KR20030076109A - Method for immobilization of antithrombotic proteins on polytetrafluoroethylene surface by plasma treatment - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 플라즈마 공정을 이용하여 PTFE 표면에 항혈전 단백질을 고정화하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 플라즈마를 이용하여 테프론(PTFE) 표면에 카르복실기를 발생시키고; 상기 표면활성된 테프론을 효소중합촉매 및 항혈전 단백질이 포함된 용액에 침지시켜 카르복실기를 통한 공유결합으로 고정하는 단계를 포함하는 항혈전 단백질의 고정화 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method of immobilizing an antithrombotic protein on a PTFE surface using a plasma process, specifically, generating a carboxyl group on a Teflon (PTFE) surface using a plasma; It relates to a method of immobilizing the anti-thrombotic protein comprising the step of immersing the surface-activated Teflon in a solution containing an enzyme polymerization catalyst and anti-thrombotic protein covalently bonded through a carboxyl group.
플라즈마 (plasma)는 고온에서 음전하를 가진 전자와 양전하를 띤 이온으로 분리된 기체상태로서 전하분리도가 상당히 높으면서도 전체적으로는 음과 양의 전하수가 같아서 중성을 띠는 기체를 의미한다. 현재 사용되는 플라즈마는 전체 에너지량이 아주 낮아서 챔버의 온도를 크게 높이지는 않는 수준이지만 원자나 이온의 수준에서 볼 때 아주 반응성이 높은 상태가 되어 화학적인 다른 방법으로 얻기 힘든 반응이 발생할 수 있어 많이 응용되고 있다.Plasma is a gas that is separated into electrons with negative charges and ions with positive charges at high temperature, and refers to a gas having a high degree of charge separation but having a negative number of positive and positive charges as a whole. Plasma currently used has a very low total energy level that does not significantly increase the temperature of the chamber. However, the plasma is very reactive at the level of atoms or ions. have.
상기 플라즈마는 고온 또는 저온에서 발생이 가능함에 따라 각 온도에 따라 연구가 진행되고 있다. 고온에서의 응용분야는, 일예로 500 ℃ 이상의 고온에서 반응을 일으키는 플라즈마 기상화학증착법 (plasma vapor deposition), 플라즈마 기상물리증착법 (plasma vapor physical deposition) 등이 있다. 상기한 방법을 통해 금속이나 세라믹재료의 물리적, 기계적, 전기, 화학적 특성을 변화시켜 기존의 모재(substrate)가 가지는 특성을 이용하면서도 표면특성을 원하는 방향으로 개선시키려는 노력이 꾸준히 진행되고 있다.As the plasma can be generated at a high temperature or a low temperature, research is being conducted according to each temperature. Applications at high temperatures include plasma vapor deposition, plasma vapor physical deposition, and the like, which cause reactions at high temperatures of 500 ° C. or higher. Efforts have been made to improve the surface properties in a desired direction while using the properties of the existing substrate by changing the physical, mechanical, electrical, and chemical properties of the metal or ceramic material through the above method.
또한 저온에서 발생시키는 플라즈마 중 상온에서 가열하지 않고 플라즈마 상태를 이용하는 대상 재료로서, 열 변성으로 재료특성의 열화가 우려되는 고분자 재료를 대상으로 표면의 화학적 특성을 개선하려는 연구가 진행되고 있다. 특히 의료용으로 이용되는 경우는 플라즈마를 이용한 표면 에너지의 변화를 항혈전성의 개선에 적용하려는 시도 (Liping T, Yuliang W, Richard BT. Fibrinogen adsorption and host tissue response to plasma functionalized surfaces.J. Biomed. Mater. Res.,1998; 42: 156)와 생리활성 단백질 고정화를 통한 항혈전성의 증대를 시도 (Yasuhide N, Takehisa M. Novel Surface Fixation Technology of Hydrogen Based on Photochemical Method: Heparin-Immobilized Hydrogelated Surface.J. Polym. Sci.,: Part A:Polym. Chem.,1993;31:977-82) 한 경우가 있다.In addition, as a target material that uses a plasma state without heating at room temperature among plasmas generated at low temperatures, research is being conducted to improve the chemical properties of the surface of polymer materials that are concerned about deterioration of material properties due to thermal denaturation. In particular, in the case of medical use, an attempt to apply plasma surface energy change to improvement of antithrombogenicity (Liping T, Yuliang W, Richard BT.Fibrinogen adsorption and host tissue response to plasma functionalized surfaces. J. Biomed. Mater. Res., 1998; 42: 156) and attempted to increase antithrombogenicity through immobilization of bioactive proteins (Yasuhide N, Takehisa M. Novel Surface Fixation Technology of Hydrogen Based on Photochemical Method: Heparin-Immobilized Hydrogelated Surface.J. Polym. Sci., : Part A: Polym. Chem., 1993; 31: 977-82).
항혈전성의 개선을 위한 측면에서 보면, 새로운 방법으로 재료를 합성하거나 (Engbers GH, Feijen J. Current techniques to improve the blood compatibility of biomaterial surfaces.Int. J. Artif. Org., 1991;14: 199-2) , 재료의 표면을 화학적으로 개질하는 방법을 이용하거나 (Takashi S, Takehisa M. Synthesis of polyazido-derivatized substances and photochemical surface modification to immobilize functional groups.J. Biomed. Mater. Res., 1996; 32: 157-64) , 재료의 표면을 화학적으로 개질한 후 헤파린이나 유로키나제 등 혈액의 응고기전을 중간에서 억제하거나 이미 발생한 혈전의 주성분인 피브린을 용해하는 약제나 효소를 고정화하는 방법 (Kim SW, Ebert CD, Mcrea JC, Briggs C, Byun SM, HP Kim. Biological activity of antithrombotic agents immobilized on polymer surfaces.Ann N.Y.Acad. Sci.,1983; 416:513-24)들이 시도되었다. 상기 열거된 방법들은 기존의 개질하지 않은 재료보다 우수한 항혈전성을 나타내었다. 특히 장기간의 항혈전성을 유지하기 위한 방법으로 세포의 이식성과 부착특성을 향상시켜 혈액과 접촉하는 표면에 세포를 이식하여 반영구적인 성능을 나타내도록 하는 시도(Laura APW, Klaus S,Antony RG, Peter RS, Kathryn RN. Performance of small diameter synthetic vascular prostheses with confluent autologous endothelial cell linings.J. Biomed. Mater. Res.,1996;30:221-9) 또한 이루어졌다.In terms of improving antithrombogenicity, materials may be synthesized in new ways (Engbers GH, Feijen J. Current techniques to improve the blood compatibility of biomaterial surfaces.Int . J. Artif. Org ., 1991; 14: 199- 2) using a method of chemically modifying the surface of the material (Takashi S, Takehisa M. Synthesis of polyazido-derivatized substances and photochemical surface modification to immobilize functional groups. J. Biomed. Mater. Res ., 1996; 32: 157-64), chemically modifying the surface of the material and then inhibiting blood coagulation, such as heparin and urokinase, or immobilizing drugs or enzymes that dissolve fibrin, the main component of blood clots that have already occurred (Kim SW, Ebert CD). , Mcrea JC, Briggs C, Byun SM, HP Kim.Biological activity of antithrombotic agents immobilized on polymer surfaces . Ann NY Acad. Sci., 1983; 416: 513-24). The methods listed above showed better antithrombogenicity than conventional unmodified materials. In particular, attempts to achieve semi-permanent performance by implanting cells on the surface in contact with blood by improving cell portability and adhesion characteristics as a way to maintain long-term antithrombogenicity (Laura APW, Klaus S, Antony RG, Peter RS, Kathryn RN.Performance of small diameter synthetic vascular prostheses with confluent autologous endothelial cell linings. J. Biomed. Mater. Res., 1996; 30: 221-9).
한편 의료용 생체재료로 사용되고 있는 합성고분자 중 폴리테트라플루오로에틸렌 (polytetrafluoroethylene, 이하 'PTFE'라 한다)은 화학적으로 불활성이고 소수성 표면특성을 나타낸다. 이들 특성은 생체 내에서 면역기능이나 혈전반응기전을 자극하지 않고 장기간 동안 체내에서 안정성을 가질 수 있도록 한다. 그러나, 이러한 고유특성은 단백질의 흡착 등으로 체내 이식시간 경과에 따라 감소하게 된다.Meanwhile, polytetrafluoroethylene (hereinafter referred to as 'PTFE') among synthetic polymers used as medical biomaterials has chemically inert and hydrophobic surface properties. These properties make them stable in the body for a long time without stimulating immune function or thrombosis mechanism in vivo. However, these intrinsic properties decrease with the time of transplantation in the body due to the adsorption of proteins.
이에 본 발명자들은 PTFE를 장기간동안 표면특성이 우수한 생체재료로 이용하기 위하여 항혈전 단백질을 PTFE의 표면에 고정하고자 노력한 결과 플라즈마 반응을 이용하여 PTFE의 표면을 개질한 후 항혈전 단백질을 화학적 반응에 의해 공유결합시켜 고정화하는 방법을 알아내고, 상기한 방법에 의해 얻어진 재료가 혈전 용해능 시험결과 항혈전 반응이 우수함을 알아내어 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors tried to fix the antithrombotic protein to the surface of PTFE in order to use PTFE as a biomaterial having excellent surface properties for a long time, and after modifying the surface of the PTFE using a plasma reaction, The present invention was completed by finding a method of immobilization by covalent bonding, and finding that the material obtained by the above-described method was excellent in antithrombogenic reaction as a result of the blood clot dissolution test.
체내에서 혈전반응을 자극하는 정도가 낮기는 하지만 그러한 혈전반응을 자극하지 않는 특성 이외에 생리적 활성 효소를 표면에 고정항 할혈전성을 능동적으로 유지할 수 있는 기능을 부가할 목적으로 PTFE 표면에 생리활성 단백질을 고정화하는 방법을 개발하였다.Although the stimulation of thrombosis in the body is low, the bioactive protein on the surface of PTFE is added for the purpose of actively maintaining physiologically active enzymes on the surface. We have developed a method to immobilize.
따라서, 본 발명의 목적은 혈전 생성 억제능을 향상시키기 위하여 PTFE 표면에 항혈전성 단백질을 고정화하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for immobilizing antithrombogenic proteins on the surface of PTFE in order to enhance the ability to inhibit thrombus formation.
구체적으로, 본 발명의 목적은 플라즈마를 발생시켜 PTFE 표면에 카르복실기를 발생시키고; 상기 표면활성된 PTFE를 효소중합촉매 및 항혈전 단백질이 포함된 용액에 침지시켜 카르복실기를 통한 공유결합으로 고정하는 단계를 포함하는 항혈전 단백질의 고정화 방법에 관한 것이다.Specifically, an object of the present invention is to generate a plasma to generate carboxyl groups on the PTFE surface; The surface-activated PTFE is immersed in a solution containing an enzyme polymerization catalyst and anti-thrombotic protein, and the immobilization method of the anti-thrombotic protein comprising the step of covalently fixing through a carboxyl group.
또한 본 발명의 또다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 항혈전 단백질이 고정화된 PTFE를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to provide PTFE in which an antithrombogenic protein prepared by the above method is immobilized.
또한 본 발명의 또다른 목적은 항혈전 단백질이 고정화된 PTFE를 혈관 카테타 등 다양한 혈액 접촉형 의료용품에 적용하는 용도를 제공하는 것이다.In addition, another object of the present invention is to provide a use of the anti-thrombotic protein immobilized PTFE in a variety of blood contact medical supplies such as vascular catheters.
도 1은 본 발명에 따른 고정화 방법을 도식화한 것이다. 1 is a schematic of an immobilization method according to the present invention.
도 2a및도 2b는 아르곤 가스 플라즈마를 처리한 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 표면에 생성된 카르복실 작용기를 전압 (도 2a) 및 시간 (도 2b)에 따른 흡광광도계로 측정한 흡광도를 보여주는 그래프이다: 2A and 2B are graphs showing absorbance measured with an absorbance meter according to voltage ( FIG. 2A ) and time ( FIG. 2B ) of carboxyl functional groups formed on the surface of polytetrafluoroethylene (PTFE) treated with argon gas plasma . to be:
도 3은 피브린 플레이트 테스트를 보여주는 사진이다: 3 is a photograph showing the fibrin plate test:
a: 본 발명에 따라 제조된 룸브로키나제가 고정된 PTFE 시편;a: PTFE specimen fixed with lumpbrokinase prepared according to the present invention;
b: 순수한 PTFE 시편;c: 클리어존 (clear zone);b: pure PTFE specimen; c: clear zone;
d: 피브린 용액d: fibrin solution
도 4a및도 4b는 본 발명에 의해 테프론 재질 소구경 인공혈관(ePTFE)를 플라즈마 처리하고 룸브로키나제를 고정한 후 피브린 플레이트 시험하여 클리어존을 보여주는 사진이다: 4A and 4B are photographs showing a clear zone by plasma treatment of Teflon-made small diameter artificial blood vessel (ePTFE) according to the present invention and fixation of lumpbrokinase followed by fibrin plate test:
a, a': 소구경 인공혈관 시편;b,b': 클리어존;a, a ': small caliber artificial blood vessel specimen; b, b': clear zone;
c,c': 피브린 용액c, c ': fibrin solution
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 플라즈마 반응을 이용하여 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene, 이하 PTFE라 한다) 표면에 항혈전 단백질을 고정화 하는 방법, 이로써 얻어진 PTFE 및 이의 용도를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for immobilizing an antithrombotic protein on a surface of polytetrafluoroethylene (hereinafter referred to as PTFE) using a plasma reaction, PTFE obtained thereby, and a use thereof.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다 (도 1참조).Hereinafter, the present invention will be described in more detail (see FIG. 1 ).
본 발명에서는 혈전 생성 억제능을 향상시키기 위하여In the present invention, to improve the ability to inhibit thrombus formation
불활성 가스를 유입하여 플라즈마를 발생시켜 PTFE 표면에 카르복실기를 도입시키고 (단계 a); 및Introducing an inert gas to generate a plasma to introduce a carboxyl group to the PTFE surface (step a); And
상기 표면활성된 PTFE를 효소중합촉매 및 항혈전 단백질이 포함된 용액에 침지시켜 (단계 b) 항혈전 단백질과 PTFE를 카르복실기를 통해 공유결합시킨다.The surface-activated PTFE is immersed in a solution containing an enzyme polymerization catalyst and an antithrombotic protein (step b) to covalently bind the antithrombotic protein and PTFE through a carboxyl group.
단계 a)에서는 PTFE 표면을 플라즈마 처리하여 카르복실기를 일정 농도로 도입한다.In step a), the PTFE surface is plasma treated to introduce carboxyl groups at a constant concentration.
이때 플라즈마는 이 분야의 통상적인 플라즈마 발생기를 이용하여 캐리어 가스 존재 하에 발생시킨다. 여기서 캐리어 가스는 불활성 기체인 아르곤, 이산화탄소, 산소, 수분, 과산화수소, 아크릴산 및 암모니아 등을 들수 있으며 이들에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 아르곤 가스를 이용하여 플라즈마를 발생시켰다.The plasma is then generated in the presence of a carrier gas using a conventional plasma generator in the art. The carrier gas may include, but is not limited to, inert gases such as argon, carbon dioxide, oxygen, moisture, hydrogen peroxide, acrylic acid, ammonia, and the like. In the embodiment of the present invention, the plasma was generated using argon gas.
이때 플라즈마의 발생은 통상적인 RF 플라즈마 발생기, DC 방전 및 마이크로파 등에 의해 이루어진다.At this time, the plasma is generated by a conventional RF plasma generator, DC discharge and microwave.
도입되는 카르복실기의 농도는 도입되는 플라즈마의 강도 및 시간, 및 캐리어 가스의 유량에 따라 가변적으로 발생한다. 즉, 단계 a)는 기체상태의 플라즈마 반응에 의하여 PTFE 표면에 화학적인 용매를 사용하지 않고도 단백질을 공유결합 시킬 수 있는 작용기를 생성시킬 수 있다. PTFE 표면에 생성한 작용기는 톨루이디엔 블루(toluidine blue) 염색법을 이용하였다. 상기 염색법은 대상 PTFE 시편의 표면에 생성된 작용기 중 카르복실기와 염색시약을 결합시킨 후 표면에 결합된 염색시약을 분리하여 흡광도 측정으로 시약의 농도를 측정하는 방법이다. PTFE 표면에 생성된 카르복실 작용기는 흡광도에서 나타나는 염색시약의 농도에 비례하므로 각 플라즈마 처리 조건에 따른 상대적인 표면 작용기의 농도를 파악할 수 있다.The concentration of the carboxyl groups introduced is variable depending on the intensity and time of the plasma introduced and the flow rate of the carrier gas. That is, step a) may generate a functional group capable of covalently binding a protein without using a chemical solvent on the PTFE surface by a gaseous plasma reaction. The functional groups generated on the PTFE surface were subjected to toluidine blue staining. The dyeing method is a method of measuring the concentration of the reagent by measuring the absorbance by combining the carboxyl group and the dyeing reagent of the functional groups generated on the surface of the target PTFE specimen and then separating the dyeing reagent bound to the surface. The carboxyl functional groups generated on the surface of PTFE are proportional to the concentration of the dyeing reagent appearing in the absorbance, so it is possible to determine the relative surface functional concentrations according to the plasma treatment conditions.
바람직한 실시예에 따르면, 플라즈마의 강도가 5∼150W, 시간 10초∼10분이며, 캐리어 가스의 유량은 5∼100 cc/분에서 수행한 경우 적절한 카르복실기의 농도를 얻을 수 있었다. 상기한 수치는 적용되는 플라즈마 장치에 따라 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절히 변경될 수 있다.According to a preferred embodiment, when the plasma intensity is 5 to 150 W, the time is 10 seconds to 10 minutes, and the flow rate of the carrier gas is performed at 5 to 100 cc / min, an appropriate concentration of carboxyl group can be obtained. The above numerical values may be appropriately changed by those skilled in the art depending on the plasma apparatus to be applied.
또다른 바람직한 실시예에 따르면, 표면에 형성되는 최대의 카르복실기 작용기가 발생하는 조건을 찾기 위하여 플라즈마 발생기의 파워 및 발생시간을 변화시키면서 착색물질인 톨루이디엔 용액을 이용하여 흡광도 측정에 의한 상대적 농도를 측정한 결과 (도 2a및도 2b참조), 플라즈마 출력이 50w인 조건하에서 플라즈마 지속시간이 약 300초에서 가장 높은 카르복실기 농도를 나타내었다.According to another preferred embodiment, in order to find the conditions under which the maximum carboxyl functional groups are formed on the surface, the relative concentration by the absorbance measurement using the toludiene solution, which is a coloring material, is changed while changing the power and generation time of the plasma generator. As a result of the measurement (see FIGS . 2A and 2B ), the plasma duration was about 300 seconds under the condition that the plasma output was 50w, showing the highest carboxyl group concentration.
그러나, 300초 동안 플라즈마 처리를 진행하면 폴리머에 플라즈마의 에너지가 전달되어 과열되므로 낮은 플라즈마 출력에서 비교적 짧은 시간이 유리하여 10W의 플라즈마 출력에서 60초의 플라즈마 지속시간을 가지는 것이 가장 유리하다.However, when the plasma treatment is performed for 300 seconds, the plasma energy is transferred to the polymer and overheated, so that a relatively short time is advantageous at low plasma output, and thus, it is most advantageous to have a plasma duration of 60 seconds at 10 W plasma output.
본 발명의 PTFE는 그 형태를 한정하지 않으며, 플라즈마를 도입할수 있는 것이라면 그 어떤 형태라도 포함하며, 일예로 시트, 박막 및 펠렛 등을 포함한다.PTFE of the present invention is not limited in form, and may include any form as long as plasma can be introduced, and includes, for example, sheets, thin films, pellets, and the like.
단계 b)에서는 상기 단계에서 카르복실기로 표면개질된 PTFE와 항혈전 단백질을 공유결합시킨다.In step b), the anti-thrombotic protein is covalently bound to the surface-modified PTFE in the carboxyl group.
구체적으로, 표면활성된 PTFE를 완충용액, 효소중합촉매 및 항혈전 단백질이 포함된 용액에 20∼37 ℃ 에서 10∼24 시간 동안 침지시켜 수행한다.Specifically, the surface-activated PTFE is carried out by immersion in a solution containing a buffer solution, enzyme polymerization catalyst and antithrombotic protein at 20 ~ 37 ℃ for 10 to 24 hours.
상기 효소중합촉매는 공유 결합반응을 촉진시키기 위하여 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노 프로필) 카르보디이미드 (1-ethyl-3-(3-(dimethylamino propyl) carbodiimide, 이하 'EDC'라 한다)을 포함하며, 0.01∼0.2 M, 바람직하기로는 0.03∼0.06 M로 사용한다.The enzyme polymerization catalyst is 1-ethyl-3- (3- (dimethylamino propyl) carbodiimide (1-ethyl-3- (3- (dimethylamino propyl) carbodiimide, hereinafter referred to as 'EDC') in order to promote a covalent bond reaction. And 0.01 to 0.2 M, preferably 0.03 to 0.06 M.
상기 완충용액은 통상적으로 사용되는 것을 사용하며, 인산칼륨(KH2PO4), 아세트산 등을 포함하며 0.01∼0.10 M, 바람직하기로는 0.1∼0.5 M로 사용하고 최종 pH가 3.5∼5.5, 바람직하기로는 4.0∼5.0, 가장 바람직하기로는 pH 4.4∼4.7이 되도록 한다.The buffer solution is used as is commonly used, containing potassium phosphate (KH 2 PO 4 ), acetic acid, etc., 0.01 to 0.10 M, preferably 0.1 to 0.5 M and the final pH is 3.5 to 5.5, preferably Is 4.0 to 5.0, most preferably pH 4.4 to 4.7.
본 발명에서 사용되는 항혈전 단백질은 이 분야에서 통상적으로 인식되는 것을 포함하며 본 발명에서는 한정하지 않으며, 일예로 룸브로키나제(Lumbrokinase), 헤파린(heparin), 히루딘(hirudin), 알부민(albumin) 및 지단백(lipoprotein) 등을 포함한다. 상기 항혈전 단백질 중 룸브로키나제는 이미 새생성된 혈전을 용해시키는 혈전용해능을 가지고 있으며, 헤파린, 히루딘, 지단 q백등은 혈전반응의 진행을 억제하거나 지연시켜 혈전의 생성을 줄이는 특징을 가지고 있다.Antithrombotic proteins used in the present invention include those commonly recognized in the art and are not limited in the present invention, for example, Lumbrokinase, heparin, hirudin, albumin And lipoproteins. Among the antithrombotic proteins, lumpbrokinase has a thrombolytic ability to dissolve newly formed blood clots, and heparin, hirudin, and liposome q-baek, etc. have the characteristics of reducing the production of blood clots by inhibiting or delaying the progression of blood clots. have.
상기 항혈전 단백질의 함량은 PTFE의 단위 표면적당 1 mL의 반응액을 기준으로 하며, 용액 내의 단백질의 농도는 0.01∼2 mg/mL, 바람직하기로는 0.1∼0.3 mg/mL의 범위에서 사용한다. 이때 농도가 상기 범위를 벗어나서 너무 낮은 농도의 경우 표면 개선 효과가 감소하며, 너무 높으면 항혈전단백질의 소요량이 증가하여 비용이 높아지는 단점이 있다.The antithrombotic protein content is based on 1 mL of the reaction solution per unit surface area of PTFE, and the concentration of the protein in the solution is used in the range of 0.01-2 mg / mL, preferably 0.1-0.3 mg / mL. At this time, if the concentration is out of the above range, the surface improving effect is reduced when the concentration is too low. If the concentration is too high, the requirement of the antithrombotic protein is increased, thereby increasing the cost.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 항혈전 단백질로 룸브로키나제를이용하여 카르복실기로 표면개질된 PTFE와 공유결합을 수행하였다.According to a preferred embodiment of the present invention, using a room brokinase as the anti-thrombotic protein was carried out covalent bond with PTFE surface-modified PTFE.
본 발명의 또다른 바람직한 실시예에 따르면, 룸브로키나제와 공유결합된 PTFE의 혈전용해능을 알아보기 위하여 피브린 플레이트를 이용한 클리어존을 관찰한 결과,도 5에 나타낸 바와 같이 클리어존이 명확하게 발생함을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 혈전용해능을 갖는 룸브로키나제가 PTFE 표면에 효과적으로 고정되어 있음을 알 수 있었다.According to another preferred embodiment of the present invention, the clear zone using the fibrin plate in order to determine the thrombolytic ability of the PTFE covalently bonded to the lumpbrokinase, clear zone is clearly generated as shown in FIG . As a result, it was found that rumbrokinase having thrombolytic ability was effectively fixed to the PTFE surface.
상기 단계 b)의 공유결합 반응 후 PTFE 표면에 부착된 미반응 물질을 제거하기 위해 통상적인 세척과정, 일예로 초음파 세척 등을 수행한다.After the covalent reaction of step b), a conventional washing process, for example, ultrasonic cleaning is performed to remove the unreacted material attached to the PTFE surface.
따라서 본 발명의 플라즈마 공정을 이용하여 PTFE의 표면에 작용기를 발생시키고 촉매를 이용한 효소 고정법을 통하여 PTFE 표면이 혈액과 접촉시 혈전이 생성되는 정도를 낮추어 혈액적합성을 증대시킬 수 있다. 즉, 기술적으로 공학적인 플라즈마 공정과 생화학적인 효소고정법이 결합하여 의료용 재료의 항혈전성의 증대를 유도하는 것이다.Therefore, by using the plasma process of the present invention to generate a functional group on the surface of the PTFE and through the enzyme fixation method using a catalyst it is possible to increase the blood compatibility by lowering the extent of the thrombus generated when the PTFE surface in contact with the blood. In other words, technically engineered plasma processes and biochemical enzyme fixation methods are combined to induce an increase in the antithrombogenicity of medical materials.
그 결과, 상기 물질이 혈전 용해능이 우수함에 따라 혈액과 접촉하는 의료용품에 바람직하게 적용이 가능하다. 상기 의료용품은 PTFE로 제작가능한 모든 물품을 포함하며 일예로 인공혈관(artificial blood vessel), 혈관 카테타(blood vessel catheter), 캐뉼라(cannular), 혈액산화기(blood oxygenator) 등을 포함한다.As a result, the substance is preferably applicable to medical supplies in contact with blood as the substance has excellent thrombolytic ability. The medical article includes all articles that can be made of PTFE and includes, for example, an artificial blood vessel, a blood vessel catheter, a cannular, a blood oxygenator, and the like.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, PTFE로 이루어진 소구경 인공혈관을 본 발명에 의해 플라즈마 처리 및 항혈전 단백질로 룸브로키나제를 고정시킨 후피브린 플레이트 시험을 수행한 결과,도 4a및4b에 나타낸 바와 같이 흰 테프론 시트주위에 검은 띠가 용해된 피브린 영역을 확인하여 항혈전 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 그 결과, 본 발명의 항혈전 단백질이 고정된 PTFE를 이용한 의료용품이 생체 내의 혈액과 접촉하였을 때 잔존하는 촉매와 화학물질에 의해 생체에서 원하지 않는 반응이 나타나는 것을 방지할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, a small diameter artificial vessel made of PTFE was subjected to plasma treatment and fibrin plate test after immobilization of lumpbrokinase with an antithrombotic protein according to the present invention, as shown in FIGS . 4A and 4B . As shown, the fibrin region in which black bands were dissolved around the white Teflon sheet showed antithrombogenic effect. As a result, it is possible to prevent unwanted reactions in the living body due to the remaining catalyst and chemicals when the medical article using PTFE immobilized with the antithrombotic protein of the present invention comes into contact with blood in the living body.
이에 본 발명을 하기 실시예 에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.The present invention will be described in more detail by the following examples.
그러나 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되지는 않는다.However, the following examples are only examples of the present invention and the present invention is not limited thereto.
실시예 1: 항혈전 단백질과 공유결합된 PTFE의 제조Example 1 Preparation of PTFE Covalently Bonded with Antithrombotic Protein
단계 a) : 카르복실기로 표면개질된 PTFE의 제조Step a) Preparation of PTFE Modified with Carboxyl Group
PTFE를 플라즈마 공정을 이용하여 표면에 카르복실기를 형성시키기 위하여 하기와 같이 실시하였다.PTFE was carried out as follows to form a carboxyl group on the surface using a plasma process.
PTFE(TEFLON, 신화베스트론사 (한국)제품) 시트 (두께: 0.15mm, 150 mm ×300 mm 폭)를 가로 x 세로 1x1cm 의 크기로 잘라내고 알콜에 담근 상태로 20분간 초음파 세척을 실시하였다. 이어서 45 ℃의 진공오븐에서 24 시간동안 진공건조를 하였다.PTFE (TEFLON, manufactured by Shinhwa Bestron Co., Ltd.) sheet (thickness: 0.15 mm, 150 mm x 300 mm width) was cut to a size of width x length 1 x 1 cm, and ultrasonic cleaning was performed for 20 minutes while soaking in alcohol. Subsequently, vacuum drying was performed for 24 hours in a vacuum oven at 45 ° C.
플라즈마 공정을 수행하기 위하여 플라즈마 장치 (오토전기 (한국)사 제품)의 챔버에 상기 테프론 시료를 넣고 진공펌프를 이용하여 진공도가 0.05 mmHg의 압력까지 도달하게 한 다음, 아르곤 가스를 분당 20 CC의 속도로 유입시켰다. 이때 진공펌프 측 밸브는 열린 상태를 유지하였다. 진공 챔버내의 압력이 일정한 수준에 도달하면 플라즈마 발생기를 작동시키고 플라즈마가 효과적으로 발생할 수 있도록 플라즈마 매칭기를 조절하였다. 이러한 플라즈마 매칭기에 의해서 플라즈마 발생기에서 발생하는 입사파와 반사파가 정현파가 되도록 조절될 수 있다.In order to perform the plasma process, the Teflon sample was placed in a chamber of a plasma apparatus (automotive (Korea)) and the vacuum degree was reached to a pressure of 0.05 mmHg using a vacuum pump, and then argon gas was fed at a rate of 20 CC per minute. Flowed into. At this time, the valve of the vacuum pump side was kept open. When the pressure in the vacuum chamber reached a certain level, the plasma generator was operated and the plasma matcher was adjusted to effectively generate the plasma. By such a plasma matcher, the incident wave and the reflected wave generated in the plasma generator may be adjusted to be a sine wave.
이때 PTFE 표면에 생성된 카르복실기의 농도를 알아보기 위하여 플라즈마 발생기의 파워를 10와트, 30와트, 50와트로 변화시키면서 각각의 파워에서 플라즈마 발생시간을 10초, 30초, 1분, 2분, 3분, 5분이 되도록 진행하여 테스트용 시편을 제작하였다.At this time, the plasma generation time was changed to 10 watts, 30 watts, and 50 watts to determine the concentration of carboxyl groups formed on the PTFE surface, and the plasma generation time was 10 seconds, 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 3 The test specimen was prepared by proceeding to 5 minutes.
각각의 조건에 따라 얻어진 표면개질된 PTFE는 톨루이디엔 블루 염색법과 분광기(spectrophotometer)로 염색약의 유무를 확인하여 표면에 카르복실기가 존재함을 확인하였다.The surface-modified PTFE obtained according to each condition was confirmed by the toludiene blue staining method and the spectrophotometer (spectrophotometer) to determine the presence of the dye, the presence of a carboxyl group on the surface.
단계 b) : 항혈전 단백질과 공유결합된 PTFE의 제조Step b): Preparation of PTFE Covalently Bonded with Antithrombotic Protein
상기 단계에서 얻어진 카르복실기로 표면 개질된 PTFE를 항혈전 단백질과 공유결합시켜 고정화하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.In order to immobilize the surface-modified PTFE covalently bonded to the anti-thrombotic protein obtained in the above step was carried out as follows.
0.05 M KH2PO4및 촉매 0.03 M 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노 프로필) 카르보디이미드 (EDC)가 포함된 완충용액을 제조한 다음, 항혈전 단백질로 룸브로키나제를 0.3 mg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 반응 용액을 제조하였다. 상기 용액에 단계 a)에서 얻어진 PTFE 시료를 넣고 상온에서 16시간 동안 반응을 지속시켰다.A buffer solution containing 0.05 M KH 2 PO 4 and 0.03 M 1-ethyl-3- (3- (dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) was prepared, followed by 0.3 mg of lumpbrokinase as an antithrombotic protein. The reaction solution was prepared by adding a concentration of / mL, and the PTFE sample obtained in step a) was added to the solution, and the reaction was continued at room temperature for 16 hours.
룸브로키나제의 고정반응이 완료된 다음, 인산 완충용액으로 2회 가볍게 세척하여 표면에 부착된 미반응 물질을 제거하고 5분간 초음파 세척을 실시하였다.After the fixation reaction of the lumpbrokinase was completed, the solution was lightly washed twice with phosphate buffer to remove unreacted substances attached to the surface, and ultrasonic cleaning was performed for 5 minutes.
실험예 1 : 표면개질된 카르복실기의 농도 측정Experimental Example 1 Measurement of Concentration of Surface Modified Carboxyl Group
상기 실시예 1의 단계 a)에서 얻어진 PTFE 시트의 플라즈마의 파워 및 시간에 따른 표면에 존재하는 카르복실기의 농도를 알아보기 위하여 하기와 같이 실시하였다.In order to determine the concentration of the carboxyl groups present on the surface of the PTFE sheet obtained in step a) of Example 1 with the plasma power and time.
카르복실기와 반응하는 착색제를 이용하여 반응을 유도한 후, 반응한 착색제의 분자를 분리반응을 통해 용액 상태로 분리하여 흡광도를 측정함으로써 표면에 존재하는 카르복실기의 농도를 상대적으로 측정하였다.After inducing a reaction by using a colorant reacting with a carboxyl group, the molecules of the reacted colorant were separated into a solution state through a separation reaction and the absorbance was measured to relatively measure the concentration of the carboxyl group present on the surface.
착색제로 10-4M NaOH 용액을 이용하여 5 x 10-5M 톨루이디엔 블루 용액을 제조하고, 이 용액 중 3 mL 취하여 플라즈마를 처리한 PTFE 시트 1조각을 넣어 25 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 이어서, 10-4M NaOH용액 (pH 10.0)을 이용하여 반응되지 않은 톨루이디엔 블루를 제거하였다.A 5 x 10 -5 M toludiene blue solution was prepared using a 10 -4 M NaOH solution as a colorant, 3 mL of the solution was added, and a piece of plasma treated PTFE sheet was added thereto and reacted at 25 ° C for 3 hours. . Subsequently, unreacted toludiene blue was removed using 10 -4 M NaOH solution (pH 10.0).
50%(v/v) 아세트산 용액 3 mL에 상기 PTFE 시트를 담궈 표면에 결합되어 있는 톨루이디엔 블루를 용해시켜 분광기(spectrophotometer)를 이용하여 631 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 톨루이디엔 블루의 분자 흡광계수는 39576.7M-1cm-1(λmax = 631 nm)이며 각 조건당 3개의 PTFE 시트를 사용하여 측정하였다.The PTFE sheet was immersed in 3 mL of 50% (v / v) acetic acid solution to dissolve toludiene blue bound to the surface, and the absorbance was measured at 631 nm using a spectrophotometer. The toll Louis molecular extinction coefficient of the diene Blue 39576.7M -1 cm - 1 (λmax = 631 nm) is measured by using the three conditions, each sheet of PTFE.
이러한 측정결과는 하기 표 1 및도 2a∼도 2b에 나타낸 바와 같다.These measurement results are as shown in Table 1 below and FIGS. 2A to 2B .
상기표 1에 따르면, 10W의 플라즈마 강도에서 높은 표면 작용기 농도가 나타난 것을 알 수 있다. 또한 플라즈마 지속시간은 10W에서 60초 유지한 경우와 50W에서 300초 유지한 경우가 가장 높은 표면 작용기 농도를 나타내었음을 알 수 있다.도 2a는 플라즈마 처리시간에 따른 카르복실 작용기의 농도를 그래프로 나타낸 것으로 카르복실기의 농도는 처리시간이 120초 이상의 조건에서 비교적 높은 값을 나타냄을 알 수 있다.According to Table 1 , it can be seen that a high surface functional group concentration appeared at a plasma intensity of 10W. In addition, the plasma duration was 60 seconds at 10W and 300 seconds at 50W showed the highest surface functional group concentration. Figure 2a is a graph showing the concentration of the carboxyl functional group according to the plasma treatment time, it can be seen that the concentration of the carboxyl group has a relatively high value at 120 seconds or more conditions.
또한도 2b는 플라즈마의 처리 강도의 변화에 따른 카르복실기의 농도를 보여주는 그래프로서, 플라즈마 처리 강도가 10W에서 비교적 고르게 높은 표면작용기 농도가 나타남을 알 수 있었다.In addition, Figure 2b is a graph showing the concentration of the carboxyl group according to the change in the treatment intensity of the plasma, it can be seen that the surface functional group concentration is relatively evenly high at 10W plasma treatment intensity.
도 2a와도2b의 자료를 비교하여 보면 생산성 측면에서 10W의 플라즈마 출력에서 60초 내외의 처리시간이 가장 적절한 것을 알 수 있었다.Comparing the data of FIG . 2A and FIG. 2B , it can be seen that the processing time of about 60 seconds at the 10 W plasma output is most appropriate in terms of productivity.
실험예 2 : 혈전 용해능 측정Experimental Example 2 Measurement of Thrombus Solubility
본 발명에 의한 항혈전 단백질이 공유결합된 PTFE 시트의 혈전 용해능을 알아보기 위하여 피브린 플레이트를 이용하여 하기와 같이 실시하였다.In order to determine the thrombolytic ability of the anti-thrombotic protein-covalently bonded PTFE sheet according to the present invention, fibrin plates were used as follows.
피브린은 혈액내에 존재하는 피브리노겐이 외부의 자극이나 내부의 기전에 의해 촉발되어 혈전반응이 진행된 후 최종단계에서 생성되는 혈전의 기본구조이다. 피브린을 제거하면 혈전에 의한 문제는 대부분 사라진다고 할 수 있다.Fibrin is a basic structure of the thrombus that is generated in the final stage after the fibrinogen in the blood is triggered by an external stimulus or an internal mechanism and the thrombus reaction proceeds. Removing fibrin almost completely eliminates the problem of blood clots.
피브린 플레이트는 피브리노겐을 0.8%(w/v)의 농도로 녹인 붕산 버퍼 용액을 페트리 디쉬에 붓고, 5 IU의 트롬빈을 넣은 후 균일하게 혼합이 되도록 잘 흔들어 준어 제조하였다. 트롬빈에 의해 피브리노겐은 피브린으로 변하면서 혈전을 구성하는 젤 상태로 변한다. 이렇게 반응시켜 제조한 피브린 플레이트는 2시간 경과 후 혈전용해능을 시험에 사용하였다.Fibrin plates were prepared by pouring a boric acid buffer solution in which fibrinogen was dissolved at a concentration of 0.8% (w / v) in a Petri dish, adding 5 IU of thrombin, and shaking well to ensure uniform mixing. Thrombin converts fibrinogen to fibrin and into a gel that constitutes a thrombus. Fibrin plates prepared by reacting in this way were used for the test for thrombolytic ability after 2 hours.
피브린 플레이트에 상기 실시예 1에서 얻어진 (조건: 10W x 60초 처리) PTFE 시트를 놓고 클리어 존의 발생을 관찰하였으며, 이러한 결과를도 3에 나타내었다. 비교를 위하여 순수한 PTFE를 사용하였다.The occurrence of a clear zone was observed by placing the PTFE sheet obtained in Example 1 (conditions: 10W x 60 seconds treatment) on a fibrin plate, and the results are shown in FIG. 3 . Pure PTFE was used for comparison.
도 3은 피브린 플레이트 검사로 생성된 클리어존의 모습으로, 흰색을 띄는 부분 (d)은 용해되지 않은 피브린 플레이트이며, 가운데에 흰 색의 테프론 시트 주위의 사각형으로 검은색을 띠는 것 (c)은 PTFE 시트에 고정된 룸브로키나제에 의해 피브린이 용해된 클리어존을 나타낸다. 즉, 본 발명에 의한 PTFE (a)는 주위의 피브린을 녹여 투명한 상태의 액체가 되는 클리어존이 (c)이 형성되었으며, 본도3에서는 배경을 검은색으로 하여 피브린과의 차이를 선명하게 하여 찍은 사진을 나타낸 것이다. 이에 비하여 순수한 PTFE (b)는 아무런 변화도 나타나지 않았다. Figure 3 is a clear zone created by the fibrin plate test, the white portion (d) is an undissolved fibrin plate, black in the center of the square around the white Teflon sheet (c) Denotes a clear zone in which fibrin is dissolved by lumpbrokinase immobilized on a PTFE sheet. That is, in the PTFE (a) according to the present invention, a clear zone (c) was formed to dissolve the surrounding fibrin to become a liquid in a transparent state . In FIG. 3 , the background is black to make the difference with fibrin clear. It is a picture taken. In contrast, pure PTFE (b) showed no change.
이러한 결과는 본 발명에 의해 PTFE 표면에 항혈전성 단백질이 고정화되어 있음을 나타내고, 상기 PTFE가 항혈전 효과를 나타내는 것을 확인시켜 준다.These results indicate that the antithrombogenic protein is immobilized on the PTFE surface by the present invention, and confirm that the PTFE exhibits an antithrombogenic effect.
실험예 3 : 소구경 인공 혈관에서의 혈전 용해능 측정Experimental Example 3 Measurement of Thrombus Solubility in Small Bore Artificial Blood Vessels
본 발명에 의한 고정화 방법을 이용하여 소구경 인공 혈관에 직접 적용하여 혈전 용해능을 알아보기 위하여 피브린 플레이트를 이용하여 하기와 같이 실시하였다.The fibrin plate was used as follows to determine the thrombolytic ability by directly applying to a small diameter artificial blood vessel using the immobilization method according to the present invention.
판매되고 있는 소구경 인공혈관 (Vascular graft, Gore-Tex사, 내경 6mm)을 구입하여 본 발명에 따라 플라즈마 처리 (플라즈마 파워 10W, 지속시간 60초)후 룸브로키나제 항혈전 단백질을 고정화 하였다. 이어서 룸브로키나제가 고정된 인공혈관을 종단면과 횡단면으로 잘라 실험예 2와 동일한 방법으로 피브린 플레이트 테스트를 수행하여 항혈전 효과를 확인하였으며 이러한 결과를 하기도 4a및도 4b에 나타내었다.Small diameter artificial blood vessels (Vascular graft, Gore-Tex, internal diameter 6mm) were purchased and immobilized after the plasma treatment (plasma power 10W, duration 60 seconds) according to the present invention. Subsequently, the fibroin plate test was performed in the same manner as in Experimental Example 2 by cutting the artificial blood vessels in which the lubrokinase immobilized, and the anti-thrombotic effect was shown in FIGS . 4A and 4B .
도 4a는 횡단면으로 절개한 본 발명에 의해 처리된 PTFE (a)의 피브린 플레이트 테스트를 수행한 것으로, 피브린이 용해됨을 보이는 검은색의 클리어존(b)이 나타남을 알 수 있었다. Figure 4a is a fibrin plate test of the PTFE (a) treated by the present invention cut in cross section, it can be seen that the black clear zone (b) showing that the fibrin is dissolved.
또한도 4b는 종단면으로 절개한 본 발명에 의해 처리된 PTFE (a')의 피브린 플레이트를 수행한 것으로, 상기도 4a에서 나타난 결과와 마찬가지로 주위에 피브린이 용해됨을 알 수 있는 클리어존 (b')을 확인할 수 있었다.In addition, Fig. 4b is a fibrin plate of PTFE (a ') treated by the present invention cut in the longitudinal section, as shown in Fig. 4a clear zone (b') that can be seen that dissolves the fibrin around Could confirm.
따라서 본 발명의 고정화 방법은 어떤 형태의 PTFE -혈액과 접촉하는 의료용품-에도 도입할 수 있으며, 항혈전 효과를 증가시킬 수 있다.Thus, the immobilization method of the present invention can be incorporated into any form of PTFE—medical products in contact with blood—and can increase antithrombotic effects.
상술한 바와 같이, 본 발명에 의해 플라즈마 처리를 통하여 항혈전 단백질을 PTFE 표면에 도입함으로써, 혈액과 접촉할 경우 혈전의 생성을 효과적으로 지연시키거나 억제할 수 있어 혈관 카테타 등 다양한 혈액 접촉형 의료용품에 적용할 수 있다.As described above, by introducing the anti-thrombotic protein into the surface of PTFE through plasma treatment according to the present invention, it is possible to effectively delay or inhibit the generation of blood clots when it comes into contact with blood, and thus to various blood contact medical supplies such as vascular catheters. Applicable
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