KR20040017697A - Regenerable electrochemical biosensor and regeneration method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 표면 재생이 가능한 전기 화학적 바이오센서 및 이의 재생 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an electrochemical biosensor capable of surface regeneration and a regeneration method thereof.
최근 들어 바이오센서의 미소화에 따라 바이오물질(bio-molecule)의 감지에 참여할 바이오물질의 절대량이 극도로 제한되므로 신호 추출의 고감도화, 신호의 정확성 및 정량화 관점에서 전자 공학 분야와 기술적으로 융합된 전기 화학적 바이오센서에 대한 연구가 활발히 수행되고 있다.Recently, the micro sensor has been micronized, and the absolute amount of bio material to participate in the detection of bio-molecule is extremely limited. Research on electrochemical biosensors is being actively conducted.
바이오센서는 바이오 물질들간의 특이적이고 안정한 결합력을 신호검출의 원리로 사용한다. 그러나, 이와 같은 특이적이고 안정한 결합에 기인하여 현재까지 개발된 바이오센서들은 일회용이라는 사용 한계를 갖는다. 즉, 한번의 특이적 결합반응이 유도되고 나면 그 바이오센서의 표면은 비가역적으로 측정 대상물에 의하여 변형된다.Biosensor uses specific and stable binding force between biomaterials as the principle of signal detection. However, due to such specific and stable binding, the biosensors developed to date have a limit of use which is disposable. In other words, once a specific binding reaction is induced, the surface of the biosensor is irreversibly modified by the measurement object.
종래에는 비등, 계면활성제, 산 또는 염기를 처리하여 바이오센서를 재생하였으나, 이 경우는 바이오물질 감지막 전체를 없앤다. 따라서, 바이오물질 감지막을 새로 형성하기 위해서는 시간 및 비용이 많이 들기 때문에 엄밀한 의미의 바이오센서의 재생이라 할 수 없다.Conventionally, the biosensor is regenerated by treating boiling, surfactant, acid or base, but in this case, the entire biomaterial sensing film is removed. Therefore, the formation of a new biomaterial detection film requires a lot of time and cost, and thus cannot be referred to as the reproduction of a biosensor in the strict sense.
따라서, 바이오물질 감지막에 부동화된 타겟 물질막을 유지한 상태의 표면 재생과 더불어 부동화된 타겟 물질막을 유리시키되 바이오물질 감지막을 재사용시 감도가 떨어지지 않도록 재생 가능한 바이오센서에 대한 개발이 요구되고 있다.Accordingly, there is a demand for development of a biosensor capable of reproducing the immobilized target material film while maintaining the surface of the biomaterial sensing film with the immobilized target material film, so that the sensitivity of the biomaterial sensing film is not degraded.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 고감도 감지가 그대로 유지되도록 표면 재생 및 재사용이 가능한 바이오센서를 제공하고자 하는 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is to provide a biosensor capable of surface regeneration and reuse to maintain high sensitivity.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 고감도 감지력을 그대로 유지할 수 있도록 바이오센서의 표면을 재생하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.Another technical problem to be achieved by the present invention is to provide a method for regenerating a surface of a biosensor to maintain a high sensitivity.
도1 은 본 발명의 제1 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서의 모식도이다.1 is a schematic diagram of an electrochemical biosensor according to a first embodiment of the present invention.
도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 흐름도이다.2 is a flowchart illustrating a process of detecting and regenerating a biosensor according to a first embodiment of the present invention.
도 3 내지 도 6은 도 2의 각 흐름도에 대응하는 바이오센서의 모식도들이다.3 to 6 are schematic views of biosensors corresponding to the flowcharts of FIG. 2.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서의 모식도이다.7 is a schematic diagram of an electrochemical biosensor according to a second embodiment of the present invention.
도 8 내지 도 11은 본 발명의 제 2실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 모식도들이다.8 to 11 are schematic diagrams illustrating a detection and regeneration process of a biosensor according to a second embodiment of the present invention.
도 12는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 재생 반응 후 및 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.12 is a graph showing the results of electrochemical measurements by cyclic voltammetry before, after, and after regeneration and after precipitation of the biosensor according to the first embodiment of the present invention.
도 13은 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 침전물박막 제거 및 환치 반응에 의한 재생반응 후 그리고 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.FIG. 13 shows the results of electrochemical measurements by cyclic voltammetry before and after the precipitation reaction of the biosensor according to the first embodiment of the present invention, after the thin film removal and regeneration reactions by the substitution and reprecipitation reactions. It is a graph.
도 14는 비교예에 따라 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 침전반응 전,후, 재생 반응 후 및 재침전 반응 후에 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 한 결과를 나타내는 그래프이다.14 is a graph showing the results of electrochemical measurements by cyclic voltammetry before, after, and after regeneration and after precipitation of the biosensor according to the first embodiment of the present invention according to a comparative example.
도 15는 비교예에 따라 재생 반응을 할 경우 항체 및 표지효소들이 활성이 없어진 상태로 되는 경우를 나타내는 모식도이다.Figure 15 is a schematic diagram showing a case in which the antibody and the labeling enzymes are in a state where the activity is lost when the regeneration reaction according to the comparative example.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명><Explanation of symbols for the main parts of the drawings>
101: 기판102: 전극101: substrate 102: electrode
103: 덴드라이머 자기 조립 단일막104: 바인더103: dendrimer self-assembled monolayer 104: binder
105: 타겟 물질 106: 표지된 촉매 물질105: target material 106: labeled catalyst material
107: 침전물 박막 110: 바이오물질 감지막107: sediment thin film 110: biomaterial detection film
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 표면 재생이 가능한 바이오센서는 기판 상의 전극 위에 형성되고, 타겟 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하며, 상기 타겟 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 타겟 물질의 유무 및/또는 그 양을감지하며, 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어져서 상기 침전물 박막을 제거할 수 있는 제1 시약을 처리함으로써 표면 재생이 가능하다.In order to achieve the above object, a surface reproducible biosensor according to the present invention includes a biomaterial sensing film formed on an electrode on a substrate and immobilized with a binder capable of specifically binding to a target material. An electrochemical signal generated by the reduction of the effective area of the electrode by a thin film of precipitate formed by the catalysis of the labeled catalytic material detects the presence and / or amount of the target material, ethanol, methanol, dimethyl sulfoxide 2 to 5% by weight of the organic solvent selected from the group consisting of a residual amount of buffer solution and the surface regeneration is possible by treating the first reagent to remove the precipitate thin film.
바람직하기로는 상기 제1 시약은 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 타겟 물질에 결합하여 상기 타겟 물질을 환치할 수 있는 바인더를 더 포함한다. 바람직하기로는, 상기 바인더와 경쟁적으로 상기 타겟 물질에 결합하여 상기 타겟 물질을 환치할 수 있는 바인더와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 상기 제1 시약과 순차적으로 처리함으로써 표면 재생이 가능하다.Preferably the first reagent further comprises a binder capable of binding to the target material to replace the target material competitively with the binder. Preferably, surface regeneration is possible by sequentially treating a second reagent comprising a binder and a buffer solution capable of binding to the target material to replace the target material competitively with the binder.
상기 바이오물질 감지막은 상기 전극 상에 형성되고, 상기 바인더가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막이거나, 상기 전극 상에 형성되고 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드가 부동화되어 있는 덴드라이머 자기 조립 단일막을 포함하는 제1 바이오물질 감지막 및 상기 제1 바이오물질 감지막 상부에 형성되고 상기 리간드와 결합된 상기 리셉터, 상기 리셉터에 상기 리간드를 매개로 하여 부동화되어 있는 상기 바인더를 포함하는 제2 바이오물질 감지막을 포함한다.The biomaterial sensing layer is a dendrimer self-assembled monolayer on which the binder is immobilized, and the ligand is capable of specifically binding to a receptor formed on the electrode and having two or more ligand binding sites. Is immobilized on the first biomaterial sensing layer including a dendrimer self-assembled monolayer immobilized thereon and formed on the first biomaterial sensing layer and bonded to the receptor and the receptor through the ligand. And a second biomaterial sensing film including the binder.
제1 및 제2 바이오물질 감지막을 포함하는 경우에는 상기 제1 시약은 상기 제1 바이오물질 감지막에 부동화되어 있는 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드를 더 포함한다. 또, 상기 리간드와 경쟁적으로 상기 리셉터에 결합하여 상기 리셉터를 환치할 수 있는 리간드와 완충 용액을 포함하는 제2 시약을 상기 제1 시약과 순차적으로 처리함으로써 표면재생이 가능하다.When the first and second biomaterial sensing membranes are included, the first reagent further includes a ligand capable of binding to the receptor and replacing the receptor in competition with the ligand immobilized on the first biomaterial sensing membrane. do. In addition, surface regeneration is possible by sequentially treating a second reagent comprising a ligand capable of binding to the receptor to replace the receptor and a buffer solution with the first reagent.
바람직하기로는 상기 리간드는 바이오틴이고, 상기 리셉터는 아비딘 또는 스트렙트아비딘이다. 상기 바인더와 상기 타겟 물질 쌍은 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄(poly- saccharide), 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드 이다.Preferably the ligand is biotin and the receptor is avidin or streptavidin. The binder and the target material pair may comprise an antigen-antibody, a hormone-hormone receptor, a polynucleotide-complementary polynucleotide, a lectin-polysaccharide, a lipid-lipid binding protein or a membrane-membrane binding protein, a polynucleotide-poly Nucleotide binding proteins, receptor-ligands, drug-targets, protein-proteins, protein-polynucleotides.
상기 침전물 박막은 수용액에는 불용성이다. 상기 제1 시약 및/또는 제2 시약은 상기 바이오물질 감지막 및/또는 상기 타겟 물질의 활성에 영향을 주지 않는 시약이다.The precipitate thin film is insoluble in the aqueous solution. The first reagent and / or the second reagent are reagents that do not affect the activity of the biomaterial sensing film and / or the target material.
상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위한 바이오센서의 표면 재생 방법에 따르면 먼저, 기판 상의 전극 위에 형성되고, 타겟 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 바인더가 부동화되어 있는 바이오물질 감지막을 포함하는 바이오 센서로, 상기 타겟 물질에 표지된 촉매 물질의 촉매 작용에 의하여 형성된 침전물 박막에 의한 상기 전극의 유효 면적의 감소에 의해 생성되는 전기화학적 신호로 상기 타겟 물질의 유무 및/또는 그 양을 감지한 바이오 센서를 제공한다. 이어서, 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어진 제1 시약을 처리한다.According to a method of regenerating a surface of a biosensor for achieving the above another technical problem, first, a biosensor is formed on an electrode on a substrate and includes a biomaterial sensing layer in which a binder capable of specifically binding to a target material is immobilized. Providing a biosensor detecting the presence and / or amount of the target material by an electrochemical signal generated by the reduction of the effective area of the electrode by the thin film of precipitate formed by the catalytic action of the catalytic material labeled on the target material do. Subsequently, a first reagent consisting of 2 to 5% by weight of an organic solvent selected from the group consisting of ethanol, methanol and dimethyl sulfoxide and a residual buffer solution is treated.
기타 나머지 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다, 그러나 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 이하 첨부된 도면들을 참조하면서, 본 발명에 따른 바이오센서 및 이의 재생 방법에 대한 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 층 및 물질들의 모양 및 두께는 설명의 편의를 위하여 과장 또는 개략화된 것이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 부재를 지칭한다.Other remaining details are included in the detailed description and drawings, but the invention is defined only by the scope of the claims. Hereinafter, embodiments of a biosensor and a regeneration method thereof according to the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various forms, and only the embodiments make the disclosure of the present invention complete, and the scope of the invention to those skilled in the art. It is provided for complete information. Shapes and thicknesses of the layers and materials in the drawings are exaggerated or outlined for convenience of description. Like reference numerals refer to like elements throughout.
본 발명에 따른 바이오센서의 일부는 본 발명자에 의해 출원되고 공개된 공개 특허 제2002-007083호 및 본 발명자에 의해 출원된 특허출원 제 2001-076229호에 상세히 개시되어 있으며, 이것은 본 명세서에 속하는 것으로 한다.Some of the biosensors according to the invention are disclosed in detail in published patent application 2002-007083 and published patent application 2001-076229, filed by the inventor, which belong to the present specification. do.
도 1은 본 발명의 제1 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서(100)의 모식도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 전기 화학적 바이오센서(100)는 기판(101)과, 상기 기판(101) 위에 형성된 전극(102)과, 바이오물질 감지막(110)을 포함한다.1 is a schematic diagram of an electrochemical biosensor 100 according to a first embodiment of the present invention. Referring to FIG. 1, an electrochemical biosensor 100 according to the present invention includes a substrate 101, an electrode 102 formed on the substrate 101, and a biomaterial sensing layer 110.
상기 기판(101)은 실리콘 또는 유리로 이루어질 수 있다. 상기 전극(102)은 금, 은, 구리 또는 백금을 증발 또는 스퍼터링 방법으로 증착하여 형성한다. 바람직하기로는 금이 증착된 실리콘 기판이 사용된다.The substrate 101 may be made of silicon or glass. The electrode 102 is formed by depositing gold, silver, copper or platinum by evaporation or sputtering. Preferably, a silicon substrate on which gold is deposited is used.
바이오물질 감지막(110)은 특정 타겟 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 바인더(104)가 부동화되어 있는 고분자 자기조립 단분자막(103)을 포함한다. 고분자 자기조립 단분자막(103)은 덴드라이머(dendrimer) 자기 조립 단분자막(103)인 것이바람직하다. 바이오물질 감지막(110)은 기판(101)의 표면으로부터 수 나노미터 이내의 범위에 형성된다.The biomaterial sensing layer 110 includes a polymer self-assembled monolayer 103 in which a binder 104 capable of specifically binding to a specific target material is immobilized. The polymer self-assembled monolayer 103 is preferably a dendrimer self-assembled monolayer 103. The biomaterial sensing layer 110 is formed within a range of several nanometers from the surface of the substrate 101.
고분자 자기조립 단분자막(103)은 다음 두 가지 방법으로 형성할 수 있다. 전극(102) 상에 한쪽 말단이 아민, 숙신이미드, 카르복시아미드 또는 알데히드 등의 작용기로 수식된 알칸티올을 사용하여 자기조립막을 형성한 후, 상기 작용기와 이민 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 작용기인 알데히드, 숙신이미드, 카르복시아미드, 아민 등으로 수식된 덴드라이머 용액을 처리하여 덴드라이머 자기조립 단분자막(103)을 형성한다.The polymer self-assembled monolayer 103 can be formed by the following two methods. A functional group capable of forming an imine or amide bond with the functional group after forming a self-assembled membrane using an alkane thiol modified at one end on a functional group such as amine, succinimide, carboxyamide or aldehyde on the electrode 102 A dendrimer self-assembled monolayer 103 is formed by treating a dendrimer solution modified with phosphorus aldehyde, succinimide, carboxyamide, amine, or the like.
덴드라이머 자기조립 단분자막(103) 표면에 노출되어 있는 작용기인 알데히드, 숙신이미드, 카르복시아미드, 아민 등과 반응하여 이민 또는 아미드 결합을 형성할 수 있는 작용기로 수식된 바인더(104)를 덴드라이머 자기조립 단분자막(103)과 반응시켜 이민 또는 아미드 결합에 의해 바인더(104)를 부동화(immobilization)시켜서 바이오물질 감지막(110)을 완성한다.The dendrimer is a binder 104 modified with a functional group capable of reacting with aldehydes, succinimides, carboxyamides, and amines, which are functional groups exposed on the surface of the dendrimer self-assembled monolayer 103, to form imines or amide bonds. The biomaterial sensing layer 110 is completed by immobilizing the binder 104 by imine or amide bond by reacting with the self-assembled monolayer 103.
바인더(104)는 검출하고자 하는 타겟 물질의 종류에 따라 선택된다. 바인더와 타겟 물질의 쌍으로는 항원-항체, 호르몬-호르몬 리셉터, 폴리뉴클레오타이드-상보적인 폴리뉴클레오타이드, 렉틴-당쇄(poly- saccharide), 지질-지질 결합 단백질 또는 멤브레인-멤브레인 결합 단백질, 폴리뉴클레오타이드-폴리뉴클레오타이드 결합 단백질, 리셉터-리간드, 약-타켓, 단백질-단백질, 단백질-폴리뉴클레오타이드 등의 조합들이 모두 가능하다. 상기 바인더와 타겟 물질들은 생체내에서 추출한 물질, 생체외에서 합성된 물질 모두를 지칭한다.The binder 104 is selected according to the type of target material to be detected. Pairs of binders and target agents include antigen-antibodies, hormone-hormonal receptors, polynucleotide-complementary polynucleotides, lectin-sugar chains, lipid-lipid binding proteins or membrane-membrane binding proteins, polynucleotide-poly Combinations of nucleotide binding proteins, receptor-ligands, drug-targets, protein-proteins, protein-polynucleotides and the like are all possible. The binder and target materials refer to both materials extracted in vivo and materials synthesized ex vivo.
도 2는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서의 감지 및 재생 과정을 나타내는 흐름도이다. 도 3 내지 도 6은 도 2의 각 흐름도에 대응하는 바이오센서의 모식도들이다.2 is a flowchart illustrating a process of detecting and regenerating a biosensor according to a first embodiment of the present invention. 3 to 6 are schematic views of biosensors corresponding to the flowcharts of FIG. 2.
도 1에 도시되어 있는 바이오센서를 사용하여 테스트 샘플내의 타겟 물질 존재 유무를 감지한다. 먼저 바이오센서(100)에 테스트 샘플을 공급하여 바인더(104)와 타겟 물질(105)간의 특이적 결합을 유도한다(S10). 테스트 샘플은 테스트하고자 하는 시료를 완충 수용액에 희석하여 준비한다. 테스트 샘플 내에 바이오센서(100)의 바인더(104)와 특이적으로 결합할 수 있는 타켓 물질(105)이 존재한다면 도 3과 같은 특이적 결합이 일어난다. 도3 에서는 바인더(104)와 타겟 물질(105)이 각각 항원과 항체인 경우를 예시하고 있다.The biosensor shown in FIG. 1 is used to detect the presence or absence of a target substance in the test sample. First, a test sample is supplied to the biosensor 100 to induce specific binding between the binder 104 and the target material 105 (S10). Test samples are prepared by diluting the sample to be tested in a buffered aqueous solution. If there is a target material 105 that can specifically bind to the binder 104 of the biosensor 100 in the test sample, specific binding occurs as shown in FIG. 3. 3 illustrates a case where the binder 104 and the target substance 105 are antigens and antibodies, respectively.
타겟 물질(105)의 결합 유무를 전기 화학적인 방법으로 검출하기 위한 침전 반응 유도를 위하여 바이오센서(100)와 반응시키기 전에 타겟 물질(105)은 침전 반응을 유도할 수 있는 촉매 물질(106)로 표지한다. 촉매 물질(106)로는 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 포도당산화효소 등의 촉매 효소를 사용하는 것이 바람직하다.Before reacting with the biosensor 100 to induce precipitation reaction to detect the presence or absence of binding of the target material 105 in an electrochemical manner, the target material 105 is a catalyst material 106 capable of inducing a precipitation reaction. Cover. As the catalytic material 106, it is preferable to use catalytic enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, and glucose oxidase.
이어서, 침전 반응을 유도한다(도2의 S20). 테스트 샘플을 처리한 후, 바인더(104)와 타겟 물질(105)의 반응이 완료되기에 적정한 시간이 소요된 후, 바이오센서(100)에 침전 기질과 표지된 촉매 물질(106)의 촉매 작용을 활성화시킬 수 있는 기질의 혼합 완충 수용액인 침전 반응 유도 용액을 공급한다. 만약 촉매 물질(106)이 표지되어 있는 타겟 물질(105)이 테스트 샘플 내에 존재한다면, 촉매물질(106)의 작용에 의해 도 4에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막(107)이 형성되어 전극(102) 표면을 덮게 된다.Subsequently, a precipitation reaction is induced (S20 in FIG. 2). After processing the test sample, it takes a reasonable time for the reaction of the binder 104 and the target material 105 to complete, and then the biosensor 100 to catalyze the precipitation substrate and the labeled catalytic material 106 A precipitation reaction induction solution, which is a mixed buffer aqueous solution of an activatable substrate, is supplied. If the target material 105 labeled with the catalytic material 106 is present in the test sample, the precipitate thin film 107 is formed as shown in FIG. 4 by the action of the catalytic material 106 to form the electrode 102. ) Cover the surface.
촉매 물질(106)이 퍼옥시다아제인 경우 침전 기질로는 4-클로로-1-나프톨을 사용한다. 침전 반응 유도 용액내의 퍼옥시다아제의 기질에 의해 퍼옥시다아제(106)가 활성화되면, 활성화된 퍼옥시다아제의 작용에 의해 침전 기질인 4-클로로-1-나프톨이 수용액에 대해 수용성에서 불용성으로 변성된다. 그 결과 침전물 박막(107)이 형성되게 된다.When the catalytic material 106 is a peroxidase, 4-chloro-1-naphthol is used as the precipitation substrate. When peroxidase 106 is activated by the substrate of the peroxidase in the precipitation induction solution, 4-chloro-1-naphthol, which is a precipitation substrate, is denatured from water-soluble to insoluble by the action of activated peroxidase. As a result, the precipitate thin film 107 is formed.
따라서, 침전 기질은 촉매 물질(106), 즉 촉매 효소의 종류에 따라 다양하게 선택할 수 있다. 예를 들어 촉매 물질(106)이 알칼라인포스파타아제인 경우에는 침전 기질로는 니트로 블루 테트라졸리움(nitro blue tetrazolium), 인도니트로테트라졸리움(indonitrotetrazolium) 등이 적합하며, 포도당 산화효소인 경우에는 테트라니트로 블루 테트라졸리움(tetranitro blue tetrazolium), 디메틸티아졸 디페닐테트라졸리움(dimethylthiazol diphenyltetrazolium) 등이 침전 기질로 적합하다.Accordingly, the precipitation substrate may be variously selected depending on the type of the catalytic material 106, that is, the catalytic enzyme. For example, when the catalytic material 106 is an alkaline phosphatase, nitro blue tetrazolium, indonitrotetrazolium, or the like is preferable as a precipitation substrate, and tetranitro is a glucose oxidase. Tetranitro blue tetrazolium, dimethylthiazol diphenyltetrazolium and the like are suitable as precipitation substrates.
계속해서, 전기화학적 방법으로 타겟 물질의 유무 및 그 양을 감지한다(도 2의 S30). 전기화학적 방법으로는 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry)을 사용하는 것이 바람직하다. 순환 전압 전류법은 도 4에 도시되어 있는 바이오센서(100)의 전극(101)을 작업 전극으로 하고, 은/염화은 기준 전극, 그리고 백금선 전극을 보조 전극으로 하는 삼 전극계를 구성하여 신호 검출을 한다. 순환 전압 전류법은 전기 화학적 활성 종을 전해질 용액 내에 공급하여 전극 상에서 전기 화학적 활성종이 산화되면서 발생시키는 산화 전류를 측정함으로써 수행한다. 전기 화학적 활성종으로는 일반적으로 페로센 유도체 등이 주로 사용되며, 전해질 용액 내에 수 밀리몰 이하의 농도가 되도록 조제하여 사용한다.Subsequently, the presence and the amount of the target material are detected by the electrochemical method (S30 of FIG. 2). As an electrochemical method, it is preferable to use cyclic voltammetry. The cyclic voltammetry uses a three-electrode system including the electrode 101 of the biosensor 100 shown in FIG. 4 as a working electrode, the silver / silver chloride reference electrode, and the platinum wire electrode as an auxiliary electrode to perform signal detection. do. Cyclic voltammetry is performed by feeding the electrochemically active species into the electrolyte solution and measuring the oxidation current generated as the electrochemically active species oxidizes on the electrode. Generally as an electrochemically active species, a ferrocene derivative etc. are mainly used, and it prepares and uses so that it may become a concentration below several millimoles in electrolyte solution.
도 4에 도시되어 있는바와 같이 형성된 침전물 박막(107)에 의하여 전극(101)의 유효 면적이 감소하면 순환 전압 전류법에 의해 측정되는 전압 전류의 파형 및 최대 전류값이 변화하게 된다. 따라서 전압 전류의 파형의 변화 또는 최대 전류 값의 변화를 측정하여 센서 신호를 정량 수치화함으로써 타겟 물질(105)의 양을 정량적으로 분석할 수 있다.When the effective area of the electrode 101 is reduced by the precipitate thin film 107 formed as shown in FIG. 4, the waveform and the maximum current value of the voltage current measured by the cyclic voltammetry are changed. Accordingly, the amount of the target material 105 can be quantitatively analyzed by measuring the change in the waveform of the voltage current or the change in the maximum current value by quantifying the sensor signal.
이와 같이 바이오센서(100)를 이용한 신호 검출을 수행하고 나면, 도 4와 같이, 사용된 바이오센서(100)의 바이오물질 감지막(110)은 특이적 결합반응이 일어난 타겟 물질(105)층과 단백질의 분자층과 침전물 박막(107)에 의하여 비가역적으로 덮이게 되고 따라서 재사용이 불가능해 진다.As described above, after performing signal detection using the biosensor 100, as illustrated in FIG. 4, the biomaterial sensing film 110 of the used biosensor 100 may be formed of a target material 105 layer having a specific binding reaction. It is irreversibly covered by the molecular layer and sediment thin film 107 of the protein and therefore impossible to reuse.
따라서, 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오센서(100)를 재사용하기 위해서는 표면 재생 단계를 실시한다.Therefore, in order to reuse the biosensor 100 according to the first embodiment of the present invention, a surface regeneration step is performed.
먼저, 침전물 제거용 시약을 처리하여 침전물 박막을 제거한다(도 2의 S40). 그 결과 도 5에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막이 제거된 표면을 구비하는 바이오센서(100)가 재생된다.First, the sediment removal reagent is treated to remove the sediment thin film (S40 of FIG. 2). As a result, as shown in FIG. 5, the biosensor 100 having the surface from which the deposit thin film is removed is regenerated.
침전물 박막(도 4의 107)의 제거는 바이오물질 감지막(110)의 표면에 결합되어 있는 물질들, 즉, 타겟 물질(105) 및 표지된 촉매 물질(106)의 생체 활성에 영향을 주지 않는 시약을 사용하여 진행하는 것이 바람직하다. 그리고 수용액에는 불용성인 상기 침전물 박막(107)을 효율적으로 제거할 수 있는 시약을 사용하여 진행하는 것이 바람직하다.Removal of the thin film of sediment (107 of FIG. 4) does not affect the bioactivity of the materials bound to the surface of the biomaterial sensing film 110, ie, the target material 105 and the labeled catalytic material 106. It is preferred to proceed with the reagents. In the aqueous solution, it is preferable to proceed with a reagent that can efficiently remove the insoluble precipitate thin film 107.
따라서, 침전물 박막(107) 제거 시약으로는 에탄올, 메탄올, 디메틸술폭사이드(DMSO)로 이루어진 그룹에서 선택된 유기 용매 2 내지 5 중량%와 잔량의 완충 용액으로 이루어진 시약이 적합하다. 완충 용액으로는 인산염 완충용액(PBS), 카보네이트 완충용액, 보레이트 완충용액 등이 적합하다.Therefore, a reagent consisting of 2 to 5% by weight of an organic solvent selected from the group consisting of ethanol, methanol, and dimethyl sulfoxide (DMSO) and a residual buffer solution is suitable as the reagent for removing the thin film 107. As the buffer solution, phosphate buffer solution (PBS), carbonate buffer solution, borate buffer solution and the like are suitable.
퍼옥시다아제에 의해 형성된 침전물 박막(107) 제거의 경우에는 중량비로 5%인 에탄올과 95%인 인산염 완충용액의 혼합액을 사용한다. 그러나, 침전 반응을 일으키는 표지 촉매 효소 및 침전 기질에 따라 형성되는 침전물 박막의 물성이 다르므로 제거 시약 또한 침전물 박막에 따라 그 조성 성분 및 함량이 달라질 수 있음은 물론이다.In the case of removing the precipitate thin film 107 formed by peroxidase, a mixture of 5% ethanol and 95% phosphate buffer solution by weight is used. However, since the physical properties of the precipitate thin film formed according to the label catalyst enzyme and the precipitation substrate causing the precipitation reaction, the removal reagent may also vary in composition and content depending on the precipitate thin film.
이어서, 바이오 물질 감지막(110)에 결합되어 있는 촉매 물질(106)이 표지되어 있는 타겟 물질(105)을 분리시킨다(도 2의 S50). 도 6과 같이, 타겟 물질(105)의 분리는 바이오 물질 감지막(110)의 바인더(104)와 경쟁적으로 상기 타겟 물질(105)에 결합하여 상기 타겟 물질(105)을 환치(displace)할 수 있는 바인더(108)가 완충 용액에 희석되어 있는 시약을 사용하여 상기 타겟 물질(105)을 분리시켜서 바이오 물질 감지막(110)의 표면을 완전히 재생한다. 환치 반응에 사용되는 시약내의 바인더(108)는 바이오 물질 감지막(110)에 부동화되어 있는 바인더(104)와 동일물질일 수도 있고, 이와 경쟁적으로 타겟 물질(105)에 결합할 수 있는 다른 물질일 수도 있다.Subsequently, the target material 105 labeled with the catalytic material 106 coupled to the biomaterial sensing film 110 is separated (S50 of FIG. 2). As illustrated in FIG. 6, the separation of the target material 105 may bind to the target material 105 to replace the target material 105 in a competitive manner with the binder 104 of the biomaterial sensing film 110. The target material 105 is separated using a reagent in which a binder 108 is diluted in a buffer solution to completely regenerate the surface of the biomaterial sensing film 110. The binder 108 in the reagent used for the displacement reaction may be the same material as the binder 104 immobilized on the biomaterial sensing film 110 or may be another material capable of competitively binding to the target material 105. It may be.
재생이 완료된 바이오센서(100)는 필요에 따라 상술한 S10 내지 S50 단계를거치면서 반복적으로 재사용될 수 있다.The biosensor 100, which has been regenerated, may be repeatedly reused through the above-described steps S10 to S50 as necessary.
도 2에서는 침전물 박막 제거와 타겟 물질 분리 단계가 순차적으로 진행되는 경우에 대해서만 도시하였으나, 침전물 박막 제거 시약이 바인더(104)와 경쟁적으로 상기 타겟 물질에 결합하여 상기 타겟 물질을 환치할 수 있는 바인더(108)를 더 포함하여 침전물 박막 제거와 타겟 물질 분리가 동시에 진행되도록 할 수도 있다.In FIG. 2, only the case where the sediment thin film removal step and the target material separation step are sequentially performed, but the binder thin film removing reagent binds to the target material competitively with the binder 104 to replace the target material ( 108) may be further included so that the deposit thin film and the target material separation proceed simultaneously.
도 7은 본 발명의 제2 실시예에 따른 전기 화학적 바이오센서(200)의 모식도이다. 제2 실시예에 따른 바이오센서(200)는 제1 바이오물질 감지막(110) 및 제2 바이오물질 감지막(120)으로 구성된다는 점에 있어서 제1 실시예와 차이가 있다. 제1 바이오물질 감지막(110)의 구조는 제1 실시예와 거의 동일하다. 다만, 고분자 자기 조립 단분자막(103)에 부동화된 제1 바인더(104)가 2 이상의 리간드 결합 부위를 가지는 리셉터(113)와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드라는 점에 있어서 제1 실시예와 차이가 있다.7 is a schematic diagram of an electrochemical biosensor 200 according to a second embodiment of the present invention. The biosensor 200 according to the second embodiment is different from the first embodiment in that the biosensor 200 and the second biomaterial detection film 120 are configured. The structure of the first biomaterial sensing film 110 is almost the same as in the first embodiment. However, the first binder 104 immobilized on the polymer self-assembled monolayer 103 is different from the first embodiment in that it is a ligand capable of specifically binding to the receptor 113 having two or more ligand binding sites. have.
제2 바이오물질 감지막(120)은 제1 바이오물질 감지막(110)에 부동화된 리간드(104)에 결합된 리셉터(113)을 매개로 하여 구성된다. 즉, 상기 리간드(104)와 결합된 상기 리셉터(113)의 나머지 결합부위에 타겟 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 제2 바인더(114)가 결합된 리간드(104)가 부동화되어 제2 바이오물질 감지막(120)을 형성한다.The second biomaterial sensing film 120 is configured through the receptor 113 coupled to the ligand 104 immobilized on the first biomaterial sensing film 110. That is, the ligand 104 coupled to the second binder 114 capable of specifically binding to the target material is immobilized on the remaining binding portion of the receptor 113 coupled to the ligand 104 to form a second biomaterial. The sensing film 120 is formed.
상기 리간드로는 바이오틴이 상기 리셉터로는 아비딘 또는 스트렙트아비딘(이하 (스트렙트)아비딘))이 적합하다.Biotin is suitable as the ligand and avidin or streptavidin (hereinafter, streptavidin) as the receptor is suitable.
제2 실시예에 따른 바이오센서(200)의 경우에는 리간드(104)인 바이오틴에결합시킬 수 있는 제2 바인더(114)의 선택 폭이 다양하므로 다양한 형태의 타겟 물질에 대한 바이오센서를 구현할 수 있다는 장점이 있다.In the case of the biosensor 200 according to the second embodiment, since the selection range of the second binder 114 capable of binding to the biotin, which is the ligand 104, varies, it is possible to implement biosensors for various types of target materials. There is an advantage.
제 2실시예에 따른 바이오센서(200)의 감지 및 재생 과정을 도 8 내지 도 11을 참고하여 설명한다. 제1 실시예와 동일한 단계는 상세한 설명을 생략하도록 한다.A detection and regeneration process of the biosensor 200 according to the second embodiment will be described with reference to FIGS. 8 to 11. The same steps as in the first embodiment will be omitted.
먼저, 바이오센서(200)에 테스트 샘플을 공급한다. 테스트 샘플내에 제2 바인더(114)와 특이적으로 결합할 수 있는 타겟 물질(125)이 존재한다면 도 8과 같은 특이적 결합이 일어난다. 타겟 물질(125)의 결합 유무를 전기 화학적인 방법으로 검출하기 위한 침전 반응 유도를 위하여 바이오센서(200)와 반응시키기 전에 타겟 물질(125)은 침전 반응을 유도할 수 있는 촉매 물질(126)로 표지한다.First, a test sample is supplied to the biosensor 200. If there is a target material 125 that can specifically bind to the second binder 114 in the test sample, specific binding as shown in FIG. 8 occurs. Before reacting with the biosensor 200 to induce precipitation reaction for detecting the binding of the target material 125 by an electrochemical method, the target material 125 is a catalyst material 126 capable of inducing a precipitation reaction. Cover.
이어서, 제1 실시예와 마찬가지로 침전 반응을 유도한다. 만약 촉매 물질(126)이 표지되어 있는 타겟 물질(125)이 테스트 샘플내에 존재한다면, 촉매 물질(126)의 작용에 의하여 도 9와 같이 침전물 박막(107)이 형성되어 전극(102) 표면을 덮게 된다.Subsequently, a precipitation reaction is induced as in the first embodiment. If the target material 125 labeled with the catalyst material 126 is present in the test sample, the precipitate thin film 107 is formed to cover the surface of the electrode 102 by the action of the catalyst material 126 as shown in FIG. 9. do.
이후, 순환 전압 전류법을 사용해서 타겟 물질(125)의 양을 정량적으로 분석하는 단계까지는 제1 실시예의 바이오센서의 경우와 동일하게 진행한다.Thereafter, the quantitative analysis of the amount of the target material 125 using the cyclic voltammetry is performed in the same manner as in the biosensor of the first embodiment.
이후 표면 재생 단계를 실시한다. 먼저, 침전물 박막 제거용 시약을 처리하여 침전물 박막(107)을 제거하여 도 10에 도시되어 있는 바와 같이 침전물 박막이 제거되어 재생된 바이오 센서(200)를 형성한다. 이 때 사용되는 침전물 박막 제거용 시약은 제1 실시예에서 설명한 특성을 만족시키는 시약을 사용한다.The surface regeneration step is then performed. First, the deposit thin film 107 is treated to remove the deposit thin film 107 to remove the deposit thin film as shown in FIG. 10 to form a regenerated biosensor 200. As the reagent for removing the thin film of precipitate, a reagent satisfying the characteristics described in the first embodiment is used.
이어서, 제2 바이오 물질 감지막(120)을 제1 바이오 물질 감지막(110)으로부터 분리 제거한다. 리간드(104)와 경쟁적으로 리셉터(113)에 결합할 수 있는 리간드(109)가 완충 용액에 희석되어 있는 시약을 사용하여 리셉터(113)를 환치함으로써 도 11과 같이 제1 바이오 물질 감지막(110)이 노출되도록 한다. 환치 반응에 사용되는 시약내의 리간드(109)는 제1 바이오 물질 감지막(110)에 부동화되어 있는 리간드(104)와 동일 물질일 수도 있고, 이와 경쟁적으로 리셉터(113)에 결합할 수 있는 다른 물질일 수도 있다.Subsequently, the second biomaterial sensing layer 120 is separated and removed from the first biomaterial sensing layer 110. By replacing the receptor 113 using a reagent in which a ligand 109 capable of binding to the receptor 113 competitively with the ligand 104 is diluted in a buffer solution, as shown in FIG. ) Is exposed. The ligand 109 in the reagent used for the substitution reaction may be the same material as the ligand 104 immobilized on the first biomaterial sensing film 110, and another material capable of competitively binding to the receptor 113. It may be.
또, 제1 실시예에서 설명한 바와 마찬가지로 침전물 박막 제거 시약이 리간드(104)와 경쟁적으로 상기 리셉터(113)에 결합하여 리셉터(113)을 환치할 수 있는 바인더를 더 포함하여 침전물 박막 제거와 타겟 물질 분리가 동시에 진행되도록 할 수도 있다.In addition, as described in the first embodiment, the deposit thin film removing reagent further includes a binder capable of binding to the receptor 113 to replace the receptor 113 in a competitive manner with the ligand 104, and thus removing the deposit thin film and the target material. You can also let the separation proceed at the same time.
이와 같은 재생 과정을 거칠 경우 제1 바이오 물질 감지막(110) 위에 원하는 타겟 물질을 검출할 수 있는 새로운 바인더를 포함하는 제2 바이오 물질 감지막을 새로 형성하여 감지 작업을 수행할 수 있다. 즉, 다양한 형태의 타겟 물질을 검출할 있는 바이오센서를 매우 쉽고도 용이하게 재 제작하여 바이오 물질의 감지에 사용할 수 있다.When such a regeneration process is performed, a sensing operation may be performed by newly forming a second biomaterial sensing film including a new binder capable of detecting a desired target material on the first biomaterial sensing film 110. That is, a biosensor capable of detecting various types of target substances can be very easily and easily rebuilt to be used for the detection of biomaterials.
이하 본 발명에 따른 바이오센서의 제조예 및 이를 이용한 감지 및 재생 방법에 대한 구체적인 실험예들을 설명한다. 그러나 이 실험예들에서 언급된 구체적인 수치 및 시약의 조성 성분 및 함량 등은 각 공정 조건에 따라 변화될 수 있음은 물론이다.Hereinafter will be described specific experimental examples of the manufacturing example of the biosensor according to the present invention and the detection and regeneration method using the same. However, the specific numerical values and compositional components and contents of the reagents mentioned in these experimental examples may be changed depending on the process conditions.
<실험예 1: 바이오센서의 제조>Experimental Example 1: Manufacture of Biosensor
금이 증착된 실리콘 기판을 피란(piranha) 용액으로 세척하고, 세척된 기질 시편을 디티오프로피온산 비스 N-히드록시숙신이미드에스테르가 DMSO에 5mM의 농도로 용해되어 있는 용액에 담근 후 2시간 동안 반응시켜 자기조립박막을 수득하였다. 얻어진 자기조립박막을 에탄올로 세척하고, G4에 해당하며 64개의 아민 반응기를 포함하는 폴리(아미도아민) 덴드라이머가 0.022mM의 농도로 용해된 에탄올 용액에 1시간 담그어 덴드라이머 자기 조립 단분자막을 제조하였다.The gold-deposited silicon substrate was washed with a piranha solution, and the washed substrate specimen was immersed in a solution in which dithiopropionic acid bis N-hydroxysuccinimide ester was dissolved in DMSO at a concentration of 5 mM. Reaction gave a self-assembled thin film. The obtained self-assembled thin film was washed with ethanol, and a poly (amidoamine) dendrimer corresponding to G4 and containing 64 amine reactors was immersed in an ethanol solution dissolved at a concentration of 0.022 mM for 1 hour to form a dendrimer self-assembled monolayer. Prepared.
이어서, 알데히드기로 수식된 IgG에 대한 항원(10μg/㎖) 용액에 덴드라이머 자기 조립 단분자막을 1시간 담그어 IgG에 대한 항원이 부동화된 바이오센서를 완성하였다.Subsequently, the dendrimer self-assembled monolayer was immersed in an aldehyde-modified IgG antigen (10 μg / ml) solution for 1 hour to complete a biosensor immobilized with an antigen against IgG.
<실험예 2: 타겟 항체에 대한 바이오센서의 노출>Experimental Example 2: Exposure of Biosensor to Target Antibody
퍼옥시다아제로 표지된 IgG (10μg/ 1㎖ 인산염 완충용액) 용액을 바이오센서 표면에 적하한 후, 25℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 은/염화은 기준 전극, 백금선 보조 전극 그리고 타겟 항체에 노출된 바이오센서의 전극을 작업전극으로 하여 순환 전압 전류법으로 전기 화학적 측정을 하였다. 작업 전극은 100μM의 페로센 메탄올 (ferrocene methanol)이 용해되어 있는 전해질 완충 용액이 들어있는 전기 화학적인 셀에 위치시켜서 측정하였다. 측정된 결과가 도 12의 ① 번 그래프이다. ① 번 그래프로부터 바이오센서의 전극 표면이 열린 구조로 형성되어 전기 화학적 활성종이 쉽게 산화됨을 확인할 수 있었다.A solution of IgG (10 μg / 1 ml phosphate buffer) labeled with peroxidase was added dropwise to the surface of the biosensor, followed by reaction at 25 ° C. for 2 hours. Electrochemical measurements were made using cyclic voltammetry using silver / silver chloride reference electrodes, platinum wire auxiliary electrodes, and electrodes of biosensors exposed to target antibodies as working electrodes. Working electrodes were measured by placing them in an electrochemical cell containing electrolyte buffer solution in which 100 μM of ferrocene methanol was dissolved. The measured result is graph ① of FIG. 12. ① The graph shows that the electrode surface of the biosensor was formed into an open structure, so that the electrochemically active species was easily oxidized.
<실험예 3: 침전 반응의 유도>Experimental Example 3: Induction of Precipitation Reaction
퍼옥시다아제의 기질과 침전기질인 4-클로로-1-나프톨이 용해되어 있는 침전 반응 유도 용액을 타겟 항체에 노출된 바이오센서의 표면에 처리하여 침전 반응을 유도시켰다. 이어서 침전 반응이 완료된 후 실험예 2에서 설명한 바와 마찬가지로 순환 전압 전류법으로 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ②번 그래프이다. ②번 그래프로부터 침전물 박막의 누적에 의하여 바이오센서의 표면이 닫혀 산화전류가 크게 감소한 것을 확인할 수 있었다.Precipitation reaction was induced by treating the surface of the biosensor exposed to the target antibody with the precipitation reaction inducing solution in which the peroxidase substrate and the precipitation substrate 4-chloro-1-naphthol were dissolved. Subsequently, after the precipitation reaction was completed, it was measured by cyclic voltammetry as described in Experimental Example 2. The result is graph ② of FIG. From the graph No. 2, the surface of the biosensor was closed due to the accumulation of thin deposits, and the oxidation current was greatly reduced.
<실험예 4: 침전물 박막의 제거>Experimental Example 4 Removal of Precipitated Thin Film
중량비로 5%인 에탄올과 95%인 인산염 완충용액을 침전 반응이 일어난 바이오센서에 적하한후 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 바이오센서의 표면을 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ③번 그래프이다. ③번 그래프로부터 침전물 박막이 완전히 제거되어 바이오센서의 표면이 다시 열린 구조로 되어 표면 재생이 일어난 것을 관찰할 수 있었다.5% ethanol and 95% phosphate buffer solution by weight was added dropwise to the biosensor where the precipitation reaction occurred, and then reacted at 25 ° C. for 5 minutes. The surface of the biosensor after the reaction was measured by cyclic voltammetry. The result is graph ③ of FIG. 12. From the graph ③, the deposit thin film was completely removed and the surface of the biosensor was opened again, and the surface regeneration occurred.
<실험예 5: 재침전 반응의 유도>Experimental Example 5: Induction of Reprecipitation Reaction
실험예 4에서 침전물 박막이 제거된 바이오센서에 대해서 실험예 3과 동일한 시약 및 반응 조건으로 재침전 반응을 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 12의 ④번 그래프이다. ④번 그래프로부터 전극이 다시 닫힌 구조에 대한 신호를 나타냄을 보이는 것을 확인할 수 있었으며 이로부터 바이오 물질 감지막의 표면에 결합된 생체물질(IgG)들의 활성이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다.In Experimental Example 4, the biosensor from which the precipitate thin film was removed was subjected to the reprecipitation reaction under the same reagents and reaction conditions as in Experimental Example 3, and then the characteristics were measured by cyclic voltammetry. The result is graph ④ of FIG. 12. It can be seen from the graph ④ that the electrode shows a signal for the closed structure again, from which the activity of the biomaterials (IgG) bound to the surface of the biomaterial sensing film was maintained.
<실험예 6: 침전물 박막 제거 및 환치 반응의 유도>Experimental Example 6 Deposition of Sediment Thin Film and Induction of Restitution Reaction
바이오센서의 준비 및 타겟 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도까지는 실험예 1 내지 실험예 3과 동일하게 진행하여 각 단계별로 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13에 도시되어 있다. ①번 그래프는 표면 침전 반응 이전의 바이오센서의 측정 그래프로 바이오센서의 표면이 열린 구조로 형성되어 전기화학적 활성종이 쉽게 산화되는 상태임을 확인할 수 있었고, ②번 그래프는 침전 반응 이후의 측정 그래프로, 침전물 박막의 누적에 의해 바이오센서의 표면이 닫혀 산화 전류가 크게 감소한 상태임을 확인할 수 있었다.Preparation of the biosensor, exposure to the target material, and induction of the precipitation reaction were performed in the same manner as in Experimental Examples 1 to 3, and the characteristics were measured by cyclic voltammetry at each step. The result is shown in FIG. The graph ① is a measurement graph of the biosensor before the surface precipitation reaction, and the surface of the biosensor was formed in an open structure, so that the electrochemically active species was easily oxidized. Accumulation of the thin film of the deposit closed the surface of the biosensor, it was confirmed that the oxidation current is significantly reduced.
이어서, 실험예 4와 동일한 방법으로 침전물 박막을 제거한 후, IgG에 대한 항원(1mg/㎖)의 완충용액을 처리하여 바이오센서의 바이오물질 감지막에 결합한 IgG 의 환치 반응을 10분간 연속적으로 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ③번 그래프이다. 침전물 박막 제거만 실시한 이후에 측정한 도 12의 ③번 그래프와 비교해볼 때, 산화 전류가 더 많이 흐르고 있음을 알 수 있으며, 이로부터 바이오센서 표면의 침전물 박막 제거와 함께 바이오 물질 감지막에 특이적으로 결합한 타겟 물질인 IgG가 환치되어 제거되었음을 확인할 수 있었다.Subsequently, the precipitate thin film was removed in the same manner as in Experimental Example 4, and then treated with a buffer solution of an antigen (1 mg / ml) for IgG to proceed with the substitution reaction of IgG bound to the biosensor membrane of the biosensor for 10 minutes. Then, the characteristic was measured by the cyclic voltammetry. The result is graph ③ of FIG. 13. Comparing with the graph ③ of FIG. 12 measured after only removing the thin film of the precipitate, it can be seen that more oxidation current flows, and from this, specific to the biomaterial sensing film together with the removal of the thin film of the surface of the biosensor. It can be confirmed that IgG, which is a target substance bound to, was removed by substitution.
계속해서 실험예 3과 동일한 시약 및 반응 조건으로 재침전 반응을 진행한 후, 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ④번 그래프이다. 전극이 열린 구조에 대한 신호를 나타내고 있음을 알 수 있다. 이는 침전 반응을 일으킬 수 있는 촉매 효소가 표지된 IgG가 바이오 물질 감지막으로부터 제거되었기 때문에 나타나는 당연한 결과임을 알 수 있다.Subsequently, the reprecipitation reaction was carried out with the same reagents and reaction conditions as in Experimental Example 3, and then the characteristics were measured by cyclic voltammetry. The result is graph ④ of FIG. 13. It can be seen that the electrode shows a signal for the open structure. This is a natural result because the catalytic enzyme labeled IgG that can cause precipitation reaction was removed from the biomaterial sensing membrane.
마지막으로, 바이오센서의 재사용시의 감지 감도 유지 여부를 알아보기 위해 상술한 재생 단계들을 거친 바이오센서의 표면에 대해 실험예 2 및 실험예 3과 동일한 방법으로 타겟 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도를 진행한 후 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 13의 ⑤번 그래프이다. ⑤번 그래프로부터 전극이 다시 닫힌 구조에 대한 신호를 나타냄을 알 수 있다. 이로부터 본 발명에 따라 재생된 바이오센서가 신규 감지에 대해서도 다시 유효한 특성을 가짐을 확인할 수 있었다.Lastly, in order to determine whether the sensitivity of the biosensor is maintained when reusing the biosensor, the exposure to the target material and the precipitation reaction are performed on the surface of the biosensor through the above-described regeneration steps in the same manner as in Experimental Examples 2 and 3. After proceeding to measure the characteristics by cyclic voltammetry. The result is graph ⑤ of FIG. From the graph ⑤, it can be seen that the electrode shows a signal for the closed structure. From this, it can be seen that the biosensor regenerated according to the present invention has valid characteristics again for new detection.
<비교예>Comparative Example
바이오센서의 준비 및 타겟 물질에의 노출 그리고 침전 반응의 유도까지는 실험예 1 내지 실험예 3과 동일하게 진행하고 침전물 박막의 제거를 순수유기 용매인 에탄올 100%로 진행하고, 다시 실험예 5와 동일하게 재침전 반응까지 진행한 후, 각 단계별로 순환 전압 전류법으로 특성을 측정하였다. 그 결과가 도 14에 도시되어 있다. ①번 그래프는 침전 반응 전, ②번 그래프는 침전 반응 후, ③번 그래프는 순수 유기 용매로 침전물 박막 제거 후, ④ 번 그래프는 재침전 반응 후에 각각 측정한 결과이다. ③번 그래프로부터 침전물 박막이 제거되었음을 확인할 수 있으나, ④번 그래프로부터 재 침전 반응이 일어나지 않음을 알 수 있다. 이는 도 15에 도시되어 있는 바와 같이, 바이오 물질 감지막(110) 표면에 결합되어 있던 단백질인 항체(IgG) 및 표지 효소들이 활성이 없어진 항체 및 표지 효소(130)로 변성되었기 때문으로 해석된다. 따라서, 순수 유기 용매만으로는 본 발명에 따른 재생반응을 효과적으로 진행할 수 없음을 알 수 있었다.Preparation of the biosensor, exposure to the target material, and induction of the precipitation reaction were performed in the same manner as in Experimental Examples 1 to 3, and the removal of the precipitate thin film was performed with 100% pure organic solvent, ethanol, and the same as in Experimental Example 5. After proceeding to the reprecipitation reaction, the characteristics were measured by cyclic voltammetry at each step. The result is shown in FIG. Graph ① is before the precipitation reaction, graph ② after the precipitation reaction, graph ③ after removing the thin film of precipitate with pure organic solvent, graph ④ after the reprecipitation reaction. It can be seen that the precipitate thin film is removed from the graph ③, but it can be seen that the re-precipitation reaction does not occur from the graph ④. This is because the antibody (IgG) and the labeling enzymes, which are proteins bound to the surface of the biomaterial sensing film 110, are denatured to the deactivated antibody and the labeling enzyme 130, as shown in FIG. 15. Therefore, it was found that the pure organic solvent alone could not effectively proceed with the regeneration reaction according to the present invention.
본 발명에 따른 바이오센서는 바이오 물질의 검출 이후에 바이오물질 감지막에 부동화된 타겟 물질막의 활성에 영향을 주지 않으면서 타겟 물질막을 유지한 상태로 표면 재생하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 특이 결합된 타겟 물질막을 유리시키되 바이오물질 감지막을 재사용시 고감도를 그대로 유지할 수 있도록 표면 재생이 가능하다.The biosensor according to the present invention is not only capable of regenerating the surface while maintaining the target material film without affecting the activity of the target material film immobilized on the biomaterial sensing film after the detection of the biomaterial, and also specifically binding the target material. The film can be released, but the surface can be regenerated to maintain the high sensitivity when the biomaterial detection film is reused.
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