KR20040063264A

KR20040063264A - 효모를 이용한 광학활성 (ｒ)-2-클로로만델릭산 및 그에스테르 유도체의 제조방법

Info

Publication number: KR20040063264A
Application number: KR1020030000620A
Authority: KR
Inventors: 김종근; 조남륜; 홍준배
Original assignee: 에스케이 주식회사
Priority date: 2003-01-06
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2004-07-14
Also published as: KR100651338B1

Abstract

본 발명은 효모(Baker's Yeast)를 이용한 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 ((R)-2-chloromandelic acid) 및 그 에스테르 유도체의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 인산 버퍼 용액 존재하에서 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트(Alkyl 2-Chloro-benzoylformate)를 효모(Baker's yeast)를 이용하여 선택적으로 환원하는 생물학적 방법에 의한 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법은 가격이 저렴하고 구하기 쉬운 효모를 사용하여 제조공정이 간단하고 경제성이 뛰어나며, 광학순도 및 수율이 높아 산업상 매우 유용하다.

Description

효모를 이용한 광학활성 (Ｒ)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 유도체의 제조방법{Method for preparing optically active (R)-2-chloromandelic acid and its ester derivatives using Baker's Yeast}

본 발명은 효모를 이용한 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 ((R)-2-chloromandelic acid) 및 그 에스테르의 제조방법에 관한 것으로, 좀 더 상세하게는 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트(Alkyl 2-Chloro- benzoylformate)를 버퍼(buffer) 용액에 용해시킨 후, 빵을 만들 때 사용하는 효모(Baker's yeast)를 작용시켜 케톤(ketone)기를 (R)-폼의 알코올로 비대칭 환원(asymmetric reduction)시키는 생물학적 방법에 의한 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 화합물은 혈전방지제로 사용되는 플라빅스(Plavix)의 합성에 필요한 중간체로 사용되고 있다. 플라빅스(Plavix)는 1998년 사노피(Sanofi)사에 의해 출시된 혈전방지제로서 화학명은 (S)-클로피도그렐 바이설파이트((S)-Clopidogrel bisulfate)이며, 하기 화학식 1로 표시된다.

1989년 사노피(Sanofi)사가 발표한 (S)-클로피도그렐 바이설파이트의 제조방법(미국특허 제4,847,265호)을 보면, 사노피사는 라세믹체의 2-클로로만델릭산(2-chloromandelic acid)에 테트라하이드로시에노[3,2-c]피리딘 (tetrahydrothieno[3,2-c]pyridine)을 도입한 후에 캄포설포닉산(camphorsulfonic acid)을 사용한 화학분할(chemical resolution)을 통하여 광학활성의 (S)-클로피도그렐 바이설파이트를 제조하였다. 이 방법의 경우 반응의 후단에서 화학분할을 수행함으로써 수율 및 경제성이 떨어지는 단점이 있다.

중간체로서 광학활성의 (R)-2-클로로만델릭산을 얻는 방법으로는 화학분할, 비대칭 촉매(asymmetric catalysis) 또는 효소분할(enzymatic resolution) 등이 있다. 2001년 노다 히로부미(NODA hirobumi) 등이 발표한 일본 특허공개 제2001-072644호에서는 (R)-N-벤질-1-페닐에틸아민((R)-N- benzyl-1-phenylethylamine)을 분할제(resolving agent)로 사용하여 라세믹 2-클로로만델릭산의 부분입체이성질체 염(diastereomeric salt)을 만들고 이를 재결정 과정을 통하여 부분입체이성질체 순도(diastereomeric excess)로 99.0%의 순수한 염(salt)으로 만들었다. 이때의 수율은 90.4%를 나타내었다. 이렇게 만들어진 부분입체이성질체 염을 산성화를 통하여 (R)-2-클로로만델릭산으로 만들었는데 이때 광학순도는 100% e.e. 였으며, 수율은 90%를 나타내었다. 그러나 이 방법은 이론상 수율이 50%을 넘지 못하고 재결정 과정을 필요로 하는 단점이 존재한다.

2002년 노쓰 마이클(NORTH MICHAEL) 등은 국제공개특허 WO 02-10095호에서 키랄 리간드(Chiral ligand)를 가진 촉매를 이용하여 광학활성의 (R)-2-클로로만델릭산을 합성하는 방법을 발표하였다. 이 방법은 살렌(salen) 계열의 키랄 리간드와 Ti를 사용하여 2-클로로벤즈알데하이드의 시안산화(cyanation)와 아세틸화(acetylation)을 이용한다. 88.6%의 수율로 얻어진 (R)-O-아세틸-시아노히드린((R)-O-acetyl-cyanohydrin)은 88.3%의 e.e.를 가지는데, 이의 가수분해를 통하여 (R)-2-클로로만델릭산을 제조한다. 이렇게 얻어진 (R)-2-클로로만델릭산를 시드(seed)로 사용하는 재결정 과정을 통하여 99% e.e.의 (R)-2-클로로만델릭산을 얻는다. 이 방법은 화학분할방법에 비하여 이론 수율이 높지만, 비대칭 반응을 수행하는 반응온도가 -42℃를 유지해야 하고 재결정 과정을 여러 번 반복해야 하는 단점이 있다.

시아노히드린은 효소 반응에서도 이용이 되는데, 2001년 디버사(Diversa)(Co.)는 유럽공개특허 제1242589호와 국제공개특허 WO 01-48175호에서 니트릴라제(nitrilase)를 사용한 시아노히드린의 가수분해와 연속적인 라세믹화(racemization)를 통하여 98% e.e.로 (R)-2-클로로만델릭산을 제조하는 방법을 발표하였다. 이때 사용한 니트릴라제는 디버사의 직접진화(Direct evolution) 기술을 사용하여 만든 효소로서, 이 방법 역시 화학분할방법에 비하여 수율이 높지만, 새로 만든 효소의 대량생산 등 해결해야 하는 과제가 많아 당장 상업화하기에는 어려운 단점이 있다.

따라서, 상기와 같은 이유로 간단한 공정을 이용하여 경제적으로 우수하며, 광학순도가 높은 광학활성의 (R)-2-클로로만델릭산 또는 그 에스테르 유도체를 생산할 수 있는 공정의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 위에서와 같은 문제점을 해결하면서 경제적인 제조공정을 개발하고자 출발물질로 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트(alkyl 2-chloro-benzoylformate)를 사용하고, 값싸고 쉽게 구할 수 있는 효모를 이용한 α-케토(keto) 에스테르의 비대칭 환원반응이라는 간단한 제조 공정으로 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 화합물을 제조하는 방법을 개발하였으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다. 상기 비대칭 환원반응은 이론 수율이 100%로서 효소 또는 화학 분할(이론 수율 50%)에 비해 월등히 높은 생산성을 획득할 수 있고, 또한 효모(Baker's Yeast)는 쉽게 구할 수 있을 뿐만 아니라 가격이 매우 싸기 때문에 기존 방법에 비해 경제적인 제조 공정의 개발이 가능하다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모라는 미생물을 이용하여 제조공정이 비교적 간단하고, 친환경적 공정이면서 시간당 생산 효율이 증가되어 경제적인 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트로부터 광학활성의 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 화합물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 제조 방법은 인산 버퍼 용액 존재 하에서, 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트를 효모로 선택적으로 환원 반응시키는 것으로 구성된다.

이하 본 발명을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

전술한 바와 같이, 본 발명에서는 효모에 의한 비대칭 환원반응의 기질로 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트를 사용하였는데, 이 화합물은 라세믹 2-클로로만델릭산을 HCl 존재하에서 용매로 사용하는 다양한 알코올과의 반응으로 라세믹 알킬 2-클로로만델레이트로 만들고, 이를 NaOCl과 염화벤질트리에틸암모늄과 같은 상전이 촉매를 이용한 산화반응을 통하여 제조된다.

이렇게 제조된 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트를 pH 6∼8의 인산 버퍼 용액에 넣고 효모를 별도의 처리 공정 없이 첨가한 다음, 상기 반응 혼합물을 20∼37℃의 온도에서 100∼300rpm으로 교반시켜 α-케토 그룹(keto group)을 선택적으로 환원 반응시킴으로서 광학활성을 갖는 알킬 (R)-2-클로로만델레이트를 제조한다.

본 발명의 비대칭 환원반응 공정은 하기 반응식 1과 같다.

여기서, R은 저급 알킬기, 바람직하게는 메틸기, 에틸기 또는 부틸기, 좀더 바람직하게는 메틸기이다.

본 발명에 사용되는 바람직한 효모는 사카로미케스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) Type II로서 직접 배양하여 사용할 수도 있으며, 시그마사와 같은 시약회사 또는 많은 효모 생산 회사에서 제품으로 나와 있으므로 구매하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 효소 반응 온도는 20∼37℃가 바람직하며, 반응 온도가 낮아질수록 반응 속도가 떨어지고 반응온도가 높아질수록 생성물의 광학순도가 떨어져 최적온도는 30℃ 정도인 것으로 나타났다. 또한 효소 반응시의 pH는 pH 6∼8의 범위가 적정한 것으로 나타났는데, pH가 6.0 미만일 경우에는 반응이 일어나지 않았고, pH가 8.0을 초과하면 광학순도가 떨어지는 문제점이 있으며, 최적 pH는 7.0인 것으로 나타났다.

또한, 상기 효모와 기질의 비율은 무게비로 1 : 0.1∼10인 것이 바람직한데, 상기 기질의 양이 상기 범위를 벗어나면 반응 효율이 떨어지는 경향이 있다.

본 발명에 따라 제조된 광학활성의 알킬 2-클로로만델레이트는 다이셀(Daicel) 사의 키랄 칼럼인 키랄셀(Chiralcel) OD-H 칼럼을 써서 HPLC에서 R-폼과 S-폼을 쉽게 분석할 수 있다. 이때 HPLC로 분석하기 위해서는 n-헥산과 이소프로필 알코올을 97 : 3의 중량 비율로 함유하고 있는 이동상을 0.5ml/분의 속도로 흘려주고 흡광도를 254nm로 하여 분석하면 되며, 각 생성물의 머무름 시간 (retention time)은 하기 표 1과 같다.

생성물	머무름 시간 (retention time)
메틸 (S)-2-클로로만델레이트	29.588
메틸 (R)-2-클로로만델레이트	36.258
에틸 (S)-2-클로로만델레이트	24.723
에틸 (R)-2-클로로만델레이트	29.713
부틸 (S)-2-클로로만델레이트	19.523
부틸 (R)-2-클로로만델레이트	23.038

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하지만, 하기 예에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

메틸 2-클로로만델레이트의 제조

2-클로로만델릭산(33g, 0.18mol)을 메탄올 100㎖에 녹인 후, 진한 염산 2㎖를 첨가한다. 반응물을 12시간 동안 교반하며 80℃로 가열한다. 반응물을 상온으로 식힌 후, CH₂Cl₂를 사용하여 추출한다. 추출액을 NaHCO₃포화용액으로 씻은 후, MgSO₄로 수분을 제거한다. 용매 CH₂Cl₂를 제거하고, 증류를 통하여 메틸 2-클로로만델레이트(32g, 0.16mol)를 얻었다.

실시예 2

메틸 2-클로로-벤조일포르메이트의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 메틸 2-클로로만델레이트(32g, 0.16mol)를 EtOAc 50㎖에 녹이고, NaOCl(13%, 81㎖, 0.22mol) 수용액을 가한다. 여기에 상전이 촉매로 염화벤질트리에틸암모늄(0.7g, 3.2mmol)를 첨가하고, 상온에서 6시간동안 교반하여 반응한다. EtOAc를 사용하여 유기층을 추출한 후, MgSO₄로 수분을 제거한다. 용매를 제거하고, 증류를 통하여 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트 (29g, 0.14mol)를 얻었다.

실시예 3

효모를 이용한 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트의 비대칭 환원반응

100mM 인산용액 (pH 7.0) 150㎖에 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트 1.5g, 효모(사카로미케스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) Type II 7.5g, 포도당 4.5g을 넣고 30℃에서 반응을 수행하였다. 반응중의 pH는 20% 수산화나트륨 용액을 이용하여 6.5∼7.5 사이로 유지되도록 하였다. 일정 시간마다 반응 샘플을 채취하여 반응 진행 상황을 분석하였다. 4시간 반응 후 GC 상에서 분석된 환원반응의 전환율은 99.9%를 기록하였고, 이때 LC상에서 광학순도를 측정한 결과, 생성된 생성물인 메틸 (R)-2-클로로만델레이트의 광학순도는 98.5% e.e. 였다.

실시예 4

(R)-2-클로로만델릭산의 제조

NaOH (0.6g, 0.015 mol)을 20㎖ 물에 녹이고, 상기 실시예 3에서 얻은 광학순도 98.5% e.e.의 메틸 2-클로로만델레이트(2.2g, 0.011 mol)을 첨가한다. 상온에서 6시간 동안 교반하여 반응한 후, 산성조건에서 EtOAc로 추출한다. 용매를 제거하고 얻은 생성물은 톨루엔/헥산에서 재결정하여 순수한 (R)-2-클로로만델릭산(1.5g, 0.008mol, e.e.>99%)를 얻었다. ([a]_d= -131.94, c=3, H₂O, 30.6℃).

실시예 5

비대칭 환원반응에 미치는 온도의 영향

100mM의 인산용액(pH 7.0) 150㎖에 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트를 1.5g, 사카로미케스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) Type II 7.5g, 포도당 4.5g을 넣은 뒤 온도를 20, 30 및 37℃로 변화시켜 반응하였다. 반응중의 pH는 20% 수산화나트륨 용액을 이용하여 6.5∼7.5 사이로 유지되도록 하였다. 일정 시간마다 반응 샘플을 채취하여 반응 진행 상황을 분석하였다. 반응 온도에 따른 반응 결과는 하기 표 2와 같다. 반응 결과 37℃의 경우 반응 속도는 빨라졌으나 생성물의 광학순도가 낮아졌으며, 20℃의 경우에는 반응 속도가 30℃의 경우보다 떨어져 최적온도는 30℃ 정도인 것으로 나타났다.

비대칭 환원반응에 미치는 온도의 영향

반응온도(℃)	반응 시간(hr)	GC 전환율 (%)	광학순도 (% ee)
20	7	99.8	98.2
30	4	99.9	98.5
37	2	99.8	93.4

그러나 상기 반응에서 광학순도가 떨어지는 경우에도, 실시예 4와 같은 조건으로 가수분해 및 재결정 반응을 수행하면 광학순도 99% e.e. 이상의 (R)-2-클로로만델릭산을 제조할 수 있었다.

실시예 6

비대칭 환원반응에 미치는 pH 의 영향

실시예 5의 반응 조건에서 반응 온도는 30℃로 유지하고 기타 조건은 같은 상태에서 반응 pH를 pH 6 미만, pH 6.5∼7.5 사이 유지, 및 pH 8을 초과하는 조건으로 pH의 영향을 측정하였다. 그 결과 pH 6 미만에서는 반응이 일어나지 않았으며, pH 8을 초과하는 경우는 전환율은 99% 이상 유지하였으나 생성물(product)의 광학순도가 약 93.5% e.e.로서 pH 6.5∼7.5 사이를 유지한 경우에 비해 떨어졌다. 따라서 반응의 최적 pH는 7.0인 것으로 나타났다.

실시예 7

비대칭 환원반응에 미치는 기질의 영향

효모를 이용한 비대칭 환원반응에 미치는 기질의 영향을 알아보기 위하여 기질을 다른 에스테르로 바꾸어 실험하였다. 이때 반응 조건은 실시 예 3과 같다. 실험 결과 다른 종류의 에스테르 화합물 모두 광학 순도면에서 좋은 결과를 보여주었으며, 이중 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트가 반응 시간 및 전환율 측면에서 가장 좋은 결과를 나타내었다. 비교실험 결과는 하기 표 3과 같다.

비대칭 환원반응에 미치는 기질의 영향

사용기질	반응시간 (hr)	GC 전환율 (%)	광학순도 (% ee)
메틸 2-클로로-벤조일포르메이트	4	99.9	98.4
에틸 2-클로로-벤조일포르메이트	4	88.5	98.5
부틸 2-클로로-벤조일포르메이트	5	99.7	98.4

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법은 효모를 사용하여 간단한 방법으로 높은 광학순도의 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 화합물을 제조할 수 있는 효과가 있다. 이 공정은 기존의 제조방법과 비교할 경우 제조공정이 비교적 간단하고 또한 가격이 매우 저렴하고 쉽게 구할 수 있는 효모를 사용함으로써, 친환경적 공정이면서 시간당 생산 효율이 증가되어 경제적이기 때문에 대량생산이 용이한 것이 장점이다. 특히 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트를 반응 기질로 사용할 경우, 주요 혈전 치료제 의약품인 플라빅스((S)-클로피도그렐 바이설파이트)의 중간체로 사용되는 메틸 (R)-2-클로로만델레이트을 광학순도 98% e.e. 이상의 제품으로 만들 수 있어 추가의 가수분해와 재결정 과정이 필요 없는 장점이 있다.

Claims

인산 버퍼 용액 존재하에서, 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트를 효모(Baker's Yeast)를 이용하여 선택적으로 환원반응시키는 것을 특징으로 하는 효모를 이용한 광학활성 (R)-2-클로로만델릭산 및 그 에스테르 유도체의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 알킬 2-클로로-벤조일포르메이트는 메틸 2-클로로-벤조일포르메이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 사카로미케스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) Type II인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 선택적 환원반응의 온도는 20∼37℃이고, pH는 6.0∼8.0인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 선택적 환원 반응의 온도는 30℃이고, pH는 7.0 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 선택적 환원 반응의 효모와 기질의 비율은 무게비로 1 : 0.1∼10인 것을 특징으로 하는 방법.