KR20040064054A - Strips and fluoresence scanner for the measurement of high sensitivity c-reactive protein in serum and whole blood - Google Patents

Strips and fluoresence scanner for the measurement of high sensitivity c-reactive protein in serum and whole blood Download PDF

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KR20040064054A
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안재순
최의열
장상호
오상욱
유진수
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Abstract

PURPOSE: Strips and fluorescence scanner for the measurement of high sensitivity C-reactive protein in serum and whole blood are provided, thereby rapidly detecting C-reactive protein, and easily and cheaply installing the strips and fluorescence scanner in small hospitals due to its small size. CONSTITUTION: A monoclonal antibody against C-reactive protein is provided, wherein the monoclonal antibody against C-reactive protein is mass produced by preparing the monoclonal antibody against C-reactive protein, producing a hybridoma cell line producing the monoclonal antibody against C-reactive protein, and selecting one monoclonal antibody having improved reaction to C-reactive protein. The strips for the measurement of high sensitivity C-reactive protein in serum and whole blood comprises a nitrocellulose membrane, a sample pad, an absorption pad which absorbs excessive sample; and a polystyrene support, wherein the nitrocellulose membrane contains a standard line containing a first fluorescence-labeled antibody and detection line containing a second fluorescence-labeled antibody.

Description

전혈 및 혈청용 고감도 씨-반응성 단백질 진단스트립 및 면역형광스캐너{STRIPS AND FLUORESENCE SCANNER FOR THE MEASUREMENT OF HIGH SENSITIVITY C-REACTIVE PROTEIN IN SERUM AND WHOLE BLOOD}STRIPS AND FLUORESENCE SCANNER FOR THE MEASUREMENT OF HIGH SENSITIVITY C-REACTIVE PROTEIN IN SERUM AND WHOLE BLOOD}

본 발명은 면역분석법을 이용한 C-반응성단백질의 정량적 측정방법 및 이 방법을 이용한 혈액 내에 저준위로 존재하는 C-반응성단백질의 검사방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, C-반응성단백질에 대한 단일클론 항체를 이용하여 측방유동 경합식 면역형광 크로마토그라피법을 사용하여 피검체의 액체시료와 반응시켜 그 결과를 전용 레이저 형광 판독기를 통하여 최저 수백pg/ml 농도까지 정량적으로 측정하는 방법; 상기 선별된 단일클론 항체와 형광으로 표지된 피검체를 사용하여 경합식 판별법으로 혈액이나 혈청시료 내에 존재하는 피검체를 정량하는 법과 선별된 단일클론 항체를 형광으로 표지하여 측정용 스트립 내부의 피검체에 대하여 경합식 판별법으로 혈액이나 혈청시료 내의 피검체를 정량적으로 측정하는 방법을 제공한다.The present invention relates to a method for quantitative determination of C-reactive protein using immunoassay and a method for testing C-reactive protein present in the blood at low levels using the method. More specifically, using monoclonal antibodies directed against C-reactive protein, they were reacted with liquid samples of subjects using lateral flow competing immunofluorescence chromatography and the results were reduced to several hundred pg / quantitatively measuring up to ml concentration; Using the selected monoclonal antibody and fluorescently labeled subjects, a method of quantitating a subject present in blood or serum samples by a competitive discrimination method, and a fluorescent substance labeled with the selected monoclonal antibody by fluorescent labeling. It provides a method of quantitatively measuring a subject in a blood or serum sample by a competitive discrimination method.

C-반응성단백질은 급성 염증반응을 측정하는 척도로써 30년 이상 사용되었다. 최근에는 혈청이나 뇌척수액에 존재하는 C-반응성 단백의 농도를 더욱 민감하게 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 개발되며 다양한 진단에 응용될 수 있도록 재평가 받고 있다. C-반응성 단백은 급성 염증반응이 일어날 때 간에서 합성되는 비정상적인 혈청 당단백질이다. C-반응성 단백은 염증반응이 나타남과 거의 동시에 극적으로 증가하고, 염증반응이 감소하거나 해소되면 빠르게 사라지므로, 현재 염증의 진행상황의 척도로 사용된다. 거기에 더하여 연속적인 시간대에 따른 C-반응성 단백 농도의 측정결과는 환자의 염증과정의 종료나 지속에 관련한 중요한 정보를 얻을 수 있는 수단이 된다.C-reactive protein has been used for more than 30 years as a measure of acute inflammatory response. Recently, a method for more sensitive and quantitative measurement of the concentration of C-reactive protein in serum or cerebrospinal fluid has been developed and is being re-evaluated for various diagnostic applications. C-reactive protein is an abnormal serum glycoprotein that is synthesized in the liver when an acute inflammatory reaction occurs. C-reactive protein is used as a measure of the progress of inflammation, since it increases dramatically almost simultaneously with the appearance of an inflammatory response and quickly disappears when the inflammatory response decreases or resolves. In addition, the measurement of C-reactive protein concentrations over time can provide important information on the termination or duration of the patient's inflammatory process.

C-반응성 단백은 급성 염증환자의 혈청에 칼슘이온이 있을 때 뉴모콕커스의 C-다당체와 반응하여 침전물을 만든다는 사실에서 C-반응성 단백질 (C-reactive protein, CRP)라고 명명되었다. 감염성과 비감염성의 모든 염증반응 및 몇몇 악성종양의 경우에서 혈청 내 C-반응성 단백의 증가는 일반적인 현상이다. 감염성과 비감염성의 경우에서 공히 C-반응성 단백이 비특이적으로 증가하기 때문에, C-반응성 단백 농도 그 자체만으로 특정 질병의 진단수단으로 쓰기에는 무리가 있다. 그렇지만, C-반응성 단백 농도의 측정은 환자의 전체 의료정보를 해석하는데 있어서 매우 유용한 정보를 제공해 줄 수가 있다.C-reactive protein was named C-reactive protein (CRP) in the fact that it reacts with C-polysaccharide of Pneumococcus when calcium ion is present in serum of acute inflammatory patients. In all infectious and non-infectious inflammatory reactions and some malignancies, an increase in serum C-reactive protein is a common phenomenon. Because C-reactive protein increases nonspecifically in both infectious and non-infectious cases, C-reactive protein concentration alone is not suitable for use as a diagnostic tool for certain diseases. However, measurement of C-reactive protein concentration can provide very useful information in interpreting the patient's entire medical information.

혈액이나 뇌척수액에 들어있는 C-반응성 단백 수치는 항상 병리학적 변화와 연관이 되어 있으므로, 염증과 관련된 진단, 처방 및 관찰에 중요하게 사용된다. C-반응성 단백은 염증반응의 진행을 조사함에 있어서 과거 사용되던 적혈구 침강율(ESR)이나 백혈구 숫자의 게수보다 더욱 정교하고 믿을만한 측정인자이다. 혈중 C-반응성 단백 농도는 동일한 상황에서 적혈구 침강율값보다 빠르게 증가하고, 상황이 종료되어 감소할 때도 적혈구 침강율 값이 정상치로 돌아오기 수 일 전에 이미 정상값에 도달한다. 혈청의 C-반응성 단백 측정은 환자가 호전되었는가, 악화되었는가, 합병증이 발생했는가 혹은 다른 문제가 생겼는가와 같은 물음에 답하기 위한 좋은 수단이 된다. C-반응성 단백의 증가는 다른 혈청 내 단백질이나 효소와는 달리, 다양한 원인이 있을지라도 항상 한가지 패턴으로 나타난다는 단점이 있다. 그러나, 매우 현격한 증가율을 보이는 특징 때문에 가장 최초로 측정할 수 있는 요소이기도 하다C-reactive protein levels in blood or cerebrospinal fluid are always associated with pathological changes and are therefore important for diagnosis, prescription and observation of inflammation. C-reactive protein is a more sophisticated and reliable measure of the progression of the inflammatory response than the number of erythrocyte sedimentation rates (ESRs) or white blood cell counts used in the past. The blood C-reactive protein concentration increases faster than the erythrocyte sedimentation rate value in the same situation, and reaches a normal value several days before the erythrocyte sedimentation rate value returns to normal even when the situation ends and decreases. Serum C-reactive protein measurement is a good way to answer questions such as whether the patient is improving, worsening, complications, or other problems. Unlike other proteins and enzymes in serum, the increase in C-reactive protein always appears in one pattern, even for a variety of causes. However, it is also the first measurable factor due to its very rapid growth.

C-반응성 단백량의 측정의 응용은 신생아의 세균성 감염, 신생아 패혈증, 뇌막염 등의 신생아 감염증 등 빠른 치료를 요구하는 병의 진단, 급성 맹장염, 폐렴, 임산부의 감염증 측정, 세균성 감염과 원생생물 감염, 비뇨기계 감염, 골수염 등의 다양한 감염성 질환의 추적 및 진단 보조의 역할을 할 수 있다. 또한, 류마티스성 관절염, 염증성 대장질환 등의 면역계통 관련 질환의 임상추적을 하거나, 외상, 수술 경과의 추적, 악성종양 치료 후의 생존성 예측인자로도 연구되고 있다. 최근에는 심장마비, 관상동맥질환, 뇌졸증 등의 예측인자로 C-반응성 단백이 연구되고 있다. 질병 수준이 아닌, 저준위의 C-반응성 단백은 항상 혈액 중에 존재한다. 이 저준위의 C-반응성 단백이 높은 그룹의 경우 낮은경우에 비하여 심근경색은 3배, 허혈성 졸증은 2배, 동맥경화는 4배나 높은 발병률을 나타낸다. 또한 고밀도 지질단백 콜레스테롤과 함께 C-반응성 단백을 측정시 임상적으로 유의하게 혈관 질환을 예측할 수 있었다.Applications of the measurement of C-reactive protein include the diagnosis of diseases requiring rapid treatment, such as bacterial infections of newborns, neonatal sepsis, meningitis, neonatal infections, acute appendicitis, pneumonia, maternal infections, bacterial infections and protozoal infections, urinary It can serve as a tracking and diagnostic aid for various infectious diseases such as mechanical infections, osteomyelitis and the like. In addition, clinical tracking of diseases related to the immune system, such as rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease, has been studied as a predictor of survival after trauma, surgery, and treatment of malignant tumors. Recently, C-reactive proteins have been studied as predictors of heart attack, coronary artery disease and stroke. Low levels of C-reactive protein, but not disease levels, are always present in the blood. This low-level group of high C-reactive protein showed a three-fold higher incidence of myocardial infarction, two-times of ischemic complications, and four-times of atherosclerosis. In addition, the measurement of C-reactive protein together with high-density lipoprotein cholesterol could significantly predict vascular disease.

이러한 필요성들에 의하여 C-반응성 단백을 검출할 수 있는 많은 방법들이 개발되어왔다. 라텍스 응집법은 C-반응성 단백 측정에 있어 가장 오래된 방법이며, 약 10mg/L 전후의 양에서 양성을 나타내는 정성적 방법이다. 이 방법은 C-반응성 단백이 검출 가능한 수치 이상 과량으로 존재할 경우에는 응집이 일어나지 않아 위음성의 결과를 보이기 때문에 위음성을 방지하기 위하여 수 개의 희석 혈청을 사용할 필요가 있는 단점이 있으며 희석률을 변화시켜 반정량화하여 농도범위의 설정은 가능하나 정확한 정량값을 낼 수 없는 단점을 가지고 있다.Due to these needs, many methods have been developed to detect C-reactive protein. Latex coagulation is the oldest method for measuring C-reactive protein and is a qualitative method that is positive in amounts around 10 mg / L. This method has the disadvantage of using several diluting serum to prevent false negatives, because when the C-reactive protein is present in excess of detectable levels, no aggregation occurs, resulting in false negatives. Although it is possible to set the concentration range by quantification, it has a disadvantage in that it is impossible to obtain accurate quantitative values.

단일클론 항체 제작기술이 발달하며 C-반응성 단백에 대한 고특이적 항체를 만들 수 있게 되었다. 이 고특이적 항체를 사용함으로 빠르고 특이적이며 매우 민감한 C-반응성 단백 측정법들이 나올 수 있었다. 가장 널리 쓰여온 네펠로메터법과 방사성면역검사법, 효소면역검사법, 방사선면역검사법 등을 포함한 새로운 면역측정법들은 다양한 임상환경에서 각광받고 있다. 기기 제작기술의 발달에 따라 네펠로메터법을 사용하는 대형 판독기의 경우, 현재는 수십 분의 시간 안에 정확한 정량값을 보일 수 있도록 발달하기도 하였으나, 대부분의 면역검사법 키트 - 엘리자, 리아 등- 은 결과를 얻기까지 최소 2시간 이상이 걸리는 단점이 있으며, 실험실 수준의 판독기가 필요하며, 전문적인 훈련을 받은 사람이 복잡한 실험과정을 거쳐서 결과를 얻어야 한다는 단점이 있다.The development of monoclonal antibody technology has led to the development of highly specific antibodies against C-reactive proteins. The use of these high specific antibodies has led to rapid, specific and highly sensitive C-reactive protein assays. New immunoassays, including the most widely used nephelometer, radioimmunoassay, enzyme immunoassay, and radioimmunoassay, are in the spotlight in various clinical settings. Due to advances in device manufacturing techniques, large readers using the Nephelometer method have now evolved to show accurate quantitation in tens of minutes, but most immunoassay kits (Eliza, Lia, etc.) The disadvantage is that it takes at least two hours to get a, a laboratory-level reader, and a professionally trained person to get the result through a complex experiment.

고감도 면역 현탁도측정법은 항원-항체반응에 의하여 시약의 현탁도가 증가하는 것을 측정하는 새로운 C-반응성 단백 측정법이다. 측정할 수 있는 최저 한계는 0.1mg/L 정도이며, 대형 화학분석기에 즉각 사용할 수 있게 만들어진 시약을 다양한 회사에서 판매하고 있다. 분석기기의 발달로 인하여 수 분에서 수십분 이내에 결과를 볼 수 있으며, 한번에 많은 시료를 처리할 수 있는 기기들이 나와있다. 그러나, 값비싸고 많은 공간을 차지하는 분석기기들은 현장탐지나 소규모 실험실에서는 사용하기가 힘들다. 또한 상기한 모든 방법들은 용혈, 고지질 혈청, 현탁성 혈청을 사용할 때 부정확한 결과를 낼 수 있으므로 이러한 시료를 사용하기에 어려움이 따른다.High sensitivity immunosuspension is a new C-reactive protein assay that measures the increase in suspension of reagents by antigen-antibody reactions. The lowest limit that can be measured is around 0.1 mg / L, and a variety of companies sell reagents that are ready for immediate use in large chemical analyzers. Due to the development of analyzers, the results can be viewed in minutes to tens of minutes and there are devices that can handle many samples at once. However, expensive and space-consuming analyzers are difficult to use in field detection or small labs. In addition, all of the above methods are difficult to use such samples because they may produce inaccurate results when using hemolysis, high lipid serum, or suspension serum.

많은 시간이 소모되는 면역효소법에 반하여, 면역크로마토그라피법을 이용한 간편진단 키트는 결과를 얻기까지 약 15분 가량의 짧은 시간이 소요되는 편리성 때문에 전혈, 혈청, 소변 등을 이용한 각종 감염성 질환이나 암, 환경호르몬 등의 진단이나 검출에 널리 응용되고 있다. 측방유동형 면역크로마토그라피법은 샌드위치형 엘리자법을 기본 원리로 하여, 주로 분석물-금입자 칸주게이트를 탐지자로 하여 방출패드에 흡수시켜 사용하는 방법을 사용한다. 시료에 검출물이 많이 포함되어 있으면 포획자와 결합한 탐지자의 양은 상대적으로 많아져서 검사선에는 금입자로 인한 강한 양성 반응이 나타나므로, 쉽게 검체의 유무를 판독할 수 있다. 이와 같은 측방 유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나 판단이 육안으로 이루어지는 까닭에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 따른다. 그렇기 때문에 대체로 분석물을 정량하기 보다는 단순히 정성을 위한 수단으로 주로 사용되고 있는 실정이다.In contrast to the time-consuming immunoenzyme method, the simple diagnosis kit using immunochromatography method takes about 15 minutes to obtain a result, which is convenient for various infectious diseases or cancers using whole blood, serum, and urine. It is widely used for diagnosis and detection of environmental hormones. The lateral flow immunochromatography method is based on the sandwich-type ELISA method, and mainly uses an analyte-gold particle conjugate as a detector and absorbs it into a release pad. If the sample contains a large amount of the detector, the amount of detector bound to the trap is relatively high, and the test line shows a strong positive reaction due to the gold particles, so that the sample can be easily read. The lateral flow analysis method is widely used in various fields such as pregnancy diagnosis, cancer diagnosis, microbial detection, and can be diagnosed very easily, but since the judgment is made with the naked eye, it is difficult to confirm the exact amount. Therefore, the situation is mainly used as a means for qualitative rather than quantifying the analyte.

본 발명은 종래의 탐지방법의 장점인 정확도와 정량성을, 빠른 시간 내에 검출이 가능한 간편진단키트의 장점과 조합함으로써, 엘리자 방법을 보완하거나 대체할 수 있으며, 시료를 채취한 그 장소에서 바로 검출 및 정량이 가능케 하며, 대형의 전용 판독기가 필요한 기존의 방식 대신, 소형의 이동형 장치를 사용함으로 현장진단의 측면과 소규모 실험실에서의 작업의 용이성을 높인다. 더욱 자세하게는측방유동 면역크로마토그라피법을 개량한 측방유동 형광면역 크로마토그라피법을 이용한 탐지 키트와 그 전용 레이저 형광판독기에 대하여 이며, 더더욱 자세하게는 상기한 방법을 통한 수백 pg/ml 수준에서의 혈액이나 혈청시료 내에 존재하는 C-반응성 단백의 정량방법을 의미한다.The present invention can complement or replace the Eliza method by combining the accuracy and quantitative advantages of the conventional detection method with the advantages of a simple diagnostic kit that can be detected quickly, and can be detected immediately at the place where the sample is taken. And quantitative, and instead of the traditional method of requiring a large, dedicated reader, the use of a small mobile device enhances field diagnostics and ease of operation in small laboratories. More specifically, the detection kit using lateral flow fluorescence immunochromatography with improved lateral flow immunochromatography and its dedicated laser fluorescence reader, and more specifically, the blood at several hundred pg / ml Means a method for quantifying C-reactive protein present in serum samples.

도 1은 본 발명에 따른 한 양태로써 측방유동 정량 스트립의 측면도이다.1 is a side view of a lateral flow metering strip in one embodiment according to the present invention.

1지지판 2샘플패드 3니트로셀룰로스 막 4탐지선 5기준선 6흡수패드1 support plate 2 sample pad 3 nitrocellulose membrane 4 detection line 5 baseline 6 absorption pad

도 2는 본 발명에 따른 한 양태로써 측방유동 정량 스트립의 평면도이다.2 is a plan view of a lateral flow metering strip in one embodiment according to the present invention.

도 3은 스트립을 하우징 내에 조립해 넣은 사진이다.3 is a photograph of the strip assembled into the housing.

도 4는 본 발명에 따른 레이저 형광 판독기의 원리를 나타낸 모식도이다.4 is a schematic diagram showing the principle of the laser fluorescence reader according to the present invention.

7레이저 8입사필터 9타원반사경 혹은 구면반사경 10탐지스트립 11공간필터7 Laser 8 Incident Filter 9 Ellipsoidal or Spherical Reflector 10 Detection Strips 11 Spatial Filter

12평행광학계 13광검출기 14형광필터12 Parallel Optical System 13 Photodetector 14 Fluorescence Filter

도 5는 본 발명에 따른 한 양태로써의 모식도이다.5 is a schematic view as one embodiment according to the present invention.

도 6은 도 5의 원리에 따른 스트립에 시료를 가하여 레이저형광판독기로 읽은 형광의 세기를 그래프화 한 것이다.6 is a graph illustrating the intensity of fluorescence read by a laser fluorescence reader by adding a sample to the strip according to the principle of FIG. 5.

도 7은 도 5의 원리에 따른 스트립의 유효 검출범위를 산출하기 위한 그래프이다.7 is a graph for calculating an effective detection range of a strip according to the principle of FIG. 5.

본 발명은 첫 번째로 C-반응성 단백에 대한 단일클론 항체를 제작하고, 이 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한 뒤, 이 하이브리도마 세포 배양액으로부터 얻은 항체들 중 C-반응성 단백에 대한 반응성이 우수한 단일클론 항체를 선발, 대량조제하여 측방 유동 형광면역 크로마토그라피 스트립과 정량키트를 제조하는 방법에 대해서이며, 두 번째로는 이 키트를 사용하여 C-반응성 단백을 정량할 수 있는 전용 판독기에 대한 내용을 제공한다.The present invention first prepared a monoclonal antibody against the C-reactive protein, a hybridoma cell line producing the monoclonal antibody, and then C-reactive protein among the antibodies obtained from the hybridoma cell culture. The present invention relates to a method for selecting and mass-producing monoclonal antibodies with high reactivity to prepare lateral flow fluorescence immunochromatography strips and quantitative kits. Second, the kit can be used to quantify C-reactive protein. Provides content for dedicated readers.

본 발명은 하기하는 실시예로 좀 더 구체적으로 예시될 것이다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 구현하기 위한 다양한 방법들 중 하나이며, 이로 인하여 본 발명을 제한하지 않는다.The invention will be more specifically illustrated by the following examples. However, the following examples are one of various methods for implementing the present invention, and thus do not limit the present invention.

<실험예 1>Experimental Example 1

구체적으로는, 본 발명에 사용된 단일클론 항체의 제작을 선행하였다. 단일클론 항체의 제작방법은 단일클론 항체 기술분야의 통상적인 방법을 사용하였다. 간략히 기술하여 C-반응성 단백 수용액을 동일한 부피의 완전 프로인트 면역보조제와 혼합, 유화시켜서 발브씨 계통의 생쥐의 복강에 주사하였다. 2~3주 정도의 간격을 두고 불완전 프로인트 면역보조제와 혼합한 항원을 2~3회 더 면역한다. 생쥐의혈액을 조금 채취하여 직접 엘리자 방법으로 C-반응성 단백에 대한 항체가 생성되었음을 확인하면 이 생쥐로부터 지라세포를 분리하여 하이브리도마 세포주를 만들 수 있는 림프종 세포주, 예를들어 에스피투오-에이쥐-14(SP2/o-Ag-14)와 융합시켜 무한 증식성을 가지며 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제작한다.Specifically, the preparation of monoclonal antibodies used in the present invention has been preceded. As for the preparation method of monoclonal antibodies, conventional methods in the monoclonal antibody art were used. Briefly, an aqueous C-reactive protein solution was mixed and emulsified with the same volume of the complete Freund's adjuvant and injected into the abdominal cavity of the Valb's line of mice. Immunize two or three times more antigens with incomplete Freund's adjuvant at intervals of two to three weeks. When a small amount of blood was collected from the mouse and confirmed that antibodies against C-reactive protein were produced by the direct Eliza method, lymphoma cell lines that can separate splenic cells from the mice to form hybridoma cell lines, e.g. Fusion with -14 (SP2 / o-Ag-14) produces a hybridoma cell line with infinite proliferation and producing the desired antibody.

<실험예 2>Experimental Example 2

C-반응성 단백와 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하기 위하여 96-웰 마이크로플레이트에 C-반응성 단백을 2ug/ml 농도로 카보네이트 완충액(pH 9.6) 에 희석하여 50ul씩 분주한다. 하룻밤동안 4도씨에서 피복시킨 후 피비에스-트윈20 완충액 (PBST)으로 씻어주었다. 비특이적 반응을 방지하기 위하여 5mg/ml 농도로 희석한 물고기 젤라틴 용액을 50ul/ml 가하여 1시간동안 상온에서 블러킹 시킨다. 피비에스-트윈20 완충액으로 3회 씻어준 후 하이브리도마 세포주 배양액을 50ul 가하여 2시간동안 상온에서 반응시킨다. 피복된 C-반응성 단백과 반응한 세포주 배양액에 있는 생쥐 유래 항 C-반응성 단백 항체는 염소 유래 항-생쥐 면역글로불린쥐-에취알피 표지 항체를 사용하여 티엠비 발색을 시킨다. 발색반응이 진행되고 15분 전후에 10mM 황산용액을 가하여 발색반응을 중단시킨 후 그 결과를 엘리자 판독기(Bio-Rad model 550)를 사용하여 가장 강하게 반응하는 배양액의 하이브리도마 세포주들을 선별하였다. 이 세포주들은 혈청내의 아밀로이드 피와 교차반응이 일어나지 않는 것들을 다시 선별하여 그 중 둘을 각각 1C1, 18C2로 명명하였다.To select hybridoma cell lines producing antibodies that bind to C-reactive protein, 50-ul aliquots of C-reactive protein were diluted in ugly carbonate buffer (pH 9.6) at 2 ug / ml in 96-well microplates. Covered overnight at 4 ° C. and washed with PB-Twin20 buffer (PBST). In order to prevent nonspecific reaction, 50 μl / ml of a fish gelatin solution diluted to 5 mg / ml was added and blocked at room temperature for 1 hour. After washing three times with PB-Tween 20 buffer, 50ul of hybridoma cell line culture solution was added and reacted at room temperature for 2 hours. Mouse-derived anti-C-reactive protein antibodies in cell line cultures reacted with coated C-reactive protein were developed for TMB development using goat-derived anti-mouse immunoglobulin-echialpi-labeled antibodies. After 15 minutes, the color reaction was stopped by adding 10 mM sulfuric acid solution about 15 minutes, and the result was selected by hybridoma cell lines of the culture medium that reacted most strongly by using Eliza reader (Bio-Rad model 550). The cell lines reselected those that did not cross-react with amyloid blood in the serum and named two of them 1C1 and 18C2, respectively.

<실험예 3>Experimental Example 3

원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 마우스 복강내에 주사하였다. 4~7일이 지나서 복수가 생성되면 주사바늘을 통하여 복수를 모았다. 이 복수를 황산암모늄 침전 후 단백질G 컬럼방법을 사용하여 항체를 분리하였다. 이를 인산염완충액에 투석하여 사용 전까지 냉동보관한다.Hybridoma cell lines producing the desired antibody were injected intraperitoneally. After 4-7 days, ascites were generated, the ascites was collected through a needle. After the ascites was precipitated by ammonium sulfate, the antibody was separated using the protein G column method. It is dialyzed in phosphate buffer and stored frozen until use.

<실험예 4>Experimental Example 4

단일클론 항체를 형광표지하기 위하여서 1M 염화 카보네이트 완충액 10 ul (pH 8.3)를 정제된 항 C-반응성 단백 단일클론 항체 18C2가 1mg/ml로 녹아있는 인산염 완충액 100ul와 혼합한다. 여기에 1 μl 의 형광물질인 알렉사 플루오 647(Alexa Fluor 647) 10 mg/ml을 가하여 4도씨에서 하룻밤 반응시킨다. 이를 세파덱스 쥐25(Sephadex G25) 컬럼을 사용하여 2500 rpm, 2분간 원심분리하여 표지되지 않은 여분의 형광물질을 제거한다.To fluoresce the monoclonal antibody, 10 ul of 1 M chloride carbonate buffer (pH 8.3) is mixed with 100 ul of phosphate buffer in which 1 mg / ml of purified anti-C-reactive protein monoclonal antibody 18C2 is dissolved. To this was added 1 mg of fluorescent substance Alexa Fluor 647 (10 mg / ml) and reacted overnight at 4 ° C. This was centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes using a Sephadex G25 column to remove excess unlabeled fluorescent material.

항-토끼면역글로불린G 항체의 형광표지 역시 상기한 방법에 준하여 제작하였다.Fluorescent labels of anti-rabbit immunoglobulin G antibodies were also prepared according to the method described above.

<실험예 5>Experimental Example 5

레이저 형광판독기에 적용하기 위한 분석용 스트립을 내장한 키트의 제작은 다음과 같다. 스트립의 주재료는 니트로셀룰로스막, 샘플패드, 흡수패드, 지지판으로 이루어져 있다 (도 1, 2). 폴리스티렌 지지판의 접착면에는 니트로셀룰로스 막, 샘플패드 및 흡수패드가 놓여진다. 얇은 플라스틱 필름으로 하부가 피복된 니트로셀룰로스 막(Millipore HF 180)이 탐지부위가 된다. 표준선과 탐지선은 이 탐지부위 안에 분주하게 된다. 표준선은 토끼 면역글루불린 G를 0.35ug/ml 농도로 하여 분주하였으며, 탐지선은 항 C-반응성 단백 1C1을 0.45ug/ml 농도로 분주하였다. 두 선은 샘플패드로부터 탐지선은 30.5 mm, 표준선은 33 mm 위치에 분주기를 이용하여 1mm의 굵기로 cm 당 1ul의 부피를 분주하였다.The fabrication of a kit containing an analysis strip for application to a laser fluorescent reader is as follows. The main material of the strip consists of a nitrocellulose film, a sample pad, an absorption pad, and a support plate (Figs. 1 and 2). On the adhesive side of the polystyrene support plate is placed a nitrocellulose membrane, a sample pad and an absorbent pad. The nitrocellulose membrane (Millipore HF 180) covered with a thin plastic film is the detection site. Standard lines and detection lines are divided into these detection areas. Standard lines were dispensed with rabbit immunoglobulin G at a concentration of 0.35 ug / ml, and detection lines were dosed with 0.45 ug / ml of anti-C-reactive protein 1C1. Two lines were dispensed at a volume of 1 ul per cm with a thickness of 1 mm using a divider at a position of 30.5 mm and a standard line of 33 mm from the sample pad.

샘플패드(S&S 903, 4X25mm)를 니트로셀룰로스 막에 위치시키기 전에 전처리 과정으로 샘플패드를 1% 소혈청알부민, 0.05% 트윈 20 이 녹아있는 인산염 완충액에 완전히 적셔준다. 이를 50도씨의 진공건조기에서 1시간 동안 수평을 유지하며 건조시킨다. 흡수패드(S&S 470 4X20mm)는 니트로셀룰로스 막의 끝부분에 위치시킨다. 지지판 위에 조립이 끝난 스트립은 전용 형광 판독기에 삽입되도록 디자인 된 플라스틱 하우징에 넣어 키트의 조립을 마친다 (도 3). 판독부분에는 장방형의 창이 나 있고 시료 투입구는 15mm 지름의 원형으로 구성되어 있으며 깊이는 5mm로 약 100 ul의 시료를 넣을 수 있는 부피이다. 이 키트의 시료 투입구에 검체와 탐지액을 혼합하여 탐지를 개시한다.Before placing the sample pad (S & S 903, 4 × 25 mm) onto the nitrocellulose membrane, pre-treat the sample pad thoroughly in phosphate buffer containing 1% bovine serum albumin and 0.05% Tween 20. This is dried for 1 hour in a 50 degree vacuum dryer. An absorbent pad (S & S 470 4 × 20 mm) is placed at the end of the nitrocellulose membrane. The assembled strip on the support plate is placed in a plastic housing designed to be inserted into a dedicated fluorescent reader to complete the assembly of the kit (FIG. 3). The reading part has a rectangular window, the sample inlet is composed of a 15mm diameter circle, and is 5mm deep and can hold about 100ul of sample. Initiate detection by mixing the sample and detection fluid in the sample inlet of the kit.

<실험예 6>Experimental Example 6

본 발명의 레이저 형광판독기는 레이저, 여기필터(exciter filter),타원반사경 또는 구면경, 표면형광이 발광되는 시료 제어 수단, 공간필터, 평행광학계, 형광필터 및 광검출기로 구성된다.The laser fluorescent reader of the present invention is composed of a laser, an exciter filter, an elliptical reflector or spherical mirror, a sample control means for emitting surface fluorescence, a spatial filter, a parallel optical system, a fluorescent filter, and a photodetector.

도 4는 본 발명에 따라 타원반사경, 또는 구면경의 제1초점에 집속된 입사광선과 시료를 배치하고 제2초점에 집속된 후 발산하는 형광을 평행광으로 가공하여 표면형광을 검출하는 시스템을 보여준다. 레이저는 특정 형광단의 여기 밴드 최대치와 일치하는 파장을 방출한다. 한 가지 양태로서, 레이저(7)은 형광물질 표지 Alexa의 흡수 최대치에 근접하는 파장 594 nm에서 방출하는 2 mW He-Ne 레이저이다. 예를 들면, He-Ne 레이저 모델 05 LYR 173(캘리포니아 어어빈 소재 Melles Griot 제품)을 레이저로 사용할 수 있다. 레이저(7)의 빛은 입사필터(8)를 통과하고 입사필터와 탐지 스트립(10)사이에 배치되어 있는 타원반사경(9)의 중간 지점에 위치한 구멍을 통과한다. 이때 레이저의 빛이 입사필터(8)를 지나 타원반사경(9)의 구멍을 적절히 통과할 수 있도록 레이저, 입사필터와 타원반사경은 일렬로 나란히 배치되는 것이 바람직하다. 타원반사경을 통과한 빛은 탐지스트립(10)에 고정되어 있는 시료면에 적절한 크기로 집속된다. 시료는 빛이 최적으로 집속될 수 있도록 제어 수단에 의하여 위아래 혹은 전후(지면에 수직한 방향)로 이동하여 위치를 변경할 수 있다. 이 집속점은 타원반사경(9)의 제1초점에 위치하고 있다. 제1초점에서 발광된 형광과 입사광의 산란광은 타원반사경(9)에 의해 반사되어 타원거울의 제2초점으로서 공간필터(11)로 집속된다. 공간필터는 시료의 표면에 위치한 먼지 등에 의한 노이즈(noise)를 제거하는 작용을 한다. 그러나, 공간필터는 사용하지 않을 수 있다. 공간필터를 통과한 빛은 평행광학계(collimator)(12)에 의하여 평행광으로 변형된다. 만일 공간필터를 사용하지 않은 경우는 타원거울의 제2초점이 평행광학계가 되어 이곳으로 집속되고 바로 평행광으로 변형된다. 평행광학계를 지나면서 형성된 평행광은 형광필터(14)를 지나면서 산란광은 걸러지고 순수한 형광성분만이 광검출기(13)로 입사한다.FIG. 4 shows a system for detecting surface fluorescence by arranging incident light and a sample focused on an ellipsoidal mirror or spherical mirror and processing a fluorescence emitted after being focused on a second focal point in parallel light according to the present invention. . The laser emits a wavelength that matches the excitation band maximum of a particular fluorophore. In one embodiment, the laser 7 is a 2 mW He-Ne laser that emits at a wavelength of 594 nm near the absorption maximum of the phosphor labeled Alexa. For example, a He-Ne laser model 05 LYR 173 (Melles Griot, Irvine, Calif.) May be used as the laser. The light of the laser 7 passes through the incident filter 8 and passes through a hole located at an intermediate point of the elliptical reflector 9 which is arranged between the incident filter and the detection strip 10. At this time, the laser, the incident filter and the ellipsoidal mirror are preferably arranged side by side so that the light of the laser can properly pass through the hole of the elliptical reflector 9 through the incident filter 8. The light passing through the ellipsoidal reflector is focused to an appropriate size on the sample surface fixed to the detection strip 10. The sample may be moved up and down or back and forth (direction perpendicular to the ground) to change the position by the control means so that the light can be optimally focused. This focusing point is located at the first focal point of the elliptical reflector 9. The fluorescence emitted from the first focus and the scattered light of the incident light are reflected by the ellipsoidal reflector 9 and focused on the spatial filter 11 as the second focus of the elliptical mirror. The spatial filter serves to remove noise caused by dust and the like located on the surface of the sample. However, the spatial filter may not be used. Light passing through the spatial filter is transformed into parallel light by a collimator 12. If the spatial filter is not used, the second focus of the elliptical mirror becomes a parallel optical system, focuses on it, and is immediately transformed into parallel light. The parallel light formed while passing through the parallel optical system passes through the fluorescence filter 14 and the scattered light is filtered and only the pure fluorescent component is incident to the photodetector 13.

표준선의 내부표준 형광의 세기와 탐지선의 형광의 세기는 면적비로 환산되며, 이 면적비는 표준곡선과 대비되어 농도값으로 환산된다.The intensity of the internal standard fluorescence of the standard line and the fluorescence of the detection line are converted into area ratios, and the area ratios are converted into concentration values in comparison with the standard curves.

<실험예 7>Experimental Example 7

탐지액의 조성은 하나의 예로써 발명품의 성능개선을 위하여 변형될 수 있으며, 이 예로 인하여 발명의 범위를 제한하지 않으며 오히려 광범위하게 해석할 수 있을 것이다.The composition of the detection liquid may be modified to improve the performance of the invention as an example, and this example does not limit the scope of the invention and may be broadly interpreted.

탐지액은 1차 탐지항체로써 형광표지 된 항 C-반응성단백 단일클론 항체 18C2 (2.4ng/ml)과 내부표준물질인 형광표지된 항 토끼면역글로불린G (16mg/ml)을 인산염 완충액에 녹여서 사용한다. 10ul의 전혈, 혹은 5ul의 혈청과 70ul의 완충액을 혼합하여 샘플투입구에 가한 후 12 분 후 레이저형광 판독기를 통하여 탐지선과 표준선에서의 형광의 세기를 면적값으로 환산하였다. 탐지선에서의 면적값을 AT, 표준선에서의 면적값을 AC로 하였다. AT/AC의 비는 마이크로소프트 액셀 프로그램을 사용하여 표준곡선과 함께 대비하여 정량하였다.The detection solution was prepared by dissolving fluorescently labeled anti-C-reactive protein monoclonal antibody 18C2 (2.4ng / ml) and fluorescently labeled anti-rabbit immunoglobulin G (16mg / ml) as a primary detection antibody in phosphate buffer. do. 10 ul of whole blood, or 5 ul of serum and 70 ul of buffer were added to the sample inlet, and after 12 minutes, the intensity of fluorescence at the detection line and the standard line was converted to the area value by a laser fluorescence reader. The area value at the detection line was A T and the area value at the standard line was A C. The ratio of A T / A C was quantified against the standard curve using the Microsoft Excel program.

도 5는 상기한 방식으로 스트립에서 피검체가 탐지되는 과정의 모식도이다. 이 방식의 키트를 사용하여 각각 다른 농도의 검체를 판독한 형광의 세기를 그래프화 하여 도 6으로 나타내었으며, 도 7은 표준곡선에 따른 형광의 양을 나타낸 도표이다. 형광의 세기는 100pg/ml 부터 10000pg/ml까지 일관성 있게 증가함을 볼 수 있다. 더 자세한 실험에 의하면 이 키트의 유효 측정 범위는 133pg/ml 부터 10000pg/ml 이며 측정 하한선은 133pg/ml이다. 현재 판매되고 있는 저준위 C-반응성 단백 측정용 시약들의 측정범위가 대개 100pg/ml~20000pg/ml 수준인 것에 비교해 보아 충분히 기존 제품과 경쟁이 가능하리라 예상된다. 도 7에서 유도한 표준곡선식은 Y=0.020+0.572X 이며, 회귀계수 R은 0.997이다.5 is a schematic diagram of a process of detecting a subject in a strip in the above-described manner. The intensity of fluorescence reading samples of different concentrations using this kit was graphed, and FIG. 7 is a chart showing the amount of fluorescence according to a standard curve. It can be seen that the intensity of fluorescence is consistently increased from 100 pg / ml to 10000 pg / ml. More detailed experiments show that the kit has a valid measurement range of 133 pg / ml to 10000 pg / ml and a lower limit of 133 pg / ml. It is expected that the low-level C-reactive protein assay reagents on the market are generally in the range of 100 pg / ml to 20000 pg / ml. The standard curve derived from FIG. 7 is Y = 0.020 + 0.572X, and the regression coefficient R is 0.997.

본 발명에 따른 저준위 C-반응성 단백 검출용 측방 유동 면역형광 키트는 혈액이나 혈청 내에서 빠른 시간 안에 염증의 표지인자이자, 차세대 심혈관 질환 예측인자인 C-반응성 단백을 검출할 수 있으며, 엘리자키트나 대형 혈액학 분석기와는 달리 키트 및 주변기기의 이동성이 뛰어나므로 대형 기기나 정밀한 실험기구를 다량 갖출 수 없는 소형 병, 의원이나 보건소 등에서 의뢰 없이 직접 혈액이나 혈청 내의 C-반응성 단백을 검사할 수 있는 장점을 가지고 있으므로 실무적으로 다양한 부문에서 사용할 수 있을 것으로 기대된다.Lateral flow immunofluorescence kit for detecting low-level C-reactive protein according to the present invention can detect C-reactive protein, which is a marker of inflammation and predictor of next-generation cardiovascular disease in blood or serum in a short time. Unlike large hematology analyzers, kits and peripherals are highly mobile, so they can directly test C-reactive proteins in blood or serum without request from small bottles, clinics, or public health centers that do not have large devices or precise laboratory equipment. It is expected to be used in various sectors in practical terms.

Claims (11)

피검체가 포함된 유체를 수송할 수 있으며, 혈구를 제거할 수 있는 다공성 재질의 패드와 여분의 시료를 흡수할 수 있는 패드, 탐지영역인 크로마토그라피성 막을 주재료로 한 스트립을 포함하여 탐지영역 내에 탐지선과 표준선을 두어 샌드위치 방식으로 탐지액 내의 표지된 1차 탐지항체와 결합한 피검체를 탐지선에 고정된 2차 탐지항체로 포획하고 내부표준물질을 직접 방식으로 표준선에 포획하는 측방 유동형 크로마토그라피 키트와 이를 판독하는 판독장치.Within the detection area, including a pad made of a porous material capable of transporting a fluid containing a subject, a pad capable of removing blood cells, a pad capable of absorbing extra samples, and a strip mainly composed of a chromatographic membrane, which is a detection area. Lateral flow chromatography that captures a subject combined with a labeled primary detection antibody in a detection solution by sandwiching a detection line and a reference line with a secondary detection antibody fixed to the detection line, and capturing the internal standard directly to the standard line. Graphi kit and reader for reading it. 제 1항에 있어서 1차 탐지항체와 내부표준물질을 형광으로 표지한 장치The device of claim 1, wherein the primary detection antibody and the internal standard are labeled with fluorescence 제 1항에 있어서 피검체가 혈액이나 혈청 내에 존재하는 C-반응성 단백인 장치The device of claim 1, wherein the subject is a C-reactive protein present in blood or serum. 제 1항에 있어서 피검체의 최소 탐지한계가 수백pg/L인 장치The device of claim 1, wherein the minimum detection limit of the subject is several hundred pg / L. 제1항에 있어서, 탐지항체로써 항 C-반응성 단백 염소항체, 토끼항체, 생쥐항체를 포함하는 것인 혈액이나 혈청 내의 C-반응성 단백을 정량하는 방법The method of quantifying C-reactive protein in blood or serum according to claim 1, wherein the detection antibody comprises an anti-C-reactive protein goat antibody, rabbit antibody, or mouse antibody. 제 1항에 있어서 탐지선과 표준선에 나타나는 신호의 세기를 면적비로 환산하여 그 양을 비례식으로 정량하는 장치The apparatus of claim 1, wherein the intensity of the signal appearing in the detection line and the standard line is converted into an area ratio, and the amount is proportionally quantified. 제 1항과 6항에 있어서 신호를 유발하는 물질이 형광물질인 장치Apparatus according to claim 1 or 6, wherein the substance causing the signal is a fluorescent substance 제 1항과 6항에 있어서 신호를 읽어들이는 기기가 광검출기인 장치Apparatus according to claim 1 and 6, wherein the device for reading out signals is a photodetector. 제 1항과 6항에 있어서 탐지액에 1차 포획항체로 피검체에 특이적인 단일클론항체를 사용하며, 탐지선에 1차 포획항체 특이적인 항체를 고정화 시킨 장치.The device according to claim 1 or 6, wherein a monoclonal antibody specific to the subject is used as the first capture antibody in the detection liquid, and the first capture antibody specific antibody is immobilized on the detection line. 제 9항에 있어서 탐지액에 1차 포획항체로 피검체에 특이적인 생쥐 유래 단일클론항체를 사용하며, 탐지선에 생쥐 면역글로불린 특이적인 항체를 고정화 시킨 장치.The device according to claim 9, wherein a mouse-derived monoclonal antibody specific for the subject is used as the first capture antibody in the detection liquid, and the mouse immunoglobulin-specific antibody is immobilized on the detection line. 제 1항에서 탐지용 스트립 내부가 아닌, 탐지액에 포획항체를 첨가하여 보존성을 높인 장치Device to increase the retention by adding capture antibody to the detection liquid, not inside the detection strip of claim 1
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