KR20040055782A

KR20040055782A - 보관-안정한 인간 피브리노겐 용액

Info

Publication number: KR20040055782A
Application number: KR10-2004-7005014A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 제이 울버튼
Original assignee: 크리스토퍼 제이 울버튼
Priority date: 2001-10-03
Filing date: 2002-10-03
Publication date: 2004-06-26
Also published as: IL161262A0; WO2003028654A3; JP2005505581A; EP1439846A4; AU2002348491A1; CN1599616A; EP1439846A2; WO2003028654A2; US20030091559A1; CA2462596A1

Abstract

본 발명의 방법은 고 농도임에도 유체 상태로 남아있고 조직 접합제 제조에 장기간 빠르고 쉽게 사용할 수 있는 곧바로 사용가능한, 생물학적으로 적합한 인간 피브리노겐의 안정한 보관 방법을 제공한다. 또한 본 발명의 방법을 통해 제조된 멸균된, 보관-안정한 수용성 피브리노겐 제품을 제공하며, 상기 피브리노겐은 곧바로 사용이 가능한 액상 형태로 장기간 유지되고, 자발적 응괴(즉, 트롬빈/Ca⁺⁺와 같은 활성제 부재하엣 응괴가 형성됨)가 없으며, 생물학적 활성(즉, 트롬빈 및 Ca⁺⁺에 노출되어 강하게 혼합되면 피브린 응괴를 빠르게 형성하는 능력)이 유지된다.

Description

보관-안정한 인간 피브리노겐 용액{Storage-stable human fibrinogen solutions}

피브리노겐은 혈장 단백질로, 포유류에서 지혈을 유지시키고 혈액 손실을 방지하는 응고의 마지막 단계에서 중요한 역할을 한다. 인간에서 응괴(clot) 형성, 즉, 혈액 응고는 최종 단계에서 모노머 형태의 피브리노겐이 칼슘 이온 존재하에서 트롬빈 및 활성화된 인자(factor) XIII과 반응하여 교차-결합된 피브린 폴리머를 포함하는 피브린 응괴를 형성하는 복합적인 일련의 단계적인 반응을 통해 일어난다.

혈장 단백질의 2∼4그램/리터로 존재하는 상기 피브리노겐 모노머는 이중황화-결합된 폴리펩타이드 사슬의 3개 쌍으로 이루어져있다. 이는 (Aα)₂, (Bβ)₂로표시하는데, α및 β사슬의 두개의 작은 아미노말단 펩타이드(각각) 및 γ₂를 나타낸다. 트롬빈에 의한 피브리노겐으로 부터 피브리노펩타이드 A의 절단으로 컴파운드(compound), 피브린 I이 생성되고, 이어서 일어나는 피브리노펩타이드 B의 절단으로 최종 피브린 II 컴파운드가 생성된다. 상기 절단은 단지 피브리노겐의 분자량을 340,000달톤에서 334,000달톤으로 약간 감소시키나, 상기 과정은 필수적인 중합반응 위치를 노출시켜 응집되고 교차결합된 피브린 응괴의 형성을 가능하게 한다. Jackson,Ann. Rev. Biochem49:765-811(1980); Furieet al.,Cell53:505-518(1998) 참조.

최근에는, 자연 응고의 최종단계와 유사한, 피브린 응괴를 생성하는, 피브리노겐, 트롬빈, 및 다른 성분을 포함하는 생물학적 접합제(adhesives)가 개발되어 왔다. 피브린- 또는 조직-봉함제(sealant), 생물학적 봉함제, 피브린- 또는 조직- 접착체(glue), 생물학적 접합제 또는 이의 동등물(본 발명에서는 통합적으로 "피브린 봉함제"로 지칭함)에 있어서, 이들 물질에 대한 테스트들은 신장 강도 및 최종 피브리노겐 농도간의 직접적인 관계를 보여준다(Japanese Patent Unexamined Published Application, Kokai No. Sho61-293443). 따라서, 농축 피브리노겐의 이용성은 통상적인 피브린 봉함제의 제조에서 중요하다.

피브리노겐 계 조직 접합제는, 예를 들어, 미국특허 제6,117,425호(맥피 등)에 기술되었다. 이와 같은 제제는 또한 피브리노겐 및 인자 XIII 뿐만 아니라, 피브로넥틴 및 알부민과 같은 추가적인 단백질, 및 선택적으로 항생제, 성장 인자,및 이의 동등물을 함유한다. 필수 촉매(트롬빈-매개) 활성은 적용될 호스트(host) 조직(상처 표면)으로 부터 유래되거나, 또는 트롬빈 및 Ca⁺⁺이온-함유 용액 또는 파우더의 형태로 적용 과정중에 조직 접합제에 첨가될 수 있다. 상기 피브린 봉함제는 상처 봉함, 지혈 및 상처 치유 촉진, 코팅 보철술 디바이스, 및 다른 치료학적 및 비-치료학적 응용분야를 위해서 인간 또는 동물 조직 또는 장기 부분의 무봉합 및/또는 봉선-지지 결합을 위해 사용되어 왔다.

피브린 봉함제의 피브리노겐 성분은 종종 인간 인자 XIII의 제조시 폐기물인 혼주 인간 혈장(pooled human plasma)으로 부터 유래되었다. 피브리노겐은 한랭침전법(cryoprecipitation), 또는 다양한 반응물, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 에탄올, 암모늄설페이트 또는 글리신등을 사용한 통상적인 방법을 통한 침전법을 통해 인간 혈장으로 부터 농축시킬 수 있다. 피브린 봉함제는 예를 들어, Brennan,Blood Review5:240-244(1991);Gibbleet al.,Transfusion30:741-747(1990);Matras,J. Oral Maxillofac. Surg.43:605-611(1985);Lerner et al.,J. Surg. Res.48:165-181(1990)등을 참조한다.

제조 관점에서, 미국특허 제5.290,552에 의하면, 초기 외과 접합제 제제는 필수적으로 높은 피브리노겐 함량(약 8 내지 10%)을 함유하였는데, 이러한 동결 건조물은 제조가 매우 어려웠다. 상기의 한랭침전법은 비교적 불안정하고, 사용전까지 -20℃ 미만에서의 보관이 필수적이었다. 한랭침전법의 안정성을 향상시키기 위한 방법은 플라즈미노겐 활성제 또는 알부민의 저해제를 첨가하는 단계를 포함한다.

충분히 높은 피브리노겐 농도에서, 상기 시료는 상처 치유 과정 동안에 효과적인 지혈, 상처 및/또는 조직 부분을 접합시키는 우수한 접합성, 높은 접착 강도 및/또는 상처 봉함, 및 접합제의 완전한 재흡수력을 제공한다. 최적의 접합력을 위해서, 약 15 내지 60㎎/㎖ 농도 피브리노겐의 사용이 용이한 접합제 용액이 요구된다(MacPhee, personal communicaition, 1995).

조직 접합제는 저온-동결 용액 형태 또는 동결 건조 상태로 판매된다. 이는 액상 용액의, 고 농도 피브리노겐이 매우 불안정한 것으로 알려져 있기 때문인데 (http:www.tissuesealing.com/us/pruducts/biological/monograph.cfm), 즉, 이들은 자연적으로 응고되었다. 결과적으로, 티슈콜(Tissucol)과 같은, 상업적으로 구매가능한 동결 건조 및/또는 저온-동결된 피브리노겐 농축물은 사용전에 액화, 즉 천천히 해동("용해")시키거나 또는 동결 건조된 형태에서 원래 상태로 복귀시켜야한다. 그러나, 액화 과정은 제품을 사용하기 전에 상당한 노력과 시간 지체로, 부상 환자가 생명이 위급한 상황에 처하게 할 수 있다.

저온-동결 농축물의 "액화 온도", 예를 들어 동결 고상에서 액상으로 변하는 점은 최대 30 내지 60분 동안 상당한 교반을 통해 적어도 25℃, 보다 바람직하게는 37℃ 이상으로 용액의 온도를 천천히 증가시키는 것이 필요하다 (http:www.tissuesealing.com/us/pruducts/biological/monograph.cfm). 그 결과, 종래 피브리노겐 시료의 원상 복귀는 가능한 가장 짧은 시간에 저온-동결 물질을 곧바로 사용할 수 있는 용액으로 전환시킬 수 있는 수욕조 또는 다른 가열 디바이스(통상적으로 37℃)의 사용이 필수적이었다. 그러나, 예를 들어 다루기 힘들고 귀찮은 해동 과정에 걸쳐 제품의 멸균 상태를 유지하도록 이중 코팅 포장이 요구되기 때문에 열 교환은 통상적으로 매우 어렵다. 예를 들어, 미리-충진된, 곧바로 사용가능한, 멸균 일회용 실린지로 제조된 저온-동결 피브린 봉함제는 멸균성을 위해서 플라스틱 필름으로 이중 봉함되어야한다.

저온-동결 고상에서 액상으로의 전환은 급작스럽게 일어나지 않고 젤라틴 및 점성의 전환 상태를 지나는, 온도 증가 단계의 진행을 거쳐야한다. 적어도 한번의 테스트에 따르면, 샘플은 테스트 튜브를 가볍게 쳐서 균일한 액상이 형성될 때까지 '액상'이라 표시하지 않는데, 즉, 샘플은 유동적이자 마자 눈에 보이는 팽창을 형성하지 않는다. 따라서, 균일한 "액상"의 곧바로 사용가능한 상태가 될 때를 결정하기 위한 제품의 테스트는 보관된 종래 피브리노겐 시료를 사용하기 전에 추가적인 시간-소모 단계가 부가된다. 게다가, 사용자에 의한 실수의 불확실성 및 가능성 정도가 피브리노겐 제품의 사용성 및 유효성에 영향을 줄 수 있음은 분명하다.

동결건조된 피브리노겐의 준비 시간 또한, 최근 사용되는 피브리노겐 계 지혈제의 실질적인 문제가 될 수 있는 제품 사용 전의 상당한 지연을 야기한다. 따라서, 동결건조 피브리노겐 시료의 용해성을 개선시키고자하는 상당한 노력이 진행되어 왔다. 예를 들어, 제조업자는 가열 동안 상당한 교반을 제공할 수 있도록 단백질 바이알(vials)에 추가된 마그네틱 교반기를 사용하는 것이 필수적이었다. 이는 상당한 혼합없이 동일 제품에 대해 얻을 수 있는 것보다 빠른 용해 시간을 가능하게 하나, 바로 사용할 수 있는 피브리노겐을 얻기 위해 30 내지 60분의 준비 시간이 요구된다.

종래 피브리노겐 시료의 용해성은 종종 바이러스 불활성 방법의 실행으로 더욱 감소되었다. 예를 들어 유럽 특허 제159,311호에는 바람직하게 동결 건조 물질에 열 처리 방식을 수행한다.

동결건조물의 원상복귀는 특정 첨가제의 첨가를 통해 개선시킬 수 있음은 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 유럽특허 제345,246호는 피브리노겐뿐만 아니라, 적어도 하나의 생물학적으로 허용가능한 첨가제(텐시드(tenside))를 더욱 함유한 동결건조 피브리노겐의 제조에 대해 기술하고 있다. 상기 텐시드의 첨가는 피브리노겐의 용해성 자체가 아닌 특정 온도에서 용해 속도를 개선시켜, 용액으로 동결건조물의 개선된 습윤을 야기한다. 그러므로, 상기 시료는 25℃ 이상, 일반적으로 37℃의 주변 온도에서 원상복귀시켜야만 한다.

사용전에 동결건조 또는 저온-동결된 피브리노겐 제품, 특히 농축 시료의 원상복귀 또는 액화시켜야되는 필요성을 극복하기 위해, 실온에서 용해되는 피브리노겐 시료가 도입되었다. 그러나. 이러한 종래 제품은 세포독성이 있었다(Beriplast, Biocol, Bolheal HG-4).

미국특허 제5,962,405호는 보관이 안정된 동결건조 또는 저온 동결된 액상 피브리노겐의 제조방법을 제공하는데, 바람직하게 가열 및/또는 교반 디바이스같은 추가적인 방법을 사용하지 않고 곧바로 사용가능한 피브리노겐 및/또는 조직 접합제로 원상복귀 및 액화시킬 수 있으며, 적어도 70㎎/㎖의 피브리노겐 농도를 갖는 곧바로 사용가능한 조직 접합제 용액이 제조된다. 그러나, 상기 제조방법은 피브리노겐과 함께 이의 용해성을 개선시키고 및/또는 액화 온도를 낮추고, 실온에서 곧바로 사용가능한 조직 접합제 용액의 점도를 감소시킬 수 있는 적어도 하나의 추가적인 물질을 포함한다. 상기 용해성 강화 물질은 벤젠, 피리딘, 피퍼리딘, 피리미딘, 모포린, 피롤, 이미다졸, 피라졸, 퓨란, 티아졸, 퓨린 컴파운드 또는 비타민, 뉴클릭 베이스, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 이루어진 물질로 부터 하나 이상 선택되며, 상대적으로 높은 비율의 물질(substance)/피브리노겐이 추천되나, 피브리노겐 그람당 0.03 내지 1.4mmol의 비율로 첨가된다. 추가적인 단백질, 보조제 및 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 그러나, 액화 온도가 낮기 때문에, 상기 '405 특허의 저온-동결, 농축 피브리노겐 용액의 액화는, 종래의 37℃의 따뜻한 조건과는 반대로, 20 내지 23℃(실온)의 주변 온도에서 가능한 바람직하다. 그럼에도, 상기 방법은 여전히 저온-동결 조건하(-25℃ 에서 -15℃ 미만으로 유지된 온도)에서 보관이 필수적이고, 상기 방법은 액화시키기 위해 여전히 최대 15분이 걸린다.

조직 봉함제 시료로 사용하기 위한 피브리노겐 용액의 조기 응고에 대한 다른 용액에 있어서, 미국특허 제5,985,315호는 활성이 칼슘 이온에 의존적이지 않은 적어도 하나의 활성화 응고 인자가 첨가된 피브리노겐을 포함하는, 안정하게 생물학적으로 전활성된(pre-activated) 접합제를 제공한다. 상기 전활성된 접합제는 수용액상태에서 안정하고, 즉, 상기 용액은 20℃의 온도에서 적어도 한시간동안은 자발적으로 응고되지 않으나, 칼슘 이온을 첨가하면 간편하게 약 5분이면 응고시킬 수 있다. 다른 추가적인 활성제가 필요하지도 않다. 따라서, 상기 최종 생물학적접합제는 응고시키기 위해 트롬빈 또는 프리트롬빈의 첨가를 필요로하지 않는다. 그러나, 불행하게도, 느린 응고 시간은 유동적이거나 또는 진동하는 상처 타입에서 사용하는데는 상기 최종 피브린 봉함제는 비실용적이다.

따라서, 의학적 견지에서, 곧바로 사용가능한 빠른 이용성의, 생물학적, 조직 접합제는 특히 외과적 응급 상황에서는 필수적이다. 추가적으로, 가능한 적은 조작으로 보조자의 부담을 최소화시킬 수 있는 곧바로 사용가능한 피브린 봉함제 용액의 제조가 필수적이다. 피브린 봉함제의 제조는 보관된 피브리노겐 성분을 요구하나, 현시점에서 상기 피브리노겐은 동결건조물, 저온-동결 농축, 또는 피브리노겐 계 조직 접합제의 효율성 또는 인간 환자에 대한 안전한 사용성을 부정적으로 변화시킬 수 있는 다른 성분과의 혼합으로만 이용가능하다. 따라서, 여전히 고 농도임에도 보관이 안정되고, 유체 형태로 이용가능하며, 빠르고 용이하게 인간 환자에게 사용하는 조직 접합제의 제조에서 조작 용이성을 갖는, 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐 용액이 요구된다.

-발명의 요약-

본 발명은 고농도에도 불구하고, 유체 상태로 유지되며, 조직 접합제로 빠르고 용이하게 조작할 수 있는, 곧바로 사용가능한 생물학적으로 적합한 인간 피브리노겐을 안정하게 보관하는 방법을 포함한다. 또한 본 발명의 방법을 통해서 멸균된, 보관이 안정한 수용성 피브리노겐 제품을 제공하며, 상기 피브리노겐은 액상 형태로 곧바로 사용가능하며, 자발적으로 응괴(즉, 트롬빈/Ca⁺⁺와 같은 활성제 부재하에서 응괴를 형성)되지 않고, 생물학적 활성(즉, 트롬빈 및 Ca⁺⁺에 노출되어 혼합되면 피브린 응괴를 빠르게 형성하는 능력)을 유지하고 있다. 본 발명의 보관 농축된, 곧바로 사용가능한 생물학적으로 적합한 인간 피브리노겐은 완전히 용해되며, 상기 용액은 수용성이고, 이의 안정성은 pH 및 온도 의존적이다. 본 발명의 방법은 안정하고, 농축된, 곧바로 사용가능한 생물학적으로 적합한 인간 피브리노겐 용액을 제공하며, 상기 안정성은 제조일로 부터 적어도 1일 내지 1년 이상의 보관 기간 동안 유지된다. 상기 제품은 조성물의 응괴 특성에 영향을 주지않고, 동결, 해동, 재동결 및 재해동시킬 수 있다.

바람직한 방법에 따르면, 본 발명은 신선하게 제조되거나, 또는 혈장 또는 어느 하나의 동결 시료로 부터 신선하게 분리 및 정제하는 단계 및 실온에서 적합한 컨테이너 또는 냉장고(약 4℃)에서 멸균상태로 유지되고, pH 6.32 내지 8.04 범위의 pH에서 유지되는 단계를 통해 곧바로 사용가능한 피브리노겐 용액을 제공한다. 안정성은 적어도 1년 이상 동안 유지된다. 본 발명의 방법에 따라 보관된, 곧바로 사용가능하고, 멸균된, 안정한 수용성 피브리노겐 용액을 더욱 제공한다.

다른 바람직한 방법에 따르면, 본 발명은 상술한 곧바로 사용가능한 피브리노겐 용액에 프로테아제(protease) 저해제를 첨가하여 보관 안정성을 강화시키는 단계를 제공한다. 특정 실시예에서 또한 다른 첨가제 또는 성분을 상술한 보관이 안정하고, 곧바로 사용가능한 피브리노겐 용액에 첨가하여 이후 적용시, 또는 이로부터 제조된 제품 또는 물질에서 최종 피브리노겐의 효율성을 강화시킨다. 상기 다른 방법에 따라 보관된 곧바로 사용가능한, 멸균된, 안정한 수용성 피브리노겐 용액을 더욱 제공한다.

상기와 같이 제조되고 보관된, 곧바로 사용가능한, 농축 인간 피브리노겐 용액은 생물학적 조직 접합제 또는 봉함제의 제조에서 추가적인 단계 또는 과정없이 중화시켜 사용할 수 있으며, 즉석에서 피브린 봉함제의 제조를 포함하며, 예를 들어, 상처 치유, 응고, 섬유소원 혈증, 수술 또는 수술 후 후유증의 억제, 코팅 혈관 보철술, 또는 주입 목적뿐만 아니라, 인 비보(in vivo) 또는 인 비트로(in vitro)에서의 다른 부가적 또는 비부가적 치료학 또는 비치료학적 분야를 포함하는 약제학적 또는 성형학적 사용을 포함한다.

본 발명의 다른 목적, 장점 및 새로운 특징은 이하 상세한 설명, 실시예 및 도면에서 더욱 설명하며, 본 발명의 시험 또는 실시를 통한 내용들은 당 분야의 당업자들에게 자명하다.

본 발명은 보관이 안정한, 농축 인간 피브리노겐 제조방법 및 혈액 손실을 방지하고, 상처 치유 및 다른 많은 치료학적 및 비-치료학적 응용분야에서 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 2001년 10월3일 출원된 미국 가출원 제60/326,963호를 우선권으로 주장하며, 본 발명에 포함시킨다.

본 발명은 농도에도 불구하고, 유체 상태로 유지 가능하며, 조직 접합제 제조가 쉽고 빠르게 진행될 수 있는 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐을 안정하게 보관하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 방법을 사용하여 제조된 보관이 안정한, 수용성 피브리노겐 제품을 제공한다.

상기 본 발명의 곧바로 사용가능한, 수용성 피브리노겐 용액은 며칠 동안의기간 이후에도 액상 상태로 안정하게 유지되고, 자발적인 응괴(즉, 트롬빈/Ca++와같은 활성제 부제하에서 응괴를 형성)가 없으며, 생물학적 활성(즉, 트롬빈 및 Ca⁺⁺에 노출되어 강하게 혼합되면 빠르게 피브린 응괴를 형성하는 능력)이 유지될 때 "보관-안정"하다. 본 발명의 방법은 실질적인 시간 기간동안 인간 피브리노겐을 곧바로 사용가능한, 수용성 용액으로 보관하고 활성과 안정성을 유지(보관-안정)되는 조건을 이하 설명한다.

보관-안정한 인간 피브리노겐 용액에 대해 사용된 "활성"은 단백질의 "생물학적 활성"을 의미하고, 상기 "생물학적 활성"은 상술한 바와 같이 빠르게 피브린 응괴를 형성시키는 능력과 같은, 또는 부분적으로 인 비트로 및/또는 인 비보에서, 인간 피브리노겐과 관련된 하나 이상의 활성을 의미한다. 생물학적 활성을 평가하는 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있다.

본 발명에서는, 다른 정의가 없는 한, 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 일반적인 숙련가들이 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미로 사용하였다.

본 발명의 보관 방법은 혈장으로 분리 및 정제되거나, 또는 재조합되어 제조되거나, 또는 동결건조 또는 저온-동결 시료로 부터 신선하게 분리 또는 신선하게 제조된 인간 피브리노겐 시료에도 적용된다. 본 발명의 방법은 신선하게 제조된 피브리노겐 용액의 생물학적 활성이 혈장으로 부터 분리 및 정제된 동등한 샘플과 동일하고, 용액내에서 자발적인 응괴가 유도되지 않는 한 상기 피브리노겐 시료를 동결 건조 또는 저온-동결하는 시간 길이에 상관없이 적용가능하다.

본 발명의 바람직한 일 실시예는 제조 과정 중의 조 피브리노겐 산물, 또는 90%를 초과하는 단백질 순도 및 95%를 초과하는 응괴가능한 단백질을 갖는 최종, 농축 피브리노겐의 제조, 또는 상기 두 범위 농도의 피브리노겐에 적용가능하다. 예를 들어, 하기 실시예에 있어서, 피브리노겐 제조는 53%의 단백질 순도 및 95&의 응괴가능한 단백질을 갖는 반면, 비-인간 피브리노겐을 사용하여 본 발명자에 의해 수행된 다른 실시예(결과를 나타내지 않음)에서, 제조는 61%의 단백질 순도 및 97%의 응괴가능한 단백질을 갖는다. 그럼에도, 본 발명의 방법은 상기 두 실시예에 모두 적용가능하다.

본 발명의 바람직하고 대표적인 실시예에서, 상기 보관 방법은 농축된 인간 피브리노겐 시료에 적용되었다. 고 농축되었음에도, 본 발명의 보관-안정한 피브리노겐 시료는 수용액에 용해된 상태로 유지되어 상기 피브리노겐은 부가적 또는 비부가적, 곧바로 사용가능한 생물학적 조직 접합제의 제조에서 사용하는데 특히 적합하다. 상기 피브리노겐은 곧바로 사용가능한 조직 접합제 시료를 제조하는 데 사용시 10 내지 85㎎/㎖의 농도, 보다 바람직하게는 15 내지 75㎎/㎖의 농도, 더욱 바람직하게는 30 내지 70㎎/㎖의 농도, 및 가장 바람직하게는 40 내지 65㎎/㎖의 농도에서 최적으로 보관된다.

또한, 본 발명의 보관-안정한 수용액에서 상기 피브리노겐, 또는 피브리노겐-함유 단백질의 농도는 일반적으로 2 내지 10w/v%, 바람직하게는 4 내지 7w/v% 범위이다. 상기 피브리노겐의 농도는 280㎚에서 단백질 흡광도 측정을 통해 결정된다(1% 피브리노겐 용액의 흡광도는 14를 사용).

본 발명의 보관-안정한 피브리노겐은 수용액에서 완전 용해되는데 즉, 물 종류의 용액이다. 시료의 최적 온도 및 pH는 본 발명을 통해 확인하였으며, 당 분야의 당 업자들에게 잘 알려진 일반적인 방법 중 하나를 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 그러나, 수용성-계 겔을 또한 본 발명에서 사용할 수 있는데, 이와 같은 물질이 이에 함유된 피브리노겐을 완전하게 용해시키고, 상기 시료가 충분하게 유체상태여서 곧바로 사용가능한 생물학적 조직 접합제의 빠른 제조 또는 본 발명에 따른 보관을 수반하는 다른 응용이 가능하다면 사용할 수 있다. 본 발명의 핵심은 상기 피브리노겐 용액이 곧바로 사용가능한 유체 상태로 안정하게 보관된다는 점과; 건조동결시료나 저온 동결된 상태로 보관되지 않는다는 점이다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 피브리노겐 용액의 점도가 통상적으로 물보다 크더라도, 신선한 피브리노겐 용액은 뒤집힌 테스트 튜브를 따라 쉽게 이동할 수 있는 자유로운 유동성 액체이다. 생물학적 활성이 있는 보관 샘플(즉, 트롬빈 및 Ca 이온 존재시 응괴됨)은 신선한 샘플과 동일한 물리적 특징을 필수적으로 갖는다. 상기 타입의 응괴는 조직 접합제가 제조되고 사용되면 활성 피브리노겐을 사용하여 형성된 조절된 응괴를 생성한다. 이의 목적은, 상기 타입의 응괴는 본 발명에서 단순히 "피브린 응괴"로 언급되는데 "자발적 응괴"와 구별하기 위함이며, 후자는 트롬빈 또는 다른 활성제의 부재시에도 불안정한, 농축 피브리노겐에서 발생할 수 있다.

그러나, 상기 용어는 안정하게 보관된 피브리노겐 용액이 동량의 피브리노겐과 트롬빈/Ca⁺⁺이 혼합되면 피브린 응괴가 빠르게 형성되는 것을 통해 증명되는 안정하게 보관된 피브리노겐 용액의 활성으로 보관 피브리노겐 용액의 바람직한 사용을 종래 피브리노겐 용액의 불안정성을 의미하는 자발성 응괴와 구별하기 위한 목적으로만 사용된다. 종래, 신선하게-제조된 인간 피브리노겐 수용액은 매우 불안정하였으며, 보관시 자발적으로 응괴하는 경향으로 인해 종래의 방법을 사용하여 1 또는 2일간 보관 후에도 곧바로 사용가능한 액상 형태의 피브리노겐 보관은 실용적이지 못하였다.

"자발적 응괴"는 수용성 인간 피브리노겐 제조에서 점도가 증가(예를 들어, 트롬빈 및 Ca 이온과 같은 활성제에 노출없이)되어, 결과적으로 혼합중 눈에 보이게 운동성(흐름)이 감소된다. 상기 과정은 비가역적이며, 피브린 봉함제의 제조과 같은 사용에서 피브리노겐을 쓸모없게 만들었다. 종종 자발적 응괴는 1일 미만, 종종 겨우 몇시간 미만에서 종래의 신선하게-제조된 수용성 피브리노겐 용액에서 발생하였다. 상기 불안정성은 최근 방법을 사용하여 곧바로 사용가능한 형태로 피브리노겐을 보관할 수 있는 시간 길이를 완전하게 예측할 수 없게 하며, 따라서 신뢰할 수 없었다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 보관-안정한 피브리노겐은 폴리머, 플라스틱 또는 플라스틱계 컨테이너에 보관되며, 보다 바람직하게 상기 플라스틱 컨테이너는 폴리프로필렌이다. 유리는 자발적 응괴 형성을 강화시키므로 피브리노겐 또는 혈소판 보관에는 사용하지 않는다.

트롬빈과 칼슘 이온이 강한 교반과 함께 첨가될때 응괴되지 않는 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐의 보관 용액을 "트롬빈-불감"이라 한다. 상기 트롬빈 불감 시료는 유체(물과 유사한 점도를 갖음)로 존재한다. 그러나, SDS-PAGE(소듐 도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)를 통해 이와 같은 트롬빈 불감 피브리노겐을 분석한 결과는 피브리노겐 단백질이 비가역적으로 저 분자량의 조각으로 분해되었음을 보여준다. 따라서, 더 이상 활성 피브리노겐을 함유하지 않는 시료는 본 발명에 사용하지 않는다.

곧바로 사용가능한 피브리노겐 용액에 트롬빈/Ca⁺⁺을 첨가한 후, 점도의 빠른 증가와 액상 운동성의 감소를 보이는데 이를 "겔"이라 한다. 이와 같은 겔 상태에서, 상기 피브리노겐 용액은 더이상 자유롭게 흐르지 않고, 교반을 통해 움직이도록 해야만 한다. 이러한 측정법이 주관적이나, 추정 변이성은 단지 ±2초이다.

"응괴" 형성은 교반을 통해 고상 물질로 부터 액상이 흐르도록 할 수 없는 피브리노겐 용액의 갑작스런 고체화이다. 상기 부동 물질은 육안적으로 불투명한 흰색 및 점소성이다. 통상적인 생리학적 또는 비생리학적 피브린 응괴의 스캔 일렉트론 마이크로그래프(SEM) 사진이 예를 들어, Redlet al.,Medizinische Welt36:769-76(1985)에 있다. 상기 응괴는 일반적으로 테스트 튜브의 벽에 부착되어 고상 표면의 튜브를 심하게 쳐도 제거되지 않는다. 이러한 측정법은 겔 형성보다 덜 주관적이며, 느린 응괴(> 100초) 샘플에 대해서는 약간 크지만, 추정 불확실성은 빠르게 형성된 샘플(8 내지 12초)에 대해 단지 ±1 초였다.

보관 동안 용액의 온도는 함유된 피브리노겐이 안정하게 유지되는 한(즉, 불활성 또는 자발적 응괴가 없이) 특별히 제한적이지 않다. 본 발명의 피브리노겐 용액의 보관을 위한 바람직한 온도는 1 내지 25℃, 보다 바람직하게는 4 내지 23℃ 범위이다. 냉동시, 최적 온도는 4±1℃이다. 실온에서 보관시, 최적 온도는 20 내지 25℃, 보다 바람직하게는 22 내지 24℃, 가장 바람직하게는 23±1℃ 범위이다.

동결한 후 응괴 형성의 효과를 평가하기 위해서, 피브리노겐 용액 샘플을 테스트하기 전에 동결하고 해동하였고, 한번 이상의 동결/해동 사이클은 동결하기 전 4℃에서 5개월간 보관한 후에도 인간 피브리노겐 용액의 응괴력에 부정적인 효과를 나타내지 않음을 확인하였다. 이와 함께, 상기 결과는 액상 피브리노겐이 초기에 동결되면 추가적인 저장 기간 년수를 갖는 적어도 1년의 저장 기간으로 제공되도록 쉽게 액상 피브리노겐 제품을 제제화할 수 있음을 분명히 보여준다.

수용성 피브리노겐 용액의 pH 값은 보관하는 동안 바람직하게 약 pH 5 내지 8, 보다 바람직하게는 pH 6.2 내지 7.5로 적정한다. 특정 피브리노겐 용액의 보관을 위한 최적 pH는 이하 실시예에 수반된 표에 나타낸 바와 같이 물질이 저장되는 온도에 의존적이다. 그러나, 본 발명에서 제공된 정보에 의하면, 당 분야의 일반적인 숙련가들은 함유된 단백질이 안정하게 유지(즉, 불활성 또는 자발적 응괴 없이)되는 결정 인자를 알고 있으므로, 계획된 보관 온도 및 조건을 기초로 피브리노겐 용액에 대한 최적 pH를 선택할 수 있다.

예를 들어, 실온(∼23℃)에서 보관된 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐(프로테아제 저해제 없음)은 pH 6.3 내지 7.1, 바람직하게는 약 pH 6.32에서 최적으로유지되어 보관된 시료를 중화하고 트롬빈/Ca⁺⁺에 노출시켰을 때 빠르게 응괴를 형성시키는 능력이 유지된다. 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐(프로테아제 없음)을 냉장(∼4℃)에서 보관하면, 최적 pH는 또한 pH 6.32 내지 8.0, 바람직하게 약 pH 6.3 내지 7.5에서 최적으로 유지되어 보관된 시료를 중화하고 트롬빈/Ca⁺⁺에 노출시켰을 때 빠르게 응괴를 형성시키는 능력이 유지된다(표 1 참조).

보관-안정한 인간 피브리노겐 용액의 pH는 보관하는 완충용액을 통해 결정된다. 예를 들어, 하기 실시예에서, 인간 피브리노겐 용액(40㎎단백질/㎖)을 하기의 0.1M 완충용액 중 하나로 신선하게 제조하였다: 히스티딘, pH 6.0 또는 7.2; 트리스 pH 8.16; 글리신 pH 9.3; 또는 카르보네이트, pH 9.1 또는 pH 9.9.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 보관-안정한 인간 피브리노겐을 제조하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 허용가능한 다른 완충용액이 알려져 있으나, 피브리노겐 용액의 최종 pH가 정해진 범위로 유지되어, 활성은 유지되고 자발적 응괴는 없는 상태가 유지되는한, 보관-안정한 피브리노겐 용액은 히스티딘 완충용액으로 제조된다.

최근 사용할 수 있는, 상업적인 피브리노겐은 분리 및 정제 과정에서 사용된 염을 함유한다. 실시예에서 언급한 바와 같이, 구연산나트륨 및 염화나트륨을 포함하나, 이와 같은 피브리노겐 정제 과정의 잔여 부분인 염의 존재는 최종 시료의 보관-안정성에 영향을 주지 않는다. 본 발명의 목적은 필적할 만한, 신선하게 제조된 인간 피브리노겐 용액의 특성을 유지하는 보관-안정한, 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐 용액을 생산하는 것이므로, 피브리노겐 정제 과정의 효과는 동일하다. 그럼에도, 고농도의 구연산 및/또는 나트륨은 보관된 피브리노겐 시료의 응고에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상기 동일한 염 또는 다른 킬레이트 화합물이 신선하게 제조된 용액에 존재하더라도, 보관되는 동안 활성이 유지되고 상기 염 또는 킬레이트 화합물에 의해 자발적 응괴가 유도되지 않는 한, 본 발명은 효과적이고, 보관 안정한 시료가 필적할 만한 신선하게 제조된 용액의 특성 및 활성을 유지하게 된다.

하기 실시예의 목적을 위해, 소듐 아자이드(0.025%)를 항균제로 각 샘플에 첨가하였다. 상기 항균제가 어느정도 자발적 응괴를 유도할 수 도 있으나, 이러한 효과는 나타나지 않았다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서는, 어떠한 항균제도 첨가하지 않으며, 멸균성은 종래 기술을 사용하여 보존시켰다. 그러나, 다른 실시예에 있어서, 항균제를 어느 정도 첨가하여 장기간 보관중인 피브리노겐 용액의 미생물 오염을 예방하였다. 보관 기간동안 피브리노겐 용액의 활성이 유지되고 자발적 응괴가 유도되지 않으며, 인간에게 사용하는 데 있어서 금기시 되지 않는 이상, 생리학적인 항균제는 본 발명의 목적에서 수용가능하다.

본 발명의 보관-안정한 피브리노겐 용액은 상술한 바와 같이 보간 기간동안 피브리노겐 용액의 활성이 유지되고 자발적 응괴가 유도되지 않는 한, 성장 인자, 약품 또는 다른 화합물 또는 이들의 혼합물와 같이 담체 운반자로 작용하는 것이 부가적으로 추가될 수 있다. 예를 들어, 성장인자가 피브리노겐 시료에 추가되면, 피브린 봉함제 또는 조직 접합제 제조에 사용시 곧바로 사용가능한 피브리노겐은 상처 치유, 조직 재생이 가속화되고, 촉진되며, 개선될 수 있다. 이와 같은 추가시료는 예를 들어, 약품, 항체, 항응고제 및 다른 화합물과 같은 추가적인 성분을 또한 포함할 수 있는데, 이들 화합물은 (1) 성장인자 또는 다른 첨가제 또는 성분의 생물학적 활성을 증가시키고, 촉진시키거나 매개하고; (2) 성장인자가 추가된 인간 피브리노겐 또는 이로부터 제조된 피브린 봉함제 또는 조직 접합제의 하나 이상의 첨가제 또는 성분의 활성을 감소시키고, 여기서 상기 활성은 시료내 성장인자를 저해 또는 파괴하는 활성이며; (3) 본 발명의 곧바로 사용가능한 피브리노겐 용액으로 부터 제조된 피브린 봉함제 또는 조직 접합제와 같은 시료로 부터 첨가제 또는 성분의 지속적인 도달이 가능하고; (4) 다른 바람직한 특성을 갖는다. 상기 첨가제 또는 보조제(supplement)는 돌연변이체, 유도체, 절단된 형태 또는 다른 변형 형태를 포함하는데, 이들은 유도된 화합물 또는 조성물과 유사한 생물학적 활성을 갖는다.

하나 이상의 첨가제 또는 성분을 본 발명의 보관-안정한 피브리노겐 용액에 동시에 첨가하거나 공급할 수 있다. 상기 첨가제 및/또는 성분의 농도가 목적에 따라 피브리노겐 용액에서 다양할 수 있으며, 상기 농도는 상기 성분 및/또는 조성물이 의도된 목적을 수행할 정도로 충분해야 한다. 상기의 첨가되는 보조제의 양은 다양한 농도를 테스트하고 의도된 목적과 분야에 유효하게 선택되도록 당 분야의 당 업자들에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 염료, 트레이서(tracer), 표지 및 이와 동등물을 또한 첨가할 수 있는 데 예를 들어, 상기 피브리노겐을 첨가한 물질의 이후 도달을 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 프로테아제 저해제(PI), 예를 들어,이에 한정되는 것은 아니나, 아프로티닌(예를 들어, 5㎍/㎖ 최종 농도) 또는 PPACK(예를 들어, 25uM 최종 농도)를 유효량으로 보관된, 수용성 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 다른 프로테아제 저해제(PI)가 당 분야에서 알려져 있으며 실시예 2에 기술된 아프로티닌 및 PPACK를 대체할 수 있다. 특히, 아프로티닌은 상업적으로 구매가능한 Tisseal 제품이다. 프로테아제 저해제의 "유효량"은 피브리노겐 샘플의 단백질 가수분해를 방지할 수 있는 PI의 양을 의미한다. 상기 양은 사용되는 PI 또는 PIs의 혼합물에 따라 다양하나, 당 분야의 당 업자들에 의해 쉽게 결정가능하다. 그러나, PI의 존재하에서 보관된 피브리노겐 용액이 장기간 동안 안정하게 유지되더라도, PI 효과는 시간 경과에 따라 감소하였다.

예를 들어, 보관-안정한 인간 피브리노겐 시료에 PI의 첨가는 4℃에서 장기간 보관된 단백질의 바람직하지 못한, 자발적 응괴 형성을 억제할 수 있으나, PI의 첨가는 빠른 빠른 피브리노겐/트롬빈 산물(피브린 응괴)을 생성하는데 사용하기에는 효과적이지 않았는데, 아마도 남아있는 저해 활성때문일 것이다. 상기 제품은 가장 낮은 pH에서 7일간 보관 후에는 테스트하지 않았다. 그러나, 테스트를 수행한 샘플에서 빠른 피브리노겐/트롬빈 응괴 형성은 적어도 149일 동안 실온(∼23℃) 및 pH 6.3 내지 7.0에서 유지된 보관-안정한, 인간 피브리노겐 용액 샘플에서는 나타났었다.

표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, "저해(inhibition)"는 "방지(prevention)"와 동일하며, 즉, PIs가 본 발명에서 개시한 조건하에서 초기에는 활성이 있으나(즉, 응괴가 저해/방지됨), 저해 효과가 감소되고 실질적으로 멈춘 후에 PI의 활성이 감소되었다. 피브리노겐 용액에서 PI 활성의 감소율은 pH와 온도 의존적이었다.

본 발명에서 수행된 실시예는, 반복적인 관찰 및 테스트를 통해, 바람직한 조건하에서 본 발명의 피브리노겐 용액이 실온(∼23℃) 또는 냉장(∼4℃)에서 보관시 pH 6.3 내지 8.0에서 적어도 97일 동안 안정하고(활성이 있고 자발적 응괴는 없음), pH 6.3에서 적어도 149일간 안정하였다. 프로테아제 존재하에서, 장기간 테스트하지는 않았으나, 상기 인간 피브리노겐 시료는 ∼23℃에서 보관시 적어도 22일 간 안정하였다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예의 인간 피브리노겐 용액은 PI 존재에 상관없이, 상온에서 수년간 안정하다.

적어도 149일 동안 증명된 안정성의 관점에서, 실질적인 활성 손실 없이 유지된(즉, 피브리노겐/트롬빈 피브린 응괴가 여전히 혼합시 빠르게 형성됨) 농축 단백질의 저온 동결 또는 동결 건조된 시료와 비교하여 매우 장기간 동안, 피브리노겐 제품의 초기 보관 후 수년간 안정함을 볼 수 있다. 따라서, "장기간 보관"은 적어도 3일동안, 바람직하게는 적어도 3주 동안, 보다 바람직하게는 적어도 13주, 보다 바람직하게는 적어도 149일, 더욱 바람직하게는 적어도 1년, 및 가장 바람직하게는 1년 이상 단백질 활성의 실질적인 손실없이, 본 발명에 개시된 조건하에서 곧바로 사용가능한 형태의 피브리노겐 용액의 저장을 의미한다. 또한, 상기 용어는 제품의 보관에 추가적인 년수를 더하여, 곧바로 사용가능한 형태로의 보관이외에도 냉동 보관 기간을 더욱 포함하는 의미이다.

본 발명은 인간 피브리노겐 시료에 관한 것이나, 본 발명의 방법은 다른 종, 가장 바람직하게는 다른 포유류 종으로 부터의 곧바로 사용가능한, 수용성 피브리노겐 용액을 안정하게 보관하기 위해 적용할 수 있다.관한 것이다. 반면, 다른 포유류 종에 대해 보관된 인간 피브리노겐의 사용과 관련된 종 적합성 문제는 나타나지 않았다. 예를 들어 대상 인간 피브리노겐을, 예를 들어, 어떠한 종류의 포유류에 대해서도 사용할 수 있는 생물학적으로 적합한 접합제 시료를 제조하기 위해 수용액으로 보관 이후 사용할 수 있다.

혈장 단백질인, 피브리노겐은 종종 인간 혈장 단백질을 오염시킬 수 있는, 좀 더 구체적으로 헤파타이티스 바이러스 또는 HIV와 같은 혈액-내 병원체에 의한 오염 위험이 수반된다. 따라서, 당 분야의 당 업자들은 감염 물질을 가능한 제거하기 위해 피브리노겐을 즉시 제조한다. 상기 목적을 이루기 위한 일반적인 기술은 한외거르기(ultrafiltration), 저온살균(pasturization)(가열), 용매 세제 처리, 방사능 노출, 및 자외선 처리등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 고열 또는 스팀 방법에 의한 바이러스 불활성화는 본 발명의 피브리노겐 용액을 포함하는 생물학적 활성 단백질 용액에서는 비실용적인데, 나노여과법은 본 발명의 인간 피브리노겐 용액을 멸균 보관 컨테이너에 놓기 전의 선택적인 처리법이다.

통상적인 액체 가열 과정 동안 피브리노겐이 열에 불안정하고 불활성화됨에도, 보통 과정들은 피브리노겐을 가열하여, 예를 들어, 피브리노겐 자체는 불활성화시키지 않고, 헤파타이티스 또는 HIV와 같은 가능한 오염 바이러스를 불활성화시키도록 발전되어 왔다. 미국특허 제5,116,950호(Miyanoet al., issued May 26, 1992)는 적어도 당, 아미노산 및 마그네슘 염의 존재하에서 바이러스 오염된 피브리노겐이 불활성화될 때까지 피브리노겐을 함유하는 수용액을 가열하는 단계를 포함하는 피브리노겐 가열 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 피브리노겐 수용액은 가열되며, 바람직하게는 더욱 정제할 수 있고 투석, 멸균 또는 여과법과 같은 통상적인 방법을 진행시킨다. 또한, 다양한 세척 단계를 적용하여 당 분야에서 알려진 통상적인 방법으로 안정화된 첨가제를 제거시킨다.

본 발명의 피브리노겐 용액은 활성제 용액에 노출될 때 생리학적 피브릴 구조를 형성하는데 매우 이상적이고, 피브린 응괴가 빠르게 형성된다. 이는 보관된 피브리노겐 용액을 동량의 트롬빈/CaCl₂용액(예를 들어, 2.5유니트/㎎ 피브리노겐(100유니트/㎖), 트롬빈 및 용액에 첨가된 구연산 또는 다른 킬레이트 화합물 보다 과량의 3 내지 6mM의 CaCl₂를 포함)과 혼합을 통해 증명되었으며, 하기 실시예에 나타내었다. 신선한 생리적 조건, 즉, 약 0.15의 이온 강도 및 중성 pH에서 신선하게 제조되거나 또는 신선하게 분리 및 정제된 인간 피브리노겐에서 트롬빈의 활성에 의해 응괴가 형성되면 최종 응괴는 생리학적 피브릴 구조로 증명된, 전형적인, 공간적으로 브랜치된 피브린 구조를 갖는다.

피브리노겐 및 트롬빈 농도는 응괴 형성 시간, 응괴 강도, 응괴 점착성 및 이에 따른 지혈등에 따른다.

또한, 본 발명에 따라 첨가된 피브리노겐 시료 및/또는 피브리노겐-계 조직 접합제는 조직 접합제로 사용시 세포독성 효과를 갖지 않았는데, 즉, "생물학적으로 적합한"은 세포가 잘 적응함을 의미하며, 세포 성장이 잘되고 우수한 상처 치유를 위한 이상적인 선결조건을 제공한다. 이는 동량의 중간-등장액 또는 등장성 염화나트륨 용액으로 조직 접합제를 희석하고 섬유아세포의 성장 배지에 첨가하여 증명되었다. 섬유아 세포에 대해 어떠한 해로운 효과도 관찰되지 않았다(Redlet al., 1985).

따라서, 본 발명의 보관-안정한, 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐 용액은 조직 접합제의 모든 요구조건, 즉 생물학적 적합성, 바이러스 안전성 및 높은 접합 강도를 갖도로 제조되며, 또한 곧바로 사용가능한 인간 피브리노겐 제품으로 부터 간편하고 빠르게 제조할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 보관 안정한 인간 피브리노겐으로 부터 제조된 조직 접합제는 생물학적으로 제조되고, 부가적 또는 비부가적인 조직 접합제가 사용되는, 항생제, 항종양약, 마취약, 및 이의 동등물의 전달과 같은 주입 목적을 포함하는 예를 들어, 약제학적 또는 성형학적 사용; 상처 치유, 응고, 및 섬유소원 혈증용; 수술 또는 수술 후 후유증 억제 용; 코팅 보철술 용; 드레싱을 해야되는 상처 봉함용 및 안전하고 지속적인 지혈, 즉 환자의 봉함 유체 및/또는 공기 누출 및 이의 유사물 용등 어떠한 통상적인 분야에서도 사용될 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 통해 더욱 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 당분야의 당업자들에게 설명의 목적으로 제공되며, 이에 한정하고자함이 아니다. 또한, 이하 실시예는 첨부된 청구항의 범주 한정으로 해석되지 않는다. 따라서, 본 발명은 하기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명에서 제공된 결과로 증명될 수 있는 모든 변형을 포함한다.

본 발명의 피브리노겐 용액의 보관-안정성을 평가하기 위해, 피브리노겐 용액의 안정성, 용해성 및 응괴 활성을 다른 완충 용액(pH 수치), 온도, 및 프로테아제 저해제와 같은 첨가제를 갖는 다양한 보관 조건에 대해 평가하였다. 소의 피브리노겐, 소의 트롬빈, 아프로티닌, 완충 용액, 염화칼슘, 수산화나트륨 및 염산을 시그마 케미칼사, 세인트 루이스, 미주리에서 구입하였다. PPACK는 칼바이오켐, 샌디에고, 캘리포니아에서 구입하였다. 인간 피브리노겐은 53% 단백질(95% 응괴가능) 및 47% 염을 함유하는 것은 증명되었다.

표준 조사 등급 피브리노겐은 분리 및 정제 과정 중에 사용된 염을 함유한다. 상기 피브리노겐은 구연산나트륨 및 염화나트륨을 포함한다. 따라서, 40㎎/㎖의 피브리노겐 용액은 예를 들어, 피브리노겐과 함께 54mM의 구연산나트륨 및 419mM의 염화나트륨을 함유한다. 또한, 소듐 아자이드(0.025%)를 항균제로 각 샘플에 첨가하였다.

응괴 분석은 캐스퍼(Kasper, Proc. Symposium on Recent Advances in Hemophilia Care, Los Angeles, CA April 13015, 1989(in Liss, New York, 1990)에 따른 일반적인 방법으로 수행하였다. 각 피브리노겐 샘플의 일정부분(100㎕)을 4㎖ 폴리프로필렌 테스트 튜브에 넣었다. 각 샘플을 0.1M 수산화나트륨, 0.2M 히스티딘 완충용액(pH 6.0), 또는 0.1M 염산을 사용하여 중화(pH 7.0 - 7.3)하였다(보다 큰 부피를 사용하여 사전 연구로 결정됨). 트롬빈을 1M 염화칼슘과 함께 200유니트/㎖로 제조하였다(피브리노겐 시료에서 구연산나트륨보다 3 내지 6mM 과량의 칼슘).상기 트롬빈 시료를 0.1M 히스티딘 완충용액(pH 7.2)으로 희석하여 최종 100유니트/㎖의 트롬빈 농도(피브리노겐 ㎎ 당 2.5유니트의 트로빈)가 되었다. 모든 샘플은 실온(23±2℃)에서 분석하였다.

응괴는 100㎕의 트롬빈을 피브리노겐 샘플(100㎕)에 첨가하고 혼합물을 강하게 혼합할 때 발생되는 반응의 시간을 측정하여 측정하였다. 용액이 점성 겔(혼합되는 액체가 매우 느림)에서 고상 응괴(모든 액체가 혼합시 활동을 멈추는 점)가 될 때의 시간을 기록하였다. 고상 응괴가 되는 시간은 대개 겔 형성시간의 두배였다.

장기간 수용성 피브리노겐 용액을 저장할 수 있는 능력을 평가하기 위해서, 두개의 인간 피브리노겐 용액의 안정성, 용해성 및 응괴 활성을 5가지의 pH (pH 6.30 내지 pH 9.8) 범위, 프로테아제 저해제(PI) 존재 유무, 실온(∼23℃) 및 냉장(∼4℃) 온도에서 149일(21주 이상) 동안 보관 후 평가하였다. 인간 피브린(40㎎단백질/㎖)의 이중 샘플을 하기의 0.1M 완충용액 중 하나로 1일간 보관된 것에서 신선하게 제조하였다: 히스티딘, pH 6.0 또는 7.2; 트리스 pH 8.16; 글리신 pH 9.3; 또는 카르보네이트, pH 9.1 또는 pH 9.9. 프로테아제 제해제: PPACK(25uM 최종 농도) 및 아프로티닌(5㎍/㎖ 최종 농도)을 보관 전에 상기 두개 시료 중 하나에 첨가하였다.

응괴 능력을 평가하기 위해서, 상술한 프로토콜에 따라 중화하였고, 실시예 1에 기술한 바와 같이, 응괴를 테스트하였다.

조건에 따른 인간 피브리노겐의 응괴 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.

23℃ 및 4℃에서 프로테아제 저해제 없이 보관된 인간 피브리노겐의 응괴 시간

일	온도, ℃	응괴 시간(초)
일	온도, ℃	pH 6.32	pH 7.13	pH 8.04	pH 8.79	pH 9.43
4	23	10	10	11	12	120
4	4	10	10	9	10	응괴
7	23	10	10	9	11	240
7	4	10	9	8	9	12
22	23	10	8	10	>300	>300
22	4	10	8	9	NT	NT
97	23	30	>300	>300	>300	>300
97	4	18	10	10	11	>300
149	23	NT	>300	>300	NT	NT
149	4	15	135	30	>300	>300

NT: 테스트 하지 않음. "응괴"는 트롬빈 부재하에서 자발적 응괴를 의미함.

23℃ 및 4℃에서 프로테아제 저해제 존재하에 보관된 인간 피브리노겐의 응괴 시간

일	온도, ℃	응괴 시간(초)
일	온도, ℃	pH 6.32	pH 7.13	pH 8.04	pH 8.79	pH 9.43
4	23	20	30	100	50	130
4	4	>300	>300	360	120	120
7	23	20	25	60	30	240
7	4	>300	>300	180	150	70
22	23	25	11	18	30	>300
22	4	NT	65	60	NT	NT
97	23	NT	16	>300	>300	>300
97	4	18	16.5	45	30	180
149	23	NT	40	>300	NT	NT
149	4	NT	30	30	NT	>300

NT = 측정 안함.

실온에서 보관한 모든 인간 피브리노겐 샘플은 투명하였고 자발적 응괴를 함유하지 않았다. 냉장 인간 피브리노겐 샘플(∼4℃)은 또한 투명하였고 자발적 응괴를 함유하지 않았다(테스트한 가장 높은 pH의 한 시간점에서 한번의 소비 반응은 제외).

그러나, 상온에서 97일 후, 인간 피브리노겐의 pH 6.32 샘플만 응괴 능력을유지하였다. 대조적으로 ∼4℃에서 97일 후, 인간 피브리노겐의 pH 6.32, pH 7.13, 및 pH 8.04 샘플은 여전히 응괴가 가능하였다(9 내지 11초는 신선하게 제조된 대조구와 같다).

이후 분석에서 인간의 보관-안정한 피브리노겐 샘플은 약 pH 7.1에서 1년 동안 4℃에서 유지될 때 용해된 상태로 완전한 응괴 능력(트롬빈 활성에 의함)을 나타내었다.

앞선 우리의 추가적인 결과(나타내지 않음)의 관점에서, 약 pH 6.3에서 액상 피브리노겐 제제는 제품 안정성을 더욱 강화시킬 수 있다.

상온에서, PI의 존재하에서, 인간 피브리노겐의 단지 pH 7.13 샘플만이 응괴되었다(pH 6.32 샘플은 증발하여 테스트할 수 없었다). ∼4℃에서 PI의 존재하에서, 모든 인간 피브리노겐 샘플은 응괴 능력을 유지하였으나, 속도가 느렸다. 응괴 능력의 감소는 아마도 피브리노겐 용액에 첨가된 트롬빈을 저해하는 잔존한 PI의 활성때문일 것이다. 그러나, PI 성분은 또한 시간이 지남에 따라 감소되므로, PI(PPACK 또는 아프로티닌)를 함유하는 ∼23 또는 ∼4℃에서 보관 후에 평가한 샘플은 pH-의존적 결과를 나타내었다.

감소된 응괴 능력은 첨가된 트롬빈을 저해하는 피브리노겐 용액내에 잔존하는 PI의 활성때문에 나타났었다. 따라서, ∼4℃에서 보다 짧은 기간의 보관(4 내지 22일)은 본질적으로 트롬빈-의존적 응괴가 저해되는데, 즉, 용액에 남은 잔여 PI 저해제에 의해 트롬빈 활성이 저해되므로 트롬빈 첨가 이후 샘플이 응괴되지 않는다. 그러나, PI 성분은 시간에 따라 분해되므로, 이들의 활성도 따라서 감소한다.보다 긴 기간의 보관(22 내지 149일) 이후에, PI 활성이 감소되었으므로, 트롬빈 첨가는 피브리노겐 샘플의 응괴를 야기시킬 수 있다. 역시, 상기 반응은 pH-의존적이다.

프로테아제 저해제없이, pH 6.32 내지 8.04 범위의 pH 수준으로 냉장(∼4℃ 보관되면 적어도 149일 동안 보관 이후, 인간 피브리노겐은 완전 용해 상태의 수용액으로 존재하고 응괴 능력을 유지한다고 결론내렸다. 만약 트롬빈 첨가전에 상기 보관-안정한 시료를 (4℃)에서 유지시키면 활성(응괴가능) 인간 피브리노겐을 또한 pH 7.13 내지 8.05에서 적어도 149일 이후에 회수되었다.

본 발명을 바람직한 실시예를 통해 설명하고, 설명의 목적으로 많은 구체적 예를 설명하였다. 본 발명이 다양한 변형 및 추가적인 실시예에 적용될 수 있고, 본 발명에서 설명한 구체적인 내용들이 본 발명의 의도 및 범주를 벗어나지 않으면서 상당히 변화시킬 수 있음은 당 분야의 당 업자들에게 분명하다. 상기의 변형, 동등물 및 변이 및 추가적인 실시예는 또한 첨부된 청구항의 범주내이다.

Claims

보관이 안정하고, 농축된, 곧바로 사용가능한 생물학적으로 적합한 인간 피브리노겐 용액에 있어서, 상기 피브리노겐 용액의 안정성은 pH 및 온도 의존적인 것을 특징으로 하는 보관 안정한 피브리노겐 용액.
제1항에 있어서, 상기 피브리노겐은 완전 용해되고, 상기 용액은 수용성인 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피브리노겐 용액의 안정성은 제조일로 부터 적어도 1일 내지 1년 이상의 보관 기간동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐 용액은 히스티딘, 트리스, 글리신 또는 카르보네이트로 이루어진 그룹으로 부터 선택된 pH-조절 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 pH 6.53 내지 8.04의 pH 범위로 완충되며 상기 보관 온도는 약 4℃ 온도의 냉장에서 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보관 완충용액은 히스티딘인 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 7일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 22일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 97일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 149일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 1년 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액은 pH 6.3 내지 8.04의pH 범위로 완충되고 상기 보관 온도는 상온으로 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제12항에 있어서, 상기 보관 안정성은 적어도 22일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제12항에 있어서, 상기 보관 pH는 약 pH 6.3으로 적어도 97일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
멸균 조건하에서 신선하게 제조된 피브리노겐 용액 또는 프라즈마 또는 동결 피브리노겐 시료로 부터 신선하게 분리 및 정제된 피브리노겐 용액을 제조하는 단계;

멸균 조건하에서, 상기 신선하게 제조 또는 신선하게 분리 및 정제된 피브리노겐 용액을 보관하는 단계, 및

상기 피브리노겐 용액을 냉장 온도에서 보관하는 단계를 포함하며,

상기 피브리노겐 용액은 액상이고, pH 6.32 내지 8.04 범위의 pH 수준이며, 피브리노겐의 생물학적 적합성 및 생물학적 활성이 유지되는 조건하에서 유지되는 것을 특징으로 하는 곧바로 사용가능한, 수용성 용액으로 인간 피브리노겐을 안전하게 보관하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 방법은 제조일로 부터 적어도 1일 내지 1년 이상의 보관 기간동안 안정성을 유지시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 냉장 온도는 약 4℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 7일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 22일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 97일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 149일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 1년 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제15 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피브리노겐 제조 단계는 안전하고, 곧바로 사용가능한 수용성 피브리노겐 용액의 제조 전에 적어도 한번 동결, 해동 및 재동결되는 것을 특징으로 하는 방법.
멸균 조건하에서 신선하게 제조된 피브리노겐 용액 또는 프라즈마 또는 동결 피브리노겐 시료로 부터 신선하게 분리 및 정제된 피브리노겐 용액을 제조하는 단계; 및

상기 피브리노겐 용액을 냉장 온도, pH 6.32 내지 8.04 범위의 pH 수준, 및 피브리노겐의 생물학적 적합성 및 생물학적 활성이 유지되는 조건하에서 보관시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 곧바로 사용가능한, 수용성 용액으로 인간 피브리노겐을 안전하게 보관하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 방법은 최초 제조 이후 적어도 1일 내지 1년 이상의 보관 기간동안 안정성을 유지시키는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 피브리노겐 용액.
제24항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 온도는 약 23℃로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 7일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 22일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 97일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정성은 적어도 1년 동안 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.