KR20040045960A - Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same - Google Patents

Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same Download PDF

Info

Publication number
KR20040045960A
KR20040045960A KR1020020073727A KR20020073727A KR20040045960A KR 20040045960 A KR20040045960 A KR 20040045960A KR 1020020073727 A KR1020020073727 A KR 1020020073727A KR 20020073727 A KR20020073727 A KR 20020073727A KR 20040045960 A KR20040045960 A KR 20040045960A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gst
protein
recombinant
gene
rgst
Prior art date
Application number
KR1020020073727A
Other languages
Korean (ko)
Other versions
KR100477928B1 (en
Inventor
공광훈
조현영
Original Assignee
공광훈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 공광훈 filed Critical 공광훈
Priority to KR10-2002-0073727A priority Critical patent/KR100477928B1/en
Publication of KR20040045960A publication Critical patent/KR20040045960A/en
Application granted granted Critical
Publication of KR100477928B1 publication Critical patent/KR100477928B1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

PURPOSE: Recombinant glutathione S-transferase(GST) protein isolated from Oryza sativa and a method for mass-producing the same are provided, which GST protein is useful in the analysis of detoxification metabolism of herbicide, agricultural chemicals or drugs in plant cells, or in the diagnosis of chemical therapy as a target molecule or cancer marker. CONSTITUTION: The recombinant glutathione S-transferase(GST) protein has the following properties: (a) molecular weight of 28 kDa; (b) optimal pH of pH 9; (c) optimal temperature of 45 deg. C; and substrate specificity to CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy) propane) and CP(cumene hydroperoxide), wherein the GST protein has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; the GST protein is derived from Oryza sativa; and a gene encoding the GST protein has the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 5. An expression vector pET-rGST contains the GST protein gene. A transformed E. coli is produced with the expression vector pET-rGST. The method for mass-producing the recombinant glutathione S-transferase(GST) protein comprises culturing the transformed E. coli and purifying the cultured medium by subjecting it to glutathione-sepharose affinity chromatography.

Description

벼 유래의 재조합 ＧＳＴ 단백질 및 상기 단백질을 대량 생산하는 방법{Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same}Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same}

본 발명은 벼 유래의 재조합 GST(glutationeS-transferase) 단백질 및 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 이용하여 상기 단백질을 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant GST (glutatione S- transferase) protein derived from rice and a method for mass production of the protein, more specifically, a recombinant GST protein characterized in that it has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 The present invention relates to a method for mass production of a protein using a recombinant expression vector pET-rGST comprising a gene encoding a protein.

농작물에 대한 제초제(herbicide)의 처리는 농업학적으로 수확량의 증대를 가져왔다. 제초제는 식물종마다 다른 종류를 사용하며, 각 종마다 다른 해독작용(detoxification)을 거치게 된다(Lamoureuxet al.,J. Agric. Food. Chem.28: 1057-1070, 1980). GST(Glutathione S -transferase, EC 2.5.1.18)는 식물 세포의 해독 작용 에 관여하는 효소이다(Rushmore and PickettJ. Biol. Chem.268: 11475-11478, 1993; Mannervik and DanielsonCRC Crit. Rev. Biochem.23: 283-337, 1988). 이 효소는 다양한 소수성 화합물에 글루타치온(Glutathione;GSH, γ-Glu-Cys-Gly)과의 친전자성 반응을 촉매하며, 척추동물, 곤충, 선충류, 효모, 호기성균 등에서 발견된다. 또한, GST는 다른 유기체에서도 발암물질(carcinogens), 약물(Hayeet al.,Carcinogenesis.9(7):1283-1287, 1988), 농약(Tsuchida and SatoJ Biol Chem.265(13): 7150-7157, 1990)에 대한 세포 내 해독작용에 있어 중요한 역할을 하고 있다. 식물 GSTs는 결합(conjugation)에 의해 독성 물질을 불활성화시키며, 병원균, 산화적 스트레스(oxidative stress), 식물 호르몬(phytohormone) 처리에 따른 스트레스 반응을 완화시킨다. 식물 GSTs의 다른 효소학적인 기능으로는 약물, 호르몬 등과 같은 소수성 비결합 화합물(non-substrate compounds)의 세포 내 이동과 저장을 촉진시킨다. 또한, GSTs는 세포 내 옥신 반응에 중요한 역할을 한다(Takahashiet al.,Planta.196(1): 111-117, 1995).Treatment of herbicides on crops has led to an increase in yield agriculturally. Herbicides are used in different plant species, and each species undergoes different detoxification (Lamoureux et al ., J. Agric. Food. Chem. 28: 1057-1070, 1980). G lutathione S - t ransferase (EC 2.5.1.18) is an enzyme involved in the detoxification of plant cells (Rushmore and Pickett J. Biol. Chem. 268: 11475-11478, 1993; Mannervik and Danielson CRC Crit. Rev Biochem. 23: 283-337, 1988). The enzyme catalyzes the electrophilic reaction with glutathione (GSH, γ-Glu-Cys-Gly) to various hydrophobic compounds and is found in vertebrates, insects, nematodes, yeasts, aerobic bacteria and the like. GST is also found in other organisms such as carcinogens, drugs (Haye et al ., Carcinogenesis. 9 (7): 1283-1287, 1988), pesticides (Tsuchida and Sato J Biol Chem. 265 (13): 7150- 7157, 1990) and plays an important role in intracellular detoxification. Plant GSTs inactivate toxic substances by conjugation and mitigate the stress response caused by pathogens, oxidative stress and phytohormone treatment. Other enzymatic functions of plant GSTs promote intracellular transport and storage of non-substrate compounds such as drugs and hormones. GSTs also play an important role in intracellular auxin responses (Takahashi et al ., Planta. 196 (1): 111-117, 1995).

최근에는 드루그 등의 분류법에 의해 GSTs를 아미노산 서열 동일성과 인트론 대 엑손의 보존 관계(intron:exon conservation)에 따라 분류하고 있다(Drooget al., Plant. Mol. Biol.29: 413-429, 1995). Ⅰ형 GSTs는 제초제 해독작용을 담당하며, 식물의 이소효소(isozyme)가 이에 해당한다. 이들은 세 개의 엑손과 두 개의 인트론으로 구성된다. 또한, Ⅰ형의 GSTs는 방어 유전자(defense genes)(Bartlinget al.,Eur. J. Biochem.216: 579-586, 1993)와 세포 내 예방 보호 유전자(cellular protectant genes)로서 기능을 하며, 병원균 공격 및 상처에 대응하는 단백질을 생산한다. 실렌(Silene)(Groveet al.,Nucleic. Acids. Res.16: 425-438, 1988), 사탕수수(Gronwaid and PlaisancePlant Physiol.117(3):877-892, 1988), 브로콜리(broccoli)(Irzyk and FuerstPlant. physiol.102: 803-810, 1993) 및 애기장대(Arabidopsis)(Frilinget al.,Proc Natl Acad Sci U S A.89(2): 668-672, 1992)의 GSTs가 이에 포함된다. Ⅱ형 GSTs는 10개의 엑손과 9개의 인트론으로 구성되는데, 이에 대해서는 오직 카네이션에서만 연구되어졌다(Dudleret al.,Mol Plant Microbe Interact.4(1): 14-18, 1991). Ⅱ형의 GSTs는 식물 기관에서 에틸렌(ethylene)과 노화 관련 유전자(senescence-related genes)로 발현된다. 마지막으로 Ⅲ형 GSTs는 2개의 엑손과 1개의 인트론으로 구성되며, 옥신 조절 유전자(auxin-regulated genes)(Drooget al.,Plant Mol Biol.21(6): 965-72, 1992)로서 기능을 한다.Recently, GSTs have been classified according to amino acid sequence identity and intron: exon conservation by Drug et al. (Droog et al., Plant. Mol. Biol. 29: 413-429, 1995). Type I GSTs are responsible for herbicide detoxification, which is the isozyme of plants. They consist of three exons and two introns. In addition, type I GSTs function as defense genes (Bartling et al ., Eur. J. Biochem. 216: 579-586, 1993) and cellular protectant genes. Produces proteins that respond to attacks and wounds. Xylene (Silene) (Grove et al, Nucleic Acids Res 16:.... 425-438, 1988), sugarcane (Gronwaid and Plaisance Plant Physiol 117 ( 3):. 877-892, 1988), broccoli (broccoli) (Irzyk and Fuerst Plant physiol 102: .. 803-810, 1993) and Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): the GSTs of (Friling et al, Proc Natl Acad Sci US A. 89 (2). 668-672, 1992) in Included. Type II GSTs consist of 10 exons and 9 introns, which have only been studied in carnations (Dudler et al ., Mol Plant Microbe Interact. 4 (1): 14-18, 1991). Type II GSTs are expressed in plant organs as ethylene and senescence-related genes. Finally, type III GSTs consist of two exons and one intron and function as auxin-regulated genes (Droog et al ., Plant Mol Biol. 21 (6): 965-72, 1992). do.

또한, 수용성 세포질 GSTs는 이들의 서열 유사성과 면역적 교차반응(immunological cross-reactivity)에 따라 알파(Alpha, α)-, 무(Mu, μ)-, 파이(Pi, φ)-, 시그마(Sigma, σ- 및 세타(Theta, θ)- 클래스(class)로 분류된다(Mannerviket al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA82: 7202-7206, 1985). 상기 다섯 종류의 GSTs는 X-선 구조분석을 통해 유사한 이량체(dimeric) 구조를 가지는 것으로 보고되었다(Sinninget al.,J. Mol. Biol.232(1): 192-212, 1993). 각 클래스는 촉매 중심(catalytic centre)과 C-말단(terminus)에 특이성을 가지나, 전체적인 위치에 있어서는 유사성을 보인다(Reinemeret al.,J. Mol. Biol.255: 289-309, 1996). 애기장대(Arabidopsis thalianaHeynh)의 GST(araGST)의 구조가 최초로 규명되었는데(Reinemeret al.,J. Mol. Biol. 255: 289-309, 1996), 상기 araGST는 동종 이량체(homodimer)로서 각 부분(sub-unit)은 다른 길이의 연결단편(segment)으로 연결된 두 개의 영역(domain)으로 구성되어 있다. 최근에는 옥수수(maize) GST의 구조에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Neuefeindet al.,J. Mol. Biol.274(4): 446-453, 1997). GST 활성부위는 두 개의 결합부위(G-site/H-site)를 포함하고 있다. G-부분(site)은 글루타치온 결합(glutathione binding)이 일어나는 부위로서 친수성이며 매우 높은 특이성을 가진다. 반면에 H-부분은 소수성이고, 구조학적으로 낮은 특이성을 가진 다른 기질들의 결합(binding)을 활성화시킨다.In addition, water soluble cytoplasmic GSTs are characterized by their sequence similarity and immunological cross-reactivity, such as alpha, alpha, mu, μ, pi, and sigma. , σ- and theta, θ-class (Mannervik et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7202-7206, 1985). It has been reported by line structure analysis to have a similar dimeric structure (Sinning et al ., J. Mol. Biol. 232 (1): 192-212, 1993) .Each class is catalytic centre. Specificity at the C-terminus and C-terminus, but similar in overall position (Reinemer et al ., J. Mol. Biol. 255: 289-309, 1996) .GST of Arabidopsis thaliana Heynh araGST) was first identified (Reinemer et al ., J. Mol. Biol . 255: 289-309, 1996), where araGST is a homodimer, with each sub-unit of a different length. As a segment It is composed of two connected domains. Recently, studies on the structure of maize GST have been actively conducted (Neuefeind et al ., J. Mol. Biol. 274 (4): 446-453, GST site contains two binding sites (G-site / H-site) G-site is hydrophilic and has very high specificity as a site where glutathione binding occurs. While the H- moiety is hydrophobic and activates the binding of other substrates with structurally low specificity.

한편, 지금까지 동물, 식물, 박테리아 등을 포함하는 다양한 유기생물체로부터 여러 유전자들이 규명되었다. 현재 유전자의 규명은 대부분 생물체로부터 클로닝한 미지의 유전자의 염기서열을 분석한 후, 이를 다시 서열 상동성 검색 프로그램으로 분석하여 높은 상동성을 나타내는 공지의 유전자를 탐색함으로써 미지의 유전자가 상기 공지의 유전자와 동일한 기능을 하는 유전자일 것이라고 추정한다. 이는 염기서열의 상동성이 높을수록 동일한 단백질을 암호화할 확률이 크기 때문이다. 이렇게 기능이 추정된 유전자의 염기서열은 "추정되는(putative)..."라는 유전자 산물(product) 명으로 NCBI 진뱅크 상에 등록된다. 그러나, 서열 상동성 검색으로 클로닝한 유전자의 기능을 추정하였다고 해서, 반드시 그 유전자가 동일한 유전자 산물을 100% 암호화하는 것은 아니다. 실제로 본 발명자가 진뱅크 상에 등록된 4개의 추정되는 GST 유전자(표 1 참조)를 단백질로 발현시킨 결과, 그 중에서 2개의 유전자로부터 발현된 단백질만이 GST 활성이 가지고 있음을 확인할 수 있었다.Meanwhile, various genes have been identified from various organic organisms including animals, plants, bacteria, and the like. Currently, the identification of genes is mostly performed by analyzing the nucleotide sequences of unknown genes cloned from living organisms, and then analyzing them by sequence homology search program to search for known genes showing high homology. It is assumed that the gene has the same function as. This is because the higher the homology of the nucleotide sequence is likely to encode the same protein. The base sequence of the gene whose function is estimated is registered on NCBI GenBank under the name of the gene product "putative ...". However, estimating the function of a cloned gene by sequence homology search does not necessarily mean that the gene encodes the same gene product 100%. In fact, the present inventors expressed four putative GST genes (see Table 1) registered on GenBank as proteins, and it was confirmed that only those proteins expressed from two genes had GST activity.

진뱅크 등록번호Genebank Registration Number 진뱅크에 등록된 유전자 산물 명Gene product name registered in Gene Bank 실제 유전자 산물Real gene products 1One AF309384AF309384 추정되는 GSTEstimated GST GSTGST 22 AF309382AF309382 추정되는 GSTEstimated GST GSTGST 33 AF309380AF309380 추정되는 GSTEstimated GST GST-CDNB 활성이 없음No GST-CDNB Activity 44 AF309377AF309377 추정되는 GSTEstimated GST GST-CDNB 활성이 없음No GST-CDNB Activity

따라서, 클로닝한 유전자의 정확한 기능을 알기 위해서는, 유전자의 염기서열을 규명하여 이로부터 기능(유전자 산물)이 추정된다 할지라도, 상기 유전자를 직접 단백질로 발현시켜서 발현된 단백질이 염기서열로부터 추정된 기능과 동일한 기능을 하는지에 대해 확인해 보아야 할 필요성이 있다.Therefore, in order to know the exact function of the cloned gene, even if the sequence of the gene is identified and the function (gene product) is estimated from the gene, the expressed protein is expressed from the sequence by directly expressing the gene as a protein. There is a need to check that it does the same.

이에, 본 발명자들은 진뱅크 AF309382에 개시된 벼의 '추정되는 글루타치온 S-전이효소 OsGSTF5'의 염기서열을 참고로 하여, 벼로부터GST유전자를 클로닝하였으며, 상기 유전자를 발현시키기 위한 대장균 대량 발현계를 구축하였다. 또한, 상기 대장균 대량 발현계를 통하여 재조합 GST 단백질을 대장균에서 대량 발현시키고, 이를 분리·정제한 후, 재조합 GST 단백질의 특성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors cloned the GST gene from rice with reference to the nucleotide sequence of 'estimated glutathione S-transferase OsGSTF5' of rice disclosed in GenBank AF309382, and established a large E. coli mass expression system for expressing the gene. It was. In addition, the present invention was completed by mass-expressing recombinant GST protein in Escherichia coli through the E. coli mass expression system, separating and purifying it, and then identifying the characteristics of the recombinant GST protein.

따라서, 본 발명의 목적은 벼 유래의 재조합 GST 단백질을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a recombinant GST protein derived from rice.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 GST 단백질을 대량 발현시키기 위한 대량 발현계를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a mass expression system for mass expression of the recombinant GST protein.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for mass production of the recombinant GST protein.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질을 발현시키기 위한, 재조합 발현 벡터 pET-rGST의 제조과정을 나타낸 모식도이다.1 is a schematic diagram illustrating a process for preparing a recombinant expression vector pET-rGST for expressing a recombinant GST protein according to the present invention.

rGST: 벼의GST유전자rGST: rice GST gene

도 2는 PCR에 의해 증폭된rGST유전자의 단편을 확인하기 위해 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.Figure 2 is a gel photograph showing the results of performing 1% agarose gel electrophoresis to identify fragments of the rGST gene amplified by PCR.

레인 Ma: λ-DNA/HindⅢ 분자량 마커Lane M a : λ-DNA / Hin dIII molecular weight marker

레인 1: 증폭된rGST유전자Lane 1: amplified rGST gene

레인 Mb: φX174/HincⅡ 분자량 마커(1057bp, 770bp, 612bp, 459bp...)Lane M b: φX174 / Hinc Ⅱ molecular weight markers (1057bp, 770bp, 612bp, 459bp ...)

도 3은 pET-rGST 벡터 내에 삽입된rGST유전자를 확인하기 위하여, 상기 벡터에NdeⅠ 및BamHⅠ을 처리하여 1% 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.3 is a gel photograph showing the results of 1% electrophoresis by treating Nde I and Bam HI to the vector to confirm the rGST gene inserted into the pET-rGST vector.

레인 M: λ-DNA/HindⅢ 분자량 마커Lane M: λ-DNA / Hin dIII molecular weight marker

레인 1: 제한효소를 처리하지 않은 pET-rGSTLane 1: pET-rGST without restriction enzyme treatment

레인 2: 제한효소를 처리한 pET-rGSTLane 2: pET-rGST Treated with Restriction Enzyme

도 4는 본 발명에 따라 벼로부터 클로닝된rGST유전자의 염기서열을 다른 종의GST유전자의 염기서열과 비교하여 도시한 것으로서, 염기서열이 일치하는 부분은 검정색 음영으로 표시하였다.Figure 4 shows the base sequence of the rGST gene cloned from rice in accordance with the present invention compared with the base sequence of the GST gene of other species, the portion of the base sequence is shown in black shades.

A: 본 발명의rGST유전자A: rGST gene of the present invention

B: 옥수수(Zea mays)의GST유전자(진뱅크 등록번호: AF244673)B: GST gene of corn ( Zea mays ) (Genbank Accession No .: AF244673)

C: 옥수수(Maize)의GST유전자(진뱅크 등록번호: P46420)C: GST gene of Maize (Genbank accession number: P46420)

D: 밀(Triticum aestivum)의GST유전자(진뱅크 등록번호: CAD11966)D: GST gene of wheat ( Triticum aestivum ) (Genbank accession number: CAD11966)

도 5는 GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피에 의해 수득된 각 분획의 GST 활성 및 단백질 양을 나타낸 그래프이다.5 is a graph showing the GST activity and protein amount of each fraction obtained by GSH-Sepharose affinity chromatography.

-●-: GST 활성-●-: GST active

-■-: 단백질 양-■-: protein amount

도 6은 조추출물로부터 정제된 재조합 GST 단백질을 확인하기 위하여, 12.5% SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타내는 겔 사진이다.Figure 6 is a gel photograph showing the result of performing 12.5% SDS-PAGE to identify the purified recombinant GST protein from the crude extract.

레인 M: 분자량 마커Lane M: molecular weight marker

레인 1: 조추출물Lane 1: crude extract

레인 2: GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피로 정제된 재조합 GST 단백질Lane 2: recombinant GST protein purified by GSH-Sepharose affinity chromatography

도 7은 수퍼덱스 200 컬럼(superdex 200 column)에 의해 정제된 재조합 GST 단백질의 분자량을 나타내는 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing the molecular weight of recombinant GST protein purified by superdex 200 column. FIG.

A: 블루 덱스트란(2,000kDa)A: Blue Dextran (2,000kDa)

B: 효모 알코올 탈수소효소(150kDa)B: Yeast Alcohol Dehydrogenase (150 kDa)

C: BSA(66kDa)C: BSA (66 kDa)

D: 트립신 저해제(29.8kDa)D: trypsin inhibitor (29.8 kDa)

E: 싸이토크롬 C(12.4kDa)E: cytochrome C (12.4 kDa)

도 8은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-CDNB의 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)이다.8 is a Lineweaver-Burk plot of GSH-CDNB with recombinant GST protein according to the present invention.

A: CDNBB:GSHA: CDNBB: GSH

도 9는 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-EPNP의 라인위버-버크 플롯이다.9 is a Lineweaver-Burk plot of GSH-EPNP by recombinant GST protein according to the present invention.

A: EPNPB:GSHA: EPNPB: GSH

도 10은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질에 의한 GSH-CP의 라인위버-버크 플롯이다.10 is a Lineweaver-Burk plot of GSH-CP by recombinant GST protein according to the present invention.

A: CPB:GSHA: CPB: GSH

도 11은 pH 변화에 따른 재조합 GST 단백질의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.11 is a graph showing the change in activity of recombinant GST protein with pH change.

-●-: 구연산-나트륨 인산 완충용액(pH 4.0 ~ 6.0)-●-: citric acid-sodium phosphate buffer (pH 4.0 ~ 6.0)

-■-: 인산 칼륨 완충용액(pH 6.0 ~ 8.5)-■-: Potassium phosphate buffer solution (pH 6.0 ~ 8.5)

-▲-: 트리스-염산 완충용액(pH 8.5 ~ 9.5)-▲-: Tris-HCl buffer (pH 8.5 ~ 9.5)

-◆-: 글리신-수산화나트륨 완충용액(pH 9.5 ~ 10.5)-◆-: glycine-sodium hydroxide buffer solution (pH 9.5 ~ 10.5)

도 12는 온도 변화에 따른 재조합 GST 단백질의 활성 변화를 나타내는 그래프이다.12 is a graph showing the change in activity of recombinant GST protein with temperature change.

도 13은 재조합 GST 단백질의 열에 대한 안정성을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.Figure 13 is a graph showing the results of examining the stability of the heat of the recombinant GST protein.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 벼 유래의 재조합 GST 단백질을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a recombinant GST protein derived from rice, characterized by having the following characteristics (a) to (d).

(a) 분자량 28kDa;(a) molecular weight 28 kDa;

(b) 최적 pH 9;(b) optimum pH 9;

(c) 최적 온도 45℃; 및(c) an optimum temperature of 45 ° C .; And

(d) CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대한 기질 특이성(d) Substrate specificity for CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA (ethacrynic acid), EPNP (1,2-epoxy-3- (ρ-nitrophenoxy) propane) and CP (cumene hydroperoxide)

본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다.The recombinant GST protein derived from rice according to the present invention preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 6.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 GST 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제공한다.In addition, to achieve another object of the present invention, the present invention provides a recombinant expression vector pET-rGST comprising a gene encoding the recombinant GST protein.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve another object of the present invention, the present invention

(a) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GST를 암호화하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써GST유전자를 증폭시키는 단계;(a) amplifying the GST gene by performing PCR using a primer for amplifying the gene encoding the GST having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6;

(b) 상기 증폭된GST유전자를 pET-26b(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하는 단계;(b) cloning the amplified GST gene into pET-26b (+) to prepare a recombinant expression vector pET-rGST;

(c) 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST로 대장균을 형질전환하는 단계; 및(c) transforming Escherichia coli with the recombinant expression vector pET-rGST; And

(d) 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.(d) culturing the transformed Escherichia coli, expressing the recombinant GST protein, and then collecting and purifying the recombinant GST protein, thereby providing a method for mass-producing a recombinant GST protein.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 '추정되는 글루타치온S-전이효소 OsGSTF5'의 염기서열을 참고로 하여 벼로부터GST유전자를 클로닝하였으며, 본 발명은 클로닝된GST유전자가 대장균에서 GST 활성을 나타내는 효소의 기능을 갖는 단백질로 발현됨을 실험을 통해 직접 확인하였다는 점에 특징이 있다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 발현을 위한 대장균 대량 발현계를 구축하였다는 점에 특징이 있다.The present inventors have disclosed in Gene Bank registration number AF309382 - was to a base sequence of the "estimation of glutathione S is transferase OsGSTF5 'by reference cloning the GST gene from rice, the enzyme of this invention is a cloned GST gene represents a GST activity in E. coli Characterized in that it was directly confirmed through experiments that the protein is expressed as a function of. In addition, the present invention is characterized in that the E. coli mass expression system for the expression of the recombinant GST protein according to the present invention was constructed.

본 발명의 일 실시예에서는 벼로부터GST유전자를 클로닝하기 위하여, 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 염기서열을 참고로 하여GST유전자 증폭용 프라이머쌍을 합성하였다. 상기GST유전자 증폭용 프라이머쌍은 각 염기서열 내에 적절한 서열의 클로닝을 위해 제한 효소의 부위를 포함하도록 제작되는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명자들은 프라이머의 각 서열 내에NdeⅠ과BamHⅠ의 제한효소 인식 부위가 존재하도록 제작하였다(표 3 참조). 본 발명자가 제작한GST유전자 증폭용 프라이머쌍의 염기서열을 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 기재하였다. 이후, 제작된 프라이머쌍을 이용하여 벼로부터GST유전자를 증폭시켰다(도 2 참조). 본 발명자들은 증폭된GST유전자를 벼(rice)로부터 분리되었다는 의미로 'rGST유전자'라 명명하였다. 벼로부터 클로닝된rGST유전자의 염기서열을 서열번호 5로 기재하였으며, 이로부터 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 6으로 기재하였다. 상기 rGST 유전자의 염기서열을 다른 종의 GST와 비교한 결과, 세타(theta, θ) 클래스의 GSTs와 54 내지 71%의 상동성을 보임을 확인할 수 있었다(도 4 참조).In an embodiment of the present invention, in order to clone the GST gene from rice, a primer pair for amplifying the GST gene was synthesized with reference to the nucleotide sequence disclosed in GenBank Accession No. AF309382. The primer pair for amplification of the GST gene is preferably prepared to include a restriction enzyme site for cloning an appropriate sequence in each base sequence. Specifically, the present inventors prepared so that restriction enzyme recognition sites of Nde I and Bam HI exist in each sequence of the primer (see Table 3). The base sequences of the primer pair for amplification of the GST gene produced by the present inventor are described as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. Thereafter, the prepared primer pairs were used to amplify the GST gene from rice (see FIG. 2). We named the amplified GST gene ' rGST gene' to mean that it was isolated from r ice. The base sequence of the rGST gene cloned from rice was described in SEQ ID NO: 5, and the amino acid sequence of the protein encoded therefrom was described in SEQ ID NO: 6. Comparing the nucleotide sequence of the rGST gene with GST of other species, it was confirmed that the homology of 54 to 71% with the GSTs of theta (theta, θ) class (see Fig. 4).

본 발명의 다른 실시예에서는 벼로부터 증폭된rGST유전자를 발현시키기 위한 대량발현계를 구축하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 상기 증폭된rGST유전자를 대장균용 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 상기 대장균용 발현 벡터로는 외래 유전자를 대장균 내에서 발현시킬 수 있는 벡터라면 제한없이 이용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 재조합 유전자의 클로닝 및 대장균 내 발현에 매우 효율적인 것으로 알려진 pET-26b(+)를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명자들은rGST유전자를 상기 pET-26b(+)에 삽입하여 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하였다(도 1 참조).In another embodiment of the present invention, a mass expression system for expressing rGST gene amplified from rice was constructed. To this end, the inventors inserted the amplified rGST gene into an E. coli expression vector to prepare a recombinant expression vector. As the expression vector for E. coli, any vector capable of expressing a foreign gene in E. coli may be used without limitation, and more preferably, pET-26b (+), which is known to be highly efficient for cloning of recombinant gene and expression in E. coli, may be used. It is preferable to use. Specifically, the inventors inserted the rGST gene into the pET-26b (+) to prepare a recombinant expression vector pET-rGST (see FIG. 1).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 이용하여 대장균을 형질전환시킨 후, 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST단백질을 발현시켰다. 이 때 배양은 배양액의 OD600값이 0.3-0.4가 되었을 때, IPTG를 최종농도 0.4mM로 첨가한 후, 11시간 정도 더 배양하는 것이 바람직하다. 상기 조건에서 배양할 때 GST 활성이 가장 높은 것으로 조사되었다(결과 미도시). 이후, 발현된 재조합 GST 단백질을 대장균 배양액으로부터 분리·정제하였다. 이 때 사용될 수 있는 분리·정제 방법으로는 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 이용한 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명에서는 GSH-세파로즈 친화 크로마토그래피(GSH-sepharose affinity chromatography)를 이용하였다(도 6 참조). 정제된 재조합 GST 단백질의 비활성을 조사한 결과, 조추출물(crude extract)에 비해 6배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다(표 4 참조).In another embodiment of the present invention, E. coli was transformed using the recombinant expression vector pET-rGST according to the present invention, followed by culturing the transformed E. coli to express the recombinant GST protein. At this time, when the OD 600 value of the culture solution is 0.3-0.4, the culture is preferably incubated for about 11 hours after adding the IPTG to the final concentration of 0.4 mM. GST activity was found to be the highest when cultured under these conditions (result not shown). Thereafter, the expressed recombinant GST protein was isolated and purified from E. coli culture. In this case, affinity chromatography using a substance capable of specifically binding to GST may be used as a separation and purification method. Specifically, in the present invention, GSH-sepharose affinity chromatography was used (see FIG. 6). As a result of investigating the inactivation of the purified recombinant GST protein, it was confirmed that the increase was about 6 times compared to crude extract (see Table 4).

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 이화학적 특성 및 효소학적 특성은 다음과 같다.Physicochemical and enzymatic properties of the recombinant GST protein according to the present invention are as follows.

1) 분자량1) Molecular Weight

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 분자량은 SDS-PAGE를 통해 28kDa로, 겔 크로마토그래피를 통해 55kDa인 것으로 규명되었다(도 6 및 도 7 참조). 이 결과로부터 본 발명에 따라 벼로부터 클로닝된 GST 단백질의 활성형은 2개의 서브유닛(subunit)으로 이루어진 동형 이량체(homo-dimer)의 구조인 것으로 추정된다.The molecular weight of the recombinant GST protein according to the present invention was found to be 28 kDa via SDS-PAGE and 55 kDa via gel chromatography (see FIGS. 6 and 7). From these results, it is estimated that the active form of the GST protein cloned from rice according to the present invention is a homo-dimer structure composed of two subunits.

2) 기질 특이성2) substrate specificity

하기 표 2에 기재된, 여러 특성을 갖는 7종류의 기질을 대상으로 하여 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 기질 특이성을 조사한 결과, CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대해서만 활성을 나타내었으며, 그 중에서 EPNP에 대한 비활성이 0.852±0.012μmol/min/mg으로 가장 높은 수치를 나타내었다(표 6 참조).As a result of investigating the substrate specificity of the recombinant GST protein according to the present invention with respect to seven kinds of substrates having various properties shown in Table 2, CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) and ETA (ethacrynic acid) , EPNP (1,2-epoxy-3- (ρ-nitrophenoxy) propane) and CP (cumene hydroperoxide) showed activity only, and the highest activity was 0.852 ± 0.012μmol / min / mg (See Table 6).

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 기질 특이성 조사에 이용된 기질 및 이들의 특성Substrates and Their Properties Used to Investigate Substrate Specificity of Recombinant GST Proteins According to the Present Invention 기질temperament 기질의 특성The nature of the substrate CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene) 대부분의 GST의 공통적인 기질Common substrates of most GSTs DCNB(1,2-dichloro-4-nitrobenzene)DCNB (1,2-dichloro-4-nitrobenzene) 포합 반응에 대한 초기속도 측정에 이용되는 기질이며, 뮤(Mu, μ) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임Substrate used to measure the initial rate for the inclusion reaction, showing high activity on GST of Mu (μ) class ETA(ethacrynic acid)Etacrynic acid (ETA) 파이(Pi, φ) 클래스의 GST 규명에 이용됨Used to identify GST of Pi, φ class EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane)EPNP (1,2-epoxy-3- (ρ-nitrophenoxy) propane) 에폭사이드 고리 열림(epoxide ring opening) 반응 측정에 이용되며, 세타(theta, θ) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임It is used to measure the epoxide ring opening reaction and shows high activity on GST of theta (θ) class. 스테로이드(Δ5-androstene-3,17-dione)Steroid (Δ 5 -androstene-3,17-dione) 스테로이드 이성질화 효소(steroid isomerase) 활성 측정에 이용됨Used to measure steroid isomerase activity 4-NPB(4-nitrophenethyl bromide)4-nitrophenethyl bromide (4-NPB) 세타 클래스의 식물 GST 규명에 이용됨Used to identify plant GST of theta class CP(cumene hydroperoxide)Cumene hydroperoxide (CP) 글루타치온 퍼옥시데이즈(glutathione peroxidase) 활성 측정에 이용되며, 알파(alpha, α) 클래스의 GST에 높은 활성을 보임It is used to measure glutathione peroxidase activity and shows high activity on GST of alpha (alpha, α) class.

3) 각 기질에 대한 Km 값 및 Vmax 값3) Km and Vmax values for each substrate

상기 표 2에 기재된 7종류의 기질 중에서 EPNP에 대한 Km값이 0.05mM로 가장 작은 수치를 나타내었으며, 이 때 Vmax 값은 0.22U/mg이었다(표 7 참조).Among the seven kinds of substrates described in Table 2, the Km value for EPNP was the smallest value of 0.05 mM, and the Vmax value was 0.22 U / mg (see Table 7).

4) 저해효과4) inhibitory effect

표 8에 기재된 다양한 저해제를 이용하여 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH-CDNB 결합에 대한 저해 효과를 조사한 결과,S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH)의IC 50 값(효소의 활성을 50%로 감소시키는 저해제의 농도)이 1.25±0.03μM로 가장 낮은 수치를 나타내었다(표 8 참조).As a result of investigating the inhibitory effect on GSH-CDNB binding of the recombinant GST protein according to the present invention using various inhibitors described in Table 8, the IC 50 value of S -hexyl-GSH ( S -hexyl-GSH) (enzyme activity Inhibitor concentration reduced to 50%) was the lowest value of 1.25 ± 0.03 μM (see Table 8).

5) 최적 pH5) Optimum pH

pH 8.5 ~ 9.5에서 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 최적 pH는 9.0인 것으로 나타났다(도 11 참조).It showed more than 80% activity at pH 8.5 ~ 9.5, the optimum pH was found to be 9.0 (see Figure 11).

6) 최적 온도6) optimum temperature

30 ~ 50℃에서 80% 이상의 활성을 나타내었으며, 최적 온도는 45℃인 것으로 나타났다(도 12 참조).It exhibited 80% or more of activity at 30-50 ° C., and the optimum temperature was found to be 45 ° C. (see FIG. 12).

7) 열안정성7) thermal stability

GSH-CDNB에 대한 활성이 50%로 감소하는 온도(Tm)는 52℃인 것으로 나타났으며, 80℃에서는 15% 미만의 잔존 활성이 존재하였다(도 13 참조).The temperature (Tm) at which the activity against GSH-CDNB decreases to 50% was found to be 52 ° C, with less than 15% remaining activity at 80 ° C (see Figure 13).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1><Example 1>

벼로부터From rice rGSTrGST 유전자의 증폭 및 분리Gene Amplification and Isolation

1-1) 주형 DNA의 제조1-1) Preparation of template DNA

벼의 뿌리와 배양세포로부터 poly(A) RNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 제조하였다. 이후, 상기 cDNA를EcoRⅠ과XhoⅠ으로 절단한 후, 동일한 효소로 절단된 λZAPⅡ 벡터(Stratagene, CA, USA)에 삽입시켰다. 클로닝한 cDNA의 염기서열을 이중가닥 DNA 주형과 pBluescript 시쿼네이즈 킷트(sequenase kit)(Stratagene, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 이후, 벼의 cDNA가 클로닝된 λZAPⅡ 벡터를 M13 파지(phage)에 도입시킨 후, 이로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 95℃에서 10분간 가열하여 PCR 용으로 변성시켰다. 변성된 DNA를 사용 전까지 4℃에서 보관하였다.Poly (A) RNA was isolated from rice roots and cultured cells, and cDNA was prepared therefrom. Then, the cDNA was digested with Eco RI and Xho I, and then inserted into a λZAPII vector (Stratagene, CA, USA) digested with the same enzyme. The base sequence of the cloned cDNA was analyzed using double stranded DNA template and pBluescript sequence kit (Stratagene, CA, USA). Then, λZAPII vector cloned with cDNA of rice was introduced into M13 phage, and DNA was separated therefrom. The separated DNA was heated for 10 minutes at 95 ℃ denatured for PCR. Denatured DNA was stored at 4 ° C. until use.

1-2)rGST유전자의 증폭을 위한 프라이머 제작1-2) Preparation of primer for amplification of rGST gene

진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 오리자 사티바(Oryza sativa) 유래 추정되는 GST의 염기서열을 참고로 하여 GST 유전자 증폭용 프라이머쌍을 제작하였다. 용이한 클로닝을 위하여, 하기 표 3에 기재된 바와 같이, 프라이머의 서열 내에NdeⅠ과BamHⅠ의 제한효소 자리가 존재하도록 제작하였다. 제작된 2개의 프라이머의 염기서열을 서열번호 1과 서열번호 2로 각각 기재하였다. 이 때 각 프라이머는 다카라(TaKaRa)에 의뢰하여 합성하였다.A primer pair for amplification of GST gene was prepared by referring to the nucleotide sequence of GST estimated from Oryza sativa disclosed in GenBank Accession No. AF309382. For easy cloning, the restriction enzyme sites of Nde I and Bam HI were present in the sequence of the primers, as shown in Table 3 below. The base sequences of the prepared two primers were described as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively. At this time, each primer was synthesized by requesting Takara (TaKaRa).

rGST유전자의 증폭에 사용된 프라이머Primer used to amplify rGST gene 염기 서열Base sequence 프라이머-N(서열번호 1)Primer-N (SEQ ID NO: 1) 5'-GGAATTC CATATG AAAGTGTACGGGTGGGTGGTA-3'NdeⅠ5'-GGAATTC CATATG AAAGTGTACGGGTGGGTGGTA-3 ' Nde Ⅰ 프라이머-C(서열번호 2)Primer-C (SEQ ID NO: 2) 5'-CGC GGATCC GCTACTATGGTATGTTCCCACTTCCGAA-3'BamHⅠ 5'-CGC GGATCC GCTACTATGGTATGTTCCCACTTCCGAA-3 ' Bam HⅠ

1-3)rGST유전자의 증폭 및 분리·정제1-3) rGST gene amplification, isolation and purification

상기 실시예 1-1)에서 제조한 DNA를 주형으로 하고, 상기 실시예 1-2)에서 제작한 2개의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응용액은 파지 DNA 20㎕, 프라이머-N 0.5㎕, 프라이머-C 0.5㎕, 25mM MgCl23㎕, 2mM dNTP 5㎕, 10×PCR 완충용액 5㎕, KOD 중합효소(polymerase) 1㎕ 및 물(H2O) 15㎕를 혼합하여 제조하였다. PCR 반응은 94℃에서 1분; 50℃에서 2분; 및 72℃에서 3분을 한 사이클로 하여 35회 반복 수행하였다. 이후, 1% 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 분자량 마커 Mb의 770bp와 612bp 사이에서 단일 밴드의 DNA가 나타남을 확인할 수 있다. 이후, 진 클린 킷트(geneclean kit; BIO 101 사)를 이용하여 겔로부터 DNA를 추출하였다.DNA prepared in Example 1-1) was used as a template, and PCR was performed using two primers prepared in Example 1-2). PCR reaction solution was 20 μl of phage DNA, 0.5 μl of Primer-N, 0.5 μl of Primer-C, 3 μl of 25mM MgCl 2 , 5 μl of 2mM dNTP, 5 μl of 10 × PCR buffer, 1 μl of KOD polymerase and water. 15 μl of (H 2 O) was prepared by mixing. PCR reaction was 1 minute at 94 ° C; 2 minutes at 50 ° C; And 35 cycles of 3 minutes at 72 ° C. in one cycle. Thereafter, 1% agarose gel electrophoresis was performed. As a result, as shown in Figure 2, it can be seen that a single band of DNA appears between 770bp and 612bp of the molecular weight marker Mb. Thereafter, DNA was extracted from the gel using a gene clean kit (BIO 101).

<실시예 2><Example 2>

재조합 발현 벡터 pET-rGST의 제조Preparation of Recombinant Expression Vector pET-rGST

상기 실시예 1에서 분리·정제된rGST유전자를NdeⅠ와BamHⅠ로 37℃에서 24시간 동안 절단한 후, 동일한 제한효소로 절단된 pET-26b(+) 벡터(Novagen 사)에삽입하였다. 제조된 재조합 발현 벡터를 'pET-rGST'라 명명하였다. 이후, 열충격(42℃) 방법으로 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였다. 이후, 25㎍/㎖ 카나마이신(kanamycin)이 포함된 평판 L-브로쓰(Broth) 배지 상에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하였다. 배양된 콜로니 중에서 하나를 선택하여 다시 액체 L-브로쓰 배지에서 배양한 후, 이로부터 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를NdeⅠ와BamHⅠ로 절단한 후, 1% 아가로그 겔 전기영동을 수행하여rGST유전자의 도입 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 절단된 pET-rGST에서 pET-26b(+) 벡터(5360bp) 및rGST유전자(669bp)의 크기에 해당하는 2개의 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다.The rGST gene isolated and purified in Example 1 was cleaved with Nde I and Bam HI at 37 ° C. for 24 hours and then inserted into a pET-26b (+) vector (Novagen) cut with the same restriction enzyme. The prepared recombinant expression vector was named 'pET-rGST'. Thereafter, the recombinant expression vector pET-rGST was introduced into E. coli BL21 (DE3) by thermal shock (42 ° C). Then, transformed Escherichia coli was selected by culturing on plate L-Broth medium containing 25 µg / ml kanamycin. One of the cultured colonies was selected and again incubated in liquid L-broth medium, after which DNA was extracted. After extracting the extracted DNA with Nde I and Bam HI, 1% agalog gel electrophoresis was performed to confirm the introduction of rGST gene. As a result, as shown in FIG. 3, two bands corresponding to the sizes of the pET-26b (+) vector (5360bp) and the rGST gene (669bp) appeared in the cleaved pET-rGST.

<실시예 3><Example 3>

재조합Recombination rGSTrGST 유전자의 염기서열 분석Sequence analysis of genes

상기 실시예 2에서 대장균에 도입된 것으로 확인된rGST유전자의 염기서열 분석은 코아바이오시스템(주) 부설 생명과학연구소의 ADD377(USA)를 이용하여 수행하였다. 이 때 서열 분석용 프라이머로는 pET-26b(+) 벡터 내에 존재하는 T7 프로모터 프라이머(#69348-1, 코아바이오시스템(주))와 T7 터미네이터 프라이머(#69337-1, 코아바이오시스템(주))을 사용하였으며, 각 프라이머의 서열은 서열번호 3과 서열번호 4로 각각 기재하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 재조합rGST유전자는 총 669bp의 염기로 구성되었으며, 이의 염기서열을 서열번호 5로 기재하였다. 또한, 서열번호 5의 염기서열로부터 암호화되는 단백질의 염기서열을서열번호 6으로 기재하였다. 본 발명에 따른 재조합rGST유전자의 염기서열을 진뱅크 등록번호 AF309382에 개시된 '추정되는 글루타치온 S-전이효소 OsGSTF5'의 CDS 염기서열과 비교한 결과, 99%의 상동성을 나타냄을 확인하였다. 이로부터 본 발명에 따른 재조합rGST유전자의 클로닝이 정확하게 이행되었음을 확인할 수 있었다.The sequencing of the rGST gene confirmed to have been introduced into Escherichia coli in Example 2 was performed using ADD377 (USA) of the Life Science Research Institute attached to Cobio Biosystems. At this time, as primers for sequence analysis, T7 promoter primer (# 69348-1, Cobiobiosystems Co., Ltd.) and T7 terminator primer (# 69337-1, Cobiobiosystems Co., Ltd.) present in the pET-26b (+) vector. ), And the sequence of each primer is described by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively. As a result, the recombinant rGST gene according to the present invention was composed of a total of 669bp base, the base sequence thereof is described as SEQ ID NO: 5. In addition, the nucleotide sequence of the protein encoded from the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 is described as SEQ ID NO: 6. Comparing the base sequence of the recombinant rGST gene according to the present invention with the CDS sequence of 'estimated glutathione S-transferase OsGSTF5' disclosed in GenBank Accession No. AF309382, it was confirmed that the homology of 99%. From this, it was confirmed that the cloning of the recombinant rGST gene according to the present invention was correctly performed.

또한, 본 발명에 따른 재조합rGST유전자의 염기서열을 다른 종의GST유전자의 염기서열들과 비교한 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 옥수수(Zea mays)의GST(진뱅크 등록번호: AF244673)와는 71%, 다른 옥수수(maize)의GST(진뱅크 등록번호: P46420)와는 60%, 그리고 밀(Triticum aestivum)의GST(진뱅크 등록번호: CAD11966)와는 54%의 서열 상동성을 나타내었다.In addition, as a result of comparing the nucleotide sequence of the recombinant rGST gene according to the present invention with the nucleotide sequences of the GST gene of another species, as shown in Figure 4, GST of corn ( Zea mays ) (Ginbank accession number: AF244673) And sequence homology of 71%, other maize GST (Ginbank Accession No .: P46420) and 60% with wheat ( Triticum aestivum ) GST (Ginbank Accession No .: CAD11966).

<실시예 4><Example 4>

대장균에서의 재조합 GST 단백질의 대량 발현Mass Expression of Recombinant GST Protein in Escherichia Coli

먼저, 상기 실시예 3에서 얻은 형질전환체(pET-rGST가 도입된 대장균)를 카나마이신 25㎍/㎖가 첨가된 10㎖의 액체 L-브로쓰 배지에서 37℃, 200rpm으로 종배양하였다. 이후, 카나마이신이 첨가된 1ℓ의 L-브로쓰에 상기 종배양액을 1%가 되도록 접종하였다. 37℃에서 배양하면서 일정 시간마다 OD600(optical density) 값을 측정하였다. OD600값이 0.3 내지 0.4 정도가 되었을 때 발현유도제인 IPTG를 최종농도가 0.4mM이 되도록 첨가하였다. IPTG 첨가 후, 11시간 정도 더 배양하여 재조합 GST 단백질의 대량 발현을 유도하였다. 배양이 끝난 후, 배양액을 냉동원심분리기를 이용하여 4℃, 10,000g, 10분간 집균하여 -20℃에서 냉동보관하였다.First, the transformant obtained in Example 3 (E. coli into which pET-rGST was introduced) was cultured at 37 ° C. and 200 rpm in a 10 ml liquid L-broth medium to which 25 µg / ml of kanamycin was added. Thereafter, 1 L of L-broth to which kanamycin was added was inoculated with the seed culture solution to 1%. OD 600 (optical density) values were measured at regular intervals while incubating at 37 ° C. When the OD 600 value was about 0.3 to 0.4, the expression inducing agent IPTG was added so as to have a final concentration of 0.4 mM. After addition of IPTG, incubation for about 11 hours further induced mass expression of recombinant GST protein. After the incubation, the culture solution was collected at 4 ° C., 10,000 g for 10 minutes using a freezing centrifuge, and stored at -20 ° C. for freezing.

<실시예 5>Example 5

재조합 GST 단백질의 정제Purification of Recombinant GST Protein

냉동 보관된 균체를 용해 완충용액(lysis buffer; 20mM potassium phosphate buffer, pH 7.0) 10㎖로 균질화시켰다. 이후, 소니케이터(sonicator)를 이용하여 4℃, 30~40 watts, 앰플리튜드(amplitude) 8%의 조건으로 10분간 세포막을 파괴하였다. 그리고 나서, 20,000rpm, 4℃로 20분간 원심분리하여 다른 세포 불순물들이 제거된 조추출물(crude extract)을 수득하였다. GSH-세파로즈 비드(sepharose bead)를 2M NaCl로 충분히 세척한 다음, 컬럼에 충진시켰다. 이후, 상기 용해 완충용액을 이용하여 컬럼을 평형화(equilibrium)시킨 후, 원심분리한 상층액을 2-3회 흘려주었다. 그리고 나서, 컬럼 내의 불필요한 단백질을 제거하기 위해 50mM 염화칼륨을 함유하는 용해 완충용액으로 세척하였다. 이 때 세척은 세척된 액의 OD280값을 측정하여 OD280=0이 될 때까지 세척하였다. 이후, 10mM GSH를 함유하는 50mM 트리스-염산(Tris-Cl) 완충용액(pH 8.0)을 이용해 컬럼에 붙어있는 재조합 GST 단백질을 용출시켰다. 이 때 2㎖씩 10개의 분획(fraction)을 수득하였다. 이후, GST 활성 측정을 위해, 200mM 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 6.5)에 1mM GSH, 1mM CDNB, 그리고 용출된 각 분획의 효소 용액을 첨가하여 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer)를 이용하여 340nm에서 1분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. 효소 활성 단위는 1분당 1μmol의 반응 생성물의 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한, Bio-Rad 사의 단백질 정량 시약을 이용하여 단백질 정량을 수행하였다(595nm에서 흡광 측정). 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 4번 분획에서 GST 활성 및 단백질 양이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 12.5% SDS-PAGE를 실시하여 정제된 재조합 GST 단백질의 순수도를 확인하였다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 약 28kDa에서 단일 밴드가 나타남을 확인할 수 있었다.The frozen cells were homogenized with 10 ml of lysis buffer (20 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0). Subsequently, cell membranes were destroyed for 10 minutes using a sonicator at 4 ° C, 30-40 watts, and 8% of amplitude. Thereafter, centrifugation at 20,000 rpm and 4 ° C. for 20 minutes yielded a crude extract from which other cellular impurities were removed. GSH-sepharose beads were sufficiently washed with 2M NaCl and then packed into the column. Thereafter, the column was equilibrated using the lysis buffer, and then the supernatant centrifuged 2-3 times. It was then washed with lysis buffer containing 50 mM potassium chloride to remove unnecessary protein in the column. When washing is to measure the OD 280 value of the washed solution it was washed until the OD 280 = 0. Thereafter, the recombinant GST protein attached to the column was eluted using 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 10 mM GSH. At this time, 10 fractions were obtained by 2 ml. Then, to measure the GST activity, 1mM GSH, 1mM CDNB, and the enzyme solution of each fraction eluted were added to 200mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), followed by ultraviolet / visible spectrophotometer ( UV / VIS spectrophotometer) was used to measure the change in absorbance at 340 nm for 1 minute. Enzyme active units were defined as the amount of enzyme that catalyzed the formation of 1 μmol of reaction product per minute. In addition, protein quantitation was performed using a protein quantification reagent from Bio-Rad (absorbance measurement at 595 nm). As a result, as shown in FIG. 5, the GST activity and protein amount were found to be the highest in the fourth fraction. In addition, 12.5% SDS-PAGE was performed to confirm the purity of the purified recombinant GST protein. As a result, as shown in Figure 6, it was confirmed that a single band appears at about 28kDa.

하기 표 4는 조추출물과 정제된 재조합 GST 단백질의 총 활성, 총 단백질 양, 비활성, 수율 및 정제도를 비교하여 나타낸 것이다.Table 4 shows a comparison of the total activity, total protein amount, inactivation, yield and purity of the crude extract and purified recombinant GST protein.

조추출물과 정제된 재조합 GST 단백질의 비교Comparison of crude extracts and purified recombinant GST proteins 총활성(unit)Total activity 총 단백질 양(mg)Total protein amount (mg) 비활성(unit/mg)Inactive (unit / mg) 수율(%)yield(%) 정제도(fold)Fold 조추출물Crude extract 16.8016.80 24.024.0 0.070.07 100100 1One 정제된 재조합 GST 단백질Purified Recombinant GST Protein 8.848.84 5.45.4 0.410.41 5252 66

상기 표 4에 기재된 바와 같이, 조추출물의 비활성은 0.07unit/mg이었으나, GSH-세파로즈를 통해 정제한 결과, 0.41unit/mg으로 약 6배 증가한 것을 확인할 수있었다. 또한, 정제된 재조합 GST 단백질의 수율은 52%로 계산되었다.As shown in Table 4, the specific activity of the crude extract was 0.07 unit / mg, but purified through GSH-sepharose, it was confirmed that about 6 times increased to 0.41 unit / mg. In addition, the yield of purified recombinant GST protein was calculated to be 52%.

<실시예 6><Example 6>

정제된 재조합 GST 단백질의 분자량 측정Molecular Weight Measurement of Purified Recombinant GST Protein

상기 실시예 5에서 정제된 재조합 GST 단백질을 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)으로 평형화시킨 겔 크로마토그래피 컬럼(Superdex 200 HR fast protein liquid Chromatography column, 1.0×30cm; Pharmacia Biotech(Upsala, Sweden))에 흡착시켰다. 이후, 상기 완충용액을 0.5㎖/min의 속도로 흘려주어 용출시켰다. 이 때 분자량 표준 마커로는 블루 덱스트란(blue dextran; 2,000 kDa), 효모 알코올 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase; 150 kDa), BSA(bovine serum albumin; 66 kDa), 트립신 저해제(trypsin inhibitor; 29.8 kDa) 및 싸이토크롬 C(Cytochrome c; 12.4 kDa)를 사용하였다. 그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 수퍼덱스 200 컬럼으로 정제된 재조합 GST 단백질의 분자량은 55kDa로 나타났다. 상기 실시예 5의 12.5% SDS-PAGE를 통해서는 재조합 GST 단백질의 분자량이 28kDa로 나타난 것을 고려할 때에, 본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질의 활성형(active form)이 28kDa의 두 폴리펩타이드로 이루어진 동형 이량체(homo-dimer)인 것으로 사료된다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 분자량은 감자 GST의 분자량(26kDa)(Karoline and GunterEur. J. Biochem.226: 619-626, 1993)과 브로콜리 GST의 분자량(27kDa)(Maryet al., Biochem. Biophys. Acta.1205: 29-38, 1994)과 유사하였다.In a gel chromatography column (Superdex 200 HR fast protein liquid Chromatography column, 1.0 × 30 cm; Pharmacia Biotech (Upsala, Sweden)) equilibrated with the recombinant GST protein purified in Example 5 with 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5). Adsorbed. Thereafter, the buffer solution was eluted by flowing at a rate of 0.5 ml / min. The molecular weight standard markers include blue dextran (2,000 kDa), yeast alcohol dehydrogenase (150 kDa), bovine serum albumin (66 kDa) and trypsin inhibitor (29.8 kDa). And Cytochrome C (12.4 kDa). As a result, as shown in FIG. 7, the molecular weight of the recombinant GST protein purified on the Superdex 200 column was 55 kDa. Considering that the molecular weight of the recombinant GST protein is 28 kDa through 12.5% SDS-PAGE of Example 5, the active form of the recombinant GST protein derived from rice according to the present invention is two polypeptides of 28 kDa. It is thought to be a homo-dimer. In addition, the molecular weight of the recombinant GST protein according to the present invention is the molecular weight of potato GST (26kDa) (Karoline and Gunter Eur. J. Biochem. 226: 619-626, 1993) and broccoli GST (27kDa) (Mary et al. , Biochem. Biophys. Acta. 1205: 29-38, 1994).

<실시예 7><Example 7>

재조합 GST 단백질의 특성 분석Characterization of Recombinant GST Protein

7-1) 기질 특이성7-1) Substrate Specificity

하기 표 5에 기재된 7종류의 기질을 사용하여 GST 활성을 측정하였다. 측정방법은 하기 표 5에 기재된 기질, 용매, GSH 및 상기 실시예 5에서 정제된 재조합 GST 단백질 20㎕를 잘 혼합한 후, 각 기질에 따른 적정 파장에서 자외선/가시광선 분광광도계를 이용하여 1분 동안의 흡광도의 변화값을 측정하였다. 이 때 총 반응 용액은 1㎖로 하였다. 효소 활성 단위는 1분당 생성물 1μmol의 형성을 촉매하는 효소의 양으로 정의하였다. 총 5회 측정하여 표준 편차(standard deviation)를 계산하였다.GST activity was measured using seven kinds of substrates described in Table 5 below. The measurement method was well mixed with 20 μl of the substrate, solvent, GSH and the recombinant GST protein purified in Example 5, and then used for 1 minute using an ultraviolet / visible spectrophotometer at an appropriate wavelength according to each substrate. The change in absorbance during the measurement was measured. At this time, the total reaction solution was 1 ml. Enzyme active units were defined as the amount of enzyme that catalyzed the formation of 1 μmol of product per minute. A total of five measurements were taken to calculate the standard deviation.

GST 활성 측정에 사용된 기질과 이에 따른 반응 조건Substrates Used in Measuring GST Activity and Reaction Conditions 기질temperament 용매menstruum pHpH GSH(mM)GSH (mM) 파장(nm)Wavelength (nm) 흡광 계수(absorbancecoefficient; mM-1cm-1)Absorption Coefficient (mM -1 cm -1 ) 1mM CDNB1mM CDNB 200mM KPB* 200mM KPB * 6.56.5 1One 340340 9.69.6 1mM DCNB1mM DCNB 200mM KPB200mM KPB 7.57.5 55 345345 8.58.5 0.2mM ETA0.2mM ETA 200mM KPB200mM KPB 6.56.5 0.250.25 270270 55 0.5mM EPNP0.5mM EPNP 200mM KPB200mM KPB 6.56.5 55 360360 0.50.5 0.1mM 스테로이드0.1mM steroid 100mM KPB100mM KPB 6.56.5 66 248248 16.316.3 0.1mM 4-NPB0.1mM 4-NPB 200mM KPB200mM KPB 6.56.5 55 310310 1.21.2 1.5mM CP1.5mM CP 200mM 인산 나트륨완충용액200 mM Sodium Phosphate Buffer 7.07.0 1One 340340 6.66.6

* KPB: 인산 칼륨 완충용액* KPB: Potassium Phosphate Buffer

그 결과, 하기 표 6에 기재된 바와 같이, EPNP의 비활성이 0.852μmol/min/mg로 가장 큰 값을 나타내었으며, CDNB, CP, ETA의 순으로 높은 값을 나타내었다. 그러나, 나머지 기질 DCNB와 스테로이드에 대해서는 활성을 보이지 않았다. 이로부터, 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질은 다른 기질에 비해 CDNB와 EPNP에 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Table 6, the inactivation of EPNP was the highest value of 0.852μmol / min / mg, the highest value in the order of CDNB, CP, ETA. However, it did not show activity against the remaining substrates DCNB and steroids. From this, it was confirmed that the recombinant GST protein according to the present invention showed high activity on CDNB and EPNP compared to other substrates.

재조합 GST 단백질의 각 기질에 대한 비활성Inactivation for each substrate of recombinant GST protein 기질temperament 비활성(μmol/min/mg)Inactive (μmol / min / mg) CDNB(1-Chloro-2,4-dinitrobenzene)CDNB (1-Chloro-2,4-dinitrobenzene) 0.410 ±0.0070.410 ± 0.007 DCNB(1,2-Dichloro-4-nitrobenzene)DCNB (1,2-Dichloro-4-nitrobenzene) NDa ND a ETA(Ethacrynic acid)Ethacrynic acid (ETA) 0.013 ±0.0030.013 ± 0.003 EPNP(1,2-Epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane)EPNP (1,2-Epoxy-3- (ρ-nitrophenoxy) propane) 0.852 ±0.0120.852 ± 0.012 스테로이드(Δ5-androstene-3,17-dione)Steroid (Δ 5 -androstene-3,17-dione) NDa ND a 4-NPB(4-Nitrophenethyl bromide)4-NPB (4-Nitrophenethyl bromide) NDa ND a CP(Cumene hydroperoxide)Cumene hydroperoxide (CP) 0.148 ±0.0060.148 ± 0.006

NDa: 활성이 측정되지 않음ND a : Activity not measured

7-2) Km 값과 Vmax 값 측정7-2) Measurement of Km value and Vmax value

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH와 CDNB에 대한 카이네틱 파라미터(kinetic parameter)를 구하기 위하여, 한 기질의 농도는 1mM로 고정시키고, 다른 한 기질의 농도를 0.2 내지 2mM의 범위(range)로 변화시키면서 기질의 농도에 따른 GST 활성도를 측정하였다. GST 활성 측정은 상기 실시예 7-1)와 동일한 방법에 따라 수행하였다. Km(Michaelis-Menten constant) 값과 Vmax(최대속도) 값은 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)에 의하여 결정되었다(도 8 참조). 또한, GSH와 EPNP에 대한 카이네틱 파라미터는 각 기질의 농도를 0.2 내지 2mM과 0.01 내지 0.25mM의 범위로 하여 측정하였으며, GSH와 CP에 대한 카이네틱 파라미터는 각 기질의 농도를 0.2 내지 2mM과 0.1 내지 1mM의 범위로 변화시키면서 측정하였다(도 9 및 도 10 참조). 각 기질에 대한 Km 값과 Vmax 값을 하기 표 7에 기재하였다.In order to obtain kinetic parameters for GSH and CDNB of the recombinant GST protein according to the present invention, the concentration of one substrate is fixed at 1 mM and the concentration of the other substrate is in the range of 0.2 to 2 mM. GST activity was measured according to the concentration of the substrate while changing. GST activity measurement was performed according to the same method as Example 7-1). Km (Michaelis-Menten constant) values and Vmax (maximum speed) values were determined by a Lineweaver-Burk plot (see FIG. 8). In addition, the kinetic parameters for GSH and EPNP were measured by the concentration of each substrate in the range of 0.2 to 2 mM and 0.01 to 0.25 mM, and the kinetic parameters for GSH and CP were 0.2 to 2 mM for each substrate. And changed in the range of 0.1 to 1 mM (see FIGS. 9 and 10). Km and Vmax values for each substrate are listed in Table 7 below.

각 기질에 따른 Km 값과 Vmax 값Km and Vmax values for each substrate 기질temperament Km(mM)Km (mM) Vmax(U/mg)Vmax (U / mg) GSH-CDNBGSH-CDNB CDNBCDNB 0.550.55 0.20.2 GSHGSH 0.350.35 0.180.18 GSH-EPNPGSH-EPNP EPNPEPNP 0.050.05 0.220.22 GSHGSH 0.840.84 0.260.26 GSH-CPGSH-CP CPCP 0.160.16 0.200.20 GSHGSH 0.340.34 0.190.19

7-3) 저해 효과 측정7-3) Inhibitory Effect Measurement

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 GSH-CDNB 결합(conjugation)에 대한 저해제의 저해 효과를 알아보기 위하여,IC 50값을 측정하였다. 이를 위해, 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)에 1mM GSH와 CDNB를 넣은 후, 저해제의 농도를 변화시키면서 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질을 넣어 30℃에서 2분간 반응을 시켰다. 저해제로는 GSH의 경쟁적 저해제인S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH)와 CDNB에 대한 경쟁적 저해제인 베나스타틴 A(Benastatin A)를 사용하였다. 또한, 반응 생성물에 대한저해제로는 DNP-SG(S-(2,4-dinitrophenyl)glutathione)을 사용하였다. 또한, 비기질 리간드(non-substrate ligand)로 작용하는 헤마틴(hematin)과 IAA(indole-3-acetic acid)도 저해제로 사용하였다. 총 5회 측정하여, 각 결과에 대한 표준편차를 계산하였다. 계산된IC 50 값을 하기 표 8에 기재하였다.In order to determine the inhibitory effect of the inhibitor on GSH-CDNB conjugation of the recombinant GST protein according to the present invention, the IC 50 value was measured. To this end, 1 mM GSH and CDNB were added to 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and the recombinant GST protein according to the present invention was added while varying the concentration of the inhibitor and reacted at 30 ° C. for 2 minutes. It was used as a competitive inhibitor of vena statin A (Benastatin A) for hexyl -GSH (S -hexyl-GSH) and CDNB - inhibitors include competitive inhibitors of GSH S. In addition, as an inhibitor for the reaction product, DNP-SG ( S- (2,4-dinitrophenyl) glutathione) was used. Hematin and IAA (indole-3-acetic acid), which act as non-substrate ligands, were also used as inhibitors. A total of five measurements were taken to calculate the standard deviation for each result. The calculated IC 50 values are listed in Table 8 below.

각 저해제의IC 50 값 IC 50 values for each inhibitor 저해제Inhibitor I 50(μM) I 50 (μM) S-헥실-GSH(S-hexyl-GSH) S - hexyl -GSH (S -hexyl-GSH) 1.25 ±0.031.25 ± 0.03 베나스타틴 A(Benastatin A)Benaststatin A 1.36 ±0.051.36 ± 0.05 DNP-SG(S-(2,4-dinitrophenyl)glutathione)DNP-SG ( S- (2,4-dinitrophenyl) glutathione) 18.92 ±0.0218.92 ± 0.02 헤마틴(hematin)Hematin 3.49 ±0.033.49 ± 0.03 IAA(indole-3-acetic acid)Indeole-3-acetic acid (IAA) 1.25 ×103±2.301.25 × 10 3 ± 2.30

그 결과, 상기 표 8에 기재된 바와 같이, S-헥실-GSH의IC 50 값이 가장 낮은 것으로 확인되었다. 반면, IAA는 별 다른 저해 효과를 미치지 못하는 것으로 나타났다.As a result, as shown in Table 8, the IC 50 value of S-hexyl-GSH was found to be the lowest. In contrast, IAA did not appear to have a significant inhibitory effect.

7-4) pH의 영향7-4) Effect of pH

pH의 변화가 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 하기 표 9에 기재된 각 pH에 해당하는 완충용액을 사용하여 GST 활성을 측정하였다. 이때 GST 활성은 CDNB을 기질로 하여 측정하였으며, 각 pH의 완충용액에 효소가 들어가지 않은 상태를 측정하여 이를 대조구(control)로 잡았다. 또한, pH를 0.5씩 증가시켜 측정하였다.In order to investigate the effect of the change in pH on the activity of the recombinant GST protein according to the present invention, GST activity was measured using a buffer corresponding to each pH shown in Table 9 below. At this time, the GST activity was measured using CDNB as a substrate, and the enzyme was not added to the buffer solution at each pH. In addition, the pH was increased by 0.5.

pH에 따른 완충용액pH-Based Buffers pH 범위pH range 완충용액Buffer pH 4.0-6.0pH 4.0-6.0 200mM 구연산-나트륨 인산 완충용액(citrate-sodium phosphate buffer)200 mM citric acid-sodium phosphate buffer pH 6.0-8.5pH 6.0-8.5 200mM 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer)200 mM potassium phosphate buffer pH 8.5-9.5pH 8.5-9.5 200mM Tris-Cl 완충용액200 mM Tris-Cl buffer pH 9.5-10.5pH 9.5-10.5 200mM 글리신-수산화나트륨 완충용액(Glycine-NaOH buffer)200 mM Glycine-NaOH buffer

그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 벼 유래의 재조합 GST 단백질의 최적 활성은 pH 9.0에서 나타났으며, 그 이후의 pH에서는 활성이 급격히 감소함을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 11, the optimal activity of the rice-derived recombinant GST protein according to the present invention appeared at pH 9.0, it was confirmed that the activity sharply decreases at pH thereafter.

7-5) 온도의 영향7-5) Influence of temperature

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 활성에 대한 온도의 영향을 조사하기 위해, 표준 활성 반응 조건에서 온도를 30℃에서 80℃까지 5℃ 간격으로 증가시키면서 GST의 잔존 활성(remaining activity)을 측정하였다. 활성 측정은 200mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)을 10분간 각 온도에 놓아둔 후, 재조합 GST 단백질과 1mM의 기질(GSH와 CDNB)를 첨가하여 340nm에서 측정하였다. 그 결과, 최적 활성은 45℃에서 나타났으며, 이 때의 활성을 100으로 하고 다른 온도에서의 활성을 상대적으로 계산하여 도 12에 도시하였다.In order to investigate the influence of temperature on the activity of the recombinant GST protein according to the present invention, the remaining activity of GST was measured while increasing the temperature at 30 ° C. to 80 ° C. at 5 ° C. in standard active reaction conditions. The activity was measured at 340 nm by adding 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) at each temperature for 10 minutes and then adding recombinant GST protein and 1 mM substrate (GSH and CDNB). As a result, the optimum activity was shown at 45 ℃, the activity at this time was set to 100 and shown in Figure 12 by calculating the activity at different temperatures relatively.

7-6) 열에 대한 안정성7-6) Thermal Stability

본 발명에 따른 재조합 GST 단백질의 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여, 20nM 인산 칼륨 완충용액(pH 7.0)에 효소액(재조합 GST 단백질)을 첨가한 후, 상기 혼합액을 각 온도(30℃에서 80℃까지 5℃ 간격을 증가시킴)에서 10분간 정치하였다. 이후, 100mM 인산 칼륨 완충용액(pH 6.5)에 1mM GSH와 CDNB, 상기 가열한 효소액, 그리고 열에 의한 산화를 방지하기 위한 3mM DTT와 EDTA를 첨가하여 GST의 잔존 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 13에 도시된 바와 같이, 52℃에서 50%의 잔존 활성을 나타내었으며, 80℃에서는 15% 미만의 잔존 활성을 보였다. 이집트콩(chickpea)의 GST의 경우 80℃에서 활성을 거의 잃고 60℃에서 50%의 잔존 활성을 나타내었다는 연구 결과(Abdelrahim and Bassam,Phytochemistry, 29: 2431-2435, 1990)를 고려할 때에 본 발명에 따른 재조합 GST 단백질은 비교적 높은 열 안정성을 가지는 것을 알 수 있다.In order to investigate the heat stability of the recombinant GST protein according to the present invention, after adding the enzyme solution (recombinant GST protein) to 20 nM potassium phosphate buffer (pH 7.0), the mixture solution was added to each temperature (30 ℃ to 80 ℃ 5 Increasing the interval of C) was allowed to stand for 10 minutes. Thereafter, 1 mM GSH and CDNB, the heated enzyme solution, and 3 mM DTT and EDTA were added to 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) to measure residual activity of GST. As a result, as shown in FIG. 13, the remaining activity was 50% at 52 ° C, and less than 15% at 80 ° C. The GST of chickpea almost lost its activity at 80 ° C and showed 50% residual activity at 60 ° C (Abdelrahim and Bassam, Phytochemistry , 29: 2431-2435, 1990). It can be seen that the recombinant GST protein has a relatively high thermal stability.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 벼로부터GST유전자를 클로닝하여 상기 유전자를 대량 발현시키기 위한 재조합 발현 벡터를 제조하였다. 또한, 상기 벡터로 형질전환시킨 대장균에서 재조합 GST 단백질이 발현됨을 확인하고, 상기 단백질을 분리·정제하여 이의 특성을 규명하였다. 본 발명에 따른 방법에 따라 대장균 내에서 대량 생산된 벼 유래의 재조합 GST 단백질은 제초제, 농약 또는 약물등에 의한 식물 세포 내 해독 대사 과정 분석에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 표적분자 또는 종양 마커(cancer marker)로서 화학요법 분야의 진단 및 이를 필요로 하는 다양한 분야에 유용하게 이용될 수 있다.As described above, in the present invention, a GST gene was cloned from rice to prepare a recombinant expression vector for mass expression of the gene. In addition, it was confirmed that recombinant GST protein was expressed in E. coli transformed with the vector, and the protein was isolated and purified to characterize it. Recombinant GST protein derived from rice mass produced in Escherichia coli according to the method according to the present invention can be usefully used for analyzing the detoxification metabolic process in plant cells by herbicides, pesticides or drugs. In addition, it may be usefully used as a target molecule or a tumor marker in the diagnosis of the chemotherapeutic field and various fields requiring the same.

Claims (6)

하기 (a) 내지 (d)의 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 GST(glutathioneS-transferase) 단백질.Recombinant GST (glutathione S- transferase) protein characterized by having the following characteristics (a) to (d). (a) 분자량 28kDa;(a) molecular weight 28 kDa; (b) 최적 pH 9;(b) optimum pH 9; (c) 최적 온도 45℃; 및(c) an optimum temperature of 45 ° C .; And (d) CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA(ethacrynic acid), EPNP(1,2-epoxy-3-(ρ-nitrophenoxy)propane) 및 CP(cumene hydroperoxide)에 대한 기질 특이성(d) Substrate specificity for CDNB (1-chloro-2,4-dinitrobenzene), ETA (ethacrynic acid), EPNP (1,2-epoxy-3- (ρ-nitrophenoxy) propane) and CP (cumene hydroperoxide) 제 1항에 있어서, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질.The recombinant GST protein according to claim 1, which has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 벼(Oryza sativa)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 재조합 GST 단백질.The recombinant GST protein according to claim 1 or 2, which is derived from Oryza sativa . 제 1항의 재조합 GST 단백질을 암호화하는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-rGST.Recombinant expression vector pET-rGST comprising a gene having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 encoding the recombinant GST protein of claim 1. (a) 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 GST를 암호화하는 유전자를 증폭하기 위한 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써GST유전자를 증폭시키는 단계;(a) amplifying the GST gene by performing PCR using a primer pair for amplifying the gene encoding the GST having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6; (b) 상기 증폭된GST유전자를 pET-26b(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET-rGST를 제조하는 단계;(b) cloning the amplified GST gene into pET-26b (+) to prepare a recombinant expression vector pET-rGST; (c) 상기 재조합 발현 벡터 pET-rGST로 대장균을 형질전환하는 단계; 및(c) transforming Escherichia coli with the recombinant expression vector pET-rGST; And (d) 형질전환된 대장균을 배양하여 재조합 GST 단백질을 발현시킨 후, 이를 수집 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 재조합 GST 단백질을 대량 생산하는 방법.(d) culturing the transformed Escherichia coli to express the recombinant GST protein, and then collecting and purifying the recombinant GST protein. 제 5항에 있어서, 상기 (d) 단계의 수집 및 정제는 글루타치온-세파로즈 친화 크로마토그래피(glutathione-sepharose affinity chromatography)를 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 5, wherein the collection and purification of step (d) is carried out using glutathione-sepharose affinity chromatography.
KR10-2002-0073727A 2002-11-26 2002-11-26 Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same KR100477928B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0073727A KR100477928B1 (en) 2002-11-26 2002-11-26 Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0073727A KR100477928B1 (en) 2002-11-26 2002-11-26 Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20040045960A true KR20040045960A (en) 2004-06-05
KR100477928B1 KR100477928B1 (en) 2005-03-21

Family

ID=37341586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2002-0073727A KR100477928B1 (en) 2002-11-26 2002-11-26 Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100477928B1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100744612B1 (en) * 2005-11-04 2007-08-01 경희대학교 산학협력단 Brassica rapa ssp. pekinensis transformed by glutatione S-trnasferase coding gene
KR100761987B1 (en) * 2005-03-09 2007-10-04 중앙대학교 산학협력단 -- Gene cloning for the novel glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same recombinant protein

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100761987B1 (en) * 2005-03-09 2007-10-04 중앙대학교 산학협력단 -- Gene cloning for the novel glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same recombinant protein
KR100744612B1 (en) * 2005-11-04 2007-08-01 경희대학교 산학협력단 Brassica rapa ssp. pekinensis transformed by glutatione S-trnasferase coding gene

Also Published As

Publication number Publication date
KR100477928B1 (en) 2005-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. Identification of a maize kernel stress-related protein and its effect on aflatoxin accumulation
Berrin et al. Stress induces the expression of AtNADK-1, a gene encoding a NAD (H) kinase in Arabidopsis thaliana
AU2018218386B2 (en) Method for producing HSL protein having improved catalytic activity for 2-oxoglutaric acid-dependently oxidizing 4-HPPD inhibitor
Caldwell et al. Identification of two cytosolic ascorbate peroxidase cDNAs from soybean leaves and characterization of their products by functional expression in E. coli
Tsitsigiannis et al. Aspergillus infection inhibits the expression of peanut 13 S-HPODE-forming seed lipoxygenases
Yang et al. Biochemical and physiological characterization of a tau class glutathione transferase from rice (Oryza sativa)
Zheng et al. Molecular and biochemical characterization of three aromatic polyketide synthase genes from Rubus idaeus
Nielsen et al. Reconstitution of cyanogenesis in barley (Hordeum vulgare L.) and its implications for resistance against the barley powdery mildew fungus
EA035528B1 (en) Herbicide tolerance genes and methods of use thereof
Zeng et al. Molecular characterization of a glutathione transferase from Pinus tabulaeformis (Pinaceae)
US7169966B2 (en) Salicylic acid-binding protein encoding nucleic acid, SABP2, and methods of use thereof
Jo et al. A plant-specific tau class glutathione S-transferase from Oryza sativa with very high activity against 1-chloro-2, 4-dinitrobenzene and chloroacetanilide herbicides
US6737260B1 (en) Sequences encoding PhzO and methods
JP2023514687A (en) Glycosyltransferases, polynucleotides encoding them and methods of use
Cabezas et al. Identification of human and rat FAD-AMP lyase (cyclic FMN forming) as ATP-dependent dihydroxyacetone kinases
KR100477928B1 (en) Recombinant glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same
Subramaniam et al. Isolation of a zeta class wheat glutathione S-transferase gene
US20040168212A1 (en) Amino polyol amine oxidase polynucleotides and related polypeptides and methods of use
Liu et al. Molecular cloning and characterization of phospholipase D from Jatropha curcas
EP1218517B1 (en) Gst sequences from soybean and their use in the production of herbicide resistant plants
US7232673B2 (en) Antimicrobial protein from Lyophyllum shimeji
Cho et al. A phi class glutathione S-transferase from Oryza sativa (OsGSTF5): molecular cloning, expression and biochemical characteristics
Wang et al. HarpinPSS-induced peroxidase and lignin accumulation in tobacco during the hypersensitive response
KR100761987B1 (en) -- Gene cloning for the novel glutathione S-transferase isolated from Oryza sativa and method for mass-producing the same recombinant protein
Mandal et al. Molecular cloning, characterization and expression of lipoxygenase 2 (lox-2) isozyme from Indian soybean [Glycine max (L.) Merrill] cv. Pusa 16

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120312

Year of fee payment: 8

LAPS Lapse due to unpaid annual fee