KR20040016353A - A composition comprising phytospingosine derivatives for apoptosis induction - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: Provided is a composition comprising phytosphingosine derivatives for apoptosis induction. The composition is useful for prevention and treatment of various kinds of skin diseases, tumors and cancers by in vivo apoptosis induction. CONSTITUTION: A composition for apoptosis induction is characterized by comprising, an active ingredient, at least one phytosphingosine derivative selected from the group consisting of phytosphingosine(PS), PS-HCl, C6-PS, CLA-Ps, tetraacetyl PS(TAPS) and N-acetyl PS(NAPS). It further comprises vitamin D3 and calcipotriol.

Description

피토스핑고신 유도체를 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물{A composition comprising phytospingosine derivatives for apoptosis induction}A composition comprising phytospingosine derivatives for apoptosis induction}

본 발명은 피토스핑고신 유도체를 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inducing apoptosis containing phytosphingosine derivatives.

아폽토시스(Apoptosis)는 예정된 세포사(programmed cell death)를 의미하는 것으로서 생리 및 병리적 상황하에서 일어나는 세포사멸의 한 형태이다.Apoptosis, which refers to programmed cell death, is a form of cell death that occurs under physiological and pathological conditions.

생체내 정상 세포 조직에서는 세포의 증식과 아폽토시스가 균형을 이루어 조직의 세포수가 일정하게 유지되는 반면, 종양 세포 조직에서는 급속한 세포증식에 비해 아폽토시스가 적절히 이루어지지 못하기 때문에 세포수가 일방적으로 증가되어 암세포의 증식이 일어나는 것으로 알려져 있다(Raff.M.C., Nature, 356:397, 1992). 아폽토시스 유도에 관련된 인자로는 p53, bcl-2, bcl-XL, 카스파제 등이 알려져 있으며(Wyllie,A., Nature, 389:237, 1997), 아폽토시스 프로그램이 활성화되면, 세포막의 수포, 누클레아제에 의한 염색체의 DNA 분해, DNA 응축 및 분절 (fragmentation)이 일어난다.In normal cell tissues in vivo, cell proliferation and apoptosis are balanced to maintain a constant cell count, whereas in tumor cell tissues, apoptosis is not properly achieved compared to rapid cell proliferation, resulting in a unilateral increase in the number of cancer cells. Proliferation is known to occur (Raff. MC, Nature, 356: 397, 1992). Factors related to apoptosis induction are p53, bcl-2, bcl-XL, caspase and the like (Wyllie, A., Nature, 389: 237, 1997). When the apoptosis program is activated, vesicles in the cell membrane, nuclea DNA degradation, DNA condensation and fragmentation of chromosomes by agents occur.

아폽토시스는 태아의 발생과정, 피부, 내장기관, 면역기관의 기능에 중요한 역할을 한다.Apoptosis plays an important role in the development of the fetus, the function of the skin, internal organs and immune system.

염증성 피부질환은 궁극적으로 임파구를 비롯한 여러 면역세포들이 피부에 침투되어 피부세포의 대다수를 차지하는 피부각질형성세포 즉, 케라티노사이트와의 상호작용에 의해 야기된다. 이들 케라티노사이트들은 면역기능에 관여하는 여러 가지 사이토카인을 분비하여 이들 면역세포들의 증식에 관여하며, 또한 면역세포로부터 케라티노사이트의 증식에 관여하는 여러 인자들을 공급받는다. 이런 세포들과 주변의 임파절을 포함하여 SALT(skin-assoaciated lymphoid issue)라고 하며, 이런 측면에서 피부는 단순히 우리 몸을 보호하는 보호막 뿐만 아니라 하나의 면역기관으로 간주되고 있다.Inflammatory skin disease is ultimately caused by interactions with keratinocytes, which are the keratinocytes, in which lymphocytes and other immune cells infiltrate the skin and make up the majority of skin cells. These keratinocytes secrete various cytokines involved in immune function and are involved in the proliferation of these immune cells, and are also supplied with various factors involved in the proliferation of keratinocytes from immune cells. These cells, including the surrounding lymph nodes, are called SALT (skin-assoaciated lymphoid issue). In this respect, the skin is regarded as an immune system as well as a protective barrier that protects our bodies.

아폽토시스와 관련된 피부질환중 특히 건선(psoriasis)은 각질세포의 이상증식, 다양한 염증성 세포, 특히 T 세포가 침윤(infiltration) 되어 있고 활성화되어있는 질환이다. 건선은 혈관신생(angiogenesis)과 함께 피부각질형성 세포를 빠르게 증식시키므로 이러한 피부각질형성 세포에 아폽토시스를 유도하는 제제가 효과적인 치료약으로 제시되어 왔다.Among the skin diseases related to apoptosis, psoriasis, in particular, is a disease in which keratinocyte hyperplasia, various inflammatory cells, in particular T cells, are infiltrated and activated. Since psoriasis rapidly proliferates keratinocytes with angiogenesis, agents that induce apoptosis in these keratinocytes have been suggested as effective therapeutics.

특히 스핑고리피드 유도체인 세라마이드는 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1 (IL-1), 인터페론-γ(INF-γ), FAS 리간드 (ligand) 및 방사선 조사와 같은 자극들에 의해 활성화된 SMase(sphingomyelinase)가 스핑고마이에린을 분해시켜 생성된 산물로서 세포내 신호전달매개물질로 작용하여 세포 분화, 세포주기 저지, 증식 및 아폽토시스 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.In particular, the cerphide, a sphingolipid derivative, is used for stimuli such as tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1 (IL-1), interferon-γ (INF-γ), FAS ligands, and irradiation. Activated by SMase (sphingomyelinase) is a product produced by decomposing sphingomyelin is known to be involved in cell differentiation, cell cycle arrest, proliferation and apoptosis by acting as an intracellular signaling mediator.

또한 비타민 D3또는 칼시포트리올(calcipotriol)은 과증식되어 있는 케라티노사이트에 아폽토시스 및 세포독성을 유도하는 것으로 알려져 있다.Vitamin D 3 or calcipotriol is also known to induce apoptosis and cytotoxicity in overproliferated keratinocytes.

또한 자외선 조사에 의해 SMase가 활성화 되어 세포내 세라마이드 형성을 증가시켜 아폽토시스를 유도한다는 보고가 있다. 뿐만 아니라 자외선 조사에 의해 생성된 많은 성장인자들이나 사이토카인 세포표면 수용체들이 활성화되어 사이토카인이나 성장인자 신호전달경로(growth factor signal transduction pathway)를 활성화한다고 알려져 있다.In addition, it has been reported that SMase is activated by UV irradiation to increase intracellular ceramide formation and induce apoptosis. In addition, many growth factors or cytokine cell surface receptors generated by UV irradiation are known to activate cytokine or growth factor signal transduction pathways.

자외선은 파장에 따라 UVA(200~290㎚), UVB(290~320㎚) 및 UVC(320~400㎚)로 나누어지며, 이들은 in vivo나 배양세포에서 면역억제기능 및 아폽토시스를 일으킨다는 보고가 있다.Ultraviolet rays are classified into UVA (200-290 nm), UVB (290-320 nm) and UVC (320-400 nm) depending on the wavelength, and these have been reported to cause immunosuppression and apoptosis in vivo or in cultured cells. .

본 발명자들은 아폽토시스 활성 유도에 의해 예방 또는 치료 효과가 나타나는 각종 질병에 유효한 물질을 찾던 중 특정한 피토스핑고신 유도체에서 아폽토시스 유도 효과가 현저하게 나타남을 발견하고 본 발명을 완성하였다.The present inventors completed the present invention by finding that apoptosis-inducing effect is remarkable in a specific phytosphingosine derivative while searching for a substance effective for various diseases in which a prophylactic or therapeutic effect is exhibited by inducing apoptosis activity.

본 발명에서는 피토스핑고신 유도체를 유효성분으로 하는 아폽토시스 유도용 조성물을 제공하고자 한다.In the present invention, to provide a composition for inducing apoptosis using an phytosphingosine derivative as an active ingredient.

도 1은 본 발명의 조성물의 유효성분인 피토스핑고신 유도체의 농도에 따른 세포독성 효과를 나타낸 도이다.1 is a diagram showing the cytotoxic effect according to the concentration of the phytosphingosine derivative which is an active ingredient of the composition of the present invention.

도 2는 본 발명의 조성물이 생쥐의 비장세포로부터 분리한 면역세포의 세포독성에 미치는 영향을 관찰한 도이다.Figure 2 is a diagram observing the effect of the composition of the present invention on the cytotoxicity of immune cells isolated from splenocytes of mice.

도 3은 본 발명의 조성물이 사람말초혈액 단핵세포의 세포독성에 미치는 영향을 관찰한 도이다.Figure 3 is a diagram observing the effect of the composition of the present invention on the cytotoxicity of human peripheral blood mononuclear cells.

도 4는 본 발명의 조성물이 혼합 백혈구 반응에 의한 사람의 Th1 세포 활성화에 미치는 영향을 관찰한 도이다.Figure 4 is a diagram observing the effect of the composition of the present invention on human Th1 cell activation by a mixed leukocyte response.

도 5는 본 발명의 조성물이 이종세포간의 반응에 의한 사람의 Th1 세포 활성화에 미치는 영향을 관찰한 도이다.Figure 5 is a diagram observing the effect of the composition of the present invention on human Th1 cell activation by the reaction between heterologous cells.

도 6은 본 발명의 조성물이 터널 어세이에 의한 아폽토시스 효과를 나타낸 도이다.6 is a diagram showing the apoptosis effect by the tunnel assay of the composition of the present invention.

도 7은 본 발명의 조성물의 유효성분인 NAPS와 TAPS 30 μM 농도에서의 시간에 따른 아폽토시스 유도 효과를 나타낸 도이다.Figure 7 is a diagram showing the effect of inducing apoptosis over time at the concentration of 30 μM NAPS and TAPS active ingredients of the present invention.

도 8은 본 발명의 조성물의 유효성분인 TAPS가 세포주기에 미치는 효과를 나타낸 도이다.8 is a diagram showing the effect of TAPS, the active ingredient of the composition of the present invention on the cell cycle.

도 9는 본 발명의 조성물의 유효성분인 TAPS 처리에 의한 체세포분열을 관찰한 도이다.9 is a diagram observing somatic cell division by TAPS treatment as an active ingredient of the composition of the present invention.

도 10은 본 발명의 조성물의 유효성분인 TAPS에 의해 유도되는 아폽토시스에 관여하는 유전자를 관찰한 도이다.10 is a diagram observing a gene involved in apoptosis induced by TAPS which is an active ingredient of the composition of the present invention.

도 11은 본 발명의 조성물의 유효성분인 NAPS, TAPS가 카스파제-3의 발현 유도에 미치는 영향을 시간대별로 관찰한 도이다.11 is a diagram observing the effect of the NAPS, TAPS as an active ingredient of the composition of the present invention on the induction of the expression of caspase-3 at different time zones.

도 12는 본 발명의 조성물의 유효성분인 TAPS 30 μM 농도에서 p53과 Chk1 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.Figure 12 is a diagram showing the expression level of p53 and Chk1 protein in TAPS 30 μM concentration of the active ingredient of the present invention.

도 13은 본 발명의 조성물의 유효성분인 NAPS와 TAPS의 시간에 따른 Chk1 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.Figure 13 is a diagram showing the expression level of Chk1 protein with time of NAPS and TAPS as the active ingredient of the composition of the present invention.

도 14는 본 발명의 조성물의 유효성분인 NAPS를 병변부위에 바른 후, 5~7일 후 치료효과를 관찰한 도이다.14 is a diagram illustrating a therapeutic effect after applying 5 to 7 days to NAPS, the active ingredient of the composition of the present invention on the lesion site.

본 발명은 피토스핑고신(phytosphingosine, PS), 피토스핑고신-HCl(PS-HCl), C6-피토스핑고신(C6-PS), CLA-피토스핑고신(CLA-PS), 테트라아세틸 피토스핑고신 (TAPS) 및 N-아세틸 피토스핑고신(NAPS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물을 제공한다.The present invention is phytosphingosine (PS), phytosphingosine-HCl (PS-HCl), C6- phytosphingosine (C6-PS), CLA- phytosphingosine (CLA-PS), tetra It provides a composition for inducing apoptosis containing at least one selected from the group consisting of acetyl phytosphingosine (TAPS) and N-acetyl phytosphingosine (NAPS) as an active ingredient.

본 발명은 피토스핑고신, 피토스핑고신-HCl, C6-피토스핑고신, CLA-피토스핑고신, 테트라아세틸 피토스핑고신 및 N-아세틸 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유효성분에, 추가로 비타민 D3또는 칼시포트리올을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물을 제공한다.The present invention is one selected from the group consisting of phytosphingosine, phytosphingosine-HCl, C6-phytosphingosine, CLA-phytosphingosine, tetraacetyl phytosphingosine and N-acetyl phytosphingosine In addition to the above active ingredients, a composition for inducing apoptosis containing vitamin D 3 or calcipotriol as an active ingredient is provided.

본 발명은 피토스핑고신, 피토스핑고신-HCl, C6-피토스핑고신, CLA-피토스핑고신, 테트라아세틸 피토스핑고신 및 N-아세틸 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유효성분에, 추가로 UVB를 조사한 세포의 배지를 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물을 제공한다.The present invention is one selected from the group consisting of phytosphingosine, phytosphingosine-HCl, C6-phytosphingosine, CLA-phytosphingosine, tetraacetyl phytosphingosine and N-acetyl phytosphingosine To the above-mentioned effective ingredient, the composition for inducing apoptosis which further contains the medium of the cell irradiated with UVB as an active ingredient is provided.

본 발명의 조성물은 아폽토시스 유도 활성을 갖는 약학 조성물 또는 화장료조성물을 포함한다.The composition of the present invention comprises a pharmaceutical composition or cosmetic composition having apoptosis inducing activity.

본 발명은 피토스핑고신, 피토스핑고신-HCl, C6-피토스핑고신, CLA-피토스핑고신, 테트라아세틸 피토스핑고신 및 N-아세틸 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물을 투여하고, 환부에 UVB를 조사하는 것으로 이루어진 건선치료 방법을 제공한다.The present invention is one selected from the group consisting of phytosphingosine, phytosphingosine-HCl, C6-phytosphingosine, CLA-phytosphingosine, tetraacetyl phytosphingosine and N-acetyl phytosphingosine Provided is a psoriasis treatment method comprising administering a composition for inducing apoptosis containing the above as an active ingredient and irradiating UVB to the affected area.

본 발명의 조성물은 인간 각질형성세포주, 인간 피부상피세포암 세포주, 사람 제대혈관내피세포, 비장내 면역세포 및 말초혈액단핵세포에서 모두 세포독성 효과를 나타낸다.The composition of the present invention exhibits a cytotoxic effect in human keratinocyte cell line, human skin epithelial cell carcinoma cell line, human umbilical cord endothelial cell, spleen immune cell and peripheral blood mononuclear cell.

본 발명의 조성물중 TAPS와 NAPS를 유효성분으로 하는 경우, 인간 각질형성세포주에서 현저한 아폽토시스 효과를 나타낸다.When TAPS and NAPS in the composition of the present invention as an active ingredient, it shows a significant apoptosis effect in human keratinocyte line.

본 발명의 조성물중 TAPS, NAPS 및 PS를 유효성분으로 함유하는 경우에는 특히 건선유발과 관련이 있는 Th1 세포의 활성화를 억제하는 효과가 있다.In the case of containing TAPS, NAPS and PS in the composition of the present invention as an active ingredient, there is an effect of inhibiting the activation of Th1 cells, particularly associated with psoriasis induction.

본 발명의 조성물중 효과적인 건선 치료제 및 증상 완화제로 사용되고 있는 비타민 D3또는 칼시포트리올을 추가의 유효성분으로 함유한 조성물은, 피토스핑고신 유도체를 단독으로 함유하는 본 발명의 다른 조성물에 비하여 현저히 상승된 아폽토시스 효과를 나타낸다.Among the compositions of the present invention, a composition containing vitamin D 3 or calcipotriol, which is used as an effective psoriasis treatment and symptom relieving agent, as an additional active ingredient is significantly higher than other compositions of the present invention containing phytosphingosine derivatives alone. Shows an elevated apoptosis effect.

본 발명의 조성물중 UVB를 조사한 세포의 배지를 추가의 유효성분으로 함유한 조성물은, 피토스핑고신 유도체를 단독으로 함유하는 본 발명의 다른 조성물에 비하여 현저히 상승된 아폽토시스 효과를 나타낸다. 상기 UVB를 조사한 세포의 배지는, 인간 각질형성세포주에 UVB를 조사한 후, 이들 세포를 배양하면서 이들 세포로부터 분비되는 각종 사이토카인을 포함하도록 세포배양액의 상등배지를 모은 것을 의미한다.The composition containing the medium of the cells irradiated with UVB as a further active ingredient in the composition of the present invention shows a significantly elevated apoptosis effect compared to other compositions of the present invention containing phytosphingosine derivatives alone. The medium of the cells irradiated with UVB means that the supernatant of the cell culture solution is collected so as to include various cytokines secreted from these cells while culturing these cells after UVB irradiation to human keratinocytes.

본 발명의 조성물을 투여하고, 환부에 UVB를 조사하는 본 발명의 건선 치료방법에서 UVB 조사량은 50 mJ/㎠ ~ 2 J/㎠이다.In the psoriasis treatment method of the present invention in which the composition of the present invention is administered and UVB is irradiated to the affected area, the UVB dose is 50 mJ / cm 2 to 2 J / cm 2.

본 발명의 조성물에 의한 아폽토시스 유도에 관여하는 단백질은 카스파제-3, p53, Chk1 등이다.Proteins involved in inducing apoptosis by the composition of the present invention are caspase-3, p53, Chk1 and the like.

본 발명의 조성물을 처리후 3시간에 카스파제-3가 최고로 발현되어, 탁월한 아폽토시스 유도능을 나타낸다.Caspase-3 is best expressed 3 hours after treatment of the composition of the present invention, showing excellent apoptosis inducing ability.

본 발명의 조성물은 생체내 아폽토시스 유도에 의해 예방 또는 치료가 가능한 각종 피부질환, 각종 종양, 각종 암 등의 예방 또는 치료에 유용하다.The composition of the present invention is useful for the prevention or treatment of various skin diseases, various tumors, various cancers and the like that can be prevented or treated by induction of apoptosis in vivo.

본 발명의 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 질환은 구체적으로 습진, 건선, 어린선 등과 같은 각질이상 질환; 아토피성 피부염, 피부염증, 소양증, 세균감염증, 여드름 또는 창상 등과 같은 피부질환; 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화; 피부암 등이다.Diseases that can be prevented or treated with the composition of the present invention include, specifically, keratinous diseases such as eczema, psoriasis, and young children; Skin diseases such as atopic dermatitis, dermatitis, pruritis, bacterial infections, acne or wounds; Keratinous skin diseases and skin aging caused by prolonged exposure to ultraviolet rays; Skin cancer.

특히, 본 발명의 조성물은 건선, 어린선 등과 같은 각질화성 질환, 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화, 피부암의 예방 또는 치료에 유용하다.In particular, the composition of the present invention is useful for keratinous diseases such as psoriasis, young and the like, keratinous skin disease and skin aging caused by prolonged exposure to ultraviolet rays, and prevention or treatment of skin cancer.

본 발명의 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.

본 발명의 조성물은 추가로 다른 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.The composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting different functions.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 제제화할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.The composition of the present invention may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers in addition to the above-described active ingredients for administration. Pharmaceutically acceptable carriers may be used in combination with saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components, if necessary, as antioxidants, buffers And other conventional additives such as bacteriostatic agents can be added. It may also be formulated by additionally adding diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants. Furthermore, it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.

본 발명의 조성물은 국부 투여가 바람직하며, 피부 및 점막 치료용으로 연고, 크림, 유액, 고약, 파우더, 함침 패드, 용액, 겔, 스프레이, 로션 또는 현탁액 형태로 제공될 수 있다.The compositions of the present invention are preferably administered topically and may be provided in the form of ointments, creams, emulsions, plasters, powders, impregnation pads, solutions, gels, sprays, lotions or suspensions for the treatment of skin and mucous membranes.

본 발명의 조성물중 피토스핑고신 유도체는 조성물 총 중량에 대해 0.05~10.0 중량부, 바람직하게는 0.1~5.0 중량부를 포함한다.The phytosphingosine derivative in the composition of the present invention comprises 0.05 to 10.0 parts by weight, preferably 0.1 to 5.0 parts by weight, based on the total weight of the composition.

본 발명의 조성물은 일회 약 10~30㎖ 또는 10~30g씩 수회에 걸쳐 환부에 바른다.The composition of the present invention is applied to the affected area several times at about 10-30 ml or 10-30 g once.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않고, 예를들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 파우더, 에센스, 팩, 유액, 로션, 연고, 겔, 고분자 또는 지질 소포 또는 나노스피어 또는 마이크로스피어, 비누 또는 샴푸 등의 제형을 가질 수 있다. 그리고, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 피토스핑고신 유도체 외에 다른 성분들은 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 적의 선정하여 배합할 수 있다.The cosmetic composition of the present invention is not particularly limited in the formulation, for example, supple cosmetics, astringent cosmetics, nourishing cosmetics, eye cream, nourishing cream, massage cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, powder, essence, Packs, emulsions, lotions, ointments, gels, polymer or lipid vesicles or nanospheres or microspheres, soaps or shampoos. In addition, in the cosmetic composition of each formulation, other components other than the phytosphingosine derivatives may be appropriately selected and blended by those skilled in the art according to the formulation or purpose of use of other cosmetics.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are provided to aid in understanding the present invention. However, the following examples are merely provided to more easily understand the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the examples.

실시예 1Example 1 : 세포독성 측정(MTT 어세이): Cytotoxicity Measurement (MTT Assay)

피토스핑고신(phytosphingosine, PS), 피토스핑고신-HCl(PS-HCl), C6-피토스핑고신(C6-PS), CLA-피토스핑고신 (CLA-PS), 테트라아세틸 피토스핑고신 (TAPS) 및 N-아세틸 피토스핑고신(NAPS)을 DMSO에 용해하여 최종 1~100 μM 농도로 사용하였다.Phytosphingosine (PS), Phytosphingosine-HCl (PS-HCl), C6-Phytosphingosine (C6-PS), CLA-Phytosphingosine (CLA-PS), Tetraacetyl Phytos Pingosine (TAPS) and N-acetyl phytosphingosine (NAPS) were dissolved in DMSO and used at a final 1-100 μM concentration.

1. 본 발명의 조성물이 인간 각질형성 세포주에서 세포독성에 미치는 영향1. Effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in human keratinocytes

본 발명의 조성물이 인간 각질형성 세포주(Human keratinocyte cell line)인 HaCaT 세포에서 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이로 세포 생존률 (cell viability)을 분석하였다.To investigate the effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in HaCaT cells, the human keratinocyte cell line, MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium The cell viability was analyzed by bromide assay.

HaCaT 세포는 독일 암연구소(German Cancer Research, Germany) N. Fuseng 교수로부터 공급받았다.HaCaT cells were sourced from Professor N. Fuseng, German Cancer Research, Germany.

HaCaT 세포는 100㎜ 디쉬에 1×106의 개수로 접종(seeding) 한 후, 10% 우태아혈청(FBS, GIBCO), 100 units/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 48시간 동안 배양하였다. 트립신을 처리하여 다시 96 웰 플레이트에 웰당 1-2×104개의 세포를 무혈청 배지를 이용하여 접종한 후, 약 3시간 후에 스핑고신 유도체들을 처리하여 배양하였다. 24시간 배양후 MTT 시약을 2㎎/㎖의 농도로 넣고 4시간 동안 배양한 후, 배지를 완전히 제거하고 DMSO에 현탁시켜 540㎚에서 O.D.를 측정하였다.HaCaT cells were seeded in 1 × 10 6 cells in 100 mm dishes, followed by DMEM (Dulbecco's) containing 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO), 100 units / ml penicillin, and 100 μg / ml streptomycin. Incubated for 48 hours in Modified Eagle Medium). Trypsin treatment was inoculated again in a 96 well plate 1-2 × 10 4 cells per well using a serum-free medium, and then incubated with sphingosine derivatives after about 3 hours. After 24 hours of incubation, the MTT reagent was added at a concentration of 2 mg / ml, followed by 4 hours of incubation. The medium was completely removed and suspended in DMSO to measure OD at 540 nm.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

측정 결과는 표 1 및 도 1에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 1 and FIG. 1.

피토스핑고신 유도체의 농도(1~30 μM)에 따른 세포생존률Cell survival rate according to the concentration of phytosphingosine derivatives (1-30 μM) PSPS PS-HClPS-HCl C6-PSC6-PS CLA-PSCLA-PS NAPSNAPS TAPSTAPS C2-세라마이드C2-ceramide concon 100±6.2100 ± 6.2 100±9.6100 ± 9.6 100±7.3100 ± 7.3 100±0.6100 ± 0.6 100±8.6100 ± 8.6 100±1.2100 ± 1.2 100±2.0100 ± 2.0 1 μM1 μM 97±11.197 ± 11.1 100±4.1100 ± 4.1 84±16.884 ± 16.8 66±7.866 ± 7.8 103±6.9103 ± 6.9 94±0.194 ± 0.1 97±3.897 ± 3.8 3 μM3 μM 93±393 ± 3 101±2.2101 ± 2.2 96±7.296 ± 7.2 64±9.964 ± 9.9 99±3.599 ± 3.5 93±2.993 ± 2.9 98±2.598 ± 2.5 10 μM10 μM 86±10.186 ± 10.1 79±7.079 ± 7.0 74±10.174 ± 10.1 58±0.458 ± 0.4 86±2.186 ± 2.1 76±1.476 ± 1.4 75±1.375 ± 1.3 30 μM30 μM 51±9.651 ± 9.6 36±6.836 ± 6.8 87±1.387 ± 1.3 55±9.155 ± 9.1 17±0.817 ± 0.8 17±1.117 ± 1.1 33±0.633 ± 0.6

표 1과 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 6 종류의 피토스핑고신 유도체 모두 세포증식을 억제하였다. 특히 30 μM에서 NAPS 및 TAPS는 각각 83%의 세포독성을 나타낸 반면 C2-세라마이드는 67%의 세포독성을 나타내어 NAPS 및 TAPS가 C2-세라마이드 보다 16%의 우수한 세포독성효과가 있음을 알 수 있다.As shown in Table 1 and Figure 1, all six phytosphingosine derivatives of the present invention inhibited cell proliferation. In particular, at 30 μM, NAPS and TAPS showed 83% cytotoxicity, while C2-ceramide showed 67% cytotoxicity, indicating that NAPS and TAPS had 16% better cytotoxicity than C2-ceramide.

2. 본 발명의 조성물이 인간 피부상피세포암 세포주에서 세포독성에 미치는 영향2. Effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in human dermal epithelial cell carcinoma cell line

본 발명의 조성물이 인간 피부상피세포암 세포주인 A431 세포에서 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 어세이를 이용하여 관찰하였다.In order to determine the effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in A431 cells, a human dermal epithelial cell carcinoma cell line, an MTT assay was used.

세포배양 방법 및 MTT 어세이는 상기 1의 방법과 동일하게 하였다.Cell culture method and MTT assay was the same as the method of 1 above.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

측정결과는 표 2에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 2.

피토스핑고신 유도체의 농도(3~50 μM)에 따른 세포생존률Cell survival rate according to the concentration of phytosphingosine derivatives (3-50 μM) PSPS PS-HClPS-HCl C6-PSC6-PS CLA-PSCLA-PS NAPSNAPS TAPSTAPS C2-세라마이드C2-ceramide concon 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 100±10.8100 ± 10.8 3 μM3 μM 85±10.785 ± 10.7 105±5.8105 ± 5.8 106±9.7106 ± 9.7 91±11.091 ± 11.0 100±10.2100 ± 10.2 113±11.2113 ± 11.2 131±19.8131 ± 19.8 10 μM10 μM 30±1.930 ± 1.9 109±8.6109 ± 8.6 61±8.161 ± 8.1 98±12.998 ± 12.9 75±6.975 ± 6.9 83±13.983 ± 13.9 97±14.797 ± 14.7 30 μM30 μM 2±0.12 ± 0.1 7±1.67 ± 1.6 57±10.457 ± 10.4 60±6.260 ± 6.2 31±10.031 ± 10.0 12±1.712 ± 1.7 82±1.482 ± 1.4 50 μM50 μM 2±0.22 ± 0.2 2±0.22 ± 0.2 44±9.644 ± 9.6 65±5.565 ± 5.5 1±0.21 ± 0.2 5±1.25 ± 1.2 74±12.874 ± 12.8

표 2에 나타난 바와 같이, 50 μM에서 PS, PS-HCl, NAPS 및 TAPS는 95~98%의 세포독성을 나타낸 반면 C2-세라마이드는 26%의 세포독성을 나타내어 PS, PS-HCl, NAPS 및 TAPS가 C2-세라마이드 보다 69~72%의 우수한 세포독성효과가 있음을 알 수 있다.As shown in Table 2, at 50 μM, PS, PS-HCl, NAPS and TAPS showed 95-98% cytotoxicity while C2-ceramide showed 26% cytotoxicity, resulting in PS, PS-HCl, NAPS and TAPS It can be seen that there is an excellent cytotoxic effect of 69-72% than C2-ceramide.

3. 본 발명의 조성물이 사람 제대혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell; HUVEC)에서 세포독성에 미치는 영향3. Effect of Composition of the Invention on Cytotoxicity in Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

본 발명의 조성물이 사람 제대혈관내피세포에서 세포독성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 어세이를 이용하여 관찰하였다.In order to determine the effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in human umbilical vascular endothelial cells was observed using an MTT assay.

사람 제대혈관내피세포는, 사람의 제대혈관으로부터 primary culture하여 사용하였다.Human umbilical cord endothelial cells were used by primary culture from human umbilical cord blood vessels.

세포배양 방법 및 MTT 어세이 방법은 상기 1의 방법과 동일하게 하였다.Cell culture method and MTT assay method was the same as the method of 1 above.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

측정결과는 표 3에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 3.

피토스핑고신 유도체의 농도(3.5~30 μM)에 따른 세포생존률Cell survival rate according to the concentration of phytosphingosine derivatives (3.5-30 μM) PSPS NAPSNAPS TAPSTAPS C2-세라마이드C2-ceramide concon 100±10.6100 ± 10.6 100±8.5100 ± 8.5 100±10.1100 ± 10.1 100±15.7100 ± 15.7 3.5 μM3.5 μM 64±4.764 ± 4.7 66±7.566 ± 7.5 47±8.447 ± 8.4 90±11.690 ± 11.6 7 μM7 μM 19±1.819 ± 1.8 51±10.551 ± 10.5 22±1.922 ± 1.9 60±7.760 ± 7.7 15 μM15 μM 14±0.914 ± 0.9 19±3.419 ± 3.4 15±0.715 ± 0.7 61±8.461 ± 8.4 30 μM30 μM 13±1.013 ± 1.0 14±0.614 ± 0.6 9±0.59 ± 0.5 34±2.334 ± 2.3

표 3에 나타난 바와 같이, 30 μM에서 PS, NAPS 및 TAPS는 86~91%의 세포독성을 나타낸 반면 C2-세라마이드는 66%의 세포독성을 나타내어 PS, NAPS 및 TAPS가 C2-세라마이드 보다 20~25%의 우수한 세포독성효과가 있음을 알 수 있다.As shown in Table 3, at 30 μM PS, NAPS and TAPS showed 86-91% cytotoxicity, while C2-ceramide showed 66% cytotoxicity, so that PS, NAPS and TAPS were 20-25 than C2-ceramide. It can be seen that there is an excellent cytotoxic effect of%.

4. 본 발명의 조성물이 생쥐의 비장세포로부터 분리한 면역세포에서 세포독성에 미치는 영향4. Effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in immune cells isolated from splenocytes of mice

본 발명의 조성물이 면역세포(T 세포, B 세포, 대식세포 및 단핵세포 등)에서 세포독성에 미치는 영향을 알아보았다.The effect of the composition of the present invention on the cytotoxicity in immune cells (T cells, B cells, macrophages and monocytes, etc.).

정상생쥐(BDF)로부터 비장을 적출한 후, 물리적 방법을 이용하여 비장으로부터 단핵구 세포를 얻었다. 이 세포들을 PBS에 용해한 후, Ficoll-Hypaque 용액에 중첩시키고, 원심분리를 통해 Ficoll-Hypaque 용액의 경계 부위에 모인 세포들을 회수한 후, PBS로 세 번 세척하였다.After removing the spleen from normal mice (BDF), monocyte cells were obtained from the spleen using physical methods. After dissolving these cells in PBS, the cells were superimposed on Ficoll-Hypaque solution, the cells collected at the boundary of Ficoll-Hypaque solution by centrifugation were recovered, and washed three times with PBS.

상기 세포에 본 발명의 조성물중 NAPS, TAPS 및 PS를 1, 10, 50, 100μM이 되도록 첨가한 후 24시간동안 배양하여, 세포증식정도를 MTT 어세이를 통해 확인하였다.NAPS, TAPS and PS in the composition of the present invention to the cells were added to 1, 10, 50, 100μM and incubated for 24 hours, the cell proliferation was confirmed through the MTT assay.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

결과는 도 2에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 2에 나타난 바와 같이, C2-세라마이드 및 NAPS, PS의 IC50는 약 75μM, TAPS의 IC50는 100μM로, 본 발명의 조성물이 생쥐 비장세포에서 얻은 면역세포에 대해 독성을 나타냄을 알 수 있다.As shown in Figure 2, the IC 50 of C2-ceramide and NAPS, PS is about 75μM, IC 50 of TAPS is 100μM, it can be seen that the composition of the present invention is toxic to immune cells obtained from mouse splenocytes. .

5. 본 발명의 조성물이 사람말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 세포독성에 미치는 영향5. Effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)

본 발명의 조성물이 사람의 혈액내에 존재하는 면역세포들에서 세포독성에미치는 영향을 알아보았다.The effect of the composition of the present invention on cytotoxicity in immune cells present in human blood was examined.

정상인으로부터 채혈한 후, 혈액을 Ficoll-Hypaque 용액에 중첩시켰다. 그리고 원심분리 후, Ficoll-Hypaque 용액의 경계 부위에 모인 세포들을 회수한 후, PBS로 세 번 세척해 주었다. 다른 사람으로부터 얻은 PBMC를 각각 2×105개씩 섞어서 96-웰 플레이트에서 5일간 배양하였으며, 배양액은 10% 세럼이 포함된 RPMI 배양액을 사용하였다.After bleeding from normal individuals, blood was superimposed on Ficoll-Hypaque solution. After centrifugation, the cells collected at the boundary of Ficoll-Hypaque solution were collected and washed three times with PBS. 2 × 10 5 PBMCs from each other were mixed and incubated in 96-well plates for 5 days, and the culture medium was an RPMI culture solution containing 10% serum.

상기 세포에 본 발명의 조성물중 NAPS, TAPS 및 PS를 1, 10, 50, 100μM이 되도록 첨가한 후 24시간동안 배양하여, 세포증식정도를 MTT 어세이를 통해 확인하였다.NAPS, TAPS and PS in the composition of the present invention to the cells were added to 1, 10, 50, 100μM and incubated for 24 hours, the cell proliferation was confirmed through the MTT assay.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

결과는 도 3에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 3에 나타난 바와 같이, C2-세라마이드는 100μM까지 처리를 해 보아도 독성효과는 나타나지 않았다. 반면에 NAPS, TAPS, PS는 사람말초혈액 단핵세포에 대해 독성을 나타내었다. NAPS의 경우에는 100μM에서, TAPS와 PS의 경우에는 50μM에서 강한 세포독성을 나타내었다.As shown in FIG. 3, C2-ceramide did not show toxic effects even after treatment to 100 μM. In contrast, NAPS, TAPS, and PS were toxic to human peripheral blood mononuclear cells. Strong cytotoxicity was shown at 100 μM for NAPS and 50 μM for TAPS and PS.

6. 본 발명의 조성물이 건선유발과 관련 있는 Th1 세포 활성화에 미치는 영향6. Effect of the composition of the present invention on Th1 cell activation associated with psoriasis induction

6-1. 혼합 백혈구 반응(Mixed Leukocyte Reaction; MLR)6-1. Mixed Leukocyte Reaction (MLR)

본 발명의 조성물이, TNBSO3(햅텐)에 반응하여 IFN-γ및 IL-12 등을 유리하는 Th1 세포의 활성화를 억제하는 효과가 있는지를 알아보았다.It was examined whether the composition of the present invention has an effect of inhibiting activation of Th1 cells that release IFN-γ, IL-12, and the like in response to TNBSO 3 (hapten).

상기 4에서 얻은 세포를 반응세포(responder cell)로 사용하였으며, TNBSO3-conjugated 세포를 자극세포(stimulator cell)로 사용하였다.The cells obtained in step 4 were used as response cells, and TNBSO 3 -conjugated cells were used as stimulator cells.

자극세포의 준비는 다음과 같이 하였다. 단일 세포를 2×107/㎖이 되도록 준비한 후, 동량의 20mM TNBSO3를 첨가하여 37℃에서 반응시켰다. 반응 후, PBS로 세 번 세척해 주었다.Preparation of stimulatory cells was as follows. Single cells were prepared to be 2 × 10 7 / ml, and then an equal amount of 20 mM TNBSO 3 was added to react at 37 ° C. After the reaction, the mixture was washed three times with PBS.

반응세포와 자극세포를 각각 2×105개씩 섞어서 96-웰 플레이트에서 5일간 배양하였으며, 배양액은 10% 세럼이 포함된 RPMI 배양액을 사용하였다.Reaction cells and stimulation cells were mixed 2 × 10 5 each and incubated for 5 days in a 96-well plate, and the culture medium was an RPMI culture solution containing 10% serum.

상기 세포에 본 발명의 조성물중 NAPS, TAPS 및 PS를 1, 10, 50, 100μM이 되도록 첨가한 후 24시간동안 배양하여, 세포증식정도를 MTT 어세이를 통해 확인하였다.NAPS, TAPS and PS in the composition of the present invention to the cells were added to 1, 10, 50, 100μM and incubated for 24 hours, the cell proliferation was confirmed through the MTT assay.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

결과는 도 4에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 4에 나타난 바와 같이, C2-세라마이드, NAPS 및 PS는 50μM에서 억제효과를 나타내었으며, TAPS는 10μM에서 억제효과를 나타내었다.As shown in Figure 4, C2- ceramide, NAPS and PS showed an inhibitory effect at 50μM, TAPS showed an inhibitory effect at 10μM.

따라서, 본 발명의 조성물은 모두 TNBSO3에 대한 세포활성화를 억제하는 기능이 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that all the compositions of the present invention have a function of inhibiting cell activation against TNBSO 3 .

6-2. 이종세포(allogenic cell)간의 반응6-2. Reaction between allogenic cells

본 발명의 조성물이 이종세포간의 반응에 의한 사람의 Th1 세포의 활성화를 억제하는 효과가 있는지 알아보았다.It was examined whether the composition of the present invention has an effect of inhibiting the activation of human Th1 cells by a reaction between heterologous cells.

이종세포간의 반응을 알아보기 위해 상기 5의 방법에 의해 두 사람으로부터 얻은 PBMC를 각각 반응세포와 자극세포로 사용하였다. 자극세포로 사용된 PBMC는 X-레이 조사를 수행한 후 사용하였다.In order to examine the response between the heterologous cells, PBMCs obtained from the two humans by the method of 5 were used as response cells and stimulation cells, respectively. PBMCs used as stimulator cells were used after X-ray irradiation.

반응세포와 자극세포는 상기 6-1에서와 같이 혼합배양한 후, 본 발명의 조성물중 NAPS, TAPS 및 PS를 1, 10, 50, 100μM이 되도록 첨가한 후 24시간동안 배양하여, 세포증식정도를 MTT 어세이를 통해 확인하였다.Reaction cells and stimulation cells were mixed and cultured as in 6-1, and then added to NAPS, TAPS and PS in the composition of the present invention to 1, 10, 50, 100μM and incubated for 24 hours, the degree of cell proliferation Was confirmed through an MTT assay.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

결과는 도 5에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 5에 나타나 바와 같이, C2-세라마이드는 억제효과가 거의 없었으며, NAPS는 50μM이상에서 이종세포에 대해 활성화되어 증식하는 반응을 억제하는 효과가 있다. TAPS와 PS는 50μM에서 세포증식을 완전히 억제함을 알 수 있다.As shown in FIG. 5, C2-ceramide had little inhibitory effect, and NAPS had an effect of inhibiting the proliferating response of activated cells to heterologous cells at 50 μM or more. TAPS and PS completely inhibit cell proliferation at 50 μM.

실시예 2Example 2 : 아폽토시스 유도 측정Apoptosis Induction Measurement

본 발명의 조성물에 의한 HaCaT 세포의 아폽토시스 유도는 in situ cell death detection kit, POD(Enzo, 1684817, Boeringer Mannhein)를 이용하여 터널 어세이(TUNEL-TdT-mediated dUTP nick end labeling- assay)로 관찰하였다.Apoptosis induction of HaCaT cells by the composition of the present invention was observed by a tunnel assay (TUNEL-TdT-mediated dUTP nick end labeling assay) using an in situ cell death detection kit, POD (Enzo, 1684817, Boeringer Mannhein). .

TC 챔버(Lab-TEK chamber Slide w/cover Permanox Slide sterile 1 well, 177410)에 HaCaT 세포를 1×106의 개수로 접종하여 DMEM 배지에서 18시간 이상 배양한 후 피토스핑고신 유도체를 처리하였다. 약물 처리 후 24시간에 세포를 고정시킨 후 차단용액(blocking solution, 3% H2O2in MeOH)으로 내인성 퍼옥시다제를 차단하고 투과용액(permeabilization solution, 0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)으로 세포의 투과를 증대시킨 후 터널 반응 혼합물을 이용하여 아폽토틱 세포를 라벨링 시켰고 DAB 기질(DAKO, K3465)을 이용하여 발색시켰다. 발색된 세포는 현미경을 이용하여 관찰하였다.HaCaT cells were inoculated in 1 × 10 6 cells in a TC chamber (Lab-TEK chamber Slide w / cover Permanox Slide sterile 1 well, 177410) and cultured in DMEM medium for 18 hours or longer to treat phytosphingosine derivatives. After 24 hours of drug treatment, the cells were fixed, and then the endogenous peroxidase was blocked with a blocking solution (3% H 2 O 2 in MeOH) and permeabilization solution (0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium). After permeation of the cells with citrate, apoptotic cells were labeled using the tunnel reaction mixture and developed using DAB substrate (DAKO, K3465). The colored cells were observed using a microscope.

측정 결과는 도 6과 도 7에 나타내었다.The measurement results are shown in FIGS. 6 and 7.

도 6은 10 μM과 30 μM 농도의 피토스핑고신 유도체를 24시간 처치하여 터널 어세이를 실시한 결과를 나타낸 도이며, 피토스핑고신 유도체 모두 세포사멸을 일으켰고, 특히 NAPS와 TAPS가 가장 현저한 세포사멸 효과를 나타내었다.FIG. 6 shows the results of tunnel assay by 24 hours treatment with 10 μM and 30 μM phytosphingosine derivatives. Both phytosphingosine derivatives caused apoptosis, and in particular, NAPS and TAPS cells were most prominent. A killing effect was shown.

도 7은 NAPS와 TAPS 30 μM 농도에서의 시간에 따른 아폽토시스 유도 효과를 나타낸 도이며, NAPS와 TAPS를 30 μM 농도로 처치한 후 4시간부터 아폽토시스가 유도됨을 알 수 있다.7 is a diagram showing the apoptosis induction effect with time at the concentration of 30 μM NAPS and TAPS, it can be seen that apoptosis is induced from 4 hours after treatment with 30 μM concentration of NAPS and TAPS.

실시예 3Example 3 : 본 발명의 조성물이 세포주기에 미치는 효과: Effect of the composition of the present invention on the cell cycle

1. 세포주기 관찰 1(Flow cytometric analysis)1.Flow cytometric analysis

주어진 시간대별로 세포를 트립신으로 처리하여 수거한 후 PBS로 세척하였다. 세포는 80% 에탄올을 이용하여 고정화시킨 다음 요오드화 프로피디움 (propidium iodide)과 RNase를 첨가한 후 유동세포 분석기(flow cytometer)를 이용하여 세포주기를 분석하였다.Cells were harvested by trypsin treatment at given time points and washed with PBS. The cells were immobilized with 80% ethanol, propidium iodide and RNase were added, and the cell cycle was analyzed using a flow cytometer.

결과는 도 8에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 8에 나타난 바와 같이, TAPS 처리후 12시간까지는 S 단계가 감소하고 상대적으로 G2/M 단계가 증가하는 경향을 나타내었다. 이후 24시간 때까지 G2/M 단계는 계속 감소하면서 상대적으로 sub G1이 증가하는 경향을 나타내었다. Sub G1은 아폽토틱 세포를 나타내는 것으로 피토스핑고신 유도체에 의한 아폽토시스 유도가 24시간 때에 급격히 증가하는 것을 볼 수 있다. 이러한 아폽토틱 세포의 증가는 동일 시간대에 그 분포가 감소하는 G2/M 단계의 세포에서 유래되었다고 볼 수 있다. (24시간 때에 G1단계의 증가는 아폽토틱 세포를 제외한 살아있는 세포만을 분석한 결과이다.)As shown in Figure 8, up to 12 hours after TAPS treatment, the S stage was decreased and the G 2 / M stage was relatively increased. The G 2 / M phase continued to decrease until 24 hours thereafter, indicating a relative increase in sub G 1 . Sub G 1 represents apoptotic cells and it can be seen that the induction of apoptosis by phytosphingosine derivatives increases rapidly at 24 hours. This increase in apoptotic cells may be attributed to cells in the G 2 / M phase, whose distribution decreases at the same time. (Increase in G 1 phase at 24 hours is a result of analyzing only the living cells except ahpop totik cells.)

2. 세포주기 관찰 2(면역형광법; Immunofluorescence)2. Cell Cycle Observation 2 (Immunofluorescence)

TAPS에 의한 아폽토시스 유도가 G2/M단계 중 어느 단계로부터 유도되는 지를 조사하기 위하여 베타-튜불린(β-tubulin)을 이용하여 체세포분열(mitosis)을 관찰하였다.Somatic cell mitosis was observed using beta-tubulin to investigate whether apoptosis induction by TAPS was induced from the G 2 / M phase.

HaCaT 세포를 커버슬립이 놓인 디쉬에 배양한 후 TAPS(30 μM)를 처리하였다. 시간대별로 세포를 PBS로 세척한 다음 5% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 15분간 고정화시키고 베타-튜불린 항체(1:100)와 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세척 후 Cy3-conjugated anti-mouse IgG로 2차 반응을 실시하였다. DNA 염색을 위해 0.3㎍/㎖의 DAPI(Sigma)를 첨가한 후 형광현미경을 이용하여 세포를 관찰하였다.HaCaT cells were cultured in dishes with coverslips and then treated with TAPS (30 μM). Cells were washed with PBS at different time periods, and then fixed for 15 minutes with 5% paraformaldehyde and reacted with beta-tubulin antibody (1: 100) for 1 hour. After washing with PBS, a secondary reaction was performed with Cy3-conjugated anti-mouse IgG. 0.3 μg / ml of DAPI (Sigma) was added for DNA staining, and the cells were observed using a fluorescence microscope.

결과는 도 9에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 9에 나타난 바와 같이, TAPS 처리후 12시간 때보다 24시간 때 염색체가 응축된 체세포들이 더 많이 관찰되었다. 따라서 체세포분열 중기에 아폽토시스 기전이 일어남을 알 수 있다.As shown in FIG. 9, more somatic cells in which chromosomes were condensed were observed at 24 hours than at 12 hours after TAPS treatment. Therefore, it can be seen that the apoptosis mechanism occurs during the somatic cell division.

실시예 4Example 4 : 본 발명의 조성물과 Vit D: Composition of the present invention and Vit D 33 또는 칼시포트리올과의 병용투여에 의한 세포독성의 상승효과Or synergistic effect of cytotoxicity by co-administration with calcipotriol

본 발명의 조성물과 Vit D3또는 칼시포트리올을 병용투여 하였을때, 세포독성 상승효과를 알아보기 위하여, 인간 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 사용하여 MTT 어세이로 세포 생존률을 분석하였다.When co-administered the composition of the present invention and Vit D 3 or calcipotriol, cell viability was analyzed by MTT assay using HaCaT cells, which are human keratinocytes, in order to examine the synergistic effect of the cells.

HaCaT 세포에 Vit D3또는 칼시포트리올을 1 μM의 농도로, NAPS 및 TAPS를 각각 10 μM의 농도로 단독 혹은 병용투여 하여 24시간 배양후 MTT 어세이에 의하여 이들 약제가 단독 혹은 병용투여에 의해 세포독성에 미치는 효과를 관찰하였다.ViT D 3 or calcipotriol was administered to HaCaT cells at a concentration of 1 μM and NAPS and TAPS at a concentration of 10 μM, respectively, and cultured for 24 hours, followed by MTT assay alone or in combination. The effect on cytotoxicity was observed.

비교군으로는 C2-세라마이드를 사용하였다.C2-ceramide was used as a comparative group.

결과는 표 4에 나타내었다.The results are shown in Table 4.

본 발명의 조성물과 Vit D3또는 칼시포트리올의 병용투여에 따른 세포생존률Cell survival rate in combination with the composition of the present invention and Vit D 3 or calcipotriol controlcontrol NAPS(10 μM)NAPS (10 μM) TAPS(10 μM)TAPS (10 μM) C2-세라마이드(10 μM)C2-ceramide (10 μM) controlcontrol 100±5100 ± 5 86±286 ± 2 76±276 ± 2 78±278 ± 2 Vit D3(1 μM)Vit D 3 (1 μM) 68±568 ± 5 1±0.021 ± 0.02 19±419 ± 4 34±1034 ± 10 칼시포트리올(1 μM)Calcipotriol (1 μM) 74±374 ± 3 24±324 ± 3 28±828 ± 8 60±460 ± 4

표 4에 나타난 바와 같이, Vit D3또는 칼시포트리올을 1 μM의 농도로 24 시간 투여하였을 때는 각각 32% 및 26%의 독성을 나타내었다. NAPS 10 μM 단독은 14%의 세포독성, TAPS 10 μM 단독은 24%의 세포독성을 나타낸 반면, Vit D3또는 칼시포트리올과 병용투여 하였을 때, NAPS의 경우 각각 99% 및 76% 이상의 세포독성 효과를 나타냈고, TAPS의 경우 각각 81% 및 72%의 세포독성효과를 나타내어, Vit D3및 칼시포트리올 혹은 NAPS 및 TAPS 단독에 의한 세포독성 보다 동시 투여에 의해 세포독성 효과가 현저히 상승함을 관찰할 수 있다.As shown in Table 4, when Vit D 3 or calcipotriol was administered at a concentration of 1 μM for 24 hours, toxicity was 32% and 26%, respectively. NAPS 10 μM alone showed 14% cytotoxicity and TAPS 10 μM alone showed cytotoxicity 24%, whereas when combined with Vit D 3 or calcipotriol, more than 99% and 76% cytotoxicity, respectively In the case of TAPS, cytotoxic effects were 81% and 72%, respectively, and the cytotoxic effect was significantly increased by simultaneous administration than the cytotoxicity by Vit D 3 and calcipotriol or NAPS and TAPS alone. Can be observed.

실시예 5Example 5 : 본 발명의 조성물과 UVB를 조사한 세포의 배지와의 병용투여에 의한 세포독성의 상승효과: Synergistic effect of cytotoxicity by co-administration of the composition of the present invention with a medium of UVB-irradiated cells

본 발명의 조성물과 UVB를 조사한 세포의 배지를 병용투여 하였을때, 세포독성 상승효과를 알아보기 위하여 HaCaT 세포를 사용하여 MTT 어세이로 세포생존률을분석하였다.When co-administration of the composition of the present invention and the medium irradiated with UVB, cell viability was analyzed by MTT assay using HaCaT cells to determine the synergistic effect of the cytotoxicity.

1. UVB를 조사한 세포의 배지의 제조1. Preparation of medium of cells irradiated with UVB

HaCaT 세포를 100㎜ 디쉬에 1×105cells/㎖로 분주하였고, 배지는 10% 우태아혈청 및 100 units/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM을 사용하여 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 배지를 제거한 후 PBS로 HaCaT 세포를 3차례 세척한 후 플레이트당 PBS 3.5㎖를 가하여 UVB 200 J/㎡의 용량으로 조사하였다. UVB 조사후 다시 DMEM 배지로 갈아준 후 24시간동안 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양한 후, 그 상등배지를 모아서 MTT 어세이용으로 사용하였다.HaCaT cells were dispensed at 1 × 10 5 cells / ml in 100 mm dishes and medium was treated with 5% CO 2 , DMEM containing 10% fetal calf serum and 100 units / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin. The cells were cultured at 37 ° C. After the medium was removed, HaCaT cells were washed three times with PBS, and then 3.5 ml of PBS was added to the plate to irradiate at a dose of UVB 200 J / m 2. After UVB irradiation, the resultant was changed to DMEM medium, incubated at 5% CO 2 , 37 ° C. for 24 hours, and the upper medium was collected and used for MTT assay.

2. 세포독성 측정2. Cytotoxicity Measurement

HaCaT 세포는 100㎜ 디쉬에 1×106의 개수로 접종 한 후, 10% 우태아혈청, 100 units/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM에서 48시간 동안 배양하였다. 트립신을 처리하여 다시 96 웰 플레이트에 웰당 1-2×104개의 세포를 무혈청 배지를 이용하여 접종한 후, 약 3시간 후에 상기 1에서 제조한 배지로 교체하였다. 그 배지상태에서 본 발명의 피토스핑고신 유도체들을 처리하여 24시간 배양하고 MTT 시약을 2㎎/㎖의 농도로 가한 후 4시간 동안 배양하였다. 배지를 완전히 제거하고 세포를 DMSO에 현탁시켜 540㎚에서 O.D.를 측정하였다.HaCaT cells were inoculated in 1 × 10 6 cells in 100 mm dishes and then incubated for 48 hours in DMEM containing 10% fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin. Trypsin treatment was inoculated again in a 96 well plate 1-2 × 10 4 cells per well using a serum-free medium, after about 3 hours was replaced with the medium prepared in 1 above. In the medium, the phytosphingosine derivatives of the present invention were treated for 24 hours, and MTT reagent was added at a concentration of 2 mg / ml, followed by 4 hours of incubation. The medium was completely removed and the cells suspended in DMSO to measure OD at 540 nm.

측정 결과는 표 5에 나타내었다.The measurement results are shown in Table 5.

본 발명의 조성물과 UVB를 조사한 세포의 배지의 병용투여에 따른 세포생존률Cell survival rate according to the co-administration of the medium of the composition of the present invention and the cells irradiated with UVB PSPS UVB+PSUVB + PS PS-HClPS-HCl UVB+PS-HClUVB + PS-HCl NAPSNAPS UVB+NAPSUVB + NAPS TAPSTAPS UVB+TAPSUVB + TAPS concon 100±2.4100 ± 2.4 100±2.4100 ± 2.4 100±5.2100 ± 5.2 100±5.2100 ± 5.2 100±9.7100 ± 9.7 100±6.4100 ± 6.4 100±8.5100 ± 8.5 100±8.5100 ± 8.5 UVB(200 J/㎡)UVB (200 J / ㎡) -- 38±3.338 ± 3.3 -- 39±3.539 ± 3.5 -- 30±6.630 ± 6.6 -- 36±8.036 ± 8.0 1 μM1 μM 133±3.4133 ± 3.4 38±7.938 ± 7.9 83±7.983 ± 7.9 39±4.539 ± 4.5 130±10.0130 ± 10.0 27±5.827 ± 5.8 111±7.0111 ± 7.0 27±7.127 ± 7.1 3 μM3 μM 93±5.593 ± 5.5 30±3.330 ± 3.3 78±10.078 ± 10.0 24±2.024 ± 2.0 117±9.7117 ± 9.7 17±1.617 ± 1.6 97±10.097 ± 10.0 27±3.927 ± 3.9 5 μM5 μM 85±10.685 ± 10.6 28±2.328 ± 2.3 78±6.778 ± 6.7 25±1.925 ± 1.9 110±14.0110 ± 14.0 11±1.311 ± 1.3 83±8.083 ± 8.0 16±3.216 ± 3.2 10 μM10 μM 71±7.671 ± 7.6 3±0.93 ± 0.9 75±8.275 ± 8.2 2±0.52 ± 0.5 67±12.067 ± 12.0 1±0.11 ± 0.1 43±4.043 ± 4.0 2±0.12 ± 0.1

표 5에 나타난 바와 같이, UVB를 조사한 세포의 배지를 단독으로 처리한 경우에는 약 61~70%의 세포독성을 나타내었고, NAPS만을 10 μM 처리한 경우에는 33%, TAPS만을 10 μM 처리한 경우에는 57%의 세포독성을 나타내었다. UVB를 조사한 세포의 배지와 NAPS 및 TAPS를 병용투여 하였을때는 세포독성 효과가 각각 약 98% 이상으로 나타났다.As shown in Table 5, when the medium of UVB-treated cells alone was treated with about 61-70% of the cytotoxicity, only 10% of NAPS treated 33%, TAPS only treated 10μM Showed cytotoxicity of 57%. When combined with the medium of UVB irradiated cells and NAPS and TAPS, the cytotoxic effect was about 98% or more, respectively.

따라서 NAPS 및 TAPS 단독에 의한 세포독성 유도보다 UVB를 조사한 세포의 배지와 병용투여에 의해서 세포독성 효과가 현저히 상승함을 관찰할 수 있다.Therefore, it can be observed that the cytotoxic effect is significantly increased by co-administration with the medium irradiated with UVB rather than the induction of cytotoxicity by NAPS and TAPS alone.

실시예 6Example 6 : 본 발명의 조성물에 의한 아폽토시스에 관여하는 유전자 및 단백질 확인: Identification of genes and proteins involved in apoptosis by the composition of the present invention

1. 유전자 확인1. Gene Identification

본 발명의 조성물에 의하여 유도되는 아폽토시스에 관여하는 유전자를 알아내고자, TAPS를 30 μM의 농도로 24시간 처치하여 mRNA를 분리한 후 아폽토시스 어레이 키트를 이용하여 관찰하였다.To find out the genes involved in apoptosis induced by the composition of the present invention, TAPS was treated for 24 hours at a concentration of 30 μM to separate mRNA and observed using an apoptosis array kit.

Human Apoptosis Expression Array(R&D system, Minneapolis, MN)에서 제공하는 아폽토시스-특이적 프라이머(apoptosis-specific primers)를 이용하여 labeled cDNA를 합성하고, 이것을 프로브로 하여 2㎍의 총 RNA와 65℃에서 하룻밤 동안 항온배양한 후 세척용액 I(0.5×SSPE, 1%(w/v) SDS)으로 상온에서 3차례, 세척용액 II(0.1% SSPE, 10% (w/v) SDS)로 65℃에서 1시간동안 세척하였다. 세척된 멤브레인(membrane)을 X-레이 필름에 노출시켜 -70℃에서 피폭시킨 후 현상하였다.Labeled cDNAs were synthesized using apoptosis-specific primers provided by the Human Apoptosis Expression Array (R & D system, Minneapolis, MN), which were probed and overnight at 65 ° C. with 2 μg total RNA. After incubation, wash solution I (0.5 × SSPE, 1% (w / v) SDS) three times at room temperature, and wash solution II (0.1% SSPE, 10% (w / v) SDS) at 65 ° C for 1 hour. Washed during. The washed membrane was exposed to X-ray film, exposed at -70 ° C and developed.

결과는 도 10에 나타내었다.The results are shown in FIG.

도 10에 나타난 바와 같이, 아폽토시스 관련 유전자로는 COX-2 및 PIN 유전자의 발현이 증가하였고, 아폽토시스 억제유전자인 서비빈(survivin)이 감소하였으며, Bcl-2 관련 유전자인 Mcl-1과 Bcl-10이 증가하였다. 또한 사이토카인중 IL-1β가 증가하였고, 세포주기 조절자(cell cycle regulator)인 p21은 증가한 반면, p53은 감소하였다.As shown in FIG. 10, as apoptosis-related genes, expression of COX-2 and PIN genes was increased, apoptosis suppressor survivin was decreased, and Bcl-2 related genes Mcl-1 and Bcl-10 Increased. In addition, IL-1β in cytokines was increased, and p53, a cell cycle regulator, was increased while p53 was decreased.

2. 아폽토시스 관련 단백질 확인2. Identification of Apoptosis Related Proteins

본 발명의 조성물이 아폽토시스 유도에 관련된 카스파제-3, p53, Chk1 단백질의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 면역화학적 분석법(Immunoblotanalysis)을 실시하였다.In order to examine the effect of the composition of the present invention on the expression of caspase-3, p53 and Chk1 proteins related to induction of apoptosis, immunoblotting was performed.

HaCaT 세포를 100-㎜ 디쉬에 배양한 후 시간대별로 수거하였다. 500㎕ RIPA lysis buffer(1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M SDS, 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2, 2mM EDTA, 50mM sodium fluoride, 0.2mM sodium vanadate)를 첨가하여 단백질을 추출한 후 Bradford 방법을 이용하여 농도를 측정하였다.HaCaT cells were incubated in 100-mm dishes and harvested by time zone. 500 μl RIPA lysis buffer (1% Nonidet P-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.15 M SDS, 0.01 M sodium phosphate, pH 7.2, 2 mM EDTA, 50 mM sodium fluoride, 0.2 mM sodium vanadate) After extracting the concentration was measured using the Bradford method.

추출된 단백질은 12% 폴리아크릴아미드겔을 이용하여 전기영동을 실시한 후 니트로셀루로즈 멤브레인으로 전이하였다. 5% non-fat milk로 차단한 멤브레인을 1차 항체(카스파제-3, p53, Chk1)와 반응시킨 다음, 멤브레인을 세척한 후 HRP-conjugated 2차 항체와 반응시켰다.The extracted protein was subjected to electrophoresis using 12% polyacrylamide gel and then transferred to nitrocellulose membrane. The membrane blocked with 5% non-fat milk was reacted with the primary antibody (Caspase-3, p53, Chk1), and then the membrane was washed and reacted with the HRP-conjugated secondary antibody.

ECL kit를 이용하여 단백질 강도(protein intensity)를 분석하였다.Protein intensity was analyzed using the ECL kit.

결과는 도 11, 도 12 및 도 13에 나타내었다.The results are shown in FIGS. 11, 12 and 13.

도 11에 나타난 바와 같이, 시간대별로 NAPS, TAPS 및 C2-세라마이드에 의한 카스파제-3 유도를 관찰한 결과, 카스파제-3는 NAPS 처치한 후 30분부터 현저히 증가되어 3시간에 최고 6배의 유도발현을 나타내었으며 증가발현된 카스파제-3는 12시간까지 유지된 후 24시간에 대조군 수준으로 떨어졌다.As shown in FIG. 11, caspase-3 induction by NAPS, TAPS, and C2-ceramide by time zone was observed. Caspase-3 was significantly increased from 30 minutes after NAPS treatment, up to 6-fold at 3 hours. Induced expression and increased expression caspase-3 was maintained for 12 hours and then dropped to control levels at 24 hours.

반면, TAPS는 NAPS에 비해 비교적 늦게 유도발현되기 시작하였으나 약처치 3시간에 최고 5배의 유도발현을 나타낸 후 24시간까지 유도발현이 지속되었다.On the other hand, TAPS started to be induced relatively late compared to NAPS, but induced expression continued up to 24 hours after 3 hours of treatment.

C2-세라마이드 역시 약처치 3시간에 카스파제-3를 최고 유도발현시켰으나 그 증가배수는 NAPS 및 TAPS에 비해 현저히 약하였다(2.5배 증가).C2-ceramide also induced the highest induction of caspase-3 at 3 hours of treatment, but its fold was significantly weaker than that of NAPS and TAPS (2.5-fold increase).

이러한 결과를 통해 피토스핑고신 유도체는 탁월한 아폽토시스 유도능을 가지며, 아폽토시스 유도에 관한 효능에 있어서 기존에 알려져 있는 C2-세라마이드에 비해 우수함을 알 수 있다.These results indicate that the phytosphingosine derivatives have excellent apoptosis inducing ability and are superior to the conventionally known C2-ceramide in terms of efficacy on inducing apoptosis.

도 12 및 도 13에서 보는 바와 같이, p53과 Chk1 단백질은 8시간 때는 TAPS 처리에 의해 큰 변화가 없었지만, 아폽토시스가 일어나는 24시간 때에는 급격히 감소하는 경향을 나타내었다. 이러한 결과는 세라마이드에 의한 아폽토시스 유도에 p53과 Chk1 경로가 관여되고 있다는 것을 의미한다. 특히 Chk1은 DNA 손상에 의한 G2/M 저지에 관여하는 단백질임을 알 수 있다.As shown in FIGS. 12 and 13, p53 and Chk1 proteins showed no significant change by TAPS treatment at 8 hours, but rapidly decreased at 24 hours when apoptosis occurred. These results indicate that the p53 and Chk1 pathways are involved in the induction of apoptosis by ceramide. In particular, it can be seen that Chk1 is a protein involved in G 2 / M inhibition by DNA damage.

실시예 7Example 7 : 본 발명의 조성물에 의한 건선치료 효과: Psoriasis treatment effect by the composition of the present invention

본 발명의 조성물의 유효성분인 NAPS를 0.5% 농도로 하여, 하기 성분의 조성비로 크림 제제를 제조한 후 시료로 사용하였다.NAPS, which is an active ingredient of the composition of the present invention, was 0.5%, and a cream formulation was prepared using a composition ratio of the following components, and then used as a sample.

NAPS 0.5gNAPS 0.5g

스테아르산 1.0g1.0 g of stearic acid

세틸알콜 1.4gCetyl alcohol 1.4g

스테아릴알콜 1.4gStearyl Alcohol 1.4g

글리세릴 모노스테아레이트 2.0gGlyceryl Monostearate 2.0g

솔비탄 모노스테아레이트 0.2g0.2 g of sorbitan monostearate

메틸 파라벤 0.2g0.2 g of methyl paraben

프로필 파라벤 0.1g0.1 g propyl paraben

미네랄 오일 10.0g10.0 g of mineral oil

카프릴릭/카프릭산 3.0gCaprylic / Capric Acid 3.0g

MDF(meadow foam seed oil) 3.0gMDF (meadow foam seed oil) 3.0 g

디메치콘(메틸 폴리실옥산) 0.5g0.5 g of dimethicone (methyl polysiloxane)

솔비탄 세스퀴올레이트 0.3g0.3 g of sorbitan sesquioleate

트윈 60 1.2gTwin 60 1.2 g

디소디움 이디티에이 0.02gDisodium ID 0.02g

글리세린 3.0gGlycerin 3.0g

트리에탄올아민 0.2g0.2 g triethanolamine

세피겔 305 0.5gSepigel 305 0.5 g

제르몰 115 0.2gZermol 115 0.2 g

정제수 71.28gPurified water 71.28 g

20~40세의 남성 환자 4명, 여성 환자 4명을 실험군으로 하였다.Four male patients and four female patients aged 20 to 40 years were included in the experimental group.

상기에서 제조한 시료를 8명의 환자의 병변 부위에 바른후, 변화를 관찰하였다.The sample prepared above was applied to the lesion site of 8 patients and the change was observed.

각 병변 부위 별로 호전된 증상을 도 14에 나타내었다(Case 1 : 팔꿈치, Case 2 : 이마, Case 3 : 무릎).Symptoms improved for each lesion site are shown in FIG. 14 (Case 1: elbow, Case 2: forehead, Case 3: knee).

8명의 환자중 7명이 본 발명의 조성물의 크림제제를 바른후, 5~7일 후에 상당히 호전됨을 확인하였다.Seven of eight patients were significantly improved after 5-7 days after applying the cream formulation of the composition of the present invention.

따라서, 본 발명의 조성물이 건선치료에 있어서 효과가 있음을 알 수 있다.Therefore, it can be seen that the composition of the present invention is effective in the treatment of psoriasis.

본 발명에 사용된 6종의 피토스핑고신 유도체는 세포독성 및 아폽토시스 유도에 있어서 탁월한 효과를 나타낸다.The six phytosphingosine derivatives used in the present invention show excellent effects in inducing cytotoxicity and apoptosis.

따라서 이들 피토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 생체내 아폽토시스 유도에 의해 예방 또는 치료가 가능한 각종 피부질환, 각종 종양, 각종 암 등의 예방 또는 치료에 유용하다.Therefore, the composition of the present invention containing these phytosphingosine derivatives as an active ingredient is useful for the prevention or treatment of various skin diseases, various tumors, various cancers and the like that can be prevented or treated by induction of apoptosis in vivo.

Claims (14)

피토스핑고신(phytosphingosine, PS), 피토스핑고신-HCl(PS-HCl), C6-피토스핑고신(C6-PS), CLA-피토스핑고신(CLA-PS), 테트라아세틸 피토스핑고신(TAPS) 및 N-아세틸 피토스핑고신(NAPS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 피토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 약학 조성물Phytosphingosine (PS), Phytosphingosine-HCl (PS-HCl), C6-Phytosphingosine (C6-PS), CLA-Phytosphingosine (CLA-PS), Tetraacetyl Phytos Pharmaceutical composition for inducing apoptosis, comprising as an active ingredient at least one phytosphingosine derivative selected from the group consisting of pingosine (TAPS) and N-acetyl phytosphingosine (NAPS) 제 1항에 있어서, 상기 피토스핑고신 유도체에 비타민 D3또는 칼시포트리올을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 유도용 약학 조성물The pharmaceutical composition for inducing apoptosis according to claim 1, further comprising vitamin D 3 or calcipotriol in the phytosphingosine derivative. 제 1항에 있어서, 상기 피토스핑고신 유도체에 UVB를 조사한 세포의 배지를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 유도용 약학 조성물The pharmaceutical composition for inducing apoptosis according to claim 1, wherein the phytosphingosine derivative further contains a medium of UVB-irradiated cells. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 생체내 아폽토시스 활성 유도에 의해 예방 또는 치료가 가능한 각종 피부질환, 각종 종양, 각종 암 등의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 약학 조성물The pharmaceutical composition for inducing apoptosis according to claim 1, which is useful for the prevention or treatment of various skin diseases, various tumors, various cancers, etc., which can be prevented or treated by inducing apoptosis activity in vivo. 제 4항에 있어서, 습진, 건선, 어린선 등과 같은 각질이상 질환; 아토피성 피부염, 피부염증, 소양증, 세균감염증, 여드름 또는 창상 등과 같은 피부질환; 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화; 피부암 등의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 약학 조성물The method of claim 4, further comprising: keratinous diseases such as eczema, psoriasis, young glands, etc .; Skin diseases such as atopic dermatitis, dermatitis, pruritis, bacterial infections, acne or wounds; Keratinous skin diseases and skin aging caused by prolonged exposure to ultraviolet rays; Pharmaceutical composition for inducing apoptosis useful for the prevention or treatment of skin cancer 제 5항에 있어서, 건선, 어린선 등과 같은 각질이상 질환, 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 약학 조성물The pharmaceutical composition for inducing apoptosis according to claim 5, which is useful for the prevention or treatment of keratinous diseases such as psoriasis and young aging, keratinous skin diseases caused by prolonged exposure to ultraviolet rays, and skin aging. 제 5항에 있어서, 피부암의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 약학 조성물The pharmaceutical composition for inducing apoptosis according to claim 5, which is useful for preventing or treating skin cancer. 피토스핑고신, 피토스핑고신-HCl, C6-피토스핑고신, CLA-피토스핑고신, 테트라아세틸 피토스핑고신 및 N-아세틸 피토스핑고신으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 피토스핑고신 유도체를 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 화장료 조성물At least one phytos selected from the group consisting of phytosphingosine, phytosphingosine-HCl, C6-phytosphingosine, CLA-phytosphingosine, tetraacetyl phytosphingosine and N-acetyl phytosphingosine Cosmetic composition for inducing apoptosis containing a pingosine derivative as an active ingredient 제 8항에 있어서, 상기 피토스핑고신 유도체에 비타민 D3또는 칼시포트리올을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 유도용 화장료 조성물The cosmetic composition for inducing apoptosis according to claim 8, wherein the phytosphingosine derivative further contains vitamin D 3 or calcipotriol. 제 8항에 있어서, 상기 피토스핑고신 유도체에 UVB를 조사한 세포의 배지를추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 아폽토시스 유도용 화장료 조성물The cosmetic composition for inducing apoptosis according to claim 8, wherein the phytosphingosine derivative further comprises a medium of UVB-irradiated cells. 제 8항 내지 제 10항에 있어서, 생체내 아폽토시스 활성 유도에 의해 예방 또는 치료가 가능한 각종 피부질환, 각종 종양, 각종 암 등의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 화장료 조성물The cosmetic composition for inducing apoptosis according to claim 8, which is useful for the prevention or treatment of various skin diseases, various tumors, various cancers, etc., which can be prevented or treated by inducing apoptosis activity in vivo. 제 11항에 있어서, 습진, 건선, 어린선 등과 같은 각질이상 질환; 아토피성 피부염, 피부염증, 소양증, 세균감염증, 여드름 또는 창상 등과 같은 피부질환; 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화; 피부암 등의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 화장료 조성물12. The method of claim 11, further comprising: keratinous disorders such as eczema, psoriasis, young glands, etc .; Skin diseases such as atopic dermatitis, dermatitis, pruritis, bacterial infections, acne or wounds; Keratinous skin diseases and skin aging caused by prolonged exposure to ultraviolet rays; Cosmetic composition for inducing apoptosis useful for the prevention or treatment of skin cancer 제 12항에 있어서, 건선, 어린선 등과 같은 각질이상 질환, 장시간 자외선에 노출되어 유발되는 각질이상 피부질환 및 피부노화의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 화장료 조성물13. The cosmetic composition for inducing apoptosis according to claim 12, which is useful for the prevention or treatment of keratinous diseases such as psoriasis and young children, keratinous skin diseases caused by prolonged exposure to ultraviolet rays, and skin aging. 제 12항에 있어서, 피부암의 예방 또는 치료에 유용한 아폽토시스 유도용 화장료 조성물The cosmetic composition for inducing apoptosis according to claim 12, which is useful for the prevention or treatment of skin cancer.
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