KR20040091076A - 리포솜에의 금속착체의 봉입방법 - Google Patents

리포솜에의 금속착체의 봉입방법 Download PDF

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KR20040091076A
KR20040091076A KR10-2004-7013267A KR20047013267A KR20040091076A KR 20040091076 A KR20040091076 A KR 20040091076A KR 20047013267 A KR20047013267 A KR 20047013267A KR 20040091076 A KR20040091076 A KR 20040091076A
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아라노야스시
카네코에미
무라카미마사히로
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아마토 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 목적은, 실용화가 가능한 방사화학적 수율 및 순도로99mTc 등의 단반감기 금속방사성 핵종과 CD와의 착체를 봉인한 리포솜을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시키는 단계를 포함하는, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)와의 착체를 봉입한 리포솜의 제조방법이 제공된다.

Description

리포솜에의 금속착체의 봉입방법{Method of Encapsulating Metal Complex within Liposomes}
방사성 핵종을 사용한 암의 화상진단은 수술 없는 조기진단을 가능하게 한다. 화상진단에 범용되는 방사성 동위원소(radioisotope: RI) 중 금속RI인 테크네튬-99m(99mTc)은, 화상진단에 적절한 반감기(6시간)와 γ선 에너지(141keV)를 갖고 있으며, 또한99Mo를 친핵종으로 하는 발생기(generator) 시스템에 의해 생리식염수용액으로 용이한 입수가 가능하기 때문에, 임상응용에 가장 적합한 핵종이다.99mTc를 종양에 선택적으로 송달시킬 목적으로, 표지모체에 항체나 펩티드를 사용하는 연구가 현재까지 많이 이루어지고 있으나, 리포솜 역시 화상진단에의 이용이 검토되어 온 담체 중 하나이다. 리포솜은 지질 2분자막으로 구성되는 폐쇄소포이며, 화학요법제 등의 약물, 단백질, 핵산 등의 캡슐형 DDS담체로서 주목받고 있다. 핵의학 진단에 있어서도, 내부에 대량의 방사능을 내포시킬 수 있고, 입자직경의 조절이나 막표면의 화학수식에 의해 표적지향화가 가능하기 때문에,99mTc로 표지한 리포솜은 고형암(固形癌) 외에, 센티넬(sentinel) 임파절이나 염증·감염 부위의 고감도 화상진단에의 응용이 기대된다.
종양조직에서는 혈관투과성이 항진되어 있고, 또한 림프계를 통한 회수가 없기 때문에, 고분자가 혈중으로부터 종양조직의 간질(間質)에 누출되어 축적되기 쉬움이 알려져 있다. 이와 같은 특성 때문에, 조직 간질에 투과한 리포솜은 종양조직 내에서 세포 안쪽으로 에워싸이지 않으면서 세포 간질에 존재함이 시사되고 있다. 그러나, 혈류를 순환하는 리포솜은 주로 간장, 비장 등과 같은 가는 그물형태의 내피계 조직에 포착되어 혈중으로부터 제거된다. 이제까지 널리 검토되어 온 동일한 종양의 화상진단을 목적으로 하는67Ga 및111In의 니트릴로트리아세트산(nitrilotriacetic acid: NTA) 착체를 봉입한 리포솜은. 실험동물에서 우수한 종양집적성을 나타내기는 하지만, 간장이나 비장에서의 높은 방사능 집적 또한 확인됨으로 인해 실용화에 큰 장해가 되고 있다. 간장이나 비장에 에워싸인 리포솜은 실질 세포 내의 리소좀과 융합하여 대사되지만, 이때 리소좀 내로 방출된 봉입착체67Ga 및111In-NTA는 수용성이기 때문에 막을 투과할 수 없으며, 또한 이들의 낮은 안정성으로 인해 착체가 분해되어 리소좀 내에 방사성 핵종이 잔류하게 된다. 그 결과, 이들 조직 내에서 장시간에 걸친 방사능의 잔류가 나타나는 것으로 여겨진다.
여기서 리포솜이 세포내 리소좀에 둘러싸여 대사된 후 방출되는 RI착체에, 리소좀으로부터 혈중으로 이동하여 신속하게 뇨중 배설되는 성질을 부여함으로써, 이들의 비특이적인 방사능 잔류를 해소할 수 있다고 생각되었다. 이와 같은 성질을 갖는 착체로99mTc-에틸렌디시스테인(99mTc-ethylene dicysteine:99mTc-CD)(참조: 도 1)이 선택되었다.99mTc-CD는 2분자의 유리된 카본산과 안정된 5가 중성착체 구조를 가지며, 파라아미노 마뇨산(馬尿酸)과 같은 모양으로 신장의 유기음이온 운반체(transporter)를 통하여 안정된 화학형으로 뇨배설되는 것이 보고되어 있다. 본 발명자들의 최근까지의 연구에 따르면,99mTc와 동족의 장반감기(long half-life) 금속방사성 핵종인 레늄-186(186Re)의 CD착체,186Re-CD를 리포솜 내에 봉입함으로써, 간장이나 비장에 집적되는 방사능을186Re-CD를 통해 신속히 뇨 중으로 배설하고, 이들 장기에서의 방사능 잔류를 크게 감소시킬 수 있음이 밝혀졌었다. 이들 결과는99mTc-CD 착체봉입 리포솜도 같은 모양으로 간장이나 비장에서의 방사능 잔류 해소가 가능함을 시사하는 것이다.
그러나,186Re-CD리포솜 제조시, 지질에186Re-CD착체를 그대로 첨가해서 팽윤시키는 직접 봉입하는 경우 봉입효율이 3.2%로 현저히 낮기 때문에,186Re-CD 또는99mTc-CD의 리포솜에의 봉입방법을 개발하여야 할 필요성이 대두되었다. 또한, 임상에 사용하려는 경우, 직접 봉입 리포솜을 사용하기 직전에 조제할 필요가 있고, 실용적인 측면에서 미리 조제하거나 임상에서 표지하는 방법이 바람직하다.67Ga 나111In의 효율적이고도 간편한 봉입방법으로, 높은 지용성과 치환활성을 갖는 착체인67Ga 및111In-옥신(oxine) 착체를 제조하여 NTA내포 리포솜과 정치(定置)시킴으로써, 리포솜막을 투과한 착체가 내부에서 배위자 교환반응을 일으켜 수용성 킬레이트인67Ga 및111In-NTA로 리포솜 내에 유지되는 방법이 보고되어 있다(참조: 도 2). 배위자 교환반응이라는 이 봉입방법을 사용할 경우,67Ga 나111In의 봉입효율은 약 90%에 달한다. 또한,99mTc표지 리포솜을 높은 방사화학적 수율로 얻는 방법으로, 지용성 착체인99mTc-헥사메틸프로필렌아민옥심(99mTc-hexamethyl propyleneamine oxime:99mTc-HMPAO)를 글루타치온 내포 리포솜과 정치시킴으로써, 내부에서99mTc-HMPAO를 환원적으로 수용성 분해물로 변환시킨다. 봉입효율은 대략60% 내지 90%이며, 최근에 핵의학적으로 사용되는 RI표지 리포솜은 이 봉입방법에 의해 조제되는 것이 가장 보편적이지만,67Ga 나111In 및99mTc 중 어느 것의 표지 리포솜에 있어서도 전술한 바와 같은 간장·비장에서의 방사능 잔류 문제가 발생한다.
본 발명은99mTc 등의 단반감기(short half-life) 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜(liposome)의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민을 배위시킨99mTc 등의 단반감기 금속방사성 핵종의 착체를 사용한,99mTc 등의 단반감기 금속방사성 핵종의 착체를 봉입한 리포솜의 제조방법, 전기 방법으로 제조된 리포솜, 그리고 전기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
도 1은99mTc-CD의 추정구조를 나타낸다. CD는 배위원자에 질소와 유황을 가지며, 5가의99mTc와 안정된 옥소착체를 형성한다.
도 2는86Re-CD직접봉입법(A)과111In-NTA의 배위자 교환반응(B)을 나타낸다.
■: CD 또는 NTA;
▲:86Re 또는111In; 및,
O : 옥신
도 3은99mTc-HMPAO(좌)와99mTc-MRP20(우)의 구조를 나타낸다. 높은 지용성과 치환활성을 갖는99mTc착체이며, 비교적 용이하게 가수분해 및 배위자 변환반응을 일으키는 것으로 여겨진다.
도 4는99mTc-HMPAO및99mTc-MRP20의 수용액 중에서의 안정성을 나타낸다. 착체형성 0시간 후를 100%로 했을 때, 각99mTc착체의 방사화학적 순도의 시간변화를 나타낸다.
(A) RP-HPLC 미정제의99mTc-HMPAO;
(B) RP-HPLC 정제 후의99mTc-HMPAO;
(C) RP-HPLC 미정제의99mTc-MRP20;
(D) RP-HPLC 정제후의99mTc-MRP20; 및,
O : 25℃, □ :37℃
도 5는99mTc-HMPAO(A) 및99mTc-HMPAO(B)와 CD의 배위자 교환반응성에서의 pH에 의한 영향을 나타낸다. 교환반응에 의해 생성된99mTc-CD의 방사화학적 흡수율을 세로축에 나타낸다.
O : RP-HPLC 미정제의99mTc착체와의 교환; 및,
□: RP-HPLC 정제 후의99mTc착체와의 교환
도 6은99mTc-HMPAO를 사용해서 조제한99mTc-CD리포솜(99mTc-(HMPAO)-CD리포솜) 내용물의 EP 분석결과를 나타낸다.
도 7은99mTc-MRP20을 사용해서 조제한99mTc-CD리포솜(99mTc-(MRP20)-CD리포솜) 내용물의 EP 분석결과(A)와 RP-HPLC 분석결과(B)를 나타낸다.
도 8은99mTc표지 리포솜을 마우스에 정맥 투여하였을 때의 체내방사능 동태를 나타낸다.
△:99mTc/GSH리포솜;
■:99mTc(HMPAO)-CD리포솜; 및,
●:99mTc(MRP20)-CD리포솜
도 9는99mTc-CD봉입 리포솜을 마우스에 투여한 후, 체외 배설된 방사능의 투여된 방사능에 대한 비율을 나타낸다.
■:99mTc(HMPAO)-CD리포솜 투여군; 및,
□(사선):99mTc(MRP20)-CD리포솜 투여군
도 10은99mTc(MRP20)-CD리포솜을 마우스에 투여한 후, 뇨 중으로 배설된 방사능의 EP(A)와 RP-HPLC(B)에서의 분석결과를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최선의 태양
이하, 본 발명을 실시하는 태양에 대하여 설명한다.
본 발명에 의하여 제공되는 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜의 제조방법은, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD)봉입 리포솜을 혼합하여 정치하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 사용할 수 있는 단반감기 금속방사성 핵종의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는99mTc(테크네슘 99m) 또는186/188Re이며, 특히 바람직하게는99mTc이다.
본 발명에 사용되는 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(MRP20)과의 착체는, 예를 들면, 단반감기 금속방사성 핵종이99mTc인 경우에는, MRP20의 에탄올 용액과 염화 제1주석의 염산 용액을 혼합하고, 여기에99mTcO4 -용액을 첨가하여 실온에서 방치함으로써 제조할 수 있다.99mTc 이외의 단반감기 금속방사성 핵종을 사용하는 경우에는,99mTcO4 -대신에 대응하는 단반감기 금속방사성 핵종을 함유하는 용액을 사용하면 된다.
본 발명에 사용되는 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜은 리포솜 형성물질을 사용하여 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.
리포솜 형성물질은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 생체 내에서 안정된 리포솜을 제공한다는 점에서, 인지질 또는 그 유도체, 인지질 이외의 지질 또는 그의 유도체가 자주 사용된다.
상기 인지질로는, 예를 들어, 디스테알로일포스파티딜콜린, 디파르토일포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜콜린, 포스파티딜콜린(레시틴), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딘산, 포스파티딜에아놀아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미에린(sphingomyelin), 카디오리핀, 대두 레티신, 난황 레티신 등의 천연 또는 합성 인지질, 또는 이들을 통상의 방법에 따라 수소 첨가시킨 것을 들 수 있다.
다시 친수성 고분자의 지질유도체를 첨가하여 리포솜의 표면을 수식할 수도 있다. 사용할 수 있는 친수성 고분자의 지질유도체로는. 리포솜의 구조안정을 손상시키지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 플루란, 피콜, 폴리비닐알코올, 합성 폴리아미노산, 아밀로스, 아밀로펙틴, 만난, 시클로덱스트린, 펙틴, 카라기난 및 이들의 유도체 등을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 리포솜에는, 필요에 따라 안정화제, 산화방지제 등을 사용하는 것도 가능하다. 안정화제는, 예를 들어, 막유동성을 저하시키는 콜레스테롤 등의 스테롤이나, 글리세롤, 수크로스 등의 당류를 들 수 있다. 산화방지제는, 예를 들어, 비타민 E와 같은 토코페롤 동족체 등을 들 수 있다.
리포솜을 제조하기 위하여, 플라스크에서 용매에 용해된 리포솜 형성물질(2종류 이상의 혼합물이라도 된다)을, 감압 하에서 용매를 증류 제거함으로써 플라스크 내벽에 지질의 박막을 형성시킬 수 있다.
용매로는 사용하는 지질을 용해시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것이든 사용할 수 있으며, 예를 들어, 클로로포름, 메틸클로로포름, 염화메틸렌 등의 할로겐화 탄화수소류, 헥산, 헵탄 등의 탄화수소류, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 방향족 탄화수소류, 디에틸에테르, 디이소프로필에테르, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 테트라히드로퓨란 등의 에테르류 등을 들 수 있다.
이어서, 감압 건조기(desiccator)로 옮겨 감압 하에서 용매를 완전히 증류 제거한 후, CD수용액을 첨가하여 지질을 팽윤시켜, 현탁액으로서 다중막 리포솜(MLV)을 얻을 수 있다. 다시 0.2㎛, 0.05㎛ 등의 멤브레인 필터를 사용하여 순차 가압 여과시킴으로써 단막 리포솜을 얻을 수 있다.
얻어진 리포솜 분산액은, 겔 여과, 원심분리 등의 공지의 방법에 의해 정제함으로써 리포솜과 리포솜 안에 봉입되지 않은 물질을 분리할 수 있다.
이어서, 상기에서 얻어진 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜에 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체(특히 바람직하게는99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민 등)를 첨가하여 정치함으로써, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)착체를 봉입한 리포솜을 제조할 수 있다. 정치시키는 온도 및 시간은 특별히 제한되지 않으며 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어, 실온에서 30분 내지 수시간 정도 정치시킴으로써 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜을 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 방법에서 얻어지는 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜은, 단반감기 금속방사성 핵종(예를 들면99mTc)-CD 착체의 순도가 높은 것을 특징으로 한다. 이와 같이, 리포솜 내부의 단반감기 금속방사성 핵종(예를 들면,99mTc)-CD 착체의 방사화학적 순도가 높을수록 간장이나 비장으로부터의 신속한 방사능 소실이 기대되기 때문에, 본 발명의 방법으로 제조되는 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)의 착체를 봉입한 리포솜은 종래의99mTc봉입 리포솜이나99mTc-HMPAO-CD 리포솜보다도 훨씬 큰 폭으로 간장이나 비장에서의 방사능 잔류가 감소되는 특징을 갖고 있다. 이와 같은 특징을 갖는 리포솜 자체도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 방법에서 얻어지는 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜은, 예를 들어, 암 또는 종양 등을 포함하는 각종 질환의 진단제 또는 치료제로서 유용하다.
본 발명의 리포솜은 경구 또는 비경구 투여에 의해 생체로 투여할 수 있다. 투여방법은 주사에 의한 투여가 바람직하며, 암 또는 종양의 존재 부위에 따라 정맥내주사, 근육내주사, 피하주사, 동맥내주사 등의 어느 것이라도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 정맥내주사이다.
본 발명의 리포솜을 진단제 또는 치료제로서 투여하는 경우, 리포솜을 그대로 투여해도 되지만, 리포솜을 포함하는 의약조성물의 형태로 투여하는 것이 바람직하다. 전기 의약조성물은 본 발명의 리포솜 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하며, 필요에 따라 다른 약학적 제제, 담체, 보조약 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 리포솜을 주사를 통해 피시험자에게 투여하는 경우, 액체의 의약조성물을 조제하는 것이 바람직하다.
액체의 의약조성물은, 예를 들어, 본 발명의 리포솜을 물, 생리식염수, 수성포도당, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등과 같은 담체 중에 필요에 따라 어쥬번트(adjuvant)를 첨가하여 용해 또는 분산시킴으로써, 용액 또는 현탁액으로 조제할 수 있다.
또한, 본 발명의 의약조성물에는, 소망에 따라서 습윤제, 유화제 또는 가용화제, pH완충제 등, 예를 들어, 아세테이트, 구연산나트륨, 시클로덱스트린 유도체, 1라우린산솔비탄, 아세트산트리에탄올아민나트륨, 올레인산트리에탄올아민 등과 같은 조제를 소량 함유할 수 있다. 이와 같은 의약조성물의 조제방법은 당업자에게는 자명한 것이다.
본 발명의 리포솜 투여량은 투여의 목적, 봉입된 단반감기 금속방사성 핵종의 종류나 봉입량 등에 의해 달라지지만, 통상 성인에게 0.1㎎∼1g 정도 투여된다.
아울러, 본 발명에서는 하기의 일반식으로 표시되는99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(99mTc-MRP20)을 사용한다.
99mTc-MRP20은 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(MRP20)의 에탄올 용액과 염화 제1주석의 염산 용액을 혼합하고, 여기에99mTcO4 -용액을 첨가하여 실온에 방치함으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 1종류 이상의 리포솜 형성물질; 에틸렌디시스테인(CD); 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜; 단반감기 금속방사성 핵종; N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민; 또는, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 물질을 포함하는, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜을 제조하기 위한 키트가 제공된다.
상기에서, 1종류 이상의 리포솜 형성물질 및 에틸렌디시스테인(CD)은 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 제조하기 위한 시약이며, 이들을 단독으로 또는 둘다 키트에 포함시켜도 되고, 또는 제조 후의 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜 자체를 키트에 포함시켜도 된다.
같은 방법으로, 단반감기 금속방사성 핵종 및 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민은, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체를 제조하기 위한 시약이며, 이들을 단독으로 또는 둘 다 키트에 포함시켜도 되고, 또는 제조 후의 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체를 키트에 포함시켜도 된다.
이하의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기한 종래 기술의 문제점을 해소하는 것을 해결할 과제로 한다. 즉, 투여한 방사능이 신속히 배설되기 위해서는, 높은 봉입효율뿐만 아니라 내부의99mTc-CD의 방사화학적 순도를 충분히 향상시키는 것도 동시에 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 실용화가 가능한 방사화학적 수율 및 순도로99mTc 등의 단반감기 금속방사성 핵종과 CD와의 착체를 봉입한 리포솜을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은 상기 과제의 해결을 목적으로 하여, 높은 막투과성과 치환활성을 갖는 2종의99mTc 착체인99mTc-HMPAO 및99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(MRP20)(참조: 도 3)을 배위자 교환반응에 이용하여 양자를 비교 검토하였다. 또한, 제조한99mTc-CD 봉입 리포솜의 체내방사능 동태를 검토하여,99mTc에 의한 화상진단 및186Re에 의한 내과용 방사선치료에서의 본 표지법의 유용성에 대해서 평가하였다. 그 결과,99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(99mTc-MRP20)을 사용하여 배위자 교환반응에 의해99mTc-CD를 리포솜에 봉입함으로써, 간장이나 비장에서의 비특이적 방사능 잔류를 해소하는99mTc 봉입 리포솜의 제조가 가능함을 발견하였다. 본 발명은 이들 발견에 기초하여 완성된 것이다.
즉, 본 발명에 의하면, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜과를 혼합하여 정치(定置)시키는 단계를 포함하는, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜의 제조방법이 제공된다.
바람직하게는,99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시키는 단계를 포함하는,99mTc-에틸렌디시스테인(CD) 착체봉입 리포솜의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합 정치하여 제조함으로써, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜이 제공된다.
바람직하게는,99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치함으로써 제조되는99mTc-에틸렌디스스테인(CD) 착체봉입 리포솜이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 리포솜을 포함하는 진단제 또는 치료제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 1종류 이상의 리포솜 형성물질; 에틸렌디시스테인(CD); 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜; 단반감기 금속방사성 핵종; N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민; 또는, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 물질을 포함하는, 본 발명에 의한 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜을 제조하기 위한 키트가 제공된다.
바람직하게는, 단반감기 금속방사성 핵종은99mTc 또는 그의 염이다.
(실험재료 및 방법)
1. 일반적 방법
99mTcO4 -용액은99Mo/99mTc 발생기(Ultra Techne Kow, 제 1 동위원소)의 생리식염수 용출액을 사용하였다. 착체 합성에 있어서의 생성물 확인은, 박층 크로마토그래피(TLC), 페이퍼 크로마토그래피(PC), 셀룰로스아세테이트 막전기영동법(EP) 및 역상고속액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하였다. TLC에는 머크(Merck)사의 실리카겔(Silica gel 60 F254)을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매(4:1)로 전개하였다. PC에는 와트만(Whatman)사의 여과지(No.1)를 사용하여 50% 아세트니트롤로 전개하였다. EP에는 전기영동 막으로 셀룰로스아세테이트막(SELECA-V, 도요료시가이샤), 완충액으로 베로날 완충액(pH=8.6, I=0.06, 나카라이테스크)을 사용하였고, 일정전류(1mA/cm)로 25분간 영동시켰다. RP-HPLC에는 칼럼으로 COSMOSIL C18-AR-300(4.6mm×150mm, 나카라이테스크)을 사용하였고, 여기에 프랙션 콜렉터(fraction collector, Pharmacia)를 연결하여 채취한 전체 분획을 감마 카운터(ARC-380M, Aloka)로 측정하였다. 표지 화합물의 분석은, 유속을 0.5ml, 이동상은 (A) 0.01M 인산 완충액(pH=7.0)과 아세트니트릴을 사용하여 아세트니트릴의 비율이 10분에서 0~100%가 되는 측정조건, (B) 0.0125M 인산 완충액(pH=2.5)과 아세트니트릴을 사용하여 아세트니트릴의 비율이 12분에서 0∼9%, 20분 내지 40분에서 9∼100%가 되는 측정조건으로 실시하였다.
2. CD 및 MRP20의 합성
N,N'-에틸렌디시스테인(ethylene dicysteine: CD)의 합성은 블론디유(Blondeau) 등의 방법에 준하여 실시하였다(참조: Blondeau et al.,Canadian J. Chem.45:49-52, 1967). L-티오프롤린(티아졸리딘-4-카르복실산, 도쿄가세이)의 암모니아 용액에 금속나트륨을 첨가해서 교반한 후, NH4Cl을 가하고 실온에서 하룻밤 교반하여 생성된 결정을 물에 용해시켜 염산으로 석출시켜서 수득하였다(수율23%, 융점 251-254℃).
N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민(MRP20)의 합성은 모건(Morgan) 등의 방법에 준해서 실시하였다(참조: Morgan et al.,Inorg. Chim. Acta190:257-264, 1991). 피롤-2-알데히드와 에틸렌 디아민을 아세트니트릴 중에서 하룻밤 교반한 후, 메탄올 용매 하에서 NaBH4로 환원시키고, 염기성 조건에서 클로로포름으로 추출하여 중간체를 수득하였다. 이어서 중간체와 아세틸아세톤을 아세트니트릴 중에서 교반한 후, 클로로포름으로 추출하여, 실리카겔 컬럼(용매는 초산에틸:메탄올=5:1)과 벤젠에 의한 재결정으로 정제하였다. 수율 15.9%, 융점 74-75℃(문헌에서의 값 75℃).
3. 99m Tc-HMPAO 및 99m Tc-MRP20의 합성
99mTc-HMPAO(99mTc-헥사메틸 프로필렌아민 옥심)은 일본 메지피직스로부터 공급되는 키트(Cerebrotec(등록상표), Nycomed Amersham International)에 의해 조제하였다. 키트에99mTcO4 -생리식염수 용액을 첨가하여 용해 직후에 사용하였다.
99mTc-MRP20은 MRP20의 에탄올 용액(17mM) 190㎕와 염화 제 1주석의 0.01N HCl용액(1.35M) 10㎕를 혼합하고, 여기에99mTcO4 -용액 200㎕를 가하여 실온에서 15분 방치한 것을 사용하였다.
수득한99mTc 착체(99mTc-HMPAO,99mTc-MRP20 및99mTc-CD)의 방사화학적 수율은 TLC, PC, EP, RP-HPLC에 의해 구하였다. 방사화학적 수율의 산출은, 건조 후의 HLC 플레이트, 여과지 및 셀룰로스아세테이트막을 5mm의 폭으로 절단하고 각 단편을 감마카운터로 측정하여, 각 플레이트상의 모든 방사능을 100%로 하였을 때의 각각의 Rf값에 의한 방사능의 비율을 구함으로써 시행되었다.
4. HMPAO 및 MRP20의 분배계수의 측정
옥탄올 500㎕와 pH 7.0의 HEPES 완충액 또는 pH 12.0의 Na2HPO4-NaOH 완충액 500㎕에, 생리식염수로 8mM이 되도록 조제한 HMPAO 또는 MRP20 용액을 20㎕ 첨가하여 교반 정치한 후, 옥탄올 층, 물 층의 흡광도를 측정하여 2착체의 지용성을 비교하였다.
5. 99m Tc 착체의 수용액 중에서의 안정성
99mTc-HMPAO와99mTc-MRP20의 수용액 중에서의 안정성을 비교하기 위하여,99mTc-HMPAO 수용액을 50mM 암모니아 완충액(pH 9.4)에서 최종 리간드 농도가 1mM이 되도록 희석시키고, 25℃ 또는 37℃의 욕조에서 정치시켜 일정시간(0.5, 2, 4, 8, 24시간) 후에 상술한 분석법에 의해 각각의 방사화학적 순도를 구하였다.99mTc-MRP20 수용액은 50mM 인산 완충액(pH 8.3)으로 희석시켜 같은 방식의 조작을 행하였다.
또한, 유리된 리간드 안정성에의 영향을 검토하기 위하여,99mTc착체 용액을 RP-HPLC로 정제하고, 100% 아세트니트릴 중에 용출된 정제99mTc착체 용액을 완충액으로 1:1의 비율로 혼합 희석시켜, 정제 전과 마찬가지로 착체의 방사화학적 순도의 시간변화를 조사하였다.
6. 99m Tc착체의 CD와의 배위자 교환반응성
CD를 1N NaOH로 66.7mM가 되도록 용해시킨 후, 완충액으로 10배로 희석시켜 2N HCl로 pH를 조정한 것을 CD 수용액으로 사용하였다. 전기 CD 수용액과99mTc-HMPAO 및99mTc-MRP20 용액을 3:1의 비율로 혼합하여 37℃로 30분간 정치시킨 후, EP에 의해 Tc-CD의 방사화학적 수율을 구하였다. CD를 희석시키는 완충액으로 pH 7.0 또는 pH 8.3의 HEPES 완충액 , pH 9.4 또는 10.5의 암모니아 완충액, pH 11.2의 인산나트륨 완충액(모두 50mM)을 사용하였다. CD 용액과99mTc-HMPAO 및99mTc-MRP20 용액을 혼합한 후의 CD 농도는 5mM, HMPAO 및 MRP20 농도는 2mM이었다.
7. 리포솜의 조제
나스형 플라스크에 클로로포름 2ml로 용해한 디스테알로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine(DSPC), 니혼유지)과 콜레스테롤(CH, Sigma)을 몰비 2:1(15μmol:7.5μmol)로 혼합시킨 후, 감압 하에 65℃로 용매를 증류 제거함으로써 플라스크 내벽에 지질의 박막을 형성시켰다. 감압 건조기(desiccator)에 옮겨 4시간 이상 감압 하에서 용매를 완전히 증류 제거한 다음, 거의 등장액인 봉입물질의 수용액을 가하고 65℃에서 지질을 팽윤시켜, 현탁액 형태로 다중막 리포솜(MLV)을 얻었다. 0.2㎛, 0.05㎛의 폴리카보네이트·멤브레인 필터(Nuclepore(등록상표), 노무라마이크로사이언스)를 이용해 순차적으로 가압 여과해서 단막 리포솜(SUV)을 수득하였다. 생성된 리포솜은 5% 만니톨 수용액으로 팽윤시킨 Bio-Gel A-1.5m(Bio-Rad)을 담체로 하는 겔 여과(에코노컬럼, 1×30cm, Bio-Rad)에 통과시키고, 5% 만토닐 수용액으로 용출시켜서 정제하였다. 이어서, 리포솜 용액을 400,000g, 20분 원심분리하고, 침전물을 생리식염수로 재현탁시켜서 리포솜 용액을 조제하였다.
8. 99m Tc-CD 봉입 리포솜의 제조
99mTc-CD 봉입 리포솜은 배위자 교환반응에 의해 제조하였다. CD를 생리식염수에 용해시키고, 2N NaOH로 pH를 11.8에 맞춘 5mM의 CD 용액 1.5ml를 상기한 방법으로 제조한 인지질의 박막에 첨가하여 리포솜을 조제한 후, 겔 여과로 미봉입의 CD를 제거하였다. 수득한 정제 리포솜 500㎕를 동량의 생리식염수로 희석시킨 후,99mTc-HMPAO 용액 및99mTc-MRP20 용액 140㎕를 여기에 첨가하고 37℃로 60분간 정치시켜99mTc-CD 봉입 리포솜을 얻었다. 반응용액을 원심분리하여 침전된 구획분을99mTc-CD 봉입 리포솜 구획분으로 하였다.
9. 99m Tc/GSH 리포솜의 제조
99mTc/GSH 리포솜은 종래의 방법에 준해서 제조하였다. GSH를 135mM NaCl/10mM HEPES 완충용액(pH 7.4)에 용해시키고, 2N NaOH로 pH6.7에 맞추어 50mM GSH 용액을 조제하였다. GSH 용액 1.5ml를 인지질의 박막에 첨가하여 리포솜을 조제한 다음, 겔 여과로 미봉입의 GSH를 제거하였다. 이어서99mTc-HMPAO 250㎕를 정제 리포솜 500㎕에 첨가하고 25℃로 40분간 정치시켜99mTc/GSH 리포솜을 수득하였다. 반응용액을 원심분리하여 침전시킨 구획분을99mTc/GSH 리포솜 구획분으로 하였다.
10. 99m Tc-CD 봉입 리포솜의 내용물의 분석
99mTc-HMPAO를 사용하여 조제한99mTc-CD 리포솜(99mTc-HMPAO-CD 리포솜) 및99mTc-MRP20을 사용해서 조제한99mTc-CD리포솜(99mTc-MRP20-CD리포솜)의 각 침전구획분에, 대략 250kBq/ml이 되는 양의 에탄올을 첨가하여 충분히 교반하고 20분 정치하여 지질막을 용해시켰다. 용출시킨 리포솜 내용물을 EP에 의해 분석하였다.
11. 정상마우스에 있어서의 체내 동태
99mTc-CD 봉입 리포솜 구획분 또는99mTc/GSH 리포솜 구획분을 인지질 농도 1.4∼1.8㎛ol/ml가 되도록 생리식염수로 희석시켰다. 각각의 리포솜 용액 0.1ml를 1군을 5마리로 하여, 5주령의 ddY계 수놈 마우스의 꼬리정맥에 투여하였다. 투여 10분, 1, 3, 6, 24시간 후에 단두로 도살한 후, 각 조직을 적출하여 장기의 중량 및 방사능을 γ선 검출장치로 측정하였다. 각 장기에 분포된 방사능은 투여한 양을 100%로 했을 때 각각의 장기 1g당의 방사능(% ID/g tissue)으로 표시하였다.
투여 24시간 후, 뇨 중의 방사능을 분석하였다. 채취한 뇨 300㎕를 원심여과용 필터(Microcon(등록상표), Millipore)에 부여해서, 4℃, 8,800rpm으로 15분간 원심분리하여 단백질을 제거한 다음, 0.45㎛의 시린지 필터로 여과시킨 것을 EP, RP-HPLC에 의해 분석하였다.
(결과)
1. 99m Tc 화합물의 화학적 성질
99mTcO4 -는, EP에서는 8.0cm 양극측으로 영동하였고, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로 전개하는 TLC에서는 Rf값 0.8 내지 0.9, 50% 아세트니트릴로 전개하는PC에서는 Rf값이 0.9 내지 1.0이었다.99mTcO4 -의 가수분해에 의하여 생기는99mTcO2는 EP, TLC 및 PC의 원점에 잔존한다고 생각된다.99mTc-CD는, EP에서는 6.0cm 양극측으로 영동하였고, RP-HPLC(B)에서는 22.0분 후에 용출되었다.99mTc-HMPAO는, EP에서는 원점으로부터 영동하지 않았고, TLC에서는 Rf값이 0.9이기 때문에, TLC Rf값이 0.9인 부근의 방사능의 비율로부터 EP에서 구해지는99mTcO4 -의 비율을 뺀 값을 방사화학적 수율로 하였다. RP-HPLC(A)에서의 유지시간은 16.9분이었다. 이어서 기술된 방법으로 합성한99mTc-MRP20은, EP에서는 원점으로부터 영동하지 않았고, PC에서는 Rf값이 0.8 내지 1.0이기 때문에, EP에서 원점에 잔존하는 방사능의 비율과 PC에서 원점에 잔존하는 방사능의 비율을 구함으로써, 방사화학적 수율을 산출하였다. RP-HPLC(A)에서의 유지시간은 18.1분이었다. 이들의 결과를 종합한 것(99mTc 화합물의 분석치)을 표 1에 나타낸다.
[표 1]99mTc화합물의 분석치
99mTcO4 99mTcO2 99mTc-CD 99mTc-HMPAO 99mTc-MRP20
TLC/CH3Cl+MeOH Rf치 0.8-0.9 0 - - 0.9
PC/50%CH3CNRf치 0.9-1.0 0 - 0.8-1.0 -
EP 영동거리(cm) 8.0 0 6.0-8.0 0 0
RP-HPLC(A)유지시간(분) 4-5 - - 18.1 16.9
RP-HPLC(B)유지시간(분) 4-5 - 22.0 - -
2. HMPAO 및 MRP20의 분배계수
옥탄올 층으로 이동한 HMPAO의 흡광도는 검출한계 이하였다. MRP20의 옥탄올 층의 흡광도와 물 층의 흡광도의 비는 완충액의 pH가 7.0인 때에 2.1±0.7, pH가 12.0인 때에는 5.0±1.6이었다.
3. 99m Tc-MRP20의 합성
통상의 조작으로 MRP20을99mTc로 표지한 경우, 부전하를 갖는 가수분해물이 50% 이상 생성되었고, 목적표지물의 수율은 35∼40%정도에 그쳤다. 여기서 용매인 에탄올과 염산을 6시간 이상 질소가스로 치환하고, 또한 주석·염산용액을 소량씩 반응용액에 첨가하였는 바,99mTc-MRP20이 81∼92%의 방사화학적 수율로 얻어졌다. RP-HPLC(A)에 의한 정제 후의99mTc-MRP20의 방사화학적 순도는 거의 100%였다.
4. 99m Tc 착체의 수용액 중에서의 안정성
99mTc-HMPAO와99mTc-MRP20의 양 착체용액을 RP-HPLC에 의한 정제 전과 정제 후로 나누어, 용액 중에 존재하는 각 착체의 방사화학적 순도의 시간변화를 조사하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
미정제의99mTc-HMPAO는 착체형성 후 30분에서 대략 40%까지 분해되었고, 그 후의 분해는 비교적 완만하게 진행되었다. 한편,99mTc-MRP20은 착체형성 후 2시간에서도 방사화학적 순도는 대략 70%였으며, 25℃에서 약 40%까지 분해가 진행된 것은 4시간 후였다. 정제 후에 37℃에서 양 착체 사이의 안정성은 큰 차이를 보이지 않았으나, 25℃에서는 역으로99mTc-HMPAO의 쪽이99mTc-MRP20보다도 안정되었다. 24시간 후에99mTc-MRP20은 6%까지 분해됨에 반해,99mTc-HMPAO의 방사화학적 순도는 59%였다.
5. 99m Tc 착체의 CD와의 배위자 교환반응성
99mTc-HMPAO와99mTc-MRP20의 양 착체를 RP-HPLC에 의해 정제하기 전후에 CD와의 배위자 교환반응성에 미치는 pH의 영향을 조사한 결과를 도 5에 나타내었다.
미정제의99mTc-HMPAO와 CD와의 교환반응에 있어서, 혼합용액의 pH가 상승함에 따라99mTc-CD의 수율이 증가하였고, pH 1.9에서는 수율은 57%였다. 또한 정제 후의 교환반응도 pH 11.9에서 수율이 74%에 달하였다.
99mTc-MRP20과 CD와의 교환반응성은 정제 전후에 모두99mTc-HMPAO보다 상당히 높았고, 측정범위 내의 pH에서는 90% 이상의99mTc-CD 수율을 나타내었다. 특히, 정제 후의99mTc-MRP20에서는 항상 95%이상의99mTc-CD 수율을 나타내었고, pH에 의한 영향은 발견되지 않았다.
6. 99m Tc 봉입 리포솜의 제조
99mTc를 봉입한 리포솜의 원심분리 후 상청(上淸)액을 채취하여, 침전물과 상청 각각의 방사능을 측정함으로써 봉입효율을 구하였다. 봉입효율은 침전물의 방사능을 침전물 방사능과 상청액 방사능의 합으로 나눈 값으로 하였다.99mTc-HMPAO를 사용한 배위자 교환반응에 의한99mTc-CD 봉입효율은 66.4%였으며,99mTc-MRP20를 사용한99mTc-CD의 봉입효율은 70.0%였다. 또한99mTc-HMPAO를 사용한 GSH 리포솜에서의 봉입효율은 75.1%였다.
99mTc-CD 봉입리포솜의 내용물을 분석한 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.99mTc-(HMPAO)-CD 리포솜,99mTc-(MRP20)-CD 리포솜 중 어느 쪽의 내용물도 EP에서는 주요 피크(peak)가 7.5cm 내지 8.0cm의 양극측에 나타났다. 그러나,99mTc-(HMPAO)-CD 리포솜은 내부에 존재하는 방사능 중에서99mTc-CD에 상당하는 피크가 54%에 그쳤다. 이에 반해,99mTc-(MRP20)-CD 리포솜의 내용물에 대하여 EP에서는 91.1%의 방사능이 양극측으로 6.5cm 영동하였고, RP-HPLC(B)에서는 거의 모든 방사능이 22.3분의 유지시간에서 용출되었다.
7. 정상 마우스에서의 체내 동태
99mTc-HMPAO 및99mTc-MRP20을 사용하여 표지한99mTc-CD 봉입 리포솜 및 비교대조가 되는99mTc/GSH 리포솜을 정상마우스에 정맥투여하였을 때의 체내 방사능동태를 도 8에 나타내었다. 전기 세 물질의 혈중으로부터의 소실은 동일 정도였으며, 투여 초기에는 간장이나 비장에의 방사능 집적에 큰 상이를 보이지 않았다. 그러나, 시간이 경과함에 따라99mTc/GSH 리포솜에서는 이들 장기에서의 방사능 집적 증가가 확인되었고, 6시간 후99mTc-CD 리포솜과의 차이가 현저하게 되었으며, 24시간 후에는 간장에 장기 1g당 투여방사능의 56%가 잔존하였다. 한편,99mTc-CD 봉입 리포솜에서 간장의 방사능은 투여 30분, 비장에서는 투여 3시간을 최고치로 하여 점차 시간이 흐르면서 감소하였다. 또한, 2종의99mTc-CD 리포솜을 비교하면,99mTc-MRP20-CD 리포솜은99mTc-(HMPAO)-CD에 비해, 특히 투여 6시간과 24시간에서 보다 신속한 방사능 소실을 나타내었다.
투여 24시간 후에 체외 배설된 방사능 양을 도 9에, 또한 뇨 중의 방사능을 분석한 결과를 도 10에 각각 나타내었다. 투여방사능 중 뇨중 배설된 방사능의 비율은99mTc-(HMPAO)-CD 투여군에서는 59%,99mTc-(MRP20)-CD 리포솜 투여군에서는 74%였다.99mTc-(MRP20)-CD 리포솜 투여 후에 배설된 뇨 중의 방사능은 그 중의 91.2%가 EP에서 양극측으로 6.0cm 영동하였고, RP-HPLC(B)에서는 유지시간 22.5분 후에 용출되었다.
(고찰)
리포솜의99mTc표지법으로 가장 일반적인99mTc-HMPAO와 글루타치온 내포 리포솜에 의한 봉입은 높은 효율의 봉입을 가능하게 한다. 그러나, 이와 같은99mTc 봉입 리포솜은99mTc-HMPAO의 환원적 분해물을 내포하고 있으며,99mTc 화합물이 가는 그물의 내피계에 축적됨으로써 생기는 비특이적 방사능 잔류가 화상정밀도 저하의 문제를 일으킨다. 한편, 직접 봉입에 의한99mTc-CD 리포솜의 제조는 봉입효율이 현저히 낮고 실용성이 떨어지지만, 리포솜에 내포되는99mTc-CD의 방사화학적 순도는 이론적으로 거의 100%이며, 실제로 마우스 투여 후에 투여방사능의 약 80%가 뇨중 배설되고, 비표적 조직으로부터의 신속한 방사능 소실을 나타내는 것이 앞서의 검토로부터 명백하게 되었다. 화상진단에의 응용을 고려하면, 종래의 표지법과 동등한 정도의 높은 방사화학적 수율에서도 직접봉입법에 필적하는 높은 방사화학적 순도가 동시에 달성될 필요가 있다.
본 실시예에서,99mTc-HMPAO 또는99mTc-MRP20을 사용한 배위자 교환반응에 의해99mTc-CD 봉입 리포솜을 제조하였는 바,186Re-CD 직접 봉입시에는 3.2%였던 봉입효율이 66% 내지 70%로 크게 향상되었다. 막투과성 착체로99mTc-HMPAO와99mTc-MRP20 중 어느 것을 사용해도 봉입효율에 큰 차이는 보이지 않았지만, 봉입 후 리포솜에 내포되는99mTc-CD의 방사화학적 순도에서는 현저한 차이가 확인되었다.99mTc-MRP20과 비교하였을 때99mTc-(HMPAO)-CD 리포솜 내의99mTc-CD 순도는 훨씬 낮다. 이것은99mTc-HMPAO의 가수분해물이라 여겨지는 부전하를 갖는 방사성 화합물의 생성이 원인이다. 배위자 교환반응에서는 출발물질이 되는 착체가 치환활성이 높고, 비교적 불안정일 필요가 있으며, 이 때문에 목적으로 하는 착체의 생성반응은 출발물질이 되는 착체의 분해반응과 경합적으로 진행한다. 어느 쪽의 반응이 우위로 진행하는가는 원료 착체의 안정성에 강하게 의존하지만, 착체 그 자체의 안정성만이 아니라 리포솜내 배위자의 농도도 중요한 인자라고 추측된다. HMPAO와 MRP20의 분배계수로부터 알려진 바와 같이, 유리 상태에서의 MRP20은 HMPAO보다도 훨씬 지용성이 높다. 막 외의 MRP20이 수동 확산에 의해 리포솜 막을 용이하게 투과함으로써, 리포솜 내부에 있어서도 높은 유리 MRP20 농도가 나타나며, 이와 같은 과잉의 유리 배위자의 공존이 착체가 가수분해되기 어려운 상태로 만들 가능성도 생각할 수 있다. 또한 착체로서의99mTc-MRP20 자체가99mTc-HMPAO보다도 안정성이 높고(참조: 도 4) CD와의 반응성이 높게 나타나며(참조: 도 5), 이들 요인이 CD와의 배위자 교환반응에 유리하게 작용하여 리포솜 내에서도 높은 순도로99mTc-CD가 생성된다고 사료된다.
리포솜 내부의99mTc-CD의 방사화학적 순도가 높을수록 간장이나 비장으로부터의 신속한 방사능 소실이 기대되기 때문에,99mTc-MRP20-CD 리포솜이 종래의99mTc 봉입 리포솜이나99mTc-HMPAO-CD 리포솜보다도 큰 폭으로 간장이나 비장에서의 방사능 잔류를 감소시킨 것은, 내부99mTc-CD 순도가 투여 후의 체내 방사능 분포에 큰 영향을 미친 결과라 생각된다. 이것은 투여방사능의 74%가 뇨중 배설되고, 그 중의 91%가99mTc-CD의 화학형으로 검출된 사실로부터도 지지된다. 이상의 결과로부터,99mTc-MRP20을 사용한 배위자 교환반응에 의해, 종래 문제되었던 비특이적 방사능의 잔류를 감소시키는99mTc-CD 봉입 리포솜의, 높은 방사화학적 수율로서의 제조가 가능함이 확인되었다. 본 발명의 봉입방법은 고정밀도의 화상진단을 가능하게 하는99mTc표지 리포솜의 제조에 유용하다. 또한, 본 발명의 봉입방법은 암의 내과용 방사선치료를 목적으로 하는 세포살상성의186/188Re표지 리포솜의 제조에 있어서도 기초를 부여할 것으로 기대된다.
막투과성 착체의99mTc-MRP20은 CD와의 배위자 교환반응에 의해99mTc-CD를 고수율로 부여할 수 있기 때문에, 본 발명에 의한99mTc-MRP20을 사용하는 배위자 교환반응에 의해 높은 방사화학적 수율 및 순도로99mTc-CD 봉입 리포솜을 제조하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 본 방법으로 제조한99mTc-CD 봉입 리포솜은 종래 문제되었던 간장이나 비장에서의 비특이적인 방사능 잔류를 크게 감소시킴이 밝혀졌다. 본 발명에 의하면,99mTc표지 리포솜을 사용한 화상진단의 정밀도를 향상시키는 것이 가능하게 되었다. 또한, 본 발명의 방법은 암의 내과용 방사치료를 목적으로 하는 세포 살상성의186/188Re표지 리포솜의 제조에도 응용 가능하다.

Claims (7)

  1. 단반감기(short half-life) 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시키는 단계를 포함하는, 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜의 제조방법.
  2. 99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시키는 단계를 포함하는,99mTc-에틸렌디시스테인(CD) 착체 봉입 리포솜의 제조방법.
  3. 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시킴으로써 제조되는, 단반감기 금속방사성 핵종 및 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜.
  4. 99mTc-N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체 및 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜을 혼합하여 정치시킴으로써 제조되는,99mTc-에틸렌디시스테인(CD) 착체 봉입 리포솜.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 기재된 리포솜을 포함하는, 진단제 또는 치료제.
  6. 1종류 이상의 리포솜 형성물질; 에틸렌디시스테인(CD); 에틸렌디시스테인(CD) 봉입 리포솜; 단반감기 금속방사성 핵종; N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민; 또는, 단반감기 금속방사성 핵종과 N-[2(1H-피롤릴메틸)]-N'-(4-펜텐-3-온-2)에탄-1,2-디아민과의 착체로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 1종류 이상의 물질을 포함하는, 제 1항에 기재된 단반감기 금속방사성 핵종과 에틸렌디시스테인(CD)과의 착체를 봉입한 리포솜을 제조하기 위한 키트.
  7. 제 6항에 있어서,
    단반감기 금속방사성 핵종은99mTc 또는 그의 염인 것을 특징으로 하는
    키트.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2489592A1 (en) * 2002-06-12 2003-12-24 Amato Pharmaceutical Products, Ltd. Inhibitor of anticancer drug side effect
US7552442B1 (en) * 2004-01-27 2009-06-23 Honeywell International Inc. Military data link integration apparatus and method
US7414137B2 (en) * 2006-03-23 2008-08-19 Inspire Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of 3,4-disubstituted-thiazolidin-2-ones
DE102009008885A1 (de) * 2009-02-14 2010-08-26 Fresenius Medical Care Deutschland Gmbh Vorrichtung zum Detektieren von Feuchtigkeit für eine Vorrichtung zur Überwachung eines Zugangs zu einem Patienten, insbesondere zur Überwachung des Gefäßzugangs bei einer extrakkorporalen Blutbehandlung
WO2010135714A2 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Methodist Hospital Research Institute Methods for modulating adipocyte expression using microrna compositions
CA2821024A1 (en) 2010-12-14 2012-06-21 Technical University Of Denmark Entrapment of radionuclides in nanoparticle compositions
JP5904484B2 (ja) * 2011-09-26 2016-04-13 国立研究開発法人国立がん研究センター Ｉｎ−１１１封入リポソームを含む放射性医薬組成物
CN104922069B (zh) * 2015-05-28 2019-04-09 燕山大学 一种纳米金球壳光敏脂质体及其制备方法
CN112967830B (zh) * 2021-02-01 2024-01-16 原子高科股份有限公司 一种β平面源制备方法和一种β平面源

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4925650A (en) 1988-11-16 1990-05-15 Mallinckrodt, Inc. Technetium -99m complex for examining the renal function
FR2655339B2 (fr) * 1989-04-19 1992-04-10 Medgenix Group Sa Composes et complexes utiles notamment en imagerie medicale.
DK1286704T3 (da) * 2000-06-02 2014-09-22 Univ Texas Ethylendicystein (EC)-glucose analoge konjugater
EP1478406B1 (en) * 2002-02-27 2011-01-05 PharmaIN Corporation Compositions for delivery of therapeutics and other materials, and methods of making and using the same

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