특별하게 높은 에러율로 복제된 폴리뉴클레오티드 서열, 합성 후 화학 물질을 사용해서 돌연변이를 도입시켰거나 또는 상동성 및 이종성 절편을 갖게끔 하는 방식으로 화학적으로 합성한 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상기 언급한 방법들을 조합하여 발생시킨 폴리뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있다. 원칙적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리뉴클레오티드,특히 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다.In addition, sequences of different origins, in particular polynucleotide sequences of gene groups from different species, in vivo (eg by virus, mutant bacteria, bacteria under UV irradiation) or in vitro (eg Qβ- Replicase reactions, by prone error-prone PCR), specifically polynucleotide sequences replicated with a high error rate, chemically synthesized in a way to introduce mutations using chemicals after synthesis or to have homologous and heterologous fragments One polynucleotide sequence, or a polynucleotide sequence generated by combining the aforementioned methods, can be used. In principle, the polynucleotides used in the methods of the invention can be any polynucleotide, in particular DNA or RNA molecules.

본 발명의 방법의 단계 (b)에서 요구되는 단일 가닥 절단부는 원칙적으로 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 폴리뉴클레오티드 가닥의 2 개의 뉴클레오티드 사이에서 포스포디에스테르 결합을 절단시키는 임의의 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 상기 방법은 물리적 또는 화학적 방법(예, 초음파 처리, 부분적 에스테르 가수분해)일 수 있다.The single stranded cleavage required in step (b) of the process of the invention can in principle be produced by any method that cleaves phosphodiester bonds between two nucleotides of the polynucleotide strand of a double stranded polynucleotide molecule. The method may be a physical or chemical method (eg, sonication, partial ester hydrolysis).

상기 단계 (b)에는 효소적 방법이 특히 적합하다.Enzymatic methods are particularly suitable for step (b).

이 방법에 적합한 효소의 예로는 뉴클레아제가 있다.An example of an enzyme suitable for this method is a nuclease.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 서열-특이적 니킹(nicking) 효소를 사용해서 단일 가닥 절단부를 도입한다.In a preferred embodiment of the method of the invention, single stranded cleavage is introduced using sequence-specific nicking enzymes.

상기 니킹 효소의 예로는 바실러스 키티노스포러스 (Bacillus chitinosporus) 유래의 V.BchI, 바실러스 스테아로써모필러스 (Bacillus stearothermophilus) 유래의 N.BstNBI, 바실러스 스테아로써모필러스 유래의 N.BstSEI, 클로렐라 (Chlorella) 균주 NC64A 유래의 N.CviPII, 클로렐라 균주 NC64A 유래의 N.CviQXI, 이. 콜라이 (E. coli) 유래의 V.EcoDem, 해모필러스 파라인플루엔자 (Haemophilus parainfluenzae) 유래의 V.HpaII, 노카르디아 애로콜로니게네스 (Nocardia aerocolonigenes) 유래의 V.Neal 및 크산토모나스 오리재 (Xanthomonas oryzae) 유래의 V.XorII가 있다.Examples of such enzymes are the Bacillus niking kitty North porous (Bacillus chitinosporus) a brush Russ (Bacillus stearothermophilus) of a brush Russ derived by N.BstNBI, stearate derived from Bacillus N.BstSEI, Chlorella (Chlorella) as V.BchI, stearate derived from Bacillus N.CviPII from strain NC64A, N.CviQXI from Chlorella strain NC64A, E. V.EcoDem from E. coli , V.HpaII from Haemophilus parainfluenzae , V.Neal from Nocardia aerocolonigenes and Xanthomonas duck Xanthomonas oryzae ) is V.XorII.

더 바람직한 실시양태에서, 비-서열-특이적 니킹 효소를 사용해서 상기 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에 단일 가닥 절단부를 도입할 수 있다. 이와 관련해서, 보조인자로서 Mg²⁺를 갖는 송아지 췌장 DNase I을 사용할 수 있다 [Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, and Melgac and Goldthwaite, J. Biolog. Chem. 243 (1968), 4409].In a more preferred embodiment, non-sequence-specific nicking enzymes can be used to introduce single stranded cleavage into the double stranded polynucleotide molecule. In this regard, calf pancreas DNase I with Mg ²⁺ can be used as cofactor [Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, and Melgac and Goldthwaite, J. Biolog. Chem. 243 (1968), 4409.

단계 (c)의 반응 조건은 사용되는 효소에 따라 선택된다.The reaction conditions of step (c) are selected depending on the enzyme used.

바람직한 실시양태에서, 단계 (c)는 드-노보 합성의 에러율 증가를 일으키는 조건하에 수행한다.In a preferred embodiment, step (c) is carried out under conditions causing an increase in the error rate of the de-novo synthesis.

드-노보 반응의 상기 에러율은 생성시킬 목적 변이체에 따라 선택할 수 있다. 통상적인 에러율은 0.1×10^-3내지 10×10^-3, 즉 0.01 내지 1 ％ 에러이다 (염기 10,000 개의 DNA 절편에서 염기 1 개 내지 10 개 교환).The error rate of the de-novo reaction can be selected according to the desired variant to be produced. Typical error rates are 0.1 × 10 ⁻³ to 10 × 10 ⁻³ , ie 0.01 to 1% error (1 to 10 base exchanges in 10,000 DNA fragments).

단계 (c)는 1×10^-3내지 5×10^-3, 즉 0.1 내지 0.5 ％ 에러, 즉 염기 1,000 개의 DNA 절편에서 염기 1 개 내지 5 개 교환의 에러율로 수행하는 것이 특히 유용하다.Step (c) is particularly useful to carry out with an error rate of 1 × 10 ⁻³ to 5 × 10 ⁻³ , ie 0.1 to 0.5% error, ie 1 to 5 base exchanges in 1,000 base DNA fragments.

DNA 폴리머라제 I의 에러율은 9×10^-6이다 [Kunkel et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:1539-1545]. 따라서, DNA 폴리머라제 I을 사용하는 경우, 에러율의 증가는 9×10^-6을 넘는 에러율을 의미한다.The error rate of DNA polymerase I is 9 × 10 ⁻⁶ [Kunkel et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1539-1545. Thus, when using DNA polymerase I, an increase in error rate means an error rate over 9 × 10 ⁻⁶ .

원칙적으로, 단계 (c)에서 돌연변이된 DNA 폴리머라제를 사용하거나 또는 적절한 반응 조건을 선택해서 드-노보 합성의 에러율을 증가시킬 수 있다.In principle, the error rate of de-novo synthesis can be increased by using mutated DNA polymerase in step (c) or by selecting appropriate reaction conditions.

바람직한 실시양태에서, 프루프 리딩(proof reading) 활성이 감소되었거나전혀 없는 폴리머라제를 사용해서 드-노보 합성의 에러율을 증가시킨다.In a preferred embodiment, polymerases with reduced or no proof reading activity are used to increase the error rate of de-novo synthesis.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 드-노보 합성의 에러율은 출발 물질로서 상이한 뉴클레오티드 농도에 의해 증가시킨다. 이와 관련해서, 각각의 또는 몇개의 뉴클레오티드의 농도를 다른 뉴클레오티드에 대해 상대적으로 변화시킬 수 있다. 한가지 뉴클레오티드, 특히 dATP를 다른 뉴클레오티드에 비해 적은 화학량으로 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 농도의 예는 dGTP, dCTP 및 dTTP 각각 200 μM 및 ATP 20 내지 50 μM이다.In a preferred embodiment of the method of the invention, the error rate of de-novo synthesis is increased by different nucleotide concentrations as starting material. In this regard, the concentration of each or several nucleotides can be changed relative to the other nucleotides. It is desirable to use one nucleotide, in particular dATP, in lower stoichiometry compared to the other nucleotides. Examples of suitable concentrations are 200 μΜ and 20-50 μΜ ATP and dGTP, dCTP and dTTP, respectively.

2 가지 뉴클레오티드, 특히 dATP 및 dGTP를 다른 뉴클레오티드에 비해 적은 화학량으로 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 농도의 예는 dCTP 및 dTTP 각각 200 μM 및 dATP 및 dGTP 각각 40 μM이다.It is preferred to use two nucleotides, especially dATP and dGTP, in lower stoichiometry compared to the other nucleotides. Examples of suitable concentrations are 200 μΜ dCTP and dTTP respectively and 40 μΜ dATP and dGTP respectively.

본 발명의 방법의 다른 실시양태에서, 뉴클레오티드 유사체를 첨가해서 드-노보 합성의 에러율을 증가시킨다. 언급할 수 있는 뉴클레오티드 유사체로는 데옥시이노신 트리포스페이트, 7-데아자데옥시구아노신 트리포스페이트 및 데옥시뉴클레오시드 α-티오트리포스페이트가 있다. 데옥시이노신 트리포스페이트를 사용하는 것이 특히 바람직하다.In another embodiment of the method of the invention, nucleotide analogues are added to increase the error rate of de-novo synthesis. Nucleotide analogs that may be mentioned include deoxyinosine triphosphate, 7-deazadeoxyguanosine triphosphate and deoxynucleoside α-thiotriphosphate. Particular preference is given to using deoxyinosine triphosphate.

본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 염 농도를 변화시켜 드-노보 합성의 에러율을 증가시킨다. 이에 적합한 예는 Mg²⁺이온 농도를 1.5 mM를 넘도록 증가시키는 것이다. 또한, Mn²⁺이온은 예를 들어 0.1 내지 1 mM, 특히 0.2 내지 0.5 mM의 농도 범위로 첨가하는 것이 적합하다.In a further embodiment of the method of the invention, the salt concentration is varied to increase the error rate of de-novo synthesis. A suitable example for this is to increase the Mg ²⁺ ion concentration above 1.5 mM. It is also suitable to add Mn ²⁺ ions, for example in a concentration range of 0.1 to 1 mM, in particular 0.2 to 0.5 mM.

본 발명의 방법의 추가의 실시양태에서, 드-노보 합성의 에러율은 첨가제를 가하여 증가시킨다. 적합한 첨가제는 에러율을 증가시키는 임의의 물질이며, 언급할 수 있는 예로는 디메틸 술폭시드, 폴리에틸렌 글리콜 및 글리세롤이 있다. 이러한 첨가제는 DMSO 2 내지 10 ％, PEG 5 내지 15 ％, 글리세롤 0 초과 내지 30 ％, 바람직하게는 5 내지 20 ％의 농도로 첨가하는 것이 특히 바람직하다.In a further embodiment of the process of the invention, the error rate of the de-novo synthesis is increased by adding an additive. Suitable additives are any materials which increase the error rate and examples which may be mentioned are dimethyl sulfoxide, polyethylene glycol and glycerol. Such additives are particularly preferably added at a concentration of 2 to 10% DMSO, 5 to 15% PEG, more than 0 to 30% glycerol, preferably 5 to 20%.

다른 실시양태에서, 드-노보 합성의 에러율은 반응 온도를 변화시켜, 특히 온도를 상승시켜 증가시킨다.In other embodiments, the error rate of de-novo synthesis is increased by varying the reaction temperature, in particular by raising the temperature.

에러율을 증가시키는데 있어서 상기 언급한 모든 방법들은 또한 서로 조합하여, 예를 들어 증가된 Mn²⁺이온 농도에서 과량의 뉴클레오티드를 사용해서 수행할 수도 있다.All of the above-mentioned methods for increasing the error rate may also be performed in combination with each other, for example, using excess nucleotides at increased Mn ²⁺ ion concentrations.

바람직한 실시양태에서, 단계 (b) 및 (c)를 동시에 수행한다.In a preferred embodiment, steps (b) and (c) are performed simultaneously.

본 발명의 방법의 단계 (d)에 따른 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 제조는 당업자에게 공지된 방법을 이용해서 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 예를 들어 물리적, 화학적, 생화학적 및 생물학적 방법이 포함된다. 본 명세서에서 언급할 수 있는 예로는 어닐링 온도를 넘는 온도로 가열하여 폴리뉴클레오티드 이중 가닥을 용융시키는 방법 [Newton, in: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994); Lazurkin, Biopolymers 9 (1970), 1253-1306], 변성제 (예, 우레아 또는 디터전트)를 첨가하여 폴리뉴클레오티드 이중 가닥을 변성시키는 방법, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 단일 가닥 폴리뉴클레오티드로 전환시키는 효소를 첨가하는 방법, 예를들어 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 엑소-핵용해성(exo-nucleolytic) 분해하는 방법이 있다.The preparation of single-stranded polynucleotide molecules according to step (d) of the methods of the invention can be carried out using methods known to those skilled in the art. Such methods include, for example, physical, chemical, biochemical and biological methods. Examples that may be mentioned herein include methods for melting polynucleotide double strands by heating to temperatures above the annealing temperature [Newton, in: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994); Lazurkin, Biopolymers 9 (1970), 1253-1306], a method of denaturing polynucleotide double strands by adding denaturants (e.g. urea or detergent), adding enzymes to convert double-stranded polynucleotides into single stranded polynucleotides Methods such as exo-nucleolytic digestion of double stranded DNA into single stranded DNA.

본 발명의 방법의 단계 (d)에 의해 제공되는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 단계 (e)에 따라 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 분자를 제조하는 방법은 당업자에게 공지된 방법을 이용해서 수행할 수 있으며, 바람직하게는 상보적인 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자의 상동성 절편을 혼성화시켜 수행한다.For the single stranded polynucleotide molecule provided by step (d) of the method of the present invention, the method for producing a partially double stranded polynucleotide molecule according to step (e) can be carried out using methods known to those skilled in the art. And, preferably, by hybridizing homologous fragments of complementary double stranded polynucleotide molecules.

이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 제공하는 혼성화는 당업자에게 공지된 방법을 이용해서 수행하며, 특히, 예를 들어 단일 가닥들을 합하고, 반응 조건을 설정하여 상보적 폴리뉴클레오티드의 어닐링을 증진시킴으로써, 예를 들어 온도를 낮추고(낮추거나) 염 농도를 저하시킴으로써 수행한다.Hybridization to provide double stranded polynucleotides is carried out using methods known to those skilled in the art, and in particular, for example, by combining the single strands and setting the reaction conditions to enhance the annealing of the complementary polynucleotides, e.g. By lowering (lowering) and lowering salt concentration.

본 발명의 방법의 단계 (e)에서 제조한 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 분자에서 시작해서, 단계 (f)에서 템플레이트-지정된 핵산 합성을 수행한다.Starting with the partially double stranded polynucleotide molecule prepared in step (e) of the method of the invention, template-designated nucleic acid synthesis is carried out in step (f).

본 명세서에서 "템플레이트-지정된 핵산 합성"이라는 용어는 기존의 단일 가닥을 상응하는 템플레이트 가닥의 정보를 기준으로 연장시켜 폴리뉴클레오티드를 합성하는 것을 의미한다.The term "template-designated nucleic acid synthesis" as used herein refers to the synthesis of a polynucleotide by extending an existing single strand based on information of the corresponding template strand.

이러한 종류의 템플레이트-지정된 혼성화의 수행은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))]에 기재되어 있다.The performance of template-specified hybridizations of this kind is well known to those skilled in the art and is described, for example, in Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

템플레이트-조절된 폴리뉴클레오티드 중합 활성을 가지며 폴리뉴클레오티드가닥을 합성할 수 있는 임의의 효소를 폴리머라제 반응에 사용할 수 있다. 여러 다양한 생물체로부터 유래하며 상이한 기능을 갖는 다수의 폴리머라제들이 이미 단리 및 기술되었다. 템플레이트의 유형, 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소), DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 (레플리카제) 사이에서 합성된 폴리뉴클레오티드의 유형에 있어서의 차이가 있다. 온도 안정성의 경우, 비-열안정성 폴리머라제 (37 ℃)와 열안정성 폴리머라제 (75 내지 95 ℃) 사이의 차이가 있다. 또한, 폴리머라제는 5'-3'- 및 3'-5'-엑소-핵용해성 활성의 존재에 대한 차이가 있다. 가장 중요한 폴리머라제는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제이다.Any enzyme having template-regulated polynucleotide polymerization activity and capable of synthesizing polynucleotide strands can be used in the polymerase reaction. Many polymerases from different organisms and having different functions have already been isolated and described. In the type of template and in the type of polynucleotide synthesized between DNA-dependent DNA polymerase, RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase), DNA-dependent RNA polymerase and RNA-dependent RNA polymerase (replicase) There is a difference. In the case of temperature stability, there is a difference between non-thermally stable polymerase (37 ° C.) and thermally stable polymerase (75-95 ° C.). In addition, polymerases differ in the presence of 5'-3'- and 3'-5'-exo-nucleolytic activity. The most important polymerase is DNA-dependent DNA polymerase.

특히, 약 37 ℃의 최적 온도를 갖는 DNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 이러한 DNA 폴리머라제로는 예를 들어 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I, 박테리오파아지 T7의 T7 DNA 폴리머라제 및 박테리오파아지 T4의 T4 DNA 폴리머라제를 들 수 있으며, 이들 폴리머라제 각각은 다수의 제조사, 예를 들어 USB, 로쉬 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals), 스트라타진 (Stratagene), NEB 또는 퀀텀 바이오테크놀로지스 (Quantum Biotechnologies)에서 시판한다. 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I (홀로효소, holoenzyme)은 5'-3' 폴리머라제 활성, 3'-5' 프루프 리딩 엑소뉴클레아제 활성 및 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 이 효소는 닉(nick) 번역 방법에 의한 시험관내 DNA 표지화에 사용된다 [Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251]. 홀로효소와는 달리, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우(Klenow) 단편은 T7 DNA 폴리머라제 및 T4 DNA 폴리머라제와 유사하게5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지 않는다. 따라서, 이러한 효소는 "필-인(fill-in) 반응" 또는 긴 가닥의 합성에 사용된다 [Young et al. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 (1974), 46-53))]. 마지막으로, 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편의 3'-5'-엑소(-) 변이체는 3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 이 효소는 흔히 생어(Sanger)의 문헌 [Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)]에 따른 DNA 서열화에 사용된다. 상기 효소 이외에도, 상이한 특성을 갖는 추가의 37 ℃ DNA 폴리머라제가 다수 존재하며, 본 발명의 방법에 사용할 수 있다.In particular, DNA polymerases having an optimum temperature of about 37 ° C. can be used. Such DNA polymerases are for example E. coli. E. coli DNA polymerase I, T7 DNA polymerase of bacteriophage T7 and T4 DNA polymerase of bacteriophage T4, each of which is a number of manufacturers, such as USB, Roche Molecular Biochemicals (Roche). Molecular Biochemicals, Stratagene, NEB or Quantum Biotechnologies. this. E. coli DNA polymerase I (holoenzyme) has 5'-3 'polymerase activity, 3'-5' proof reading exonuclease activity and 5'-3 'exonuclease activity. This enzyme is used for in vitro DNA labeling by nick translation methods [Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251. Unlike the holoenzyme, Lee. Klenow fragments of E. coli DNA polymerase I do not have 5 'exonuclease activity similar to T7 DNA polymerase and T4 DNA polymerase. Thus, such enzymes are used for "fill-in reactions" or for the synthesis of long strands [Young et al. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 (1974), 46-53)). Finally, this. The 3'-5'-exo (-) variant of the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I lacks 3 'exonuclease activity. This enzyme is often used for DNA sequencing according to Sanger (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). In addition to the above enzymes, there are many additional 37 ° C. DNA polymerases with different properties and can be used in the methods of the invention.

75 ℃의 최적 온도를 가지며 95 ℃에서 충분히 안정한 가장 통상적인 열안정성 DNA 폴리머라제는 시판되고 있는, 써무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 유래의 Taq DNA 폴리머라제이다. Taq DNA 폴리머라제는 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 없는, 고도로 전진성인 5'-3' DNA 폴리머라제이다. 이 효소는 표준 PCR, 서열화 반응 및 돌연변이유발 PCR에서 흔히 사용된다 [Cadwell und Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni and Kaminski (Methods Mol. Biol. 23 (1993), 109-114))]. 써무스 써모필루스 (Thermus thermophilus)HB8 유래의 Tth DNA 폴리머라제 및 써무스 플라부스 (Thermus flavus) 유래의 Tfl DNA 폴리머라제는 유사한 특성을 갖는다. 그러나, Tth DNA 폴리머라제는 추가로 망간 이온의 존재하에 고유의 역전사효소 (RT) 활성을 갖는다 [Cusi et al. (Biotechniques 17 (1994), 1034-1036)]. 또한, 3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖지만 5' 엑소뉴클레아제 활성은 갖지 않는, 다음과 같은 다수의 열안정성 DNA 폴리머라제가 시판된다: 피로코커스 우에세이 (Pyrococcus woesei) 유래의 Pwo DNA 폴라머라제, 써모코커스 리토랠릭스 (Thermococcus litoralix)유래의 Tli, Vent 및 DeepVent DNA 폴리머라제, 피로코커스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) 유래의 Pfx 및 Pfu DNA 폴리머라제, 써무스 유비퀴토스 (Thermus ubiquitous) 유래의 Tub DNA 폴리머라제, 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 유래의 Tma 및 UlTma DNA 폴리머라제 [Newton and Graham, in: PCR, Spektrum Akad. Verlag Heidelberg (1994), 1)]. 3' 프루프 리딩 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 폴리머라제를 사용해서 가능한 적은 에러를 갖는 PCR 생성물을 증폭시킨다. 마지막으로, 5' 및 3' 둘 다의 엑소-핵용해성 활성이 결여된 DNA 폴리머라제는 Taq DNA 폴리머라제, Vent-(엑소-) DNA 폴리머라제 및 Tsp DNA 폴리머라제의 스토펠(Stoffel) 단편 형태로 이용할 수 있다. RNA-의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소) 중에서 가장 일반적인 효소로는 조류 골수아세포증바이러스 유래의 AMV 역전사효소, 몰로니(Moloney) 쥐과동물 백혈병 바이러스 유래의 M-MuLV 역전사효소 및 인간 면역결핍 바이러스 유래의 HIV 역전사효소를 들 수 있으며, 이들 효소는 예를 들어 NEB, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies), 퀀텀 바이오테크놀로지스 (Quantum Biotechnologies)와 같은 다양한 판매사에 의해 시판된다. HIV 역전사효소와 유사하게, AMV 역전사효소는 M-MuLV 역전사효소에서 현저하게 감소된 관련된 RNase H 활성을 갖는다. M-MuLV 및 AMV 역전사효소 모두 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다.The most common thermostable DNA polymerase that has an optimum temperature of 75 ° C. and is sufficiently stable at 95 ° C. is Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus , which is commercially available. Taq DNA polymerase is a highly forward 5'-3 'DNA polymerase that lacks 3'-5' exonuclease activity. This enzyme is commonly used in standard PCR, sequencing reactions and mutagenesis PCR [Cadwell und Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni and Kaminski (Methods Mol. Biol. 23 (1993), 109- 114))]. Tth DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8 and Tfl DNA polymerase from Thermus flavus have similar properties. However, Tth DNA polymerase further has inherent reverse transcriptase (RT) activity in the presence of manganese ions [Cusi et al. (Biotechniques 17 (1994), 1034-1036). In addition, a number of thermostable DNA polymerases having 3 'exonuclease activity but no 5' exonuclease activity are commercially available: Pwo DNA polymerase from Pyrococcus woesei Tli, Vent and DeepVent DNA polymerases from Thermococcus litoralix, Pfx and Pfu DNA polymerases from Pyrococcus furiosus , Thermus ubiquitous from Thermococcus litoralix Tub DNA polymerase of Tma and UlTma DNA polymerase from Thermotoga maritima [Newton and Graham, in: PCR, Spektrum Akad. Verlag Heidelberg (1994), 1)]. Polymerases lacking 3 'proof reading exonuclease activity are used to amplify PCR products with as few errors as possible. Finally, DNA polymerases lacking the exo-nucleolytic activity of both 5 'and 3' form Stoffel fragments of Taq DNA polymerase, Vent- (exo-) DNA polymerase and Tsp DNA polymerase. Can be used as Among the RNA-dependent DNA polymerases (reverse transcriptases), the most common enzymes are AMV reverse transcriptase from avian myeloblastosis virus, M-MuLV reverse transcriptase from Moloney murine leukemia virus and human immunodeficiency virus. HIV reverse transcriptases, which are commercially available from various vendors such as NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies, and the like. Similar to HIV reverse transcriptase, AMV reverse transcriptase has an associated RNase H activity that is significantly reduced in M-MuLV reverse transcriptase. Both M-MuLV and AMV reverse transcriptases lack 3'-5 'exonuclease activity.

DNA-의존성 RNA 폴리머라제 중에서 가장 일반적인 효소로는 이. 콜라이 RNA 폴리머라제, 박테리오파아지 SP6에 감염된 살모넬라 티피무리움 (Salmonellathyphimurium) LT2 유래의 SP6 RNA 폴리머라제, 박테리오파아지 T3 유래의 T3 RNA 폴리머라제 및 박테리오파아지 T7 유래의 T7 RNA 폴리머라제를 들 수 있다.The most common enzymes among DNA-dependent RNA polymerases are E. coli. E. coli RNA polymerase, SP6 RNA polymerase derived from Salmonella thyphimurium LT2 infected with bacteriophage SP6, T3 RNA polymerase derived from bacteriophage T3 and T7 RNA polymerase derived from bacteriophage T7.

본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 이 방법의 단계 (f)에서 템플레이트 가닥은 DNA 분자이며, DNA-의존성 DNA 폴리머라제를 템플레이트-지정된 단일 가닥 합성에 사용한다.In a preferred embodiment of the method of the invention, in step (f) of the method the template strand is a DNA molecule and DNA-dependent DNA polymerase is used for template-designated single strand synthesis.

특히 바람직한 실시양태에서, 비-열안정성 DNA 폴리머라제, 특히 바람직하게는 5' 및 3' 엑소-핵용해성 활성을 갖는 비-열안정성 DNA 폴리머라제, 예를 들어 이. 콜라이 폴리머라제 I을 본 발명에서 사용한다.In a particularly preferred embodiment, non-thermo stable DNA polymerases, particularly non-thermo stable DNA polymerases having 5 'and 3' exo-nucleolytic activity, for example E. coli. E. coli polymerase I is used in the present invention.

대안으로서, 3' → 5' 엑소-핵용해성 활성을 갖지만 5' → 3' 엑소-핵용해성 활성은 갖지 않는 비-열안정성 DNA 폴리머라제, 예를 들어 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편, 박테리포파아지 T7 유래의 T7 DNA 폴리머라제 또는 박테리오파아지 T4 유래의 T4 DNA 폴리머라제를 사용할 수도 있다.Alternatively, non-thermally stable DNA polymerases having 3 '→ 5' exo-nucleolytic activity but no 5 '→ 3' exo-nucleolytic activity, for example E. coli. Clinau fragment of E. coli DNA polymerase I, T7 DNA polymerase derived from bacteriophage T7 or T4 DNA polymerase derived from bacteriophage T4 may be used.

또한, 5' → 3' 엑소-핵용해성 활성을 갖지 않으며 3' → 5' 엑소-핵용해성 활성도 갖지 않는 비-열안정성 DNA 폴리머라제, 예를 들어 이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 클리나우 단편의 3'-5'-엑소(-) 변이체를 사용할 수도 있다.In addition, non-thermally stable DNA polymerases having no 5 '→ 3' exo-nucleolytic activity and no 3 '→ 5' exo-nucleolytic activity, for example E. coli. 3'-5'-exo (-) variants of the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I can also be used.

특히 바람직한 다른 실시양태는 또한 5' 및 3' 엑소-핵용해성 활성을 가질 수 있거나, 또는 5' 엑소-핵용해성 활성을 갖지만 3' 엑소-핵용해성 활성은 갖지 않을 수 있는 열안정성 폴리머라제 (예, Taq 폴리머라제, Pwo 폴리머라제), 예를 들어 써무스 아쿠아티쿠스 유래의 Taq DNA 폴리머라제, 써무스 써모필리스 HB8 유래의 Tth DNA 폴리머라제 또는 써무스 플라부스 유래의 Tfl DNA 폴리머라제를 사용한다.Other particularly preferred embodiments are also thermostable polymerases, which may have 5 'and 3' exo-nucleolytic activity, or may have 5 'exo-nucleolytic activity but no 3' exo-nucleolytic activity (eg , Taq polymerase, Pwo polymerase), for example, Taq DNA polymerase derived from Thermos aquaticus, Tth DNA polymerase derived from Thermos thermophilis HB8, or Tfl DNA polymerase derived from Thermos flavus. .

또는, 열안정성 DNA 폴리머라제, 예를 들어 피로코커스 우에세이 유래의 Pwo DNA 폴리머라제, 써모코커스 리토랠리스 유래의 VentR DNA 폴리머라제, DeepventR DNA 폴리머라제 또는 Tli DNA 폴리머라제, 피로코커스 푸리오수스 유래의 Pfu DNA 폴리머라제 또는 Pfx DNA 폴리머라제 또는 써모토가 마리티마 (Thermotoga maritima) 유래의 UlTma DNA 폴리머라제는 3' → 5' 엑소-핵용해성 활성을 가질 수 있지만, 5' → 3' 엑소-핵용해성 활성은 갖지 않는다.Or thermostable DNA polymerases such as Pwo DNA polymerase from Pyrococcus uesei, VentR DNA polymerase from Thermococcus litoralis, DeepventR DNA polymerase or Tli DNA polymerase, from Pyrococcus furiosus Pfu DNA polymerase or Pfx DNA polymerase or UlTma DNA polymerase from Thermotoga maritima may have 3 '→ 5' exo-nucleolytic activity, but 5 '→ 3' exo-nucleus It has no soluble activity.

또한, 3'-5' 엑소-핵용해성 활성을 갖지 않으며 5'-3' 엑소-핵용해성 활성도 갖지 않는 열안정성 폴리머라제, 예를 들어 써무스 아쿠아티쿠스 유래의 Taq DNA 폴리머라제, Tsp DNA 폴리머라제 또는 써모코커스 리토랠리스 (Thermococcus litoralis) 유래의 VentR DNA 폴리머라제 또는 DeepVentR DNA 폴리머라제의 엑소(-) 변이체를 사용할 수 있다.In addition, thermostable polymerases having no 3'-5 'exo-nucleolytic activity and no 5'-3' exo-nucleolytic activity, such as Taq DNA polymerase from Thermos Aquaticus, Tsp DNA polymer VentR DNA polymerase from Laze or Thermococcus litoralis or exo (-) variants of DeepVentR DNA polymerase can be used.

열안정성 폴리머라제를 사용하는 경우, 폴리머라제 반응을 바람직하게는 단계 (e) 이후에 중간 정제 또는 추가의 샘플 처리 없이 즉시 수행한다.If a thermostable polymerase is used, the polymerase reaction is carried out immediately, preferably after step (e) without intermediate purification or further sample processing.

본 발명의 방법의 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 (f)에서 템플레이트-지정된 단일 가닥의 합성이 수행되는 템플레이트 가닥은 RNA 분자이다. 이 경우, 템플레이트-지정된 단일 가닥 합성은 RNA-의존성 DNA 폴리머라제, 바람직하게는 조류 골수아세포증바이러스 유래의 AMV 역전사효소, 인간 면역결핍 바이러스 유래의 HIV 역전사효소 또는 몰로니 쥐과동물 백혈병 바이러스 유래의 M-MuLV 역전사효소를 사용한다. 또한, 열안정성 역전사효소를 사용하는 것이 바람직하며, 고유의 역전사효소 활성을 갖는 써무스 써모필러스 유래의 Tth DNA 폴리머라제를 사용하는 것이 매우 특히 바람직하다.In another preferred embodiment of the method of the invention, the template strand in which the synthesis of the template-designated single strand is carried out in step (f) of the method of the invention is an RNA molecule. In this case, the template-designated single stranded synthesis is RNA-dependent DNA polymerase, preferably MV reverse transcriptase from avian myeloblastosis virus, HIV reverse transcriptase from human immunodeficiency virus or M from moroni murine leukemia virus. -MuLV reverse transcriptase is used. It is also preferred to use thermostable reverse transcriptases, and very particular preference is given to using Tth DNA polymerases derived from thermos thermophilus with intrinsic reverse transcriptase activity.

달리 언급하지 않으면, 실험은 분자생물학의 현재 프로토콜에 따라 수행하였다.Unless otherwise stated, experiments were performed according to the current protocol of molecular biology.

I. 출발 물질 제공I. Offer starting material

다음과 같은 4 가지 리파제 변이체를 출발 물질로 사용함:Four lipase variants are used as starting materials:

pBP2035에 의해 코딩된 LipA H86W, pBP2008에 의해 코딩된 LipA S87T, pBP2006에 의해 코딩된 LipA F142W, pBP2007에 의해 코딩된 LipA L167A.LipA H86W encoded by pBP2035, LipA S87T encoded by pBP2008, LipA F142W encoded by pBP2006, LipA L167A encoded by pBP2007.

1. 하기 플라스미드를 제조함1. Prepare the following plasmid

플라스미드Plasmid 벡터vector 벡터 크기Vector size 삽입물insertion 삽입물 크기Insert size 효소 변이체Enzyme Variants pBP2006pBP2006 pBSIIKSpBSIIKS 2961 bp2961 bp 56-2056-20 1142 bp1142 bp F142WF142W pBP2007pBP2007 pBSIIKSpBSIIKS 2961 bp2961 bp 98-1098-10 1142 bp1142 bp L167AL167A pBP2008pBP2008 pBSIIKSpBSIIKS 2961 bp2961 bp 124-9124-9 1142 bp1142 bp S87TS87T pBP2035pBP2035 pBSIIKSpBSIIKS 2961 bp2961 bp 198-1-3198-1-3 1142 bp1142 bp H86WH86W

2. 제한 엔도뉴클레아제 HindIII 및 SacI을 사용하여 플라스미드를 절단함2. Cleavage of the Plasmid Using Restriction Endonucleases HindIII and SacI

3. GFX 키트 (Pharmacia)를 사용해서 겔 추출에 의해 삽입물을 단리함3. Isolate inserts by gel extraction using GFX kit (Pharmacia)

4. DNA 단편을 H₂O에 재현탁시킴4. Resuspend DNA fragment in H ₂ O

5. DNA 농도를 약 250 ng/㎕로 조정함5. Adjust DNA concentration to about 250 ng / μl

II. 단일 가닥 절단부의 생성 및 드-노보 합성II. Generation and de-novo synthesis of single stranded cleavage

1. 닉 번역 키트 (Roche, Cat. No. 976776)를 사용해서 삽입물 56-20, 98-10,124-9, 198-1-3의 닉 번역물에 대한 4 가지 개별 반응 혼합물을 얻었다.1. Nick translation kit (Roche, Cat. No. 976776) was used to obtain four separate reaction mixtures for nick translations of inserts 56-20, 98-10,124-9, 198-1-3.

성분ingredient 부피volume 삽입물 약 250 ng/㎕를 함유하는 DNA 용액DNA solution containing about 250 ng / μl insert 16 ㎕16 μl dATP 0.4 mMdATP 0.4 mM 2.5 ㎕2.5 μl dCTP 0.4 mMdCTP 0.4 mM 2.5 ㎕2.5 μl dGTP 0.4 mMdGTP 0.4 mM 2.5 ㎕2.5 μl dTTP 0.4 mMdTTP 0.4 mM 2.5 ㎕2.5 μl 10 ×완충액10 × buffer 5 ㎕5 μl H₂OH ₂ O 14 ㎕14 μl 효소 혼합물¹⁾ Enzyme Mixture ¹⁾ 5 ㎕5 μl 총gun 50 ㎕50 μl ¹⁾효소 혼합물:50％ 글리세롤 (v/v) 중 DNA 폴리머라제 I 및 DNAseI ¹⁾ Enzyme mixture: DNA polymerase I and DNAseI in 50% glycerol (v / v)

2. 혼합물을 15 ℃에서 90분 동안 인큐베이션함2. Incubate the mixture at 15 ° C. for 90 minutes

3. 0.5 M EDTA (pH 8.8) 5 ㎕를 가하여 반응을 정지시킴3. Stop the reaction by adding 5 µl of 0.5 M EDTA (pH 8.8).

4. 혼합물을 침전시키고, 세척하여 건조시킨 다음, H₂O 20 ㎕ 중에 재현탁시킴4. Precipitate the mixture, wash, dry and resuspend in 20 μl of H ₂ O

III. 프라이머 부재하의 PCRIII. PCR without primer

GC 풍부 PCR 시스템 (Roche, Cat. No. 2140306)을 사용하는 PCR용 반응 혼합물Reaction mixture for PCR using GC rich PCR system (Roche, Cat. No. 2140306)

성분ingredient 부피volume 2.4로부터의 각 혼합물 6 ㎕의 혼합물6 μl of each mixture from 2.4 24 ㎕24 μl dNTP 10 mMdNTP 10 mM 1 ㎕1 μl GC 풍부 용해 용액 5 MGC Rich Dissolution Solution 5 M 10 ㎕10 μl GC 풍부 반응 완충액GC Rich Reaction Buffer 10 ㎕10 μl PCR 등급 H₂OPCR Grade H ₂ O 4 ㎕4 μl GC 풍부 효소 혼합물²⁾ GC rich enzyme mixture ²⁾ 1 ㎕1 μl 총gun 50 ㎕50 μl ²⁾열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tgo DNA 폴리머라제 ²⁾ Thermostable Taq DNA Polymerase and Tgo DNA Polymerase

PCR 조건PCR conditions

온도Temperature 시간time 사이클cycle 95 ℃95 ℃ 5 분5 minutes 55 ℃55 ℃ 60 초60 sec 4545 72 ℃72 ℃ 60 초60 sec 95 ℃95 ℃ 30 초30 sec 72 ℃72 ℃ 10 분10 minutes 4 ℃4 ℃ x 분x minutes

IV. 프라이머를 사용하는 PCRIV. PCR using primers

GC 풍부 PCR 시스템 (Roche, Cat. No. 2140306)을 사용하는 PCR용 반응 혼합물:Reaction mixture for PCR using GC rich PCR system (Roche, Cat. No. 2140306):

성분ingredient 부피volume 단계 3으로부터의 PCR 생성물PCR product from step 3 5 ㎕5 μl dNTP 10 mMdNTP 10 mM 1 ㎕1 μl 프라이머 MAT16* 6.25 μMPrimer MAT16 * 6.25 μM 2 ㎕2 μl 프라이머 MAT19* 6.25 μMPrimer MAT19 * 6.25 μM 2 ㎕2 μl GC 풍부 용해 용액 5 MGC Rich Dissolution Solution 5 M 10 ㎕10 μl GC 풍부 반응 완충액GC Rich Reaction Buffer 10 ㎕10 μl PCR 등급 H₂OPCR Grade H ₂ O 19 ㎕19 μl GC 풍부 효소 혼합물GC Rich Enzyme Mixture 1 ㎕1 μl 총gun 50 ㎕50 μl * 프라이머 MAT16 = 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3'* 프라이머 MAT19 = 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3'* Primer MAT16 = 5'-GATCGACGTAAGCTTTAACGATGGAGAT-3 '* Primer MAT19 = 5'-CATCGGGCGAGCTCCCAGCCCGCCGCG-3'

PCR 조건PCR conditions

온도Temperature 시간time 사이클cycle 95 ℃95 ℃ 5 분5 minutes 52 ℃52 ℃ 30 초30 sec 2525 72 ℃72 ℃ 60 초60 sec 95 ℃95 ℃ 30 초30 sec 72 ℃72 ℃ 10 분10 minutes 4 ℃4 ℃ x 분x minutes

V. 단편의 클로닝 및 분석V. Cloning and Analysis of Fragments

1. 단계 4로부터의 PCR 생성물 20 ㎕를 HindIII 및 SacI으로 절단함1.Cut 20 μl of PCR product from Step 4 with HindIII and SacI

2. 혼합물을 침전시키고, 세척 및 건조시켜 H₂O 20 ㎕ 중에 재현탁시킴2. Precipitate the mixture, wash and dry to resuspend in 20 μl of H ₂ O

3. GFX 키트 (Pharmacia)를 사용해서 절단된 단편을 정제함3. Purifying fragments cut using GFX kit (Pharmacia)

4. 절단된 단편을, HindIII 및 SacI으로 미리 절단한 벡터 pBSIIKS (Stratagene)에 라이게이션함4. Ligation of the cleaved fragments into vector pBSIIKS (Stratagene) previously cleaved with HindIII and SacI

5. 라이게이션 혼합물로 이. 콜라이 XL1-블루(blue)를 형질전환시킴5. As a ligation mixture. Transforms E. coli XL1-blue

6. 삽입물을 갖는 29 개의 클론을 서열 분석함6. Sequencing 29 clones with inserts

<110> BASF AG <120> Method for generating polynucleotide molecules <130> PF53571/MSt <140> PCT/EP03/05308 <141> 2003-05-21 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptIIKS+ <220> <221> misc_feature <223> Lipases in pBluescriptIIKS+ <400> 1 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggctggag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 2 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII+ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <400> 2 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacac ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 3 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII+ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <400> 3 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacggc caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 4 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII+ <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1142) <223> <400> 4 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gcctgggtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142<110> BASF AG <120> Method for generating polynucleotide molecules <130> PF53571 / MSt <140> PCT / EP03 / 05308 <141> 2003-05-21 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptIIKS + <220> <221> misc_feature <223> Lipases in pBluescriptIIKS + <400> 1 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggctggag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 2 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII + <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <400> 2 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacac ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 3 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII + <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <400> 3 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gccttcgtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacggc caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142 <210> 4 <211> 1142 <212> DNA <213> pBluescriptKSII + <220> <221> misc_feature (222) (1) .. (1142) <223> <400> 4 aagctttaac gatggagata aacatggtca gattgatgcg ttccagggtg gcggcgaggg 60 cggtggcatg ggcgttggcg gtgatgccgc tggccggcgc ggccgggttg acgatggccg 120 cgtcgcccgc ggccgtcgcg gcggacacct acgcggcgac gcgctatccg gtgatcctcg 180 tccacggcct cgcgggcacc gacaagttcg cgaacgtggt ggactattgg tacggaatcc 240 agagcgatct gcaatcgcat ggcgcgaagg tgtacgtcgc gaatctctcg ggattccaga 300 gcgacgacgg gccgaacggc cgcggcgagc agctgctcgc ctacgtgaag caggtgctcg 360 cggccaccgg cgcgaccaag gtgaacctga tcggccacag ccagggcggc ctgacctcgc 420 gctacgtcgc ggccgtcgcg ccgcaactgg tggcctcggt gacgacgatc ggcacgccgc 480 atcgcggctc cgagttcgcc gacttcgtgc aggacgtgct gaagaccgat ccgaccgggc 540 tctcgtcgac ggtgatcgcc gcctgggtca acgtgttcgg cacgctcgtc agcagctcgc 600 acaacaccga ccaggacgcg ctcgcggcgc tgcgcacgct caccaccgcg cagaccgcca 660 cctacaaccg gaacttcccg agcgcgggcc tgggcgcgcc cggttcgtgc cagacgggcg 720 ccgcgaccga aaccgtcggc ggcagccagc acctgctcta ttcgtggggc ggcaccgcga 780 tccagcccac ctccaccgtg ctcggcgtga ccggcgcgac cgacaccagc accggcacgc 840 tcgacgtcgc gaacgtgacc gacccgtcca cgctcgcgct gctcgccacc ggcgcggtga 900 tgatcaatcg cgcctcgggg cagaacgacg ggctcgtctc gcgctgcagc tcgctgttcg 960 ggcaggtgat cagcaccagc taccactgga accatctcga cgagatcaac cagctgctcg 1020 gcgtgcgcgg cgccaacgcg gaagatccgg tcgcggtgat ccgcacgcac gtgaaccggc 1080 tcaagctgca gggcgtgtga tggcgcaggc cgatcgtccg gcgcgcggcg ggctgggagc 1140 tc 1142

Claims

(a) 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 분자 집단을 제공하며, 상기 집단의 개별 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 상동성 서열 절편 및 하나 이상의 이종성 서열 절편을 갖는 것인 단계,(a) providing a double stranded polynucleotide molecule or a double stranded polynucleotide molecule population, wherein individual polynucleotides of the population have one or more homologous sequence segments and one or more heterologous sequence segments,

를 포함하는 사이클을 1회 이상 수행하는 것을 포함하며, 단계 (b) 및 (c)를 연속적으로 또는 동시에 수행할 수 있는 것인, 변화된 특성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 생성시키는 방법.A method for producing a polynucleotide molecule having changed properties, comprising performing one or more cycles comprising, and being able to perform steps (b) and (c) continuously or simultaneously.

제1항에 있어서, 단계 (a) 내지 (f)를 포함하는 사이클을 1 회 넘게 수행하는 방법.The method of claim 1, wherein the cycle comprising steps (a) to (f) is performed more than once.

제2항에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 유전자형 또는 표현형, 또는 유전자형 및 표현형 둘 다와 관련된 선별 단계를 1 사이클, 몇 사이클 또는 모든 사이클 이후에 수행하는 방법.The method of claim 2, wherein the screening step associated with the genotype or phenotype of the polynucleotide, or both genotype and phenotype, is performed after one cycle, several cycles or all cycles.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 서열 특이적 니킹(nicking) 효소가 상기 단일 가닥 절단부를 도입하는 것인 방법.The method of any one of claims 1 to 3, wherein in step (b) a sequence specific nicking enzyme introduces said single stranded cleavage.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)에서 비-서열 특이적 니킹 효소가 상기 단일 가닥 절단부를 도입하는 것인 방법.The method of any one of claims 1 to 3, wherein in step (b) the non-sequence specific nicking enzyme introduces said single stranded cleavage.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 DNA 폴리머라제 I을 사용하는 방법.6. The method of claim 1, wherein the DNA polymerase I is used in step (c). 7.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 적합한 반응 조건을 선택하여 상기 드-노보 합성의 에러율을 증가시키는 방법.The method according to any one of claims 1 to 6, wherein in step (c) the appropriate reaction conditions are selected to increase the error rate of the de-novo synthesis.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1 종 이상의 뉴클레오시드 트리포스페이트를 과량 사용하여 상기 드-노보 합성의 에러율을 증가시키는 방법.The method of any one of claims 1 to 6, wherein an excess of one or more nucleoside triphosphates is used to increase the error rate of the de-novo synthesis.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 1 종 이상의 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 상기 드-노보 합성의 에러율을 증가시키는 방법.The method of any one of claims 1 to 6, wherein one or more nucleotide analogues are used to increase the error rate of the de-novo synthesis.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 염 농도를 변화시켜 상기 드-노보 합성의 에러율을 증가시키는 방법.The method of claim 1, wherein the salt concentration is varied to increase the error rate of the de-novo synthesis.

제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 프루프 리딩(proof reading) 활성이 감소되었거나 전혀 없는 폴리머라제를 사용하여 상기 드-노보 합성의 에러율을 증가시키는 방법.The method of any one of claims 1 to 6, wherein the error rate of the de-novo synthesis is increased using a polymerase with reduced or no proof reading activity.