KR20030084133A - Fluorescence-labeled peptide for pdk1 protein kinase assay and non-radioactive pdk1 protein kinase assay using the same - Google Patents

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KR20030084133A
KR20030084133A KR1020020022655A KR20020022655A KR20030084133A KR 20030084133 A KR20030084133 A KR 20030084133A KR 1020020022655 A KR1020020022655 A KR 1020020022655A KR 20020022655 A KR20020022655 A KR 20020022655A KR 20030084133 A KR20030084133 A KR 20030084133A
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강상순
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주식회사 아트만 바이오 사이언스
강상순
홍순광
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Abstract

PURPOSE: A fluorescence-labeled peptide for PDK1 protein kinase assay and a non-radioactive PDK1 protein kinase assay using the same are provided, thereby easily, rapidly and accurately assaying the activity of PKD1 protein kinase without using a radioactive isotope. CONSTITUTION: A fluorescence-labeled peptide for PDK1 protein kinase assay has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14, wherein Xaa is one selected from 20 amino acids in nature; and fourth, tenth, sixteenth and nineteenth amino acids are aromatic amino acids. A non-radioactive PDK1 protein kinase assay comprises the steps of: labeling peptide for PDK1 protein kinase assay with fluorescence; reacting the fluorescence-labeled peptide with PDK1 protein kinase; subjecting the reacted fluorescence-labeled peptide to electrophoresis at isoelectric point of the peptide to separate phosphorylated peptides from nonphosphorylated peptides; and measuring the amount of the phosphorylated peptides.

Description

피디케이1 단백질 인산화효소 활성측정용 형광표지 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 피디케이1 단백질 인산화효소 활성측정법{Fluorescence-Labeled Peptide for PDK1 Protein Kinase Assay and Non-Radioactive PDK1 Protein Kinase Assay Using the Same}Fluorescence-Labeled Peptide for PDK1 Protein Kinase Assay and Non-Radioactive PDK1 Protein Kinase Assay Using the Same}

본 발명은 피디케이1(PDK1, 3-phosphotidylinositol dependent protein kinase 1) 단백질 인산화효소 활성측정용 형광표지 펩티드 및 이를 이용한 비방사성 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 단백질 인산화효소의 활성을 측정하기 위한 형광표지 펩티드 및 전기 형광표지된 펩티드를 PDK1 단백질 인산화효소와 반응시키고, 자신의 등전점에서 전기영동한 다음, 인산화된 펩티드의 양을 측정함으로써, PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a fluorescent label peptide for measuring PDK1 (3-phosphotidylinositol dependent protein kinase 1) protein kinase activity and a non-radioactive PDK1 protein kinase activity assay using the same. More specifically, the present invention reacts fluorescently labeled peptides and electrofluorescent peptides with PDK1 protein kinase to measure the activity of protein kinase, electrophoreses at their isoelectric point, and then the amount of phosphorylated peptide is determined. By measuring, the present invention relates to a method for measuring the activity of PDK1 protein kinase.

Phoshpothidylinositol 3 kinase (PI3K) 관계되는 신호전달경로는 몇몇 호르몬, 성장인자, 사이토카인, 및 주변인자에 의하여 그들의 수용체가 활성화되어 신호전달이 세포내부로 전달되면서 단백질-단백질 상호작용으로 활성화된다. 이 PI3K의 직접적인 제어 하에 있는 PDK1은 세린/트레오닌 단백질 인산화효소로 Akt protein kinase를 포함하는 cyclic AMP/cyclic GMP dependent and protein kinase C related protein kinase (AGC) family에 속하는 protein kinase의 activation loop의 세린/트레오닌 잔기를 인산화하고 이들 protein kinase를 활성화시킨다. 그러므로 이 PDK1은 서로 중첩하여 세포막으로부터 핵으로 신호를 전달하는 작용을 수행하는 과정에 중요한 중개자 역할을 수행하는 것으로 추측되고 있다. 특히, 세포의 생존과 사멸에 관여하고, 세린/트레오닌 단백질 인산화효소 Akt prtein kinase의 작용을 조절하는 중추적인 기능을 수행하는 PDK1 단백질 인산화효소 최근에 세포 신호전달 분야에서 많은 관심을 받고 있어, 그 활성을 측정하는 방법 또한 집중적인 연구의 대상이 되고 있다.Phoshpothidylinositol 3 kinase (PI3K) related signaling pathways are activated by protein-protein interactions as several receptors, growth factors, cytokines, and peripheral factors activate their receptors and signal transduction into the cell. PDK1, which is under direct control of PI3K, is a serine / threonine protein kinase that is a serine / threonine in the activation loop of protein kinase belonging to the cyclic AMP / cyclic GMP dependent and protein kinase C related protein kinase (AGC) family, which contains Akt protein kinase. Phosphorylates residues and activates these protein kinase. Therefore, PDK1 is believed to play an important mediator in the process of overlapping each other and transmitting the signal from the cell membrane to the nucleus. In particular, PDK1 protein kinase, which is involved in cell survival and death and plays a pivotal role in regulating the action of serine / threonine protein kinase Akt prtein kinase, has recently received a lot of attention in the field of cell signaling. The method of measuring is also the subject of intensive research.

그런데 종래에는 방사성 동위원소 [γ-32P] ATP의 32P가 인산화 반응에 따라 단백질 기질이나 펩티드에 전달되는 정도를 측정함으로써, PDK1 단백질 인산화효소를 비롯한 여러 인산화효소의 활성을 측정하였다. 이는 여러 종류의 인산화 효소가 공존하는 세포 내부에서 이들 효소의 활성측정을 위해서는 효소의 정제가 필수적이었으며, 신속한 측정이 곤란하였고, 방사성 동위원소를 다루는 불편함과 실험자 및 주위 사람의 방사선 피폭에 대한 잠재적인 위험을 피할 수 없었다.However, conventionally, by measuring the degree to which 32P of the radioisotope [γ-32P] ATP is transferred to a protein substrate or a peptide according to a phosphorylation reaction, the activity of various kinase including PDK1 protein kinase was measured. It was necessary to purify enzymes for the activity measurement of these enzymes in cells coexisting with different types of phosphatase, and it was difficult to measure them quickly, and it was difficult to deal with radioisotopes and potential for radiation exposure of experimenter and people around. The risk of being unavoidable was unavoidable.

이런 이유들로, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제되거나, 정제되지 않은 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속, 정확하고도 안전하게 측정하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.For these reasons, there is a constant need to develop methods for measuring the activity of purified or unpurified PDK1 protein kinase without the use of radioisotopes in a simple, rapid, accurate and safe manner.

이에, 본 발명자는 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속, 정확하고도 안전하게 측정하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 형광표지된 펩티드를 이용하여 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정함으로써, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제되거나, 정제되지 않은 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 것이 가능하다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a method for simple, rapid, accurate and safe measurement of the activity of purified as well as unpurified PDK1 protein kinase without using radioisotopes. By measuring the activity of PDK1 protein kinase using, it was confirmed that it is possible to measure the activity of purified or unpurified PDK1 protein kinase without using a radioisotope, thereby completing the present invention.

도 1은 방사성 동위원소를 이용한 종래의 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법에 의한 전기영동 사진이다.1 is a photoelectrophoresis by conventional PDK1 protein kinase activity assay using radioisotopes.

도 2는 PDK1 단백질 인산화효소의 반응시간과 양에 따른 활성을 보여주는 전기영동 사진이다.Figure 2 is an electrophoresis picture showing the activity according to the reaction time and amount of PDK1 protein kinase.

도 3은 MKK3 펩티드의 특이성과 PDK1 단백질 인산화효소의 특이성을 보여주는 전기영동 사진이다.Figure 3 is an electrophoresis picture showing the specificity of the MKK3 peptide and the specificity of PDK1 protein kinase.

도 4는 PI3/Akt 단백질 인산화효소 활성억제제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 서열번호 1의 펩티드를 기질로 이용하여, 세포 용해물에서 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정한 전기영동 사진이다.Figure 4 is an electrophoresis picture of the activity of PDK1 protein kinase in cell lysate after treatment with PI3 / Akt protein kinase activity inhibitor in human melanoma cell line, using the peptide of SEQ ID NO: 1 as a substrate.

도 5는 단백질 인산화효소 활성촉진제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 서열번호 1의 펩티드를 기질로 이용하여, 세포 용해물에서 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정한 전기영동 사진이다.Figure 5 is an electrophoresis picture of the activity of PDK1 protein kinase in cell lysate after treatment with protein kinase activator to the human melanoma cell line, using the peptide of SEQ ID NO: 1 as a substrate.

Akt3Akt3 305 T; 서열번호 1의 펩티드305 T; Peptide of SEQ ID NO: 1 p90 S6Kp90 S6K 212 S; 서열번호 2의 펩티드212 S; Peptide of SEQ ID NO: 2 PKC deltaPKC delta 229 T; 서열번호 3의 펩티드229 T; Peptide of SEQ ID NO: 3 SGKSGK 256 T; 서열번호 4의 펩티드256 T; Peptide of SEQ ID NO: 4 MAPKKK5/ASK1MAPKKK5 / ASK1 839 T; 서열번호 5의 펩티드839 T; Peptide of SEQ ID NO: 5 PDK1PDK1 241 S; 서열번호 6의 펩티드241 S; Peptide of SEQ ID NO: 6 CISKCISK 320 T; 서열번호 7의 펩티드320 T; Peptide of SEQ ID NO: 7 MUK1MUK1 269 S; 서열번호 8의 펩티드269 S; Peptide of SEQ ID NO: 8 MAP3K12MAP3K12 269 S; 서열번호 9의 펩티드269 S; Peptide of SEQ ID NO: 9 LZKLZK 312 S; 서열번호 10의 펩티드312 S; Peptide of SEQ ID NO: 10 HGKHGK 187 T; 서열번호 11의 펩티드187 T; Peptide of SEQ ID NO: 11

본 발명의 발명자들은 단백질 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)를 통하여, AGC의 activation loop 에 보존되어 있는(conserved) 아미노산 서열을 검색하였고, 그 결과 서열번호 13의 펩티드임을 밝혀 냈다. (그 중 세번째와 열번째의 Xaa로 표시되어진 아미노산은 아로마틱 아미노산(aromatic amino acid)이며, 첫번째와 두번째, 여섯번째와 일곱번째의 세린과 트레오닌, 열한번째와 열두번째의 메타오닌과 루이신은 둘 중 어느 하나의 아미노산만이 포함된다. 표1) 그리고 AGC family에 속하는 Akt protein kinase 3(Akt3)을 entrez에서 검색하여 위의 conserved sequence에 해당하는 서열번호 1의 펩티드가 305번째의 아미노산부터 316번째 아미노산까지 존재하고 있음을 알아냈다. Akt 3의 305 트레오닌(Thr)를 알라닌(Ala)로 치환한 돌연변이를 사용하여 야생형 Akt 3의 PDK에 의한 인산화 여부를 검증하였다 그 결과 Akt 3 T305A mutant는 인산화가 일어나지 않음을 확인하였다 (도1). 그러나 Akt kinase나 MAPK kinasekinase 3에서 적용한 방법처럼 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속, 정확하고도 안전하게 측정하는 방법을 완성하기 위해 합성한 서열번호 1의 펩티드를 이용하여, PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정했으나, 이 펩티드의 인산화는 다른 것들과 달리 인산화가 일어나지 않았다 (도 2). 이 결과는 PDK1은 기질을 인산화하기 위해서 또 다른 요구 조건 (conserved sequence)이 필요함을 보여준다. 이를 규명하기 위해 최근 연구 논문들 참고하여 고찰해본 결과 PDK1의 기질이 되기 위해서는 PDK1 interacting fragment (PIF) motif가 또 필요하다는 것을 인지하였다. PIF는 PDK1에 있는 binding pocket domain에 결합한다고 한다. 현재 규명된 PIF는 두 가지로, 하나는 c-terminal 이 서열번호 15의 펩티드인 motif와, 서열번호 16의 펩티드인 motif이다. Protein kinase A는 전자(서열번호 15의 펩티드)의 경우로 PDK1의 PIF binding pocket에 PKA C-terminal이 결합해, PKA의 activation (T) loop Thr residue가 PDK1에 의해 인산화/활성화된다고 하며, protein kinase C related kinase-1, 2 (PRK1, 2)는 후자 (서열번호 16의 펩티드)의 경우로 PDK1의 PIF binding pocket에 PRK의 서열번호 16의 펩티드 motif가 결합, PRK activation (T) loop내의 Thr residue가 PDK1에 의해 인산화/ 활성화된다고 한다.The inventors of the present invention searched for the amino acid sequence conserved in the activation loop of AGC through the protein database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/), and as a result SEQ ID NO: 13 It was found that the peptide. (The amino acids labeled Xaa in the third and tenth are aromatic amino acids, and the first and second, sixth and seventh serine and threonine, and the eleventh and twelfth metaonin and leucine are either Only one amino acid is included in Table 1) and Akt protein kinase 3 (Akt3) belonging to the AGC family was searched in entrez for the peptide of SEQ ID No. 1 corresponding to the conserved sequence from amino acid 305 to 316 amino acid. I found out that it exists. The mutant substituted 305 threonine (Thr) of Akt 3 with alanine (Ala) was used to verify the phosphorylation by PDK of wild-type Akt 3. As a result, it was confirmed that Akt 3 T305A mutant did not occur phosphorylation (FIG. 1). . However, the activity of PDK1 protein kinase using the peptide of SEQ ID NO: 1 synthesized to complete the method for measuring the activity of PDK1 protein kinase simply, quickly, accurately and safely as in the method applied in Akt kinase or MAPK kinasekinase 3 However, the phosphorylation of this peptide did not occur, unlike the others (Fig. 2). These results show that PDK1 requires another conserved sequence to phosphorylate the substrate. In order to find out this, we reviewed recent research papers and found that the PDK1 interacting fragment (PIF) motif is needed to be a substrate of PDK1. PIF is said to bind to the binding pocket domain in PDK1. There are currently two identified PIFs, one motif is the c-terminal is a peptide of SEQ ID NO: 15 and the motif is a peptide of SEQ ID NO: 16. Protein kinase A is the former (peptide of SEQ ID NO: 15) PKA C-terminal binds to PDK1's PIF binding pocket, and the activation (T) loop Thr residue of PKA is phosphorylated / activated by PDK1. C related kinase-1, 2 (PRK1, 2) is the latter (SEQ ID NO: 16 peptide). The peptide motif of PRK SEQ ID NO: 16 binds to the PIF binding pocket of PDK1, and the Thr residue in the PRK activation (T) loop. Is phosphorylated / activated by PDK1.

Hydrophobic motif를 가진 Akt 3 와 같은 AGC family protein kinase는 이 motif의 (Ser/Thr)를 인산화하는 가상적인 protein kinase의 작용으로 이 Hydrophobic motif가 인산화되어 PIF (서열번호 16의 펩티드)에 상응하는 기능을 수행한다고 한다. 이런 induced PIF가 PDK1의 PIF binding pocket과 결합이 일어나고 Akt 3 의 activation (T) loop내 305 Thr residue의 PDK1에 의해 인산화가 유발되고, Akt 3 protein kinase가 활성화된다고 한다. 이때 이 hydrophobic motif내 Ser/Thr를 인산화 시키는 kinase를 가상적인 protein kinase를 PDK2라고 하는데 아직 그 실체가 불명확하다. 우리는 이런 학술적 정보에 기초하여 Non-Radioactive PDK1 assay용 기질 peptide로서열번호 12의 펩티드로 고안하였다 이는 T loop에 해당하는 서열번호 17의 펩티드의 sequence motif와 PIF motif를 함께 붙인 것으로 PDK1의 PIF pocket에 결합이 생겨나는 서열번호 15의 펩티드인 motif를 합한 것이다. 이 두 motif를 가지고 있어야만 PDK1에 의해서 인산화가 일어나며 PDK1 assay용으로 이용 가능하였다 (도 3). 이를 바탕으로 단백질 데이터베이스의 검색결과와 [γ-32P] ATP를 이용한 종래의 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법의 분석결과를 참조하여, 다음과 같은 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 형광표지 펩티드의 발명을 완성하였다 (도 4).AGC family protein kinase, such as Akt 3 with a hydrophobic motif, acts as a hypothetical protein kinase that phosphorylates (Ser / Thr) of this motif, resulting in phosphorylation of this hydrophobic motif to correspond to PIF (peptide of SEQ ID NO: 16). It is said to perform. The induced PIF binds to the PIF binding pocket of PDK1, and phosphorylation is induced by 305 Thr residue PDK1 in the activation (T) loop of Akt 3, and Akt 3 protein kinase is activated. At this time, the kinase that phosphorylates Ser / Thr in this hydrophobic motif is called a protein kinase, PDK2. Based on this scientific information, we designed the peptide of SEQ ID NO: 12 as the substrate peptide for the Non-Radioactive PDK1 assay. It is a PIF pocket of PDK1 with the sequence motif and PIF motif of the peptide of SEQ ID NO: 17 corresponding to the T loop. To the motif of the peptide of SEQ ID NO: 15 to form a bond. Only with these two motifs did phosphorylation occur by PDK1 and could be used for PDK1 assay (FIG. 3). Based on the results of the protein database search and the results of conventional PDK1 protein kinase activity assay using [γ-32P] ATP, the invention of the fluorescent label peptide for PDK1 protein kinase activity measurement was completed. (FIG. 4).

본 발명의 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 형광표지 펩티드는 하기 17개의 아미노산 서열로 나타내어진다: 서열번호 14의 펩티드The fluorescently labeled peptide for measuring PDK1 protein kinase activity of the present invention is represented by the following 17 amino acid sequence: peptide of SEQ ID NO: 14

상기 펩티드에서, Xaa는 자연계에 존재하는 아미노산 20개 중 어느 하나를 나타내며 네번째, 열번째, 열여섯번째, 열아홉번째의 Xaa 아미노산은 특히 아로마틱 아미노산을 나타낸다. 또한 두번째와 세번째의 세린과 트레오닌, 열한번째와 열두번째의 메타오닌과 루이신은 둘 중 하나의 아미노산만이 포함된다.In the peptide, Xaa represents any one of the 20 amino acids present in nature and the fourth, tenth, sixteenth and ninth Xaa amino acids represent especially aromatic amino acids. Also the second and third serine and threonine, the eleventh and twelfth metaonine and leucine contain only one amino acid.

PDK1 단백질 인산화효소는 전기 펩티드에 반응 특이성을 보이며, 전기 펩티드와 유사한 PTF가 없는 다른 기질 펩티드 (서열번호 13의 펩티드)와는 전혀 반응하지 않는다. 다른 단백질 인산화효소는 본 발명의 PDK1 기질 펩티드도 반응을 하지않는다. 따라서, 이들 펩티드는 PDK1 단백질 인산화효소에 대한 매우 선택적인 기질로 작용하여, 부분정제한 효소나 정제하지 않은 세포파쇄액을 이용하여도 정확한 활성측정이 가능하다. 전기 펩티드로 바람직하게는 서열번호 14의 펩티드 중 두번째(세번째), 네번째, 일곱번째, 열번째, 열한번째(열두번째), 열세번째, 열네번째, 열다섯째, 열여섯번째, 열아홉번째 아미노산으로 구성된 펩티드를 들 수 있다.PDK1 protein kinase shows reaction specificity to the electrical peptide and does not react at all with other substrate peptides (peptide of SEQ ID NO: 13) that do not have a PTF similar to the electrical peptide. Other protein kinases do not react with the PDK1 substrate peptide of the present invention. Thus, these peptides act as highly selective substrates for PDK1 protein kinase, allowing accurate activity measurements even with partially purified enzymes or unpurified cell lysates. The peptide is preferably composed of the second (third), fourth, seventh, tenth, eleventh (twelfth), thirteenth, fourteenth, fifteenth, sixteenth, nineteenth amino acids of the peptide of SEQ ID NO: 14. Peptides.

또한, 본 발명의 비방사성 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법은 전기 펩티드를 형광표지하는 단계; 형광표지된 전기 펩티드를 PDK1 단백질 인산화효소와 반응시키는 단계; 반응이 끝난 전기 펩티드를 등전점에서 전기영동하여, 인산화된 펩티드와 인산화되지 않은 펩티드로 분리하는 단계; 및, 인산화된 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함한다.In addition, the non-radioactive PDK1 protein kinase activity assay of the present invention comprises the steps of fluorescent labeling the peptide; Reacting the fluorescently labeled electric peptide with PDK1 protein kinase; Electrophoresis at the isoelectric point after completion of the reaction to separate the phosphorylated peptide from the non-phosphorylated peptide; And measuring the amount of phosphorylated peptide.

이하에서는, 전술한 비방사성 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법을 좀 더 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the non-radioactive PDK1 protein kinase activity assay described above will be described in more detail.

우선 펩티드에 플루오레스세인(fluorescein)과 같은 형광물질을 접합(conjugation)하여 형광을 띠게 한 다음, PDK1 단백질 인산화효소를 ATP 존재 하에서 형광표지된 펩티드와 반응시키면 형광펩티드에 인산화가 일어난다. 인산화되지 않은 펩티드는 자신의 중성 pH(등전점)에서 전하를 띠지 않기 때문에, 전기장에서 이동하지 않으며, 인산화된 펩티드는 -2가의 전하를 띠게 되어 전기장을 걸어주면 양극으로 이동한다. 이러한 차이를 이용하여 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 양 펩티드를 분리한다. 인산화된 펩티드는 정량은 아가로스 겔을 덴시토메트리(densitometry)를 이용하여 분석하거나, 아가로스 겔에서 인산화된 펩티드를 분리한 다음 형광을 측정하여 정량할 수 있는데, 10ng 정도의 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 2시간 이내에 검출할 수 있다. 한편, 본 발명의 기질 펩티드는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 시료에 존재하는 다른 인산화효소와는 반응하지 않는 기질 특이성을 나타내므로, 부분적으로 정제한 효소나 정제하지 않은 세포파쇄액을 이용하여도, 동위원소를 이용한 인산화효소 활성측정법에 비하여 노이즈(noise)나 배경(background)이 거의 없고, 동위원소 이용에 따른 잠재적인 위험도 피할 수 있다.First, a fluorescent substance such as fluorescein is conjugated to the peptide to fluoresce, and then, when the PDK1 protein kinase is reacted with the fluorescently labeled peptide in the presence of ATP, phosphorylation occurs in the fluorescent peptide. Since unphosphorylated peptides are not charged at their neutral pH (isoelectric point), they do not migrate in the electric field, and phosphorylated peptides carry a -divalent charge, which moves to the anode when the electric field is applied. Using this difference, agarose gel electrophoresis is performed to separate both peptides. Phosphorylated peptide can be quantitated by analyzing agarose gel using densitometry, or by quantifying the phosphorylated peptide from agarose gel and measuring fluorescence. Can be detected within 2 hours. On the other hand, since the substrate peptide of the present invention exhibits a substrate specificity that does not react with other kinase present in the sample as described in the following examples, even partially purified enzymes or unpurified cell lysates can be used. Compared to the method for measuring kinase activity using isotopes, there is little noise or background, and the potential risk of using isotopes can be avoided.

이하 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Through the following examples will be described in more detail the present invention. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

비교 실시예 1: PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 형광표지 펩티드 합성 Comparative Example 1 Synthesis of Fluorescent Labeled Peptide for PDK1 Protein Phosphorase Activity Measurement

[γ-32P] ATP의 존재하에서 PDK1 단백질 인산화효소를 기질 단백질인 야생형 SGK1(SGK1 WT) 및 전기 SGK1 단백질의 189번 위치 세린이 알라닌으로 치환된 SGK1 S189A와 반응시킨 후, 알칼라인 탈인산화효소를 처리하거나 처리하지 않고 전기영동한 다음 X선 사진을 촬영하였다(참조: 도 1). 도 1의 상단부에는 이용된 기질 단백질(SGK1 WT, SGK1 S189A)을 표시하고, 알카라인 탈인산화효소를 처리한 경우(＋)와 처리하지 않은 경우(－)를 표시하며, 음성대조군(negative control)은 각각 PDK1을 첨가하지 않거나, 32P를 포함하는 ATP를 첨가하지 않고 반응시킨 기질 단백질을 나타낸다. 우측의 화살표에서, 32P를 포함하는 PDK1 단백질 인산화효소는 PDK1로 표시하고, Akt 3 WT 또는 Akt3 T305A는 Akt3로 표시한다. 도 1에서 보듯이, 방사성 동위원소를 이용한 종래의 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법에 의한 전기영동의 결과, PDK1 단백질 인산화효소에 의하여 야생형 Akt 3( Akt 3 WT)은 인산화되지만, Akt 3의 305 세린을 알라닌으로 치환한 돌연변이 단백질(SGK1 S189A)은 인산화되지 않으므로, PDK1 단백질 인산화효소가 SGK1의 189번 세린과 자기 자신을 인산화한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 아미노산 서열정보를 이용하여 서열번호 12의 펩티드를 합성하였다.In the presence of [γ-32P] ATP, PDK1 protein kinase was reacted with the substrate type wild type SGK1 (SGK1 WT) and SGK1 S189A where serine at position 189 of the previous SGK1 protein was substituted with alanine, followed by alkaline dephosphorylation. X-rays were taken after electrophoresis with or without treatment (see FIG. 1). In the upper part of FIG. 1, the used substrate proteins (SGK1 WT, SGK1 S189A) are displayed, and the alkaline dephosphatase treated (+) and the non-treated (-), and the negative control (negative control) The substrate protein reacted without adding PDK1 or adding ATP containing 32P, respectively. In the arrow to the right, PDK1 protein kinase comprising 32P is denoted PDK1 and Akt 3 WT or Akt3 T305A is denoted Akt3. As shown in Figure 1, as a result of electrophoresis by conventional PDK1 protein kinase activity assay using radioisotopes, wild type Akt 3 (Akt 3 WT) is phosphorylated by PDK1 protein kinase, but 305 serine of Akt 3 is phosphorylated. Since the mutant protein (SGK1 S189A) substituted with alanine was not phosphorylated, it was confirmed that PDK1 protein kinase phosphorylates itself with serine No. 189 of SGK1, and synthesized the peptide of SEQ ID NO: 12 using the amino acid sequence information. It was.

실시예 1: PDK1 단백질 인산화효소의 양 및 반응시간에 따른 활성측정 Example 1 Activity Measurement According to Amount and Reaction Time of PDK1 Protein Kinase

형광표지된 기질 펩티드를 이용한 PDK1 단백질 인산화효소의 활성측정법의 감도를 확인하기 위하여, PDK1 단백질 인산화효소의 양 및 반응시간에 따른 활성을 다음과 같이 측정하였다(참조: 도 2): PDK1 단백질 인산화효소의 기질로서 아미노 말단에 이소티오시아네이트 플루오레스세인(FITC)를 부착시켜 형광을 띠게 한 서열번호 1의 펩티드를 제작하였다. 전기 플루오레스세인이 접합된 형광펩티드 5㎍을 5㎕의 구분-처리된(differential-treated) 세포파쇄액이나, 5, 10 및 20ng의 활성화된 PDK1 단백질 인산화효소와 함께 20㎕의 단백질 인산화효소 반응액(20mM HEPES, pH 7.2, 10mM MgCl2, 10mM MnCl2, 1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.2mM EGTA, 20mM ATP, 1mg 포스파티딜세린(phosphatidylserine), PDK1 단백질 인산화효소 활성촉진제)에 넣고, 30 에서 30분간 반응시킨 다음, 95 에서 10분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 전기 반응물을 0.8% 아가로스 겔, TBE 완충용액(pH 8.0)에서 100V 전압에 15분 동안 전기영동하여, 인산화된 펩티드를 인산화되지 않은 것과 분리하였다. 전기영동한 겔을 UV-분광기 위에 놓고 사진을 촬영하고, 인산화된 펩티드 밴드를 절단하여, 일정량(1㎖)의 증류수로 30분간 용출시킨 다음, 광학밀도 488mm에서 정량하여, 사용한 기질의 양에 대한 인산화 산물의 생성 비율(conversion ratio)을 도 2의 하단부에 표시하였다. 도 2에서, 인산화되지 않은 펩티드는 검은색 화살머리로, 인산화된 펩티드는 흰색 화살머리로 표시한다. 도 2에서 보듯이, PDK1 단백질 인산화효소의 양의 증가 및 일정량의 PDK1 단백질 인산화효소에 대한 반응시간 증가에 따른 PDK1 단백질 인산화효소의 활성증가를 확인할 수 있고, 약 5ng 까지의 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 검출할 수 있었다.In order to confirm the sensitivity of PDK1 protein kinase activity assay using fluorescently labeled substrate peptide, the activity according to the amount and reaction time of PDK1 protein kinase was measured as follows (see FIG. 2): PDK1 protein kinase A peptide of SEQ ID NO: 1 was prepared by attaching isothiocyanate fluorescein (FITC) to the amino terminal as a substrate. 5 μl of an electrofluorescein conjugated fluorescent peptide was reacted with 20 μl of protein kinase with 5 μl of differentially-treated cell lysate or 5, 10 and 20 ng of activated PDK1 protein kinase. In a liquid (20 mM HEPES, pH 7.2, 10 mM MgCl2, 10 mM MnCl2, 1 mM dithiothreitol, 0.2 mM EGTA, 20 mM ATP, 1 mg phosphatidylserine, PDK1 protein kinase activator), 30 to 30 After the reaction, the reaction was stopped by heating at 95 for 10 minutes. The reaction was electrophoresed at 0.8V agarose gel, TBE buffer (pH 8.0) for 15 minutes at 100V voltage to separate the phosphorylated peptide from the unphosphorylated. The electrophoretic gel was placed on a UV-spreader and photographed, the phosphorylated peptide band was cut, eluted with a predetermined amount (1 ml) of distilled water for 30 minutes, quantified at an optical density of 488 mm, and used for the amount of substrate used. The conversion ratio of the phosphorylated product is shown at the bottom of FIG. 2. In FIG. 2, non-phosphorylated peptides are indicated by black arrowheads and phosphorylated peptides by white arrowheads. As shown in Figure 2, the increase in the amount of PDK1 protein kinase and the increase in the reaction time for a certain amount of PDK1 protein kinase can increase the activity of PDK1 protein kinase, the activity of PDK1 protein kinase up to about 5ng Could be detected.

실시예 2: Akt3 펩티드의 특이성과 PDK1효소의 특이성 Example 2 Specificity of Akt3 Peptide and Specificity of PDK1 Enzyme

PDK1 단백질 인산화효소에 의한 인산화 반응의 기질 특이성을 확인하기 위하여, PDK1 T loop alone peptide (서열번호 17의 펩티드), Rac1 peptide (서열번호18의 펩티드), MEKK3 (서열번호 19의 펩티드)의 peptide 를 합성한 다음, 플루오레스세인을 접합시켜 형광을 띠게 하고, PDK1 단백질 인산화효소와 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다. 또한, 서열번호 12의 펩티드를 기질로 하여 PDK1 단백질 인산화효소 대신 20 ng의 다른 단백질 인산화효소(PKC, GSK3)와 전기 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다(참조: 도 3). 도 3에서, 인산화되는 peptide위치를 검은색 화살머리 표시한다. 도 3에서 보듯이, Rac1, IRS-1의 펩티드는 PDK1과 반응하지 않으며, PDK 펩티드는 다른 단백질 인산화효소와 반응을 하지 않는 것을 확인할 수 있었다.To confirm the substrate specificity of the phosphorylation reaction by PDK1 protein kinase, peptides of PDK1 T loop alone peptide (peptide of SEQ ID NO: 17), Rac1 peptide (peptide of SEQ ID NO: 18), and MEKK3 (peptide of SEQ ID NO: 19) were used. After synthesis, fluorescein was conjugated to fluoresce, and the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 with PDK1 protein kinase. In addition, using the peptide of SEQ ID NO: 12 as a substrate, the reaction was performed in the same manner as in Example 1 with 20 ng of other protein kinase (PKC, GSK3) instead of PDK1 protein kinase (see Fig. 3). In FIG. 3, the peptide positions to be phosphorylated are indicated by black arrowheads. As shown in FIG. 3, the peptides of Rac1 and IRS-1 did not react with PDK1, and the PDK peptide did not react with other protein kinase.

실시예 3: PI3K/Akt 단백질 인산화효소 활성억제제의 처리농도에 따른 PDK1 단백질 인산화효소의 활성변화 Example 3 PDK1 Protein Kinase Activity Changes According to the Treatment Concentration of PI3K / Akt Protein Kinase Inhibitors

PI3K/Akt 단백질 인산화효소 활성억제제 (LY29002)가 나타내는 PDK1 단백질 인산화효소에 대한 길항작용이 형광표지된 펩티드를 이용한 방법으로 검사되는 것을 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다: PI3/Akt 단백질 인산화효소 억제제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 세포 용해물에서 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하였다. 기질로는 서열번호 1의 펩티드를 이용하였으며, 효소활성은 정제하지 않은 5㎕의 구분-처리된 세포 파쇄액을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다(참조: 도 4). 도 4에서 인산화된 펩티드는 검은색 화살머리로 표시하였다. 도 4에 보듯이, PI 3/Akt 단백질 인산화효소 억제제의 처리농도에 비례하여 PDK1 기질 펩티드의 인산화가 감소함을 확인할 수 있었다.To confirm that the antagonism of the PDK1 protein kinase represented by the PI3K / Akt protein kinase activator (LY29002) was examined by a method using fluorescently labeled peptides, the following experiment was performed: PI3 / Akt protein kinase inhibitor Was treated with human melanoma cell line, and then the activity of PDK1 protein kinase in cell lysate was measured. As a substrate, the peptide of SEQ ID NO: 1 was used, and the enzyme activity was carried out in the same manner as in Example 1 using 5 µl of untreated purified cell lysate (see FIG. 4). Phosphorylated peptides in FIG. 4 are indicated by black arrowheads. As shown in Figure 4, it was confirmed that the phosphorylation of PDK1 substrate peptide decreases in proportion to the treatment concentration of the PI 3 / Akt protein kinase inhibitor.

실시예 4: 단백질 인산화효소 활성촉진제의 처리농도에 따른 PDK1 단백질 인산화효소의 활성변화 Example 4 Changes of PDK1 Protein Kinase Activity According to Treatment Concentration of Protein Kinase Enzyme Activator

단백질 인산화효소 활성촉진제(okadaic acid)의 처리농도에 따라 조절된 효소활성의 변화가 형광기질을 이용한 방법으로 검사되는 것을 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다: 단백질 인산화효소 활성촉진제를 인간 흑색종 세포주에 처리한 다음, 세포용해물에 있는 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하였다. 기질로 이용한 펩티드는 서열번호 1의 펩티드를 이용하였으며, 효소활성은 정제하지 않은 5㎕의 구분-처리된 세포파쇄액을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 반응을 수행하였다 (참조: 도 5). 도 5에서, 인산화된 펩티드는 검은 화살머리로 표시하였다. 도 5에서 보듯이, 단백질 인산화효소 활성촉진제의 처리농도에 비례하여 기질 펩티드의 인산화가 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.In order to confirm that the change in the enzyme activity regulated according to the treatment concentration of the protein kinase activator (okadaic acid) was examined by the method using a fluorescent substrate, the following experiment was carried out: The protein kinase activator was a human melanoma cell line. After treatment, the activity of PDK1 protein kinase in cell lysate was measured. The peptide used as the substrate was used as the peptide of SEQ ID NO: 1, and the reaction was carried out in the same manner as in Example 1 using 5 µl of the separated-treated cell lysate that was not purified. . In FIG. 5, phosphorylated peptides are indicated by black arrowheads. As shown in Figure 5, it was confirmed that the phosphorylation of the substrate peptide increases in proportion to the treatment concentration of the protein kinase activator.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명은 형광표지된 펩티드를 이용하여, 간편, 신속, 정확하고도 안전하게, PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 PDK1 단백질 인산화효소의 활성을 측정하는 방법에 의하면, 방사성 동위원소를 이용하지 않고, 정제된 것은 물론, 정제되지 않은 PDK1단백질 인산화효소의 활성을 간편, 신속, 정확하고도 안전하게 측정하는 것이 가능한 바, 세포 신호전달 분야에서 PDK1 단백질 인산화효소의 역할에 관한 연구에 크게 이바지할 수 있을 것이다.As described in detail above, the present invention provides a method for measuring the activity of PDK1 protein kinase, simply, quickly, accurately and safely using a fluorescently labeled peptide. According to the method for measuring the activity of PDK1 protein kinase of the present invention, it is simple, rapid, accurate and safe to measure the activity of purified and unpurified PDK1 protein kinase without using radioisotopes. It is possible that this will greatly contribute to the study of the role of PDK1 protein kinase in the field of cell signaling.

Claims (5)

하기 17개의 아미노산 서열로 나타내어지는 PDK1 인산화 효소 활성특정용 펩티드: 서열번호 14의 펩티드PDK1 kinase activity specific peptide represented by the following 17 amino acid sequence: Peptide of SEQ ID NO: 14 (Xaa는 자연계에 존재하는 아미노산 20개 중 어느 하나를 나타내며 그 중 네번째, 열번째, 열여섯번재, 열아홉번째 아미노산은 아로마틱 아미노산(aromatic amino acids)이다. 또한 두번째와 세번째의 세린과 트레오닌, 열한번째와 열두번째의 메타오닌과 루이신은 둘 중 하나의 아미노산만이 포함된다)(Xaa represents any one of the 20 amino acids in nature, of which the fourth, tenth, sixteenth, and ninth amino acids are aromatic amino acids. The second and third serine and threonine, and eleventh And twelfth methionine and leucine contain only one amino acid) 제 1항에 있어서, 서열번호 14의 펩티드 amino acid 순서 두번째(세번째), 네번째, 일곱번째, 열번째, 열한번째(열두번째), 열세번째, 열네번째, 열다섯째, 열여섯번째, 열아홉번째 아미노산으로 이루어진 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1가지인 것을 특징으로 하는 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 펩티드.The amino acid sequence according to claim 1, wherein the peptide amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 is the second (third), fourth, seventh, tenth, eleventh (twelfth), thirteenth, fourteenth, fifteenth, sixteenth, and ninth amino acids. Peptide for measuring PDK1 protein kinase activity, characterized in that one selected from the group consisting of a peptide consisting of. 제 1항에 있어서, 전기 펩티드는 형광표지된 것임을 특징으로 하는 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 펩티드.The peptide for measuring PDK1 protein kinase activity according to claim 1, wherein the peptide is fluorescently labeled. 제 1항의 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정용 펩티드를 형광표지하는 단계; 전기 형광표지된 펩티드를 PDK1 단백질 인산화효소와 반응시키는 단계; 반응이 끝난 전기 형광표지된 펩티드를 자신의 등전점에서 전기영동하여, 인산화된 펩티드와 인산화되지 않은 펩티드로 분리하는 단계; 및, 인산화된 펩티드의 양을 측정하는 단계를 포함하는 비방사성 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법.Fluorescent labeling the peptide for measuring PDK1 protein kinase activity of claim 1; Reacting the electrofluorescent peptide with PDK1 protein kinase; Electrophoresis of the reacted electrofluorescent peptide at its isoelectric point to separate the phosphorylated peptide from the non-phosphorylated peptide; And, non-radioactive PDK1 protein kinase activity assay comprising the step of measuring the amount of phosphorylated peptide. 제 4항에 있어서, 전기 펩티드는 표 1 펩티드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1가지인 것을 특징으로 하는 비방사성 PDK1 단백질 인산화효소 활성측정법.5. The non-radioactive PDK1 protein kinase activity assay according to claim 4, wherein the electric peptide is one selected from the group consisting of Table 1 peptides.
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