KR20040111402A - 인플루엔자 м2 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체 및그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents
인플루엔자 м2 단백질에 대한 인간 모노클로날 항체 및그의 제조 및 사용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 M2 단백질과 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 모노클로날 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 치료, 진단, M2 또는 인플루엔자 바이러스의 정제 및 단리, 및 샘플 또는 대상체내 M2 또는 인플루엔자 바이러스 존재의 동정에 있어서 유용하다.
Description
<우선권 출원 정보>
본 출원은 2002년 3월 13일 출원된 미국 가출원 번호 제60/364,997호를 우선권으로 주장한다.
인플루엔자 유형 A 또는 B 바이러스는 모든 국가에서 거의 매 겨울마다 질병의 전염을 유발하며, 발달된 세계에서 주요한 사망 원인이다. 미국에서, 이러한 동계 인플루엔자 전염병은 10％ 내지 20％의 사람들에서 병을 유발할 수 있으며, 연간 평균 20,000명의 사망 및 114,000명의 입원과 관련된다. 인플루엔자의 억제를 위한 현재의 전략은 불활성화된 전체-바이러스 서브유닛 백신을 매년 백신접종하는 것이다. 인플루엔자 바이러스의 주요한 중화 항원은 헤마글루티닌 (HA)이다 (Frace et al., Vaccine 17:2237 (1999)). 그러나, HA의 빈번하고 예상치 못한 항원성 변화로 인해, 이러한 백신은 분기하는 바이러스 균주에 대해 최적의 보호 면역을 제공하지 못하는 일이 빈번하다. 또한, 나이든 환자, 암 환자, 및 계속적인 치료 및(또는) 질병으로 인해 면역력이 없는 다른 환자와 같이 면역반응을 제대로 발휘하지 못하는 개체의 경우, 백신접종은 효과적인 보호를 제공하지 못할 수 있다.
헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA)는 항체 생산을 자극하는 2가지 주요 항원이다. 이러한 2가지 단백질의 빈번한 항원성 변화로 인해, 이들 단백질은 치료 약물의 개발을 위한 최적의 표적을 나타내지 않는다. 유형 A 인플루엔자 바이러스의 제3의 막횡단 단백질인 매트릭스 단백질 2 (M2)는 바이러스-감염된 세포에 의해 풍부하게 발현되며, 이는 바이러스 복제에서 필수적인 양성자의 막횡단 유입을 제공하는 것으로 추정된다 (Ciampor et al., Virus Research 22:247 (1992); Grambas and Hay, Virology 190:11 (1992); Sugrue et al., EMBO Journal 9:3469 (1990)). HA 및 NA와는 달리, M2는 보존되며, 인플루엔자 환자에서 항체-기초의 수동 면역요법의 개발을 위한 표적을 제공할 수 있다 (Ito et al., J Virology 65:5491 (1991); Slepushkin et al., Vaccine 13:1399 (1995); Neirynck et al., Nature Med. 5:1157 (1999)).
바쿨로바이러스-발현된 M2 단백질을 사용한 마우스의 백신접종은 마우스 폐로부터 바이러스의 제거를 증진시키며, 마우스를 동종 및 이종 인플루엔자 A 바이러스 둘 다에 의한 치명적인 공격으로부터 보호하는 것으로 보고되었다 (Slepushkin et al., Vaccine 13:1399 (1995)). 보다 최근의 보고는, M2의 세포외 도메인과 B형 간염 바이러스 코어 (HBc) 단백질이 융합하여 생성된 M2HBc를 코딩하는 융합 유전자가 백신으로 사용되는 경우 마우스에서 치명적인 바이러스 공격에 맞서 90 내지 100％의 보호를 제공할 수 있었음을 보여준다 (Neirynck et al., Nature Med. 5:1157 (1999)). 이러한 보호는 M2HBc 백신화된 마우스로부터의 혈청을 사용해서 백신화되지 않은 마우스에게 수동으로 전달할 수 있다. 제베데 (Zebedee) 등은 항-M2 마우스 모노클로날 항체가 플라크 분석에서 인플루엔자 바이러스의 성장에 적절한 영향을 준다는 것을 입증하였다. A/Udorn/72 바이러스의 경우, 플라크의 크기는 항체가 인큐베이션 동안 존재하는 경우에 더 작았지만, 플라크의 수는 그렇지 않았다. A/WSN/33 종의 경우에 플라크의 크기 또는 수에 대한 효과는 관찰되지 않았으며, 이는 이러한 특정의 모노클로날 항체가 다른 인플루엔자 종들에 대해 폭넓게 효과적이지 않음을 암시한다 (Zebedee and Lamb, J Virol 62:2762 (1988)). 이러한 항체가 바이러스 공격 하루 전에 마우스에 수동으로 전달된 경우, 감염된지 3일 내지 4일 후에 폐에서의 바이러스의 복제 수준은 부적절한 항체를 제공받은 동물에서의 수준보다 대략 100배 더 적었다 (Treanor et al., J. Virol 64:1375). 그러나, 이러한 항체가 바이러스 감염 1일 전에 SCID 마우스에게 투여되었을 때, 폐 바이러스 역가는 대조군 마우스의 역가와 다르지 않았다 (Palladino et al., J Virol. 69:2075 (1995)). 동일한 쥐과동물 항-M2 모노클로날 항체인 14C2를 사용한 모쯔드자노브스카(Mozdzanowska) (Virology 254: 138 (1999)) 등은 제베데 등과 동일하게 항-M2 모노클로날 항체가 바이러스 플라크 분석에서 바이러스 역가를 감소시킬 수 있음을 입증할 수 있었지만, 인플루엔자 종 A/PR/8/34의 바이러스 역가를 감소시킬 수는 없었으며, 이는 14C2가 인플루엔자에대해 넓은 보호를 제공하지 않음을 나타낸다.
발명의 개요
본원에 개시된 완전한 인간, 인간화 및 키메라 (예, 인간/마우스 키메라) 항-M2 모노클로날 항체는 A/PR/8/34 및 A/HK/8/68 종을 인식할 수 있으며, 이는 인플루엔자 A에 대한 넓은 반응성을 나타낸다. 또한, 본원에 개시된 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체는, 마우스가 인플루엔자 A에 감염된 이후에 상기 항체가 투여되는 경우, 마우스를 A/PR/8/34 인플루엔자 A 종의 치명적인 공격으로부터 보호할 수 있다.
따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 단백질 M2와 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 비롯한 조성물, 이들 인간, 인간화 및 키메라 항체를 함유하는 제약 조성물, 및 상기 항체를 함유하는 키트를 제공한다. 본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 항체는 감염 이전 (예방) 또는 감염 이후 (치료)를 비롯해서 인플루엔자에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 대상체에서의 인플루엔자의 치료; 바이러스 역가를 측정하는 것을 포함하는 인플루엔자의 진단; 전체 바이러스 또는 M2 단백질을 정제 또는 단리하는 것을 포함하는 정제/단리; 및 다른 분석 시스템에 유용하다. 따라서, 본 발명은 치료 (예, 인플루엔자 감염의 치료), 진단 (샘플에서 인플루엔자 또는 M2 단백질의 양 검출) 및 정제 (인플루엔자 바이러스 또는 M2 단백질의 정제 또는 단리)에서 본 발명의 항체를 사용하는 방법을 또한 제공한다.
한 실시양태에서, M2 세포외 도메인의 적어도 일부와 특이적으로 결합하는 인간 항체가 제공된다. 특정 측면에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1), 그의 서브서열(subsequence) 또는 그의 아미노산 변이체 (예, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가)를 포함한다. 다른 측면에서, 아미노산 치환은 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 또는 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD (각각, 서열 2 내지 8)로부터 선택된다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 및 이들의 혼합물을 포함하며, IgG, IgA, IgM, IgE, IgD, 및 이들의 이소타입의 어느 것, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3또는 IgG4일 수 있다. 항체는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄 (예, 중쇄 및 경쇄 가변 영역)를 갖는 원형 인간, 인간화 및 키메라 이뮤노글로불린 분자, 및 M2와 특이적으로 결합하는 모(parental) 원형 인간, 인간화 및 키메라 항체의 기능 (M2 결합 특이성, M2 결합 친화성 또는 항-인플루엔자 바이러스 활성)의 적어도 일부를 보유하는 중쇄 또는 경쇄의 서브서열을 포함한다. 예시적인 서브서열로는 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, 단쇄 Fv (scFv), 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL또는 VH, 또는 원형 인간 또는 인간화 이뮤노글로불린의 다른 M2 단백질 결합 단편을 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 번호 2074 (ATCC PTA-4025), 161 (ATCC PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함한다.
다양한 측면에서, 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조된다.
항체는 또한 본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 항체의 결합 특이성 및 결합 친화성을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 항체의 결합 친화성을 갖는다.
또한, 본 발명의 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 예시된 항체와 같이, 시험관내 또는 생체내에서 바이러스 감염을 억제하거나 또는 세포의 M2 결합을 억제하는 능력을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 3.0 ㎍/ml 미만이다. 다양한 측면에서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 예를 들어 A/PR/8/34 또는 A/HK8/68이다.
본 발명의 항체는 임의로 여러 인플루엔자 바이러스 (예, 종 또는 단리물) 상에 존재할 수 있는, 상이한 아미노산 서열을 갖는 2종 이상의 M2 단백질과 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 M2 세포외 도메인 서열의 적어도 일부와 결합한다. 특정 측면에서, M2 세포외 도메인 서열은 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1), 그의 서브서열 또는 그의 아미노산 변이체 (예, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가), 예를 들어 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD (서열 2)을 포함한다. 다른 특정 측면에서, M2 세포외도메인 서열은 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 및 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD (각각, 서열 2 내지 8)로부터 선택된다.
본 발명의 항체는, 예를 들어 올리고머화 도메인 (예, 류신 지퍼 모티프)의 부착을 통해 또는 가교결합제 (예, 화학적 가교결합제)를 통해 올리고머가 형성되도록 변형시킨 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 다량체 형태, 예를 들어 이량체, 삼량체, 사량체 또는 더 높은 차수의 인간, 인간화 및 키메라 항체 올리고머를 포함한다. 통상적으로 이러한 항체 다량체는 단량체 항체에 비해 M2에 대해 증가된 친화성을 나타낸다.
본 발명의 항체는 M2와 결합하는 인간 또는 인간화 항체에 대해 구별되는 기능 또는 활성을 부여하는 하나 이상의 이종 도메인을 추가로 포함한다. 상기 인간 또는 인간화 항체와 하나 이상의 아미노산이 다른 경우 (즉, 이들이 천연 항체의 부분이 아닌 경우) 항체는 아미노산 이종 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 도메인은 결합 단백질 (예, 수용체 또는 리간드 결합), 효소 활성, 약물, 항바이러스제, 독소, 면역-조절자, 검출가능한 잔기 또는 태그를 포함한다. 한 측면에서, 결합 단백질은 인플루엔자 단백질 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체와 다른 결합 특이성 또는 친화성을 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 다중특이적 및 다관능성 항체 (예, 이중특이적 및 이관능성 항체, 예를 들어 각각 2가지 이상의 항원과 결합하거나 또는 2개 이상의 기능 또는 활성을 갖는 항체)를 추가로 제공한다.
본 발명의 항체는 임의로는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 존재하는 인플루엔자 단백질 M2와 결합할 수 있다. 따라서, 항체는 M2 또는 인플루엔자 바이러스 감염성, 복제, 증식, 역가, 인플루엔자와 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 중증도 또는 지속기간, 또는 인플루엔자 바이러스 감염의 감수성에 대한 하나 이상의 효과, 즉 항-인플루엔자 바이러스 활성을 갖는다. 한 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 시험관내 또는 생체내에서 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 세포의 감염을 억제한다. 다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 바이러스 역가 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 바이러스 역가 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양의 증가를 억제하거나 방지한다. 또 다른 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 대상체를 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염으로부터 보호하거나 또는 상기 감염에 대해 대상체의 감수성을 감소시킨다. 추가의 실시양태에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예를 들어, 오한(chill), 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증)을 감소시킨다. 다양한 측면에서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 대상체의 전신으로 투여 (예, 정맥내 주사, 피하주사, 정맥내 주입, 근육내 주사)하거나 또는 점막 조직 (예, 비도(nasal passage), 부비동(sinuses), 인후부, 후두부, 식도, 귀 또는 이도(ear canal)) 또는 폐에 국소 투여한다. 다양한 측면에서, 인플루엔자 종은 A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68, 또는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3으로부터 선택되는 다른 종으로부터 선택된다.
본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 항체를 발현시키는 숙주 세포가 또한 제공된다. 이러한 세포로는 본 발명의 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 발현시키는 박테리아, 효모, 식물, 동물 (예컨대, 포유동물 세포, 예를 들어 하이브리도마 세포주 및 CHO 세포주), 및 비인간 동물 및 식물과 같은 전체 생물을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체를 코딩하는 핵산 (그의 서브서열 및 변이체 포함)이 추가로 제공된다. 핵산은 용액, 세포 또는 임의의 생물에서 핵산의 클로닝 또는 다른 유전적 조작을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체를 포함하는 배합 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 M2 단백질 및 항바이러스제와 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 인플루엔자 M2 단백질과 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 및 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 부비동 감염 또는 귀 감염)을 억제하는 물질을 포함한다.
본 발명의 항체 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 담체는 대상체의 점막 조직 (예, 비도, 부비동, 인후부, 후두부, 식도) 또는 폐로 투여하는데 있어서 적합하다.
하나 이상의 본 발명의 항체를 용기내에 포함하는 키트가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 치료(예방 또는 치료)하거나, 억제하거나, 예방하거나, 이에 대한 감수성을 감소시키거나 또는 상기 증상 또는 합병증을 경감시키기 위한 지침을 포함한다. 다른 실시양태에서, 용기는 대상체로의 흡입 또는 비 투여에 적합한 에어로졸, 스프레이 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트 또는 용기는 항바이러스제 (예, 항체 또는 약물) 또는 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 포함한다.
대상체의 인플루엔자 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체의 인플루엔자 감염을 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 항체는 대상체의 감염과 실질적으로 동시에 또는 대상체의 감염 후에 (즉, 치료 처치) 투여한다. 다른 측면에서, 항체는 치료 이점을 제공한다. 다양한 측면에서, 치료 이점으로는 하나 이상의 인플루엔자 종의 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증, 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 바이러스 단백질의 양을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다. 감소 또는경감될 수 있는 인플루엔자 감염의 증상 또는 합병증으로는 예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증을 들 수 있다. 또 다른 측면에서, 치료 이점은 인플루엔자 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는 것을 포함한다.
하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하는 방법의 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하거나 또는 상기 종 또는 단리물에 의한 인플루엔자 감염에 대해 대상체의 감수성을 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 대상체의 감염 이전에 (예방), 대상체의 감염과 실질적으로 동시에 또는 대상체의 감염 이후에 투여한다. 다른 측면에서, 항체는 치료 이점을 제공한다. 다양한 측면에서, 치료 이점은 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증), 상기 종 또는 단리물의 바이러스 역가 또는 바이러스 단백질의 양, 또는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염에 대해 대상체의 감수성을 감소시키거나 또는 경감시키는 것을 포함한다.
대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 인플루엔자 바이러스 단백질의 양의 증가를 방지하는 방법이 추가로 제공된다. 한실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체에서 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 인플루엔자 바이러스 단백질 양의 증가를 방지하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다.
또한, 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하거나 또는 상기 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염으로부터 상기 대상체를 보호하거나 또는 상기 감염에 대한 상기 대상체의 감수성을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 이러한 보호는 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예, 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증)을 감소시키거나 경감시키는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁),C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 결합 친화성을 갖는 항체를 사용해서 실시할 수 있다. 항체는 대상체로 투여하기에 앞서서 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제내에 포함시킬 수 있다.
치료, 진단 및 정제/단리를 포함하는 본 발명의 방법은 임의의 인플루엔자 종/단리물 또는 이들 종/단리물의 조합물에 적용할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 인플루엔자 종은 A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68, 또는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3으로부터 선택되는 다른 종으로부터 선택된다.
본 발명은 항체, 보다 구체적으로는 인플루엔자 바이러스 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체에 관한 것이다.
도 1은 C40 항체의 이뮤노글로불린 경쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (C40Lv(서열 10)) 및 상기 항체의 이뮤노글로불린 중쇄의 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (C40Hv(서열 9))을 나타낸다.
도 2는 항체 번호 2074, N547, L66 및 C40G1이 A) A/PR/8/34 및 B) A/HK/8/68 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2와 결합한다는 것을 보여준다.
도 3은 A) C40G1, C40G4 및 L30과, 및 B) 번호 2074, F1 및 F2 항체의 보호 효능의 비교를 나타내며, IgG1 이소타입 M2 항체가, 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2에 대해 약한 결합 친화성을 갖는 항체 (즉, F1 및 F2)보다 치명적인 바이러스 공격으로부터 동물을 훨씬 잘 보호한다는 것을 보여준다.
도 4는 인플루엔자 바이러스 감염된 세포 상에 발현된 A) M2 펩티드/BSA 및 B) M2와 결합하는 M2 항체의 비교를 나타낸다.
도 5는 M2 항체 번호 2074를 투여받은 동물의 예방적 보호를 나타낸다.
도 6은 M2 항체 번호 2074를 투여받은 동물의 치료적 보호를 나타낸다.
본 발명은 적어도 부분적으로는 인간, 인간화 및 키메라 항-M2 모노클로날 항체를 기초로 한다. 본 발명의 여러 항체들은 분기하는 인플루엔자 A 바이러스 균주를 기초로 하는 다양한 M2 세포외 도메인 서열에 대해 넓은 반응성을 갖는다. 예방 (바이러스 감염 이전) 및 치료 (바이러스 감염 이후) 마우스 인플루엔자 모델 둘 다에 본 발명의 인간 항-M2 모노클로날 항체를 수동으로 전달하여 인플루엔자A/PR/8/34의 치사량 공격으로부터 상기 동물을 보호하였다. 따라서, 본 발명의 항체는 넓은 범위의 인플루엔자 종 또는 단리물을 처리하는데 있어서 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 인간 항체이기 때문에 반복 투여하더라도 과민성을 유발할 가능성이 적으며, 보다 오랜 기간 동안 대상체 (예, 인간)의 체내에 잔류할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따라, 인플루엔자 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 및 키메라 항체가 제공된다. 한 실시양태에서, 인플루엔자 단백질 M2 세포외 도메인과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체가 제공된다.특정 측면에서, 세포외 도메인은 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1), 그의 일부 또는 그의 아미노산 변이체 (예, 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가), 예를 들어 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD (서열 2)을 포함한다. 특정 측면에서, 아미노산 치환을 갖는 세포외 도메인은 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 및 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD (각각, 서열 2 내지 8)로부터 선택된다.
용어 "항체"는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인인 VH및 VL을 통해 다른 분자 (항원)과 결합하는 단백질을 의미한다. "항체"는 임의의 이뮤노글로불린 분자, 예를 들어 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이들의 임의의 하위군을 의미한다. 또한, 용어 "항체"는 달리 기술하지 않는다면 이뮤노글로불린 분자의 기능성 단편, 예를 들어 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv를 의미한다.
용어 "M2 항체" 또는 "항-M2 항체"는 인플루엔자 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 특이적 결합은 M2 단백질에 존재하는 에피토프에 대해 선택적인 결합이다. 즉, M2 이외의 단백질과의 결합은 이 결합이 M2의 검출을 유의하게 방해하지 않도록 한다. 당업계에 공지된 분석법을 이용해서 선택적 결합을 비-선택적 결합과 구별할 수 있다.
본 발명의 예시적인 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시된다. 예시적인 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열은 각각 서열 11 및 서열 12에 기재된 아미노산 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날"이 항체와 관련하여 사용되는 경우에는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 비롯한 단일 클론을 기초로 하거나, 그로부터 얻어지거나 또는 그로부터 유도된 항체를 의미한다. 따라서, "모노클로날" 항체는 본원에서 구조적으로 정의되며, 그를 제조하는 방법은 기재하지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 하이브리도마 또는 다른 세포주에 대해 제공된 구체적인 명칭, 숫자 또는 다른 표시, 예를 들어 번호 2074, 161, N547, L66 및 C40G1은 항체의 명칭을 의미하기 위해 사용된다.
항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "인간"은 항체의 아미노산 서열이 완전히 인간 서열임을 의미한다. 본원에서 "인간 M2 항체" 또는 "인간 항-M2 항체"는 인간 이뮤노글로불린 아미노산 서열, 즉 M2와 특이적으로 결합하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 의미한다. 즉, 항체 아미노산의 전체가 인간 서열이거나 또는 인간 항체에 존재한다. 따라서, 예를 들어, 비인간 항체는비인간 아미노산 잔기를 인간 항체에 존재하는 아미노산 잔기로 치환함으로써 완전히 인간 항체로 만들 수 있다. 인간 항체에 존재하는 아미노산 잔기, CDR 영역 맵(map) 및 인간 항체 컨센서스 잔기는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed. US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); and Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 186:651 (1987)) 참조). 22개의 공지된 인간 VHIII 서열의 조사를 기초로 하는 인간 VH서브그룹 III의 컨센서스 서열 및 30개의 공지된 인간 카파 I 서열의 조사를 기초로 하는 인간 VL카파-쇄 서브그룹 I의 컨센서스 서열은 문헌 (Padlan Mol. Immunol. 31:169 (1994); and Padlan Mol. Immunol. 28:489 (1991))에 기재되어 있다.
항체와 관련하여 사용되는 경우에 용어 "인간화"는, 항체의 아미노산 서열이 어셉터(acceptor) 인간 이뮤노글로불린 분자에서 목적하는 항원 (예, M2)과 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결정 영역 (CDR)의 비인간 아미노산 잔기 (예, 마우스, 래트, 염소, 토끼 등) 및 이러한 CDR을 플랭킹하는 아미노산 잔기인 Fv 프레임워크 영역 (FR)에서 하나 이상의 인간 아미노산 잔기를 가짐을 의미한다. 이뮤노글로불린의 인간 프레임워크 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체할 수 있다. 따라서, 인간 프레임워크 영역의 잔기를 비인간 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환하여, 예를 들어 항원 친화성 또는 특이성을 변화, 일반적으로는 향상시킬 수 있다. 또한, 인간화 항체는 인간 항체에도 존재하지 않고 공여자 CDR 또는프레임워크 서열에도 존재하지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 항체 또는 공여자 비인간 항체에 존재하지 않는 특정 위치에서의 프레임워크 치환은 이러한 위치에서 인간 항체의 결합 친화성 또는 특이성을 향상시킬 것으로 예상할 수 있다. 분자 모델링을 기초로 하는 항체 프레임워크 및 CDR 치환은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링하여 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 동정하고, 서열 비교에 의해 특정 위치에서 통상적이지 않은 프레임워크 잔기를 동정한다 (예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호, 및 문헌 (Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)) 참조). 당업계에서 "영장류화된" 것으로 언급된 항체는, 어셉터 인간 이뮤노글로불린 분자 및 프레임워크 영역 아미노산 잔기가 임의의 인간 잔기 이외에도 임의의 영장류 잔기일 수 있음을 제외하면, 본원에 사용된 바와 같은 "인간화"의 의미내에 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체와 관련해서 사용되는 경우에 용어 "키메라" 및 그의 문법상 유사어는, 항체의 아미노산 서열이 2가지 이상의 상이한 종들로부터 유도되거나, 수득 또는 단리되거나, 또는 이들 종을 기초로 하는 하나 이상의 부위를 함유함을 의미한다. 즉, 예를 들어, 항체의 일부는 인간 서열 (예, 불변 영역)일 수 있으며, 항체의 다른 일부는 비인간 서열 (예, 쥐과동물 가변 영역)일 수 있다. 따라서, 키메라 항체는 항체의 여러 부위들이 상이한 종에서 기원하는 분자이다. 인간화 항체와는 달리, 키메라 항체는 항체의 임의의 영역에서 상이한 종 서열을 가질 수 있다. 키메라 항체의 예로는 마우스 람다 경쇄 및 인간 감마 중쇄를 갖는 항체 번호 2074가 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "M2," "M2 단백질," "M2 서열" 및 "M2 도메인"은 자연 발생적이거나 또는 인공적으로 제조된 임의의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물로부터 단리되거나, 이러한 종 또는 단리물을 기초로 하거나 또는 상기 종 또는 단리물에 존재하는 M2 단백질 서열의 전부 또는 일부 (예, 세포외 도메인과 같은 서브서열)를 의미한다. 따라서, M2 등과 같은 용어는, 바이러스 생활환 동안에 돌연변이에 의해 생성되거나 또는 선택적 압력 (예, 약물 요법, 숙주 세포 향성 또는 감염성의 확대 등)에 반응하여 생성된 자연 발생적인 M2 서열 변이체, 및 재조합적으로 또는 합성에 의해 제조된 M2 서열을 포함한다.
하기에 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명의 M2 항체는 자연 발생적인 항체에서와 같이 각각 전장인 카파 또는 람다 경쇄 서열, 그의 혼합물 (즉, 카파 및 람다 쇄 서열의 융합물), 및 그의 서브서열을 갖는 항체를 포함한다. 자연 발생적인 항체 분자는 2개의 카파 및 2개의 람다 경쇄를 함유한다. 카파 및 람다 경쇄 사이의 주요한 차이는 불변 영역의 서열에 있다.
본 발명의 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체의 결합 특이성을 갖는 항체, 예를 들어 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 항체를 포함한다. 한 측면에서, M2 항체는 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 어느 것에 기재된 중쇄 (H) 또는 경쇄 (L) 서열, 또는 그의 서브서열을 가지며, 단 항체의 중쇄 또는 경쇄 서열, 또는 그의 서브서열은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40,S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 결합 특이성을 갖는다.
항체와 관련해서 사용되는 경우에 용어 "결합 특이성"은, 항체가 관련 항체와 동일한 항원성 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 번호 2074로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 번호 2074로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합하고; 161로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 161로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합하고; N547로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 N547로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합하고; L66으로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 L66으로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합하며; C40G1로 표시되는 항체의 결합 특이성을 갖는 M2 항체는 C40G1로 표시되는 M2 항체와 동일한 에피토프의 전부 또는 일부와 특이적으로 결합하는 등이다.
항원성 에피토프의 부분은 에피토프의 서브서열 또는 일부를 의미한다. 예를 들어, 에피토프가 8개의 인접 아미노산을 포함하는 경우, 에피토프의 서브서열, 즉 에피토프의 부분은 상기 8개의 아미노산 서열 에피토프내의 7개 이하의 아미노산일 수 있다. 또한, 에피토프가 비-인접 아미노산 서열, 예를 들어 서로 인접하지 않지만 단백질 폴딩으로 인해 에피토프를 형성하는 5개의 아미노산 서열 및 8개의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 에피토프의 서브서열, 즉 에피토프의 부분은 5개의 아미노산 서열 또는 8개의 아미노산 서열 단독일 수 있다.
본원에 예시된 M2 항체의 결합 특이성을 갖는 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 의해 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 결합과 경쟁한다. 본원에 예시된 M2 항체의 결합 특이성을 갖는 본 발명의 항체는 경쟁적 결합을 측정하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 본원에 개시된 면역분석법에 의해 특성화할 수 있다. 결합 친화성이 예시된 항체와 다를 수 있기 때문에, 항체는 M2와의 결합을 경쟁하는 능력에 있어서 다를 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 결합을 95％ 이상, 90％ 이상, 85％ 이상, 80％ 이상, 75％ 이상, 70％ 이상, 65％ 이상, 60％ 이상, 55％ 이상, 50％ 이상, 45％ 이상, 40％ 이상, 35％ 이상 또는 30％ 이상, 또는 그보다 적게 경쟁적으로 억제한다.
에피토프는 통상적으로 짧은 아미노산 서열이며, 예를 들어 아미노산 약 5개 내지 15개 길이이다. 에피토프를 동정하는 체계적인 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제4,708,871호에 기재되어 있다. 요컨대, M2 항원으로부터 유도된 오버랩핑(overlapping) 올리고펩티드 세트를 합성하여 핀(pin)들로 이루어진 고상 어레이(array)에 결합시킬 수 있는데, 올리고펩티드는 각각의 핀에 대해 특이적이다. 핀들로 이루어진 어레이는 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 항-M2 모노클로날 항체와의 결합에 있어서 96개의 올리고펩티드 모두를 동시에 분석할 수 있게끔 한다. 또는, 에피토프 맵핑에 있어서 현재 시판되는 것으로는 파아지 디스플레이 펩티드 라이브러리 키트 (New England BioLabs)가 있다. 이러한 방법들을 이용해서 연속적인 아미노산들의 가능한 모든 서브세트에 대한 결합 친화성을 측정함으로써 특정 항체가 결합하는 에피토프를 동정할 수 있다. 또한, 에피토프 길이 펩티드 서열을 사용해서 펩티드 서열과 결합하는 항체가 얻어지는 동물을 면역화하는 경우에 추정에 의해 에피토프를 동정할 수도 있다.
또한, 본 발명의 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체와 동일한 결합 친화성 및 그와 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 인간, 인간화 및 키메라 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 M2 항체는 관련 항체보다 2배 내지 5배, 5배 내지 10배, 10배 내지 100배, 100배 내지 1,000배 또는 1,000배 내지 10,000배 더 크거나 더 작은 친화성을 가질 수 있다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 항체와 동일한 결합 친화성 및 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 M2 항체를 제공하며, 단 중쇄 또는 경쇄 서열, 또는 그의 서브서열은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), X547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 결합 특이성을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이, 항체 결합 친화성과 관련해서 사용되는 경우에 용어 "동일한"은 해리 상수 (KD)가 관련 항체의 약 5배 내지 100배 (관련 항체보다 5배 내지 100배 더 크거나 더 작은 친화성) 이내임을 의미한다. 항체 결합 친화성과 관련해서 사용되는 경우에 용어 "실질적으로 동일한"은 해리 상수 (KD)가 관련항체의 약 5배 내지 5,000배 (관련 항체보다 5배 내지 5,000배 더 크거나 작은 친화성) 이내임을 의미한다.
본 발명에 포함된 추가의 항체는 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-1026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 항체의 결합 특이성, 및 M2에 대해 5×10-2M, 10-2M, 5×10-3M, 10-3M, 5×10-4M, 10-4M, 5×10-5M, 10-5M, 5×10-6M, 10-6M, 5×10-7M, 10-7M, 5×10-8M, 10-8M, 5×10-9M, 10-9M, 5×10-10M, 10-10M, 5×10-11M, 10-11M, 5×10-12M, 10-12M, 5×10-13M, 10-13M, 5×10-14M, 10-14M, 5×10-15M 및 10-15M 미만의 해리 상수 (Kd)로 결합 친화성을 갖는다.
본 발명의 인간 M2 항체는 본원에 예시된 M2 항체의 하나 이상의 항-인플루엔자 활성의 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스감염을 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 증식 또는 복제를 억제하거나, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 경감시키거나, 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 감수성을 감소시키는 등의) 적어도 일부를 갖는 항체를 포함한다. 따라서, 추가의 실시양태에서, 본 발명은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 항체의 하나 이상의 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 갖는 M2 항체를 제공한다.
항체와 관련 항체를 비교하는데 사용되는 경우에 용어 "활성"은, 이 항체가 관련 항체로서의 활성, 예를 들어 결합 친화성, 결합 특이성 또는 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부를 가짐을 의미한다. 따라서, N547로 표시되는 M2 항체의 활성을 갖는 항체는 N547로 표시되는 M2 항체의 하나 이상의 활성의 적어도 일부를 가지고; L66으로 표시되는 M2 항체의 활성을 갖는 항체는 L66으로 표시되는 M2 항체의 하나 이상의 활성의 적어도 일부를 가지고; C40G1로 표시되는 M2 항체의 활성을갖는 항체는 C40G1로 표시되는 M2 항체의 하나 이상의 활성의 적어도 일부를 갖는 등이다. 용어 "적어도 일부"는 항체가 적은 활성을 가질 수 있지만, 이 항체가 관련 M2 항체의 활성의 적어도 일부, 예를 들어 M2에 대한 결합 친화성의 적어도 일부, 적어도 부분적인 항-인플루엔자 활성 등을 보유함을 의미한다.
예시된 인간 M2 항체의 활성을 갖는 항체는, 코팅 항원으로서 플레이트-결합된 M2 펩티드를 사용하는 결합 분석 (ELISA), 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2 단백질에 대한 결합 분석 (세포 기초의 ELISA), 및 M2 펩티드를 갖는 바이러스 감염된 MDCK 세포 상의 M2 (M2 세포외 부위)와 결합하는 항체의 특이적 억제를 이용해서 동정할 수 있다. 추가의 분석으로는 인플루엔자 바이러스를 사용하는 시험관내 세포 감염성 분석 (Zebedee et al. J Virology 62:2762 (1988)) 및 실시예 1, 3 및 4에 기재된 생체내 동물 분석을 들 수 있다.
인간 항체를 제조하는 방법은 본원에 개시되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같이, KLH 또는 BSA에 접합된 M2 단백질을 사용해서 인간 트랜스염색체 KM 마우스 (WO 02/43478) 또는 HAC 마우스 (WO 02/092812)를 면역화하였다. KM 마우스 또는 HAC 마우스는 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현시킨다. 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여, M2 항원에 대한 고(high) 반응자였던 면역화된 마우스로부터 비장세포를 단리하고, 골수종 세포와 융합시켰다. 12가지 모노클로날 항체를 얻었으며, 번호 2074, C40, L17, L30, L40, L66, N547, S212, S80, S900, F1 및 F2로 표시하였는데, 이들은 M2 펩티드 및(또는) M2-BSA 접합체와는 반응하였지만, BSA 또는 KLH 캐리어(carrier)와는 결합하지않았다. 인간 항체의 제조를 위한 기술의 개요는 문헌 (Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65 (1995))에 기재되어 있다. 내생성 이뮤노글로불린을 발현시키지 않는 하나 이상의 인간 이뮤노글로불린 유전자 (카파 또는 람다)를 갖는 형질전이(transgenic) 동물은 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호에 기재되어 있다. 또한, 인간 항체는 애브제닉스, 인크.(Abgenix. Inc.)(Freemont, CA) 및 젠팜(Genpharm)(San Jose, CA)과 같은 판매업자로부터 입수할 수도 있다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 제조하는 추가의 방법은 문헌 (예를 들어, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,885,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598호 참조)에 기재되어 있다.
M2 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파아지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 비롯한 다른 기술을 이용해서 쉽게 생성시킬 수도 있다 (미국 특허 제4,902,614호, 동 제4,543,439호 및 동 제4,411,993호 참조; 또한, 문헌 (Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) 참조). 본 발명의 방법에 추가로 이용할 수 있는 적합한 기술로는 M2 친화성 정제, 비-변성 겔 정제, 단백질 A 컬럼 상 HPLC 또는 RP-HPLC 정제, 또는 이들 기술의 임의의 조합 등을 들 수 있다. 항체 이소타입은 ELISA 분석을 이용해서 결정할 수 있으며, 예를 들어 인간 Ig는 마우스 Ig-흡착된 항-인간 Ig를 사용해서 동정할 수 있다.
항체는, 예를 들어 CDR-그래프팅(grafting)(EP 239,400; W0 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 동 제5,530,101호; 및 동 제5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서피싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 91:969 (1994)), 및 체인 셔플링(chain shuffling)(미국 특허 제5,565,332호)를 비롯해서 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용해서 인간화할 수 있다. 이미 인간 컨센서스 서열 (Padlan Mol. Immunol. 31:169 (1994); and Padlan Mol. Immunol. 28:489 (1991))을 사용해서 항체를 인간화한 바 있다 (Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); and Presta et al. J. Immunol. 151:2623 (1993)).
키메라 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191); 및 미국 특허 제5,807,715호; 동 제4,816,567호; 및 동 제4,816,397호). 하나의 종의 항체로부터의 가변 도메인이 다른 종의 가변 도메인으로 치환된 키메라 항체는 예를 들어 문헌 (Munro, Nature 312:597 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Capon et al., Nature337:525 (1989); and Traunecker et al., Nature 339:68 (1989))에 기재되어 있다.
항체를 제조하는데 적합한 M2 단백질은 당업계에 공지된 다양한 표준 단백질 정제 또는 재조합 발현 기술들 중 어떤 것에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, M2는 표준 펩티드 합성 기술, 예를 들어 고상 합성에 의해 제조할 수 있다. 이 단백질의 일부는 발현 또는 합성된 M2의 정제를 용이하게 하기 위해 T7 태그 또는 폴리히스티딘 서열과 같은 아미노산 서열을 함유할 수 있다. M2 펩티드는 세포에서 발현될 수 있으며, 세포에 의해 제조된 단백질은 정제할 수 있다. M2 단백질은 재조합 방법에 의해 더 큰 단백질의 일부로서 발현될 수도 있다.
면역 반응을 발생시키는데 적합한 M2의 형태는 전장 M2의 펩티드 서브서열 (예를 들어, 통상적으로 아미노산 4개 내지 5개, 또는 그 이상의 길이임)을 포함할 수 있다. M2의 다른 형태는 M2 함유 제제 또는 추출물, 부분적으로 정제된 M2, 및 M2를 발현시키는 세포 또는 바이러스, 또는 이러한 발현성 세포 또는 바이러스의 제제를 포함한다.
면역화할 수 있는 동물로는 마우스, 토끼, 래트, 양, 염소 또는 기니 피그를 들 수 있는데, 이러한 동물들은 인간 IgG 유전자 로커스(locus)를 포함하도록 유전적으로 변형시킬 수 있다. 또한, 면역 반응을 증가시키기 위해, M2를 다른 단백질, 예를 들어 난알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 티로글로불린 및 파상풍 톡소이드(toxoid)와 연결하거나, 또는 프로인트(Freund's) 완전 또는 불완전 보조제 등의 보조제와 혼합할 수 있다. 초기 및 이후의 임의의 면역화는 복강내, 근육내, 안내 또는 피하 경로를 통한 것일 수 있다. 이후의 면역화는 M2 항원 제제와 동일한 농도 또는 상이한 농도에서 규칙적인 간격 또는 불규칙한 간격으로 수행할 수 있다.
따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염, 복제, 증식 또는 역가를 억제하거나, 바이러스 복제, 증식 또는 역가의 증가를 억제하거나, 인플루엔자 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 중증도 또는 지속기간 또는 감염에 대한 감수성을 감소시키거나, 또는 다양한 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 대해 넓은 반응성을 갖는 항체를 비롯한 인간 M2 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 M2 또는 그의 면역원성 단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현시킬 수 있는 동물 (예, 마우스)에게 투여하는 단계, 인간 M2 항체를 발현시키는 동물을 스크리닝하는 단계, 인간 M2 항체를 생성시키는 동물을 선별하는 단계, 인간 M2 항체를 생산하는 동물로부터 항체를 단리하는 단계, 및 인간 M2 항체가 M2와 결합하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법은 인간 M2 또는 그의 면역원성 단편을 인간 이뮤노글로불린을 발현시킬 수 있는 동물 (예, 마우스)에게 투여하는 단계, 인간 M2 항체를 생산하는 마우스로부터 비장 세포를 단리하는 단계, 비장 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 하이브리도마를 항-인플루엔자 활성을 갖는 인간 M2 항체의 발현에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함한다.
본 발명은 변형된 인간 M2 항체를 추가로 제공한다. 변형의 예로는 항체의 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 들 수 있으며, 단 변형된 항체는 변형된 M2 항체의 활성, 예를 들어 항-인플루엔자 활성의 전부 또는 적어도 일부를 갖는다.
변형의 특정 예는 본 발명의 항체가, 예를 들어 중쇄 불변 영역의 치환에 의해 상이한 이소타입 또는 하위군을 갖도록 변형된 경우이다 (예를 들어, 실시예 2 참조). IgG4에서 IgG1까지의 M2 항체 C40의 Ig 하위군의 변형은 항-인플루엔자 활성을 향상시킨다. 따라서, 변형은 본 발명의 항체로부터 아미노산 서열의 큰 영역을 결실시키고, 이 영역을, 서열 길이가 결실된 영역보다 길던지 짧던지 간에 다른 아미노산 서열로 치환하는 것을 포함한다.
본 발명에 포함된 M2 항체의 추가의 변형은 항체 유도체, 즉 임의의 형태를 갖는 분자가 항체와 공유결합 부착하는 것이다. 항체 유도체의 구체적인 예로는 글리코실화된 항체, 아세틸화된 항체, 인산화된 항체, 아미드화된 항체, 포르밀화된 항체, 유비퀴틴화된 항체, 보호기/차단기에 의해 유도체화된 항체, 및 수많은 화학적 변형 중 어떤 것에 의해 변형된 항체를 들 수 있다.
개별적인 아미노산 치환은, 자연 발생적인 L-아미노산이 D-형태의 아미노산으로 치환되는 것을 제외하면 동일한 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산 치환은 보존적이거나 비-보존적일 수 있으며, 항체의 불변 영역 또는 가변 영역에서 행해질 수 있다. 불변 영역 또는 가변 영역에서의 하나 또는 몇몇 보존적 아미노산 치환은 허용될 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 구체적인 예로는 Ile, Val, Leu 또는 Ala를 서로 치환하는 것, Lys 및 Arg를 서로 치환하는 것, Glu 및 Asp를 서로 치환하는 것, Gln 및 Asn을 서로 치환하는 것이 있다. 초가변 영역내 여러아미노산의 비-보존적 치환은 결합 활성, 특이성 또는 항체 기능 또는 활성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 비치환된 항체의 결합 활성, 특이성 또는 항체 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유하는 것들을 동정하기 위해 상기 효과에 대하여 초가변 영역내 치환을 분석할 수 있다. 비변형된 인간 M2 항체의 결합 특이성, 결합 친화성 또는 항-인플루엔자 활성의 적어도 일부가 치환된 항체에 의해 보유되기만 하면, 아미노산 치환을 갖는 이러한 항체는 본 발명에 포함된다.
따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 M2 항체는 본원에 기재된 바와 같은 서브서열 (예, 단편) 및 변형된 형태 (예, 서열 변이체)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 M2 항체 서브서열은 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL또는 VH도메인 단편을 포함한다. 특정 측면에서, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 디술피드-연결된 Fv (sdFv) 및 VL또는 VH도메인 서브서열은 동일한 결합 친화성, 실질적으로 동일한 결합 친화성, 동일한 결합 특이성, 또는 하나 이상의 항-인플루엔자 활성, 예를 들어 관련 M2 항체 (예, 전장 또는 비변형된 M2 항체)로서 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 감염을 억제하는 효능을 갖는다. 단쇄 항체를 비롯한 M2-결합 항체 서브서열은 가변 영역(들)만을 포함하거나 또는 이 영역(들)을 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인 중 하나 이상의 전부 또는 일부와 함께 포함한다. 또한, 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2 및 CH3 도메인의 임의의 조합의 항원-결합 서브서열이 포함된다.
본 발명의 M2 항체 서브서열 (예, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, scFv, sdFv 및 VL또는 VH)은 항체의 단백질분해성 가수분해, 예를 들어 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 항체를 언급하는 경우에 용어 "기능성 서브서열" 및 "기능성 단편"은 원형 관련 항체로서 하나 이상의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유하는 항체의 일부를 의미한다.
펩신을 사용한 효소적 절단에 의해 제조할 수 있는 항체 단편은 F(ab')2로 표시되는 5S 단편을 제공한다. 티올 환원제를 사용해서 이러한 단편을 추가로 절단하여 3.5S Fab' 1가 단편을 제조할 수 있다. 펩신을 사용하는 효소적 절단으로 2가지 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 제조한다 (예를 들어, 골든버그(Goldenberg)의 미국 특허 제4,036,945호 및 동 제4,331,647호; 및 문헌 (Edelman et al. Methods in Enzymology 1:422 (1967)) 참조). 또한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예를 들어 중쇄를 분리하여 1가 경쇄-중쇄 단편을 형성시키는 방법, 단편을 추가로 절단하는 방법, 또는 다른 효소적 또는 화학적 방법을 이용할 수도 있다. 유전자 기술로는 M2 항체 유전자의 전부 또는 일부를 Cos 세포 또는 이. 콜라이와 같은 숙주 세포내로 발현시키는 기술을 들 수 있다. 재조합 숙주 세포는 원형 또는 단일 항체 쇄, 예를 들어 scFv를 합성한다 (예를 들어, 문헌 (Whitlow et al., In: Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991), Bird et al., Science 242:423 (1988); 미국 특허 제4,946,778호) 참조). 단쇄 Fv 및 항체는 문헌 (미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,258,498호; Huston et al., MethodsEnzymol. 203:46 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993); and Skerra et al., Science 240:1038 (1988))에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
아미노산이 부가된 변형된 M2 항체의 다른 특정 예로는 제2 이종 서열, 즉 이종 기능성 도메인을 부착하여 항체에 상이한 기능 또는 상보적 기능을 부여하는 예가 있다. 예를 들어, 아미노산 태그, 예를 들어 T7 또는 폴리히스티딘을 부착시켜 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 정제 또는 검출을 용이하게 할 수 있다. 또 다른 예는 항바이러스제를 M2 항체에 부착시켜 인플루엔자로 감염된 세포를 표적화함으로써 바이러스를 사멸시키고, 증식을 억제하고, 복제를 억제하는 것 등이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 M2 항체, 및 도메인이 항체에 상이한 기능을 부여하는 이종 도메인, 즉 이종 기능성 도메인을 제공한다.
이종 기능성 도메인은 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 따라서, 이종 기능성 도메인은 상이한 유형의 작거나 큰 다양한 기능성 잔기들 중 어떤 것으로 구성될 수 있다. 이러한 잔기로는 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 작은 유기 화합물, 예를 들어 약물 (예, 항바이러스제)을 들 수 있다.
링커 서열을 항체 서열과 이종 기능성 도메인 사이에 삽입시켜 이들 2개의 실재(entities)가 적어도 부분적으로는 구별되는 기능 또는 활성을 유지하도록 할 수 있다. 링커 서열은 가요성 형태, 정렬된 2차 구조 형성능 부재, 또는 각 도메인을 촉진시키거나 그와 상호작용할 수 있는 소수성 또는 하전된 특성을 포함하는 하나 이상의 특성을 가질 수 있다. 가요성 단백질 영역에 통상적으로 존재하는 아미노산으로는 Gly, Asn 및 Ser을 들 수 있다. 또한, 거의 중성인 다른 아미노산, 예를 들어 Thr 및 Ala를 링커 서열에서 사용할 수도 있다. 링커 서열의 길이는 융합 단백질의 기능 또는 활성에 유의한 영향을 주지 않으면서 변화시킬 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제6,087,329호 참조).
이종 기능성 도메인의 추가의 예는 검출가능한 표지이다. 따라서, 다른 실시양태에서, 본 발명은 검출가능하게 표지된 인간 M2 항체를 제공한다.
검출가능한 표지의 구체적인 예로는 형광발색단(fluorophore), 발색단(chromophore), 방사성 동위원소 (예, S35, p32, I125), 전자-밀집(electron-dense) 시약, 효소, 리간드 및 수용체를 들 수 있다. 효소는 통상적으로 그의 활성에 의해 검출된다. 예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB)과 같은 기질을 정량가능한 청색 안료로 전환시키는 능력에 의해 검출하는 것이 일반적이다. 리간드는 비오틴 등의 다른 분자와 결합할 수 있는데, 이는 아비딘 또는 스트렙타비딘, 및 단백질 A와 결합할 수 있는 IgG와 결합할 수 있다.
M2 항체는 2개 이상의 변화, 변형 또는 표지를 가질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 비오틴과 연결시켜 그의 존재를 아비딘과 함께 검출할 수 있을 뿐만 아니라, I125로 표지하여 그가 검출가능한 신호를 제공하도록 할 수 있다. 다른 변경 및 가능성은 당업계의 통상의 기술을 가진 사람에게는 극히 자명할 것이며, 본 발명의 범위내인 것으로 고려된다.
추가로, 본 발명은 변형된 형태, 단편, 키메라 등을 비롯하여 본 발명의 인간 M2 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 원형 또는 단쇄 M2 항체를 코딩한다.
용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 서로 바꾸어 쓸 수 있으며, 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 비롯한 모든 형태의 핵산을 언급하기 위해 사용된다. 핵산은 이중 또는 단일 스트랜드이거나, 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산으로는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스를 들 수 있다. RNA 핵산은 스플라이싱되거나(spliced) 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 안티센스일 수 있다. 본 발명의 핵산은 자연 발생적인 핵산, 합성 핵산, 및 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 포함한다. 이러한 변화된 또는 변형된 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 뉴클레아제 내성을 제공하는 유사체를 포함한다.
핵산은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))의 어떤 것의 서브서열은 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는 단백질을 코딩한다. 특정 실시양태에서, 핵산은 서열 9 및 서열 10에 기재된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 핵산은 서열 11 및 서열 12에 기재된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 코딩한다.
유전자 코드의 퇴행성(degeneracy)의 결과로서, 핵산은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026;), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))을 코딩하는 서열, 및 본원에 기재된 그의 서브서열 및 변형된 형태에 대해 퇴행성인 서열을 포함한다.
핵산은 잘 알려진 다양한 표준 클로닝 및 화학적 합성 방법들 중 임의의 것을 이용해서 제조할 수 있으며, 부위-지시적 돌연변이유발법 또는 당업자에게 공지된 다른 재조합 기술에 의해 의도적으로 변화시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 서열분석 및 겔 전기영동 등을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 핵산은, 핵산 발현이 본원에서 "발현 카세트"로 언급되는 "발현 조절 요소"에 의해 영향받거나 조절되는 핵산 구조물에 삽입시킬 수 있다. 용어 "발현 조절 요소"는 이 요소가 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하거나 발현에 영향을 주는 하나 이상의 핵산 서열 요소를 의미한다. 발현 조절 요소는, 경우에 따라, 단백질-코딩 유전자의 앞쪽에 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 유전자 사일렌서(silencer), 개시 코돈 (예, ATG) 등을 포함할 수 있다.
핵산 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소는 핵산 서열의 전사, 및 경우에 따라 그의 번역을 조절한다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 언급된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 병렬 배치 (juxtaposition)를 의미한다. 통상적으로, 발현 조절 요소는 유전자의 5' 또는 3' 말단에 병렬 배치되지만, 인트론성(intronic)일 수도 있다.
발현 조절 요소는 전사를 구성적(constitutive)으로 활성화하며, 유도가능하거나 (즉, 활성화를 위한 외부 신호를 필요로 함), 또는 탈억제가능한 (즉, 전사를 종결하는 신호를 필요로 함; 신호가 더 이상 존재하지 않는 경우, 전사는 활성화되거나 또는 "탈억제됨") 요소를 포함한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트에는 유전자 발현을 특정 세포-유형 또는 조직에 대해 조절가능하게 만드는데 충분한 조절 요소 (즉, 조직-특이적 조절 요소)가 포함된다. 통상적으로, 이러한 요소는 코딩 서열의 상류 또는 하류 (즉, 5' 및 3')에 위치한다. 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 5'에 위치한다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 제조된 프로모터를 사용해서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 제공할 수 있다. "프로모터"는 전사를 지시하는데 충분한 최소 서열 요소를 의미한다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포로의 증식, 및 원한다면 이후의 유전적 조작을 위해 플라스미드내에 삽입할 수 있다. 플라스미드는 숙주 세포에서 안정하게 증식할 수 있는 핵산이며, 플라스미드는 발현 조절 요소를 임의로 함유하여 숙주 세포에서 M2 항체를 코딩하는 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 본원에서 벡터는 플라스미드와 동의어로 사용되며, 숙주 세포에서 발현을 위한 발현 조절 요소를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 플라스미드 및 벡터는 적어도 세포의 증식을 위한 복제 기점 및 프로모터를 함유한다. 따라서, 플라스미드 및 벡터는 예를 들어 M2 항체 코딩 핵산의 유전적 조작, M2 항체 또는 안티센스 제조, 및 숙주 세포 또는 생물체에서 M2 항체의 발현에 유용하다.
항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하거나 또는 전장 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은 하이브리도마로부터 단리할 수 있다. 단리된 핵산은 적합한 발현 벡터내에 삽입할 수 있으며, 재조합 M2 항체의 제조를 위해 배양할 수 있는 효모 또는 CHO 세포 등의 적합한 숙주 세포내에 도입할 수 있다.
박테리아 시스템 프로모터는 T7 및 유도가능한 프로모터, 예를 들어 박테리오파아지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 곤충 세포 시스템 프로모터는 구성적이거나 또는 유도가능한 프로모터 (예, 엑디손(ecdysone))를 포함한다. 포유동물 세포의 구성적 프로모터로는 SV40, RSV, 소 파필로마 바이러스 (BPV) 및 다른 바이러스 프로모터, 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 유도가능한 프로모터 (예, 메탈로티오네인 IIA 프로모터; 열 충격 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 유도가능한 프로모터 (예, 아데노바이러스 후기(late) 프로모터; 유도가능한 마우스 유방 종양 바이러스의 말단의 긴 반복부)를 들 수 있다. 또는, 레트로바이러스 게놈을 유전적으로 변형시켜 적절한 숙주 세포에서 M2 항체의 발현을 도입 및 지시할 수 있다.
발현 시스템은 생체내 사용을 위해 설계된 벡터를 추가로 포함한다. 구체적인 비-제한적 예로는 아데노바이러스 벡터 (미국 특허 제5,700,470호 및 동 제5,731,172호), 아데노-관련 벡터 (미국 특허 제5,604,090호), 단순 포진 바이러스 벡터 (미국 특허 제5,501,979호), 레트로바이러스 벡터 (미국 특허 제5,624,820호, 동 제5,693,508호 및 동 제5,674,703호), BPV 벡터 (미국 특허 제5,719,054호) 및 CMV 벡터 (미국 특허 제5,561,063호)를 들 수 있다.
효모 벡터는 구성적 및 유도가능한 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 (Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methodsin Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology. 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y.; and, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II) 참조). 구성적 효모 프로모터, 예를 들어 ADH 또는 LEU2 또는 유도가능한 프로모터, 예를 들어 GAL을 사용할 수 있다 (R. Rothstein In: DNA Cloning. A Practical Approach, Vol.11, Ch.3, ed. D. M. Glover, IRL Press, Wash., D. C., 1986). 예를 들어 상동 재조합을 통해 외래 핵산 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진시키는 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 삽입된 폴리뉴클레오티드가 보다 통상의 벡터에 대해 너무 긴 (예를 들어, 약 12 kb 초과인) 경우에는 효모 인공 염색체 (YAC)를 통상적으로 사용한다.
인간 M2 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다양한 측면에서, 진핵 세포는 효모 또는 포유동물 (예, 인간, 영장류 등) 세포이다.
본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 증식, 전사될 수 있는 핵산이 도입되거나 또는 코딩된 M2 항체가 발현되는 세포이다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 임의의 자손 또는 서브클론을 포함한다. 자손 세포 및 서브클론은 모 세포와 동일할 필요는 없는데, 그 이유는 복제 및 증식 동안 일어나는 돌연변이가 있을 수 있기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 세포는 본 발명의 숙주 세포인 것으로 고려된다.
숙주 세포는 미생물, 예를 들어 박테리아 및 효모; 및 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 재조합 박테리오파아지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터 (예, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템, 또는 안정한 발현을 위해 조작된 형질전환된 동물 세포가 제공된다.
또한, 발현 벡터는 선택적 압력에 대한 내성을 부여하는 선택가능한 마커 또는 동정가능한 마커 (예, β-갈락토시다제)를 함유함으로써 벡터를 보유하는 세포가 선별, 성장 및 확장되게끔 한다. 또는, 선택가능한 마커는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제1 벡터와 함께 숙주 세포를 공동형질감염시키는 제2 벡터상에 있을 수 있다.
선별 시스템은 각각 tk-, hgprt-또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자 (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자 (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항-대사산물 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt 유전자 (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 유전자 (Colberre-Garapin et al., J.Mol. Biol. 150:1 (1981)); 퓨로마이신; 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 히그로마이신 유전자 (Santerre et al., Gene 30:147 (1984))에 대한 선별을 기초로 하여 사용될 수 있다. 추가의 선택가능한 유전자로는 세포가 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 사용할 수 있도록 하는 hisD (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); 및 오르니틴 데카르복실라제 저해제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 데카르복실라제)(McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)를 들 수 있다.
대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법은 상기 대상체에게 인플루엔자 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 항체는 대상체의 감염 이전에, 즉 예방적으로 투여하거나, 실질적으로 감염과 동시에 투여하거나, 또는 감염 이후에, 즉 치료 처치로 투여할 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체에게 치료 이점을 제공하는 것, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 감소시키거나 경감시키는 것, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물의 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 바이러스 단백질의 양을 감소시키거나 억제하는 것을 포함한다. 감소 또는 경감시킬 수 있는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증으로는 예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증을 들 수 있다. 치료 이점은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 것 또는 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는 것을 포함할 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에게 인플루엔자 바이러스 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 대상체의 바이러스 감염을 억제하거나 또는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 대상체의 감수성을 감소시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 다양한 측면에서, 항체는 대상체의 감염 이전에 (예방), 실질적으로 감염과 동시에 또는 감염 이후에 (치료) 투여한다. 항체는, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염의 하나 이상의 증상 또는 합병증 (예를 들어 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염 또는 귀 통증)의 중증도 또는 지속기간, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물의 바이러스 역가 또는 바이러스 단백질의 양, 또는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 대상체의 감수성을 감소시키거나 또는 경감시키는 것을 포함하는 치료 이점을 제공할 수 있다.
또한, 치료 이점 및 이에 따라 대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제, 바이러스 증식 또는 인플루엔자 바이러스 단백질 양의 증가를 방지하거나 또는 억제하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 상기 대상체에서 인플루엔자 바이러스 역가, 바이러스 복제 또는 하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물의 인플루엔자 바이러스 단백질의 양의 증가를 방지하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다.
하나 이상의 인플루엔자 종 또는 단리물에 의한 감염으로부터 대상체를 보호하고, 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키며, 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는 방법이 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체에게 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 바이러스 감염으로부터 대상체를 보호하거나, 상기 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키거나, 또는 상기 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법은 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)), 및 C40, L30, L40, S212, S80, S900 (각각, ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))으로 표시되는 세포주 (예, 하이브리도마 또는 CHO 세포주)에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 임의의 항체를 사용해서 실시할 수 있다.
치료, 진단 및 정제/단리 방법을 비롯한 본 발명의 방법은 임의의 인플루엔자 종/단리물 또는 종/단리물의 조합물에 대해 적용할 수 있다. 인플루엔자 종의 구체적인 비-제한적 예로는 A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68, 또는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3으로부터 선택되는 다른 종들이 있다.
본 발명의 인간, 인간화 및 키메라 M2 항체는 단독으로 사용하거나, 또는 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염, 복제, 증식을 억제하거나 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 중증도 또는 지속기간을 감소시키는 항-인플루엔자 활성을 갖는 치료제와 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 조합의 예로는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는데있어서 상이한 결합 특이성, 결합 친화성 또는 효능을 갖는 2종 이상의 상이한 M2 항체를 함유하는 푸울링된 모노클로날 항체를 들 수 있다. 따라서, M2 항체를 포함하는 조합 조성물, 및 이러한 조성물을 본 발명의 방법에 따라 사용하는 방법이 제공된다.
인플루엔자 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 질환 도는 합병증을 치료하는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 의해 대상체의 증상을 개선하거나, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 중증도 또는 지속기간을 감소시키거나, 또는 증상을 나타내는 환자의 위험을 감소시키거나 또는 감염, 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 감수성을 줄일 수 있다. 따라서, 개선은 바이러스 증식, 복제 또는 역가, 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증의 감소 또는 경감의 하나 이상을 포함한다. 또한, 개선은 인플루엔자 바이러스에 감염되었거나 감염될 위험이 있는 대상체 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 증상 또는 합병증을 치료하는데 사용되는 항바이러스 약물 또는 다른 물질의 투여 빈도 또는 투여량을 줄이는 것을 포함한다.
이러한 개선에서 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 임의의 또는 모든 증상 또는 합병증을 완전히 제거할 필요는 없다. 오히려, 치료는 본원에 기재된 바와 같이 임의의 측정가능하거나 검출가능한 항-인플루엔자 바이러스 효과 또는 개선일 수 있다. 따라서, 임상적으로 만족스런 최종 목적은, 대상체의 증상 또는 그와 관련된 증상 또는 합병증의 부분적 감소 또는 개선 증가, 또는 단기간 또는 장기간 동안 증상의 악화 억제가 있는 경우에 달성된다.
치료에 적절한 대상체로는 인플루엔자 바이러스 감염에 걸려있거나 또는 그럴 위험이 있는 대상체들이 포함된다. 표적 대상체로는 또한, 인플루엔자 관련 증상 또는 합병증의 발병 위험이 있는 대상체들이 포함된다. 따라서, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스 감염 또는 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 합병증의 위험이 있는 대상체의 치료에 적용할 수 있다. 따라서, 예방 방법이 포함된다.
치료에 적절한 위험 대상체로는, 인플루엔자 바이러스를 보유하는 다른 대상체에 노출된 대상체, 또는 바이러스 감염성 또는 세포 향성, 면역학적 감수성 (예, 면역력이 약화된 대상체) 또는 환경 인자의 변화로 인해 인플루엔자 바이러스 감염이 증가된 대상체를 들 수 있다.
M2 항체는 단일 투여 또는 다중 투여, 예를 들어 약 1주 내지 10주 동안 주당 1회 투여하거나, 또는 예를 들어 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 중증도를 감소시키기 위해 적절하게 투여할 수 있다. 투여량은 치료가 예방 또는 치료 목적인지의 여부, 치료할 관련 질환 또는 합병증의 중증도, 원하는 임상 목적, 기존 치료 또는 동시 치료, 대상체의 전체적인 건강, 연령, 성별 또는 인종, 및 당업자에 의해 평가되는 다른 인자들에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면 치료 이점을 위한 충분량을 제공하는데 필요한 투여량 및 시점에 영향을 줄 수 있는 인자들을 판단할 수 있을 것이다. 투여량은 실험적으로 결정하거나 또는 동물 질병 모델을 이용하거나 인간 임상 실험에서 결정할 수 있다.
용어 "대상체"는 동물, 전형적으로는 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류 (원숭이, 긴팔원숭이(gibbon), 침팬지, 오랑우탄, 마카크(macaque)), 가축 동물 (개및 고양이), 농장 동물 (말, 소, 염소, 양, 돼지), 실험 동물 (마우스, 래트, 토끼, 기니 피그) 및 인간을 의미한다. 대상체로는 동물 질병 모델, 예를 들어 본원에 예시된 인플루엔자 감염의 마우스 동물 모델을 들 수 있다.
변형된 형태, 그의 변이체 및 서브서열을 비롯한 본 발명의 M2 항체 및 M2 항체를 코딩하는 핵산을 제약 조성물내에 혼입시킬 수 있다. 이러한 제약 조성물은 생체내 또는 생체외에서 대상체에게 투여하는데 유용하다.
항체는 대상체에게 투여하기에 앞서서 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제에 포함시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한" 및 "생리학적으로 허용가능한"은 약제 투여에 적합한 용매 (수성 또는 비-수성), 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅, 등장성 물질 및 흡수 촉진 또는 지연 물질을 포함한다. 이러한 제제는 정제 (코팅되거나 비코팅됨), 캡슐 (경질 또는 연질), 마이크로비드, 에멀젼, 분말, 과립, 결정, 현탁액 또는 엘릭서에 함유시킬 수 있다. 보조 활성 화합물 (예, 보존제, 항박테리아제, 항바이러스제 및 항진균제)을 조성물내에 포함시킬 수도 있다.
제약 조성물은 특정 투여 경로에 적합하게끔 제제화할 수 있다. 따라서, 제약 조성물은 다양한 경로에 의한 투여에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
경점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적절한 침투제를 제제 중에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우에는 디터전트(detergent), 담즙산염, 및 푸시드산 유도체를 들수 있다. 경피 투여의 경우, 활성 화합물을 일반적으로 당업계에 알려진 바와 같은 에어로졸, 스프레이, 연고, 고약(salve), 겔 또는 크림으로 제제화한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 제약 제제 및 전달 시스템은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); and Poznansky et al., Drug Delivery Svstems. R. L. Juliano, ed., Oxford, N. Y. (1980), pp. 253-315) 참조).
제약 제제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태로 패키지화할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 단위 투여 형태는 치료할 대상체에 대해 단위 투여량으로 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 의미하는데, 각 단위는 원하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 제약상 담체 또는 부형제와 함께 함유한다.
본 발명은 적합한 패키지 물질로 패키지화된, M2 항체, M2 항체를 코딩하는 핵산 및 그의 제약 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 전형적으로, 이러한 키트는 성분들에 대한 설명 및 키트내 성분들의 시험관내, 생체내 또는 생체외 사용을 위한 지침을 포함하는 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 키트는 이 성분들의 집합물, 예를 들어 둘 이상의 인간 M2 항체만을 함유하거나 또는 이 항체를 항바이러스제 또는 약물과 함께 함유한다.
용어 "패키지 물질"은 성분들을 보유하는 키트의 물리적 구조를 의미한다. 패키지 물질은 성분들을 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적에 통상적으로 사용되는 물질 (예, 종이, 골판지, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플 등)로 제조될 수 있다. 표지 또는 패키지 삽입물을 적절한 수기 지침을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법에서 키트 성분들의 사용에 관한 표지 또는 지침을 추가로 포함할 수 있다. 지침은 치료, 검출, 모니터링 또는 진단 방법을 비롯해서 본원에 기재된 본 발명의 방법들 중 어떤 것을 실시하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 키트는 본원에 기재된 하나 이상의 항-인플루엔자 활성을 갖는 인간 M2 항체를, 본 발명의 치료 방법에서 항체의 투여를 위한 지침과 함께 포함할 수 있다.
지침은 "인쇄된 물질", 예를 들어 키트내에 있거나 키트에 고정된 종이 또는 판지(cardboard)상에, 또는 키트 또는 패키지 물질에 고정되거나 또는 키트의 성분을 함유하는 바이알 또는 튜브에 부착된 표지상에 존재할 수 있다. 지침은 컴퓨터 판독가능한 매체, 예를 들어 디스크 (플로피 디스켓 또는 하드 디스크), 광학 CD, 예를 들어 CD- 또는 DVD-ROM/RAM, 자기 테이프, 전기 저장 매체, 예를 들어 RAM 및 ROM 및 이들의 하이브리드, 예를 들어 자기/광학 저장 매체에 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 키트는 인간 M2 항체를 함유하는 제약 제제 중 배양 배지 (예, M2 항체 생산 세포주의 경우), 완충제, 또는 보존제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 각 성분은 개별 용기내에 포함될 수 있으며, 다양한 용기들은 모두 단일 패키지내에 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 냉각 저장을 위해 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 인간 M2 항체 제조 하이브리도마 또는 다른 숙주 세포 (예, CHO 세포)를 함유하도록 설계될 수 있다. 키트내 세포는 세포를 사용할 준비가 될 때가지 적절한 저장 조건하에 유지할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 하이브리도마 또는 다른 세포를 포함하는 키트는 세포가 해동 및 성장될 수 있도록 적절한 세포 저장 배지 (예, 조직 배양 배지, 예를 들어 DMEM, α-MEM 등 중에서 10-20％ DMSO)를 함유할 수 있다.
본 발명의 인간 M2 항체는 M2 폴리펩티드를 단리, 검출 또는 정제하는데 유용하다. 이러한 방법은 (용액 중에서, 고상에서, 시험관내 또는 생체내에서, 또는 원형 세포 또는 생물체내에서) M2를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 M2 항체와 결합 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2의 존재를 검출하거나 또는 결합된 M2 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 시험 샘플에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 샘플을 인간 M2 항체와, 샘플 중 M2의 검출 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2가 시험 샘플내에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다. M2 또는 인플루엔자 바이러스의 검출은 통상의 방법, 예를 들어 면역침전법, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학적 염색 또는 유동세포계수법에 의해 수행할 수 있다.
M2 및 인플루엔자 바이러스 검출 방법은 M2 및 인플루엔자 바이러스를 검출하는 진단 프로토콜에서 유용하다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스의 수준이 증가하거나 감소하는 것이 인플루엔자 감염의 발생 또는 퇴화와 관련이 있는 경우, 본 발명의 항체를 사용해서 M2 또는 인플루엔자 바이러스에서 어떤 증가 또는 감소를 검출할 수 있다. 또한, M2 또는 인플루엔자 바이러스 수준을 감소시키는 치료 요법 이후에 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 수준을 모니터링하는 것이 필요한 경우, 본 발명의 항체를 사용해서 장시간 또는 단시간의 기간 동안 치료 이전, 치료 동안 또는 치료 이후에 M2 또는 인플루엔자 바이러스 수준의 상기 증가 또는 감소를 검출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 대상체의 시험 샘플 (생물학적 유체, 세포, 또는 조직 또는 기관 샘플, 예를 들어 생체조직 절편을 함유함)에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출하는 방법을 또한 제공한다. 한 실시양태에서, 이 방법은 대상체로부터 얻은 M2 또는 인플루엔자 바이러스를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 샘플을 인간 M2 또는 인플루엔자 바이러스 항체와, M2 또는 인플루엔자 바이러스의 검출 허용 조건하에 접촉시키는 단계 및 M2 또는 인플루엔자 바이러스가 상기 대상체로부터의 시험 샘플에 존재하는지를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 인간 M2 항체를 사용해서 진단에서 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 모니터링하거나 또는 대상체의 치료 이후에 대상체에서 M2의 생체내 수준을 측정할 수도 있다. 예를 들어, M2 또는 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 객담(sputum)을, 상기 기술한 바와 같이, 결합 발생을 허용하는 조건하에 인큐베이션하여 M2 또는 인플루엔자 바이러스의 존재를 검출한다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 본원에 기재되어 다.
본원에 인용된 모든 용도, 간행물, 특허문헌 및 다른 참고문헌, 젠뱅크 (GenBank) 인용물 및 ATCC 물질은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 명세서가 기준이 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나(an)," 및 "그(the)"는, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는다면 복수 형태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 M2 항체"가 지시하는 것은 이 항체의 복수를 포함하며, "하나의 항-인플루엔자 활성 또는 기능"이 지시하는 것은 하나 이상의 활성 또는 기능의 지시를 포함하는 등이다.
본 발명의 다수의 실시양태가 기재되어 있다. 그렇지만, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어남이 없이 다양한 변형을 수행할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 하기 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 설명하기 위한 것이며 이를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예는 다양한 재료 및 방법을 기술한다.
펩티드 합성 및 펩티드-KLH 접합체: M2 펩티드를 다중 펩티드 시스템(Multiple Peptide Systems)(San Diego, CA)에 의해 합성하였다. HPLC 이후의 펩티드 순도는 95 ％를 넘었다. 이어서, M2 펩티드를 상기 시스템 의해 KLH (M2-KLH) 및 BSA (M2-BSA)에 접합시켰다. 세포외 23-아미노산 M2 펩티드의 서열은 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1)이었다.
마우스: 인간 이뮤노글로불린을 함유하는 인간 염색체 단편을 보유하는 인간 트랜스-염색체 마우스 (Ishida and Lonberg, IBC's 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000); and Kataoka, S. IBC's 13th Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002))를 기린 브루어리 컴퍼니, 리미티드 (Kirin Brewery Co., Ltd. (Japan))로부터 입수하였으며, 라 졸라 인스티튜트 포 알러지 앤드 이뮤놀러지 (La Jolla Institute for Allergy and Immunology)에서 동물 수용설비에 넣어 두었다. C57BL/6J 마우스는 잭슨 래버러토리즈 (Jackson Laboratories; Bar Harbor, ME)에서 구입하였으며, 라 졸라 인스티튜트 포 알러지 앤드 이뮤놀러지 (La Jolla Institute for Allergy and Immunology)에서 동물 수용설비에 넣어 두었다.
면역화: PBS 중 M2-KLH 또는 M2-BSA (GIBCO BRL, Rockville, MD)를 동일 부피의 완전 프로인트 (Freund's) 보조제 (CFA)(Sigma, St. Louis, MO)와 혼합하고, 에멀젼을 제조하였다. 마우스를 CFA 중 20 ㎍의 M2-KLH 또는 M2-BSA로 피하로 면역화하고, 21일 후에 불완전 프로인트 보조제 (IFA)(Sigma, St. Louis, MO) 중 20 ㎍의 M2-KLH 또는 M2-BSA를 피하로 또는 RIBI (Corixa, Hamilton MT)를 복강내로 주사하여 추가로 자극하고, 21일 후 한번 더 반복하였다. 융합 3일 전에 보조제없이 M2 펩티드 10 ㎍을 최종 복강내 및 정맥내 주사하였다.
ELISA: 항체 역가 및 항체 특이성, 및 하이브리도마에 의한 항체 제조를 ELISA에 의해 결정하였다. 요컨대, M2-BSA 또는 M2 펩티드 50 ㎕를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Nunc, Denmark) 상에 4 ℃에서 밤새 또는 37 ℃에서 1시간 동안 탄산염 완충액 (pH 9.6)을 사용해서 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. PBS/0.1％ 트윈 (Tween) 20으로 2회 세척한 후, 플레이트를 37 ℃에서 30분 동안 PBS/1％ BSA (Sigma, St. Louis, MO)로 차단하고, 항체 또는 혈청을 웰에 가하고, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 후, 희석된 HRP 접합된 염소 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 특이적 항체 (Jackson Immunoresearch Laboratory, West Grove, PA)를 웰에 가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, TMB 기질 용액 (DAKO, CA)을 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
이소타입 ELISA: 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 이소타입을 ELISA에 의해 결정하였다. 요컨대, M2-BSA 또는 M2 펩티드 50 ㎕를 96-웰 평면 바닥 플레이트 (Nunc, Denmark) 상에 4 ℃에서 밤새 또는 37 ℃에서 1시간 동안 탄산염 완충액 (pH 9.6)을 사용해서 1 ㎍/ml의 농도로 코팅하였다. PBS/0.1％ 트윈 (Tween) 20으로 2회 세척한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS/1％ BSA (Sigma, St. Louis, MO)로 차단하고, 항체를 웰에 가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척한 후, 희석된 HRP-접합된 마우스 항-인간 IgGI, IgG2,IgG3 및 IgG4 중쇄 검출 항체 (Zymed, San Francisco, CA)의 각각을 웰에 가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척한 다음, TMB 기질 용액 (DAKO, CA)을 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기에 의해 측정하였다.
인플루엔자 A 바이러스-감염된 세포 기초의 ELISA: MDCK 세포 (마딘-다르비 (Madin-Darby) 개과동물 신장 상피 세포; ATCC, Rockville, MD)를 96-웰 평면 바닥 플레이트에 mL 당 1.5×105개의 세포 및 웰 당 150 ㎕로 플레이팅하고, 7 ％ CO2에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 플레이트를 PBS로 2회 세척하고, 주기적으로 소용돌이를 일으키면서(swirling) 실온에서 30분 동안 100배의 TCID50인플루엔자 A 바이러스(A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68; ATCC, Rockville, MD) 30 ㎕로 감염시켰다. 감염 후, 플레이트를 PBS로 1회 세척하고, 최소 필수 배지 (Invitrogen Corp, CA) 중 1 ㎍/mL 트립신 (TPCK-처리, Worthington, Biochem. Corp.) 150 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 27시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 후, 세포 단층을 PBS/1％ FCS (GIBCO BRL, Rockville, MD)로 3회 세척하고, 실온에서 30분 동안 PBS/1％ BSA/ 5％ FCS로 차단하였다. 항체를 희석하여 50 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, HRP 접합된 토끼 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 항체 (DAKO, Denmark)를 1:3000으로 희석하고, 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척한 다음, 1 mM 레바미솔(Levamisole) 용액 (Vector Laboratories Inc. Burlingame,CA)을 함유하는 TMB 기질 (DAKO, Denmark) 100 ㎕를 가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 상등액 50 ㎕를, 100 ㎕ 중단(stop) 용액 (1 N H2SO4)을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)로 옮기고, 450 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 각 항체의 EC50을 선행 문헌 (Sette et al. Nature 328:395 (1987))에 기술된 바와 같이 계산하였다. 10 ㎍/ml의 번호 2074 항체의 OD 데이타를 내부 대조군으로서 100％로 설정하였다.
인플루엔자 A 바이러스 감염된 세포 기초의 ELISA에서의 펩티드 경쟁: 바이러스-감염된 MDCK 세포를 상기와 같이 제조하였다. M2 펩티드 및 항 M2 항체를 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 펩티드 및 항체의 혼합물 50 ㎕를 차단된 세포에 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 4회 세척한 다음, HRP 접합된 토끼 항-인간 이뮤노글로불린 감마 쇄 항체 (DAKO, Denmark)를 1:3000으로 희석하고, 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 5회 세척한 다음, 1 mM 레바미솔 용액 (Vector Laboratories Inc. Burlingame, CA)을 함유하는 TMB 기질 (DAKO, Denmark) 100 ㎕를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 상등액 50 ㎕를, 100 ㎕의 중단 용액 (1 N H2SO4)을 함유하는 새로운 96-웰 플레이트 (Nunc, Denmark)로 옮기고, 450 nm에서의 광학 밀도를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다.
하이브리도마 제조: 모노클로날 항체의 제조를 위해 가장 높은 항체 역가를갖는 마우스를 선별하였다. 비장을 수획하고, 50％ PEG (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)를 사용해서 단일 세포 현탁액을 골수종 세포주 (SP2/O-Ag14) (ATCC, Rockville, MD)에 3:1의 비율로 융합시켰다. 융합물을 96-웰 플레이트상에 최적 밀도로 플레이팅하고, 37 ℃의 인큐베이터에서 5％ CO2하의 완전 RPMI-10 배지 (10％ FCS, 1％ 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 50 μM 2-ME, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 술페이트를 함유하는 RPMI 1640)에서 배양하였다. 각 융합물에 대한 대략 2000 하이브리도마가 성장하는 웰을 ELISA에 의해 스크리닝하였다. M2 펩티드와의 결합에 대해 양성인 세포를 24 웰 플레이트로 옮기고, 제한 희석 4 라운드를 수행하여 모노클로날 항체를 얻었다. 항-M2 모노클로날 항체는 또한 인플루엔자 A 바이러스 감염된 세포 기초의 ELISA에 의해 확인하였다.
항체 정제: 항체 정제에 있어서, 하이브리도마를 하이브리도마-SFM (GIBCO BRL, Rockville, MD) 함유 인테그라(Integra) 시스템 (INTEGRA Bioscience, Inc. Ijamsville, MD)에서 배양하였다. 단백질 A-세파로스 패스트 플로우 겔 (Sepharose Fast Flow gel)(Amersham Pharmacia Cat# 17-0618-02, Uppsala, Sweden)을 사용해서 인간 모노클로날 항체를 배양 배지로부터 정제하였다. 요컨대, 컬럼 용량에 대한 적정량의 항체를 함유하는 조정 배지를 0.22 ㎛ 디스크 필터 (Minisarto-plus, Sartorius Cat# 17822, Gettingen, Germany)로 여과하고, 인산염 완충 염수 (PBS)로 평형화된 2.0 ml 단백질 A-세파로스 패스트 플로우 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 40 ml 초과의 PBS로 세척하고, 항체를 0.1 M Gly-HCl (pH 3.6), 0.15 M NaCl로 용출시켰다. 용출 완충액의 처음 1.0 ml를 통과시킨 다음, 3개의 각 용출 분액을 튜브 당 5.0 ml의 부피로 모으고, 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 250 ㎕로 즉시 중화시켰다. 모든 조정 배지가 처리될 때까지 이러한 정제 과정을 반복하였다. 인간 IgG-특이적 ELISA로 항체 농도를 결정하고, 항체를 함유하는 모든 분액을 푸울링하고, 원심분리 농축기 (Vivaspin 20, 30,000MWCO: Sartorius Cat# VS2022, Gettingen, Germany)로 농축시켰다.
발열물질(pyrogen)을 제거하기 위해, 농축된 샘플을 20 mM 인산나트륨 (pH 6.6)으로 완충액-교환하고, 동일한 완충액으로 평형화된 0.5 ml SP-세파로스 HP 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat# 17-1087-01, Uppsala, Sweden)상에 로딩하였다. SP-세파로스 HP 컬럼에 일렬로 연결된 2 ml Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat# 17-0510-01, Uppsala, Sweden)을 통해 샘플을 제1 통과시킴으로써 발열물질을 제거하였다. 적용 후, Q-세파로스 패스트 플로우 컬럼을 제거하고, 항체를 0 내지 0.5 M 범위의 염화나트륨 선형 농도구배로 용출시켰다. 항체를 280 nm에서 검출하고, 항체 함유 분액을 푸울링하였다. 샘플을 원심분리 농축기로 농축하고, NAP25 탈염(desalting) 컬럼 (Amersham Pharmacia, Cat# 17-0852-02, Uppsala, Sweden)을 사용해서 PBS로 완충액-교환하였다. 항체 농도를 인간 IgG 특이적 ELISA에 의해 정량하였다. 샘플의 발열물질 수준은 리물루스 아메보사이트(Limulus Amebocyte) 용해물 (LAL) 분석 (Associates of Cape Cod, Inc., Falmouth, MA)에 따르면 단백질 0.13 EU/mg 미만인 것으로 결정되었다.
인간 항-M2 항체(C40) 유전자의 단리:
C40 항체 (이소타입: IgG4)를 생산하는 배양된 하이브리도마 세포 (113C-40-H-22)를 원심분리에 의해 수획하였다. ISOGEN (NIPPONGENE, Co., Ltd.)을 사용해서 총 RNA 240 ㎍을 이들 세포로부터 정제하고, 이어서 올리고텍스(Oligotex)TM-dT30 <Super> (Takara Shuzo, CO., Ltd., Japan)를 사용해서 폴리A+RNA 3 ㎍을 총 RNA 120 ㎍으로부터 정제하였다. 공급원으로서 하이브리도마 세포의 폴리A+RNA로부터의 이뮤노글로불린 유전자의 가변 영역에 대한 cDNA의 클로닝을 위해 SMART RACE cDNA 증폭 키트 (Clontech, Co., Ltd., CA)를 사용했다. 요컨대, 제1 스트랜드 cDNA를 역전사효소에 의해 폴리A+ RNA의 2 ㎍으로부터 제조하였다. 이러한 cDNA를 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에서 템플레이트로 사용해서 리더 서열 (각각, HV 및 LV)을 포함한 중쇄 및 경쇄 모두의 가변 영역을 증폭시켰다. 반응물은 다음과 같았다: 2.5 U TaKaRa LA TaqTM DNA 폴리머라제 (Takara Shuzo, Co.,); 한쪽 사이드에 대한 0.2 μM 프라이머(Primer)(중쇄의 경우 IgG1p, 경쇄의 경우 hk-2, 표 1 참조); 다른쪽 사이드에 대한 0.2 μM 프라이머 (SMART RACE 키드에 부착된 UMP 프라이머); 400 μM의 각 dNTP 혼합물; LA PCR 완충액 II (Mg2+ 플러스) (최종 농도는 1x임); 및 cDNA 템플레이트.
열순환 프로그램은 94 ℃에서 5분에 이어서, 94 ℃에서 10초 및 68 ℃에서 1분과 72 ℃에서 7분 연장의 30 사이클이었다. 에탄올 침전 및 이후의 아가로스 겔 전기영동 후에 증폭된 DNA 단편을 수집하여 QIAquick 겔 추출 키트 (Qiagen Co.,Ltd., Germany)로 정제하였다. PCR-증폭 생성물 둘 다 (HV 및 LV)의 뉴클레오티드 서열을 특정 프라이머 (HV: hh-4, LV: hk-5 및 ik-6, 프라이머의 서열에 대하여는 표 1 참조)로 확인하였다. HV 및 LV의 정제된 DNA 단편을 pGEM(등록상표)-T 이지(Easy) 벡터 시스템 (Promega Co.)으로 통합하고, 각각의 구조물 플라스미드를 이. 콜라이 (E. coli)에 전기천공하여 도입한 다음, 클로닝하였다. 구조물 플라스미드내 각 삽입물 (HV 및 LV)의 뉴클레오티드 서열을, 특정 프라이머 (SP6 및 T7, 표 1 참조)를 사용해서 분석하였다. 구조물 플라스미드로부터의 HV 및 LV 둘 다의 뉴클레오티드 서열은 PCR 생성물 유래의 것들과 완전히 일치하였다. 이들 아미노산 서열의 HV 및 LV의 뉴클레오티드 서열을 하기에 나타내었다.
C40 중쇄 가변 영역(HV)의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (가변 영역의 개시 코돈 (ATG)으로부터 말단부로) -
C40 경쇄 가변 영역 (LV)의 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (가변 영역의 개시 코돈 (ATG)으로부터 말단부로) -
C40 중쇄 가변 영역 (HV)의 cDNA의 아미노산 서열 (리더 서열(밑줄침) 및 가변 영역) -
C40 경쇄 가변 영역 (LV)의 cDNA의 아미노산 서열 (리더 서열(밑줄침) 및 가변 영역) -
이소타입 변화된 인간 항-M2 항체 (C40-IgG1 유형)의 발현 벡터의 생성:
IgG1 유형 이소타입-스위치된(switched) C40 항체 (원래의 이소타입은 IgG4이었음)의 제조를 위해, 새로운 DNA 벡터를 구성하였다. 요컨대, LV의 PCR용 프라이머 세트가 LV의 양쪽 사이드에서 제한 효소에 대한 민감성 영역을 갖도록 설계하였다. 사용된 프라이머 세트는 M240L5BGL 및 M240L3BSI (표 1)이며, LV의 구성체 플라스미드를 템플레이트로서 사용하였다. LV의 정제된 PCR-증폭된 생성물을 pGEM(등록상표)-T 이지 벡터 시스템 (Promega, Co., Ltd.)에 서브클로닝하였다. 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 2종의 제한 효소, 즉 BglII 및 BsiWI로 절단하고, 0.4 킬로베이스 DNA 삽입물 (단편 A, 도 1 참조)을 단리하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다.
플라스미드 벡터 (IDEC Pharmaceuticals, CA, N5KG1-Val Lark (미국특허 제6,001,358호의 N5KG1의 변형된 벡터))를 IgG1 제조용 발현 벡터로서 사용하였는데, 이는 IgG1 경쇄 및 중쇄의 불변 영역을 함유하였다. 벡터 DNA를 2종의 효소, 즉 BglII 및 BsiWI에 의해 절단한 다음, DNA 말단의 탈인산화를 위해 알칼리 포스파타제 (Takara Shuzo, Co., Ltd., Japan)로 처리하였다. 8.9 킬로베이스의 DNA 단편 (단편 B)을 아가로스 겔 전기영동 및 DNA 정제 키트에 의해 단리하였다.
2개의 DNA 단편인 A 및 B를 T4 DNA 리가제 (Takara Shuzo, Co., Ltd., Japan)로 라이게이션하고, 라이게이션된 구조물 (N5KG1_C40Lv)을 전기천공으로 이. 콜라이 DH5α 균주에 넣어 형질전환체를 생성시켰다. 양성 이. 콜라이 형질전환체를 선별하였다.
제2 단계로서, HV를 다음과 같이 N5KG1_C40Lv DNA 벡터에 삽입하였다: DNA 벡터를 2종의 DNA 제한 효소인 NheI 및 SalI로 절단한 다음, 탈인산화하였다. 9.2 킬로베이스 크기의 DNA 단편 (단편 C)를 단리하였다. 경쇄 구조물과 유사하게, HV의 PCR용 프라이머 세트가 HV의 양쪽 사이드에서 제한 효소에 대한 민감한 영역을갖도록 설계하였다. 사용된 프라이머 세트는 M240H5SAL 및 M240H3NHE (표 1)이며, HV의 구조체 플라스미드를 템플레이트로서 사용하였다. HV의 정제된 PCR-증폭 생성물을 pGEM(등록상표)-T 이지 벡터 시스템에 서브클로닝하였다. 서브클로닝된 구조물내 삽입물의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 플라스미드 DNA를 2종의 제한 효소인 NheI 및 SalI로 절단하고, 0.44 킬로베이스 크기의 DNA 삽입물 (단편 D, 도 1 참조)을 단리하고, 아가로스 겔 전기영동 후에 정제하였다.
T4 DNA 리가제를 사용해서 2개의 DNA 단편인 C 및 D를 라이게이션하고, 라이게이션된 구조물 (N5KG1_M2C40)을 전기천공으로 이. 콜라이 DH5α 균주에 넣어 형질전환체를 생성시켰다. 양성인 이. 콜라이 형질전환체를 선별하였다. 발현 벡터를 정제하고, LV 및 HV 영역 둘 다의 뉴클레오티드 서열을 확인하였다. 이 과정 동안 돌연변이는 도입되지 않았다.
이소타입-변화된 인간 항-M2 항체(IgG4-유형 C40)의 발현 벡터의 생성:
IgG4 타입 C40의 DNA 구조물의 생성을 위해, N5KG1-Val Lark 벡터 대신에 N5KG4PE DNA 벡터를 사용하였다. 이 DNA 벡터는 IgG4의 경쇄 및 중쇄 둘 다의 불변 영역을 함유한다. C40의 IgG4 벡터의 생성 과정은 IgG-유형 C40의 것과 동일하였다.
CHO 세포로부터 재조합 인간 항-M2 항체의 제조:
재조합 항체의 제조를 위해, 생성된 DNA 벡터로 숙주 세포를 형질감염시키고, 재조합 항체를 형질감염된 세포의 상등액으로부터 단리하였다. 요컨대, 전기천공에 의해 DNA 벡터로 차이니스 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO 세포, ATCC # CRL-9096)의 숙주 세포 dhfr-결핍 균주를 형질감염시켰다. 20 ㎍의 정제된 DNA 발현 벡터인 N5KG1_M2C40을 DNA 제한 효소인 AscI에 의해 선형화하고, 바이오 래드(Bio Rad) 전기천공기 (350V, 500 μF)를 사용해서 4×106개의 CHO 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 96-웰 배양 플레이트에 시딩(seeding)하고, DNA 벡터를 함유하는 CHO 세포의 선별을 위해 제네티신(Geneticin)(Gibco-BRL)을 함유하는 배양 배지에서 세포를 배양하였다. 여러 안정한 형질감염체 균주의 선별 후, 고수율의 인간 IgG 생산자를 ELISA에 의해 스크리닝하고, 재조합 항체의 제조를 위해 사용하였다.
재조합 항체 단백질의 단리 및 정제:
재조합 항체를 발현하는 CHO 세포를 EX-CELL 배지 325-PE (JRH Bioscience, Co., Ltd.)를 사용해서 배양하였다. 소비된 배양 상등액 10 리터를 사용해서 항체 단백질을 다음과 같이 정제하였다: 상등액을 MabSelect 단백질 A 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.)에 가하였다. 항체의 단백질 A로의 흡착을 위해, 인산염 완충 염수 (PBS)를 사용하고, 용출을 위해 20 mM 시트르산나트륨 완충액 및 50 mM 염화나트륨 (pH 2.7)을 사용했다. 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.0)을 가하여 용출 분액의 pH를 5.5로 조정하였다. SP 세파로스 컬럼 (Amersham PharmaciaBiotech, Co., Ltd.)을 사용해서 항체의 추가 정제를 수행하고, PBS를 용출 완충액으로 사용하였다. 정제된 항체를 슈퍼 컵(Super Cup) 100 캡슐 막 필터 (0.22 ㎛ 직경의 공극 크기)를 사용해서 여과함으로써 멸균하였다. 정제된 항체의 농도는 280 nm에서 분광광도법에 의해 측정하였으며, 여기서 1 mg/ml의 단백질은 280 nm에서 1.4 OD를 나타냈다. 재조합 C40-IgG1 항체 17 mg을 10 리터의 CHO 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다.
실시예 2
이 실시예는 인간 및 키메라 M2 모노클로날 항체의 제조 및 특성화를 기술한다.
KM 마우스 또는 HAC 마우스를, 운반체로서 KLH 또는 BSA에 접합된 M2 세포외 도메인 유래의 서열을 기초로 하는 합성 M2 펩티드로 면역화하였다. 마우스의 대부분은 코팅 항원으로서 M2 펩티드를 사용하는 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 높은 역가를 갖는 M2 항원에 반응하였다. 여러 항-M2 인간 모노클로날 항체를, 6가지 높은 반응자(responder)로부터의 비장세포와, 골수종 세포의 융합에 의해 생성시켰다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 얻어진 20개의 모노클로날 항체 (번호 2074, C40, L17, L30, L40, L66, N547, S212, S80, S900, F1 및 F2로 표시됨)는 M2 펩티드 및(또는) M2-BSA 접합체와 반응하였지만, BSA, KLH (면역화를 위한 운반체), mGAD (마우스 글루탐산 데카르복실라제 (GAD) 유래의 합성의 비관련 펩티드, 아미노산 246 내지 266)와는 반응하지 않았다. C40G1(IgG1) 및 C40G4(IgG4)의 코딩 서열을 원래의 C40 유전자로부터 클로닝하였으며, CHO 세포 (실시예 1)에서 발현시켰다.
인간/마우스 키메라 모노클로날 항체 번호 2074 및 완전 인간 항체 C40G1, S212, S80, S900, N547, L66, F1 및 F2는 IgG1 이소타입이다. C40은 IgG4 이소타입이고, L40은 IgG3 이소타입이며, 항체 L17 및 L30은 IgG2 이소타입이다 (표 2).
모든 항체는 인플루엔자 A/PR/8/34 또는 A/HK/8/68 균주로 감염된 MDCK 세포상에 발현된 M2를 인식하였으며, 이는 세포외 도메인의 서열이 약간 다르다 하더라도 상기 항체가 2가지 상이한 균주에 의해 발현되는 M2의 천연 형태를 인식한다는 것을 나타낸다 (도 2). 또한, 감염된 세포와 결합하는 항체는 M2 펩티드가 존재하는 경우에 특이적으로 억제되었다 (대표적 데이타는 표 3에 나타냄).
상기 2가지 바이러스 균주 사이에서 M2 서열의 세포외 부위는 하나의 아미노산에서 차이가 있는데, 이는 A/PR/8/34 균주에서 M2의 세포외 부위의 위치 20에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 것이다. A/HK/8/68로부터 유도된 서열, 이른바 보편적인(universal) M2 세포외 부위는 대부분의 인플루엔자 종 사이에서 공유된다 (Neirynck et al., Nature Med. 5:1157 (1999)). 그러나, 이러한 하나의 돌연변이는 다른 마우스 항-M2 모노클로날 항체, 14C2에 의한 결합을 근절시켰다 (Gerhard et. al. Immunological Rev. 159:95 (1997)).
항체 번호 2074, N547, L66, L17, C40G1의 반응성은 비교할만하였는데, 항체 C40G4, S212 및 S80의 반응성보다 대략 3배 내지 5배 더 높았으며, A/PR/8/34 바이러스 균주에 대해서는 F1 및 F2보다 100배 넘게 더 높았다 (도 2 및 표 4).
A/HK/8/68 감염된 세포상의 M2에 대한 반응성에 대해, S212, S80, S900, F1 및 F2는 다른 항체보다 대략 100배 미만이었다 (표 4). 예상한 바와 같이, 이소타입 매치된 비관련 인간 항-HSA 항체 (항-인간 혈청 알부민)는 어떠한 반응성도 나타내지 않았다.
항-M2 항체의 돌연변이체 M2 펩티드와의 결합 활성은, 인플루엔자 A 바이러스에서 보고된 8가지 상이한 M2 펩티드 (서열 1 내지 8, 표 5)를 사용하는 ELISA 분석으로 분석하였다. 항-M2 항체 번호 2074, C40, C40G1, L66 및 N547은 M2 펩티드뿐만 아니라 원래의 M2 펩티드에 대한 결합 활성을 나타냈다 (표 6). 특히, C40G1 및 N547은 본 연구에서 사용된 8가지 M2 펩티드에 모두 결합하였다.
A/HK/8/68 및 A/PR/8/34 바이러스 균주는 M2 단백질에서 각각 서열 1 및 9에 기재된 펩티드 서열을 갖는다. 상기 언급된 항-M2 항체는 이러한 2가지 바이러스 균주의 어느 하나에 의해 감염된 MDCK 세포에서 세포 표면 M2 단백질과 결합하기 때문에, 이들 항체는 또한 서열 9에 기재된 M2 펩티드 (즉, M2G, 표 5)와 결합할 수도 있다.
이러한 결과는 본 발명의 항-M2 항체가 돌연변이체 인플루엔자 A 바이러스 균주에서 관찰된 다양한 M2 돌연변이체 펩티드와 결합하는 넓은 특이성을 가짐을 나타낸다.
실시예 3
이 실시예는 동물이 인플루엔자 바이러스에 감염되기 이전 및 이후에 본 발명의 M2 모노클로날 항체를 투여하는 것이 치명적인 바이러스 감염에 대한 보호를 제공함을 나타내는 동물 모델 연구를 기술한다.
마우스 인플루엔자 A 바이러스 모델에서 (바이러스 감염 이전의) 예방 처치를 위한 항-M2 mAb의 생체내 효능:
동물 모델에서 항-M2 인간/마우스 키메라 모노클로날 항체의 효능을 평가하기 위해, 항체 번호 2074를 마우스 당 200 ㎍의 투여량으로 암컷 C57BL/6J 마우스 (생후 8주 내지 10주령)에게 복강내 투여하였다. 처치 시작으로부터 1일 후, 마취된 마우스 (아버틴 (Avertin) (1:1 (w/v)의 2,2,2-트리브로모에탄올:tert-아밀-OH, Sigma, St. Louis, MO) 15 ㎕/g)에게 치사량의 인플루엔자 A/PR/8/34 (ATCC) 30 ㎕ (300 pfU/30 ㎕)를 비측 투여하여 감염시켰다. 감염 2일 후, 마우스에게 번호 2074 항체 (200 ㎍/마우스)를 복강내 투여하였다. 마우스를 27일 동안 매일 관찰하여 생존율을 분석하였다. 이후, 생존 마우스를 희생시키고, 폐를 적출하여 바이러스 검출 및 조직 분석을 수행하였다. 생존율 분석을 도 5에 나타내었다. 대조군으로서, KM 마우스로부터 생성된 이소타입 매치된 인간 모노클로날 항-HSA IgG1 항체를 사용했다 (Kirin, Japan). 결과는 표 5에 나타내었다.
대조군에서, 마우스 12 마리 중 11 마리가 감염 후 18일 이내에 사망하였다. 이와는 달리, 항-M2 항체 번호 2074 처리된 마우스는 유의하게 보호되었다. 12 마리의 마우스 중 10 마리는 관찰 기간 27일 동안 내내 생존하였다. 생존 마우스 (항-M2 처리군으로부터 10 마리 및 대조군으로부터 1마리)는 감염 후 제27일에 희생시켰으며, 폐를 적출하여 바이러스 역가 및 조직 분석을 수행하였다. 바이러스 플라크 분석 결과, 각 군 유래의 마우스의 폐로부터 검출가능한 바이러스는 발견되지 않았으며, 양성 대조군의 경우에는 A/HK/8/68 바이러스의 역가는 5.95×103pfU/ml이었다 (표 7). 이 데이타는 항-M2 항체의 투여가 마우스 폐에서 바이러스 역가를 방지 및 증가시켜, 결국에는 마우스 체내에서 바이러스 제거를 촉진시킨다는 사실을 암시한다.
마우스 인플루엔자 A 바이러스 모델에서 (바이러스 감염 후) 치료 처치를 위한 항-M2 mAb의 생체내 효능.
마취된 암컷 C57BL/6J 마우스 (생후 8주 내지 10주령)에게 치사량의 인플루엔자 A/PR/8/34 (ATCC) 30 ㎕를 비내 투여하여 감염시켰다. 마취는 상기 기술된 바와 같이 아버틴(Avertin)을 사용해서 수행하였다. 마우스를 24일 동안 매일 관찰하여 생존율을 분석하였다.
인플루엔자 바이러스의 치료 처치에 있어서 항-M2 모노클로날 항체의 효능을평가하기 위해, 바이러스 감염 이후에 항체를 투여하였다. 치사량의 인플루엔자A/PR/8/34를 C57BL/6J 마우스에게 투여한지 2일 및 4일 후에, 항-M2 항체 번호 2074를 매번 마우스 당 200 ㎍의 양으로 복강내 주사에 의해 투여하였다 (마우스는 총 12 마리임). 대조군 (마우스는 총 12 마리임)에는 이소타입 매치된 비관련 인간 모노클로날 항체 (기린 비루 가부시끼가이샤 (Kirin Brewery Co., Ltd., Japan)의 항-HSA(IgG1))를 투여하였다.
대조군에서, 12 마리의 마우스 중 11 마리가 감염 후 18일 이내에 사망하였다 (도 6). 항체 번호 2074 군에서, 12 마리의 마우스 중 9 마리가 바이러스 감염 후 제24일의 시점에서 생존하였다. 따라서, 항-M2 인간/마우스 키메라 모노클로날 항체 번호 2074는 A/PR/8/34 바이러스에 감염된 마우스의 생존율을 유의하게 증가시켰다.
데이타는 항-M2 항체가 바이러스 감염 이후에 투여되더라도 효과적임을 나타낸다. 이는 상기 항체가 예방용으로 뿐만 아니라 치료용으로도 사용될 수 있음을 암시한다.
다른 2가지 세트의 평가 연구를 수행하였다. 치사량의 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스 투여를 C57BL/6J 마우스에게 제공하고, 1일, 2일 및 3일 후, 항-M2 항체 C40G1, C40G4, L30, F1, F2 및 번호 2074 (양성 대조군으로서)를 매번 마우스 당 200 ㎍의 양으로 복강내 주사에 의해 투여하였다 (각 군에서, 마우스 개체수인 n은 8 또는 12임). 대조군 (마우스 총 개체수는 8 마리 또는 12 마리임)에는 항-HSA 특이적 인간 IgG1 항체를 주사하였다. L30, C40G4, F1 및 F2 항체는 대조군에 비해 바이러스 감염된 마우스의 생존을 연장시키지 못하였다 (도 3A, B). 이와는 달리, C40G1 항체는 바이러스 공격으로부터 분명한 보호를 나타냈으며, 이러한 군의 모든 마우스는 감염된지 30일 후에도 여전히 생존하였다 (도 3A).
N/PR/8/34 감염된 세포상에 발현된 M2 (도 4B, 표 4) 또는 M2-BSA 접합체 (도 4A)에 대한 C40G1, L30 및 C40G4 항체의 결합 친화성은 서로 유의하게 다르지 않았다. C40G1 및 C40G4는 동일한 항원 결합 부위를 가지는데, 이는 이들 모두가 C40 항체로부터 유래하기 때문이다. L30 (IgG2) 및 C40G4 (IgG4)는 바이러스 공격에 대한 보호를 나타내지 않았지만 C40G1은 유의한 보호를 나타냈기 때문에, IgG1 유형 항체가 생체내 용도로서 잠재적으로 더 우수한 후보이다. 이와는 달리, F1 및 F2 항체는 바이러스 감염된 세포상의 M2와 적게 결합하지만, 이들 항체는 M2-BSA 접합체에는 잘 결합한다 (도 4A, B, 표 4). 바이러스 감염된 세포상의 M2에 대한 F1 및 F2 항체의 적은 결합으로 생체내 보호 효과의 결여를 설명할 수 있다.
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 2
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Lys Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 3
Ser Leu Pro Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
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1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Gly Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 5
Ser Phe Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 6
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1 5 10 15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 7
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1 5 10 15
Arg Cys Ser Asp Ser Ser Asp
20
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<212> PRT
<213> Influenza virus
<400> 8
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1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210> 9
<211> 432
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtcccag 60
ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc 120
tgcactgtct ctggtggttc catcagcagt agtttttact actgtggctg gatccgccag 180
cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatt atcgtgggag cacctactac 240
aacccgtccc tcaagagtcg agtcaccata tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc 300
ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggctgtgt attactgtgc gagacgggtt 360
actatggttc ggggagttaa gggggactac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 420
accgtctcct ca 432
<210> 10
<211> 384
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt 60
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 120
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 180
gagaaagtcc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 240
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 300
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataattatt acccgctcac tttcggcgga 360
gggaccaagg tggagatcaa acga 384
<210> 11
<211> 144
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
35 40 45
Ser Ser Ser Phe Tyr Tyr Cys Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Val Thr Met Val Arg Gly Val Lys Gly
115 120 125
Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 12
<211> 128
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro
1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly
35 40 45
Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Val Pro
50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn
100 105 110
Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 13
tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 14
gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 15
ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 16
aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 17
ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt 27
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 18
gatttaggtg acactatag 19
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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taatacgact cactataggg 20
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 20
agagagagag atctctcacc atgagggtcc tcgctcagct cctg 44
<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 21
ctctctctcg tacgtttgat ctccaccttg gtcc 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
<400> 22
agagagaggt cgacaccatg aagcacctgt ggttcttcct 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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ctctctctgc tagctgagga gacggtgacc agg 33
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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ggtacgtgaa ccgtcagatc gcctgga 27
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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tctatataag cagagctggg tacgtcc 27
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 30
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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gacaccctca tgatctcccg gacc 24
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<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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cgacatcgcc gtggagtggg agag 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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tgttctccgg ctgcccattg ctct 24
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Primer
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tggctgcacc atctgtcttc atcttc 26
Claims (82)
- 인플루엔자 단백질 M2와 특이적으로 결합하는, 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, M2 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 M2 세포외 도메인의 서브서열(subsequence)과 결합하는 항체.
- 제2항에 있어서, 세포외 도메인이 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1)을 포함하는 것인 항체.
- 제3항에 있어서, 서브서열이 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1)에서 4개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 것인 항체.
- 제2항에 있어서, 세포외 도메인이 아미노산 서열 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (서열 1)의 아미노산 치환, 삽입, 결실 또는 부가를 포함하는 것인 항체.
- 제5항에 있어서, 세포외 도메인이 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 또는 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(각각, 서열 2 내지 8)로부터 선택되는, 아미노산 치환을 갖는 서열을 포함하는 것인 항체.
- 제5항에 있어서, 서브서열이 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 또는 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD (각각, 서열 2 내지 8) 중 어느 하나에서 4개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD 이소타입으로부터 선택되는 항체.
- 제8항에 있어서, 이소타입이 IgG1, IgG2, IgG3및 IgG4로부터 선택되는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제12항에 있어서, 친화성이 관련 항체의 약 5배 내지 100배 이내 또는 관련 항체의 약 5배 내지 5,000배 이내인 항체.
- 제1항에 있어서, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 바이러스 감염, 바이러스 증식 또는 바이러스 복제를 억제하는 항체.
- 제1항에 있어서, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 인플루엔자 결합을 억제하는 항체.
- 제1항에 있어서, 대상체에서 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 바이러스 역가를 감소시키거나, 바이러스 복제 또는 증식을 감소시키거나, 또는 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 감소시키는 항체.
- 제1항에 있어서, 대상체가 바이러스에 노출되거나 바이러스에 감염된 후에 상기 대상체에서 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 바이러스 역가를 감소시키거나, 바이러스 복제 또는 증식을 감소시키거나, 또는 바이러스 감염과 관련된 하나이상의 증상 또는 합병증을 감소시키는 항체.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 증상 또는 합병증이 오한(chill), 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 항체.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체와 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 결합 특이성 또는 결합 친화성을 가지며, 대상체의 바이러스 감염을 억제하는 항체.
- 제1항에 있어서, 바이러스 감염에 대한 대상체의 감수성을 감소시키는 항체.
- 제21항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 인플루엔자 A 바이러스를 포함하는것인 항체.
- 제23항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 A/PR/34, A/HK8/68, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3을 포함하는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기초의 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 3.0 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제25항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 A/PR/8/34, A/HK8/68, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3을 포함하는 것인 항체.
- 제25항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 세포 기초의 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 M2 결합을 억제하는 EC50이 3.0 ㎍/ml 미만인 항체.
- 제28항에 있어서, 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 2가지 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물과 특이적으로 결합하는 항체.
- 제1항에 있어서, 다른 서열을 갖는 2가지 이상의 M2 단백질과 특이적으로 결합하는 항체.
- 제31항에 있어서, M2 단백질이 세포외 도메인을 포함하는 것인 항체.
- 제32항에 있어서, M2 단백질 세포외 도메인이 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD, SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD, SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD, SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD, SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD, SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 또는 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD (각각, 서열 1 내지 8)로부터 선택되는 것인 항체.
- 제1항의 항체의 아미노산 서브서열.
- 제34항에 있어서, 서브서열이 제1항의 항체의 결합 특이성 또는 결합 친화성을 갖는 것인 항체.
- 제34항에 있어서, 서브서열이 중쇄 및 경쇄 가변 영역 (VH및 VL), Fab,Fab', (Fab')2, Fv, Fd, scFv 및 sdFv로부터 선택되는 것인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체 다량체를 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 이종 도메인을 추가로 포함하는 항체 또는 그의 서브서열.
- 제38항에 있어서, 이종 도메인이 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체.
- 제38항에 있어서, 이종 도메인이 결합 단백질, 효소 활성, 약물, 항바이러스제, 독소, 면역-조절자, 검출가능한 잔기 또는 태그를 포함하는 것인 항체.
- 제1항의 이중특이적 또는 이관능성인 항체.
- 제1항의 항체를 발현시키는 숙주 세포.
- 제42항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 것인 세포.
- 제42항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 것인 세포.
- 제42항에 있어서, 박테리아, 효모, 식물 또는 동물 세포인 세포.
- 제1항의 항체를 발현시키는 비인간 형질전이(transgenic) 동물 또는 식물.
- 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체를 코딩하는 핵산.
- 제47항에 있어서, 벡터를 추가로 포함하는 핵산.
- 제1항에 있어서, 항바이러스제를 추가로 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 추가로 포함하는 항체.
- 제50항에 있어서, 증상 또는 합병증이 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 항체.
- 제1항의 항체 및 제약상 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항의 항체, 및 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 대상체 감염을 치료하거나, 억제하거나, 예방하거나 또는 상기 감염의 감수성을 감소시키기 위한 지침을 포함하는 키트.
- 제53항에 있어서, 항체를 점막 조직으로 전달하기 위한 제품을 추가로 포함하는 키트.
- 제53항에 있어서, 제품이 대상체의 흡입 또는 대상체로의 비측 투여에 적합한 흡입기, 에어로졸, 스프레이 또는 스퀴즈 보틀(squeeze bottle)을 포함하는 것인 키트.
- 제53항에 있어서,점막 조직이 비도 (nasal passage), 부비동, 입, 인후부, 후두부 또는 폐를 포함하는 것인 키트.
- 제53항에 있어서, 항바이러스제를 추가로 포함하는 키트.
- 제53항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 억제하는 물질을 추가로 포함하는 키트.
- 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 모노클로날 항체를 대상체에게 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법.
- 제59항에 있어서, 항체를 대상체의 감염 이전에, 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 방법.
- 제59항에 있어서, 항체를 대상체의 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 방법.
- 제59항에 있어서, 투여가 치료 이점을 제공하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 치료 이점이 대상체에서 바이러스 역가의 증가를 억제하거나, 바이러스 역가를 감소시키거나, 바이러스 복제의 증가를 억제하거나, 바이러스 복제를 감소시키거나, 바이러스 증식의 증가를 억제하거나, 바이러스 증식을 감소시키거나, 또는 바이러스 감염과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증을 경감시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제63항에 있어서, 증상 또는 합병증이 오한, 발열, 기침, 인후통, 코막힘, 부비동 막힘, 비측 감염, 부비동 감염, 전신통, 두통, 피로, 폐렴, 기관지염, 귀 감염, 귀 통증 및 사망으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 치료 이점이 인플루엔자 바이러스 감염으로부터 대상체의 회복을 촉진시키는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는 그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 항체가 세포 기초의 ELISA 분석으로 측정했을 때, MDCK 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 3.0 ㎍/ml 미만인 방법.
- 제59항에 있어서, 인플루엔자 종이 A/PR/8/34, A/HK/8/68, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3을 포함하는 것인 방법.
- 인플루엔자 M2와 특이적으로 결합하는 인간, 인간화 또는 키메라 항체를 대상체에게 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 상기 대상체의 감염을 억제하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주 또는 단리물에 의한 대상체의 감염을 억제하는 방법.
- 제70항에 있어서, 항체를 대상체의 바이러스 감염 이전에, 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 방법.
- 제70항에 있어서, 항체를 대상체의 바이러스 감염과 실질적으로 동시에 또는 감염 이후에 투여하는 방법.
- 제70항에 있어서, 투여가 치료 이점을 제공하는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 치료 이점이 바이러스 감염으로부터 대상체의 보호 또는 바이러스 감염으로부터 대상체의 감수성 감소를 포함하는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 결합 특이성 또는그와 동일하거나 실질적으로 동일한 결합 친화성을 갖는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 항체가 번호 2074 (ATCC 기탁 번호 PTA-4025), 161 (ATCC 기탁 번호 PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 것인 방법.
- 제70항에 있어서, 세포 기초의 ELISA 분석으로 측정했을 때, 항체가 MDCK 세포의 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 EC50이 3.0 ㎍/ml 미만인 방법.
- 제70항에 있어서, 인플루엔자 종이 A/PR/8/34, A/HK/8/68, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H9N2, H2N1, H4N6, H6N2, H7N2, H7N3, H4N8, H5N2, H2N3, H11N9, H3N8, H1N2, H11N2, H11N9, H7N7, H2N3, H6N1, H13N6, H7N1, H11N1, H7N2 및 H5N3을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 번호 2074 (ATCC PTA-4025), 161 (ATCC PTA-4026), N547 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), L66 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁), C40G1 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 2003년 3월 11일 기탁) 및 L17 (ATCC 기탁 번호; 미국 버지니아주 마나사스에 소재한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC))로 표시되는 하이브리도마 또는 CHO 세포주에 의해 제조되는 항체의 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 서열 9 및 서열 10에 기재된 핵산 서열 또는 서열 9 및 서열 10에 대해 퇴행성(degeneracy)인 핵산 서열에 의해 코딩되는 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체.
- 제1항에 있어서, 서열 11 및 서열 12에 기재된 중쇄 가변 서열 및 경쇄 가변 서열을 포함하는 항체.
- 제79항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 서브타입을 포함하는 항체.
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