KR20030084200A

KR20030084200A - 비 유기용매시스템에서의 포스파티딜에탄올아민 및리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법 및 그 방법으로제조된 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 수용성 조성물

Info

Publication number: KR20030084200A
Application number: KR1020020022770A
Authority: KR
Inventors: 정국훈; 한정준; 양영래; 정헌민; 고의찬
Original assignee: 주식회사 두산
Priority date: 2002-04-25
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2003-11-01
Also published as: WO2003091263A1; AU2003224466A1

Abstract

본 발명은 포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 리소포스파티딜에탄올아민을 함유한 수용성 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 의한 포스파티딜에탄올아민의 제조방법은 포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 에탄올아민을 반응시키는 단계를 포함하는 포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 의한 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법은, 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A의 존재 하에서 레시틴과 에탄올아민을 반응시키는 단계를 포함하는 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법을 이용하면, 유기 용매의 사용 없이 완충 용액만을 매개로 하므로 독성 유기용매의 사용에 따른 위험성, 정제의 어려움이 없으며, 효소의 불활성화도가 심하지 않고 반응 효율이 높다. 특히 반응 중 유기용매를 이용하지 않으므로 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며, 분리 정제시 유기 용매를 사용하는 경우에도 용매의회수가 보다 용이하다. 또한, 중,저순도의 레시틴(레시틴 함량 50％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴도 모두 원활하게 분산 시킬 수 있다. 또한 포스파티딜에탄올아민 합성 후 칼슘염을 형성한 반응물을 물로 수세함으로써 반응에 이용된 효소 및 에탄올아민 그리고 반응 후 생성된 콜린을 제거할 수 있어 제품에 효소, 에탄올아민, 콜린 등의 불순물이 혼입되지 않도록 할 수 있다.

Description

비 유기용매시스템에서의 포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법 및 그 방법으로 제조된 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 수용성 조성물{Method for producing phosphatidylethanolamine and lysophosphatidylethanolamine using non-organic solvent system and a water-soluble composition comprising the lysophosphatidylethanolamine produced by the method}

본 발명은 포스파티딜에탄올아민의 제조방법 및 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 수용성 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는, 비 유기 용매시스템에서 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산, 포스파티딜이노시톨 등을 적어도 한 종 포함하는 천연 또는 합성 레시틴(phospholipid)에 포스포리파제 D를 단독으로 또는 포스포리파제 A(A1 또는 A2)와 함께 처리하여 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세히 설명하면 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산, 포스파티딜이노시톨 등을 적어도 한 종 포함하는 레시틴을 염화 칼슘이 있는 완충용액에 1 내지 50% 의 농도로 첨가하고 포스포리파제 D를 단독으로 또는 포스포리파제 A(A1 또는 A2)와 함께 처리하여 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 관한 것이다.

리소포스파티딜에탄올아민은 과실의 숙성(ripening)과 노화(senescence)에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 리소포스파티딜에탄올아민을 처리하면 토마토의 잎(leaves)과 과실의 노화를 억제시킬 수 있는 것으로 알려져 있으며 이로써 토마토를 수확한 후 리소포스파티딜에탄올아민을 처리하면 과실의 저장기간을 연장시켜 줄 수 있다는 것 또한 알려져 있다.(US 특허 5,110,341, US 특허 5,126,155). 또한 리소포스파티딜에탄올아민을 사과에 처리하면 껍질에 안토시아닌(anthocyanin) 형성을 촉진하며 수확된 사과의 저장 기간 중 연화(loss of firmness)를 억제하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 이런 작용은 사과, 크랜베리(cranberry), 토마토(tomato) 등과 같은 과실의 호흡속도(respiration rate)를 낮추어주는 역할과 에틸렌(ethylene) 가스 형성을 촉진하거나 억제하는 기능과 연관이 있는 것으로 알려져 있다(Farag, K.M. and J.P. Palta, "Stimulation of Ethylene Production by Erea, Thidiazoron, and Lysophosphatidylethanolamine and Possible sites of this stimulation" Annual meeting of the American Society of Plant Physiologists, April 1989).

적당한 농도로 조절된조리소포스파티딜에탄올아민(Lysophosphatidylethanolamine) 용액은 절화(Cut flower)의 수명을 연장하는 수단으로 이용되기도 한다(HortScience 32(5): 888-890, 1997). 일반적으로 당을 함유한 실버티오설페이트(Silver thiosulfate)용액을 수확한 꽃에 약 20시간이상 처리함에 의해 꽃의 노화를 억제시키기 때문에 이런 용도로 최근까지 사용되어져 왔다. 하지만 이 용액 중에 함유된 은이온(silver ion)이 환경오염을 야기시키는 문제 때문에 최근 미국에서는 사용을 꺼리고 있다. 천연에서 정제한 리소포스파티딜에탄올아민도 실버 티오설페이트 (Silver thiosulfate) 용액과 유사하게 절화 (cut flower)의 꽃병 내 저장성을 증가 시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 이와 같은 분야에서 리소포스파티딜에탄올아민의 이용이 활발히 추진되고 있다.

리소포스파티딜에탄올아민을 실제로 이용하는 방법으로는 수확한 농작물의 수명을 연장하고자 할 때 그 농작물을 리소포스파티딜에탄올아민이 녹아있는 용액에 침지시켜 처리하거나 이들의 용액을 농작물에 살포하는 형태로 이용하게 되는데 이 때 리소포스파티딜에탄올아민이 물에 녹은 형태여야 균일한 제형을 만들 수 있으며 효능이 좋다. 따라서 리소포스파티딜에탄올아민이 물에 잘 녹는 상태로 만들수록 그 효과가 크다.

현재까지 공업적으로 고순도 리소포스파티딜에탄올아민의 생산법은 개발되어 있지 않았으며 실리카겔(Silica gel) 칼럼 크로마토그래피법(Column chromatography)을 이용한 소량의 분리정제가 실험실적으로 이루어지고 있다. 이것은 Avanti Polar Lipids, Inc나 Sigma사에 의해 시약용으로만 소량 판매되고 있고,가격도 매우 고가이다. 칼럼 크로마토그래피를 이용한 리소포스파티딜에탄올아민의 생산은 리소포스파티딜콜린이 칼럼내에서 이동이 유사하기 때문에 그 분리가 매우 어렵다. 또한 일반 헥산이나 에탄올과 같이 저독성인 유기용매를 단독용매로 이용하여 컬럼 크로마토그라피를 하는 경우에는 리소포스파티딜에탄올아민이 유기 용매에 매우 낮은 용해도를 갖기 때문에 정제가 매우 어렵다. 클로로포름, 벤젠, 메탄올과 같이 매우 독성이 심한 것으로 알려진 용매계를 이용하여 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제할 때에만 좋은 결과를 얻을 수 있으나 이러한 경우 수율도 나쁘고 정제에 많은 비용이 든다. 따라서 수율도 좋고 정제도 용이한 방법이 절실히 요구되었다.

일반적으로 대두레시틴과 난황레시틴이 리소인지질 제조를 위한 발명의 출발물질이 되나 이 원료에 한정되지는 않는다. 대두유의 제조 공정 중에 부산물로 생산되는 조 대두 레시틴(crude soybean lecithin, 흔히 조 레시틴 이라 함)은 60∼70% 극성지질(인지질/ 당지질), 27∼39%의 대두유, 1∼3%의 물, 0.5∼3%의 기타성분들로 구성되어 있다. 그 중 극성지질은 조 레시틴에 포함된 중성지질인 대두유를 제거함에 의해 정제되며 정제된 상태의 조성은 22-30% 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, 이하 PC), 2-5% 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, 이하 LPC), 16-22% 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine, 이하 PE), 0.5-2% 리소포스파티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine, 이하 LPE), 0.5-8% 포스파티딘 산 (Phosphatidic acid, 이하 PA), 0.1-3% 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 6-15% 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 기타 등으로 구성되어 있다. 난황 레시틴의 경우에도 73∼83% 포스파티딜콜린(PC), 2∼5% 리소포스파티딜콜린(LPC), 13∼17% 포스파티딜에탄올아민(PE), 1∼3% 리소포스파티딜에탄올아민(LPE), 기타 등으로 구성되어 있다. 이와 같이 레시틴에는 매우 소량의 리소포스파티딜에탄올아민이 함유되어 있기 때문에 이들 레시틴으로부터 직접 리소포스파티딜에탄올아민을 분리하여 상업적으로 사용하는 것은 거의 불가능하다. 따라서 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A의 존재하에 레시틴을 에탄올아민과 반응시킴으로써 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하되, 수율도 높고 정제도 용이한 제조방법에 대한 요구가 높았다.

일반적으로 포스포리파제 D를 이용하는 인지질의 합성에는 인지질이 물에 불용성이기 때문에 에틸아세테이트, 디에틸에테르 등의 유기 용매와 완충용액을 이용하는 이상계 (two-phase system)에서 합성하는 것이 일반적이다. 하지만 포스파티딜콜린의 함량이 20∼40％, 포스파티딜에탄올아민의 함량이 20∼30％ 정도인 레시틴(예컨대, 신동방 SOYA LECITHIN POWDER 95, CENTRAL SOYA사 FP 40, D, RP40 등)은 에틸아세테이트에 잘 녹지 않는 문제점이 있었다. 특히, 에틸아세테이트-물로 이루어진 이상계 시스템에서는, 레시틴을 일정 농도 이상 사용할 경우, 교반이 원활하지 않으며 레시틴의 응집현상이 일어나고 반응성이 떨어지며 효소의 불활성화가 크다. 디에틸에테르의 경우는 휘발도가 높고 끓는점이 낮아 대량생산은 불가능하다. 기타 톨루엔, 벤젠등의 경우도 효소 불활성화가 심하고 독성이 큰 용매이므로 반응 종료 후 남아있는 유기 용매는 분리 정제에 영향을 주게 되는 문제점이 있었다. 헥산의 경우는 레시틴을 녹일 수 있는 매우 효율적인 용매이지만 합성전이 반응에서 반응성이 매우 떨어진다는 단점이 있었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민을 생산함에 있어 합성 및 분리 정제가 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 독성 유기용매를 사용하지 않으면서도 효소의 불활성화도가 심하지 않으며 반응 효율이 높고 안전한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 반응 중 유기용매를 이용하지 않음으로써 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며 분리 정제 시 사용하는 유기용매의 회수가 보다 용이한 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은 중,저순도의 레시틴 뿐만 아니라 고순도의 레시틴으로부터도 매우 안전하고도 반응성이 매우 좋은 비 유기용매 시스템을 이용하여 포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 것을 목적으로 하고 있다. 또한, 포스파티딜에탄올아민 합성 후 염을 형성한 반응물을 물로 수세함으로써 반응에 이용된 효소 및 에탄올아민, 그리고 반응 후 생성된 콜린 및 반응 후 남은 잔존 에탄올아민 등을 제거할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 포스파티딜에탄올아민의 제조방법은, 포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 에탄올아민을 반응시키는 단계를 포함하는 포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법은, 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A를 처리하여 레시틴과 에탄올아민으로부터 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서, 상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법의 한 실시예는, 먼저 포스포리파제 D의 존재하에서 레시틴과 에탄올아민을 1차 반응시키는 단계; 및 상기 반응물에 포스포리파제 A를 넣고 2차 반응시키는 단계로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 비 유기용매 시스템은 염화칼슘 및 완충용액만으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 레시틴은 상기 완충용액에 대해 1 내지 50%의 양으로 첨가되어 반응되는 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 4 내지 8의 범위인 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 반응의 온도는 20℃ 내지 60℃의범위인 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나로서, 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들의 한 실시예에 있어서, 상기 포스포리파제D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 특징으로 한다.

상기한 포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법은, 상기 포스포리파제 D로 반응시키는 단계 이후에, 상기 반응에 의해 칼슘염이 형성된 반응액을 물 또는 완충용액으로 수세하여 반응액 중의 효소 및 반응 부산물인 콜린, 이노시톨 그리고 미반응 기질인 에탄올아민 등을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법은, 상기 포스포리파제 A로 반응시키는 단계 이후에, 에탄올을 이용하여 추출, 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법은, 상기 포스포리파제 A로 반응시키는 단계 이후에, 헥산, 에탄올 및 물을 이용하여 추출, 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법은, 상기 추출, 분리 및 정제하는 단계 이후에 상기 정제된 리소포스포파티딜에탄올아민을 아세톤으로 처리하여 분말화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 방법들은, 상기 원료 레시틴, 상기 방법에 의해 제조된 포스파티딜에탄올아민 또는 상기 방법에 의해 제조된 리소포스파티딜에탄올아민에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾸는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 조성물은 상기한 방법들에 의한 방법으로 제조된 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 의한 제조방법 및 그 방법으로 제조된 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 조성물에 대해 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 반응매개 시스템으로서 염화칼슘을 용해시킨 완충용액을 사용하였다. 본 발명에 의한 제조방법은 미생물 유래 또는 식물 유래의 포스포리파제 D를 이용하여, 상업적으로 이용 가능한 레시틴의 극성부분을 에탄올아민과 치환하여 포스파티딜에탄올아민을 제조하고 칼슘염으로서 생성된 반응물을 물로 수세하여 반응 중 생성된 부산물인 콜린 등을 비롯하여 전이 반응에 사용된 효소, 반응 후 남아 있는 에탄올아민 등을 제거할 수 있게 하여 제품 중 불순물이 혼입되지 않도록 하였으며 이로써 이후 분리 정제과정을 간소화 하였다.

리소포스파티딜에탄올아민을 얻기 위해서는 수세된 포스파티딜에탄올아민을 함유한 레시틴에 포스포리파제 A 및 염화칼슘을 포함하는 완충용액을 첨가하여 반응시킨다.

상기 제조방법에서 완충용액으로 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 등 pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7의 완충용액을 사용한다.

상기 레시틴은 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 같거나 다른 포화, 모노-, 다가 불포화지방산을 포함하는 식물성 혹은 동물성 레시틴일 수 있으며 상기 레시틴에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾼 것일 수 있으며, 염의 형태일 수 있다. 염으로서는 이화학적으로 허용될 수 있는 염의 형태라면 아무런 문제없이 사용가능하며, 구체적인 염으로서는 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염, 황산염을 들 수 있다. 특히, 이들 염 중에서 나트륨염 및 칼륨염이 바람직하다.

또한, 상기 완충용액의 pH는 4 에서 8의 범위이며, 상기 방법에서 반응온도는 20℃에서 60℃의 범위인 것이 좋다.

본 발명에 의한 상기 포스포리파제 D는 미생물 유래 또는 식물 유래의 것일 수 있다.

제조방법을 보다 구체적으로 설명하면, 교반 장치 및 온도 조절 장치를 갖추고 있는 반응조에 에탄올아민을 넣고, 초산 완충용액 또는 인산 완충용액 (pH 4∼8, 보다 바람직하게는 pH 5∼7, 약 0.2 M)을 반응 기질인 레시틴의 3 내지 6배 정도를 넣는다 반응은 필요에 따라 20∼50℃의 범위에서 행할 수 있다. 에탄올아민이 녹아있는 완충용액에 포스포리파제 D의 활성을 갖는 효소를 필요량만큼 첨가한다. 이 후 레시틴을 적당한 농도로 녹여 첨가한 후 5 시간∼24시간 교반한다. 반응이 끝난 후 반응액을 감압 여과를 하고 깨끗한 물을 첨가하여 교반한 후 감압여과를 하는 수세 과정을 2 내지 3 회 행한다. 이렇게 얻어진 포스파티딜에탄올아민 함유하는 레시틴을 감압 건조시키거나 추가로 아세톤 처리등을 이용하여 분말화시켜 감압건조하면 포스파티딜에탄올아민을 고농도로 함유하는 인지질을 얻을 수 있다.

리소포스파티딜에탄올아민을 얻기 위해서는 반응 후 수세된 인지질에 염화칼슘이 포함된 완충용액을 2 내지 4 배 정도 첨가하고 포스포리파제 A를 필요량만큼 첨가하여 5 시간∼12시간 교반한다. 이 후 반응액에서 지방산을 제거하고 리소포스파티딜에탄올아민을 고농도로 함유하는 인지질을 얻는다. 여기서 리소포스파티딜에탄올아민의 분리 정제 방법은 여러가지가 있을 수 있다.

우선 에탄올을 이용하여 추출하는 방법으로는, 반응 종료 후 에탄올의 농도가 70- 90% 되도록 반응물에 첨가한 후 60 내지 75℃ 정도까지 교반 가열시킨 후 추출액을 여과하거나 정치시킨 후 상등부분을 덜어내어 증발 농축시킨다. 이 후 아세톤 처리를 하여 지방산을 제거하고 분말화시켜 고농도의 리소포스파티딜에탄올아민을 얻는다. 지방산을 제거하는 방법으로는 아세톤 대신에 초임계 유체 추출 혹은 고압 프로판 가스를 이용한 추출 방법들을 사용할 수도 있다.

또다른 방법은 핵산과 에탄올을 이용하여 추출하는 방법인데, 이는 효소 반응 종료후 반응액에 핵산, 에탄올, 물을 첨가시켜 교반한 후 정치시켜 상분리를 시키고 상층부를 농축시킨다. 이 후 아세톤 처리를 하여 지방산을 제거하고 분말화시켜 고농도의 리소포스파티딜에탄올아민을 얻는다.

또한, 제조된 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민에 수소 첨가 반응하여 지방산 조성을 바꿀 수 있다. 수소 첨가 반응의 경우는 에탄올에 10∼20％의 농도로 원료 레시틴이나 전이반응에 의해 합성된 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 녹이고, 4％ 팔라디움 카본을 전체의 3.3∼5％가 되도록 첨가한 후, 40 psi 이상의 수소압으로 3회 불어넣고, 최종적으로 원하는 수소 첨가의 정도에 따라 40∼60 psi의 수소압에서 50℃에서 300∼900rpm의 조건으로 6∼15시간 정도 반응을 시키면 수소 첨가된 원료 레시틴, 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 얻을 수 있다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

<측정 조건>

포스파티딜에탄올아민 및 리소포스파티딜에탄올아민의 함량을 측정하기 위해 HPLC 분석 방법을 이용하였으며, 그 조건은 다음과 같다. HPLC 분석용 LiChrosphere 100 diol (머크사, 4m x 125 mm)을 사용하였고, 이동상으로 A상은 헥산/이소프로판올/아세트산/트리에틸아민 = 82 : 17 : 1 : 0.08, B상은 이소프로판올/물/아세트산/트리에틸아민 = 85 : 14 : 1 : 0.08 인 두 용매 시스템의 농도 구배를 이용한다. 시간 프로그램은 다음 표1과 같다.

시간(분)	플로우(mL/분)	%A	%B
0	1.5	95	5
23	1.5	60	40
28	1.5	0	100
29	1.5	0	100
39	1.5	95	5

유속은 분당 1.5ml이며, 검출기로는 ELSD 검출기를 사용하였고, 검출기 온도는 65℃, 가스 압력은 1.9 L/min으로 하였다.

<실시예 1>

에탄올아민 60g 및 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(FP 40, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 40％) 200g을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 감압 건조하여 얻어진 수율은 90%이었으며, 포스파티딜에탄올아민 함량은 70% 였다.

<실시예 2>

실시예 1에서의 전이반응에 이어서, 포스포리파제 A를 추가로 처리하여 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하였다.

즉, 에탄올아민 60g과 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(FP 40, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 40％) 200g을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 400ml을 첨가하고 염화 칼슘 3.5g과 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 6ml 첨가한 후 37℃에서 6시간 반응시켰다. 반응 종료 후 헥산, 에탄올 및 물을 각 1000, 600, 400 ml 을 첨가하여 30분간 교반한 후 정치하여 두었다. 상분리가 된 후 상층부를 덜어내어 증발 농축 시키고 이어 아세톤 1 ℓ를 이용하여 분말화 시켰다. 이렇게 얻어진 것의 수율은 35%이었으며, 리소포스파티딜에탄올아민의 함량은 70%이었다.

<실시예 3>

실시예 2에서의 반응 종료후 리소포스파티딜에탄올아민의 분리 정제를 위하여 에탄올 및 아세톤을 이용하였다.

에탄올아민 60g과 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(FP 40, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 40％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 400ml을 첨가하고 염화 칼슘 3.5g과 돼지 췌장 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 6ml 첨가한 후 37℃에서 6 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 에탄올 1.6ℓ를 첨가하여 70℃로 가열하면서 교반시켜추출한 후 여과하였다. 여액을 증발 농축하고 아세톤 1ℓ를 이용하여 교반하는 과정을 2회 반복하여 지방산을 제거하고 리소포스파티딜에탄올아민을 분말화하였다. 이 때 수율은 40% 였으며 리소포스파티딜에탄올아민의 함량은 64% 였다.

<실시예 4>

실시예 2에서의 반응 종료 후 리소포스파티딜에탄올아민의 분리 정제를 위하여 아세톤을 이용하지 않고 에탄올에 용해시킨 후 냉각하는 방법을 이용하였다.

에탄올아민 60g 및 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(FP 40, CENTRAL SOYA사, 포스파티딜콜린 함량 40％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 400ml을 첨가하고 염화 칼슘 3.5g과 돼지 췌장 포스포리파제 A2(8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 6ml 첨가한 후 37℃에서 6시간 반응시켰다. 반응 종료 후 에탄올 1.6ℓ를 첨가하여 70℃로 가열하면서 교반시켜 추출한 후 -10℃에서 냉각시켜 침전시킨 후 여과하였다. 이 때 수율은 30%이었으며, 리소포스파티딜에탄올아민의 함량은 90.2%이었다.

<실시예 5>

실시예 1에서의 반응에 있어서 원료를 난황 유래의 레시틴을 원료로 이용하였다. 에탄올아민 100g 및 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D를 2000unit 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴(PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 감압 건조하여 얻어진 수율은 90%이었으며 포스파티딜에탄올아민 함량은 90%이었다.

<실시예 6>

실시예 3 에서의 반응에 있어서 원료를 난황 유래의 레시틴을 원료로 이용하였다. 즉, 에탄올아민 100g 및 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 1ℓ에 넣고, 방선균 유래 포스포리파제 D 2000 unit를 첨가하고, 40℃에서 교반하여 에탄올아민을 완전히 녹인 후, 여기에 레시틴 (PL95, 두산 바이오텍사, 포스파티딜콜린 함량 75％) 200g 을 넣어, 200rpm으로 교반하면서 12 시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 소디움 아세테이트 완충용액 (pH 5.6) 400 ml을 첨가하고 염화 칼슘 3.5g과 돼지 췌장 유래 포스포리파제 A2 (8,000 IU/ml, 상품명 LECITASE 10L, NOVO NORDISK Co.)를 10 ml 첨가한 후 37℃에서 6시간 반응시켰다. 반응 종료 후 에탄올 1.6ℓ를 첨가하여 80℃로 가열하면서 교반시켜 추출한 후 여과하였다. 여액을 증발 농축하고 아세톤 1ℓ를 이용하여 교반하는 과정을 2회 반복하여 지방산을 제거하고 리소포스파티딜에탄올아민을 분말화하였다. 이 때 수율은 60%이었으며 리소포스파티딜에탄올아민의 함량은 94%이었다.

<실시예 7>

효소원으로서 방선균 유래의 포스포리파제 D 이외에도 식물 유래의 포스포리파제 D도 이용가능하다. 식물 유래 포스포리파제 D에는 양배추, 대두 등이 있다. 본 실시예에서는 포스포리파제 D의 활성을 나타내는 양배추 추출물을 이용하여 포스파티딜에탄올아민을 합성하는 예를 나타낸다. 에탄올아민 60g 및 염화칼슘 8.8g을 소디움 아세테이트 완충용액(pH 5.6) 1L에 넣고 앞에서 제조한 포스포리파제 D 활성을 지닌 양배추 추출물 2000 unit를 넣은 후 레시틴(CENTROLEX D, CENTRAL SOYA사) 200g을 넣고 200RPM으로 교반하며 12 시간 반응시켰다. 반응 종료 후 깨끗한 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하였다. 여기에 물 3ℓ를 첨가하여 교반한 후 여과하는 과정을 2회 거친 후 헥산, 에탄올 및 물을 각 1000, 600, 400 ml을 첨가하여 30분간 교반한 후 정치하여 두었다. 상분리가 된 후 상층부를 덜어내어 증발 농축 시키고 이어 아세톤 1ℓ를 이용하여 분말화 시켰다. 이렇게 얻어진 것의 수율은 83%이었으며, 포스파티딜에탄올아민의 함량은 50%이었다.

<실시예 8>

상기 실시예2 및 3 에서 얻어진 리소포스파티딜에탄올아민 1kg을 10％의 농도로 에탄올에 녹이고, 5％ 팔라디움 카본을 전체의 2.5 중량％가 되도록 첨가한 후 14.7 psi의 수소압으로 50℃에서 15시간 정도 반응을 시킴으로써 거의 모든 지방산이 수소첨가가 되어 포화 지방산으로 이루어진 리소포스파티딜에탄올아민952g을 얻을 수 있었다.

<실시예 9>

상기 실시예 2 및 3 에서 얻어진 리소포스파티딜에탄올아민 10g을 물 100ml에 넣고 교반하여 10%의 투명한 리소포스파티딜에탄올아민 수용액을 얻을 수 있었다.

본 발명에 의한 제조방법을 이용하면, 유기 용매의 사용 없이 완충 용액만을 매개로 하므로 독성 유기용매의 사용에 따른 위험성, 정제의 어려움이 없으며, 효소의 불활성화도가 심하지 않고 반응 효율이 높다. 특히 반응 중 유기용매를 이용하지 않으므로 반응 종료 후 분리 정제 과정이 단순화되며, 분리 정제시 유기 용매를 사용하는 경우에도 용매의 회수가 보다 용이하다. 또한, 중,저순도의 레시틴(레시틴 함량 50％ 이하) 뿐만 아니라 고순도의 레시틴도 모두 원활하게 분산 시킬 수 있다. 또한 포스파티딜에탄올아민 합성 후 칼슘염을 형성한 반응물을 물로 수세함으로써 반응에 이용된 효소 및 에탄올아민 그리고 반응 후 생성된 콜린을 제거할 수 있어 제품에 효소, 에탄올아민, 콜린 등의 불순물이 혼입되지 않도록 할 수 있다.

Claims

포스포리파제 D의 존재 하에서 레시틴과 에탄올아민을 반응시키는 단계를 포함하는 포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서,

상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고,

상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
포스포리파제 D 및 포스포리파제 A를 처리하여 레시틴과 에탄올아민으로부터 리소포스파티딜에탄올아민을 제조하는 방법에 있어서,

상기 레시틴은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜산 및 포스파티딜이노시톨 중 적어도 하나를 포함하고,

상기 반응은 염화칼슘 및 완충용액을 포함하는 비 유기용매 시스템에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 방법은,

먼저 포스포리파제 D의 존재하에서 레시틴과 에탄올아민을 1차 반응시키는 단계; 및 상기 반응물에 포스포리파제 A를 넣고 2차 반응시키는 단계로 이루어진것을 특징으로 하는 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
제1항 또는 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비 유기용매 시스템은 염화칼슘 및 완충용액만으로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 상기 완충용액에 대해 1 내지 50%의 양으로 첨가되어 반응되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충용액의 pH는 4 내지 8의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응의 온도는 20℃ 내지 60℃의 범위인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레시틴은 대두레시틴, 채종레시틴, 어류 유래 레시틴, 연체동물 유래 레시틴 및 난황레시틴으로 이루어진 군에서 선택된 것 중 하나로서, 지방산 고리가 탄소수 6 내지 30개의 포화, 모노-, 다가 불포화지방산, 또는 이들의 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염, 인산염, 염산염 및 황산염 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스포리파제D는 미생물 유래 또는 식물 유래인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 포스포리파제 D로 반응시키는 단계 이후에, 상기 반응에 의해 칼슘염이 형성된 반응액을 물 또는 완충용액으로 수세하여 반응액 중의 효소 및 반응 부산물인 콜린, 이노시톨 그리고 미반응 기질인 에탄올아민 등을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 포스포리파제 A로 반응시키는 단계 이후에, 에탄올을 이용하여 추출, 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 포스포리파제 A로 반응시키는 단계 이후에, 헥산, 에탄올 및 물을 이용하여 추출, 분리 및 정제하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 추출, 분리 및 정제하는 단계 이후에 상기 정제된 리소포스포파티딜에탄올아민을 아세톤으로 처리하여 분말화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리소포스파티딜에탄올아민의 제조방법.
제1항 내지는 제3항에 있어서, 상기 원료 레시틴, 상기 방법에 의해 제조된 포스파티딜에탄올아민 또는 상기 방법에 의해 제조된 리소포스파티딜에탄올아민에 수소를 첨가하여 지방산의 조성을 바꾸는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 제조된 포스파티딜에탄올아민 또는 리소포스파티딜에탄올아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 조성물.