KR20040108081A

KR20040108081A - 단삼유래 천연물 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로하는 항산화제 및 항노화제

Info

Publication number: KR20040108081A
Application number: KR1020030038823A
Authority: KR
Inventors: 정해영; 최재수; 김형석; 이지영
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-06-16
Publication date: 2004-12-23

Abstract

본 발명은 단삼에서 추출한 천연 화합물 디메틸리소스퍼메이트(dimethyl lithospermate, DML)를 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.

[ 화학식 1 ]

상기 화합물은 페록시나이트라이트에 대한 강한 소거작용과 페록시나이트라이트 생성 억제를 통하여 총활성산소종 및 활성질소종의 발생을 억제하고, SIN-1에 의해 생성 유도된 페록시나이트라이트에 의한 혈관내피세포의 세포사를 방지하며, 페록시나이트라이트에 의해서 발생되는 단백질의 니트로화(nitration)를 억제함으로써 세포의 산화적 손상을 막는 단백질들의 기능을 보호하여 라디칼 등의 지속적인 축척에 의해 발생되는 노화에 대한 억제효과가 뛰어나므로 효과적인 항산화제 및 항노화제로 이용될 수 있다.

Description

단삼유래 천연물 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 하는 항산화제 및 항노화제 {Antioxidant and anti-aging effects of dimethyl lithospermate derived from a Salvia miltiorrhiza}

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.

dimethyl lithospermate (DML)

노화란 생명체가 겪는 불가피한 현상으로, 시간에 따른 생체의 기능적 손실을 의미하며 노화에 따른 세포의 기능적 손실은 곧 조직의 손상과 생체 내 저항력의 소실을 초래하게 되고, 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 또한, 인간에서의 노화과정이란 수십년에 걸쳐 일어나는 오랜 시간 동안의 퇴행적 변화이므로 이 변화들이 적절히 조절되지 않을 경우 병적 노화, 즉 동맥경화를 비롯한 암, 당뇨병, 치매등과 같은 여러 노인성 질환의 유발요인이 된다.

호기성 생물체는 생명현상을 유지하기 위해 일어나는 여러 대사과정에서 끊임없이 생성되는 활성산소에 노출되어 있다. 노화란 이러한 활성산소가 체내에 지속적으로 생성 축적됨으로써 이들을 제거하는 체내 항산화능과의 불균형으로 과도한 산화적 스트레스의 환경에 놓이게 되어 세포내 항상성이 깨어지면서 생명분자들의 기능저하를 비롯한 세포사의 유발 현상이다. 활성산소란 짝을 이루지 못한 독신전자를 가진 불안정한 산소 화합물 (free radical: ·O₂ ^-, OH, LOO, LO 등) 혹은 반응성이 큰 산소화합물 (H₂O₂,¹O₂등)로써, 질소 유래 라디칼(NO, NO₂, HNO₂, NO₃, ONOO^-)과 함께 세포막, 지질, 단백질, 핵산에 작용하여 세포기능을 유지하기 위한 세포소기관인 미토콘드리아, 마이크로좀의 장해, 세포막의 파괴, 세포에너지 생성의 감소, 물리적 압박등을 초래함으로써 세포손상을 야기시켜 결국 세포사를 일으키게 된다. 특히, 생체 내에서는 ·NO와 ·O₂ ^-가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 비라디칼 페록시나이트라이트 (ONOO^-)가 쉽게 생성된다. ONOO^-의 독성 작용은 알쯔하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 및 여러 가지 노인성 질환이 관련되는 것으로 보고되고 있다. 특히, 생체에는 이를 제거하는 특이적 효소가 없으므로 이로 인한 세포손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 효과적인 항산화, 항노화제 개발을 위한 연구가 절실히 요구된다.

노화에 따른 생체 내 각 조직의 활성산소 생성 증가 및 축적과 이들을 제거하는 항산화능과의 균형이 노화과정을 결정하는 중요한 요소인데, 항산화능의 노화에 따른 변화를 살펴보면 비타민C는 노령자의 혈구, 뇌하수체, 대뇌피질, 심근, 흉근 등에서 감소하며 글루타치온도 여러조직에서 노화에 따라 그 함유량의 저하가 나타난다. 활성산소 제거 효소는 종이나 장기에 따라 다소 차이가 있지만 대체로 고령으로 갈수록 카탈라제, 글루타치온 과산화효소, 글루타치온 환원효소의 활성이 감소한다. 따라서 활성산소 생성량에 대한 그 제거능력의 비가 노화 과정에서 중요한데, 어떤 원인으로 활성산소 발생량이 증가했을 경우 얼마만큼 원활히 항산화 능력의 상승을 유도할 수 있는지가 포인트이다. 그러므로 이러한 것을 포함하는 예비력을 서서히 잃어가는 과정이 보편적인 노화현상이다. 즉 항산화력의 예비력 소실을 잘 보완한다면 노화과정은 조절이 가능할 것이다.

상기에서 언급했듯이 ONOO^-는 독성이 매우 강하여 노화는 물론, 여러 가지 질병과 관련되어 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 ONOO^-의 특성을 검토하고 연구하여 이것을 무독화시키는 방법은 노화과정뿐만이 아니라 노인성 질환을 조절하는데 대단히 중요한 의미를 가진다. 인체 내에서 특이하게 ONOO^-를 소거하는 효소가 존재하지 않으므로 내인성 물질과 천연물을 이용하여 ONOO^-에 대한 독성을 방지하는 것이 중요하다.

이에 본 발명자들은 천연물 유래 항산화물을 탐색하여 더욱 활성이 강한 물질을 개발하고 그 기전을 규명하고자 단삼으로부터 유효한 항산화, 항노화 성분을 분리하여 발명하였다.

단삼(Salvia miltiorrhizaBUNGE)은 혈관확장, 혈압강하, 항균작용을 갖는 것으로 알려져 있으며, 또한 임상적으로는 관(冠)부전, 심근경색, 간질환의 만성기, 혈전성 정맥염, 고혈압, 월경곤란증, 월경통, 항균 항암 등에 이용되고 있는 대표적인 양혈활혈약(養血活血藥)이지만, 그 유효성분은 불분명하다. 본 발명자들은 단삼의 강한 페록시나이트라이드 소거작용을 확인하였고, 그 유효성분으로 리소스퍼메이트 및 그 유도체인 디메틸리소스퍼메이트를 분리하였다. 이에 본 발명자들은 퍼옥시나이트라이트에 의한 세포의 산화적 손상과 이에 의한 노화를 억제할 수 있는 물질을 찾고자 연구한 결과, 단삼 성분의 퍼옥시나이트라이트 소거 및 발생 억제 효과를 확인하고, 이는 단삼의 성분 중 디메틸리소스퍼메이트에 의해 특이적으로 억제됨을 밝히고 그 작용기전의 규명을 통해 항산화제 및 항노화제로 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 단삼 성분들 중 하나인 디메틸리소스퍼메이트의 항산화 활성을 조사하고, 페록시나이트라이트에 대한 제거 활성과 페록시나이트라이트로부터 야기되는 단백질 니트로화(nitration)의 저해작용에 대한 기전을 밝힘으로써 항산화제 및 항노화제로 유용한 화합물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 기술적 과제는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 소거능 및 생성억제능을 검증하고 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 밝히고 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 항노화제를 제공함으로써 달성하였다.

도 1은 혈관내피세포에서 SIN-1에 의해 생성촉진된 페록시나이트라이트에 의해 유발된 혈관내피세포의 세포사에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 세포사 방어작용을 나타내는 그래프이다.

도 2는 AAPH에 의해 유도 생성된 인간피부의 섬유아세포 내 총활성산소종에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 생성억제효과에 대한 현미경 사진이다.

도 3은 디메틸리소스퍼메이트의 LPS 주사한 마우스신장에서 촉진된 총활성산소종의 발생에 대한 억제 효과 그래프이다.

도 4는 디메틸리소스퍼메이트의 LPS 주사한 마우스 혈청에서 발생하는 나이트라이트(NO₂)와 나이트레이트(NO₃) 생성억제 효과에 대한 그래프이다.

도 5는 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 신장에서 발생하는 페록시나이트라이트 발생억제효과에 대한 그래프이다.

도 6은 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 혈청에서 발생하는 나이트라이트 생성억제효과에 대한 그래프이다.

도 7은 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 신장에서 발생하는 총활성산소종 발생억제효과에 대한 그래프이다.

도 8은 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 나타내는 그래프이다.

도 9는 디메틸스퍼메이트의 단백질 니트로화(nitration)에 대한 방어작용을 나타내는 그림이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 포함하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다

[ 화학식 1 ]

본 발명은 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 소거능을 검증하는 단계; 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 페록시나이트라이트 생성억제능을 검증하는 단계; 및 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전을 검증하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성 및 효과를 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거능 및 항산화능 측정

(시약)

몰포리노신논(SIN-1), 페니실라민, 리포폴리사카라이드는 시그마 화학 주식회사에서, 디하이드로로다민123과 디클로로디하이드로플루오레신 디아세테이트는 몰레큘라 프로브사로부터 구입하였으며, 다이아미노플루오레신은 다이치화학회사에서 페록시니이트라이트는 케이맨사로부터 구입하였다. 케모루미노센스 측정시약은 아머샴 라이프 사이언스사에서 구입하여 사용하였고, 나이트로타이로신 항체는 업스테이트 바이오테크놀러지사에서 구입하였다.

(실험기기)

바이오테크 인스트루먼트사의 미세판형광 판독기 (FL 500, Bio-Tek Instrument)와 다중촛점 레이져 현미경 (LSM 510, Zeiss Co., Japan)을 이용하였다.

(페록시나이트라이트에 대한 소거효과 측정)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 대하여 소거작용을 갖는지를 확인하기 위하여 Kooy 등의 방법을 변형하여 디하이드로로다민123의 산화정도를 측정함으로써 수행하였다. 마우스 신장파쇄액에 리포폴리사카라이드의 처리에 의해 유도되는 ·O₂와 ·NO에 의해 생성되는 ONOO^-소거능을 검토하였다. 90 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산으로 구성된 완충액에 시료와 페록시나이트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민 123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm인 미세판형광 판독기에서 측정하였다. 이때 IC₅₀은 신장파쇄액에 리포폴리사카라이만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 리소스퍼메이트의 양 (μM)으로 표 1에 정리하였다.

단삼으로부터 분리된 리소스메이트들의 페록시나이트라이트 제거효과

화합물	ONOO^-소거 (IC₅₀, μM)
리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH₂/K 리소스퍼메이트 B	19.22±0.629.22±0.5717.39±0.2314.67±0.6813.45±0.30
페니실라민 (penicillamine)	9.29±0.13

(활성산소에 대한 소거효과 측정)

리포폴리사카라이드에 의해 수퍼옥사이드와 나이트릭옥사이드의 생성을 유도한 신장 파쇄액에 비형광성 2',7'-DCFDA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 디메틸리소스퍼메이트의 첨가에 따른 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 IC₅₀은 신장 파쇄액에 리포폴리사카라이드만 첨가한 형광도 값을 50% 감소시키는데 필요한 리소스퍼메이트의 양(μM)으로 표 2에 정리하였다.

단삼으로부터 분리된 리소스퍼메이트들의 총활성산소종 제거효과

화합물	ROS 소거 (IC₅₀, μM)
리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH₂/K 리소스퍼메이트 B	4.10±0.470.56±0.113.75±0.403.60±0.275.41±0.70
Trolox	2.49±0.21

(나이트릭옥사이드에 대한 소거효과 측정)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 나이트릭옥사이드에 대한 소거효과를 검토하기 위해 다이아미노플루오레신 (DAF-2)을 이용하여 폴리사카라이드 처리한 신장 파쇄액으로 형광의 변화를 측정하였다. 이는 나이트릭 옥사이드에 의해 비형광성인 DAF-2가 형광성인 DAF-2T로 산화되기 때문이다. 시료에 니트로플루시드 나트륨, 50 mM 포타슘포스페이트 완충액 (pH 7.4)에 DAF-2 용액을 넣어 37℃에서 5분 간 혼합하였다. 형광의 변화를 여기 파장 495 nm 및 방출 파장 515 nm에서 60분 간10분 간격으로 미세판영광 판독기로 측정하였다. 이때 IC₅₀은 리포폴리사카라이드만 첨가한 형광도 값을 감소시키는데 필요한 디메틸리소스퍼메이트의 양 (μM)으로 표 3에 정리하였다.

단삼으로부터 분리된 리소스퍼메이트들의 나이트릭옥사이드 제거효과

화합물	·NO 소거 (IC₅₀, μM)
리소스퍼메이트디메틸리소스퍼메이트리소스퍼메이트 B마그네슘 리소스퍼메이트 BNH₂/K 리소스퍼메이트 B	6.92±0.243.99±0.366.92±0.246.33±0.145.69±0.39
카르복시-PTIO (Carboxy-PTIO)	6.74±0.07

실시예 2 : 디메틸리소스퍼메이트의 생체내에 페록시나이트라이드 생성억제능

(혈관내피세포의 페록시나이트라이트로 인한 세포사 억제능)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 SIN-1처리에 의해 유도된 페록시나이트라이트로 인한 세포사에 대한 억제작용을 측정하기 위하여, 혈관내피세포 (YPEN)에 SIN-1을 처리하여 세포내 페록시나이트라이트의 생성을 유도한 후 세포 생존율을 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)

측정법으로 측정하였다. 96 웰 플레이트(well-plate)에 키운 세포에 디메틸스퍼메이트와 SIN-1을 처리하여 24시간 배양한 다음 MTT 50㎕를 가하고 CO₂배양기

(5% CO₂, 37℃)에서 3시간 배양하여 살아있는 세포의 마이토콘드리아 탈수효소(dehydrogenases)의 환원반응에 의하여 MTT를 포마즌(formazan)으로 변화시킨 후, 생성된 보라색의 결정물질을 완전히 용해시켜 용출되도록 하여 560nm에서 흡광도를 측정하여 비처리 대조군의 % 값으로 도 1에 나타내었다.

실험결과 디메틸리소스퍼메이트는 SIN-1에 의한 페록시나이트라이트로 초래된 세포사의 억제기능이 있는 것으로 나타났다.

(AAPH 의한 세포내 활성산소종 생성억제 효과 측정)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트가 2,2 azobis (2-amidino propane) dihydrochloride (AAPH) 처리에 의해 혈관내피세포내 유도된 활성산소종의 생성 억제능을 검토하기 위해, 혈관내피세포를 6-웰 플레이트(well plates)에 2x10⁴/ml로 심은 후 하루 동안 배양한 다음 1, 2, 4 μM의 디메틸리소스퍼메이트와 AAPH를 처리하여 8시간 배양하였다. 배양된 세포는 커버 글래스(cover glass)에서 10 μM의 DCFDA을 가하여 세포내 생성된 활성산소종에 대한 디메틸리소스퍼메이트의 억제를 다중 초점 현미경 (confocal laser scanning microscope) (LSM 510, Zeiss Co., Japan)을 통해 분석하였다. 도 2의 a와 같이 AAPH 처리하지 않은 세포에 비해 AAPH를 도 2의 b, c 각각 500 μM, 1 mM 처리한 세포의 활성산소의 생성이 촉진되었으며, 도 2의 d, e, f 와 같이 디메틸리소스퍼메이트를 함께 처리함으로써 세포내 활성산소 생성이 억제되었다.

(LPS에 의한 생체내 활성산소종 생성억제 효과 측정)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 활성산소종에 생성억제능을 확인하기 위하여, 리포폴리사카라이드(LPS)를 복강주사하여 총활성산소종 생성을 유도하였으며, 디메틸리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액에 DCFDA (2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 그 결과 리포폴리사카라이드(LPS)를 먹인 흰쥐 대조군에 비해 리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 활성산소 생성은 유의성 있는 감소를 나타냈으며 이를 도 3에 나타내었다.

(LPS에 의한 혈청 나이트라이트와 나이트레이트에 대한 생성억제 효과)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체 내 활성산소종에 생성억제능을 확인하기 위하여 리포폴리사카라이드를 복강주사하여 총활성산소종 생성을 유도하였으며, 리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 나이트라이트는 그리스(Griess) 시약과 결합하여 보라색을 띄게되므로 540nm에서 흡광도를 측정하여 확인할 수 있다. 그러나 그리스(Griess) 시약은 나이트레이트와는 결합하지 않으므로 나이트레이트는 나이트레이트 환원효소와 NADPH를 이용하여 나이트라이트로 환원 후 측정하였다. 그 결과 리포폴리사카라이드를 먹인 흰쥐 대조군에 비해 디메틸리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 혈청내의 나이트라이트와 나이트레이트의 생성은 유의성 있는 감소효과를 나타내었다 (도 4 참조).

(노화 흰쥐에서 페록시나이트라이트에 대한 소거효과)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 생체내 나이트라이트 생성억제능을 확인하기 위하여 디메틸리소스퍼메이트를 20일 간 5 또는 10 mg/kg을 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 90 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산으로 구성된 완충액에 시료와 페록시나이트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm인 미세판형광 판독기에서 측정하였다. 그 결과 노화 흰쥐 대조군에 비해 리소스퍼메이트를 먹인 쥐의 페록시나이트라이트 생성이 유의성 있는 감소를 나타내었다 (도 5 참조).

(노화 흰쥐에서의 혈청 나이트라이트와 나이트레이트에 대한 생성억제 효과)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 생체내 나이트라이트와 나이트레이트의 생성억제능을 확인하기 위하여 리소스퍼메이트를 20일 간 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 나이트라이트는 그리스(Griess) 시약과 결합하여 보라색을 띄게되므로 540nm에서 흡광도를 측정하여 확인할 수 있다. 그러나 그리스(Griess) 시약은 나이트레이트와는 결합하지 않으므로 나이트레이트는 나이트레이트 환원효소와 NADPH를 이용하여 나이트라이트로 환원 후 측정하였다. 그 결과 노화 흰쥐 대조군에 비해 디메틸리소스퍼메이트를 함께 먹인 쥐의 혈청내의 나이트라이트와 나이트레이트의 생성은 유의성 있는 감소를 나타내었다 (도 6 참조).

(노화 흰쥐에서 활성산소종에 대한 생성억제 효과)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 노화 흰쥐의 생체내 활성산소종 생성억제능을 확인하기 위하여 디메틸리소스퍼메이트를 20일간 5 또는 10 mg/kg을 먹이와 섞어 투여한 후 그 신장 파쇄액을 사용하였다. 파쇄액에 비형광성 2',7'-DCFDA (2`,7`-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 첨가한 후, 디메틸리소스퍼메이트의 첨가에 따른 형광도의 변화를 여기 파장 485 nm 및 방출 파장 530 nm에서 60분 간 10분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. 이때 노화 흰쥐에서 증가한 총활성산소종의 생이 디메틸리소스퍼메이트를 먹인 쥐에서 감소되었으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

실시예 3 : 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트 제거 기전 측정

(3-나이트로타이로신 생성 억제 기전 확인)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트에 의해 발생되는 단백질 니트로화(nitration) 저해효과를 확인하기 위하여 Pannala 등의 방법을 변형하여 분광측정법으로 분석하였다. 50 mM 인산칼륨(potassium phosphate) (pH 7.4)에 농도별로 페록시나이트라이트와 디메틸리소스퍼메이트을 가한 용액을 190 nm에서 600 nm까지 파장을 이동하여 측정하였다. 타이로신은 페록시나이트라이트와 반응하며 430 nm에서 최대 흡광을 가지는 3-나이트로타이로신을 생성한다. 430 nm 근처에서 피크(peak)가 관찰되면 질화과정으로 페록시나이트라이트를 소거하며,피크(peak)가 관찰되지 않으면 전자 공여과정으로 소거함을 알 수 있다. 실험결과, 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트와의 반응에서는 피크(peak)가 관찰되지 않았으므로 이는 전자공여과정으로 페록시나이트라이트를 제거함을 알 수 있다 (도 8 참조).

(단백질 니트로화의 저해효과)

본 발명의 디메틸리소스퍼메이트의 페록시나이트라이트에 의한 단백질 니트로화 억제효과를 확인하기 위하여 본 실시예에서는 알부민의 타이로신이 페록시나이트라이트에 의해 니트로화되는 정도에 디메틸리소스퍼메이트가 미치는 영향을 나이트로타이로신 항체로 검토하였다. 단백질 양의 확인은 웨스턴 블랏(Western blot) 분석법을 실시하였다. 알부민 단백질(BSA, 0.5mg/㎖) 95㎕에 농도별 시료나 혹은 용매 2.5㎕를 첨가하여 상온에서 10분 간 배양한 후, 페록시나이트라이트(4mM in 0.3N NaOH) 2.5㎕를 첨가하고 20분 간 상온에서 재배양하였다. 니트로화 반응이 끝난 후, SDS-PAGE 에 전기영동한 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막에 단백질을 전이시키고 나이트로타이로신 항체로 반응시킨 다음 ECL법으로 확인하였다. 그 결과 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트를 전자공여에 의해 효과적으로 소거함으로써 알부민의 니트로화를 억제하였다 (도 9 참조).

본 발명은 단삼 유래의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 및 항노화용 조성물에 관한 것이다.

디메틸리소스퍼메이트는 페록시나이트라이트의 생성 및 반응성을 억제시키며, 생체 내 페록시나이트라이트뿐만 아니라 수퍼옥사이드와 나이트릭옥사이드의 생성을 억제하고, 페록시나이트라이트로 인한 세포사를 억제하므로 세포내 항산화능을 나타냄과 동시에 그에 따른 항산화능으로 세포사를 방지한다. 또한 전자공여 기전을 통해 페록시나이트라이트를 제거함으로써 단백질의 니트로화 (nitration)를 저해하여 세포내 항상성을 유지시키는데 주요한 역할을 담당하는 단백질들의 기능을 효과적으로 보호한다.

따라서 본 발명의 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화제 및 항노화제는 세포내 산화적 손상에 의해 진행되는 노화를 효과적으로 방지하므로 이는 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항산화용 조성물.

[ 화학식 1 ]
하기 화학식 1로 표시되는 디메틸리소스퍼메이트를 유효성분으로 함유하는 항노화용 조성물.

[ 화학식 1 ]
제 1항 또는 제 2항에 있어서 디메틸리소스퍼메이트는 단삼으로부터 회수된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 의한 세포사를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 LPS에 의한 생체내 페록시나이트라이트 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 페록시나이트라이트에 의한 3-나이트레이션을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 디메틸리소스퍼메이트가 전자공여에 의한 단백질 니트로화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.