KR20030082312A

KR20030082312A - 디-알라닌펩타이드 분해효소 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20030082312A
Application number: KR1020020020977A
Authority: KR
Inventors: 이영남
Original assignee: 일진소재산업주식회사
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-10-22

Abstract

본 발명은 디-알라닌 펩타이드 분해효소를 생산하는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 CMB01 (Bacillus amyliquefaciensCMB01)균주를 배지에서 배양하여 그 배양균체로부터 얻어진 신규 디-알라닌펩타이드 분해효소(D-alaninepeptidase)와 디-알라닌펩티다제를 통상의 항생물질과 병용하면 항생물질의 항균력을 높여 항생물질의 사용량을 줄일 수 있다.

Description

디-알라닌펩타이드 분해효소 및 그 제조 방법 {D-alaninepeptidase and the process for the preparation thereof}

본 발명은 디- 알라닌펩타이드 분해효소 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 알카리 환경에서 잘 생육하는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 (Bacillus amyliquefaciens)CMB01 균주에서 분리된 디-알라닌펩타이드 분해효소(이하 “디-알라닌펩티다제 : D-alaninepeptidase”라 한다.), 그 제조방법 및 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)와 항생물질을 병용하여 항균력을 높이는 것에 관한 것이다.

미생물에 의한 질환을 치료하기 위한 화학요법제의 개발 및 항생물질의 탐색 연구는 의학, 약학, 농, 축산 등 여러 분야에서 인류 복지 향상에 크게 기여하여왔으며 무엇보다 세균성 질환치료제의 개발 연구는 괄목 할 만하다. 그러나 화학요법제 및 항생물질의 사용이후 약제 내성 균주들이 빠르게 출현하여(1-5) 미생물 질환 치료에 많은 문제점이 나타나고 있는데 이러한 내성균을 효과적으로 제어하거나 약제의 상승 효과를 줄 수 있는 신물질의 개발이 요구되고 있다.

미생물은 자연생태계의 없어서는 안될 아주 중요한 구성원이며, 모든 미생물들은 생명활동을 영위하기 위하여 다양한 생화학 반응을 진행하며 생명 활동의 결과로 여러 가지 대사산물들을 만들어 낸다 (6-8). 미생물의 대사산물 가운데에서 효소제, 항생물질, 항암제 등 여러 가지 생리 활성 물질의 활용 가치가 널리 인식되고 있어 미생물 대사산물에서 신약으로 창출하려는 연구가 국. 내외적으로 매우 활발하다 (9-18).

미생물 질환을 항생제로 치료할 때, 매우 심각한 문제는 약제에 내성을 보이는 균들의 출현으로 효과적인 치료효과를 볼 수 없는데 있다. 약제 내성 병원균의 출현은 범세계적 문제로 인지되고 있어, 1996년 봄, 한국 및 일본을 주축으로 한 동남아 지역의 의료진이 뜻을 모아 “내성 병원균주 감시 아시안 넷트웍 (Asian Network for Survelliance of Resistant Pathogens, ANSORP)”을 구성하였고, 1997년 봄에는 ICAAC (Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotheraphy)에서 범세계적 파수 항생제 감독 프로젝트 (The Global Sentry Antimicrobial Surveilance Project, SAS)를 만들기에 이르렀고 그후 해마다 세계각국의 관련 학자들이 함께 모여 병원성 균들의 내성 균주 출현에 대한 보건의료의 심각성을 간파하고 이에 대한 다각적 대책을 강구하고 있다. 다각적 대책의 하나로 내성 세균에 의한 질환을 치료할 수 있는 새로운 약제의 개발을 들 수 있고, 다른 하나는 기존의 사용되고 있는 항생 약제의 약효를 높여 내성 균주를 보다 쉽게 통제하는 것이다. 전자는 신약개발을 의미하는데 하나의 신약이 개발되어 실용화되기까지에는 장시간의 연구와 막대한 비용을 수반한다. 후자는 기존 약물의 구조변환으로 약효를 상승시키거나 아니면 병원균체 내부로의 약재의 수송을 늘여 균체에 대한 약물의 유효농도를 높임으로 약제의 효과를 고양하는 것이다.

약제에 대한 미생물의 내성은 여러 가지 기작에 의하여 나타날 수 있는데 그중 하나는 미생물 세포 내로 들어 온 약제를 밖으로 퍼내거나, 세포벽, 세포막의 구조적 변화를 야기하여 균세포 안으로 약제의 유입을 차단하여 (19-21) 세포 내 약물의 농도가 유효 농도에 훨씬 못 미치게 끔 하는 것이다. 따라서 약물이 미생물의 세포벽, 세포막을 보다 용이하게 통과 할 수 있도록 도와주는 물질이 있다면 적은 량의 약제로도 우수한 항생 효과를 기대할 수 있어 내성 균주에 의하여 야기되는 문제점을 극복할 수 있다고 사료된다.

세균은 다른 생명체에서는 볼 수 없는 세포벽을 갖고 있다. 세균의 세포벽은 세균을 외부 환경변화로부터 균을 보호하는 세균의 생명력 보호에 아주 중요한 구조로 세포벽 구조에 이상이 생기면 생명력에 큰 손상을 입는다. 세균의 세포벽에는 다른 생물 세포에서는 볼 수 없는 몇 종의 특수 성분이 있다. 그러한 성분 중 엘-알라닌 (L-alanine) 과 디-알라닌 (D-alanine)은 세균의 벽 구성에 필수적인데 특히 디-알라닌 (D-alanine)은 세균 벽에서만 볼 수 있는 특이한 물질이다. 세균의 세포벽은 펩티도그리칸(peptidoglycan)이란 물질로 구성되어 있는데 펩티도그리칸 (peptidoglycan)은 엔-아세틸글루코사민 (N-acetylglucosamine)과 엔-아세틸뮤라민 산 (N-acetylmuramic acid)에 올리고펩타이드 (oligopeptide)가 연결된 당-펩타이드 화합물이며 올리고펩타이드(oligopeptide)에는 세균들만이 지닌 특유의 디-알라닌 펩타이드(D-alaninepeptide) 결합이 있다 (22). 따라서 디-알라닌 펩타이드(D-alaninepeptide)결합을 해체하는 물질을 찾아 이를 세균에 적용한다면 세균 세포벽 구조에 변화가 생겨 항생제 처리 시 균 속으로 항생제의 수송이 늘어나 약물의 유효농도가 높아져 항생제의 상승효과를 기대할 수 있으리라 사료된다. 사람에게는 디-알라닌펩타이드 (D-alaninepeptide)결합이 없음으로 디-알라닌 펩타이드 (D-alaninepeptide)를 해체하는 물질은 사람에게는 전혀 해를 주지 않는다. 세균의 디-알라닌펩타이드 (D-alaninepeptide)의 펩타이드 (peptide) 결합이 끊어지면 균의 세포벽은 구조적으로 느슨하게 되어 외부에서 세균 안으로 약제의 유입이 용이해지며 결과적으로 항생제의 약효를 증폭할 수 있게 될 것이다. 따라서 세균만이 고유하게 지니고 있는 디-알라닌펩타이드 (D-alaninepeptide)를 분해할 수 있는 물질과 항생제를 병용할 때 약제의 상승 효과를 도모하여 적은 량의 약제로 항생 효과를 볼 수 있어 내성 균주로 인한 문제도 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 본인은 신약 개발 연구의 일환으로 미생물 질환에 대하여 널리 사용하고 있는 항생 약제의 효과를 증폭시킬 수 있는 즉 항균활성 항진 물질 (enhancer of antibiotic activity )에 관심을 두고 세균 세포벽 성분의 하나인 디-알라닌 펩타이드 (D-alaninepeptide)를 분쇄하여 세균 세포 내로의 약물의 수송을 도와 줄 수 있는 물질, 즉 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)를 탐색하였다.

자연계로부터 탐색한 호알카리성Bacillus amyloliquefacinsCMB01 균주가 만드는 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)를 분리 정제하여 효소학적 특성을밝히고, 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)가 세균성 질환 치료제로 쓰이는 다양한 항생제의 항균활성을 상승시키는지를 확인하여 약제 내성 균주의 출현으로 인한 세균성 질환 치료의 문제점을 보완 할 수 있는 신약물질 후보로 개발하고자 한다.

도 1은 CMB01으로부터 정제중인 디-알라닌펩티다제(D-alaninepeptidase)의 8% 비변성 전기영동(Native-PAGE;좌측)과 D-alanine-ρ-nitroanilide zymogram(우측)이며,

도 2는 정제된 디-알라닌펩티다제에 의한 D-alanine-ρ-nitroanilide와 L-alanine -ρ-nitroanilide의 분해산물에 대한 페이퍼 크로마토그램이며,

도 3은 비변성 전기영동(native PAGE)를 이용한 디-알라닌펩티다제의 분자량을 측정한 그래프이며,

도 4는정제된 디-알라닌펩티다제의 8% 변성 전기영동(SDS-PAGE)이며,

도 5는 pH와 완충액 성분에 따른 디-알라닌펩티다제의 활성을 나타낸 그래프이며,

도 6은 Britton Robinson 광역 완충액에 대한 디-알라닌펩티다제의 pH안정성을 나타낸 그래프이며,

도 7은 디-알라닌펩티다제의 온도에 대한 안정성을 나타낸 그래프이며,

도 8은 디-알라닌펩티다제의 활성에 대한 온도의 영향을 나타낸 그래프이며,

도 9은 디-알라닌펩티다제에 의한 항생제 향균력 상승효과를 나타낸 사진이며,

도 10은 `내성균을 이용한 디-알라닌펩티다제 향균력 상승효과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 (Bacillus amyliquefaciens)균주가 생산하는 디-알라닌펩타이드 분해효소인 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)와 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)가 보이는 수종 항생제의 항세균력을 크게 증진시키는 항균조성물에 관한 것이다. 디-알라닌펩티다제를 생산하는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 씨엠비01 (Bacillus amyloliquefaciensCMB01) 균주는 2001년 2월 22일에 대한민국 특허청에 특허 출원한 신규 균주 (출원번호: 10-2001-0008919)로 알카리 환경에서 잘 생육한다. 다음에 이 균주가 생산하는 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)의 정제 및 효소의 성질에 대한 상세한 설명과 바씨러스 아밀로리퀴화씨엔스 (Bacillus amyliquefaciens) CMB01의 디-알라닌펩티다제에 수종의 그람음성세균에 대한 겐타마이신 등 항생제의 항균활성을 항진시키는 특성에 관하여 설명한다.

실시 예 1

D-alaninepeptidase 의 정제 및 효소의 성질에 대한 상세한 설명

1. D-alaninepeptidase의 정제

Bacillus sp.CMB01 균체로부터 D-alaninepeptidase를 다음과 같은 방법으로 정제하였다 .

가. 균의 배양 및 무세포 추출액 준비

균 (Bacillus amyloliquefaciensCMB01)은 엘비 액체배지 (LB 배지: 조성 트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나토륨 1%)에서 배양 온도 30℃, 진탕 배양 (진탕 속도:150 RPM) 으로 24-48시간 배양하였다. 균 배양액을 저온 원심분리기 (4500 x g로 4℃에서 20분)로 모은 후, 50 mM 인산카리완충액(potassium phosphate buffer, pH 6.0)으로 두 번 세척하였다. 세척한 균체를 동일 완충액에 현탁하여 4℃에서 50W의 초음파분쇄기로 20초간 40회 반복해서 파쇄한 후 이 시료를 저온 고속원심분리기 (12,000 x g, 4 ℃) 20분간 원심분리 한 후 상층액을 취하여 무세포 추출액 (cell-free extract)을 만들었다 (23).

나. D-alaninepeptidase의 활성측정 (24)

50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) 500 ㎕에 380 ㎕의 증류수, 100 ㎕의 100 mM D-alanine-ρ-nitroanilide, 20 ㎕의 효소액을 첨가한 후 37℃ 항온기에서 30분간 반응시킨다. 반응 후 10% 트리크로로아세틱 산 (trichloroacetic acid, TCA) 100 ㎕를 넣어 반응을 중지하고 반응액의 흡광도를 420 nm에서 측정한다. 상기 조건에서 1분 동안 1 μmol의 ρ-nitroanilide (ε=0.003 μmol^-1.cm^-1)을 생성하는 효소의 활성을 D-alanine-peptidase의 활성 1 Unit로 정했다. 조 효소액 중의 단백 량은 Lowry의 방법으로 측정하였고, 표준단백질로는 우혈청알부민 (bovine serum albumin, 1mg/ml)을 사용하였다.

다. 자이모그람법에 의한 효소 활성 확인 (25)

(Detection of enzyme activity by Zymogram method)

시료를 비변성 8% 폴리아크릴아마이드 겔 (non-denaturing 8 % polyacrylamidegel) 에 넣은 후, 4 ℃에서 60V 또는 90V로 3시간정도 전기영동 한 후 전기영동 한 켈을 10 mM D-alanine-ρ-nitroanilide 용액에 미리 적셔 놓은 여과지 위에 올려놓고 효소활성대가 나올 때까지 상온에 방치한다. 효소활성이 있는 부위는 황색을 띄었다.

라. 황화암모니윰 침전에의한 D-alaninepeptidase 분획

(Fractionation of D-alaninepeptidase by ammonium sulfate precipitation)

초음파 분쇄액에 ammonium sulfate 분말을 서서히 첨가하면서 녹여 30% 포화농도에 이르도록 한 후 이것을 고속저온원심분리기 (12,000 x g, 4℃)에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 취한다. 상등액을 50 mM 인산(potassium phosphate) 완충액 (pH 6.0)에서 투석한 후 초미세여과법 (PM 10 membrane ultrafiltration)으로농축하였다 (23).

마. 모노큐 에프피엘씨 음이온 교환 크로마토그라피

(MonoQ FPLC anion exchange chromatography)

농축된 시료를 50mM 인산완충액 (potassium phosphate buffer, pH 6.0)로 평형화시킨 모노 큐 칼럼 (monoQ column, 1.6×10 cm)에 흡착시킨 후 동일한 완충용액으로 비흡착 단백질을 우선 용출한 후에, 0～1.0 M 의 NaCl 직선 구배를 걸어 흡착된 단백질을 차례로 용출하였다. 이때 유속은 분당 2 ㎖로 하였으며 한 분획의 양은 1.3 ㎖로 하였다. 크로마토그라피를 하는 과정에 분획의 단백질의 농도는 280 nm에서 측정하였다. 효소활성을 갖고 있는 분획을 모아 50 mM 인산완충액 (pH 6.0)로 투석한 후 피엠 10 초미세 여과막 (PM 10 membrane)으로 여과 농축하였다 (23).

사. 세파덱스 지-200 겔 여과법 (Sephadex G-200 gel filtration)

모노 큐 칼럼 크로마토그라피 후 농축된 단백질을 50 mM 인산완충액 (pH 6.0)로 평형화시킨 세파덱스 지-200 겔 (Sephadex G-200) 칼럼(2.5×30 cm)을 이용하여 여과하였다. 이 때 유속은 시간당 150 ㎖였으며, 한 분획의 양은 3.5 ㎖로하였고 각 분획의 단백질의 농도는 280 nm에서의 흡광도로 측정하였다. 효소활성을 갖고 있는 분획을 모아 피엠 10 초미세 여과막으로 여과농축 하였다. 이러한 과정을 거쳐 얻은 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase)를 폴리아크릴아마이드 겔전기영동하여 본바 겔 상에 단백대가 하나만 나타나 순수 정제됨을 알았고 이 단백대가 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase) 활성을 가지고 있는지 여부는 자이모그람법으로 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

CMB01 균주의 체내 디-알라닌펩티다제 (D-alaninepeptidase) 의 정제수율은 28%, 정제배수는 122배였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.

2. B. amyloliqufaceins D-alaninepeptidase의 특성 (26)

가. D-alaninepeptidase의 기질 특이성

정제된 D-alaninepeptidase를 D-alanine-ρ-nitroanilide나 L-alanine -ρ-nitroanilide와 1:5의 비율로 혼합한 후, 37 ℃ 에서 2 시간동안 반응시킨 후, 각각의 반응액을 10 ㎕씩, 표준물질은 5㎕ 씩 왓트만 종이 (Whatman paper)에 최소의 원형으로 찍고 전개용액 (n-butanol: acetic acid: 멸균수 =12: 3: 5 v/v)에서 전개시켰다. 이때 사용된 표준물질은 0.01% D-alanine, 0.01% L-alanine, 100 mM D-alanine-ρ-nitroanilide, 100 mM L-alanine-ρ-nitroanilide이었다. 전개 완결 후 풍건 후 0.2% ninhydrine (in acetone)액으로 분무하여 아미노산들을 발색시켰다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 D-alanine peptidase는 D-alanine-ρ-nitroanilide 기질에만 특이적으로 작용하여 D-alanine-ρ-nitroanilide을 D-alanine과 ρ-nitroanilide로 가수분해할 수 있는 효소이다. 즉 D-alaninepeptidase는 L-alaninepeptidase의 활성을 보이지 않는다.

나. 효소의 분자량 및 구성단위 결정 (27)

정제된 효소를 비변성 전기영동 (native PAGE)와 변성 전기영동(SDS-PAGE) 하여 효소 및 구성단위 (subunit)의 분자량을 구하였다. D-alaninepeptidase의 분자량은 195.2kD이고, 이를 도 3에 나타내었다. 구성단위의 분자량은 64.8 kD이다. 이를 도 4에 나타내었다. 따라서 D-alaninepeptidase는 3개의 구성 단위를 지니고 있다.

다. 효소의 등전점 (27)

정제된 효소를 가지고 등전 초점 전기영동 (isoelectric focusing electrophoresis, 2.4 % ampholyte가 든 5% 폴리아크릴아마이드겔) 한 바 효소의 등전점 (isoelectic point, pI)은 4.9이다 .

라. D-alaninepeptidase는 pH 5 이하에서는 완충액의 종류에 관계없이 효소활성이 나타나지 않았으나 pH 6이상에서는 효소의 활성이 점증하여 pH 9 -10에서 높은 활성을 보이는 알카리성 효소였다. 이를 도 5에 나타내었다. Alaninepeptidase의 안전성은 도 6에서 보는바와 같이 pH 2-3의 산성에서는 약하나 pH 7.0 - 10.0 에서는 대체로 높았으며 효소안전성의 최적 pH는 8.0 - 9.0로 알카리성 환경에서 안정한 효소이다.

마. D-Alaninpeptidase 열 안정성 및 활성에 대한 온도의 영향

효소는 60℃ 까지는 활성의 변화가 없어 열에 매우 안정한 효소이고 70℃ 이상 에서는 급격히 실활되었다. 이를 도 7에 나타내었다. D-alaninepeptidase는 최고의 활성을 보이는 온도는 50℃지만, 20～60℃사이에 비교적 높은 활성을 보여 효소 활성이 온도변화에 크게 영향받지 않는다. 이를 도 8에 나타내었다.

바. D-alaninepeptidase의 기질 (D-alanine-ρ-nitroanilide)에 대한 Km 값은

28,5 mM, Vmax 값은 1250 μM/min이었다.

사. 금속이온의 D-alaninepeptidase에 대한 영향 및 효소의 안정성을 살펴 본 바

CuSO₄, HgCl₂, CdCl₂, Pb(CH₃COO)₂가 효소 활성을 억제하였는데 (표 2), CuSO₄, HgCl₂, CdCl₂에 의한 효소활성의 저해는 보다 현저하다. Pb(CH₃COO)₂에 의한 저해 효과는 단시간에는 크지 않고 효소와 장시간 반응 할 때 크다. 한편 Co⁺²에 의한 효소활성의 상승을 관찰 할 수 있었으나 활성의 증가도 미미하고 Co⁺²농도와 효소활성 증가사이에 상관성이 없는 것으로 보아 별 의미가 없다고 사료된다. 여러 가지 금속이온에 대한 효소의 안정성을 본 바 (표 2) CuSO₄, HgCl₂, CdCl₂, Pb(CH₃COO)₂가 효소의 안정성을 비교적 크게 저하시켰고 ZnSO₄, MnCL₂도 어느 정도는 안정성을 저해하는 금속으로 간주될 수 있다.

아. 활성에 대한 알카리성 금속의 영향

알카리 금속 이온, Na⁺¹, K⁺¹, Li⁺¹는 D-alaninepeptidase의 활성이나 안정성에 크게 영향을 주는 것으로는 사료되지 않았다.

자. D-alaninepeptidase 활성이 serine 잔기 변형제인 phenylmethanesulfonyl fluoride(PMSF)와 3,4-dichloroisocoumarin (3,4-DCI)에 의하여 현저하게 저해되어 serine 잔기가 효소 활성부위에 있는 것으로 사료되며 (표 3), 이에 D-alaninepeptidase는 serine type protease로 간주된다. 효소 활성이 cystein 잔기 변형제인 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)에 의하여도 다소 저해되는 것으로 미루어 보아 효소 활성 부위에 cystein 잔기가 관여함을 추정하였다. 그러나 aspartic 잔기 억제제에 대하여는 비교적 내성을 보였으며, EDTA, tyrosine, cystein 변형제, 2-mercaptoethanol에 대해서도 안정하다.

3.D-alaninepeptidase에 의한 항생제의 항생활성 상승효과에 대한 상세한 설명

다음의 균주와 항생제디스크를 실험에 사용하였다.

* 병원성 비내성 균주

Staphylococcus aureusATCC 25923

Pseudomonas aeruginosaATCC 27853

Pseudomonas fluorescensKCTC 1397

Pseudomonas syringaeKCTC 1832

Klebsiella oxytoca,ATCC 8724

Klebsiella aerogenes(SHV-1) 1976E

Proteus vulgarisCMB

* 임상분리 내성 균주

(서울여자대학교 항생제내성균주 은행에서 분양 받았음)

S. aureusCCARM, (vancomycin 0.5 ㎍/ml)

P. aeruginosaCCARM (gentamicin 128 ㎍/ml)

P. vulgarisCCARM (gentamicin＜0.5 ㎍/ml)

* 항생제 디스크(직경 6 mm)

Gentamicin (10 ㎍), Kanamycin (30 mcg), Vancomycin (30 ㎍)

Luria-Bettani (LB) 액체 배지에서 15시간 정도 배양한 균액을 멸균 LB agar 표면에 골고루 도말하고 D-alaninepeptidase를 5unit 첨가한 Gentamicin (10 ㎍), Kanamycin (30 mcg), Vancomycin (30 ㎍) 항생제 디스크와 D-alaninepeptidase를전혀 첨가하지 않은 항생제디스크 (실험 대조군)를 일정간격으로 놓은 후 37oC 배양기에서 48시간 배양한 후 항생제디스크 주변의 균 성장저지환의 직경을 재었다 (28, 29). D-alaninepeptidase를 첨가한 항생제디스크에 의한 균의 성장저지환이 D-alaninepeptidase를 첨가하지 않은 항생제에 의한 균의 성장 저지환 보다 더 큼이 관찰되었다. 그 결과를 도 9에 나타내었으며, 실험결과를 표 4에 정리하였다. D-alaninepeptidase에 의한 항생제 활성의 상승정도는 균종이나 처리 항생제에 따라 다소 차이가 있음을 알 수 있었다. 항생제 없이 효소만으로 항생활성을 살펴본 봐 전혀 항생활성을 보이지 않았다. 따라서 효소첨가에 의한 항생활성의 상승은 균체, 항생제, 효소간의 상관으로 나타난 것으로 사료된다. 약제에 대한 내성을 지닌 임상 분리주인S. aureusCCARM,P. aeruginosaCCARM과P. vulgarisCCARM균주 (항생제내성균주은행에서 분양 받은 균주)를 가지고 동일한 실험을 하여 본 봐 D-alaninepeptidas를 첨가한 항생제 disc의 균 성장효과가 이들 효소를 첨가하지 않은 대조군보다 상승되었음을 관찰하였다. 이 결과를 표 5 및 도 10에 나타내었다. 항생활성의 상승도는 균 종에 따라 처리 항생제에 따라 상승정도가 좀 달랐다.

4. Salmonella를 이용한D-alaninepeptidase의 유전자 복귀돌연변이 시험 (Ames Test) (30,31)

시험에Salmonella typhimuriumLT2주 유래의 TA1535, TA1537, TA100, TA98 및 Escherichia coli WP2uvrA-의 균주를 산업보건안전연구원에서 분양 받아 계대유지한 것을 사용하였으며 각 균주는 Maron과 Ames에 의해 제시된 방법에 따라 본 시험에 앞서 histidine 요구성, crystal violet 감수성, UV 감수성, ampicillin 또는 tetracycline 내성 및 자발복귀변이빈도 등의 유전적인 특성을 확인하였다.

D-alaninepeptidase은 DMSO에 1, 5, 10, 50 및 100(μg/plate)의 5단계의 농도를 희석하여 실험을 수행하였다. 균 현탁액 0.1 ml에 설정농도의 D-alaninepeptidase 수용액 0.05 ml 및 인산완충액 (0.2 M phosphate buffer, pH 7.4) 0.5 ml를 첨가하여 37℃에서 30분간 전배양하였다. 반면, S9에의해 대사활성을 갖는 경우에 대해 인산완충액 대신 S9혼합액(10% v/v) 0.5 ml을 첨가하였다. 전 배양 후 45℃에서 용해한 top agar 2 ml를 첨가하여 잘 혼합후 1.5% Bactor-Difco agar와 2% glucose를 함유한 변이원성 검색용배지 (Vogel-Bonner minimal medium E) 위에 중층하여 37℃에서 2일간 배양한 후 복귀변이성 집락을 계수하였다. D-alaninepeptidase가 첨가된 실험군에서 계수된 돌연변이 집락수는 돌연변이 물질이 전혀 존재하지 않은 실험 음성 대조군에서 계수된 정도로 이는 D-alaninepeptidase가 돌연변이성이 없음을 보여주고 있다. 이 결과를 표 6에 나타내었다.

결 론

1. Strain CMB01의 체내 D-alaninepeptidase를 염석, monoQ FPLC anion exchange chromatography, sephadex G-200 gel filtration 방법으로 정제하였으며, 최종 수율은 28%, 정제배수는 122배였다.

2. 정제된 D-alanine peptidase의 분자량은195.2 kD로 3개의 64.8 kDa subunit로 구성된 homo-trimer 효소이고, pI는 4.9였다. D-alanine-ρ-nitroanilide에 대한 Km 값은 28.5 mM., Vmax 값은 1250 μM/min이었다.

3.B. amyloliqufaceinsD-alaninepeptidase는 L-alaninepeptidase activity를 갖고 있지 않는 것을 확인하였다.

4. D-alaninepeptidase 의 활성의 최적 온도는 50℃지만, 20～60℃사이에 비교적 높은 활성을 보여 효소 활성이 온도 변화에 크게 영향받지 않는다. D-alaninepeptidase는 pH 5 이하에서는 완충액의 종류에 관계없이 효소활성이 나타나지 않았으나 pH 6이상에서는 효소의 활성이 점증하여 pH 9 -10에서 높은 활성을 보이는 알카리성 효소였다. Alaninepeptidase의 안전성은 그림 8에서 보는바와 같이 pH 2-3의 산성에서는 약하나 pH 7.0 - 10.0 에서는 대체로 높았으며 효소안전성의 최적 pH는 8.0 - 9.0로 알카리성 환경에서 안정한 효소로 사료된다.

5. 다양한 금속이온 중 Pb²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, 그리고 Cd²⁺이 D-alanine peptidase 활성을 저해하였으며, serine inhibitor인 PMSF 와 3,4-DCI에 의해 효소 활성이 저해되는것으로 보아 serine peptidase일 것으로 사료되며, aspartic inhibitor에 대해서는 강한 내성을 보였으며, EDTA, tyrosine modifiers, cysteine modifier, 그리고 2-mercaptoethanol에 대해서도 활성이 안정하였다.

6. Strain CMB01의 D-alanine peptidase를 다양한 항생제와 병용하였을 경우, 특히P. vulgaris에 대한 vancomycin,P. vulgaris(내성균)에 대한 gentamicin과 vancomycin의 항균력을 높여주었다.

7. Strain CMB01의 D-alanine peptidase의 돌연변이성 여부를 복귀돌연변이 실험

(Ames test)로 알아본 바 세포 내 (in vivo) 복귀돌연변이 실험이나 시험관내

(in vitro) 복귀 돌연변이실험 모두에서 음성을 보여 D-alanine peptidase의 돌연변이성은 없는 것으로 판명되었다.

이상의 실험결과로부터 본 발명의 디-알라닌 펩티다제는 모든 종류의 항생물질 또는 항균제와 병용할 경우 항생물질의 내성을 방지할 수 있으며, 적은 량의 항생물질을 사용하여도 탁월한 항균효과를 가진다.

Bacillus CMB01의 D-alaninepeptidase의 정제

Purificationstep	Totalprotei(mg)	Totalactivity(Unitb)	Specificactivity(Unit/mg)	Yield (%)	Purification(fold)
Cell freeextract	246.9	1092.8	4.4	100	1
Conc. ofsupernatantafter ASF30%a	43.65	955.8	21.89	87.46	4.98
MonoQ	4.75	663.3	139.6	60.7	31.7
SephadexG-200 gelfiltration	0.57	305.98	536.8	28	122

a: 초미세여과 (피엠 10 아미콘 막)로 농축

b: 37℃에서 1분에 D-alanine-ρ-nitroanilide 로부터 1 μmol의 ρ-

nitroanilide (ε=0.003 μmol^-1.cm^-1)을 생성하는 효소의 활성을

D-alaninepeptidase의활성 1 Unit로 정했다.

효소 활성에 대한 금속이온의 영향

Metal ions	Residual activity (%)
Metal ions	1 mM	5 mM
None	100	100
ZnSO₄	64	62
FeCl₂	98	99
CaCl₂	102	111
MnCl₂	78	64
CuSO₄	59	68
HgCl₂	58	56
MgCl₂	80	69
Pb(CH₃COO)₂	71	45
BaCl₂	98	80
CdCl	79	52
CoCl₂	114	86

효소 활성에 대한 화학 변형제 및 억제제의 영향

Inhibitors	Residual activity (%)
Inhibitors	1 mM	5 mM	Remark
None	100	100
PMSF¹⁾	52	23	Serine inhibitor
3,4-DCI²⁾	75	49	″
EDTA³⁾	83	70	Metal chelator
Iodine	94	85	Tyrosine modifier
Succinic acid(anhydride form)	91	79	″
N-Ethylmaleimide	94	98	Cysteine inhibitor
5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)	83	62	Cysteine modifier
Pepstatin A	101	94	Aspartic inhibitor
2-SHEtOH⁴⁾	91	85	Reducing agent

¹⁾PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride

²⁾3,4-DCI: 3,4-dichloroisocoumarin

³⁾EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

⁴⁾2-SHEtOH: 2-mercaptoethanol

D-alaninepeptidases에 의한 항생제 항균력 상승 효과

Strain	항생제 disc	성장 저지환의 직경(mm)	비고
Strain	항생제 disc	항생제	비고	항생제+Ala-peptidase
S. aureus	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	1615	1716.5
P. aeruginosa	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	16No inhibition	17
P. fluorescens	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	2727	2827	kanamycin만을 사용했을 때 내성 콜로니를 보임
P. vulgaris	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)Van (30 ㎍)	181914	1920.518
P. syringae	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	1816	1917.5
K. oxytoca	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	1815	1818	kanamycin만을 사용했을 때는 내성콜로니를 보였으나항생제에 효소를 첨가한 후에는 내성 콜로니를 보이지 않음
K. aerogenes	Gen (10 ㎍)Kan (30 mcg)	1815	2016	kanamycin이 있을 때 균주가 잘 자라지 못함 (균주 자체의 효과)

내성균에 대한 D-alaninepeptidases의 항생제 항균력 상승 효과

Strain(내성균)	항생제 disc	성장 저지환의 직경(mm)	비 고
Strain(내성균)	항생제 disc	항생제	비 고	항생제+ Ala-peptidase
S. aureusCCARM	Gen (10 ㎍)Kan(30 mcg)	No inhibitionNo inhibition		Vancomycin0.5 ㎍/ml
P. aeruginosaCCARM	Gen (10 ㎍)Kan(30 mcg)	18No inhibition	18	Gentamycin 128 ㎍/ml 효소 첨가시 내서 콜로니 적게보임
P. vulgarisCCARM	Gen (10 ㎍)Kan(30 mcg)Van (30 ㎍)	202113.5	242317	Gentamycin<0.5 ㎍/ml

5 unit of enzyme was loaded on each antibiotic disc.

Gen: gentamicin, Kan: kanamycin, Van: vancomycin.

살모넬라 균주를 사용한 D-alaninepeptidase의 복귀돌연변이실험

균주	TA 100	TA88	비고(돌연변이성연부)
S9 mix	－	＋	-	＋
음성 대조균	187	201	23	27	-
D-alapeptidase*	97	161	23	29	-
양성 대조군**	645	712	609	299	++

*:100 ug/plate

**: aminofluorene, 0.01 ug/plate

본 발명의 요지는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스씨엔비 01(Bacillus amylolique-faciensCMB01) 균주에서 정제 분리한 D-alaninepeptidase와 D-alaninepeptidase이 지닌Staphylococcus aureusATCC 25923, Pseudomonas aeruginosaATCC 27853,Pseudomonas syringaeKCTC 1832,Klebsiella oxytoca,ATCC 8724,Klebsiella aerogenes(SHV-1) 1976E,Proteus vulgarisCMB 등 수종의 병원성 세균과 임상분리 약제내성 세균인P. vulgarisCCARM (gentamicin＜0.5 ㎍/ml) 에 대하여 vancomycin, gentamicin, Kanamycin 의 항균력을 높여주는 항생 활성 상승효과이다. D-alaninepeptidase는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 씨엔비 01균의 세포내 효소(intracellular nzyme)로 무세포 추출액 (cell-free extract)을 황화암모나윰 염석, monoQ FPLC anion exchange chromatography, sephadex G-200 gel filtration 방법으로 정제하였으며, 최종 수율은 28%, 정제배수는 122배였다. D-alanine peptidase는 D-alanine-ρ-nitroanilide 기질에만 특이적으로 작용하여 D-alanine-ρ-nitroanilide을 D-alanine과 ρ-nitroanilide로 가수분해할 수 있는 효소임을 알 수 있었다. 즉 D-alaninepeptidase는 L-alaninepeptidase의 활성을 보이지 않음을 알 수 있었다. D-alaninepeptidase의 분자량은 195.2 kD이고 구성단위의 분자량은 64.8 kD로 D-alaninepeptidase의 구성 단위 수는 3개로 사료된다. 효소의 등전점 (isoelectic point, pI)은 4.9 이다. D-alaninepeptidase는 pH 7-10범위에서 매우 안정하며 활성의 최적 pH는 9.0-10.0으로 알카리 환경에서 활성을 보이는 효소다. D-alaninepeptidase는 20～60℃사이에 높은 활성을 보이는데 40～60℃가 활성의 최적온도로 비교적 고온에서 활성을 보인다. 효소는 60 ℃ 까지는 열 안정을 유지하나, 60 ℃ 이상에서 급격히 실활되었다. D-alaninepeptidase의 기질 (D-alanine-ρ-nitroanilide)에 대한 Km 값은 28.5 mM., Vmax 값은 1250 μM/min이다. D-alanine peptidase는 Pb²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Cd²⁺에 의하여 효소활성이 영향을 받으며 효소의 안정성을 살펴 본 바 CuSO₄, HgCl₂, CdCl₂, Pb(CH₃COO)₂가 효소의 안정성을 비교적 크게 저하시켰고 ZnSO₄, MnCL₂도 어느 정도는 안정성을 저해하는 금속으로 간주될 수 있다.

D-alaninepeptidase의 효소 활성 부위에 세린이 있어 serine 억제제인 PMSF와 3,4-DCI에 의해 효소 활성이 많이 저해 받는다. 아스파르틱산 잔기 억제제에 대하여는 비교적 내성을 보였으며, EDTA, tyrosine, cystein 변형제, 2-mercaptoethanol에 대해서도 안정하였다.

따라서 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 씨엠비 01 (BacillusamyloliquefaciensCMB01) 균의 세포내 D-alaninepeptidase를vancomycin, gentamicin, kanamycin의 항생제와 함께Pseudomonas syringaeKCTC 1832,Klebsiella oxytoca,ATCC 8724,Klebsiella aerogenes(SHV-1) 1976E,Proteus vulgarisCMB 등 수종의 병원성 세균과 임상분리 약제내성 세균인P. vulgarisCCARM (gentamicin＜0.5 ㎍/ml) 균에 사용하면 항생활성의 상승효과를 볼 수 있어 항생제의 사용량을 줄이거나 약제 내성균들에 대한 좋은 치료 전략을 마련 할 수 있다.

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Claims

배열형태 : 아미노산,

타잎 : 세린 타잎 프로테아제,

분자형태 : 펩타이드,

프래그먼트 형태 : N-말단 프래그먼트

프래그먼트 잔기 : 세린,

구성단위 : 3개의 구성단위로 구성되고 구성단위의 분자량 64.8kD,

분자량 : 195.2kD,

등전점 : 4.9,

효소활성 : 산성영역에서 효소활성이 나타나지 않으며, 알칼리영역에서 효소

활성을 가짐.

기질(D-alanine-p-nitroanilide)에 대한

Km값 : 28.5mM,

Vmax값 : 1250μM/min

상기의 특성을 가지며 비변성 전기영동 및 변성 전기영동법에 의하여 측정한 분자량이 195.2kD인 D-알라닌펩타이드 분해효소(D-알라닌펩티다제).
D-알라닌펩타이드 분해효소의 생산능력을 가지는 바씰러스 아밀로리퀴화씨엔스 씨엠비 01 (Bacillus amyloliquefaciensCMB01)균 을 배지에서 배양하고 얻어진 배양물로부터 D-알라닌펩타이드 분해효소(D-alaninepeptidase)를 분리 및 정제하는 것을 특징으로 하는 D-알라닌 분해효소(D-alaninepeptidase)를 제조하는 방법.
D-알라닌펩타이드 분해효소와 항생물질을 병용하여 항생물질의 항균력을 높이는 방법.